DE60310944T2 - Neue formen von interferierenden rns-molekülen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Ribonukleinsäure umfassend eine doppel-strängige Struktur, wobei die doppel-strängige Struktur einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei der erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst und wobei der erste Abschnitt wenigstens teilweise komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, die Verwendung einer derartigen Ribonukleinsäure, eine Zelle bzw. ein Organismus, der eine derartige Ribonukleinsäure umfasst, eine Zusammensetzung, die eine derartige Ribonukleinsäure umfasst, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine derartige Ribonukleinsäure umfasst, und ein Verfahren zum Inhibieren der Expression eines targetierten Gens.
  • RNA-vermittelte Interferenz (RNAi) ist ein post-translationeller Gen-Abschaltmechanismus, der durch doppel-strängige RNA (dsRNA), die hinsichtlich ihrer Sequenz zu dem abgeschalteten Gen homolog ist, initiiert wird. (Fire (1999), Trends Genet 15, 358-63, Tuschl, et al. (1999), Genes Dev 13, 3191-7, Waterhouse, et al. (2001), Nature 411, 834-42, Elbashir, et al. (2001), Nature 411, 494-8, für eine Übersicht siehe Sharp (2041), Genes Dev 15, 485-90, Barstead (2001), Curr Opin Chem Biol 5, 63-6). RNAi ist intensive verwendet worden, um die Genfunktion bei einer Anzahl von Organismen zu bestimmen, einschließlich Pflanzen (Baulcombe (1999), Curr Opin Plant Biol 2, 109-13), Nematoden (Montgomery, et al. (1998), Proc Natl Acad Sci USA 95, 15502-7), Drosophila (Kennerdell, et al. (1998), Cell 95, 1017-26, Kennerdell, et al. (2000), Nat Biotechnol 18, 896-8). Bei dem Nematoden C. elegans ist bereits ein Drittel des Genoms Gegenstand einer funktionellen Analyse durch RNAi gewesen (Kim (2001), Curr Biol 11, R85-7, Maeda, et al. (2001), Curr Biol 11, 171-6).
  • Bis vor kurzem war RNAi bei Säugerzellen im allgemeinen nicht anwendbar mit Ausnahme der frühen Mausentwicklung (Wianny, et al. (2000), Nat Cell Biol 2, 70-5). Die Entdeckung, dass die Transfektion mit Duplexen aus 21 Nukleotiden in Säugetierzellen die Genexpression störte und keine Sequenz-unabhängige Interferon-getriebene anti-virale Antwort induzierte, die üblicherweise mit langer dsRNA erhalten wird, führte zu neuen potentiellen Anwendungen bei differenzierten Säugerzellen (Elbashir et al. (2001), Nature 411, 494-8). Interessanterweise ähneln diese kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) den Prozessierungsprodukten aus langen dsRNAs, was einen möglichen Umgehungsmechanismus bei differenzierten Säugetierzellen nahelegt. Der Dicer-Komplex, ein Mitglied der RNAse III-Familie, der für das initiale Prozessieren von dsRNA erforderlich ist, ist identifiziert worden (Bernstein, et al. (2001), Nature 409, 363-6, Billy, et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98, 14428-33). Eines der früher aufgetretenen Probleme bei der Verwendung von nicht-modifizierten Ribooligonukleotiden war der schnelle Abbau in Zellen oder sogar im Serumenthaltenden Medium (Wickstrom (1986), J Biochem Biophys Methods 13, 97-102, Cazenave, et al. (1987), Nucleic Acids Res 15, 10507-21). Es wird von der speziellen Gen-Funktion und den speziellen Testsystemen, die verwendet werden, abhängen, ob der entsprechende Knock-Down, der durch trans-wirkende siRNA induziert wird, lang genug aufrecht erhalten werden wird, um eine phänotypische Änderung zu erreichen.
  • Parrish S. et al. (Molecular Cell, Band 6, 1077-1087, November, 2005) beschreiben die Erfordernisse von dsRNAs, die das unc 22-Gen von C. elegans targetieren. Genauer wird der Einfluss von chemischer Modifikation auf bestimmte Nukleotide untersucht, wobei ob ein Nukleotid modifiziert wird, von der Chemie des Nukleotids abhängt.
  • Die veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 02/055693 offenbart die Verwendung von RNAi-Molekülen mit einer doppel-strängigen Struktur, wobei ein derartiges RNAi-Molekül einen Überhang an einem Ende aufweist, der aus 1-4 Nukleotiden gebildet ist.
  • Die veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 02/044321 offenbart die Verwendung von RNAi-Molekülen mit einer doppel-strängigen Struktur, wobei derartige RNAi-Moleküle eine Länge von 19-23 Nukleotidpaaren aufweisen.
  • Die veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO 95/13834 offenbart chimäre Oligonukleotidverbindungen, die bei der Aktivierung von RNAase H-vermittelter Spaltung von Ziel-Nukleinsäuresequenzen nützlich sind. Genauer sind derartige chimäre Oligonukleotide einzel-strängige Oligonukleotide, die zu einer Ziel-Nukleinsäure komplementär sind.
  • Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem bestand darin, synthetische interferierende RNA-Moleküle bereitzustellen, die sowohl stabil als auch in einer biochemischen Umgebung wie beispielsweise einer lebenden Zelle aktiv sind.
  • Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem wird durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den beigefügten abhängigen Ansprüchen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung, dass kleine interferierende RNAs so konstruiert werden können, dass sie sowohl hoch spezifisch als auch hoch aktiv ebenso wie unter den Reaktionsbedingungen stabil sind, die typischerweise in biologischen Systemen wie beispielsweise biochemischen Tests oder zellulären Umgebungen angetroffen werden. Die verschiedenen, im Stand der Technik wie beispielsweise Tuschl et al. (internationale Patentanmeldung WO 01/75164) beschriebenen interferierenden RNAs sehen eine Länge von 21-23 Nukleotiden und eine Modifikation am 3'-Ende der doppel-strängigen RNA vor. Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass das Problem der Stabilität von interferierender RNA, einschließlich kleiner interferierender RNA (siRNA), die hierin allgemein im folgenden als RNAi bezeichnet werden, tatsächlich im Angriff von Endonukleasen statt Exonukleasen, wie man früher glaubte, begründet liegt. Auf der Grundlage dieser Feststellung wurden verschiedene Strategien von den vorliegenden Erfindern entwickelt, die Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit neue Formen von interferierender RNA, wie in Anspruch 1 definiert. RNAi besteht aus einer Ribonukleinsäure, die eine doppel-strängige Struktur umfasst. Die doppel-strängige Struktur wird durch einen ersten Strang und einen zweiten Strang ausgebildet. Der erste Strang umfasst einen Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden, der hierin auch als erster Abschnitt aus auseinanderfolgenden Nukleotiden bezeichnet wird, und dieser erste Abschnitt ist wenigstens teilweise komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure. Der zweite Strang umfasst auch einen Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist. Die spezielle Grundstruktur dieser Ribonukleinsäure ist schematisch in 1 gezeigt. Der erste Strang und der zweite Strang sind bevorzugterweise miteinander hybridisiert und bilden die doppel-strängige Struktur aus. Die Hybridisierung erfolgt typischerweise durch Watson-Crick-Basenpaarung. Die erfindungsgemäße Ribonukleinsäure ist jedoch hinsichtlich ihrer Länge nicht notwendigerweise auf die doppel-strängige Struktur beschränkt. Es kann weitere Nukleotide geben, die an einem jeden Strang und/oder an ein jedes Ende eines jeden Stranges angefügt sind, der/die die RNAi bilden. Abhängig von der besonderen Sequenz des ersten Abschnittes und des zweiten Abschnittes ist die Hybridisierung oder Basenpaarung nicht notwendigerweise vollständig oder perfekt, was bedeutet, dass der erste und zweite Abschnitt infolge von Fehlpaarungen nicht zu 100% basengepaart sind. Es kann auch eine oder mehrere Fehlpaarungen innerhalb des Duplex geben. Die Fehlpaarungen haben keine Wirkung auf die RNAi-Aktivität, wenn sie außerhalb eines Bereiches von bevorzugterweise 15, 16 oder 17 passenden Nukleotiden angeordnet sind. Wenn Fehlpaarungen so angeordnet sind, dass sie lediglich 15 oder weniger aufeinanderfolgende passende Nukleotide ergeben, zeigt das RNAi-Molekül typischerweise eine verringerte Aktivität beim Herunterregulieren von mRNA für ein gegebenes Ziel verglichen mit einem Duplex aus passenden 17 Nukleotiden.
  • Der erste Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden des ersten Stranges ist im Wesentlichen komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure, bevorzugtererweise zu einem Teil der Ziel-Nukleinsäure. Komplementär wie hierin verwendet bezeichnet bevorzugterweise, dass die Nukleotidsequenz des ersten Stranges an eine Nukleinsäuresequenz einer Ziel-Nukleinsäuresequenz oder einen Teil davon hybridisiert. Typischerweise ist die Ziel-Nukleinsäuresequenz oder Ziel-Nukleinsäure gemäß dem Wirkmechanismus von interferierenden Ribonukleinsäuren eine einzel-strängige RNA, bevorzugtererweise eine mRNA. Eine derartige Hybridisierung erfolgt am wahrscheinlichsten durch Watson-Crick-Basenpaarung, ist jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt. Der Umfang, in dem der erste Strang und genauer der erste Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden des ersten Stranges komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist, kann so hoch wie 100% und so wenig wie 80%, bevorzugterweise 80-100%, bevorzugtererweise 85-100% und am bevorzugtesten 90-100% sein. Eine optimale Komplementarität scheint 95-100% zu sein. Komplementarität in diesem Sinne bedeutet, dass der vorerwähnte Bereich von Nukleotiden wie, beispielsweise, 80%-100% der Nukleotide, abhängig von dem speziellen Bereich, perfekt durch Watson-Crick-Basenpaarung gepaart sind. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass die Komplementarität zwischen dem ersten Abschnitt von Nukleotiden und der Ziel-RNA 18-19 Nukleotide sein muss, Bereiche von so wenig wie 17 Nukleotiden selbst mit zwei Sequenz-spezifischen Überhängen sind nicht funktional beim Vermitteln von RNAi. Entsprechend wäre, ausgehend von einem Duplex mit einer Länge von 19 Nukleotiden oder Basenpaaren eine minimale Komplementarität von 17 Nukleotiden oder Nukleotidbasenpaaren akzeptabel, was eine Fehlpaarung von zwei Nukleotiden erlaubt. Im Falle eines Duplexes, der aus 20 Nukleotiden oder Basenpaaren besteht, wäre eine Komplementarität von 17 Nukleotiden oder Nukleotidbasenpaaren erlaubbar und funktionell aktiv. Das gleiche gilt für einen Duplex aus 21 Nukleotiden oder Basenpaaren mit insgesamt 17 komplementären Nukleotiden oder Basenpaaren. Grundsätzlich kann der Umfang an Komplementarität, die für eine Länge eines Duplexes erforderlich ist, d. h. einer doppelsträngigen Struktur, auch auf der Schmelztemperatur des Komplexes basieren, der durch entweder die doppel-strängige Struktur, wie sie hierin beschrieben ist, oder durch den Komplex aus dem ersten Abschnitt des ersten Stranges und der Ziel-Nukleinsäure gebildet ist.
  • Es soll verstanden werden, dass alle Ribonukleinsäuren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, RNA-vermittelte Interferenz zu bedingen oder daran beteiligt zu sein, wie sie beispielsweise in den internationalen Patentanmeldungen WO 99/32619, WO 00/44895 und WO 01/75164 beschrieben ist.
  • Die erste Strategie gemäß der ein interferierendes Ribonukleinsäuremolekül in Übereinstimmung mit Anspruch 1 gemäß der vorliegenden Erfindung ausgestaltet sein kann, besteht darin, dass der Bereich, der komplementär zur Ziel-Nukleinsäure ist, eine optimale Länge von 18 und 19 Nukleotiden aufweist. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die optimale Länge von 18 oder 19 Nukleotiden die Länge der doppelsträngigen Struktur in der verwendeten RNAi ist. Dieses Längenerfordernis ist eindeutig verschieden von der technischen Lehre des Standes der Technik, wie, beispielsweise, der internationalen Patentanmeldung WO 01/75164. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jegliche weitere Ausgestaltung gemäß der vorliegenden Erfindung und wie im Stand der Technik beschrieben, im Zusammenhang mit einer interferierenden Ribonukleinsäure mit diesen Längencharakteristiken realisiert werden kann, d. h. einer Länge von 18 oder 19 Nukleotiden.
  • Die zweite Strategie gemäß der ein interferierendes Ribonukleinsäuremoleküle in Übereinstimmung mit Anspruch 1 ausgestaltet sein kann, besteht darin, dass es am ersten Strang eine freie 5'-Hydroxylgruppe aufweist, die hierin auch als freie 5'OH-Gruppe bezeichnet wird. Eine freie 5'OH-Gruppe bedeutet, dass das terminalste Nukleotid, das den ersten Strang bildet, vorhanden und nicht modifiziert ist, insbesondere nicht durch eine End- Modifikation modifiziert ist. Typischerweise liegt die terminale 5'-Hydroxygruppe des zweiten Stranges auch in einer nicht-modifizierten Form vor. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist auch das 3'-Ende des ersten Stranges bzw. ersten Abschnittes unmodifiziert, um eine freie OH-Gruppe zu präsentieren, die hierin auch als freie 3' OH-Gruppe bezeichnet wird, wobei die Ausgestaltung des 5'-terminalen Nukleotids eine solche gemäß einer der zuvor beschriebenen Ausführungsformen ist. Bevorzugterweise ist eine derartige freie OH-Gruppe auch am 3'-Ende des zweiten Stranges bzw. zweiten Abschnittes vorhanden. In weiteren Ausführungsformen der Ribonukleinsäuremoleküle, wie sie zuvor hinsichtlich der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, kann das 3'-Ende des ersten Stranges bzw. ersten Abschnittes und/oder das 3'-Ende des zweiten Stranges bzw. zweiten Abschnittes eine End-Modifikation am 3'-Ende aufweisen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnen die Begriffe freie 5'OH-Gruppe und 3'-OH-Gruppe auch, dass das am meisten terminal gelegene Nukleotid am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende des Polynukleotids eine OH-Gruppe präsentiert. Eine derartige OH-Gruppe kann entweder von dem Zuckerteil des Nukleotids, bevorzugterweise von der 5'-Position im Falle der 5'-Gruppe und von der 3'-Position im Falle der 3'OH-Gruppe stammen, oder von einer Phosphat-Gruppe, die an dem Zuckerteil des entsprechenden terminalen Nukleotids befestigt ist. Die Phosphat-Gruppe kann prinzipiell an irgendeine OH-Gruppe des Zuckerteils des Nukleotids befestigt sein. Bevorzugterweise ist die Phosphat-Gruppe an der 5'-OH-Gruppe des Zuckerteils im Falle der freien 5'OH-Gruppe befestigt und/oder an der 3'OH-Gruppe des Zuckerteils im Falle der freien 3'OH-Gruppe, was immer noch das bereitstellt, was hierin als freie 5' oder 3'OH-Gruppe bezeichnet wird.
  • Wie hierin im Zusammenhang mit einer jeglichen Strategie für die Ausgestaltung von RNAi oder irgendeiner Ausführungsform der hierin offenbarten RNAi verwendet, bedeutet der Begriff End-Modifikation eine chemische Entität, die an das am meisten 5' oder 3'-gelegene Nukleotid des ersten und/oder zweiten Stranges hinzugefügt ist. Beispiele für derartige End-Modifikation umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, invertierte abasische (Desoxy)Nukleotide, Amin, Fluor, Chlor, Brom, CN, CF, Methoxy, Imidazol, Caboxylat, Thioat, C1 bis C10 niedriges Alkyl, substituiertes niedriges Alkyl, Alkaryl oder Aralkyl, OCF3, OCN, O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalklylamino oder substituiertes Silyl, wie, beispielsweise, in den europäischen Patenten EP 0 586 520 B1 oder EP 0 618 925 B1 beschrieben.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet Alkyl oder irgendein Begriff, der „Alkyl" umfasst, eine jegliche Kohlenstoffatomkette, die 1 bis 12, bevorzugterweise 1 bis 6 und bevorzugtererweise 1 bis 2 C-Atome umfasst.
  • Eine weitere End-Modifikation ist eine Biotin-Gruppe. Eine derartige Biotin-Gruppe kann bevorzugterweise an entweder dem am meisten 5' oder dem am meisten 3'-gelegenen Nukleotid des ersten und/oder zweiten Stranges oder beiden Enden befestigt sein. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Biotin-Gruppe an ein Polypeptid oder ein Protein gekoppelt. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Polypeptid oder das Protein durch eine jegliche der zuvor erwähnten End-Modifikationen befestigt ist. Das Polypeptid oder Protein kann den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen weitere Merkmale verleihen. Unter anderem kann das Polypeptid oder Protein als ein Ligand für ein weiteres Molekül dienen. Wenn das weitere Molekül ein Rezeptor ist, kann die Funktion und Aktivität des Rezeptors durch den bindenden Liganden aktiviert werden. Der Rezeptor kann eine Internalisierungsaktivität aufweisen, die eine effektive Transfektion des an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül gebundenen Liganden erlaubt. Ein Beispiel für den Liganden, das erfindungsgemäß an die Nukleinsäuremoleküle gebunden werden soll, ist VEGF und der entsprechende Rezeptor ist der VEGF-Rezeptor.
  • Verschiedene mögliche Ausführungsformen der RNAi der vorliegenden Erfindung, die verschiedene Arten von End-Modifikation(en) aufweisen, sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1: Verschiedene Ausführungsformen der interferierenden Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
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  • Die verschiedenen End-Modifikationen, wie sie hierin offenbart sind, sind bevorzugterweise an dem Riboseteil eines Nukleotids der Ribonukleinsäure angeordnet. Bevorzugtererweise kann die End-Modifikation an irgendeine der OH-Gruppen des Riboseteils gebunden sein oder diese ersetzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die 2'OH-, 3'OH- und 5'OH-Position, unter der Vorraussetzung, dass das solchermaßen modifizierte Nukleotid ein terminales Nukleotid ist. Invertierte abasische Nukleotide sind Nukleotide, entweder Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, die keinen Nukleobasenteil aufweisen. Die Art von Verbindung ist, unter anderem, in Sternberger et al. (2002), Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev. in press, beschrieben.
  • Eine jede der zuvor erwähnten End-Modifikationen kann im Zusammenhang mit den verschiedenen Ausführungsformen von RNAi, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind, verwendet werden. Im Zusammenhang damit gilt es festzuhalten, dass eine jede der RNAi-Formen oder Ausführungsformen, wie sie hierin offenbart sind, wobei der Sense-Strang inaktiviert ist, bevorzugterweise indem er eine End-Modifikation aufweist und bevorzugtererweise am 5'-Ende eine Endmodifikation aufweist, besonders vorteilhaft ist. Dies ergibt sich aus der Inaktivierung des Sense-Stranges, der dem zweiten Strang der hierin beschriebenen Ribonukleinsäuren entspricht, der ansonsten mit einer nicht in Beziehung stehenden einzel strängigen RNA in der Zelle interferieren könnte. Die Expression und insbesondere das Expressions- und besonders das Translationsmuster des Transkriptoms einer Zelle wird somit spezifischer beeinflusst. Diese Wirkung wird auch als Off-Target-Wirkung bezeichnet. Unter Bezugnahme auf Tabelle 1 sind jene als Ausführungen 7 und 8 dargestellten Ausführungen im obigen Sinne besonders vorteilhaft, da die Modifikation zu einer Inaktivierung des – Zielunspezifischen – Teils der RNAi führt (was der zweite Strang ist), wodurch eine jegliche unspezifische Wechselwirkung des zweiten Stranges mit einzel-strängiger RNA in einem zellulären oder ähnlichen System verringert wird, wo die RNAi gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, um spezifische Ribonukleinsäuren bzw. Proteine herunterzuregulieren.
  • Eine dritte Strategie wie sie Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, besteht darin, eine Ribonukleinsäure gemäß Anspruch 1 zu realisieren, die ein doppel-strängige Struktur umfasst, wobei die doppel-strängige Struktur einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei der erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, wobei der erste Strang wenigstens teilweise komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, wobei die doppel-strängige Struktur glattendig ist. Wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird der Begriff doppel-strängige Struktur auch als Duplex bezeichnet. Die Ausgestaltung ist somit eindeutig verschieden von, beispielsweise, der von Tuschl et al., wie sie in der Patentanmeldung WO 01/75164 offenbart ist, die einen 3'-Überhang offenbart. Wie hierin verwendet bezeichnet Überhang eine doppel-strängige Struktur, wobei wenigstens ein Ende des Strangs länger ist als das korrespondierende Ende des anderen Stranges, das die doppel-strängige Struktur ausbildet, der hierin auch als der Gegenstrang bezeichnet wird. Bevorzugterweise ist der erste Abschnitt identisch zu dem ersten Strang und der zweite Strang ist identisch zu dem zweiten Strang.
  • Mit Blick auf die Wirksamkeit von glatt-endiger RNAi und den Vorteilen einer End-Modifikation von entweder dem ersten oder dem zweiten Strang, oder beiden, der entsprechenden Ribonukleinsäure ist es bevorzugt, eine Kombination aus beiden Ausgestaltungsprinzipien zu haben. Mit anderen Worten, es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine glatt-endige RNAi vorliegt, die ein Endmodifikationsschema aufweist, wie es in Tabelle 1 dargestellt ist.
  • Die vierte Strategie, wie sie Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, besteht darin, am 5'-Ende der Ribonukleinsäure gemäß Anspruch 1 einen 5'-Überhang zu haben. Genauer kann ein derartiger Überhang im Prinzip an einem jeden oder sowohl dem ersten als auch dem zweiten Strang der Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Die Länge des Überhangs kann so wenig wie ein Nukleotid und so lang wie 2 bis 8 Nukleotide, bevorzugterweise 2, 4, 6 oder 8 Nukleotide sein. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der 5'-Überhang an dem ersten Strang und/oder dem zweiten Strang der Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung angeordnet ist. Das/die Nukleotid(e), die den Überhang ausbildet/ausbilden, kann/können (ein) Desoxyribonukleotid(e), (ein) Ribonukleotid(e) oder eine Fortsetzung davon sein.
  • Der Überhang umfasst bevorzugterweise wenigstens ein Desoxyribonukleotid, wobei das eine Desoxyribonukleotid bevorzugterweise das am meisten 5'-terminal gelegene ist. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das 3'-Ende des entsprechenden Gegenstranges der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure keinen Überhang aufweist, bevorzugterweise keinen Desoxyribonukleotid-Überhang. Hier wiederum kann eine jede der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäuren ein Endmodifikationsschema aufweisen, wie im Zusammenhang mit Tabelle 1 dargestellt und/oder eine End-Modifikation, wie hierin dargelegt.
  • Die Strategie bei der Ausgestaltung der interferierenden Ribonukleinsäuren gemäß Anspruch 1 besteht in der Ausbildung eines bestimmten Musters aus modifizierten Nukleotiden auf sowohl dem ersten als auch auf dem zweiten und genauer auf dem ersten und zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Ribonukleinsäure(n) gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Art von Modifikation der Nukleotide kann die gleiche sein, wie im Zusammenhang mit den anderen Strategien zur Ausgestaltung interferierender RNA diskutiert, wie sie hierin offenbart sind, und genauer die Art von Modifikation, wie sie hierin beschrieben ist, oder eine End-Modifikation, wie beispielsweise, ein invertiertes abasisches Nukleotid, Methoxy oder Amino und dergleichen am Riboseteil von wenigstens einem Nukleotid, das die Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ausbildet. Es ist festzuhalten, dass die Modifikation der Nukleotide eine jegliche Modifikationsform sein kann, wie sie hierin beschrieben ist, insbesondere die Art von Modifikation, wie sie hierin als End-Modifikation beschrieben ist, mit der Vorgabe, dass die so genannte End-Modifikation nicht notwendigerweise an terminalen Nukleotiden lokalisiert ist. Vielmehr erfolgt die Modifikation an einem nicht-terminalen Nukleotid. Unter derartigen Bedingungen ist die Modifikation bevorzugterweise an den Riboseteil des – zu modifizierenden – Nukleotids und bevorzugterweise an die 2'-Position des Riboseteils gebunden.
  • Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jede Ribonukleinsäure gemäß Anspruch 1 auch die Merkmale aufweisen kann, die einer Ribonukleinsäure gemäß Anspruch 1 durch irgendeine der anderen Ausgestaltungsstrategien verliehen wird, wie sie hierin beschrieben sind. Entsprechend kann die interferierende Ribonukleinsäure ein Muster aus modifizierten Nukleotiden aufweisen, die eine End-Modifikation aufweisen, ein Endmodifikationsschema aufweisen, können glattendig sein oder einen 5'-Überhang oder eine Kombination aus zwei oder mehreren dieser Elemente oder Merkmale aufweisen.
  • Abgesehen von den zuvor erwähnten Modifikationen, die entweder als End-Modifikationen oder als Modifikationsmuster vorhanden sein können, kann das Ribonukleinsäurerückgrat als solches weiter modifiziert sein durch Ausbilden verschiedener Verbindungen zwischen den Nukleotiden. Derartige Verbindungen sind, unter anderen, in dem europäischen Patent EP 0 586 520 B1 und dem europäischen Patent EP 0 681 925 B1 beschrieben. Von besonderem Interesse hierin sind/ist eine interne Modifikation(en) des Ribonukleinsäurerückgrats, von der/denen gezeigt wurde, dass sie den Ribonukleotiden eine höhere Nukleinsäureresistenz verleihen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Modifikation des modifizierten Nukleotid eine Methoxylierung der 2'-OH-Gruppe des Riboseteils des Nukleotids.
  • Gemäß Anspruch 1 zeigen beide Stränge und insbesonderer sowohl der erste Abschnitt als auch der zweite Abschnitt diese Art von Modifikation der Nukleotide, die die Stränge bzw. Abschnitte ausbilden. Wie hierin verwendet kann der Begriff Gruppe aus modifizierten Nukleotiden oder flankierende Gruppe von Nukleotiden so wenig wie ein Nukleotid, d. h. ein oder mehrere Nukleotide umfassend darstellen.
  • Ausgehend von einem Abschnitt von aufeinanderfolgenden Nukleotiden kann ein Modifikationsmuster der Nukleotide, die den Abschnitt ausbilden, so realisiert sein, dass ein einzelnes Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden, die kovalent miteinander vermittels Standardphosphordiesterbindungen verbunden sind oder, wenigstens teilweise, durch Phosphothioatbindungen verbunden sind, eine derartige Modifikation aufweisen. In dem Falle, dass ein derartiges Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden, die hierin als Gruppe aus modifizierten Nukleotiden bezeichnet werden, nicht das 5'-Ende oder 3'-Ende des Abschnittes ausbildet/ausbilden, folgt ein Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden auf beiden Seiten des Nukleotids, das die Modifikation des vorhergehenden Nukleotids oder Gruppe von Nukleotiden nicht aufweist. Es wird verstanden, dass diese Art von Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden jedoch eine andere Modifikation aufweisen kann. Diese Gruppe von Nukleotiden wird hierin auch als die flankierende Gruppe von Nukleotiden oder flankierende Gruppe aus Nukleotiden bezeichnet. Diese Sequenz von modifiziertem Nukleotid bzw. Gruppe von modifizierten Nukleotiden und unmodifizierten oder unterschiedlich modifiziertem Nukleotid oder Gruppe von unmodifizierten oder anders modifizierten Nukleotiden kann ein oder mehrfach wiederholt sein. Bevorzugterweise ist die Sequenz mehr als einmal wiederholt. Aus Gründen der Klarheit wird das Muster detailliert im folgenden diskutiert, wobei allgemein auf eine Gruppe modifizierter Nukleotide oder eine Gruppe von unmodifizierten Nukleotiden Bezug genommen wird, wobei eine jede der Gruppe tatsächlich so wenig wie ein Nukleotid umfassen kann. Unmodifiziertes Nukleotid, wie hierin verwendet, bedeutet entweder, dass es keine der zuvor erwähnten Modifikationen an dem Nukleotid vorhanden ist, das das entsprechende Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden ausbildet, oder eine Modifikation aufweist, die verschieden ist von der des modifizierten Nukleotids bzw. Gruppe von Nukleotiden.
  • Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Modifikation der/des unmodifizierten Nukleotids/Nukleotide, wo (ein) derartige(s) nicht-modifizierte(s) Nukleotid(e) tatsächlich anders modifiziert ist/sind als die Modifikation der/des modifizierten Nukleotids/Nukleotide, gleich oder sogar verschieden für die verschiedenen Nukleotide sein kann, die die unmodifizierten Nukleotide oder die verschiedenen flankierenden Gruppen von Nukleotiden ausbilden.
  • Das Muster aus modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden kann so sein, dass das 5'-terminale Nukleotid des Stranges oder des Abschnittes mit einer modifizierten Gruppe von Nukleotiden oder mit einer unmodifizierten Gruppe von Nukleotiden beginnt. In einer alternativen Ausführungsform ist es jedoch auch möglich, dass das 5'-terminal Nukleotid durch eine unmodifizierte Gruppe aus Nukleotiden gebildet ist.
  • Diese Art von Muster kann entweder auf dem ersten Abschnitt oder dem zweiten Abschnitt der interferierenden RNA oder auf beiden realisiert sein. Man muss festhalten, dass ein 5'- Phosphat auf dem zum Zielmolekül komplementären Strang des siRNA-Duplexes für die Funktion der siRNA-Funktion erforderlich ist, was vorschlägt, dass Zellen die Authentizität von siRNAs durch ein freies 5'-OH überprüfen (das phosphoryliert sein kann) und nur solchen bonafide siRNAs erlaubt, eine Zerstörung der Ziel-RNA zu steuern (Nykanen, et al. (2001), Cell 107, 309-21).
  • Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass sowohl der erste als auch der zweite Abschnitt diese Art von Muster aufweisen. Bevorzugterweise ist ein Muster aus Modifikation und Nicht-Modifikation das gleiche für sowohl den ersten als auch den zweiten Abschnitt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gruppe aus Nukleotiden, die den zweiten Abschnitt ausbilden und der modifizierten Gruppe aus Nukaeotiden des ersten Abschnittes entspricht, ebenfalls modifiziert, wohingegen die unmodifizierte Gruppe aus Nukleotiden, die den zweiten Abschnitt ausbilden oder jene des zweiten Abschnittes, der unmodifizierten Gruppe aus Nukleotiden, die den ersten Abschnitt ausbilden oder jene des ersten Abschnittes entspricht. Diese Möglichkeit ist schematisch in 2A dargestellt. Eine weitere Alternative besteht darin, dass es eine Phasenverschiebung des Modifikationsmusters des ersten Abschnittes bzw. ersten Stranges relativ zu dem Modifikationsmuster des zweiten Abschnittes bzw. zweiten Stranges gibt. Bevorzugterweise ist die Verschiebung von der Gestalt, dass die modifizierte Gruppe aus Nukleotiden des ersten Stranges zu der unmodifizierten Gruppe aus Nukleotiden des zweiten Stranges korrespondiert und umgekehrt. Diese Möglichkeit ist in 2B gezeigt. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Phasenverschiebung des Modifikationsmusters nicht vollständig ist, sondern, wie in 2C dargestellt, überlappt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Nukleotid am Ende des Stranges bzw. Abschnittes ein unmodifiziertes Nukleotid oder der Beginn einer Gruppe von nicht-modifizierten Nukleotiden. Bevorzugterweise ist dieses unmodifizierte Nukleotid oder diese unmodifizierte Gruppe aus Nukleotiden am 5'-Ende des ersten bzw. zweiten Stranges angeordnet und sogar bevorzugtererweise des ersten Stranges. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das unmodifizierte Nukleotid oder die unmodifizierte Gruppe aus Nukleotiden am 5'-Ende des ersten Stranges bzw. ersten Abschnittes angeordnet. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Muster aus alternierenden einzelnen modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung umfasst die interferierende Ribonukleinsäure zwei Stränge, wobei ein 2'-O-Methyl-modifiziertes Nukleotid und ein nicht-modifiziertes Nukleotid, bevorzugterweise ein Nukleotid, das nicht 2'-O-Methyl-modifiziert ist, auf beiden Strängen in einer alternierenden Art und Weise eingebaut ist, was bedeutet, dass jedes zweite Nukleotid ein 2'-O-Methyl-modifiziertes bzw. ein nicht-modifiziertes Nukleotid ist. Dies bedeutet, dass auf dem ersten Strang ein 2'-O-Methyl-modifiziertes Nukleotid von einem nicht-modifizierten Nukleotid gefolgt ist, das wiederum von einem 2'-O-Methyl-modifizierten Nukleotid gefolgt ist und so weiter. Die gleiche Sequenz aus 2'-O-Methyl-Modifikation und Nicht-Modifikation existiert auf dem zweiten Strang, wobei bevorzugterweise eine Phasenverschiebung in der Form besteht, dass das 2'-O-Methyl-modifiziert Nukleotid auf dem ersten Strang basenpaart mit (einem) nicht-modifizierten Nukleotid(en) auf dem zweiten Strang und umgekehrt. Diese spezielle Anordnung, d. h. Basenpaaren von 2'-O-Methyl-modifizierten und nicht-modifizierten Nukleotid(en) auf beiden Strängen ist besonders bevorzugt im Falle kurzer interferierender Ribonukleinsäuren, d. h. kurzer basengepaarter doppelsträngiger Ribonukleinsäuren, da angenommen wird, dass, obwohl die vorliegenden Erfinder nicht durch diese Theorie beschränkt sein wollen, eine bestimmte Abstoßung zwischen zwei basenpaarenden 2'-O-Methyl-modifizierten Nukleotiden besteht, was einen derartigen Duplex destabilisieren würde, insbesondere kurze Duplexes. Hinsichtlich der speziellen Anordnung ist bevorzugt, wenn der Antisense-Strang mit einem 2'-O-Methyl-modifizierten Nukleotid am 5'-Ende beginnt, wobei entsprechend das zweite Nukleotid nicht-modifiziert ist, die dritten, fünften, siebten usw. Nukleotide somit wieder 2'-O-Methyl-modifiziert sind, wohingegen die zweiten, vierten, sechsten, achten und dergleichen Nukleotide nicht-modifizierte Nukleotide sind. Wiederum ohne durch eine Theorie gebunden zu sein, scheint, dass der Position 2 und optional der Position 4, 6, 8 und ähnlichen Positionen am 5'-terminalen Ende des Antisense-Stranges eine besondere Bedeutung zugemessen werden kann, die keine Modifikation umfassen soll, wohingegen das am weitesten 5'-terminal gelegene Nukleotid, d. h. das erste 5'-terminale Nukleotid des Antisense-Stranges eine derartige Modifikation aufweisen kann, wobei eine jegliche ungradzahlige Position wie die erste, optional dritte, fünfte und ähnliche Position(en) des Antisense-Stranges modifiziert sein können. In weiteren Ausführungsformen kann die Modifikation bzw. Nicht-Modifikation der/des modifizierten und nicht-modifizierten Nukleotide/Nukleotids eine jegliche der hierin beschriebenen sein.
  • Obwohl nicht darauf beschränkt, wird die doppel-strängige Struktur der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure, die auch als Duplex bezeichnet wird, durch den ersten Strang und zweiten Strang ausgebildet, oder den ersten und zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Die Länge des ersten Abschnittes bzw. zweiten Abschnittes beträgt typischerweise etwa 15 bis etwa 23, bevorzugtererweise 17 bis 21 und am bevorzugtesten 18 oder 19 Basen. Im Zusammenhang damit soll festgehalten werden, dass eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden, bevorzugterweise weniger als 21 Nukleotiden, nicht dazu führt, dass ein biologisches System, das grundsätzlich in der Lage ist, eine RNA-Interferenz und auch eine Interferon-Antwort zu zeigen, eine Interferon-Antwort entwickelt. Der Grund dafür liegt in der Beobachtung, dass eine gegebene Zelle tiefreichende physiologische Änderungen erfährt, wenn doppel-strängige RNA, die länger als 30 Basenpaare ist, Proteinkinase PKR und 2',5'-Oligoadenylatsynthetase bindet und aktiviert. Aktivierte PKR unterbindet die Translation durch Phosphorylierung von eIF2a, aktivierte 2',5'-AS bedingt mRNA-Abbau. Diese Wirkungen sind bei der Target-Validierung und in Tiermodellen nicht erwünscht, da sie über die Wirkung des Target-spezifischen Knock-Downs auf den Phänotyp die Oberhand gewinnen.
  • Entsprechend einer sechsten Strategie bei der Ausgestaltung von interferierenden Ribonukleinsäuren gemäß Anspruch 1 umfasst die Ribonukleinsäure eine doppel-strängige Struktur, wobei die doppel-strängige Struktur einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei der erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst und wobei der erste Abschnitt wenigstens teilweise komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, wobei ein Terminus des ersten Stranges und ein Terminus des zweiten Stranges durch eine Schleifen-Struktur verbunden sind.
  • In einer Ausführungsform besteht die Schleifen-Struktur aus einem Nicht-Nukleinsäure-Polymer. Ein derartiges Nicht-Nukleinsäure-Polymer kann Polyethylenglycol oder ähnliche Polymere sein. Die Nicht-Nukleinsäure-Polymere können im Prinzip aus der Gruppe ausgewählt sein, die Polymere umfasst, die kein Polynukleotid umfassen, und erlauben, dass die zwei Stränge, die verbunden werden sollen, tatsächlich miteinander hybridisieren. Um eine derartige Hybridisierung zu erlauben, muss das Molekül oder der Teil des Moleküls, das/der die zwei Abschnitte, die miteinander hybridisieren, verbindet, eine bestimmte Molekülstruktur oder Molekülflexibilität aufweisen, um das Biegen des Moleküls zu erlauben, um wiederum zu erlauben, dass beide Stränge miteinander in engen Kontakt und in eine 3-dimensionale Orientierung gelangen, die eine Hybridisierung erlaubt. Ein derartiges Molekül oder Teil fungiert faktisch als ein Gelenk. Im Prinzip kann ein jegliches Molekül, das diesem Erfordernis gerecht wird, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Neben Polyethylenglycol können Aminosäure-basierte Moleküle verwendet werden. Derartige Aminosäure-basierte Moleküle können entweder Homopolymere oder Heteropolymere sein. Ein nützliches Beispiel ist ein Homopolymer, das aus sieben Glycin-Resten besteht, das die Erzeugung eines Gelenkes erlaubt, wie es erforderlich ist, um die beiden Abschnitte für das Hybridisieren in die erforderliche räumliche Nähe zu bringen. Dieses Glycin-basierte Gelenk ist, beispielsweise in Gaun K. L. und Dixon J. E. (1991), Anal Biochem. 192, 262 beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform kann das Gelenk durch Kronenether ausgebildet sein, die in der Technik bekannt sind.
  • In einer alternativen Ausführungsform besteht die Schleife aus einer Nukleinsäure. Wie hierin verwendet werden LNA, wie in Elayadi und Corey (2001) Curr Opin Investig Drugs. 2(4):558-61 beschrieben, und PNA als Nukleinsäuren betrachtet und können auch als Schleifen-bildende Polymere verwendet werden. Im Grunde kann das 5'-Ende des ersten Stranges mit dem 3'-Terminus des zweiten Stranges verbunden sein. In einer Alternative kann das 3'-Ende des ersten Stranges mit dem 5'-Terminus des zweiten Stranges verbunden sein. Die Nukleotidsequenz, die die Schleifenstruktur ausbildet, wird im Allgemeinen als nicht kritisch betrachtet. Die Länge der Nukleotidsequenz, die eine derartige Schleife ausbildet, scheint jedoch aus sterischen Gründen kritisch zu sein. Entsprechend scheint eine Minimallänge aus vier Nukleotiden angemessen zu sein, um eine Schleifen-Struktur auszubilden. Im Prinzip ist die maximale Anzahl von Nukleotiden, die das Gelenk oder die Bindung zwischen beiden Strängen, die hybridisiert werden sollen, nicht beschränkt. Je länger ein Polynukleotid jedoch ist, desto wahrscheinlicher werden Sekundär- und Tertiär-Strukturen ausgebildet und somit die erforderliche Orientierung der Abschnitte beeinflusst. Bevorzugterweise ist eine maximale Anzahl von Nukleotiden, die das Gelenk ausbilden, etwa 12 Nukleotide. Es ist im Rahmen der Offenbarung dieser Anmeldung, dass eine jegliche der oben beschriebenen Ausgestaltungen mit der vorliegenden sechsten Strategie kombiniert werden kann, d. h. durch kovalentes Verbinden der zwei Strängen in einer Art und Weise, dass eine Rückfaltung (Schleife) durch eine Schleifen-Struktur oder ähnliche Struktur erfolgen kann.
  • Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass, wenn die Schleife 3' zum Antisense-Strang angeordnet ist, d. h. dem ersten Strang der Ribonukleinsäure(n) gemäß der vorliegenden Erfindung, die Aktivitäten dieser Art von RNAi größer sind verglichen mit der Anordnung der Schleife 5' zu dem Antisense-Strang. Entsprechend ist die spezielle Anordnung der Schleife relativ zu dem Antisense-Strang und Sense-Strang, d. h. zum ersten Strang bzw. dem zweiten Strang, entscheidend und ist somit im Gegensatz zu dem Verständnis, wie es im Stand der Technik zum Ausdruck gebracht wird, wo ausgeführt wird, dass die Orientierung keine Bedeutung hätte. Dies scheint jedoch mit Blick auf die hierin präsentierten experimentellen Ergebnisse nicht zutreffend zu sein. Das Verständnis, wie im Stand der Technik zum Ausdruck gebracht, basiert auf der Annahme, dass eine jegliche RNAi Gegenstand eines Prozessierens ist, währenddessen eine nicht durch Schleifen verbundene RNAi erzeugt wird. Wenn dies der Fall wäre, könnte die eindeutig beobachtete erhöhte Aktivität jener Strukturen nicht erklärt werden, bei denen die Schleife 3' zum Antisense angeordnet ist. Insoweit ist eine bevorzugte Anordnung in 5'→3'-Richtung für diese Art kleiner interferierender RNAi: zweiter Strang – Schleife – erster Strang. Die entsprechenden Konstrukte können in geeignete Vektor-Systeme eingebaut werden. Bevorzugterweise umfasst der Vektor einen Promotor für die Expression von RNAi. Bevorzugterweise ist der entsprechende Promotor pol III und bevorzugtererweise sind die Promotoren U6, H1, 7SK-Promotor, wie in Good et al. (1997) Gene Ther, 4, 45-54 beschrieben.
  • Infolge der allgemeinen Anwendbarkeit des Konzeptes der interferierenden RNA und somit des Knock-Downs oder Knock-Outs für eine kodierende Nukleinsäure wie beispielsweise eine mRNA, kann ein jedes Gen, das eine derartige RNA produziert, hinsichtlich seiner Expression modifiziert werden, indem eine der Ribonukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Infolge des grundlegenden und allgemein anwendbaren Mechanismus kann eine jegliche Anwendung auf der Basis desselben realisiert werden, was den Knock-Down oder Knock-Out eines Gens impliziert. Eine bevorzugte Anwendung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure für die Target-Validierung. Wie hierin verwendet soll Target-Validierung einen Prozess bezeichnen, der das Durchführen von Schritten umfasst, um zu belegen, dass eine DNA, eine RNA oder ein Proteinmolekül direkt in einem biologischen Prozess involviert ist, bevorzugterweise in einem Prozess, der – kausal – bei einer Erkrankung oder einem Nicht-Standard-Zustand involviert ist, und deshalb ein geeignetes Ziel für die Entwicklung einer neuen therapeutischen Verbindung ist.
  • Sequenzhomologiestudien haben erfolgreich Gene in Ziel-Familien eingeteilt. Die enorme Aufgabe, zu entschlüsseln, welche dieser Ziele Schlüsselelemente bei Erkrankungen sind und die für eine nachfolgende Arzneimittelentwicklung verwendet werden sollten, muss in effizienter Art und Weise angegangen werden. Deshalb sollte der Knock-Down einer Genexpression um 50-100% verringert sein, bevorzugterweise um 90%, um signifikante Wirkungen auf den Phänotyp zu sehen. In anderen Fällen, abhängig von den Genen, kann ein Knock-Down von so wenig wie 20% ausreichend sein, um einen Phänotyp zu bedingen. Ein Phänotyp wird durch Vergleich von Zellen definiert werden, die funktionelle RNAi-Moleküle enthalten, mit Zellen, die keine funktionelle RNAi-Moleküle enthalten. Dies wird ein signifikantes Ableseergebnis gewährleisten, selbst unter Bedingungen, wo die Proteinfunktion nur teilweise inhibiert ist. Im allgemeinen besteht keine lineare Korrelation zwischen dem Umfang der mRNA-Reduktion und dem Umfang der Änderung im Phänotyp. Man muss anerkennen, dass für einige Proteine eine Verringerung von etwa 20% des Proteins ausreichend ist, um eine Änderung im Phänotyp zu erzeugen, wohingegen im Falle von anderen Genen bzw. mRNA so wenig wie 5-10% verbleibendes Protein ausreichend ist, um den beobachteten Phänotyp aufrechtzuerhalten.
  • Eine weitere Verwendung der Ribonukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in deren Verwendung für die Herstellung eines Medikaments oder die Verwendung als ein Medikament. Ein derartiges Medikament könnte entweder für die Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen oder Zuständen verwendet werden, wie eine jegliche Art von Krebs, wo ein Gen und sein Produkt mit dem Beginn, der Ursache oder dem Fortschreiten dieser Erkrankung verknüpft worden ist. Zusätzlich könnte ein derartiges Medikament verwendet werden, um Erkrankungen zu behandeln, wo die Anwesenheit oder Überexpression eines Genproduktes einen pathologischen Phänotyp erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung gekennzeichnet durch einen Zugewinn an Funktion und kann durch Anwendung oder Verabreichung der entsprechenden, biologisch aktiven RNAi geheilt werden. Erkrankungen oder Zustände, die durch das Medikament behandelt werden können, das eine Ribonukleinsäure umfasst, wie hierin offenbart, können ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Krebs, Herzerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen, dermatologische Erkrankungen, entzündliche Erkrankungen, Immunsystemstörungen und Autoimmunstörungen. Die verschiedenen Formen von Krebs umfassen, sind aber nicht beschräkt auf solide Tumoren und Tumoren des blutbildenden Systems, wie beispielsweise Glioblastom, Prostatakrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs und Leukämie. Stoffwechselerkrankungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Fettleibigkeit und Diabetes. Dermatologische Erkrankungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Psoriasis.
  • In einem weiteren Aspekt können die Ribonukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung als Diagnostika verwendet werden, bevorzugterweise für jene Erkrankungen, wie sie im Zusammenhang mit den oben erwähnten Erkrankungen und Zuständen angegeben sind. Eine derartige Diagnose könnte auf der Beobachtung basieren, dass nach Anwenden der Ribonukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang mit einer Probe, die bevorzugterweise Zellen enthält, eine Änderung des Expressionsmusters der Probe erfolgt. Bevorzugterweise umfasst eine derartige Probe Zellen von einem Lebewesen, von dem angenommen wird, dass es die Erkrankung oder den Zustand, die/der behandelt werden soll, oder eine Prädisposition dafür aufweist.
  • Eine weitere Anwendung der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in ihrer Verwendung beim Screenen von pharmazeutisch aktiven Verbindungen und/oder der Lead-Optimierung. Letzteres wird so durchgeführt, dass die Wirkung von Kandidatenarzneimitteln wie beispielsweise kleinen Molekülen überwacht oder bestimmt wird und die Wirkung, die durch die Kandidatenarzneimittel bedingt werden, mit der Wirkung verglichen werden, die nach Verabreichung von spezifischer RNAi beobachtet wird, die auf der Grundlage der hierin offenbarten Prinzipien ausgestaltet ist. Indem so verfahren wird, können Kandidatenarzneimittel, die Off-Target-Wirkungen zeigen, aus dem Screening-Prozess eliminiert werden, wohingegen jene Kandidatenarzneimittel, die einen ähnlichen oder identischen Phänotyp erzeugen, als hochrelevante Lead-Verbindungen erachtet werden und können sogar selbst eine pharmazeutisch aktive Verbindung sein. Bei diesem Ansatz fungieren die hochspezifischen RNAi-Moleküle als Goldstandard, gegen die die Kandidatenarzneimittel gemessen werden.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle, bevorzugterweise eine Knock-Down-Zelle, die eine Ribonukleinsäure enthält, wie hierin offenbart. Eine derartige Zelle ist bevorzugterweise eine Zelle, die entweder aus einem Gewebe oder sogar Organ, das wiederum bevorzugterweise nicht in einem Organismus enthalten ist, isoliert oder darin enthalten ist. Die Zelle kann jedoch auch in einem Organismus enthalten sein. Die Zelle ist bevorzugterweise eine Zelle, die an der Erkrankung oder dem Zustand, der durch die erfindungsgemäßen Ribonukleinsäuren behandelt werden soll, involviert ist. Diese Art von Knock-Down-Zellen können verwendet werden, um ein Expressionsprofil basierend, z. B., auf mRNA oder Protein zu erzeugen, um die funktionelle Beziehung aufzuklären und stromabwärtige Ziele zu bestimmen. In dem Fall, wo die Zelle eine menschliche Zelle ist, ist eine derartige menschliche Zelle eine isolierte menschliche Zelle.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Organismus, der eine Ribonukleinsäure enthält, wie hierin offenbart. Bevorzugterweise ist ein derartiger Organismus ein Vertebraten-Organismus und bevorzugterweise ist der Vertebraten-Organismus ein Säugetier. Ein Säugetier, wie hierin verwendet, ist, unter anderem, aber nicht beschräkt auf, einen (Menschen)Affen, einen Hund, eine Katze, eine Ziege, ein Schaf, ein Schwein, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, eine Maus und eine Ratte. Der Organismus ist verschieden von einem Menschen.
  • In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthält. Bevorzugterweise umfasst eine derartige Zusammensetzung Negativ- und Positivkontrollen, entweder in Kombination mit der wirksamen Ribonukleinsäure oder getrennt davon. Eine derartige Zusammensetzung kann weiter ein Lösungsmittel, bevorzugterweise einen Puffer umfassen.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthält und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und umfassen, unter anderem, Verdünnungsmittel, Puffer und dergleichen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weitere pharmazeutisch aktive Verbindungen umfassen. In dem Fall, wo die Erkrankung oder der Zustand, der unter Verwendung der Ribonukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden soll, bevorzugterweise jene sind, die bereits jetzt im Zusammenhang mit der Behandlung der Erkrankungen oder Verwendungen der Erkrankungen oder Zustände verwendet werden. Infolge der verschiedenen Wirkweisen der Ribonukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung und der Medikamente, die für die Behandlung der Erkrankungen und Zustände gemäß dem Stand der Technik verwendet werden, werden synergistische Wirkungen auftreten.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Figuren und Beispiele veranschaulicht werden, aus denen weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können.
  • 1 zeigt eine schematische Darstellung, die die hierin verwendete Terminologie definiert. Der obere der zwei Stränge ist der erste Strang und der Antisense-Strang der targetierten Nukleinsäure, wie beispielsweise mRNA. Der zweite Strang ist derjenige, der im Wesentlichen hinsichtlich seiner Sequenz der targetierten Nukleinsäure entspricht und somit den Sense-Strang ausbildet. Beide, d. h. der erste und der zweite Strang bilden eine doppelsträngige Struktur, typischerweise durch Watson-Crick-Basenpaarung.
  • 2 veranschaulicht einige Ausführungsformen der Ribonukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit Mustern aus modifizierten und unmodifizierten Gruppen aus Nukleotiden, das hierin auch als Modifikationsmuster bezeichnet wird. Die modifizierten Gruppen aus Nukleotiden werden hierin auch als Gruppe aus modifizierten Nukleotiden bezeichnet. Die unmodifizierten Nukleotide oder unmodifizierten Gruppen aus Nukleotiden, die hierin als flankierende Gruppe(n) aus Nukleotiden bezeichnet werden, können, wie hierin verwendet, auch eine oder mehrere der Modifikation(en), wie hierin offenbart, aufweisen, die jedoch verschieden von der Modifikation der Nukleotiden ist/sind, die die Gruppe(n) aus modifizierten Nukleotiden ausbilden. In 2A sind die modifizierten und unmodifizierten Gruppen aus Nukleotiden, d. h. Gruppen aus modifizierten Nukleotiden und den flankierenden Gruppen aus Nukleotiden auf sowohl dem ersten Abschnitt als auch auf dem zweiten Abschnitt auf entsprechenden Teilen der Abschnitte angeordnet und somit miteinander ausgerichtet (Gruppen aus modifizierten Nukleotiden auf dem ersten Strang ausgerichtet mit Gruppen aus modifizierten Nukleotiden auf dem zweiten Strang und flankierende Gruppen aus Nukleotiden auf dem ersten Strang ausgerichtet mit flankierenden Gruppen aus Nukleotiden auf dem zweiten Strang), wohingegen 2B das auf dem ersten Strang realisierte Muster ebenfalls auf dem zweiten Strang realisiert ist, jedoch mit einer Basenverschiebung, so dass die modifizierte Gruppe aus Nukleotiden auf dem ersten Abschnitt basenpaart mit einer unmodifizierten Gruppe aus Nukleotiden des zweiten Abschnittes und umgekehrt, so dass eine Gruppe modifizierter Nukleotide auf dem ersten Strang mit einer flankierenden Gruppe aus Nukleotiden auf dem zweiten Strang ausgerichtet ist. In 2C ist eine weitere Möglichkeit der Anordnung der modifizierten und unmodifizierten Gruppen aus Nukleotiden realisiert. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Muster des ersten Abschnittes unabhängig von dem Muster des zweiten Abschnittes ist und dass beide Muster teilweise hinsichtlich der relativen Position zueinander in der doppel-strängigen Struktur, die durch Basenpaarung definiert ist, überlappen. In einer weiteren Ausführungsform kann das Ausmaß dieser Überlappung über die Länge des/der Abschnittes/Abschnitte bzw. Strang/Stränge variieren.
  • 3 zeigt das Ergebnis eines Knock-Down-Experimentes unter Verwendung von RNAi-Molekülen mit verschiedenen Endschutzgruppen. Genauer zeigt 3A, dass die verschiedenen Formen von endgeschützten RNAi-Molekülen hinsichtlich des Knock-Downs von PTEN-mRNA funktionell sind.
  • 3B zeigt die Sequenz verschiedener RNAi-Moleküle, die in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis in 3A dargestellt ist. 3C zeigt das Ergebnis einer Immunoblot-Analyse von PTEN-Protein nach Behandlung mit modifizierten RNAi-Molekülen verglichen mit PTEN-spezifischen Antisense-Konstrukten.
  • 4 zeigt, dass der 3'-Überhang von RNAi-Molekülen für RNA-Interferenz nicht wichtig ist. Genauer zeigt 4A eine Dosis-Antwort-Kurve verschiedener RNAi-Moleküle und 4B zeigt die Sequenz von RNAi-Molekülen, die in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis in 4A gezeigt ist.
  • 5 zeigt, dass die Duplexlänge der RNAi-Moleküle wenigstens 18-19 Nukleotide lang sein muss. Genauer zeigt 5B die Sequenz der PTEN-spezifischen RNAi-Moleküle, die in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis in 5A als Dosis-Antwort-Kurve dargestellt ist.
  • 6 zeigt, dass vier terminale fehlgepaarte Nukleotide in RNAi-Molekülen mit einer Länge von 19 Nukleotiden hinsichtlich der Vermittlung eines Knock-Downs von Akt1 noch funktionell sind. Genauer zeigt 6B die Sequenz der in dem Experiment verwendeten RNAi-Moleküle, dessen Ergebnis in 6A gezeigt ist.
  • 7 zeigt weitere Ergebnisse hinsichtlich der Duplexlängenerfordernisse und Toleranz gegenüber Mutationen in siRNAs. Genauer zeigt 7A die verschiedenen Konstrukte, die verwendet wurden (linke Tafel) und die entsprechende Wirkung auf die Inhibition von Akt1- mRNA-Expression in HeLa-Zellen relativ zur Expression von p110α, die in den angegebenen siRNA-Molekülmengen verwendet wurden (rechte Tafel). Die Nukleotidänderungen in den Fehlpaarungs-siRNA-Molekülen sind durch Pfeile angegeben. Das 3'-Desoxynukleotid, wenn es ein solches gibt, ist in Großbuchstaben angegeben. 7B zeigt die verschiedenen PTEN-spezifischen siRNAs (linke Tafel), die Inhibition von PTEN-mRNA-Expression in HeLa-Zellen, ausgedrückt als das Verhältnis PTEN/p110α, bei verschiedenen Mengen von siRNA (mittlere Tafel), und 7C eine Western Blot-Analyse, die die Inhibition der PTEN-Proteinexpression darstellt unter Verwendung von PTEN-spezifischer siRNA (30nM) und entsprechender fehlpaarender siRNA nach 48 bzw. 96 Stunden, wobei p100α als Ladekontrolle verwendet ist.
  • 8 zeigt die Ergebnisse von Studien hinsichtlich der Stabilität in Serum, die RNAi-Moleküle durch 2'-O-Methylierung verliehen wird, und dass End-Modifikationen keine vorteilhafte Wirkungen auf die RNAi-Stabilität aufweisen. Genauer zeigt 8A das Ergebnis einer Gel-Elektrophorese der verschiedenen, in 8B gezeigten RNAi-Moleküle, die eine Inkubation mit fötalem Kälberserum ausgesetzt waren.
  • 9 zeigt, dass eine Amino-Endmodifikation zum Verlust an Aktivität führt. 9B zeigt die speziellen RNAi-Moleküle, die in Experimenten verwendet wurden, deren Ergebnis in 9A gezeigt ist, ausgedrückt als PTEN/p 110α-Expressionsniveauverhältnis. 9C zeigt die Ausgestaltungsprinzipien, die aus den in 9A dargestellten Ergebnissen abgeleitet werden können. Wie in 9C verwendet, bedeutet der Begriff funktionell funktionell aktiv in dem speziellen Testsystem, wie in dem Beispiel beschrieben und „nicht funktionell" bedeutet nicht funktionell in dem besagten System.
  • 10 zeigt, dass 2'-O-Alkyl(Methyl)-Modifikationen RNAi-Moleküle stabilisieren, aber auch zur Verringerung ihrer Aktivität führen. Genauer zeigt 10C die Sequenz der RNAi-Molekülen, die in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis als eine Dosis-Antwort-Kurve in 10A dargestellt ist. 10B zeigt das Ergebnis einer Gel-Elektrophorese der verschiedenen in 10C dargestellten RNAi-Moleküle, die einer zweistündigen Inkubation in fötalem Kälberserum ausgesetzt waren.
  • 11 zeigt das Ergebnis eines Experiments hinsichtlich der Wirksamkeit von RNAi-Molekülen mit Blöcken aus 2'-O-Methylmodifikationen, wobei 11A graphisch die Ergebnisse der Experimente als eine Dosis-Antwort-Kurve darstellt und 11C die Sequenzen der speziellen RNAi-Moleküle zeigt, die in den Experimenten verwendet wurden, und 11B das Ergebnis einer Gel-Elektrophorese der verschiedenen in 11C dargestellten RNAi-Moleküle zeigt, die einer zweistündigen Inkubation in fötalem Kälberserum unterzogen worden waren.
  • 12 zeigt, dass eine alternierende 2'-O-Methylmodifikation zu einer Aktivität der modifizierten RNAi-Moleküle verglichen mit unmodifizierten Formen führt. Genauer zeigt 12B die Sequenz der in diesem Experiment verwendeten RNAi-Moleküle, deren Ergebnis in 12A gezeigt ist. 12C zeigt die Stabilität der RNAi-Moleküle nach Inkubation in Serum für zwei Stunden, wohingegen 12D einen Immunoblot für PTEN-Protein nach Anwenden verschiedener RNAi-Moleküle auf HeLa-Zellen zeigt. Wie daraus ersichtlich sind RNAi-Moleküle mit alternierenden Modifikationen gegen Endonukleaseabbau stabilisiert und aktiv beim Vermitteln eines PTEN-Protein-Knock-Downs.
  • 13 zeigt das Ergebnis einer Western Blot-Analyse, um den Zeitverlauf eines PTEN-Protein-Knock-Downs zu bestimmen. Die Zellen wurden kontinuierlich mit 2'-O-Methylmodifizierten gegenüber unmodifizierten RNAi-Molekülen unter Verwendung von kationischen Lipiden für 72 Stunden transfiziert. Proteinlysate wurden hergestellt und durch Immunoblot nach 48 und 120 Stunden analysiert. Für die 96 Stunden- und 120 Stunden-Zeitpunkte wurden die Zellen aufgeteilt, erneut ausplattiert und in Abwesenheit von RNAi-Molekülen für weitere 20 und 48 Stunden inkubiert.
  • 14 zeigt einen Western Blot, der den Protein-Knock-Down von PTEN darstellt, der persistent ist bei Verwendung von alternierend modifizierten RNAi-Molekülen verglichen mit unmodifizierten RNAi-Molekülen. Die Transfektion wurde für nur 5 Stunden durchgeführt und neues Medium ohne Transfektionsreagens wurde hinzugegeben. Die Lysate wurden analysiert durch Immunoblot 72 und 96 Stunden nach Transfektion mit den angegebenen RNAi-Molekülen.
  • 15 zeigt, dass siRNA-Moleküle mit distinkten 2'-O-Ribonukleotidmodifikationen eine erhöhte Stabilität in Serum aufweisen und Protein-Knock-Down in HeLa-Zellen vermitteln. Insbesondere zeigt 15A die verschiedenen siRNA-Molekülkonstrukte, die verwendet wurden (linke Tafel), wobei 2'-O-Methylribonukleotidmodifikationen unterstrichen und durch Fettdruck in der Sequenz angegeben sind. Die Inhibierung von PTEN-mRNA-Expression in HeLa-Zellen, die mit den angegebenen Mengen modifizierter siRNA-Moleküle infiziert waren, ist als Verhältnis PTEN/p110α ausgedrückt und auf der rechten Tafel angegeben. 15B zeigt auf der linken Tafel die verschiedenen siRNA-Konstrukte, die verwendet wurden, und auf der rechten Tafel eine PAA-Gel-Elektrophorese modifizierter und unmodifizierter siRNA-Moleküle nach Inkubation in Serum. Die verschiedenen Konstrukte mit 2'-O-Methylribonukleotiden sind durch Unterstreichung und Fettdruck angegeben. 15C zeigt einen SDS-PAGE-basierten Immunoblot, der die Inhibierung von PTEN-Proteinexpression unter Verwendung verschiedener der siRNA-Konstrukte (30 nM), wie in 15A bzw. 15B gezeigt, veranschaulicht. Wiederum wird p110α als Ladekontrolle verwendet. Schließlich ist 15D ein Immunoblot, der einen verlängerten Protein-Knock-Down zeigt, d. h. die Inhibierung von PTEN-Proteinexpression, nach Verabreichung von siRNA-Molekülen (30 nM) mit distinken 2'-O-Methylribonukleotidmodifikationen nach 48 und 128 Stunden. Wie in 15C wird p110α als Ladekorolle verwendet.
  • 16 zeigt, dass siRNA-Moleküle mit distinkten 2'-O-Methylribonukleotidmodifikationen, die für Akt1- und p110β-mRNA spezifisch sind, eine erhöhte Stabilität in Serum aufweisen und Protein-Knock-Down in HeLa-Zellen vermitteln. Genauer zeigt 16C auf der linken Tafel die verschiedenen Konstrukte, die verwendet wurden, wobei wiederum 2'-O-Methylribonukleotide unterstrichen und in Fettdruck dargestellt sind. Die Integrität der angegebenen siRNA-Moleküle nach Inkubation in Serum ist in der rechten Tafel gezeigt. 16B zeigt einen Immunoblot von Akt1-, Akt2- und Akt-Phosphorylierung und p110 ist als Ladekontrolle nach Transfektion der Zellen mit den angegebenen siRNAs (30 nM) verwendet. 16C zeigt verschiedene p110β-spezifische siRNA-Konstrukte (linke Tafel), wobei die 2'-O-Methylmodifikationen unterstrichen und in Fettdruck gehalten sind, und das Ergebnis einer Immunoblot-Analyse der Inhibierung der Phosphorylierung der stromabwärtigen Kinase Akt1 durch die siRNA-Konstrukte (rechte Tafel). P110α ist als Ladekontrolle verwendet worden.
  • 17 zeigt die Wirksamkeit verschiedener RNAi-Moleküle mit Hairpin-Strukturen als Dosis-Antwort-Kurven, während 17B die Struktur der RNAi-Moleküle zeigt, deren Ergebnis in 17A dargestellt ist. Synthetische siRNAs mit unterschiedlichen Schleifen sind hinsichtlich der Verringerung der Expression von p110β, Akt1 und Akt2 funktionell. (14A) Inhibierung von p110b-mRNA-Expression in siRNA-transfizierten HeLa-Zellen.
  • Proben wurden parallel auf das Niveau der p110β-mRNA-Expression 24 Stunden nach Transfektion der angegebenen siRNAs analysiert. Die transfizierten bimolekularen siRNAs (21mer mit 3'TT-Überhängen, Molekül 1AB) oder die monomolekularen siRNAs mit Schleifen-Strukturen sind schematisch gezeigt. Es ist beachtlich, dass die Position der Schleifen (HIV-abgeleitete pA-Schleife; (A)12-Schleife) relativ zu der Antisense-Sequenz in 3A, 4A relativ zu 3B, 4B umgekehrt ist. Das 2AB siRNA-Molekül enthält 6 Fehlpaarungen in dem 21mer-Duplex und dient als Negativkontrolle zusammen mit der unbehandelten Probe. RNA wurde hergestellt und einer Echtzeit-RT-PCR (Taqman)-Analyse unterzogen. p110β-mRNA-Niveaus sind relativ zu den mRNA-Niveaus von p110α gezeigt, das als interne Referenz dienen. Ein jeder Balken stellt Dreifachtransfektionen dar (± Standardabweichung). HeLa-Zellen wurden bei einer Konfluenz von 50% (2500 Zellen pro 96 Napf) mit siRNAs bei den angegebenen Konzentrationen in Wachstumsmedium transfiziert.
  • 18 zeigt die Wirksamkeit verschiedener RNAi-Moleküle mit intermolekularen und intramolekularen Schleifenstrukturen als Dosis-Antwort-Kurven. (18A) Inhibition von Akt1-mRNA-Expression in siRNA-transfizierten HeLa-Zellen. Proben wurden parallel auf das Niveau von Akt1- und Akt2-mRNA-Expression 24 Stunden nach Transfektion der angegebenen siRNAs analysiert. Die verschiedenen Schleifen (A-Schleifen; GAGA-Schleife und ein Polyethylenglycol (PEG)-Linker) und ihre mutmaßliche Sekundärstruktur sind schematisch gezeigt. Das siRNA-Molekül 9A ist spezifisch für Akt2 und dient als Negativkontrolle. Beachte, dass 10A und 10B keine selbst-komplementären Sequenzen enthalten und in Kombination transfiziert sind. Akt1-mRNA-Niveaus sind relativ zu den mRNA-Niveaus von p110β angegeben, die als interne Kontrolle dienten. (18B) Inhibierung von Akt2-mRNA-Expression in HeLa-Zellen, die mit den angegebenen siRNA-Molekülen transfiziert sind. Akt2-mRNA-Niveaus sind relativ zu den mRNA-Niveaus von p110β gezeigt. Das Akt1-spezifische Molekül 7A dient hier als Negativkontrolle.
  • 18C zeigt eine Western Blot-Analyse betreffend Akt-Protein, die die Funktionalität von synthetischen siRNAs mit verschiedenen Schleifen hinsichtlich des spezifischen Verringern der Akt1- und Akt2-Expression darstellt. Die Inhibierung von Akt1- und Akt2-Proteinexpression wurde durch Immunoblot analysiert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion der angegebenen Hairpin-siRNAs (20 nM) geerntet. Zellextrakte wurden durch SDS-PAGE getrennt und durch Immunblotten unter Verwendung von anti-p110-Antikörper anti-Akt 1/2 analysiert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem Antikörper erhalten, der für die phosphorylierte Form von Akt1 spezifisch ist. Die Positionen von p110α, einer weiteren katalytischen Untereinheit der PI 3-Kinase, die als Ladekontrolle verwendet wurde, und von Akt1, Akt2 und phosphoryliertem Akt (P*-Akt) sind auf der linken Seite angegeben.
  • 19 zeigt eine NH2-Modifikation, die hierin auch als Amino-Modifikation bezeichnet wird, die entweder am 3'-OH-terminalen Nukleotid oder dem 5'-terminalen Nukleotid vorhanden sein kann. Die Aminogruppe ist an das Phosphat gebunden, das wiederum an die OH-Gruppe des Zuckerteils gebunden ist, durch eine Alkylgruppe, die eine Alkylkette aus 1 bis 8, bevorzugterweise 6 C-Atomen umfasst, wobei das zweite C-Atom nahe an der Phosphatgruppe eine CH2OH-Gruppe daran gebunden aufweist. Als eine Alternative kann der Linker durch einen Ether ausgebildet sein, wobei der Ether aus zwei Alkoholen besteht, wobei ein Alkohol ein Aminoalkohol und der andere ein Dialkohol ist, wobei eine Alkoholgruppe an der Ausbildung der Ethergruppe beteiligt ist und die andere eine OH-Gruppe ist, die an einem jeden der C-Atome angeordnet ist, bevorzugterweise an dem zweiten C-Atom relativ zur Phosphatgruppe.
  • Beispiel 1: Dosis-Antwort synthetischer Duplex-RNAi-Moleküle
  • Bei diesem Beispiel wurde der Einfluss von NH2-Endschutzgruppen auf die Aktivität von Duplex-RNAi-Molekülen untersucht. Synthetische siRNAs wurden von Biospring (Frankfurt, Deutschland) gekauft. Die Ribo-Oligonukleotide wurden in RNase-freiem TE auf eine Endkonzentration von 50 μM resuspendiert. Im Falle von bimolekularen siRNA-Molekülen wurden gleiche Aliquots (100 μM) kombiniert zu einer Endkonzentration von 50 μM. Für die Ausbildung von intramolekularen Duplexen wurden die siRNAs bei 50°C für 2 Minuten in Annelierungsbuffer (25 mM NaCl; 5 mM MgCl2) inkubiert und Raumtemperatur abgekühlt. Transfektionen wurden in Platten mit 96 Näpfen oder 10cm-Platten (bei 30% bis 50% Konfluenz) unter Verwendung verschiedener kationischer Lipide wie beispielsweise Oligofectamin, Lipofectamin (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, CO), oder FuGene 6 (Roche) gemäß den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. RNAi-Moleküle wurden transfiziert durch Hinzugeben von vorab ausgebildetem 5x-konzentriertem Komplex aus annelierter RNAi und Lipid in Serum-freiem Medium zu Zellen in vollständigem Medium. Vor der Transfektion wurden 2500 HeLa-Zellen pro Napf 15 bis 18 Stunden vor der Transfektion für das 96-Napf-Format transfiziert.
  • Das Gesamttransfektionsvolumen beträgt 100 μl für Zellen, die in Platten mit 96 Näpfen ausplattiert waren, und 10 ml für in 10cm-Platten ausplattierten Zellen. Die Lipidendkonzentration betrug 0,8 bis 1,2 μg/ml, abhängig von der Zelldichte; die RNAi-Konzentration ist in einem jeden Experiment angegeben.
  • Man erlaubte, dass die Komplexbildung für 30 Minuten bei 37°C stattfand. Komplexe wurden zu den Zellen hinzugegeben, um eine 1 × Endkonzentration von sowohl Lipid als auch RNAi zu ergeben. Abhängig von der nach Transfektion durchgeführten Analyse wurden Zellen lysiert unter Verwendung von Standardzelllysebuffer für die Proteinextraktion (Klippel, A., Escobedo, J. A., Hirano, M. and Williams, L. T. (1994). Mol Cell Biol 14, 2675-2685) oder einen denaturierenden Puffer für RNA-Isolierung gemäß dem RNA-Isolierungskit (Invitek, Berlin (Deutschland)), 24 bis 48 Stunden nach Transfektion für RNA-Analyse und 48 bis 72 Stunden nach Transfektion für Proteinanalyse durch Western Blot.
  • Bestimmung von relativen Mengen von RNA-Niveaus durch Taqman-Analyse:
  • 24 Stunden nach Transfektion wurde die RNA von Zellen, die in Platten mit 96 Näpfen transfiziert waren, isoliert und gereinigt unter Verwendung des Invisorb RNA HTS 96 kit (InVitek GmbH, Berlin). Inhibierung von PTEN-mRNA-Expression wurde nachgewiesen durch Echtzeit-RT-PCR (Taqman)-Analyse unter Verwendung von 300 nM PTEN 5'-Primer CACCGCCAAATTTAACTGCAGA, 300 nM PTEN 3'-Primer AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT und 100 nM der PTEN-Taqman-Sonde Fam-TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA-Tamra in Kombination mit 40 nM β-Actin 5'-Primer GTTTGAGACCTTCAACACCCCA, 40 nM β-Actin 3'-Primer GACCAGAGGCATACAGGGACA und 100 nM der β-Actin Taqman-Sonde Vic-CCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG-Tamra. Die Akt-Primer- und Sonden wurden wie in Stemberger et al. bestimmt (Stemberger, a.a.O.) und werden verwendet gemäß den Angaben des Herstellers (Applied Biosystem; Verwendung des Amplicon-Sets). Die Primer und Sonden können auch ausgestaltet werden unter Verwendung des Software-Programms Primer Express (Applied Biosystem). Die Reaktion wurde in 50 μl durchgeführt und auf dem ABI PRISM 7700-Sequenz-Detektor (Applied Biosystem) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter den folgenden Bedingungen getestet: 48°C für 30 Minuten, 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen aus 15 Sekunden bei 95°C und einer Minute bei 60°C.
  • RNA-Knock-Down ist durch Echtzeit-RT-PCR-Analyse von HeLa-Zellen gezeigt, die mit 21 nt-langen Duplex-Molekülen transfiziert waren, die entweder unmodifiziert oder mit entweder NH2 oder invertierten abasischen Nukleotiden am 5'-Ende modifiziert waren, bei einer Lipidträgerkonzentration von 1,0 μg/ml. Die Zelldichte betrug 2000 Zellen/Napf. Modifikationen am 3'-Ende sind entweder RNA-Überhänge, RNA-Überhänge mit Aminogruppen oder DNA-Überhänge.
  • Herstellung von Zellextrakten und Immunbloten
  • Zellen wurden zweifach mit kalter Phosphat-gepufferter Saline gewaschen und bei 4° C in Lysepuffer lysiert, der 20 mM Tris (pH 7,5), 137 mM NaCl, 15 % (Vol/Vol) Glycerol, 1 % (Vol/Vol) Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mg Aprotinin pro ml, 20 mM Leupeptin, 2 mM Benzamidin, 1 mM Natriumvanadat, 25 mM β-Glycerolphosphat, 50 mM NaF und 10 mM NAPPi enthält. Lysate wurden geklärt durch Zentrifugation bei 14.000 xg für 5 Minuten und Aliquots der Zellextrakte, die gleiche Mengen an Protein enthielten, wurden hinsichtlich Proteinexpression durch Western-Bloten analysiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) transferiert. Die Filter wurden blockiert in TBST-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,05 % (Vol/Vol) Tween 20, 0,5% (Gew/Vol) Natriumazid), der 5 % (Gew/Vol) getrocknete Milch enthält. Die entsprechenden Antikörper wurden in TBST mit geeigneten Verdünnungen hinzugegeben. Gebundener Antikörper wurde nachgewiesen unter Verwendung von anti-Maus- oder anti-Kaninchen-konjugierter Meerrettichperoxidase (Transduction Laboratories) in TBST, gewaschen und entwickelt unter Verwendung des SuperSignal West Dura (Pierce) oder von ECL (Amersham)-chemilumineszierenden Substraten (siehe Sternberger et al. (2002). Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev. in press).
  • Antikörper
  • Der murine monoklonale anti-p110-Antikörper U3A und der murine monoklonale anti-p85-Antikörper N7B sind beschrieben worden (Klippel et al., 1994, aaO). Polyklonale Kaninchen-anti-AKT und anti-Phospho-Akt (S473)-Antikörper wurden von Cell Signaling Technology erhalten. Der murine monoklonale anti-PTEN-Antikörper stammt von Santa Cruz Biotechnology. Das PTEN 53-spezifische Antisensemolekül, d. h. GeneBloc, ist beschrieben in Sternberger et al. (Sternberger aaO) mit der folgenden Sequenz (ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga), wobei die in Kleinbuchstaben dargestellten Nukleotide Ribonukleotide sind, wohingegen die Nukleotide in Großbuchstaben Desoxyribonukleotide sind. Das Antisense-Molekül ist ebenfalls identisch zu RNAi 1A ohne TT.
  • Die Ergebnisse sind in 3A und die entsprechenden RNAi-Moleküle in 3B gezeigt, die gegen die mRNA von PTEN gerichtet sind. Die in Kleinbuchstaben geschriebenen Nukleotide stellen Ribonukleotide dar, wohingegen Großbuchstaben Desoxyribonukleotide darstellen. Der Begriff NH2 zeigt an, dass die 3'-Position des Ribonukleotids durch eine Amina-Gruppe modifiziert war. Die RNAi-Moleküle, die in diesem und anderen Beispielen, wie sie hierin offenbart sind, verwendet sind, werden auch als kleine interferierende RNA-Moleküle, siRNA, bezeichnet. Es soll festgehalten werden, dass in einer jeden der hierin enthaltenen Figuren der obere Strang der Antisense- oder erste Strang ist, wohingegen der untere Strang der Sense- oder zweite Strang des interferierenden RNA-Moleküls ist.
  • Wie aus 3A entnommen werden kann, sind Endmodifikationen wie beispielsweise Aminomodifikationen und invertierte abasische Nukleotide Modifikationen der terminalen OH-Gruppe der Nukleinsäure ebenso potent wie unmodifizierte Enden, wenn die Modifikation am 3'-Ende des Antisense-Stranges angeordnet ist (siehe auch 8A; 8B). Deshalb werden chemische Modifikationen zur Stabilisierung oder mit anderen vorteilhaften Eigenschaften (Abgabe) toleriert werden ohne Aktivitätsverlust, wenn sie am 3'-OH lokalisiert sind; insbesondere wenn das 3'-OH an einem überhängenden Nukleotid angeordnet ist.
  • Für das in 3C gezeigte Experiment wurden ähnliche Bedingungen wie oben angegeben verwendet. Der erste Strang und der zweite Strang der RNAi waren entweder durch eine NH2-Gruppe an der 3'-Position des Riboseteils oder durch ein invertiertes abasisches Nukleotid an der Position modifiziert. Das erste Konstrukt ist als siRNA-NH2 (3A3B) bezeichnet, das zweite als siRNA-iB (4A4B). Die Sequenz beider Moleküle ist in 3B dargestellt. Der Begriff 3A3B zeigt an, dass die interferierende Ribonukleinsäure aus Strang 3A als den Antisense-Strang und Strang 3B als den Sense-Strang besteht. Aus Vergleichsgründen wurde ein Antisense-Oligonukleotid erzeugt, das als GB53 bezeichnet ist (Steinberger et al. aaO), das ebenfalls gegen die mRNA von PTEN gerichtet war. Die Besonderheiten dieses letzteren Experimentes waren die folgenden.
  • Wie aus 3C entnommen werden kann, sind endgeschützte RNAi-Moleküle, wie sie in 3B dargestellt sind, funktionell dahingehend, dass sie einen PTEN-Protein-Knock-Down ergeben.
  • Aus diesem Beispiel kann entnommen werden, dass beide Endschutzgruppen RNAi-Moleküle hinsichtlich des Knock-Downs von PTEN-Protein aktiv machen. Diese Inhibierung ist so wirksam wie eine Inhibierung mit Antisense-Konstrukten, aber bei niedrigeren verwendeten Konzentrationen, was einen klaren Vorteil gegenüber der bereits sehr leistungsfähigen Antisense-Technologie darstellt.
  • Beispiel 2: Überhang-Erfordernisse für RNAi-Duplexaktivität in vivo
  • Die experimentellen Vorgehensweisen waren die gleichen wie im Zusammenhang mit Beispiel 1 dargestellt mit der Ausnahme, dass die PTEN-mRNA-targetierenden interferierenden RNAi-Moleküle unterschiedlich ausgestaltet waren. Die Ergebnisse sind in 4A als Dosis-Antwort-Kurven gezeigt, wobei 4B die besondere Sequenz und Modifikationen der interferierenden RNAi-Moleküle zeigt, die verwendet wurden, um die in 4A dargestellten Daten zu erzeugen. Die Nomenklatur ist so, dass, beispielsweise, RNAi 18 aus Strang 18A als Antisense-Strang und Strang 18B als Sense-Strang zusammengesetzt ist.
  • Glattendige Moleküle werden mit Molekülen mit 3'-Überhängen (RNAi 18) und 5'-Überhängen (RNAi 30 und RNAi 31) hinsichtlich ihrer Aktivität verglichen, PTEN-mRNA in HeLa-Zellen herunterzuregulieren (Knock-Down). Die Aktivität von glattendigen Molekülen (RNAi 28) und Molekülen mit 5'-Überhängen ist vergleichbar mit der Aktivität von Molekülen mit 3'-Überhängen. Dies zeigt, dass 3'-Überhänge für RNAi-Aktivität nicht essentiell sind.
  • Beispiel 3: Duplexlängenerfordernis von interferierenden RNA-Molekülen für RNAi-Aktivität in vivo
  • Der experimentelle Ansatz war ähnlich dem im Zusammenhang mit Beispiel 1 dargestellten, mit der Ausnahme, dass die interferierenden RNA-Moleküle gegen die mRNA von Akt1 gerichtet waren. Die Negativkontrolle, um die Spezifität der RNAi-Moleküle zu zeigen, war wiederum p110-mRNA. Die experimentellen Ergebnisse sind in 5A gezeigt, wobei die Besonderheiten der interferierenden RNAi-Moleküle, wie sie verwendet wurden, in 5B gezeigt sind. Ähnliche Experimente wurden durchgeführt mit weiteren siRNA-Konstrukten, die in 7A, linke Tafel dargestellt sind, wobei die Pfeile Fehlpaarungen angeben und Desoxyribonukleotide in Großbuchstaben dargestellt sind. Die Inhibierung von Akt1-mRNA-Expression in HeLa-Zellen, die mit den angegebenen Mengen von siRNA-Molekülen transfiziert sind, ist in der rechten Tafel von 7A gezeigt.
  • Die Taqman-Analyse von Akt-RNA von HeLa-Zellen, die mit verschiedenen RNAi-Molekülen transfiziert waren, zeigt, dass der doppelsträngige Duplex der siRNA-Moleküle länger als 17 Basenpaare sein muss, um eine Aktivität zu zeigen, wohingegen Moleküle mit 17 Basenpaaren langen Duplexen oder kürzer nicht funktionell sind, selbst wenn Sequenzspezifische Überhänge hinzugefügt sind. Die kürzesten, erfolgreich getesteten RNAi-Moleküle waren 18 bis 19 Nukleotide oder Basenpaare lang. Es soll festgehalten werden, dass die Ausgestaltung des interferierenden RNA-Moleküls 51A/51B, das als RNAi51 bezeichnet ist, derjenigen entspricht, wie sie in der internationalen Patentanmeldung WO 01/75164 beschrieben ist. Das RNAi-Molekül 55A/55B umfasst einen Abschnitt aus 17 Nukleotiden und weist eine eindeutig verringerte Aktivität hinsichtlich des Abbaus von Akt1-mRNA auf.
  • Wie aus 7A entnommen werden kann, sind 17 nt lange Duplexe hocheffizient bei der Verringerung von Akt1-mRNA-Niveaus unabhängig von der Art (Desoxy- oder Ribonukleotide) des 3'-Überhanges (vergleiche Moleküle 1AB, 2AB, 3AB, 4AB). Die 17 Nukleotid-lange siRNA (Molekül 5AB) zeigte eine dramatisch verringerte Abschaltaktivität, was das oben ausgedrückte Verständnis bestätigt, dass aktive siRNA-Duplexe wenigstens 18 nt oder länger sein sollten. Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, kann dieses Ergebnis mechanistisch durch zwei unterschiedliche Erfordernisse erklärt werden. Erstens kann eine minimale Basenpaarung aus 18 nt zwischen dem Antisense der siRNA und der Ziel-mRNA obligatorisch sein, oder, zweitens, erfordert der Einbau in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eine Minimallänge des siRNA-Duplex. Um diese Frage zu adressieren, wurde ein 19 nt langes siRNA-Duplexmodell mit einer und zwei terminalen Mutationen (CG und UA-Inversion) relativ zur Wildtyp-Sequenz synthetisiert (Moleküle 6AB und 7AB). Beide Moleküle, selbst das Molekül mit einem Abschnitt aus nur 15 nt, der mit der Ziel-mRNA basenpaarte, war bei der Induktion des Akt1-mRNA-Niveaus funktionell. Deshalb kann gefolgert werden, dass die Duplexlänge selbst, aber nicht die Basenpaarung der Antisense-siRNA mit der Ziel-RNA die Minimallänge funktioneller siRNAs zu bestimmen scheint. Dies schlägt vor, dass die Länge der doppel-strängigen Helix eine wichtige Determinante für den Einbau in den RISC-Komplex ist. Die eingeführten Fehlpaarungen an den terminalen Enden der siRNA-Duplexe hatten einen geringen Einfluss auf RNA-Interferenz.
  • Mit Blick auf die experimentellen Ergebnisse ist das Minimalerfordernis für optimale RNAi-vermittelte Interferenz einer Duplexlänge von 18 oder 19 Nukleotiden, unabhängig von dem weiteren Design der RNAi-Moleküle, wie beispielsweise glattendig oder mit 5'-Überhang oder irgendeiner anderen Form, wie hierin offenbart, sondern allgemein auf RNAi-Moleküle anwendbar. Es muss jedoch anerkannt werden, dass die spezielle Ausgestaltung der RNAi-Moleküle diesen Molekülen weitere Vorteile verleihen kann, wie beispielsweise erhöhte Wirksamkeit bzw. erhöhte Stabilität.
  • Beispiel 4: Ziel-Antisense-Homologie-Erfordernis für RNAi in vivo
  • Der experimentelle Aufbau war ähnlich zu dem in Beispiel 1 beschriebenen, wobei die RNAi spezifisch für Akt1 ist. Zusätzlich wurde ein PTEN-spezifisches interferierendes RNA-Molekül konstruiert und als Negativkontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 6A und 6B gezeigt. Grundsätzlich wurde das gleiche Experiment ausgeführt unter Verwendung weiterer siRNA-Moleküle, wie in 7B dargestellt, wobei die Ergebnisse in 7B (rechte Tafel) bzw. 7C dargestellt sind.
  • Nachdem die minimale Duplexlänge von 18 oder mehr als 18 Nukleotiden für funktionelle siRNA-Moleküle etabliert war, stellten wir die Frage, wie viele passende Nukleotide zwischen Ziel-mRNA und siRNA für die Abschaltaktivität notwendig sind. Wie durch Taqman-Analyse an Akt1-RNA gezeigt, ist ein Abschnitt aus 19 bis 15 Nukleotiden, die perfekt zu der Ziel-RNA passen, in diesem Falle Akt1, ausreichend, um RNAi-Aktivität zu vermitteln. Ein PTEN-spezifisches RNAi-Molekül verringert die RNA-Mengen von Akt1 nicht, was somit die Spezifität dieses Ansatzes bestätigt. Fehlpaarungen aus einem oder zwei Nukleotiden an einem oder beiden Enden eines Stranges sind funktionell, was nahelegt, dass ein homologer Abschnitt aus 15 nt zwischen einer Ziel-mRNA und RNAi für das Abschalten eines Gens ausreichend ist. Es kann aus diesen Daten gefolgert werden, dass ein unspezifisches Abschalten eines Gens durch Zufall durch unspezifisches Binden an nicht-verwandte Ziele erfolgen kann. Dies basiert auf dem Verständnis, dass ein Abschnitt aus 15 bis 17 passenden Basenpaaren für ein einzelnes Gen nicht spezifisch ist und durch Zufall, mit Blick auf die Komplexität und Größe des Genoms oder Transkriptoms von Vertebraten, auftreten wird. Neben den zuvor beschriebenen Experimenten wurde auch die Position der Fehlpaarung nachfolgend analysiert. Zu diesem Zweck wurde eine 19 nt lange glattendige siRNA verwendet, die gegen PTEN-mRNA gerichtet war. Die Sequenzänderungen in einem siRNA-Strang wurden ausgeglichen durch komplementäre Änderungen in dem anderen Strang, um ein Auseinanderreisen der Duplexbildung zu vermeiden. Wie sowohl aus 7A als auch C entnommen werden kann, war eine siRNA mit nur einer Punktmutation im Zentrum des Moleküls hinsichtlich seiner Fähigkeit stark eingeschränkt, mRNA und Protein-Niveaus zu verringern. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die RNA-Maschinerie stark zwischen perfektem und nicht-perfektem Basenpaaren zwischen Ziel-mRNA und siRNA im Zentrum des Duplexes unterscheidet. Diese extreme Abhängigkeit von einer perfekten Komplementarität zwischen Ziel- und siRNA ist bereits für RNAi-Interferenz im Drosophila-System beschrieben worden, jedoch noch nicht im Zusammenhang mit Säugersystemen wie beispielsweise HeLa.
  • Auf der Grundlage dieser Beobachtung verringert die vorliegende Erfindung dieses Off-Target-Problem von siRNA durch zwei Ansätze. Zuerst durch Verringern der Moleküllänge der siRNA-Moleküle auf die minimalen Erfordernisse (18-19 nt) und dadurch Verringern der Chance einer Homologie zu einem Off-Target. Zweitens, durch Inaktivieren des Sense-Stranges, um eine unerwünschte RNA-Abschaltung zu verhindern, die durch eine zufällige Komplementarität des Sense-Stranges zu einer nicht-verwandten Ziel-RNA bedingt wird (siehe auch Beipsiel 6).
  • Beispiel 5: Stabilität von modifizierten RNAi-Molekülen in Serum
  • Oligonukleotide wurden in menschlichem Serum für 15 Minuten und 2 Stunden inkubiert und auf 10 % Polyacrylamidgel zusammen mit unbehandelten Kontrollen geladen. Die Ergebnisse sind in 8A gezeigt. Die verschiedenen RNAi-Moleküle, die verwendet wurden, sind in 8B gezeigt und detaillierter beschrieben.
  • Aus diesem Beispiel kann entnommen werden, dass die RNAi-Duplexe von RNA-Molekülen, bei denen alle Nukleotide mit 2'-O-Methylgruppen modifiziert sind (RNAi-Moleküle 79A79B und 28A28B) eine höhere Stabilität in Serum aufweisen. Es ist auch gezeigt, dass ein glattendiger Duplex stabiler ist als das Duplexmolekül mit Überhängen. Daraus kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass der Endschutz (z. B. iB oder Amino) die Stabilität in Serum nicht erhöht.
  • Zusätzlich kann auch gefolgert werden, dass im Gegensatz zu dem Verständnis in der Technik vor dem Einreichen dieser Anmeldung Endonukleasen statt Exonukleasen beim Schutz von RNAi-Molekülen wichtiger sind.
  • Im Lichte dessen kann zusätzlich zu den verschiedenen Modifikationen oder Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen RNAi-Molekülen, wie sie in dieser Anmeldung offenbart sind, eine weitere oder zusätzliche Modifikation der Nukleotide in der Verwendung eines Phosphothiatrückgrates der RNAi-Moleküle gesehen werden, die entweder vollständig oder teilweise sein kann, um die Endonuklease-Funktion zu inhibieren. Ein vollständiges Phosphothioatrückgrat bedeutet, dass ein jedes Nukleotid eine Phosphothioatgruppe aufweist, wohingegen ein teilweises Phosphothioatrückgrat bedeutet, dass nicht alle der Nukleotide, die das RNAi-Molekül ausbilden, eine Phosphothioatmodifikation aufweisen. Diese Modifikation ist geeignet, die Lebenszeit von RNAi-Molekülen unabhängig von der weiteren Ausgestaltung von RNAi-Molekülen zu erhöhen. In dieser Hinsicht ist eine teilweise oder vollständig Phosphothioat-modifizierte RNAi Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die im Zusammenhang mit den verschiedenen Strategien für die Ausgestaltung von interferierenden RNA-Molekülen, wie sie hierin offenbart sind, oder mit irgendeiner der in der Technik bekannten Ausgestaltungen realisiert sein kann.
  • Beispiel 6: Inaktivierung des Sense-Stranges durch NH2-Endschutzgruppen an den 5'- und 3'-Enden
  • Der experimentelle Aufbau war ähnlich dem im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschriebenen, wobei die Zielnukleinsäuresequenz PTEN-mRNA ist. Die Konzentration von HeLa-Zellen betrug 2.000 Zellen pro Napf. RNA von PTEN wurde in Taqman-Tests nach Transfektion unterschiedlich modifizierter RNAi-Moleküle analysiert. Die verschiedenen interferierenden RNA-Moleküle, die verwendet wurden, sind in 9B dargestellt, wohingegen die experimentellen Ergebnisse in 9A gezeigt sind.
  • Wie aus diesen Dosis-Antwort-Kurven verschiedener RNAi-Moleküle, die in 8A dargestellt sind, entnommen werden kann, sind RNAi-Moleküle funktionell, wenn der Sense- Strang, d. h. der zweite Strang, an beiden Enden mit Aminogruppen modifiziert ist. Besonders wirksam sind die RNAi-Moleküle 20A26B, 18A26B und 28A26B. Die niedrigste Aktivität wird von dem RNAi-Molekül 26A26B gezeigt, das einer Endmodifikation an allen vier Enden des Duplexes entspricht (Tuschl ist 18AB).
  • Die RNAi-Aktivität wird jedoch auch erreicht, wenn der Antisense-Strang, d. h. der erste Strang, nur an dem 3'-Ende modifiziert ist, wodurch eine freie OH-Gruppe am 5'-Ende verbleibt (RNAi-Konstrukte 22A26B; 20A26B). Es gibt keine Aktivität, wenn der Antisense-Strang an sowohl dem 5'- als auch dem 3'-Ende mit Aminogruppen modifiziert ist (26A26B). Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass ein jegliches Ende des Antisense-Stranges und spezieller das 5'-Ende des Antisense ohne Modifikation verbleiben sollte. Zusätzlich ist es wert festzuhalten, dass die NH2-Endmodifikation verwendet werden kann, um den Sense-Strang an dem 5'- und 3'-Ende zu inaktivieren und deshalb off-target-Wirkungen zu verringern, die durch einen ansonsten funktionellen Sense-Strang vermittelt werden, was zu einer signifikant erhöhten Spezifität der RNAi-Moleküle führt, was für Target-Validierung ebenso wie für eine jegliche medizinische Verwendung von RNAi-Molekülen vorteilhaft ist.
  • Die weitere Verallgemeinerung der Ergebnisse aus diesem Experiment ist in 9C dargestellt. Funktionell aktive RNAi sind entsprechend jene, die keine Amino-Modifikation am Antisense-Strang oder eine Aminomodifikation nur an dem 3'-Ende des Antisense-Stranges aufweisen, wohingegen eine Aminomodifikation an beiden Enden des Antisense-Stranges nicht funktionell ist, d. h. nicht zu einem Knock-Down der Ziel-mRNA führt.
  • Beispiel 7: Einfluss von 2'-O-Methyl-Modifikation von RNAi-Molekülen hinsichtlich Schutz vor Endonukleasen
  • RNA-Knock-Down ist wiederum unter Verwendung der Echtzeit RT-PCR-Analyse an HeLa-Zellen gezeigt, die mit RNAi-Duplex-Molekülen transfiziert sind, die gegen die PTEN-mRNA gerichtet sind, wie in 10A dargestellt. Die experimentellen Verfahrensweisen waren grundsätzlich die gleichen wie in Beispiel 1 angegeben. Die Struktur der untersuchten RNAi-Moleküle und ihre Dosisantworten, die in 10A gezeigt sind, sind in 10C gezeigt. Die in Fettdruck gehaltenen Nukleotide sind jene mit einer 2'-O-Methyl-Modifikation.
  • Es ist durch die Dosis-Antwort-Kurven, die für verschiedene RNAi-Moleküle in 10A gezeigt sind, veranschaulicht, dass interne 2'-O-Alkylgruppen RNAi-Aktivität verringern. Bevorzugterweise sind solche 2'-O-Alkylgruppen 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Ethylgruppen. Moleküle mit unmodifizierten Nukleotiden in Verbindung mit 2'-O-Alkyl-Modifikation zeigen jedoch eine signifikante Aktivität. Wie auch in 10A dargestellt, tritt keine Aktivität auf, wenn der Antisense-Strang vollständig mit 2'-O-Methylgruppen modifiziert ist und deren Sense-Strang nicht modifiziert ist (siehe, beispielsweise, RNAi-Molekül 79A28B). Im Lichte dieser Ergebnisse eines Stabilitätstests wie beispielsweise Inkubieren der verschiedenen RNAi-Moleküle in Serum, wie in 10B gezeigt, zeigt, dass 2'-O-Alkyl-Modifikationen RNAi-Moleküle gegen Abbau stabilisieren. Diese eindeutig vorteilhafte Wirkung wird jedoch in einem bestimmten Umfang ausgeglichen durch die Wirkung, dass 2'-O-Alkyl-Modifikationen im Allgemeinen zu einer verringerten Knock-Down-Aktivität führen. Entsprechend muss die Ausgestaltung von RNAi-Molekülen Stabilität gegen Aktivität ausbalancieren, was es wichtig macht, dass man sich der verschiedenen Ausgestaltungsprinzipien, wie sie in der vorliegenden Anmeldung offenbart sind, bewusst ist.
  • Beispiel 8: Einfluss von Blöcken interner 2'-O-Methyl-Modifikationen auf die Stabilität von RNAi-Molekülen in Serum
  • Der experimentelle Ansatz im Zusammenhang mit dieser Studie war tatsächlich der gleiche, wie der in Beispiel 1 beschriebene. Wiederum wird PTEN-RNA durch Echtzeit-FT-PCR an HeLa-Zellen bei einer Dichte von 2.000 Zellen pro Napf analysiert, die mit unterschiedlichen Dosen von RNAi-Molekülen transfiziert waren. RNAi-Moleküle wurden in Serum für 2 Stunden inkubiert und auf einem 10 % Polyacrylamidgel analysiert. Die Ergebnisse dieser Studie sind in 11A bis 11C dargestellt, wobei 11A die Dosis-Antwort verschiedener RNAi-Moleküle zeigt, die in 11C dargestellt sind, und 11B die Ergebnisse eines Stabilitätstests unter Verwendung von einigen der in 11C gezeigten RNAi-Molekülen zeigt. Es soll verstanden werden, dass die in 11C in Fettdruck dargestellten Nukleotide diejenigen sind, die eine Modifikation tragen, die in diesem Falle eine 2'-O-Methyl-Modifikation des Riboseteils der Nukleotide ist.
  • Es existiert eine dosisabhängige Inhibierung durch die unmodifizierten RNAi-Moleküle. Es ist auch gezeigt, dass die 2'-O-Methyl-Modifikation der neun Kernnukleotide die RNAi in Serum stabil macht und eine Aktivität des Duplexes im Sinne des Interferenz-Phänomens erlaubt, was zu einem Abbau der PTEN-mRNA führt. Die Gesamtmodifikation des Sense-Stranges macht das RNAi-Molekül in Serum stabil und erlaubt eine gewisse Aktivität.
  • Abwechselnde Blöcke aus für Nukleotiden mit 2'-O-Methyl-Modifikation machen das RNAi-Molekül stabil in Serum und erlauben eine Aktivität auf PTEN-RNA, wie gezeigt durch Inkubation des RNAi-Duplex in Serum für 2 Stunden und Laden der Proben auf ein 10 % Polyacrylamidgel. Wie aus 11B entnommen werden kann, ist der Duplex umfassend die Stränge 80A und 80B nach Inkubation in Serum für 2 Stunden stark abgebaut. Der Duplex, der aus den Strängen 82A und 82B besteht, bestätigt das Ergebnis, dass das 5'-Ende des ersten Stranges, der den Antisense-Strang umfasst, nicht am 5'-terminalen Nukleotid modifiziert sein soll (vergleiche 82A und 82B mit dem umgekehrt orientierten 81A81B). Dies wird auch bestätigt durch die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn der Duplex aus den Strängen 86A und 86B besteht, der sowohl aktiv als auch in Serum stabilisiert ist. Es ist beachtlich, dass Moleküle mit unmodifizierten Blöcken am terminalen 5'-Ende des Antisense-Stranges aktiver sind, wobei die 5'-terminale OH-Gruppe bevorzugterweise nicht derivatisiert ist.
  • Weitere Experimente wurden durchgeführt unter Verwendung verschiedener Modifikationsmuster aus 2'-O-Methylmodifikation der Nukleotide. Die Ergebnisse davon sind in 12A bis 12C gezeigt und werden weiter hierin in Beispiel 9 diskutiert.
  • Beispiel 9: Der Einfluss von alternierender interner 2'-O-Alkyl-Modifikation auf Serumstabilität von RNAi-Molekülen
  • Der experimentelle Aufbau für die Durchführung dieser Art von Studie war der gleiche, wie er im Zusammenhang mit den in Beispiel 1 bzw. Beispiel 8 berichteten Studien verwendet wurde, wobei die Ziel-Nukleinsäure wiederum PTEN-mRNA war. HeLa-Zellen wurden mit den verschiedenen RNAi-Molekülen transfiziert, die in 12B dargestellt sind, und RNA-Knock-Down wurde gezeigt unter Verwendung von Echtzeit-RT-PCR an PTEN-RNA in einer dosisabhängigen Art (12A). Die Stabilität der verschiedenen RNAi-Moleküle nach 15 Minuten und 2 Stunden in Serum bei 37° C ist in 12C gezeigt und ein Western Blot für p110 und PTEN als das Zielprotein der verschiedenen RNAi-Moleküle ist in 12D gezeigt, wobei die getesteten RNAi-Moleküle in beiden Experimenten, die 12C und 12D zugrunde liegen, identisch sind.
  • Wie in 12A und 12C gezeigt, machen Nukleotide, die mit 2'-O-Methylgruppen modifiziert sind, und mit unmodifizierten Nukleotiden abwechseln, RNAi-Moleküle in Serum stabil, während sie erlauben, dass sie in dem Sinne aktiv sind, dass sie mit Ziel-mRNA interferieren. Es ist gezeigt, dass die Inkubation von RNAi-Duplexmolekülen für 15 Minuten und 2 Stunden in Serum den unmodifizierten Duplex und den Duplex abbauen wird, wo die zehn am meisten 5'-positionierten Nukleotide unmodifiziert sind.
  • Bei den in 12B dargestellten RNAi-Molekülen sind verschiedene Muster aus modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden realisiert. Das RNAi-Molekül 94A1/94B1 umfasst eine Struktur, wobei ein modifiziertes Nukleotid von einem unmodifizierten Nukleotid flankiert ist, wobei das unmodifizierte Nukleotid am 5'-Ende des ersten Stranges angeordnet ist. Das RNAi-Molekül, das aus den Strängen 94A2 und 94B2 besteht, ist ein weiteres Beispiel, wo die modifizierten Nukleotide und die unmodifizierten Nukleotide des ersten und zweiten Stranges an gegenüberliegenden Stellen angeordnet sind. Im Gegensatz dazu hat das RNAi-Molekül, das aus den Strängen 94A1 und 94B2 besteht, das gleiche Muster aus modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden. Es existiert jedoch eine Phasenverschiebung, so dass die modifizierten Nukleotide Basenpaare mit einem unmodifizierten Nukleotid ausbilden. Die zwei RNAi-Moleküle, die aus den Strängen 94A1 und 94B1 und Strängen 94A2 und 94B2 bestehen, unterscheiden sich darin, dass im ersten Falle der erste Strang mit einem unmodifizierten Nukleotid beginnt und das korrespondierende erste Nukleotid auf dem zweiten Strang, d. h. das Nukleotid am 3'-Ende des zweiten Stranges mit einem unmodifizierten Nukleotid beginnt, wobei die Anordnung dazu entgegengesetzt ist in dem RNAi-Molekül, das aus 94A2 und 94B2 besteht.
  • Zusätzlich sind alternierend modifizierte RNAi-Moleküle, wie sie in 12B gezeigt sind, funktionell hinsichtlich des Vermittelns eines PTEN-Protein-Knock-Downs wie in 12D gezeigt, aber nur, wenn das zweite 5'- und zweite 3'-terminale Nukleotid nicht modifiziert sind (siehe 94A294B1 und 94A294B2). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die stabilsten und aktivsten RNAi-Moleküle alternierende 2'-O-Alkyl-modifizierte und unmodifizierte Nukleotidreste aufweisen. Es sollte festgehalten werden, dass diese Moleküle eine sehr ähnliche mRNA-Verringerung aufweisen, wenn sie mit unmodifizierten siRNA-Molekülen verglichen werden, was, da sie in Serum stabil sind, eine erhöhte oder leichtere Handhabung erlaubt.
  • Beispiel 10: Durch intern modifizierte RNAi-Moleküle vermittelter funktioneller Protein-Knock-Down
  • Der experimentelle Ansatz war ähnlich dem im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschriebenen.
  • Western Blots wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion (48, 72, 96 und 120 Stunden) mit alternierend modifizierten RNAi-Molekülen, wie in 12B dargestellt, durchgeführt wurden. Aus experimentellen Gründen ist es beachtlich, dass die Zellen des 96 Stunden-Zeitpunktes aufgeteilt worden sind und die Hälfte der Population erneut ausplattiert wurde. Insgesamt 40 nM der verschiedenen RNAi-Moleküle wurden an diese Zellen verabreicht. Die Zellen wurden kontinuierlich für 72 Stunden mit kationischen Lipiden wie in Beispiel 1 beschrieben transfiziert; dann in Abwesenheit von Transfektionsreagenzien erneut ausplattiert.
  • Die Transfektionen wurden in Platten mit 96 Näpfen oder in 10 cm Platten (bei Konfluenz von 30 % bis 50 %) unter Verwendung verschiedener kationischer Lipide wie beispielsweise Oligofectamin, Lipofectamin (Life Technologies), NC388, L8 (atugen, Berlin) durchgeführt. RNAi wurde transfiziert durch Hinzugeben von zuvor ausgebildetem, fünfach konzentriertem Komplex aus siRNAs und Lipid in serumfreiem Medium zu Zellen in vollständigem Medium. Das Gesamttransfektionsvolumen betrug 100 μl für Zellen, die in Platten mit 96 Näpfen ausplattiert waren, und 10 ml für Zellen, die in 10 cm Platten ausplattiert waren. Die Lipidendkonzentration betrug 0,8 bis 1,2 μg/ml, abhängig von der Zelldichte; die siRNA-Konzentration ist in einem jeden Experiment angegeben.
  • Das Ergebnis der Western Blot-Analyse ist in 13 dargestellt. Wie aus dieser Figur ersichtlich, ergeben RNAi-Moleküle der Version 94A2B1 und 94A2B2 einen länger andauernden PTEN-Protein-Knock-Down als unmodifizierte Moleküle. Das Fehlen von Protein-Knock-Down, der auch in 12 mit den Molekülen der Version 94A1B1 und 94A1B2 beobachtet wird, wird in diesem Experiment bestätigt. Unmodifizierte Moleküle (80AB) sind nicht so potent beim Unterstützen eines lang anhaltenden Protein-Knock-Downs, wenn die Zellen nicht kontinuierlich transfiziert werden.
  • Beispiel 11: Persistenter PTEN-Protein-Knock-Down mit RNAi-Molekülen mit alternierenden 2'-O-Methylmodifikationen
  • Der experimentelle Ansatz war ähnlich dem, wie er im Zusammenhang mit Beispiel 10 dargestellt ist, mit der Ausnahme, dass die Transfektion nach 5 Stunden beendet wurde durch Ersetzen des Transfektionsmediums durch neues Medium. Das Protokoll war geringfügig modifiziert derart, dass für ein jedes der RNAi-Moleküle eine 40 nM-Konzentration realisiert wurde unter Verwendung einer Stammlösung aus 1 μg RNAi/ml kationischem Lipid, wie im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschrieben. 5 Stunden nach Transfektion wurde das Medium abgezogen und frisches EMEM hinzugegeben. Die Zellen wurden nach 72 Stunden aufgeteilt, wobei die Hälfte der Zellen lysiert wurde und die andere Hälfte erneut ausplattiert und 24 Stunden nach Transfektion später lysiert wurde (96 Stunden nach Transfektion). Das Ergebnis einer Western Blot-Analyse unter Verwendung dreier verschiedener RNAi-Moleküle (80AB, 94A1/B2, 94A2/B1) sind in 14 dargestellt. Als Positivkontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet. 14 zeigt die Expression von PTEN nach 72 Stunden bzw. 96 Stunden. Mit Blick auf die strukturellen Besonderheiten der verschiedenen RNAi-Moleküle kann man aus 14 entnehmen, dass der Protein-Knock-Down mit alternierenden Molekülen von der Art des 94A2B1 persistent ist, selbst nach 96 Stunden nach Aufteilen und erneutem Ausplattieren von Zellen verglichen mit unmodifizierten RNAi-Molekülen (wie beispielsweise 80AB) und RNAi-Molekül 94A1B2.
  • Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung der siRNA-Konstrukte, wie in 15A (linke Tafel) dargestellt. Aus den Ergebnissen, dargestellt als Verhältnis von PTEN/p110α-mRNA-Abbau bei verschiedenen Konzentrationen an siRNA-Konstrukten, die dem Testsystem verabreicht wurden, kann entnommen werden, dass siRNA-Moleküle, wo entweder einer oder beide Stränge aus 2'-O-Methyl-Resten bestehen, nicht in der Lage waren, RNAi-Interferenz in dem Säugetiersystem zu induzieren (15A, Moleküle V2, V5, V6). Die Abnahme an Aktivität war jedoch weniger ausgeprägt, wenn nur Teile der Stränge modifiziert waren. Interessanterweise war ein Molekül mit einem unmodifizierten Antisense-Strang (das ist der obere Strang in der Darstellung im Rahmen dieser Beschreibung, sofern nicht anders angegeben), und ein vollständig modifizierter Sense-Strang signifikant aktiver verglichen mit der umgekehrten Version (5A, Moleküle V5 und V6). Dieses Ergebnis schlägt vor, dass der Antisense-Strang von siRNA kritischer und hinsichtlich Modifikation empfindlicher zu sein scheint. Die wirksamsten Moleküle, die PTEN-mRNA induzierten, wiesen nur Bereiche von Modifikationen auf, wobei das 5'-Ende unmodifiziert war, oder waren an alternierenden Positionen an beiden Strängen modifiziert (15A, Moleküle V10, V12).
  • Um die Nukleaseresistenz zu testen, wurden die verschiedenen siRNA-Versionen in Serum inkubiert, gefolgt von PAA-Gelelektrophorese. Das Ergebnis ist in 15B gezeigt (rechte Tafel mit den verschiedenen Sequenzen, die auf der linken Tafel von 15B angegeben sind). Wie früher gezeigt wurden glattendige siRNA-Moleküle mit unmodifizierten Ribonukleotiden sehr schnell abgebaut, wohingegen eine vollständige Substitution mit 2'-O-Methylnukleotiden Resistenz gegen aus Serum stammenden Nukleasen vermittelte (15B, vergleiche Molekül AB mit V1). siRNA-Moleküle mit teilweiser 2'-O-Methylmodifikation zeigten ebenso eine erhöhte Stabilität verglichen mit unmodifizierten siRNAs. Insbesondere Moleküle mit alternierenden Modifikationen auf beiden Strängen zeigten eine signifikante Verbesserung der Stabilität (15B, Moleküle V13, V14 und V16). Wichtiger ist, dass die Transfektion von 3 dieser Moleküle in HeLa-Zellen zu einer signifikanten Herunterregulierung der PTEN-Proteinexpression führte, wie in 15C, Spuren 6, 9 und 10 dargestellt. In diesem RNA-Interferenz-Aktivitätstest wurde eine unerwartete Präferenz für Moleküle beobachtet, die an einem jeden zweiten Nukleotid beginnend mit dem am meisten 5'-terminal gelegenen Nukleotid des Antisense-Stranges modifiziert waren (Moleküle V15 und V12). Moleküle, die Modifikationen enthielten beginnend mit dem zweiten Nukleotid am 5'-Ende des Antisense-Stranges waren stabiler, hatten aber eine stark verringerte Aktivität hinsichtlich des Abschaltens von Genen (Moleküle V13, V14). Dieses Ergebnis weist auf eine hochspezifische Wechselwirkungen zwischen den beteiligten Enzymen und präzisen Nukleotiden in dem siRNA-Duplex hin. Zusammengenommen belegen die hierin gezeigten Daten, dass 2'-O-Methylmodifikationen an besonders ausgewählten Positionen in dem siRNA-Duplex die Nukleaseresistenz erhöhen können und RNAi nicht notwendigerweise vollständig beseitigen.
  • Obwohl eine erhöhte Stabilität von synthetischer siRNA primär für in vivo Anwendungen Implikationen aufweist, wurde auch analysiert, ob die spezielle Modifikation auch zu einem verlängerten Protein-Knock-Down in Zellkultursystemen führen kann. In Übereinstimmung damit wurden HeLa-Zellen transient für sechs Stunden transfiziert unter Verwendung verschiedener Versionen von PTEN-spezifischen siRNAs. Der Lipid-siRNA-Komplex wurde dann weggewaschen und der PTEN-Protein-Knock-Down 48 Stunden und 120 Stunden später analysiert. Obwohl Knock-Down-Experimente ohne fortgesetzte Transfektion von siRNAs infolge des schnellen Wachstums von nicht-transfizierten Zellen in dieser Zeitspanne kompliziert sind, was zu einem sehr transienten Knock-Down führt, waren die vorliegenden Erfinder in der Lage, einen verlängerten PTEN-Protein-Knock-Down mit siRNA-Molekülen zu zeigen, die durch die beschriebene 2'-O-Methyl-Modifikation stabilisiert sind. 48 Stunden nach Transfektion zeigte die unmodifizierte siRNA (AB) die stärkste Verringerung hinsichtlich des PTEN-Proteinniveaus, 120 Stunden nach Transfektion ist jedoch die Verringerung der PTEN-Proteinexpression mit der siRNA überlegen, die durch alternierende 2'-O-Methylmodifikationen stabilisiert ist (15D, vergleiche Spur 2 mit Spuren 4, 6 und 7).
  • Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass bevorzugterweise die Startnukleotidposition der alternierenden Modifikation wichtig zu sein scheint. Um diese Bevorzugung detaillierter zu testen, wurden zwei zusätzliche Serien von siRNAs synthetisiert, eine spezifisch für die Kinase Akt1 und die andere für p110β, was eine der zwei katalytischen Untereinheiten von PI(3-)-Kinase ist. Die speziellen Konstrukte sind in 16A gezeigt. Wie daraus entnommen werden kann, wurden nur 19 nt lange siRNA-Duplexe entweder ohne oder mit 2'-O-Methylmodifikation an einem jeden zweiten Nukleotid verwendet. Unter Verwendung von Akt1 als ein Zielmolekül wurde ein wirksamer Protein-Knock-Down ebenso wie eine dramatische Verringerung der Niveaus von Phospho-Akt mit glattendigen, unmodifizierten siRNAs beobachtet (16A, rechte Tafel). Aus diesen verschiedenen Versionen von Molekülen mit Modifikationen an nur einem jeden zweiten Nukleotid war lediglich eine wirksam beim Vermitteln von RNAi (16A, Molekül V5). Dieses siRNA-Molekül enthielt einen Antisense-Strang, der an dem am meisten 5'-terminal und 3'-terminal gelegenen Nukleotid modifiziert war. Der Sense-Strang begann mit den unmodifizierten Nukleotiden an der terminalsten Position, was zu einer Struktur führt, bei der die modifizierten und unmodifizierten Ribonukleotide beider Stränge einander gegenüberliegen. Wie erwartet war auch dieses Molekül gegen aus dem Serum stammende Nukleasen geschützt, wie in 16B gezeigt (Molekül V5).
  • Interessanterweise zeigt ein sehr ähnliches 19 nt langes siRNA-Molekül (V5) mit Modifikationen beginnend an dem zweiten Nukleotid des Antisense-Stranges, in dem speziell verwendeten Test keine RNA-Interferenz-Aktivierung. Die Version V6, bei der die modifizierten Nukleotide des Antisense-Stranges modifizierten Nukleotiden auf dem Sense- Strang gegenüberliegen, war bei diesem Experiment ebenfalls inaktiv. Eine identische Serie aus 19 nt langen siRNA-Molekülen, die für p110β spezifisch waren, bestätigte diese Beobachtung, wie in 16C dargestellt. Wiederum war das ähnlich modifizierte siRNA-Moleküe (V5) das aktivste, wie angegeben durch Verringerung der Akt-Phosphorylierung, was ein Zeichen für eine verringerte P (I)-3-Kinaseaktivität infolge verringerter p110β-Niveaus ist. Die verringerte Aktivität der Moleküle V6 könnte durch verringerte Duplexstabilität erklärt werden, da die gleiche Struktur aktiv war in dem PTEN-Knock-Down-Experiment mit 21mer siRNAs. Obwohl bekannt ist, dass 2'-O-Methylmodifikationen auf beiden Strängen, die einander gegenüberliegen, die Stabilität von Nukleinsäure-Duplexen verringern wird, rührt der Unterschied zwischen der Aktivität von siRNA-Molekülen V4 und V5 (16B und C) wahrscheinlich nicht von den Unterschieden der Duplexstabilität her, da die Anzahl von Basenpaarungen von modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden identisch ist. Der Unterschied in der Aktivität könnte auf spezifischen Erfordernissen der interagierenden Proteine beruhen, die beim Abbau der Ziel-mRNA beteiligt sind. Weiterhin kann diesen Experimenten entnommen werden, dass die am meisten terminal gelegenen Nukleotide des Antisense-Stranges an der 2'-OH-Gruppe ohne einen erheblichen Verlust an Abschaltaktivität modifiziert sein können.
  • Beispiel 12: Unterschiedliche Schleifen-Strukturen sind funktionell bei der Vermittlung von RNA-Interferenz
  • Um zu testen, ob RNAi-Moleküle, bevorzugterweise synthetische RNAi-Moleküle mit selbstkomplementären Strukturen, die Genexpression so wirksam inhibieren können, wie standardmäßige doppel-strängige siRNA-Moleküle, wurden HeLa-Zellen mit p110β-spezifischen siRNAs transfiziert. Die Transfektionen wurden in Platten mit 96 Näpfen oder 10 cm großen Platten (bei einer Konfluenz von 30 bis 50%) unter Verwendung verschiedener kationischer Lipide wie beispielsweise Oligofectamin, Lipofectamin (Life Technologies) durchgeführt. GeneBlocs wurden transfiziert durch Hinzugeben von vorab ausgebildeten 5 × konzentrierten Komplexen aus GB und Lipid in Serum-freiem Medium zu Zellen in vollständigem Medium. Das Gesamttransfektionsvolumen betrug 100 μl für Zellen, die in Platten mit 96 Näpfen ausplattiert waren, und 10 ml für Zellen in 10 cm Platten. Die letztendliche Lipidkonzentration betrug 0,8 bis 1,2 μg/ml, abhängig von der Zelldichte; die RNAi-Molekülkonzentration ist in einem jeden Experiment angegeben.
  • Eine Dosis-abhängige Titration zeigte keinen signifikanten Unterschied der Wirksamkeit von mRNA-Knock-Down, der durch das standardmäßige bimolekulare doppel-strängige 21 mer und die entsprechenden monomolekularen Moleküle erreicht wurden, wie analysiert durch Echtzeit-PCR (Taqman) (17A). Zwei unterschiedliche Schleifenstrukturen, eine (A)12-Schleife und eine von HIV abgeleitete pA-Schleife, wurden parallel mit ähnlichen Ergebnissen getestet. Ein Vergleich der Relativposition der Antisense-Sequenz und der Schleifenstruktur ergab eine verbesserte Knock-Down-Wirksamkeit, wenn die Antisense-Sequenz 3' zur Schleife angeordnet ist (17B; vergleiche Konstrukt 3A, 3B und 4A, 4B).
  • Beispiel 13: Studien zur Wirksamkeit von unterschiedlichen intramolekularen Hairpin-Schleifen und intermolekularen „Blasen"
  • Der Einfluss verschiedener Schleifenstrukturen auf die Inhibierung von mRNA und Proteinexpression wurde getestet. Für diese Experimente wurden Akt1 und Akt2 als Ziele ausgewählt. Der experimentelle Ansatz war ähnlich dem in Beispiel 12 beschriebenen.
  • Die Verringerung von Akt1 mRNA, wie in 18A und 18B dargestellt, ebenso wie die der Akt1-Protein-Niveaus, wie in 18C dargestellt, vollkommen unabhängig von der getesteten Schleifenstruktur (vergleiche Moleküle 5A, 6A, 7A, 8A) (die Struktur des getesteten RNAi-Moleküls ist jeweils unter dem Balkendiagramm angegeben). Selbst ein Molekül, das eine vergleichsweise unphysiologische Struktur wie beispielsweise einen Polyethylenglycol-Linker (PEG) als eine Schleife enthielt, verringerte die Expression von Akt1 wirksam, was anzeigt, dass die Größe und die Nukeotidsequenz der Schleife nicht kritisch sind (18A; Molekül 8A). Das synthetische siRNA-Molekül, dass für Akt2 (9A) spezifisch ist, wurde verwendet, um auf Spezifität hin zu kontrollieren und hatte keine Wirkung auf Akt1-Niveaus, wie in 15A gezeigt. Dieses Molekül schaltete jedoch in wirksamer Weise die Expression von Akt2 aus (18B; 18C). Selbst-komplementäre RNA-Moleküle mit Schleifenstrukturen haben die Möglichkeit, als Doppelstränge in molekularen oder biomolekularen Strukturen unter physiologischen Hybridisierungsbedingungen zu annelieren (18B, Schleifen- oder Blasenstruktur). Um die Frage zu adressieren, ob die siRNA-Moleküle ihre Funktion durch Einnehmen einer intramolekularen Schleife oder einer intermolekularen „Blase" (schematisch in 18B gezeigt) ausüben, wurden zwei Moleküle, die nicht in der Lage sind, auf sich selbst zurückzufalten, transfiziert. Dieses Strukturen enthielten Akt1- und Akt2-spezifische Sequenzen innerhalb des gleichen Moleküls (18B, Konstrukte 10A, 10B) und wurden so konstruiert, dass sie dahingehend beschränkt waren, dass sie einen bimolekularen Komplex ausbilden („Blase"). Überraschenderweise vermittelte dieses Molekül sowohl den Akt1- als auch Akt2-mRNA-Knock-Down, ebenso wie Protein-Knock-Down, wenn nach dem Annelieren beider Stränge transfiziert wurde.
  • Ob Schleifen- und Blasenstrukturen tatsächlich Substrate für RNA-prozessierende Enzyme, z. B. Dicer, sind, ist zu diesem Zeitpunkt nicht klar. Eine kürzlich durchgeführte Studie von Paddison und Mitarbeitern schlägt vor, dass Hairpin-enthaltene siRNAs stärker von der Dicer-Aktivität abhängen als doppel-strängige -siRNAs. Diese Daten, die eine RNA-Interferenz-Aktivität bei Verwendung eines PEG-Linkermoleküls zeigen, belegen, dass die Linkersequenz wahrscheinlich irrelevant ist.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (38)

  1. Ribonukleinsäure umfassend eine doppelsträngige Struktur, wobei die doppelsträngige Struktur einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei der erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst und wobei der erste Abschnitt wenigstens teilweise komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Strang wenigstens teilweise identisch ist zu der Ziel-Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Abschnitt und der zweite Abschnitt ein Muster umfassen bestehend aus einer Vielzahl von Gruppen aus modifizierten Nukleotiden mit einer Modifikation einer 2'-Position, wobei innerhalb des Abschnittes jede Gruppe aus modifizierten Nukleotiden auf einer oder beiden Seiten von einer flankierenden Gruppe von Nukleotiden flankiert ist, wobei die flankierenden Nukleotide, die die flankierende Gruppe von Nukleotiden ausbilden, entweder unmodifizierte Nukleotide oder Nukleotide sind mit einer Modifikation, die von der Modifikation der modifizierten Nukleotide verschieden ist.
  2. Ribonukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Gruppe aus modifizierten Nukleotiden und/oder die Gruppe aus flankierenden Nukleotiden eine Anzahl von Nukleotiden umfasst, wobei die Anzahl ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleotid bis 10 Nukleotide.
  3. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Muster aus modifizierten Nukleotiden des ersten Abschnittes das gleiche ist wie das Muster aus modifizierten Nukleotiden des zweiten Abschnittes.
  4. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Muster des ersten Abschnittes mit dem Muster des zweiten Abschnittes ausgerichtet ist.
  5. Ribonukleinsäure nach Anspruch 3, wobei das Muster des ersten Abschnittes um ein oder mehrere Nukleotide relativ zum Muster des zweiten Abschnittes verschoben ist.
  6. Ribonukleinsäure nach Anspruch 1 bis 5, wobei die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Amino, Fluoro, Methoxy, Alkoxy und Alkyl.
  7. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die doppelsträngige Struktur glattendig ist.
  8. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die doppelsträngige Struktur auf beiden Seiten glattendig ist.
  9. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die doppelsträngige Struktur auf der Seite der doppelsträngigen Struktur glattendig ist, die durch das 5'-Ende des ersten Stranges und das 3'-Ende des zweiten Stranges definiert ist.
  10. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die doppelsträngige Struktur auf der Seite der doppelsträngigen Struktur glattendig ist, die durch das 3'-Ende des ersten Stranges und das 5'-Ende des zweiten Stranges definiert ist.
  11. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste Strang einen Überhang am 5'-Ende umfasst und der zweite Strang einen Überhang am 5'-Ende umfasst.
  12. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei beide Stränge einen Überhang aus wenigstens einem Nukleotid am 3'-Ende aufweisen.
  13. Ribonukleinsäure nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Überhang aus wenigstens einem Nukleotid besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide.
  14. Ribonukleinsäure nach Anspruch 13, wobei das Nukleotid eine Modifikation aufweist, wobei die Modifikation bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nukleotide, die ein invertiertes abasisches Nukleotid sind, und Nukleotide mit einer NH2-Modifikation am 2'-Ende.
  15. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Länge der doppelsträngigen Struktur eine Länge von etwa 17 bis 21 und bevorzugtererweise 18 oder 19 Basen aufweist.
  16. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 9 bis 14, wobei die Länge des ersten Stranges und die Länge des zweiten Stranges unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die Bereiche von etwa 15 bis etwa 23 Basen, 17 bis 21 Basen und 18 oder 19 Basen.
  17. Ribonukleinsäure nach Anspruch 15, wobei die Länge des ersten Stranges und die Länge des zweiten Stranges unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die Bereiche von 17 bis 21 Basen und 18 oder 19 Basen.
  18. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Komplementarität zwischen dem ersten Strang und der Ziel-Nukleinsäure vollständig ist.
  19. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der zwischen dem ersten Strang und der Ziel-Nukleinsäure ausgebildete Duplex wenigstens 15 Nukleotide umfasst, wobei ein oder zwei Fehlpaarungen zwischen dem ersten Strang und der Ziel-Nukleinsäure vorhanden ist/sind, die die doppelsträngige Struktur ausbilden.
  20. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 19, in dem Umfang, wie sie sich nicht auf Anspruch 4 beziehen, wobei sowohl der erste Strang als auch der zweite Strang jeweils ein Muster umfassen bestehend aus einer Vielzahl von Gruppen aus modifizierten Nukleotiden und einer Vielzahl von flankierenden Gruppen von Nukleotiden, wobei jede Gruppe aus modifizierten Nukleotiden wenigstens ein Nukleotid umfasst und wobei eine jede flankierende Gruppe von Nukleotiden wenigstens ein Nukleotid umfasst, wobei eine jede Gruppe aus modifizierten Nukleotiden des ersten Stranges mit einer flankierenden Gruppe von Nukleotiden an dem zweiten Strang ausgerichtet ist, wobei das am meisten terminal gelegene 5'-Nukleotid des ersten Stranges ein Nukleotid der Gruppe aus modifizierten Nukleotiden ist, und das am meisten terminal gelegene 3'-Nukleotid des zweiten Stranges ein Nukleotid der flankierenden Gruppe von Nukleotiden ist.
  21. Ribonukleinsäure nach Anspruch 20, wobei jede Gruppe aus modifizierten Nukleotiden aus einem einzelnen Nukleotid besteht und/oder jede flankierende Gruppe von Nukleotiden aus einem einzelnen Nukleotid besteht.
  22. Ribonukleinsäure nach Anspruch 21, wobei auf dem ersten Strang das Nukleotid, das die flankierende Gruppe von Nukleotiden ausbildet, ein unmodifiziertes Nukleotid ist, das in 3'-Richtung relativ zu dem Nukleotid angeordnet ist, das die Gruppe aus modifizierten Nukleotiden ausbildet, und wobei auf dem zweiten Strang das Nukleotid, das die Gruppe aus modifizierten Nukleotiden ausbildet, ein modifiziertes Nukleotid ist, das in 5'-Richtung relativ zu dem Nukleotid angeordnet ist, das die flankierende Gruppe von Nukleotiden bildet.
  23. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei der erste Strang acht bis zwölf, bevorzugterweise neun bis elf Gruppen aus modifizierten Nukleotiden umfasst und wobei der zweite Strang sieben bis elf, bevorzugterweise acht bis zehn Gruppen aus modifizierten Nukleotiden umfasst.
  24. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste Strang und der zweite Strang durch eine Schleifen-Struktur verbunden sind.
  25. Ribonukleinsäure nach Anspruch 24, wobei die Schleifen-Struktur ein Nicht-Nukleinsäure-Polymer umfasst.
  26. Ribonukleinsäure nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Nicht-Nukleinsäure-Polymer Polyethylenglycol ist.
  27. Ribonukleinsäure nach Anspruch 24, wobei die Schleifen-Struktur eine Nukleinsäure umfasst.
  28. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der 5'-Terminus des ersten Stranges mit dem 3'-Terminus des zweiten Stranges verknüpft ist.
  29. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das 3'-Ende des ersten Stranges mit dem 5'-Terminus des zweiten Stranges verknüpft ist.
  30. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei das Zielgen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Strukturgene, Hauskeeping-Gene, Transkriptionsfaktoren, Motilitätsfaktoren, Zellzyklusfaktoren, Zellzyklusinhibitoren, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Tumorsuppressoren.
  31. Verwendung einer Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30 zur Target-Validierung.
  32. Verwendung einer Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30 für die Herstellung eines Medikaments.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Medikament für die Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes ist, die/der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Glioblastome, Prostatakrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Kolonkrebs, Pankreaskrebs und Leukämie, Diabetes, Fettleiblichkeit, kardiovaskuläre Erkrankungen und metabolische Erkrankungen.
  34. Zelle, bevorzugterweise eine Knockdown-Zelle, enthaltend eine Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei wenn die Zelle eine menschliche Zelle ist, die menschliche Zelle eine isolierte menschliche Zelle ist.
  35. Organismus, bevorzugterweise Knockdown-Organismus, der eine Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30 enthält, wobei der Organismus verschieden ist von einem Menschen.
  36. Zusammensetzung umfassend eine Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30.
  37. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  38. In vitro Verfahren zur Inhibierung der Expression eines Zielgens in einer Zelle oder einem Derivat davon, umfassend das Einführen einer Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30 in die Zelle in einer Menge, die ausreicht, um die Expression des Zielgens zu inhibieren, wobei das Zielgen das Zielgen der Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 30 ist.
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Families Citing this family (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO2005121368A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric gapped oligomeric compositions
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US20050020525A1 (en) * 2002-02-20 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US8202979B2 (en) * 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
EP2345742B1 (de) 2000-03-30 2014-06-11 The Whitehead Institute for Biomedical Research Mediatoren von RNS-interferenz, die RNS-sequenzspezifisch sind
US20050054836A1 (en) * 2000-11-09 2005-03-10 Cold Spring Harbor Laboratory Chimeric molecules to modulate gene expression
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US20050282188A1 (en) * 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
JP2005515780A (ja) 2002-02-01 2005-06-02 セクイター インコーポレイテッド 二本鎖オリゴヌクレオチド
EP1572902B1 (de) 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HOCHWIRKSAME siRNAS ZUR REDUZIERUNG DER EXPRESSION VON ZIELGENEN
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US8232383B2 (en) * 2002-02-20 2012-07-31 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7928218B2 (en) * 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20100240730A1 (en) * 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US7910724B2 (en) * 2002-02-20 2011-03-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US20090099117A1 (en) * 2002-02-20 2009-04-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MYOSTATIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20090093439A1 (en) * 2002-02-20 2009-04-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
DE60310944T3 (de) 2002-08-05 2017-08-03 Silence Therapeutics Gmbh Weitere neue formen von interferierende rns moleküle
AU2003261449A1 (en) 2002-08-07 2004-02-25 Compositions for rna interference and methods of use thereof
US7956176B2 (en) * 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003273336A1 (en) * 2002-09-18 2004-04-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Efficient reduction of target rna's by single- and double-stranded oligomeric compounds
US7892793B2 (en) 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
US9150606B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
EP1578765A4 (de) * 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere verbindungen,die zuckerersatzstoffe enthalten, und zusammensetzung zur verwendung in dergenmodulation
US9827263B2 (en) * 2002-11-05 2017-11-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 2′-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
DK1606406T4 (da) 2003-03-21 2013-12-16 Santaris Pharma As Short Interfering RNA (siRNA) Analogues
ATE536408T1 (de) * 2003-04-02 2011-12-15 Dharmacon Inc Modifizierte polynukleotide zur verwendung bei rna-interferenz
WO2005001043A2 (en) * 2003-06-02 2005-01-06 University Of Massachusetts METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE EFFICACY AND SPECIFICITY OF FNAi
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
EP1633767B1 (de) * 2003-06-02 2018-11-21 University of Massachusetts Verfahren und zusammensetzungen zur steuerung der wirksamkeit von rna silencing
US8575327B2 (en) 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
WO2004113496A2 (en) * 2003-06-20 2004-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded compositions comprising a 3’-endo modified strand for use in gene modulation
CA2533701A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US20050136437A1 (en) * 2003-08-25 2005-06-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nanoparticles for delivery of nucleic acids and stable double-stranded RNA
US20070203084A1 (en) * 2003-08-28 2007-08-30 Jan Weiler Interfering Rna Duplex Having Blunt-Ends And 3'-Modifications
US20050074801A1 (en) * 2003-09-09 2005-04-07 Monia Brett P. Chimeric oligomeric compounds comprising alternating regions of northern and southern conformational geometry
ES2808561T3 (es) 2003-09-12 2021-03-01 Univ Massachusetts Interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función
US8680063B2 (en) 2003-09-12 2014-03-25 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
US20060134787A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA
DE602005025347D1 (de) * 2004-01-30 2011-01-27 Quark Pharmaceuticals Inc Oligoribonukleotide und verfahren zu deren anwendung bei der behandlung von fibrotischen leiden und anderen krankheiten
WO2005073378A1 (en) * 2004-01-30 2005-08-11 Santaris Pharma A/S MODIFIED SHORT INTERFERING RNA (MODIFIED siRNA)
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
KR101147147B1 (ko) * 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
US20160230185A1 (en) 2013-03-14 2016-08-11 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling diabrotica
EP2471922A1 (de) 2004-05-28 2012-07-04 Asuragen, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen mit microRNA
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US20090048192A1 (en) * 2004-06-03 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
AU2005252662B2 (en) * 2004-06-03 2011-08-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
AP2007003921A0 (en) 2004-08-16 2007-02-28 Atugen Ag Therapeutic uses of inhibitors of rtp801
SI1781787T1 (sl) 2004-08-23 2017-08-31 Sylentis S.A.U. Zdravljenje očesnih nepravilnosti, kakakterističnih za povišan očesni tlak s sirna
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
ES2594083T3 (es) * 2004-09-28 2016-12-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligorribonucleótidos y métodos de uso de los mismos para tratamiento de la alopecia, insuficiencia renal aguda y otras enfermedades
EP2322616A1 (de) 2004-11-12 2011-05-18 Asuragen, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen, die miRNAs und miRNA-inhibitorischen Molekülen verbunden sind
US7935811B2 (en) 2004-11-22 2011-05-03 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing compositions
US7923206B2 (en) 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Method of determining a cellular response to a biological agent
US7923207B2 (en) 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing pools
US20060160110A1 (en) * 2004-12-02 2006-07-20 Takayuki Mizutani Methods of designing small interfering RNAs, antisense polynucleotides, and other hybridizing polynucleotides
WO2006063356A1 (en) * 2004-12-10 2006-06-15 Isis Phamaceuticals, Inc. Regulation of epigenetic control of gene expression
WO2006131925A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of fibrotic conditions and other diseases
WO2007022506A2 (en) 2005-08-18 2007-02-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating neurological disease
GB0520063D0 (en) * 2005-10-03 2005-11-09 Novartis Forschungsstiftung Methods for regulating metabolism and diagnosing disease
GB0521351D0 (en) 2005-10-20 2005-11-30 Genomica Sau Modulation of TRPV expression levels
GB0521716D0 (en) 2005-10-25 2005-11-30 Genomica Sau Modulation of 11beta-hydroxysteriod dehydrogenase 1 expression for the treatment of ocular diseases
EP1942943A2 (de) * 2005-11-04 2008-07-16 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Peptid-dicer-substrat-rna-konjugate als abgabevehikel für sirna
JP5232990B2 (ja) * 2005-11-08 2013-07-10 国立大学法人愛媛大学 Ａｋｔ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ
KR100877824B1 (ko) 2005-11-11 2009-01-12 한국생명공학연구원 Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도
US7825099B2 (en) * 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
NL2000439C2 (nl) * 2006-01-20 2009-03-16 Quark Biotech Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801.
US8129515B2 (en) * 2006-01-27 2012-03-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of microRNAs
JP2009524419A (ja) * 2006-01-27 2009-07-02 サンタリス ファーマ アー／エス Ｌｎａ修飾したホスホロチオール化オリゴヌクレオチド
EP1989307B1 (de) * 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. Neue tandem-sirnas
US7910566B2 (en) * 2006-03-09 2011-03-22 Quark Pharmaceuticals Inc. Prevention and treatment of acute renal failure and other kidney diseases by inhibition of p53 by siRNA
WO2007107162A2 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Santaris Pharma A/S Small internally segmented interfering rna
FR2898908A1 (fr) 2006-03-24 2007-09-28 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation de cellules aviaires differenciees et genes impliques dans le maintien de la pluripotence
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
WO2007141796A2 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 Quark Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic uses of inhibitors of rtp801l
RU2553561C2 (ru) 2006-07-21 2015-06-20 Сайленс Терапьютикс Аг Средства ингибирования экспрессии протеинкиназы 3
EP1897941A1 (de) * 2006-09-11 2008-03-12 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Mittel zur Erhöhung der intrazellulären Protoporphyrin IX Spiegel und dessen Verwendung
JP2010504350A (ja) * 2006-09-19 2010-02-12 アシュラジェン インコーポレイテッド 治療的介入の標的としての、ｍｉＲ−２００によって調節される遺伝子および経路
CA2663601C (en) 2006-09-22 2014-11-25 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
EP2061901A2 (de) 2006-10-31 2009-05-27 Noxxon Pharma AG Verfahren zum nachweis eines einzel- oder doppelsträngigen nukleinsäuremoleküls
WO2008106102A2 (en) * 2007-02-26 2008-09-04 Quark Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of rtp801 and their use in disease treatment
US20100292301A1 (en) * 2007-02-28 2010-11-18 Elena Feinstein Novel sirna structures
US7812002B2 (en) 2007-03-21 2010-10-12 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotide inhibitors of NRF2 and methods of use thereof for treatment of cancer
WO2008143774A2 (en) * 2007-05-01 2008-11-27 University Of Massachusetts Methods and compositions for locating snp heterozygosity for allele specific diagnosis and therapy
KR20100024410A (ko) * 2007-05-11 2010-03-05 엔즌 파마슈티칼스, 인코포레이티드 Ｈｅｒ３ 조절용 ｒｎａ 길항제 화합물
US20100273854A1 (en) * 2007-06-15 2010-10-28 Hagar Kalinski Compositions and methods for inhibiting nadph oxidase expression
US8785408B2 (en) 2007-06-27 2014-07-22 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for reducing or protecting against delayed graft function (DGF)
US8361714B2 (en) 2007-09-14 2013-01-29 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
JP5723154B2 (ja) 2007-09-19 2015-05-27 アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー ＲＮＡｉにおけるオフターゲット表現型の影響を減少させるためのＳｉＲＮＡ配列非依存性修飾フォーマットおよびその安定化型
US8614309B2 (en) 2007-10-03 2013-12-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded RNA directed to CASP2 and methods of use thereof
US20100317714A1 (en) * 2007-11-29 2010-12-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Complex molecule interfering the expression of target genes and its preparing methods
US8071562B2 (en) 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20110105584A1 (en) * 2007-12-12 2011-05-05 Elena Feinstein Rtp80il sirna compounds and methods of use thereof
US8614311B2 (en) 2007-12-12 2013-12-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. RTP801L siRNA compounds and methods of use thereof
KR100949791B1 (ko) * 2007-12-18 2010-03-30 이동기 오프-타겟 효과를 최소화하고 ＲＮＡｉ 기구를 포화시키지않는 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
WO2009090639A2 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Quark Pharmaceuticals, Inc. Sirna compounds and methods of use thereof
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
US10131904B2 (en) 2008-02-11 2018-11-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
JP5540312B2 (ja) * 2008-02-15 2014-07-02 独立行政法人理化学研究所 環状１本鎖核酸複合体およびその製造方法
CA2718765A1 (en) * 2008-03-20 2009-09-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirna compounds for inhibiting rtp801
US8278287B2 (en) * 2008-04-15 2012-10-02 Quark Pharmaceuticals Inc. siRNA compounds for inhibiting NRF2
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
CA2635187A1 (en) 2008-06-05 2009-12-05 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Oligonucleotide duplexes and uses thereof
WO2009147684A2 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of ear disorders
TWI455944B (zh) 2008-07-01 2014-10-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 雙股多核苷酸
WO2010008562A2 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Recombinetics Methods and materials for producing transgenic animals
WO2010008582A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell drug delivery system
US9433684B2 (en) 2008-08-19 2016-09-06 Nektar Therapeutics Conjugates of small-interfering nucleic acids
ES2708944T3 (es) * 2008-09-22 2019-04-12 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para la inhibición específica de la expresión de genes por DSRNA que tenga modificaciones
JP2012502991A (ja) 2008-09-22 2012-02-02 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション 皮膚適用におけるｒｎａ干渉
US8765931B2 (en) 2008-10-22 2014-07-01 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide compound for down-regulating the expression of CASP2 gene
EP2447274B1 (de) 2008-10-24 2017-10-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomerverbindungen und Verfahren
AU2009308217B2 (en) 2008-10-24 2016-01-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5' and 2' bis-substituted nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2010059226A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of map4k4 through rnai
US20110288155A1 (en) 2008-12-18 2011-11-24 Elena Feinstein Sirna compounds and methods of use thereof
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
WO2010091878A2 (en) 2009-02-13 2010-08-19 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of opa1
US8829179B2 (en) 2009-02-18 2014-09-09 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of ANG2
EP2408916A2 (de) * 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression von ctgf (connective tissue growth factor) unter verwendung von sina (short interfering nucleic acid)
WO2010111198A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compounds compositions and methods of treating cancer and fibrotic diseases
EP2440214A4 (de) 2009-06-08 2013-07-31 Quark Pharmaceuticals Inc Verfahren zur behandlung chronischer nierenkrankheiten
GB0910723D0 (en) 2009-06-22 2009-08-05 Sylentis Sau Novel drugs for inhibition of gene expression
WO2011035065A1 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Nektar Therapeutics Monoconjugated chitosans as delivery agents for small interfering nucleic acids
WO2011034811A1 (en) 2009-09-17 2011-03-24 Sigma-Aldrich Co. Short rna mimetics
CN102666856B (zh) 2009-11-08 2016-04-06 夸克制药公司 定向至RhoA靶基因的双链RNA化合物在制造治疗神经性疼痛的药物中的用途
JP2013511990A (ja) 2009-11-26 2013-04-11 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 末端置換を含むｓｉＲＮＡ化合物
US8778904B2 (en) 2009-12-09 2014-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the CNS
KR101692063B1 (ko) 2009-12-09 2017-01-03 닛토덴코 가부시키가이샤 hsp47 발현의 조절
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
WO2011119871A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Phrmaceuticals Corporation Rna interference in ocular indications
BR112012024049A2 (pt) 2010-03-24 2017-03-01 Rxi Pharmaceuticals Corp interferência de rna em indicações dérmicas e fibróticas
WO2011119852A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds
EP2625186B1 (de) 2010-04-28 2016-07-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modifizierte nukleoside und daraus hergestellte oligomere verbindungen
CN103154014B (zh) 2010-04-28 2015-03-25 Isis制药公司 修饰核苷、其类似物以及由它们制备的寡聚化合物
US20110306653A1 (en) 2010-05-14 2011-12-15 Tagcyx Biotechnologies Stabilization method of functional nucleic acid
EP2390327A1 (de) 2010-05-27 2011-11-30 Sylentis S.A. siRNA und deren Verwendung in Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder Prävention von Augenleiden
KR101553753B1 (ko) 2010-06-24 2015-09-16 쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드 Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도
NZ606232A (en) * 2010-07-08 2015-06-26 Bonac Corp Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
EP2412724A1 (de) 2010-07-29 2012-02-01 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Regulierung der Glypican-4-Aktivität zur Modulierung des Schicksals von Stammzellen und Verwendungen davon
US8691782B2 (en) 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
KR20130137160A (ko) 2010-08-24 2013-12-16 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제
EP2616543A1 (de) * 2010-09-15 2013-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modifizierte irna-wirkstoffe
CA2818662C (en) 2010-10-22 2021-07-06 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Nucleic acid molecule inducing rna interference, and uses thereof
EP2632472B1 (de) 2010-10-29 2017-12-13 Sirna Therapeutics, Inc. Durch rna-interferenz vermittelte inhibition einer genexpression unter verwendung von short-interfering-nukleinsäuren (sina)
CA2818024C (en) 2010-12-06 2019-09-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
US9796979B2 (en) 2011-03-03 2017-10-24 Quark Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
US9487778B2 (en) 2011-03-03 2016-11-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
CA2828002A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
TW202244278A (zh) 2011-06-30 2022-11-16 美商艾羅海德製藥公司 用於抑制ｂ型肝炎病毒基因表現之組合物及方法
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
KR102011048B1 (ko) 2011-10-18 2019-08-14 다이서나 파마수이티컬, 인크. 아민 양이온성 지질 및 그것의 용도
US20140323549A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
KR102385013B1 (ko) 2011-11-18 2022-04-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
CN105861503A (zh) 2011-11-18 2016-08-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 修饰的RNAi试剂
EP2797632A1 (de) 2012-01-01 2014-11-05 QBI Enterprises Ltd. Auf endo180 gezielte partikel zur selektiven verabreichung von therapie- und diagnosemitteln
CA2858630A1 (en) 2012-01-12 2013-07-18 Quark Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hearing and balance disorders
WO2013123996A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Astrazeneca Uk Limited Novel sirna inhibitors of human icam-1
US9980942B2 (en) 2012-05-02 2018-05-29 Children's Hospital Medical Center Rejuvenation of precursor cells
DK2853597T3 (en) * 2012-05-22 2019-04-08 Olix Pharmaceuticals Inc RNA INTERFERENCE-INducing NUCLEIC ACID MOLECULES WITH CELL PENETENING EQUIPMENT AND USE THEREOF
US9663784B2 (en) 2012-05-26 2017-05-30 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for regulating expression of gene having delivering function
WO2014018375A1 (en) 2012-07-23 2014-01-30 Xenon Pharmaceuticals Inc. Cyp8b1 and uses thereof in therapeutic and diagnostic methods
GB201215857D0 (en) 2012-09-05 2012-10-24 Sylentis Sau siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
WO2014037686A1 (en) 2012-09-05 2014-03-13 Sylentis S.A.U. Sirna and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
US9611474B2 (en) 2012-09-12 2017-04-04 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to DDIT4 and methods of use thereof
WO2014043292A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
CA3120574A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Process for formulating an anionic agent
EP2992112B1 (de) 2013-04-22 2020-06-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mutationen in pdgfrb und notch3 als ursachen für autosomale dominante infantile myofibromatose
TW201534578A (zh) 2013-07-08 2015-09-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 新穎脂質
WO2015015498A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
EP3027222A1 (de) 2013-07-31 2016-06-08 QBI Enterprises Ltd. Sphingolipid-polyalkylamin-oligonukleotidverbindungen
EP2853595A1 (de) 2013-09-30 2015-04-01 Soluventis GmbH NOTCH 1-spezifische siRNA-Moleküle
WO2015051366A2 (en) * 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Novel formats for organic compounds for use in rna interference
EP2865756A1 (de) 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA und deren Verwendung in Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Expression des FLAP-Gens
EP2865758A1 (de) 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA und deren Verwendung in Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Expression des ORAI1-Gens
EP2865757A1 (de) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA und deren Verwendung in Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Expression des PDK1-Gens
RU2744194C2 (ru) 2013-12-02 2021-03-03 Фио Фармасьютикалс Корп Иммунотерапия рака
CN105899663B (zh) 2013-12-26 2019-07-26 学校法人东京医科大学 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
US10934542B2 (en) 2013-12-27 2021-03-02 Bonac Corporation Artificial match-type miRNA for controlling gene expression and use therefor
US20160333346A1 (en) * 2014-01-17 2016-11-17 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Nucleic acid capable of inhibiting expression of beta-2gpi
EP3960860A3 (de) 2014-02-11 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk)-irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
US10011837B2 (en) 2014-03-04 2018-07-03 Sylentis Sau SiRNAs and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
CA2947270A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating cancer using nucleic acids targeting mdm2 or mycn
US9777273B2 (en) * 2014-08-07 2017-10-03 Industrial Technology Research Institute Small interfering RNA and pharmaceutical composition and method for inhibiting galectin-12 expression and/or enhancing lipolysis containing the same
US10900039B2 (en) 2014-09-05 2021-01-26 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting Tyr or MMP1
FR3026409B1 (fr) * 2014-09-26 2018-03-30 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Procede de criblage de molecules interferentes
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
WO2016083624A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of edn1
WO2016094845A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Woolf Tod M Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
WO2016104775A1 (ja) 2014-12-27 2016-06-30 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための天然型ｍｉＲＮＡおよびその用途
US20160272970A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 Arrowhead Madison Inc. RNA Interference Agents
ES2926369T3 (es) 2015-03-27 2022-10-25 Bonac Corp Molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene función de suministro y capacidad de control de la expresión génica
WO2017007825A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
CN108135923B (zh) 2015-07-06 2021-03-02 菲奥医药公司 靶向超氧化物歧化酶1（sod1）的核酸分子
IL296476A (en) 2015-07-31 2022-11-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Preparations of transthyretin (ttr) irna and methods of using them for the treatment or prevention of ttr-related diseases
KR20180038465A (ko) 2015-08-07 2018-04-16 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 Ｂ형 간염 바이러스 감염에 대한 ｒｎａｉ 치료법
MA44908A (fr) 2015-09-08 2018-07-18 Sylentis Sau Molécules d'arnsi et leur utilisation dans des procédés et des compositions pour inhiber l'expression du gène nrarp
JP2018531037A (ja) 2015-10-19 2018-10-25 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション 長い非コードｒｎａを標的とする減少したサイズの自己送達型核酸化合物
WO2017079442A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
KR20180071362A (ko) 2015-11-16 2018-06-27 올릭스 주식회사 MyD88 또는 TLR3을 타겟팅하는 RNA 복합체를 이용한 연령-관련 황반 변성의 치료
AU2017211461B2 (en) 2016-01-26 2023-01-12 Nissan Chemical Corporation Single-stranded oligonucleotide
KR20180104692A (ko) 2016-02-02 2018-09-21 올릭스 주식회사 Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료
WO2017134525A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGET lL4Rα, TRPA1, OR F2RL1
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
CN109072238B (zh) 2016-04-11 2022-05-24 奥利克斯医药有限公司 使用靶向结缔组织生长因子的rna复合物治疗特发性肺纤维化
WO2017181088A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Use of mir-223-3p as a cancer therapeutic and method for treating cancer using the same
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
EP3452055A4 (de) 2016-05-06 2019-11-06 Tod M. Woolf Verbesserte verfahren zur genomänderung mit und ohne programmierbaren nukleasen
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
JOP20170161A1 (ar) 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
EP3315125A1 (de) 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipidnanopartikelformulierung
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
MX2019008199A (es) 2017-01-06 2019-11-25 Avidity Biosciences Llc Composiciones de acido nucleico polipeptido y metodos de induccion de la omision de exon.
WO2018143475A1 (ja) * 2017-02-06 2018-08-09 日産化学工業株式会社 一本鎖オリゴヌクレオチド
WO2018146557A2 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Dong Ki Lee Long double-stranded rna for rna interference
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
WO2019048645A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Mina Therapeutics Limited STABILIZED COMPOSITIONS OF SMALL ACTIVATOR RNA (PARNA) FROM CEBPA AND METHODS OF USE
EP3679139B1 (de) * 2017-09-08 2022-11-02 MiNA Therapeutics Limited Stabilisierte hnf4a-sara-zusammensetzungen und verwendungsverfahren
US11806360B2 (en) 2017-09-19 2023-11-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (TTR) mediated amyloidosis
MX2020004898A (es) * 2017-11-13 2020-10-05 Silence Therapeutics Gmbh Ácidos nucleicos para inhibir la expresión de un gen diana que comprende enlaces fosforoditioato.
EP3720448A4 (de) 2017-12-06 2021-11-03 Avidity Biosciences, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von muskelatrophie und myotonischer dystrophie
US11648260B2 (en) 2018-03-29 2023-05-16 Technion Research And Development Foundation Limitted Vesicles comprising a PTEN inhibitor and uses of same
CA3103663A1 (en) 2018-06-18 2019-12-26 University Of Rochester Inhibition of re1-silencing transcription factor in the treatment of schizophrenia and other neuropsychiatric disorders
EP3810184A2 (de) 2018-06-21 2021-04-28 University of Rochester Verfahren zur behandlung oder hemmung des auftretens von morbus huntington
SG11202100715WA (en) 2018-08-13 2021-02-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc HEPATITIS B VIRUS (HBV) dsRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2019396450A1 (en) 2018-12-11 2021-06-24 University Of Rochester Methods of treating schizophrenia and other neuropsychiatric disorders
JP2022513482A (ja) 2018-12-21 2022-02-08 アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． 抗トランスフェリン受容体抗体およびその使用
WO2020167822A2 (en) 2019-02-13 2020-08-20 University Of Rochester Gene networks that mediate remyelination of the human brain
WO2021011936A2 (en) 2019-07-18 2021-01-21 University Of Rochester Cell-type selective immunoprotection of cells
AU2020345317A1 (en) 2019-09-10 2022-04-21 Daiichi Sankyo Company, Limited CONJUGATE OF GalNAc-OLIGONUCLEOTIDE FOR DELIVERY TO LIVER AND MANUFACTURING METHOD THEREOF
CN115666589A (zh) 2020-03-19 2023-01-31 艾维迪提生物科学公司 治疗面肩肱型肌营养不良的组合物和方法
CN115697418A (zh) 2020-03-27 2023-02-03 艾维迪提生物科学公司 治疗肌营养不良的组合物和方法
WO2021255262A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Sylentis Sau siRNA AND COMPOSITIONS FOR PROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC TREATMENT OF VIRUS DISEASES
US11459567B2 (en) 2020-06-24 2022-10-04 Patricia Virginia Elizalde Specific siRNA molecules, composition and use thereof for the treatment of triple negative breast cancer
EP4015634A1 (de) 2020-12-15 2022-06-22 Sylentis, S.A.U. Sirna und zusammensetzungen zur prophylaktischen und therapeutischen behandlung von viruskrankheiten
WO2022162155A1 (en) 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Nucleic acids containing abasic nucleotides
AU2022214281A1 (en) 2021-01-30 2023-07-27 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2022162161A1 (en) 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2022162157A1 (en) 2021-01-30 2022-08-04 E-Therapeutics Plc Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
CA3204317A1 (en) 2021-01-30 2022-08-04 Ahmad Ali MORTAZAVI Conjugated oligonucleotide compounds, methods of making and uses thereof
WO2023014677A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
AU2022336209A1 (en) 2021-09-03 2024-01-18 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
CA3231330A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023150553A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 University Of Rochester Gpr17 promoter-based targeting and transduction of glial progenitor cells

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB992744A (en) 1962-01-18 1965-05-19 Dennis Harold Ward Plastic containers and lifting means therefore
US4217294A (en) 1979-03-30 1980-08-12 Union Carbide Corporation Method for producing mercaptan-containing organosilicon compounds
EP0942000B1 (de) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5914396A (en) 1990-01-11 1999-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5955589A (en) * 1991-12-24 1999-09-21 Isis Pharmaceuticals Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5872232A (en) 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US5811533A (en) 1990-06-11 1998-09-22 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to vascular endothelial growth factor (VEGF)
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
CA2093664C (en) † 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
FR2678512B1 (fr) 1991-07-03 1995-06-30 Novacell Machine a internaliser.
EP1695979B1 (de) 1991-12-24 2011-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Durch DNA-Abschnitte unterbrochene modifizierte Oligonukleotide
HUT69981A (en) * 1992-07-02 1995-09-28 Hybridon Inc Self-stabilized oligonucleotides as therapeutic agents
CA2105364A1 (en) * 1993-09-01 1995-03-02 Eric T. Kool Stem-loop oligonucleotides containing parallel and antiparallel binding domains
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US6060456A (en) * 1993-11-16 2000-05-09 Genta Incorporated Chimeric oligonucleoside compounds
NZ277617A (en) * 1993-11-16 1998-01-26 Genta Inc Chimeric oligonucleoside compounds useful in activating rnaseh mediated cleavage of ribonucleic acid sequences
GB9425118D0 (en) 1994-12-13 1995-02-08 Henkel Kgaa Two component natural hair colorant
CA2207593A1 (en) 1994-12-13 1996-06-20 John Gustofson Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US5716824A (en) 1995-04-20 1998-02-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-alkylthioalkyl and 2-C-alkylthioalkyl-containing enzymatic nucleic acids (ribozymes)
US5760012A (en) * 1996-05-01 1998-06-02 Thomas Jefferson University Methods and compounds for curing diseases caused by mutations
DE19618797C2 (de) 1996-05-10 2000-03-23 Bertling Wolf Vehikel zum Transport molekularer Substanz
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
US6284267B1 (en) 1996-08-14 2001-09-04 Nutrimed Biotech Amphiphilic materials and liposome formulations thereof
GB9710475D0 (en) 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
GB9720148D0 (en) 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
US6129912A (en) 1997-09-26 2000-10-10 Uab Research Foundation Polyethylene glycol-protein compositions which reduce the antigenic display of red blood cells
US6617438B1 (en) * 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1071762A4 (de) 1998-03-20 2003-09-24 Benitec Australia Ltd Kontrolle der genexpression
EP1068311B2 (de) 1998-04-08 2020-12-09 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen
EP1071753A2 (de) 1998-04-20 2001-01-31 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nukeinsäure moleküle mit einer neuen chemischen zusammensetzung die fähig sind die expression von gene zu modulieren
JP2002512794A (ja) 1998-04-29 2002-05-08 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ヌクレオチド三リン酸およびリボザイム内へのそれらの取り込み
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6200924B1 (en) 1999-01-29 2001-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Porous highly fluorinated acidic polymer catalyst
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
JP2002542263A (ja) 1999-04-21 2002-12-10 ワイス ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物
DE60026313D1 (de) 1999-07-23 2006-04-27 Uutech Ltd Sensibilisierung von roten blutkörperchen gegenüber ultraschall durch einwirkung eines elektrischen feldes
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
EP2345742B1 (de) 2000-03-30 2014-06-11 The Whitehead Institute for Biomedical Research Mediatoren von RNS-interferenz, die RNS-sequenzspezifisch sind
EP1309706A2 (de) 2000-08-19 2003-05-14 Axordia Limited Modulation der stammzell-differenzierung
US20030190635A1 (en) 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
WO2003070912A2 (en) * 2001-06-06 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20060142226A1 (en) 2001-05-18 2006-06-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1390472A4 (de) 2001-05-29 2004-11-17 Sirna Therapeutics Inc Nukleinsäurebehandlung von krankheiten oder leiden im zusammenhang mit ras-, her2- und hiv-niveaus
US7074863B2 (en) 2001-06-22 2006-07-11 Borealis Technology Oy Metallocene catalysts containing an idenyl moiety substituted at the 4,-5,-6- or 7-position by a siloxy or germyloxy group
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US20030135033A1 (en) 2002-01-04 2003-07-17 Anke Klippel-Giese Compounds and methods for the identification and/ or validation of a target
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
CA2474414C (en) * 2002-02-01 2018-03-06 Mcgill University Oligonucleotides comprising alternating segments and uses thereof
EP1572902B1 (de) 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HOCHWIRKSAME siRNAS ZUR REDUZIERUNG DER EXPRESSION VON ZIELGENEN
AU2003207708A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
DE60310944T3 (de) 2002-08-05 2017-08-03 Silence Therapeutics Gmbh Weitere neue formen von interferierende rns moleküle
EP1393742A1 (de) 2002-08-14 2004-03-03 atugen AG Verwendung von Protein Kinase N beta
KR101295939B1 (ko) 2002-08-14 2013-09-09 사일런스 테라퓨틱스 아게 단백질 키나아제 ｎ 베타의 용도
PT1551868E (pt) 2002-10-18 2009-04-06 Silence Therapeutics Ag Factor envolvido nas metástases e as respectivas utilizações
US7289445B2 (en) * 2002-11-25 2007-10-30 Intel Corporation Managing a protocol control block cache in a network device
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
CA2530125A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Atugen Ag Use of double-stranded ribonucleic acid for inducing cell lysis
EP1735009A4 (de) 2004-03-12 2011-03-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Irna mittel targeting vegf
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20050217329A1 (en) * 2004-04-02 2005-10-06 Wen-Kwei Chang Anti-drilling structure of a latch
HUE036916T2 (hu) 2004-05-05 2018-08-28 Silence Therapeutics Gmbh Lipidek, lipid komplexek és ezek alkalmazása
EP1765847A4 (de) 2004-05-27 2010-10-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc Nukleaseresistente doppelsträngige ribonukleinsäure
AP2007003921A0 (en) 2004-08-16 2007-02-28 Atugen Ag Therapeutic uses of inhibitors of rtp801
EP1830888B1 (de) 2004-12-27 2015-08-05 Silence Therapeutics GmbH Mit peg beschichtete lipid-komplexe und ihre anwendung
US20070027097A1 (en) 2005-07-28 2007-02-01 Lewis David L Small interfering RNA with improved activity
MX2008005508A (es) 2005-10-28 2008-11-18 Topigen Pharmaceuticals Inc Pequeños oligonucleotidos de interferencia que comprenden nucleotidos modificados de arabinosa.
EP2395012B8 (de) 2005-11-02 2018-06-06 Arbutus Biopharma Corporation Modifizierte siRNA-Moleküle und Verwendungen davon
NL2000439C2 (nl) 2006-01-20 2009-03-16 Quark Biotech Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801.
US7541994B2 (en) 2006-05-17 2009-06-02 Raytheon Company Refractive compact range
US8614309B2 (en) 2007-10-03 2013-12-24 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded RNA directed to CASP2 and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CY1119021T1 (el) 2018-01-10
US10323246B2 (en) 2019-06-18
US20110118456A1 (en) 2011-05-19
BRPI0313202A8 (pt) 2016-08-16
EP3222725A1 (de) 2017-09-27
US20170247691A1 (en) 2017-08-31
DK1527176T4 (en) 2017-07-03
ES2280826T3 (es) 2007-09-16
US20170247707A1 (en) 2017-08-31
CY1120128T1 (el) 2018-12-12
KR20050035877A (ko) 2005-04-19
DE60310944D1 (de) 2007-02-15
MXPA05001355A (es) 2005-09-30
JP2011024592A (ja) 2011-02-10
US20170247697A1 (en) 2017-08-31
DK2258847T3 (en) 2017-06-26
DK3222724T3 (en) 2018-12-03
IL166546A (en) 2014-01-30
US8933215B2 (en) 2015-01-13
EP1857547B1 (de) 2018-01-17
US20130102769A1 (en) 2013-04-25
US9783802B2 (en) 2017-10-10
DE60310944T3 (de) 2017-08-03
SI2258847T1 (sl) 2017-08-31
US9222092B2 (en) 2015-12-29
EP1857547A2 (de) 2007-11-21
CN1675359A (zh) 2005-09-28
AU2008207337A1 (en) 2008-09-04
US20210062198A1 (en) 2021-03-04
EP3222726A1 (de) 2017-09-27
WO2004015107A3 (en) 2004-04-29
CA2494930A1 (en) 2004-02-19
US9758784B1 (en) 2017-09-12
US8324370B2 (en) 2012-12-04
ES2280826T5 (es) 2017-08-03
US20190024089A1 (en) 2019-01-24
AU2003260370B2 (en) 2008-05-22
US7452987B2 (en) 2008-11-18
US20180223286A1 (en) 2018-08-09
US20160130587A1 (en) 2016-05-12
EP1527176B1 (de) 2007-01-03
DK1527176T3 (da) 2007-05-07
US20150105545A1 (en) 2015-04-16
PT1527176E (pt) 2007-04-30
EP2258847B2 (de) 2020-07-01
JP2013179944A (ja) 2013-09-12
US20190390201A1 (en) 2019-12-26
BR0313202A (pt) 2005-06-21
EP3222724B1 (de) 2018-10-31
EP1857547A3 (de) 2011-05-18
US20170247698A1 (en) 2017-08-31
EP3222724A1 (de) 2017-09-27
ZA200500459B (en) 2005-08-31
CA2494930C (en) 2021-03-09
US10774332B2 (en) 2020-09-15
JP2016144451A (ja) 2016-08-12
KR101201664B1 (ko) 2012-11-15
DK1857547T3 (en) 2018-04-23
WO2004015107A2 (en) 2004-02-19
JP2017163995A (ja) 2017-09-21
IL166546A0 (en) 2006-01-15
AU2003260370A1 (en) 2004-02-25
EP2258847A2 (de) 2010-12-08
EP2258847B1 (de) 2017-03-15
CY1120919T1 (el) 2019-12-11
US9790505B2 (en) 2017-10-17
US20090186845A1 (en) 2009-07-23
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