DE60316300T2

DE60316300T2 - Maiswurzel-spezifische promotoren und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60316300T2
Application number: DE60316300T
Authority: DE
Inventors: Greet Vanderkimpen; Gerben Van Eldik; Frank Meulewaeter
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2023-07-29
Also published as: CN101240280A; CN101240280B; US7554005B2; EP1527091B1; BR0313137A; AR075363A2; ATE430762T1; CN1671739A; US20070174938A1; US20040133945A1; AU2003250189A1; DE60316300D1; US7205454B2; ES2294329T3; DE60327568D1; AR040957A1; WO2004013169A1; ATE373011T1; EP1527091A1; CN100355778C

Description

Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft die Isolation von Promotoren aus Mais, die in der Lage sind, die Transkription einer operativ verknüpften fremden DNA-Sequenz bevorzugt, selektiv oder ausschließlich in den Wurzeln von Pflanzen, wie Maispflanzen, zu steuern. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung chimärer Gene für die bevorzugte oder selektive Expression von interessierender biologisch aktiver RNA in den Wurzeln von Pflanzen, wie Maispflanzen. Pflanzen, wie Maispflanzen, die Promotoren mit Bevorzugung oder Selektivität für die Maiswurzel umfassen, die mit einer fremden DNA-Sequenz operativ verknüpft sind, die nach Transkription biologisch aktive RNA bevorzugt oder selektiv in den Wurzeln von Pflanzen ergeben, werden ebenfalls bereitgestellt.
Beschreibung des verwandten Standes der Technik.
Eine signifikante Überlegung bei der Produktion transgener Pflanzen ist die Gewinnung ausreichender Spiegel der Expression des Transgens in den interessierenden Geweben auf eine bevorzugte oder selektive Weise. Dadurch können mögliche Nachteile in Verbindung mit der konstitutiven Expression des Transkripts, wie Ausbeuteverschleppung, vermieden werden. Die Auswahl geeigneter Promotoren ist für den Erhalt des interessierenden Expressionsmusters mit einem bestimmten Transgen entscheidend.
Die selektive Expression von Transgenen in Wurzeln von Pflanzen, insbesondere Getreidepflanzen, wie Mais, wird als potenziell kommerziell wichtig angesehen, z.B. zur Veränderung der Funktion von Wurzelgewebe, Resistenz gegen Pathogene oder Schädlinge mit Bevorzugung für einen Angriff von Wurzeln (wie Nematoden, Maiswurzelbohrer usw.), Resistenz gegen Herbizide oder nachteilige Umweltbedingungen (wie Trockenheit oder Bodenbeschaffenheit).
US 5,633,363 beschreibt eine aus Mais isolierte, 4,7 kb große stromaufwärts gelegene Promotorregion mit der Bezeichnung ZRP2 und schreibt dieser Promotorregion eine besondere Nützlichkeit zum Antreiben der Expression mit Bevorzugung für die Wurzel von heterologen Genen zu.
WO 97/44448 betrifft allgemein Mechanismen der Genexpression in Pflanzen und, genauer gesagt, die Regulation der Expression von Genen in Pflanzen auf gewebsspezifische Weise, insbesondere in Wurzeln. Ein Verfahren zur Isolation transkriptionsregulatorischer Elemente, die zur Genexpression mit Bevorzugung für bestimmte Gewebe beitragen, ist offenbart.
WO 00/15662 beschreibt einen Promotor eines glycinreichen Proteins (zmGRP3), dessen Transkripte ausschließlich in Wurzeln junger Maissetzlinge nach entwicklungsspezifischen Mustern akkumulieren.
WO 00/070068 und WO 00/70066 beschreiben die Maispromotoren RS81 bzw. RS324, bei denen es sich um Promotoren von Genen handelt, die in Maiswurzelgewebe, aber nicht in Korngewebe exprimiert werden und von denen in der molekularen Analyse beschrieben wurde, dass sie ein wurzelspezifisches Expressionsprofil besitzen.
Trotz der Tatsache, dass Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel im Stand der Technik verfügbar sind, besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen Promotoren, die zu einer bevorzugten oder selektiven wurzelselektiven Expression in der Lage sind, z.B. zur unabhängigen Expression mehrerer fremder interessierender DNA-Sequenzen ohne die Möglichkeit eines posttranskriptionalen Silencing aufgrund der Verwendung desselben Promotors. Außerdem steuern die bekannten Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel jeweils ein besonderes zeitliches, räumliches und/oder entwicklungsgemäßes Expressionsmuster, das nicht immer zu bestimmten Zielen passt. Somit verbleibt ein Bedarf an neuen Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel mit der Fähigkeit, die Transkription in Wurzeln, vorzugsweise auf selektivere Weise zu steuern, die zudem vorzugsweise zu sehr viel Transkriptionsprodukt führt.
Zusammenfassung und Aufgaben der Erfindung.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel bereitzustellen, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR. 1 von dem Nukleotid in Position 1 bis zu dem Nukleotid in Position 338 oder die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 vom Nukleotid in Position 11 bis zu dem Nukleotid in Position 1196 ("GL4-Promotor") oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität dazu umfassen.
Die Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel können innerhalb einer Promotorregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel umfasst sein und können ferner die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 von dem Nukleotid in Position 339 bis zu dem Nukleotid in Position 366 oder die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 14 von dem Nukleotid in Position 1281 bis zu dem Nukleotid in Position 1308 umfassen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, chimäre Gene bereitzustellen, welche die folgenden operativ verknüpften DNA-Regionen umfassen: einen erfindungsgemäßen Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel; eine heterologe DNA-Region, die für eine interessierende biologisch aktive RNA codiert sowie ein Transkriptionsterminations- und ein Polyadenylierungssignal, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Die biologisch aktive RNA kann für ein interessierendes Protein codieren, wie ein Protein, das, wenn es in den Zellen einer Pflanze exprimiert wird, der Pflanze eine Schädlings- oder Pathogenresistenz verleiht. Die biologisch aktive RNA kann auch eine Antisense-, Sense- oder doppelsträngige RNA sein, die sich für das posttranskriptionale Silencing eines interessierenden Zielgens eignet.
Ebenfalls bereitgestellt werden Pflanzenzellen und Pflanzen oder deren Samen, insbesondere Getreidepflanzen, wie Maispflanzen, die ein erfindungsgemäßes chimäres Gen umfassen.
Noch eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Exprimieren einer biologisch aktiven RNA vorzugsweise in den Wurzeln einer Pflanze, wie einer Maispflanze, das folgende Schritte umfasst: Bereitstellen eines erfindungsgemäßen chimären Gens an die Zellen der Wurzeln dieser Pflanzen; und Heranziehen der Pflanzen.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Promotors mit Bevorzugung für die Maiswurzel für die bevorzugte Expression einer biologisch aktiven RNA in Wurzeln einer Pflanze, wie einer Maispflanze, bereit.
Kurze Beschreibung der Figuren.
1: Alignment der Nukleotidsequenzen für die cDNAs GL4, GL5 und GL12. Lücken, die für ein optimales Alignment in die Sequenz eingeführt wurden, sind mit Bindestrichen gekennzeichnet.
2: Nukleotidsequenz für die kurze Promotorregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel von GL4.
3: Nukleotidsequenz für die lange Promotorregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel von GL4.
4: Schematische Darstellung von pTWV011. LB: linker T-DNA-Rand; 3'nos: 3'-Ende des Opalinsynthase-Gens; Balken: für die Bialaphos-Resistenz codierende Region; P35S3: Promotorregion des 35S-Transkripts von CaMV; 3' 35S: 3'-Ende des 35S-Transkripts von CaMV; isp1a: für das insektizide sezernierte Protein 1a von Brevibacillus laterosporus codierende Region; 5'gl4: Leader-Region der GL4-Promotorregion; Pgl4: für die Maiswurzel selektiver Promotor GL4; isp2a: für das insektizide sezernierte Protein 2a von Brevibacillus laterosporus codierende Region; RB: rechte T-DNA-Rand region; nptl-Homologie: Region mit Homologie zu Helfer-Ti-Plasmiden; ORI colE1: colE1-Replikationsursprung; ORI pVS1: Replikationsursprung für Pseudomonas; PaadA: bakterieller Promotor der Aminoglycosidadenyltransferase, die Resistenz gegen Streptomycin und Spectinomycin verleiht; aadA: codierende Region des Aminoglycosidadenyltransferase-Gens; 3'aadA: 3'-Ende des Aminoglycosidadenyltransferase-Gens.
Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen.
Die Erfindung basiert auf dem Befund, dass die hier beschriebenen Promotoren insbesondere für die bevorzugte und reichliche Expression (d.h. Transkription oder Transkription und Translation) einer operativ verknüpften DNA in Wurzeln von Pflanzen, insbesondere Getreidepflanzen, wie Mais, geeignet sind.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Promotorregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel bereitgestellt, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 von etwa 400 bp umfasst.
Wie hier verwendet, betrifft "Mais" Mais, d.h. Zea mays L.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Promotor" eine beliebige DNA, die von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase während der Initiation der Transkription erkannt und (direkt oder indirekt) gebunden wird. Ein Promotor beinhaltet die Transkriptionsinitiationsstelle und Bindungsstellen für Transkriptionsinitiationsfaktoren sowie RNA-Polymerase und kann verschiedene andere Stellen (z.B. Enhancer) umfassen, an die regulatorische Proteine der Genexpression binden können.
Der Begriff "regulatorische Region", wie hier verwendet, bedeutet eine beliebige DNA, die am Antreiben der Transkription und der Steuerung (d.h. Regulation) des Zeitpunkts und des Spiegels der Transkription einer gegebenen DNA-Sequenz, wie einer für ein Protein oder Polypeptid codierenden DNA, beteiligt ist. Zum Beispiel ist eine 5'-regulatorische Region (oder "Promotorregion") eine DNA-Sequenz, die sich stromaufwärts (d.h. 5') von einer codierenden Sequenz befindet und den Promotor und die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz umfasst. Eine 3'-regulatorische Region ist eine DNA-Sequenz, die sich stromabwärts (d.h. 3') von der codierenden Sequenz befindet und geeignete Signale zur Bildung (und/oder Regulation) des Transkriptions-3'-endes, einschließlich eines oder mehrerer Polyadenylierungssignale, umfasst.
Der Begriff "Gen" bedeutet ein beliebiges DNA-Fragment, das eine DNA-Region (die "transkribierte DNA-Region"), die in ein RNA-Molekül (z.B. eine mRNA) transkribiert wird, in einer Zelle unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Regionen, z.B. einer in Pflanzen exprimierbaren Promotorregion, umfasst. Somit kann ein Gen mehrere operativ verknüpfte DNA-Fragmente, wie einen Promotor, eine 5'untranslatierte Leader-Sequenz, eine codierende Region und eine 3'-untranslatierte Region, die eine Polyadenylierungsstelle umfasst, umfassen. Ein endogenes Pflanzengen ist ein Gen, das man natürlicherweise in einer Pflanzenspezies findet. Ein chimäres Gen ist ein beliebiges Gen, das man normalerweise nicht in einer Pflanzenspezies findet, oder alternativ ein beliebiges Gen, in dem der Promotor nicht in der Natur mit einem Teil der oder der gesamten transkribierten DNA-Region oder zumindest mit einer anderen der regulatorischen Regionen des Gens assoziiert ist.
Der Begriff "Expression eines Gens" betrifft den Vorgang, wobei eine DNA-Region unter der Kontrolle regulatorischer Regionen, insbesondere des Promotors, in eine RNA transkribiert wird, die biologisch aktiv ist, d.h. entweder zur Wechselwirkung mit einer anderen Nukleinsäure in der Lage ist oder in ein biologisch aktives Polypeptid oder Protein translatiert werden kann. Man sagt, dass ein Gen für eine RNA codiert, wenn das Endprodukt der Expression des Gens biologisch aktive RNA, wie eine Antisense-RNA oder ein Ribozym, ist. Man sagt, dass ein Gen für ein Protein codiert, wenn das Endprodukt der Expression des Gens ein biologisch aktives Protein oder Polypeptid ist.
Der Begriff "wurzelselektiv" in Bezug auf die Expression einer erfindungsgemäßen DNA betrifft, zu praktischen Zwecken, die hochspezifische Expression einer DNA in Zellen von Wurzeln von Pflanzen, wie Maispflanzen ("maiswurzelselektiv"). Anders gesagt, sind die Transkriptspiegel einer DNA in anderen Geweben als Wurzelpflanzen entweder unterhalb der Nachweisgrenze oder sehr niedrig (weniger als etwa 0,2 Picogramm pro Mikrogramm Gesamt-RNA).
Der Begriff "mit Bevorzugung für die Wurzel" in Bezug auf die Expression einer erfindungsgemäßen DNA betrifft ein Expressionsmuster, wodurch die DNA hauptsächlich in Wurzeln exprimiert wird, aber eine Expression in anderen Geweben der Pflanze identifiziert werden kann. Vorzugsweise ist die Expression in Wurzeln etwa 2- bis etwa 10-mal höher in Wurzeln als in anderen Geweben.
Es wird deutlich, dass der Fachmann nach dem Lesen dieser Ausführungsformen funktionell äquivalente Promotoren leicht identifizieren und für die gleichen Zwecke verwenden kann.
DNA-Sequenzen mit einer im Wesentlichen ähnlichen Promotoraktivität wie die Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 von dem Nukleotid in Position 1 bis zu dem Nukleotid in Position 338 oder der SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 11 bis zu dem Nukleotid in Position 1196 umfassen, sind diesen Promotoren ähnlich. Diese ähnlichen Promotoren können mit den Promotorregionen mit Bevorzugung für die Maiswurzel, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 oder der SEQ ID Nr. 2 umfassen, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
"Stringente Hybridisierungsbedingungen", wie hier verwendet, bedeutet, dass eine Hybridisierung in der Regel erfolgt, wenn mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Sequenzidentität zwischen der Sonde und der Zielsequenz besteht. Beispiele für stringente Hybridisierungsbedingungen sind eine Inkubation über Nacht in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5x Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte gescherte Träger-DNA, wie Lachssperma-DNA, umfasst, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei etwa 65°C. Andere Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind bekannt und in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY (1989), insbesondere in Kapitel 11, beispielhaft erwähnt.
Andere ähnliche Promotoren umfassen Nukleotidsequenzen, die unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die mindestens etwa 25, vorzugsweise mindestens etwa 50, insbesondere mindestens etwa 100 aufeinander folgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 ausgewählt sind, in einer Polymeraseketten-Amplifikationsreaktion amplifiziert werden können. Beispiele für solche Oligonukleotidprimer sind GVK 29 (SEQ ID Nr. 9) und GVK 30 (SEQ ID Nr. 10).
Ähnliche Promotoren können z.B. aus unterschiedlichen Maisvarietäten isoliert werden. Sie können auch hergestellt werden, indem isolierte Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel mittels Addition, Substitution, Deletion oder Insertion von Nukleotiden modifiziert werden. Sie können auch vollständig oder teilweise synthetisiert werden.
Alternativ können ähnliche Promotoren isoliert werden, indem eine cDNA von einem Transkript, das in einem hohen Spiegel in Wurzeln einer Pflanze, wie einer Maispflanze, exprimiert wird, als Sonde zur Isolation der genomischen DNA stromaufwärts der Nukleotidsequenz, welche der Nukleotidsequenz der cDNA entspricht, verwendet wird. Wie hier verwendet, wird "cDNA" dazu verwendet, sowohl die Erststrang-cDNA (die zu der mRNA komplementär ist) als auch den dazu komplementären Strang (der somit identisch zu der mRNA ist, ausgenommen, dass U durch T ersetzt ist) oder ein doppelsträngiges cDNA-Fragment anzugeben. Maiswurzelselektive cDNAs und ihre entsprechenden genomischen Pflanzen-DNA-Fragmente können wie folgt identifiziert werden:

1) Eine cDNA-Bank kann ausgehend von aus Wurzeln isolierter mRNA konstruiert werden, und die cDNA-Bank kann einem differentiellen Screening unterzogen werden, um eine mRNA zu identifizieren, die bevorzugt in Wurzeln vorliegt, wenn sie mit anderen Pflanzengeweben verglichen wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Blätter, Samen, Stängel, Reproduktionsorgane und dergleichen. Alternativ kann die cDNA-Bank mit Oligonukleotiden gescreent werden, die von einer bestimmten Aminosäuresequenz eines isolierten Proteins abgeleitet sind, das als eines identifiziert wurde, das bevorzugt in den Wurzeln vorliegt. Ferner ist es möglich, die gleichen Oligonukleotide in einem geschachtelten PCR-Ansatz einzusetzen und das (die) amplifizierte(n) Fragment(e) als Sonde für das Screening der Bank einzusetzen. Die cDNA-Bank mit Bevorzugung für die Maiswurzel kann aus einem Pool von mRNAs konstruiert werden, die in verschiedenen Stadien der Maiswurzelentwicklung isoliert wurden. Ein Verfahren zur Identifizierung und Isolation der 3'-Enden von cDNA von RNA, die insbesondere in einem spezifischen Gewebe, wie hier den Wurzeln von Pflanzen, exprimiert wird, ist die so genannte READS-Analyse oder "Restriction Enzyme digested cDNAs", wie z.B. von Prashar und Weismann oder dem US-Patent 5712126 beschrieben (beide Dokumente sind hier durch Bezugnahme aufgenommen).
2) Eine cDNA, die von RNA revers transkribiert wurde, die bevorzugt in Wurzeln von Pflanzen, wie Maispflanzen, transkribiert wird, oder 3'-Enden von cDNAs, die mittels READS-Differential-Display-Analyse als bevorzugt in Wurzeln von Pflanzen exprimiert identifiziert wurden, können isoliert und z.B. mittels Nukleotidsequenzbestimmung weiter charakterisiert werden; eine Volllängen-cDNA kann z.B. unter Verwendung der 5'RACE-Technologie (rapid amplification of cDNA ends) isoliert werden.
3) Diese cDNA oder das 3'-Ende davon kann als Sonde zu Identifizierung und Isolation der Region im Pflanzengenom verwendet werden, welche die Nukleotidsequenz umfasst, die für die mRNA mit Bevorzugung für die Maiswurzel codiert. Alternativ kann die genomische DNA z.B. mittels inverser PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden isoliert werden, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet wurden. Alternativ kann TAIL-PCR (thermal assymetric interlaced PCR, wie von Liu et al. (1995) beschrieben) unter Verwendung geschachtelter langer spezifischer Oligonukleotide, die von der Nukleotidsequenz des (5'-Endes) der identifizierten cDNA stammen, und ein kurzer zufälliger degenerierter Primer zur Isolation der genomischen Sequenzen, welche die codierende Region flankieren, verwendet werden.
4) Gegebenenfalls werden RNA-Sonden konstruiert, die den cDNAs entsprechen, und bei herkömmlicher RNA-RNA-In-situ-Hybridisierungsanalyse [siehe z.B. De Block et al. (1993), Anal. Biochem. 215: 86] verschiedener Pflanzengewebe, einschließlich des interessierenden Wurzelgewebes, zur Bestätigung des bevorzugten Vorliegens der mRNA verwendet, die von dem endogenen Pflanzengen produziert wird, für das eine wurzelspezifische Expression in diesen Wurzeln angenommen wird.

Ist das Gen mit Bevorzugung für die Maiswurzel (d.h. das genomische DNA-Fragment, das für die mRNA mit Bevorzugung für die Maiswurzel codiert, von der die cDNA mit Bevorzugung für die Maiswurzel hergestellt werden kann) erhalten worden, wird die Promotorregion, die den Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel enthält, als die Region stromaufwärts (d.h. 5') von dem Codon bestimmt, das für die erste Aminosäure des Proteins codiert, das von der mRNA codiert wird. Es ist bevorzugt, dass eine solche Promotorregion mindestens etwa 400 bis 500 bp, vorzugsweise mindestens etwa 1000 bp, stärker bevorzugt etwa 1200 bp, insbesondere etwa 1300 bp, ganz besonders mindestens etwa 1500 bis 2000 bp stromaufwärts des Startcodons liegt. Der Einfachheit halber ist bevorzugt, dass eine solche Promotorregion sich nicht über mehr als etwa 3000 bis 5000 bp stromaufwärts des Startcodons erstreckt. Die Fragmentgröße kann teilweise durch das Vorliegen geeigneter Restriktionsstellen bestimmt werden. Der tatsächliche Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel ist die Region der genomischen DNA stromaufwärts (d.h. 5') der Region, welche für die mRNA mit Bevorzugung für die Maiswurzel codiert. Ein chimäres Gen, das einen Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel, operativ verknüpft mit der codierenden Region eines Markergens umfasst, produziert das Markerprotein bevorzugt in den Zellen der Maiswurzeln transgener Maispflanzen, die mittels herkömmlicher histochemischer In-situ-Techniken untersucht werden können.
Beispiele für Gene mit Bevorzugung für die Maiswurzel, von denen Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel erhalten werden können, sind Gene, die für eine mRNA codieren, die bevorzugt in Maiswurzeln nachgewiesen werden kann und eine Größe von etwa 600 nts hat, von der eine cDNA hergestellt werden kann, die das Komplement der Nukleotidsequenz enthält, die der Nukleotidsequenz des Oligonukleotids GVK27 (SEQ ID Nr. 7) entspricht, und/oder das Komplement der Nukleotidsequenz des Oligonukleotids GVK28 (SEQ ID Nr. 8); und/oder das Komplement der Nukleotidsequenz enthält, die dem Oligonukleotid GVK29 (SEQ ID Nr. 9) entspricht, und/oder das Komplement der Nukleotidsequenz enthält, die dem Oligonukleotid GVK30 (SEQ ID Nr. 10) entspricht. Eine solche cDNA mit Bevorzugung für die Maiswurzel kann jede der vorstehend genannten Sequenzen enthalten, die den Oligonukleotiden GVK27 und GVK28 sowie GVK29 oder GVK30 entsprechen.
Ein solches Gen ist das Gen, das für ein Transkript mit Bevorzugung für die Maiswurzel codiert, von dem eine cDNA hergestellt werden kann, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 codiert und die z.B. die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 3 haben kann. Andere Gene mit Bevorzugung für die Maiswurzel sind die Gene, die für eine mRNA mit Bevorzugung für die Maiswurzel codieren, von der eine cDNA hergestellt werden kann, welche die Sequenz der SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 enthält, oder eine Nukleotidsequenz enthält, die für das Protein codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 6 umfasst.
Künstliche Promotoren können konstruiert werden, welche diejenigen internen Abschnitte des Promotors der 5'-regulatorischen Region der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 14 enthalten, welche die Bevorzugung für die Maiswurzel dieses Promotors festlegen. Diese künstlichen Promotoren können einen "Kern-Promotor" oder eine "TATA-Box-Region" eines anderen Promotors enthalten, der zur Expression in Pflanzen in der Lage ist, wie eine CaMV-35S-"TATA-Box-Region", wie in WO 93/19188 beschrieben. Die Eignung von Promotorregionen, die solche künstlichen Promotoren enthalten, kann durch ihre geeignete Fusion mit einem Reportergen und den Nachweis der Expression des Reportergens in de(m/n) angemessenen Gewebe(n) und dem angemessenen Entwicklungsstadium identifiziert werden. Es wird angenommen, dass solche kleineren Promotoren und/oder künstlichen Promotoren, welche diejenigen internen Abschnitte der 5'-regulatorischen Region der SEQ ID Nr. 1 oder 2 umfassen, welche die Bevorzugung für die Maiswurzel festlegen, eine bessere Selektivität der Transkription in Maiswurzelzellen bereitstellen können und/oder erhöhte Spiegel der Transkription der transkribierten Regionen der hier beschriebenen chimären Gene mit Bevorzugung für die Maiswurzel bereitstellen. Solche kleineren Abschnitte der hier beschriebenen Promotorregionen mit Bevorzugung für die Maiswurzel können die Nukleotidsequenzen beinhalten, die eine hohe Homologie zwischen den GL4- und GL5-Promotorregionen gemeinsam haben, wie: die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 1024 bis zu dem Nukleotid in Position 1105 (mit 80% Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 14 von dem Nukleotid in Position 435 bis zu dem Nukleotid in Position 510); die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 866 bis zu dem Nukleotid in Position 994 (mit 77% Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 14 von dem Nukleotid in Position 236 bis zu dem Nukleotid in Position 358); die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 544 bis zu dem Nukleotid in Position 568 (mit 96% Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. Nr. 15 von dem Nukleotid in Position 198 bis zu dem Nukleotid in Position 222); die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 1122 bis zu dem Nukleotid in Position 1143 (mit 73% Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 15 von dem Nukleotid in Position 485 bis zu dem Nukleotid in Position 510).
Neben dem eigentlichen Promotor umfasst die 5'-regulatorische Region der erfindungsgemäßen Gene mit Bevorzugung für die Maiswurzel auch ein DNA-Fragment, das für eine 5'-untranslatierte Leader-(5'-UTL-)Sequenz einer RNA codiert, die sich zwischen der Transkriptionsstartstelle und der Translationsstartstelle befindet. Es wird angenommen, dass die 5'-Transkriptionsstartstelle des GL4-Promotors sich um Position 1197 in der SEQ ID Nr. 2 befindet, was zu einer 5'-UTL von etwa 30 Nukleotiden Länge führt. Es wird angenommen, dass die 5'-Transkriptionsstartstelle des GL5-Promotors sich um Position 1280 in der SEQ ID Nr. 14 befindet, was zu einer 5'-UTL von etwa 30 Nukleotiden Länge führt, es wird ebenfalls angenommen, dass diese Region durch eine andere 5'-UTL, wie die 5'-UTL eines anderen in Pflanzen exprimierbaren Gens, ersetzt werden kann, ohne die Spezifität des Promotors im Wesentlichen zu beeinflussen.
Somit stellt die Erfindung bei einer anderen Ausführungsform einen Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel oder eine Promotorregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel bereit, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 von dem Nukleotid in Position 1 bis zu dem Nukleotid in Position 338 oder die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 vom Nukleotid in Position 11 bis zu dem Nukleotid in Position 1196 oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität dazu umfasst.
Für den Zweck der Erfindung betrifft die "Sequenzidentität" zweier verwandter Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, ausgedrückt in Prozent, die Anzahl an Positionen in den beiden optimal aneinander ausgerichteten Sequenzen, die identische Reste besitzen (x 100), dividiert durch die Anzahl an verglichenen Positionen. Eine Lücke, d.h. eine Position in einem Alignment, an der ein Rest in der einen Sequenz, aber nicht in der anderen vorhanden ist, wird als Position mit nicht-identischen Resten angesehen. Das Alignment der zwei Sequenzen erfolgt durch den Needleman-und-Wunsch-Algorithmus (Needleman und Wunsch 1970). Das vorstehende computergestützte Sequenzalignment kann leicht unter Verwendung eines Standardsoftwareprogramms, wie GAP, das Teil des Wisconsin-Pakets Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA) ist, unter Verwendung der Default-Scoring-Matrix mit einer Lückenerzeugungsstrafe von 50 und einer Lückenerweiterungsstrafe von 3.
Es muss nicht extra erwähnt werden, dass erfindungsgemäße Promotoren und Promotorregionen auch zusätzliche Elemente umfassen können, von denen bekannt ist, dass sie die Transkriptionseffizienz steigern, wie Enhancer, Introns usw.
Die Erfindung beinhaltet ferner DNA-Moleküle, welche die erfindungsgemäßen Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel, operativ verknüpft mit einer oder mehreren heterologen Regionen, die für eine biologisch aktive RNA, ein biologisch aktives Peptid oder Protein codieren, umfassen. Die erfindungsgemäßen Promotoren können zur Expression jeder gewünschten heterologen codierenden Region verwendet werden.
Somit wird bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ein chimäres Gen bereitgestellt, das folgendes umfasst

a) eine Promotorregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 von dem Nukleotid in Position 1 bis zu dem Nukleotid in Position 338 oder die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 11 bis zu dem Nukleotid in Position 1196 oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität dazu umfasst;
b) eine interessierende DNA-Region, die, wenn sie transkribiert wird, eine biologisch aktive RNA ergibt; und
c) eine DNA-Region, die ein in Pflanzenzellen funktionelles 3'-Transkriptionsterminations- und -Polyadenylierungssignal umfasst.

Die interessierende DNA-Region oder die transkribierte RNA können somit für ein Protein oder Polypeptid codieren, können aber auch für biologisch aktive RNA codieren, wie eine Antisense-RNA, eine Sense-RNA oder eine dsRNA, die sowohl Sense- als auch Antisense-RNA-Abfolgen umfasst, die zur Basenpaarung und zur Bildung doppelsträngiger RNA in der Lage sind, wie in WO 99/53050 beschrieben (hier durch Bezugnahme aufgenommen), die für das posttranskriptionale Gen-Silencing einer Zielsequenz verwendbar ist.
Um Pflanzen, wie Maispflanzen, auf wurzelselektive Weise oder auf eine Weise mit Bevorzugung für die Wurzel, eine Maiswurzelbohrer-Resistenz, vorzugsweise eine Resistenz gegen Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpuncata, Diabrotica virgifera, zu verleihen, beinhalten geeignete Kandidaten-DNA-Regionen, die mit den erfindungsgemäßen maiswurzelselektiven Promotoren operativ verknüpft werden sollen, das reife VIP1Aa-Protein, wenn es mit dem reifen VIP2Aa- oder VIP2Ab- Protein der PCT-Veröffentlichung WO 96/10083 kombiniert ist; die Maiswurzelbohrer-Toxine von Photorhabdus oder Xhenorhabdus spp., z.B. die insektiziden Proteine von Photorhabdus luminescens W-14 (Guo et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 9836-9842); das CryET70-Protein der WO 00/26378 ; die von den Bt-Stämmen PS80JJ1, PS149B1 und PS167H2 produzierten insektiziden Proteine, wie in WO 97/40162 beschrieben, insbesondere die etwa 14 kD und etwa 44 kD großen Proteine des Bt-Stamms PS149B1; das Cry3Bb-Protein des US-Patents 6,023,013 ; Proteaseinhibitoren, wie die N2- und R1-Cysteinproteinaseinhibitoren aus Sojabohne (Zhao et al., 1996, Plant Physiol. 111, 1299-1306) oder Oryzastatin, wie Reis-Cystatin (Genbank-Eintrag S49967), Mais-Cystatin (Genbank-Einträge D38130, D10622, D63342), wie das von Irie et al. (1996, Plant Mol. Biol. 30, 149-157) beschriebene in Pflanzen exprimierte Mais-Cystatin. Ebenfalls eingeschlossen sind alle Äquivalente und Varianten, wie verkürzte Proteine, welche die insektizide Aktivität beibehalten, von jedem der vorstehenden Proteine.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung umfassen chimäre Gene zum Verleihen einer Wurzelbohrer-Resistenz auf eine Weise mit Bevorzugung für die Wurzel eine Nukleotidsequenz, die ein insektizides sezerniertes Protein (ISP) von Brevibacillus laterosporus codiert, das insektizid ist, wenn es von einem Insekt in Kombination mit einem ISP-komplementären Protein, wie einem anderen ISP-Protein, aufgenommen wird, wie in der PCT-Anmeldung PCT/EP01/05702 , veröffentlicht als WO 01/87931 , beschrieben (insbesondere die DNA-Sequenzen SEQ ID Nr. 7 und 9 der WO 01/87931 ). Bei den Nukleotidsequenzen, die ISP-Protein codieren, kann es sich um eine modifizierte DNA handeln.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zum Exprimieren einer interessierenden fremden DNA, vorzugsweise in den Wurzeln einer Pflanze, wie einer Maispflanze, bereit, die folgende Schritte umfassen:

a) Bereitstellen der erfindungsgemäßen chimären Gene an Pflanzenzellen, vorzugsweise stabil in deren Genom, insbesondere deren Kerngenom, integriert, um transgene Zellen zu erzeugen;
b) Regenerieren von Pflanzen aus diesen transgenen Zellen.

Eine geeignete Weise zum Bereitstellen der erfindungsgemäßen chimären Gene an Pflanzenzellen ist das Einbringen der DNA über herkömmliche Transformationsverfahren. Es wird deutlich, dass das tatsächliche Verfahren zum Transformieren der Pflanzen, insbesondere Getreidepflanzen, für die hier beschriebenen Verfahren von geringer Bedeutung ist, und mehrere Verfahren zum Einbringen fremder DNA in das Genom von Pflanzenzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf direkte Protoplastentransformation (siehe z.B. für Mais US 5792936 ), Agrobacteriumvermittelte Transformation (siehe z.B. für Mais US 6074877 oder US 6140553 ), Mikroprojektilbeschuss, Elektroporation kompakter embryogener Kalli (siehe z.B. für Mais US 5641664 ) oder Silizium-Whisker-vermittelte DNA-Einführung, sind im Stand der Technik verfügbar.
Die operative Verknüpfung der interessierenden fremden DNA mit einem erfindungsgemäßen Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel kann auch durch Ersetzen der DNA, die natürlicherweise mit dem Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel assoziiert ist, durch homologe Rekombination mit der interessierenden DNA erzielt werden, vorausgesetzt, dass diese interessierende DNA eine Homologieregion mit der DNA besitzt, die normalerweise mit dem Promotor mit Bevorzugung für die Maiswurzel assoziiert ist. Verfahren zum Einbringen interessierender DNA in das Pflanzenzellgenom durch homologe Rekombination sind verfügbar (z.B. US-Patent 5744336 ).
Die erhaltene transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Züchtungsschema zur Produktion von mehr transformierten Pflanzen mit den gleichen Merkmalen oder zum Einbringen des erfindungsgemäßen chimären Gens für die Expression mit Bevorzugung für die Maiswurzel in andere Varietäten derselben oder einer verwandten Pflanzenspezies oder in Hybridpflanzen verwendet werden. Von den transformierten Pflanzen erhaltene Samen enthalten die erfindungsgemäßen Chimären Gene als stabiles genomisches Insert und sind von der Erfindung mit umfasst.
Man erkennt, dass die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren insbesondere für Mais geeignet sind, aber auch bei anderen Pflanzen, insbesondere bei Getreidepflanzen, einschließlich Mais-, Weizen-, Hafer-, Gerste-, Roggen-, Reis-, Rasengras-, Sorghum-, Hirse- oder Zuckerrohrpflanzen, mit ähnlichen Wirkungen angewendet werden können.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschreiben die Isolation von Promotoren mit Bevorzugung für die Maiswurzel und die Konstruktion chimärer Gene für die selektive Expression in Maiswurzelpflanzen. Wenn in den Beispielen nicht anders angegeben, werden sämtliche DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standardprotokollen ausgeführt, wie beschrieben in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, und in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardmaterialien und -verfahren für Pflanzemolekulararbeiten sind beschrieben in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R.D.D. Croy, gemeinsam von BIOS Scientific Publications Ltd (GB) und Blackwell Scientific Publications, GB, veröffentlicht.
In der gesamten Beschreibung und den Beispielen wird auf die folgenden Sequenzen Bezug genommen, die im Sequenzprotokoll angegeben sind:
SEQ ID Nr. 1: Nukleotidsequenz des etwa 400 bp langen Promotors mit Bevorzugung für die Maiswurzel (GL4-Promotor)
SEQ ID Nr. 2: Nukleotidsequenz des etwa 1200 bp langen Promotors mit Bevorzugung für die Maiswurzel (GL4-Promotor)
SEQ ID Nr. 3: Nukleotidsequenz der cDNA der natürlicherweise assoziierten mRNA, die unter der Kontrolle des Promotors mit Bevorzugung für die Maiswurzel mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 (GL4) transkribiert wird
SEQ ID Nr. 4: Aminosäuresequenz des Proteins, das von der GL4-cDNA codiert wird.
SEQ ID Nr. 5: Nukleotidsequenz der cDNA GL5 mit Bevorzugung für die Maiswurzel.
SEQ ID Nr. 6: Aminosäuresequenz des Proteins, das von der GL5-cDNA codiert wird.
SEQ ID Nr. 7: Oligonukleotidprimer GVK 27.
SEQ ID Nr. 8: Oligonukleotidprimer GVK 28.
SEQ ID Nr. 9: Oligonukleotidprimer GVK 29.
SEQ ID Nr. 10: Oligonukleotidprimer GVK 30.
SEQ ID Nr. 11: Nukleotidsequenz der cDNA GL12 mit Bevorzugung für die Maiswurzel.
SEQ ID Nr. 12: Nukleotidsequenz des Plasmids pTWV011
SEQ ID Nr. 13: Nukleotidsequenz des Plasmids pTWV018
SEQ ID Nr. 14: Nukleotidsequenz des etwa 1300 bp langen Promotors mit Bevorzugung für die Maiswurzel (GL5-Promotor)
SEQ ID Nr. 15: Oligonukleotidprimer GVK22
SEQ ID Nr. 16: Oligonukleotidprimer GVK23
SEQ ID Nr. 17: Oligonukleotidprimer GVK24
SEQ ID Nr. 18: Oligonukleotidprimer GVK25
SEQ ID Nr. 19: Oligonukleotidprimer GVK26
SEQ ID Nr. 20: Oligonukleotidprimer GVK31
SEQ ID Nr. 21: Oligonukleotidprimer GVK32
SEQ ID Nr. 22: Oligonukleotidprimer GVK33
SEQ ID Nr. 23: Oligonukleotidprimer GVK38
SEQ ID Nr. 24: Oligonukleotidprimer GVK39
SEQ ID Nr. 25: Oligonukleotidprimer GVK45
SEQ ID Nr. 26: Oligonukleotidprimer MDB285
SEQ ID Nr. 27: Oligonukleotidprimer MDB286
SEQ ID Nr. 28: Oligonukleotidprimer MDB363
SEQ ID Nr. 29: Oligonukleotidprimer MDB364
SEQ ID Nr. 30: Oligonukleotidprimer MDB552
SEQ ID Nr. 31: Oligonukleotidprimer MDB556
BEISPIELE
Beispiel 1. Isolation von Mais-cDNAs mit Bevorzugung für die Wurzel
In diesem Bezugsbeispiel wurden RNA-Transkript-Tags, die vorzugsweise in Maiswurzeln exprimiert werden, durch ein differentielles RNA-cDNA-Display identifiziert, das als READS bekannt ist (Prashar und Weismann, 1999, Methods in Enzymology 303: 258-272).
Zu diesem Zweck wurden Gesamt-RNA-Proben aus verschiedenen Geweben (Wurzeln, Stängeln, Blättern, ..) von Maispflanzen hergestellt, in verschiedenen Entwicklungsstadien geerntet (von 64 Tage alten Pflanzen bis zu adulten Pflanzen). 3'-Ende-Fragmente von cDNA-Molekülen, die mit verschiedenen Endorestriktionsnukleasen gespalten wurden, wurden unter Verwendung von stringenten PCR-Bedingungen und Oligonukleotiden, wie von Prashar und Weismann (1999, siehe oben) beschrieben, für jede der Proben amplifiziert.

Ein Vergleich der Gelmuster der für jede der RNA-Proben hergestellten 3'-Ende-cDNA-Restriktionsfragmente gestattete eine vorläufige Identifikation von Fragmenten, die nur in der RNA-Probe aus Maiswurzelgewebe auftraten oder in Wurzelgewebe-RNA stärker vertreten waren als in anderen Maisgeweben. Diese 3'-Ende-Fragmente wurden isoliert und sequenziert. Ihre Nukleotidsequenz wurde mit öffentlichen und privaten Datenbanken verglichen, und nur neue Sequenzen wurden in einer weiteren Northern-Analyse unter Verwendung der RNA-Sonden aus verschiedenen Maisgeweben als Treiber und jedem der isolierten 3'-Ende-cDNA-Fragmente als Sonde verwendet. Die hybridisierenden RNA-Transkripte wurden hinsichtlich Größe, Häufigkeit und Spezifität analysiert. Die Ergebnisse für das 3'-Ende mit der besten Spezifität für die Expression in Maiswurzeln sind in Tabelle 1 zusammengefasst, angeordnet in abnehmender Reihenfolge von Spezifität und Häufigkeit. Tabelle 1.

Identifikation des als Sonde verwendeten 3'-Endes	Quantifizierung des hybridisierenden Transkripts¹	geschätzte Länge des hybridisierenden Transkripts²	Spezifität des Vorliegens des hybridisierenden Transkripts
GL4	18	etwa 600	wurzelselektiv
GL5	15	etwa 600	wurzelselektiv
GL12	13	etwa 600	wurzelselektiv
GL11	3	etwa 820	wurzelselektiv
GL3	1	etwa 1200	wurzelselektiv
GL9	7	etwa 900	mit Bevorzugung für die Wurzel
GL7	2	etwa 700	mit Bevorzugung für die Wurzel
GL16	< 2	etwa 1500	niedrige Expression
GL17	< 2	etwa 650	niedrige Expression
GL6	-	-	keine sichtbare Hybridisierung
¹ausgedrückt in Picogramm/μg Gesamt-RNA
²in Nukleotiden

Die 3'-Enden, die mit den häufigsten RNA-Transkripten mit der höchsten spezifischen Expression in Maiswurzeln (GL4; GL5 und GL12) hybridisierten, wurden weiter analysiert.
Für GL4 und GL5 wurden Volllängen-cDNAs unter Verwendung des SMART^TM-RACE-cDNA-Amplifikationskits von CLONTECH Laboratories mit den geschachtelten Oligonuk leotidprimern GVK22 (SEQ ID Nr. 15)/GVK23 (SEQ ID Nr. 16) für GL4 sowie GVK24 (SEQ ID Nr. 17)/GVK25 (SEQ ID Nr. 18) für GL5 isoliert. Die Nukleotidsequenz der Volllängen-cDNAs ist in SEQ ID NR. 3 bzw. 5 dargestellt. Ein Vergleich beider Nukleotidsequenzen zeigte, dass GL4 und GL5 etwa 89% Sequenzidentität aufweisen.
In beiden Sequenzen konnte ein kleiner ORF (beginnend bei dem Nukleotid der SEQ ID NR. 3 in Position 32 bis zu dem Nukleotid in Position 319 für GL4; bei dem Nukleotid der SEQ ID NR. 5 in Position 27 bis zu dem Nukleotid in Position 307 für GL5) identifiziert werden. Die Aminosäuresequenzen der Polypeptide, die von den ORFs codiert werden, sind in SEQ ID Nr. 4 bzw. 6 angegeben. Der Nukleotidsequenz in der Region, die für den ORF codiert, ist zwischen GL4- und GL5-cDNA stärker konserviert als an anderen Stellen in den Fragmenten.
Unter Verwendung der GL4-cDNA-Nukleotidsequenz als Abfrage wurde eine Nukleotidsequenz mit 91% Sequenzidentität in der 322 Nukleotide langen Überlappung identifiziert (SEQ ID Nr. 19 aus WO 00/32799 ). Es ist nicht beschrieben, dass SEQ ID Nr. 19 aus Zea mays, wie in WO 00/32799 beschrieben, auf eine wurzelselektive Weise oder eine Weise mit Bevorzugung für die Wurzel transkribiert wird. Ferner hat man eine Nukleotidsequenz (Klon MEST23-CO7.T3 aus einer Setzling- und Seiden-cDNA-Bank) identifiziert, die 99% Sequenzidentität über 582 nt aufweist.
Unter Verwendung der GL5-cDNA-Nukleotidsequenz als Abfrage ist eine Nukleotidsequenz mit 85% Sequenzidentität zu einer mit FtsZ1 verwandten Seq. aus Zea mays (A47325 in Geneseq) identifiziert worden. Es ist nicht beschrieben, dass diese Sequenz auf eine wurzelselektive Weise oder eine Weise mit Bevorzugung für die Wurzel transkribiert wird. Ferner hat man eine Nukleotidsequenz (Klon MEST523-G12 (3') aus einer Setzling- und Seiden-cDNA-Bank) identifiziert, die 100% Sequenzidentität über 525 nt aufweist.
Beispiel 2. Isolation von Promotorregionen mit Bevorzugung für die Maiswurzel aus dem Gen, das eine mRNA transkribiert, deren cDNA GL4- oder GL5-cDNA entspricht.
Die genomischen Fragmente stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, die GL4-cDNA- und GL5-cDNA-Sequenzen (Letztere nur als Referenz) entsprechen, welche die Promotorregion umfassen, wurden unter Verwendung von Thermal-Asymmetric-Interlaced-PCR, wie von Liu et al. (1995, The Plant Journal 8 (3): 457-463) beschrieben, isoliert.
Genomische Mais-DNA für die Verwendung als anfängliche Matrizen-DNA wurde gereinigt, wie von Dellaporte et al. beschrieben. Die Sequenz der spezifischen geschachtelten Oligonukleotide, die für die TAIL-PCR zur Isolation der genomischen Fragmente stromaufwärts der genomischen DNA-Sequenzen, die GL4-cDNA-Sequenzen entsprechen, verwendet wurden, sind in SEQ ID Nr. 7 (GVK27), SEQ ID Nr. 8 (GVK28) und SEQ ID Nr. 9 (GVK 29) dargestellt; die verwendeten unspezifischen degenerierten Primer waren jeder der 6 degenerierten Primer MDB285, MDB286, MDB363, MDB364, MDB552 oder MDB556 in getrennten Reaktionen. Die PCR-Bedingungen waren wie in Liu et al. (1995, siehe oben) beschrieben.
Ein genomisches Fragment von etwa 400 bp (das dem Amplifikationsprodukt entsprach, das mit dem Primerpaar (GVK29/MDB285) erhalten wurde) wurde isoliert, in pGEM-T Easy^® kloniert und sequenziert.
Auf Basis der Nukleotidsequenz des etwa 400 bp langen Fragments wurden neue spezifische geschachtelte Primeroligonukleotide (GVK 31/SEQ ID Nr. 20; GVK32/SEQ ID Nr. 21 und GVK33/SEQ ID Nr. 22) gestaltet und in Verbindung mit den oben beschriebenen degenerierten Primern zur Isolation der benachbarten DNA-Regionen weiter stromaufwärts des isolierten Promotorregionfragments verwendet. Dies führte zur Isolation eines etwa 350 nt langen DNA-Fragments (das dem Amplifikationsprodukt entsprach, das mit dem Primerpaar GVK33/MDB286 erhalten wurde). In einer dritten Runde wurde das benachbarte stromaufwärts gelegene DNA-Fragment von etwa 800 nt unter Verwendung eines neuen Satzes spezifischer geschachtelter Oligonukleotide GVK33/SEQ ID Nr. 22; GVK38/SEQ ID Nr. 23 und GVK39/SEQ ID Nr. 24 in Verbindung mit den oben genannten degenerierten Primern isoliert (es entsprach dem Amplifikationsprodukt unter Verwendung von GVK39 und MDB363)
Zur Bestätigung, dass die isolierten genomischen stromaufwärts gelegenen Fragmente kontinuierlich waren, wurde das vollständige 1200 bp lange DNA-Fragment unter Verwendung der Primer GVK29 und GVK45 (SEQ ID Nr. 25) amplifiziert und in pGEM-T Easy^® kloniert. Die vollständige Nukleotidsequenz des etwa 1200 bp langen stromaufwärts gelegenen DNA-Fragments ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Die Primer GVK 27, GVK28 und GVK30 (SEQ ID Nr. 10) wurden in Verbindung mit den oben genannten degenerierten Primern verwendet. Ein etwa 1300 nt langes Fragment mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 14 (das dem Amplifikationsprodukt mithilfe von MDB364 und GVK30 entsprach) wurde amplifiziert.
Beispiel 3. Konstruktion chimärer Gene unter Verwendung der isolierten GL4/GL5-Promotorregionen mit Bevorzugung für die Maiswurzel.
Die folgenden Chimären ISP1A/ISP2A-Konstrukte unter der Kontrolle der GL4-Promotorregion oder unter der Kontrolle der GL5-Promotorregion (die Letztere nur als Referenz) wurden unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt:
GL4::ISP1A, das folgende DNA-Fragmente umfasste:

• die GL4-Promotorregion (SEQ ID Nr. 2)
• ein DNA-Fragment, das für das isp1A-Protein von Brevibacillus laterosporus codiert (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12 von dem Nukleotid in Position 2003 bis zu dem Nukleotid in Position 4511);
• das 3'-Ende-Fragment des 35S-Transkripts (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12 von dem Nukleotid in Position 1767 bis zu dem Nukleotid in Position 1991).

• die GL4-Promotorregion (SEQ ID Nr. 2)
• ein DNA-Fragment, das für das isp2A-Protein von Brevibacillus laterosporus codiert (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12 von dem Nukleotid in Position 6001 bis zu dem Nukleotid in Position 7228);
• das 3'-Ende-Fragment des 35S-Transkripts (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12 von dem Nukleotid in Position 5765 bis zu dem Nukleotid in Position 5989).

• die GL5-Promotorregion (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 13 von dem Nukleotid in Position 4518 bis zu dem Nukleotid in Position 5822)
• ein DNA-Fragment, das für das isp1A-Protein von Brevibacillus laterosporus codiert (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 13 von dem Nukleotid in Position 2003 bis zu dem Nukleotid in Position 4511);
• das 3'-Ende-Fragment des 35S-Transkripts (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 13 von dem Nukleotid in Position 1767 bis zu dem Nukleotid in Position 1991).

• die GL5-Promotorregion (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 13 von dem Nukleotid in Position 8628 bis zu dem Nukleotid in Position 7324)
• ein DNA-Fragment, das für das isp2A-Protein von Brevibacillus laterosporus codiert (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12 von dem Nukleotid in Position 6090 bis zu dem Nukleotid in Position 7317);
• das 3'-Ende-Fragment des 35S-Transkripts (das Komplement der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12 von dem Nukleotid in Position 5765 bis zu dem Nukleotid in Position 5989).

Beispiel 4. Expressionsanalyse chimärer Gene, welche die GL4- und GL5-Promotoren umfassen, in stabil transformierten Maispflanzen.
Die im Beispiel 3 beschriebenen chimären Gene wurden zusammen mit einem chimären bar-Gen (wie im US-Patent 5,561,236 beschrieben) in einen T-DNA-Vektor eingebracht, so dass pTWV011 (GL4-Promotorkonstrukte) und pTWV018 (GL5-Promotorkonstrukte; nur als Referenz) erhalten wurden. Diese T-DNA-Vektoren wurden in Agrobacterium tumefaciens eingebracht, welches das Helfer-Ti-Plasmid pGV4000 oder pEHA101 enthielt.
Stabil mit den erwähnten chimären Genen transformierte Maispflanzen wurden unter Verwendung der in US 6,140,553 beschriebenen Agrobacteriumvermittelten Transformationstechnik erhalten.
Stabil mit den erwähnten chimären Genen transformierte Maispflanzen können auch unter Verwendung von direkter DNA-Zufuhr an Maisprotoplasten, wie in US 5,767,367 beschrieben, erhalten werden.
RNA wurde aus Wurzel-, Blatt- und Stängelgewebe dieser Maispflanzen isoliert (die entweder in vitro oder in vivo herangezogen wurden) und einer Northern-Analyse unter Verwendung einer ISP1A-spezifischen Sonde unterzogen. Die einzelnen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Zusammengefasst lässt sich sagen, dass nach Korrektur hinsichtlich der Beladung durch Hybridisierung mit einer ribosomalen RNA-Sonde die GL5-Promotorregion durchschnittlich 11-mal mehr Transkrip tion in Wurzeln als in Blättern und 19-mal mehr in Wurzeln als in Stängeln einleitete. Die GL4-Promotorregion leitet durchschnittlich 2-mal mehr Transkription in Wurzeln als in Blättern und mehr als 10-mal mehr in Wurzeln als in Stängeln ein (obwohl einzelne Transformanten ein ausgeprägteres maiswurzelselektives Expressionsmuster zeigen können). Tabelle 1. Zusammenfassung von GL4/GL5- Transkritionsdaten

		Mittelwert	SD
		n = 3
G14-Promotor	Wurzel	1,25	1,18	Wurzel/Blatt	2
	Blatt	0,61	0,73	Wurzel/Stängel	> 10
	Stängel	< 0,06
G15-Promotor	Wurzel	1,32	0,24	Wurzel/Blatt	11
	Blatt	0,12	0,05	Wurzel/Stängel	19
	Stängel	0,07	0,03

Tabelle 2. Zusammenfassung von Northern-Analyse-Daten

Beispiel 5. Expressionsanalyse chimärer Gene, welche die GL4- und GL5-Promotoren umfassen, in Nachkommen stabil transformierter Maispflanzen.
Neun transgene T0-Linien von jeder der Maispflanzen des Beispiels 4, die den GL4- und GL5-Promotor (Letzteren nur als Referenz) enthalten, wurden mit untransformierten B73 gekreuzt, und die T1-Pflanzen wurden mittels Southern-Blot, Northern-Blot und ELISA-Assay hinsichtlich des Vorliegens von ISP1-mRNA oder -Protein in verschiedenen Pflanzenteilen analysiert.
Die Southern-Analyse wurde im V4-Stdium durchgeführt, um die Kopienzahl des Transgens zu bestimmen. Alle analysierten Ereignisse waren Einzelkopieereignisse, mit Ausnahme von zwei Linien, die 2 Kopien des Transgens enthielten.
Die Northern-Analyse erfolgte an RNA, die aus Wurzel-, Blatt- und Stängelmaterial stammte, das im V11-V13-Stadium erhalten wurde, wie im Beispiel 4. Die Transkriptspiegel wurden unter Verwendung von Bildquant-Analyse quantifiziert. Eine Korrektur hinsichtlich Beladungsunterschieden wurde unter Verwendung einer ribosomalen Sonde durchgeführt.
Für die Pflanzen mit dem Transgen, das den GL4-Promotor enthielt, wurde die isp1-mRNA auf zwischen 0,17 bis 0,74 p^g/μ^g Gesamt-RNA abgeschätzt. Der durchschnittliche isp1a-mRNA-Spiegel in Wurzeln (n = 9) betrug 0,42 pg/μg ges. RNA (SE = 0,18). Das durchschnittliche Verhältnis (n = 9) von isp1a-mRNA in Wurzel gegenüber Blatt beträgt > 6,3. Das durchschnittliche Verhältnis (n = 8) von isp1a-mRNA in Wurzel gegenüber Stängel beträgt > 7,1. Keine Expression wurde in Stängel beobachtet, mit Ausnahme einer Probe, bei der das Verhältnis Wurzel/Stängel 1,9 betrug.
Für die Pflanzen mit dem Transgen, das den GL5-Promotor enthielt, wurde die isp1-mRNA auf zwischen 0,95 bis 2,55 p^g/μ^g Gesamt-RNA abgeschätzt. Der durchschnittliche isp1a-mRNA-Spiegel in Wurzeln (n = 9) betrug 1,57 p^g/μ^g ges. RNA (SE = 0,53). Das durchschnittliche Verhältnis (n = 9) von isp1a-mRNA in Wurzel gegenüber Blatt beträgt > 17,6 Das durchschnittliche Verhältnis (n = 8) von isp1a-mRNA in Wurzel gegenüber Stängel beträgt > 26,6. Keine Expression wurde in Stängel beobachtet.
Im V8-Stadium geerntetes Wurzel-, Blatt- und Stängelmaterial wurde auf Proteinebene hinsichtlich des Vorliegens von ISP1a-Protein mittels ELISA analysiert. Es wurden zwei Pflanzen pro Ereignis analysiert. Als negative Kontrolle wurden Wurzel, Blatt und Stängel für wtB73 hinsichtlich ISP1A-Protein überprüft. Kein ISP1A-Protein wurde in den Kontrollexperimenten nachgewiesen.
Bei allen Ereignissen wurde keine ISP1A-Proteinexpression in Blättern oder Stängel nachgewiesen. Die Mittelwerte der in Wurzeln nachgewiesenen Spiegel an ISP1A-Protein waren:

– 0,07 pg/ml, was etwa 0,024% des Gesamt-Proteinspiegels entspricht (n = 18) für Wurzeln von Pflanzen, die das GL4-Promotor-angetriebene Transgen enthalten.
– 0,12 pg/ml, was etwa 0,041% des Gesamt-Proteinspiegels entspricht (n = 18) für Wurzeln von Pflanzen, die das GL5-Promotor-angetriebene Transgen enthalten.

Im Blütestadium geerntetes Wurzel-, Blatt-, Stängel- und Pollenmaterial wurde auf der Proteinebene hinsichtlich des Vorliegens von ISP1a-Protein mittels ELISA analysiert. Es wurde eine Pflanze pro Ereignis analysiert. Als negative Kontrolle wurde Wurzel-, Blatt-, Stängel- und Pollenmaterial für wtB73 hinsichtlich ISP1A-Protein überprüft. Kein ISP1A-Protein wurde in den Kontrollexperimenten nachgewiesen.
Bei allen Ereignissen wurde keine ISP1A-Proteinexpression in Pollen nachgewiesen. In Wurzel, Blatt und Stängel von Pflanzen, die das GL4-Promotorangetriebene Transgen enthielten, nachgewiesener mittlerer ISP1A-Proteinspiegel: Mittelwert (n = 9):

– Wurzel: 0,286 μg isp1a/ml ~ 0,116% isp1a des ges.
Proteinspiegels
– Blatt: 0,018 μg isp1a/ml ~ 0,0022% isp1a des ges.
Proteinspiegels (6% des Wurzelspiegels)
– Stängel: 0,020 μg isp1a/ml ~ 0,0043% isp1a des ges. Proteinspiegels (7% des Wurzelspiegels)

In Wurzel, Blatt und Stängel von Pflanzen, die das GL5-Promotor-angetriebene Transgen enthielten, nachgewiesener mittlerer ISP1A-Proteinspiegel:
Mittelwert (n = 9):

– Wurzel: 0,265 μg isp1A/ml ~ 0,142% isp1a des ges. Proteinspiegels
– Blatt: 0,013 μg isp1A/ml ~ 0,0015% isp1a des ges. Proteinspiegels (5% des Wurzelspiegels)
– Stängel: 0,024 μg isp1A/ml ~ 0,0058% isp1a des ges. Proteinspiegels (9% des Wurzelspiegels)

Beim Samenansatz wurde der ISP1A-Proteinspiegel in Körnern der transgenen Pflanzen bestimmt. Kein ISP1A-Protein konnte in Samen der transgenen Pflanzen, noch in der wtB73-Kontrolle nachgewiesen werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Promoterfragment mit Bevorzugung für die Maiswurzel, das die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 von dem Nukleotid in Position 1 bis zu dem Nukleotid in Position 338 oder SEQ ID Nr. 2 von dem Nukleotid in Position 11 bis zu dem Nukleotid in Position 1196 oder eine Nukleotidsequenz mit mindestens 95% Sequenzidentität dazu umfaßt.
Promoterregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel, die einen Promoter mit Bevorzugung für die Maiswurzel nach Anspruch 1 umfaßt.
Promoterregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel nach Anspruch 2, die weiterhin die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 von dem Nukleotid in Position 339 bis zu dem Nukleotid in Position 366 umfaßt.
Promoterregion mit Bevorzugung für die Maiswurzel nach Anspruch 2, die weiterhin die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 14 von dem Nukleotid in Position 1281 bis zu dem Nukleotid in Position 1308 umfaßt.
Chimäres Gen, das die folgenden operativ verknüpften DNA-Regionen umfaßt: a) einen Promoter mit Bevorzugung für die Maiswurzel nach Anspruch 1; b) eine heterologe DNA-Region, die für eine interessierende biologisch aktive RNA codiert; und c) ein Transkriptionsterminations- und Polyadenylationssignal.
Chimäres Gen nach Anspruch 5, wobei die biologisch aktive RNA für ein interessierendes Protein codiert.
Chimäres Gen nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Protein um ein Protein handelt, das, wenn es in den Zellen exprimiert wird, dieser Pflanze Schädlings- oder Pathogenresistenz verleiht.
Chimäres Gen nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Protein um ISPA1 oder ISPA2 aus Brevibacillus laterosporus handelt.
Pflanzenzelle, die ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 5 bis 8 umfaßt.
Pflanze, die in ihren Zellen ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 5 bis 8 umfaßt.
Pflanze nach Anspruch 10, bei der es sich um eine Maispflanze handelt.
Samen einer Pflanze, die in ihren Zellen ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 5 bis 8 umfaßt.
Verfahren zum Exprimieren einer biologisch aktiven RNA, vorzugsweise in den Wurzeln einer Pflanze, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Bereitstellen eines chimären Gens nach einem der Ansprüche 5 bis 8 an die Zellen der Wurzeln dieser Pflanze; und b) Heranziehen dieser Pflanzen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei der Pflanze um eine Maispflanze handelt.
Verwendung eines Promoters mit Bevorzugung für die Maiswurzel nach Anspruch 1 für die bevorzugte Expression einer biologisch aktiven RNA in Wurzeln einer Pflanze.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei es sich bei der Pflanze um eine Maispflanze handelt.