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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Ribonukleinsäure umfassend eine doppel-strängige Struktur, wobei
die doppel-strängige
Struktur einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei
der erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden umfasst und wobei der erste Abschnitt wenigstens teilweise
komplementär
zu der Ziel-Nukleinsäure ist,
und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise
identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist,
die Verwendung einer derartigen Ribonukleinsäure, eine Zelle bzw. ein Organismus,
der eine derartige Ribonukleinsäure
umfasst, eine Zusammensetzung, die eine derartige Ribonukleinsäure umfasst,
eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine derartige Ribonukleinsäure umfasst, und
ein Verfahren zum Inhibieren der Expression eines targetierten Gens.
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RNA-vermittelte
Interferenz (RNAi) ist ein post-translationeller Gen-Abschaltmechanismus,
der durch doppel-strängige
RNA (dsRNA), die hinsichtlich ihrer Sequenz zu dem abgeschalteten
Gen homolog ist, initiiert wird. (Fire (1999), Trends Genet 15,
358-63, Tuschl, et al. (1999), Genes Dev 13, 3191-7, Waterhouse,
et al. (2001), Nature 411, 834-42, Elbashir, et al. (2001), Nature
411, 494-8, für
eine Übersicht
siehe Sharp (2041), Genes Dev 15, 485-90, Barstead (2001), Curr Opin Chem
Biol 5, 63-6). RNAi ist intensive verwendet worden, um die Genfunktion
bei einer Anzahl von Organismen zu bestimmen, einschließlich Pflanzen
(Baulcombe (1999), Curr Opin Plant Biol 2, 109-13), Nematoden (Montgomery,
et al. (1998), Proc Natl Acad Sci USA 95, 15502-7), Drosophila (Kennerdell,
et al. (1998), Cell 95, 1017-26,
Kennerdell, et al. (2000), Nat Biotechnol 18, 896-8). Bei dem Nematoden
C. elegans ist bereits ein Drittel des Genoms Gegenstand einer funktionellen
Analyse durch RNAi gewesen (Kim (2001), Curr Biol 11, R85-7, Maeda,
et al. (2001), Curr Biol 11, 171-6).
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Bis
vor kurzem war RNAi bei Säugerzellen
im allgemeinen nicht anwendbar mit Ausnahme der frühen Mausentwicklung
(Wianny, et al. (2000), Nat Cell Biol 2, 70-5). Die Entdeckung,
dass die Transfektion mit Duplexen aus 21 Nukleotiden in Säugetierzellen
die Genexpression störte
und keine Sequenz-unabhängige
Interferon-getriebene anti-virale Antwort induzierte, die üblicherweise
mit langer dsRNA erhalten wird, führte zu neuen potentiellen Anwendungen
bei differenzierten Säugerzellen
(Elbashir et al. (2001), Nature 411, 494-8). Interessanterweise ähneln diese
kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) den Prozessierungsprodukten
aus langen dsRNAs, was einen möglichen
Umgehungsmechanismus bei differenzierten Säugetierzellen nahelegt. Der
Dicer-Komplex, ein Mitglied der RNAse III-Familie, der für das initiale Prozessieren
von dsRNA erforderlich ist, ist identifiziert worden (Bernstein,
et al. (2001), Nature 409, 363-6, Billy, et al. (2001), Proc Natl
Acad Sci USA 98, 14428-33). Eines der früher aufgetretenen Probleme
bei der Verwendung von nicht-modifizierten
Ribooligonukleotiden war der schnelle Abbau in Zellen oder sogar
im Serumenthaltenden Medium (Wickstrom (1986), J Biochem Biophys
Methods 13, 97-102, Cazenave, et al. (1987), Nucleic Acids Res 15,
10507-21). Es wird von der speziellen Gen-Funktion und den speziellen Testsystemen,
die verwendet werden, abhängen,
ob der entsprechende Knock-Down, der durch trans-wirkende siRNA
induziert wird, lang genug aufrecht erhalten werden wird, um eine
phänotypische Änderung
zu erreichen.
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Parrish
S. et al. (Molecular Cell, Band 6, 1077-1087, November, 2005) beschreiben
die Erfordernisse von dsRNAs, die das unc 22-Gen von C. elegans
targetieren. Genauer wird der Einfluss von chemischer Modifikation
auf bestimmte Nukleotide untersucht, wobei ob ein Nukleotid modifiziert
wird, von der Chemie des Nukleotids abhängt.
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Die
veröffentlichte
internationale Patentanmeldung WO 02/055693 offenbart die Verwendung
von RNAi-Molekülen
mit einer doppel-strängigen
Struktur, wobei ein derartiges RNAi-Molekül einen Überhang an einem Ende aufweist,
der aus 1-4 Nukleotiden gebildet ist.
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Die
veröffentlichte
internationale Patentanmeldung WO 02/044321 offenbart die Verwendung
von RNAi-Molekülen
mit einer doppel-strängigen
Struktur, wobei derartige RNAi-Moleküle eine Länge von 19-23 Nukleotidpaaren
aufweisen.
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Die
veröffentlichte
internationale Patentanmeldung WO 95/13834 offenbart chimäre Oligonukleotidverbindungen,
die bei der Aktivierung von RNAase H-vermittelter Spaltung von Ziel-Nukleinsäuresequenzen nützlich sind.
Genauer sind derartige chimäre
Oligonukleotide einzel-strängige
Oligonukleotide, die zu einer Ziel-Nukleinsäure komplementär sind.
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Das
der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem bestand darin,
synthetische interferierende RNA-Moleküle bereitzustellen, die sowohl
stabil als auch in einer biochemischen Umgebung wie beispielsweise
einer lebenden Zelle aktiv sind.
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Das
der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem wird durch den
Gegenstand der beigefügten
unabhängigen
Ansprüche
gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen
ergeben sich aus den beigefügten
abhängigen
Ansprüchen.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung,
dass kleine interferierende RNAs so konstruiert werden können, dass
sie sowohl hoch spezifisch als auch hoch aktiv ebenso wie unter den
Reaktionsbedingungen stabil sind, die typischerweise in biologischen
Systemen wie beispielsweise biochemischen Tests oder zellulären Umgebungen
angetroffen werden. Die verschiedenen, im Stand der Technik wie
beispielsweise Tuschl et al. (internationale Patentanmeldung WO
01/75164) beschriebenen interferierenden RNAs sehen eine Länge von
21-23 Nukleotiden und eine Modifikation am 3'-Ende der doppel-strängigen RNA vor. Die vorliegenden
Erfinder haben überraschenderweise
festgestellt, dass das Problem der Stabilität von interferierender RNA,
einschließlich
kleiner interferierender RNA (siRNA), die hierin allgemein im folgenden
als RNAi bezeichnet werden, tatsächlich
im Angriff von Endonukleasen statt Exonukleasen, wie man früher glaubte,
begründet
liegt. Auf der Grundlage dieser Feststellung wurden verschiedene
Strategien von den vorliegenden Erfindern entwickelt, die Gegenstand
der vorliegenden Anmeldung sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft somit neue Formen von interferierender
RNA, wie in Anspruch 1 definiert. RNAi besteht aus einer Ribonukleinsäure, die
eine doppel-strängige
Struktur umfasst. Die doppel-strängige
Struktur wird durch einen ersten Strang und einen zweiten Strang
ausgebildet. Der erste Strang umfasst einen Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden, der hierin auch als erster Abschnitt aus auseinanderfolgenden
Nukleotiden bezeichnet wird, und dieser erste Abschnitt ist wenigstens
teilweise komplementär
zu einer Ziel-Nukleinsäure.
Der zweite Strang umfasst auch einen Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise identisch
zu einer Ziel-Nukleinsäure
ist. Die spezielle Grundstruktur dieser Ribonukleinsäure ist
schematisch in 1 gezeigt. Der erste Strang
und der zweite Strang sind bevorzugterweise miteinander hybridisiert
und bilden die doppel-strängige
Struktur aus. Die Hybridisierung erfolgt typischerweise durch Watson-Crick-Basenpaarung.
Die erfindungsgemäße Ribonukleinsäure ist
jedoch hinsichtlich ihrer Länge
nicht notwendigerweise auf die doppel-strängige Struktur beschränkt. Es kann
weitere Nukleotide geben, die an einem jeden Strang und/oder an
ein jedes Ende eines jeden Stranges angefügt sind, der/die die RNAi bilden.
Abhängig
von der besonderen Sequenz des ersten Abschnittes und des zweiten
Abschnittes ist die Hybridisierung oder Basenpaarung nicht notwendigerweise
vollständig
oder perfekt, was bedeutet, dass der erste und zweite Abschnitt
infolge von Fehlpaarungen nicht zu 100% basengepaart sind. Es kann
auch eine oder mehrere Fehlpaarungen innerhalb des Duplex geben.
Die Fehlpaarungen haben keine Wirkung auf die RNAi-Aktivität, wenn
sie außerhalb
eines Bereiches von bevorzugterweise 15, 16 oder 17 passenden Nukleotiden
angeordnet sind. Wenn Fehlpaarungen so angeordnet sind, dass sie lediglich
15 oder weniger aufeinanderfolgende passende Nukleotide ergeben,
zeigt das RNAi-Molekül typischerweise
eine verringerte Aktivität
beim Herunterregulieren von mRNA für ein gegebenes Ziel verglichen
mit einem Duplex aus passenden 17 Nukleotiden.
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Der
erste Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden des ersten
Stranges ist im Wesentlichen komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure, bevorzugtererweise
zu einem Teil der Ziel-Nukleinsäure.
Komplementär
wie hierin verwendet bezeichnet bevorzugterweise, dass die Nukleotidsequenz
des ersten Stranges an eine Nukleinsäuresequenz einer Ziel-Nukleinsäuresequenz
oder einen Teil davon hybridisiert. Typischerweise ist die Ziel-Nukleinsäuresequenz
oder Ziel-Nukleinsäure
gemäß dem Wirkmechanismus
von interferierenden Ribonukleinsäuren eine einzel-strängige RNA,
bevorzugtererweise eine mRNA. Eine derartige Hybridisierung erfolgt
am wahrscheinlichsten durch Watson-Crick-Basenpaarung, ist jedoch nicht notwendigerweise
darauf beschränkt.
Der Umfang, in dem der erste Strang und genauer der erste Abschnitt
aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden des ersten Stranges komplementär zu einer
Ziel-Nukleinsäuresequenz
ist, kann so hoch wie 100% und so wenig wie 80%, bevorzugterweise
80-100%, bevorzugtererweise 85-100% und am bevorzugtesten 90-100%
sein. Eine optimale Komplementarität scheint 95-100% zu sein.
Komplementarität
in diesem Sinne bedeutet, dass der vorerwähnte Bereich von Nukleotiden
wie, beispielsweise, 80%-100% der Nukleotide, abhängig von
dem speziellen Bereich, perfekt durch Watson-Crick-Basenpaarung
gepaart sind. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird gezeigt,
dass die Komplementarität
zwischen dem ersten Abschnitt von Nukleotiden und der Ziel-RNA 18-19
Nukleotide sein muss, Bereiche von so wenig wie 17 Nukleotiden selbst mit
zwei Sequenz-spezifischen Überhängen sind
nicht funktional beim Vermitteln von RNAi. Entsprechend wäre, ausgehend
von einem Duplex mit einer Länge
von 19 Nukleotiden oder Basenpaaren eine minimale Komplementarität von 17
Nukleotiden oder Nukleotidbasenpaaren akzeptabel, was eine Fehlpaarung
von zwei Nukleotiden erlaubt. Im Falle eines Duplexes, der aus 20
Nukleotiden oder Basenpaaren besteht, wäre eine Komplementarität von 17
Nukleotiden oder Nukleotidbasenpaaren erlaubbar und funktionell
aktiv. Das gleiche gilt für
einen Duplex aus 21 Nukleotiden oder Basenpaaren mit insgesamt 17
komplementären
Nukleotiden oder Basenpaaren. Grundsätzlich kann der Umfang an Komplementarität, die für eine Länge eines
Duplexes erforderlich ist, d. h. einer doppelsträngigen Struktur, auch auf der
Schmelztemperatur des Komplexes basieren, der durch entweder die
doppel-strängige
Struktur, wie sie hierin beschrieben ist, oder durch den Komplex
aus dem ersten Abschnitt des ersten Stranges und der Ziel-Nukleinsäure gebildet
ist.
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Es
soll verstanden werden, dass alle Ribonukleinsäuren der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, RNA-vermittelte Interferenz zu bedingen oder daran
beteiligt zu sein, wie sie beispielsweise in den internationalen
Patentanmeldungen WO 99/32619, WO 00/44895 und WO 01/75164 beschrieben
ist.
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Die
erste Strategie gemäß der ein
interferierendes Ribonukleinsäuremolekül in Übereinstimmung
mit Anspruch 1 gemäß der vorliegenden
Erfindung ausgestaltet sein kann, besteht darin, dass der Bereich,
der komplementär
zur Ziel-Nukleinsäure
ist, eine optimale Länge
von 18 und 19 Nukleotiden aufweist. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden
Erfindung, dass die optimale Länge
von 18 oder 19 Nukleotiden die Länge
der doppelsträngigen
Struktur in der verwendeten RNAi ist. Dieses Längenerfordernis ist eindeutig
verschieden von der technischen Lehre des Standes der Technik, wie,
beispielsweise, der internationalen Patentanmeldung WO 01/75164.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jegliche
weitere Ausgestaltung gemäß der vorliegenden
Erfindung und wie im Stand der Technik beschrieben, im Zusammenhang
mit einer interferierenden Ribonukleinsäure mit diesen Längencharakteristiken
realisiert werden kann, d. h. einer Länge von 18 oder 19 Nukleotiden.
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Die
zweite Strategie gemäß der ein
interferierendes Ribonukleinsäuremoleküle in Übereinstimmung mit
Anspruch 1 ausgestaltet sein kann, besteht darin, dass es am ersten
Strang eine freie 5'-Hydroxylgruppe aufweist,
die hierin auch als freie 5'OH-Gruppe
bezeichnet wird. Eine freie 5'OH-Gruppe
bedeutet, dass das terminalste Nukleotid, das den ersten Strang
bildet, vorhanden und nicht modifiziert ist, insbesondere nicht durch
eine End- Modifikation
modifiziert ist. Typischerweise liegt die terminale 5'-Hydroxygruppe des
zweiten Stranges auch in einer nicht-modifizierten Form vor. In
einer bevorzugteren Ausführungsform
ist auch das 3'-Ende
des ersten Stranges bzw. ersten Abschnittes unmodifiziert, um eine
freie OH-Gruppe zu präsentieren, die
hierin auch als freie 3' OH-Gruppe bezeichnet
wird, wobei die Ausgestaltung des 5'-terminalen Nukleotids eine solche gemäß einer
der zuvor beschriebenen Ausführungsformen
ist. Bevorzugterweise ist eine derartige freie OH-Gruppe auch am
3'-Ende des zweiten
Stranges bzw. zweiten Abschnittes vorhanden. In weiteren Ausführungsformen
der Ribonukleinsäuremoleküle, wie
sie zuvor hinsichtlich der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden,
kann das 3'-Ende
des ersten Stranges bzw. ersten Abschnittes und/oder das 3'-Ende des zweiten
Stranges bzw. zweiten Abschnittes eine End-Modifikation am 3'-Ende aufweisen.
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Wie
hierin verwendet bezeichnen die Begriffe freie 5'OH-Gruppe und 3'-OH-Gruppe auch, dass das am meisten
terminal gelegene Nukleotid am 5'-Ende
bzw. am 3'-Ende
des Polynukleotids eine OH-Gruppe präsentiert. Eine derartige OH-Gruppe
kann entweder von dem Zuckerteil des Nukleotids, bevorzugterweise
von der 5'-Position
im Falle der 5'-Gruppe
und von der 3'-Position
im Falle der 3'OH-Gruppe
stammen, oder von einer Phosphat-Gruppe,
die an dem Zuckerteil des entsprechenden terminalen Nukleotids befestigt
ist. Die Phosphat-Gruppe kann prinzipiell an irgendeine OH-Gruppe
des Zuckerteils des Nukleotids befestigt sein. Bevorzugterweise
ist die Phosphat-Gruppe an der 5'-OH-Gruppe
des Zuckerteils im Falle der freien 5'OH-Gruppe befestigt und/oder an der
3'OH-Gruppe des
Zuckerteils im Falle der freien 3'OH-Gruppe, was immer noch das bereitstellt,
was hierin als freie 5' oder
3'OH-Gruppe bezeichnet
wird.
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Wie
hierin im Zusammenhang mit einer jeglichen Strategie für die Ausgestaltung
von RNAi oder irgendeiner Ausführungsform
der hierin offenbarten RNAi verwendet, bedeutet der Begriff End-Modifikation
eine chemische Entität,
die an das am meisten 5' oder
3'-gelegene Nukleotid
des ersten und/oder zweiten Stranges hinzugefügt ist. Beispiele für derartige
End-Modifikation
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf, invertierte abasische (Desoxy)Nukleotide, Amin, Fluor, Chlor,
Brom, CN, CF, Methoxy, Imidazol, Caboxylat, Thioat, C
1 bis C
10 niedriges Alkyl, substituiertes niedriges
Alkyl, Alkaryl oder Aralkyl, OCF
3, OCN,
O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH
3;
SO
2CH
3; ONO
2; NO
2, N
3; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl;
Aminoalkylamino; Polyalklylamino oder substituiertes Silyl, wie,
beispielsweise, in den europäischen
Patenten
EP 0 586 520
B1 oder
EP
0 618 925 B1 beschrieben.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet Alkyl oder irgendein Begriff, der „Alkyl" umfasst, eine jegliche
Kohlenstoffatomkette, die 1 bis 12, bevorzugterweise 1 bis 6 und
bevorzugtererweise 1 bis 2 C-Atome umfasst.
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Eine
weitere End-Modifikation ist eine Biotin-Gruppe. Eine derartige
Biotin-Gruppe kann bevorzugterweise an entweder dem am meisten 5' oder dem am meisten
3'-gelegenen Nukleotid
des ersten und/oder zweiten Stranges oder beiden Enden befestigt
sein. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Biotin-Gruppe an
ein Polypeptid oder ein Protein gekoppelt. Es ist auch im Rahmen
der vorliegenden Erfindung, dass das Polypeptid oder das Protein
durch eine jegliche der zuvor erwähnten End-Modifikationen befestigt
ist. Das Polypeptid oder Protein kann den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen weitere
Merkmale verleihen. Unter anderem kann das Polypeptid oder Protein
als ein Ligand für
ein weiteres Molekül
dienen. Wenn das weitere Molekül
ein Rezeptor ist, kann die Funktion und Aktivität des Rezeptors durch den bindenden
Liganden aktiviert werden. Der Rezeptor kann eine Internalisierungsaktivität aufweisen,
die eine effektive Transfektion des an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül gebundenen
Liganden erlaubt. Ein Beispiel für
den Liganden, das erfindungsgemäß an die
Nukleinsäuremoleküle gebunden
werden soll, ist VEGF und der entsprechende Rezeptor ist der VEGF-Rezeptor.
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Verschiedene
mögliche
Ausführungsformen
der RNAi der vorliegenden Erfindung, die verschiedene Arten von
End-Modifikation(en) aufweisen, sind in der folgenden Tabelle 1
angegeben.
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Tabelle
1: Verschiedene Ausführungsformen
der interferierenden Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
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Die
verschiedenen End-Modifikationen, wie sie hierin offenbart sind,
sind bevorzugterweise an dem Riboseteil eines Nukleotids der Ribonukleinsäure angeordnet.
Bevorzugtererweise kann die End-Modifikation an irgendeine der OH-Gruppen
des Riboseteils gebunden sein oder diese ersetzen, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf die 2'OH-, 3'OH- und 5'OH-Position, unter der
Vorraussetzung, dass das solchermaßen modifizierte Nukleotid
ein terminales Nukleotid ist. Invertierte abasische Nukleotide sind
Nukleotide, entweder Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, die
keinen Nukleobasenteil aufweisen. Die Art von Verbindung ist, unter
anderem, in Sternberger et al. (2002), Antisense. Nucl. Ac. Drug
Dev. in press, beschrieben.
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Eine
jede der zuvor erwähnten
End-Modifikationen kann im Zusammenhang mit den verschiedenen Ausführungsformen
von RNAi, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind, verwendet werden.
Im Zusammenhang damit gilt es festzuhalten, dass eine jede der RNAi-Formen
oder Ausführungsformen,
wie sie hierin offenbart sind, wobei der Sense-Strang inaktiviert
ist, bevorzugterweise indem er eine End-Modifikation aufweist und
bevorzugtererweise am 5'-Ende eine Endmodifikation
aufweist, besonders vorteilhaft ist. Dies ergibt sich aus der Inaktivierung
des Sense-Stranges, der dem zweiten Strang der hierin beschriebenen
Ribonukleinsäuren
entspricht, der ansonsten mit einer nicht in Beziehung stehenden
einzel strängigen
RNA in der Zelle interferieren könnte.
Die Expression und insbesondere das Expressions- und besonders das
Translationsmuster des Transkriptoms einer Zelle wird somit spezifischer
beeinflusst. Diese Wirkung wird auch als Off-Target-Wirkung bezeichnet.
Unter Bezugnahme auf Tabelle 1 sind jene als Ausführungen
7 und 8 dargestellten Ausführungen
im obigen Sinne besonders vorteilhaft, da die Modifikation zu einer
Inaktivierung des – Zielunspezifischen – Teils der
RNAi führt
(was der zweite Strang ist), wodurch eine jegliche unspezifische
Wechselwirkung des zweiten Stranges mit einzel-strängiger RNA
in einem zellulären
oder ähnlichen
System verringert wird, wo die RNAi gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden soll, um spezifische Ribonukleinsäuren bzw.
Proteine herunterzuregulieren.
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Eine
dritte Strategie wie sie Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist,
besteht darin, eine Ribonukleinsäure
gemäß Anspruch
1 zu realisieren, die ein doppel-strängige Struktur umfasst, wobei
die doppel-strängige
Struktur einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei
der erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden umfasst, wobei der erste Strang wenigstens teilweise
komplementär
zu einer Ziel-Nukleinsäure
ist, und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise
identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist,
wobei die doppel-strängige
Struktur glattendig ist. Wie im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung verwendet wird der Begriff doppel-strängige Struktur auch als Duplex
bezeichnet. Die Ausgestaltung ist somit eindeutig verschieden von,
beispielsweise, der von Tuschl et al., wie sie in der Patentanmeldung
WO 01/75164 offenbart ist, die einen 3'-Überhang
offenbart. Wie hierin verwendet bezeichnet Überhang eine doppel-strängige Struktur,
wobei wenigstens ein Ende des Strangs länger ist als das korrespondierende
Ende des anderen Stranges, das die doppel-strängige Struktur ausbildet, der
hierin auch als der Gegenstrang bezeichnet wird. Bevorzugterweise
ist der erste Abschnitt identisch zu dem ersten Strang und der zweite
Strang ist identisch zu dem zweiten Strang.
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Mit
Blick auf die Wirksamkeit von glatt-endiger RNAi und den Vorteilen
einer End-Modifikation
von entweder dem ersten oder dem zweiten Strang, oder beiden, der
entsprechenden Ribonukleinsäure
ist es bevorzugt, eine Kombination aus beiden Ausgestaltungsprinzipien
zu haben. Mit anderen Worten, es ist im Rahmen der vorliegenden
Erfindung, dass eine glatt-endige RNAi vorliegt, die ein Endmodifikationsschema
aufweist, wie es in Tabelle 1 dargestellt ist.
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Die
vierte Strategie, wie sie Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist, besteht darin, am 5'-Ende der Ribonukleinsäure gemäß Anspruch
1 einen 5'-Überhang
zu haben. Genauer kann ein derartiger Überhang im Prinzip an einem
jeden oder sowohl dem ersten als auch dem zweiten Strang der Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung vorhanden sein. Die Länge
des Überhangs
kann so wenig wie ein Nukleotid und so lang wie 2 bis 8 Nukleotide,
bevorzugterweise 2, 4, 6 oder 8 Nukleotide sein. Es ist im Rahmen
der vorliegenden Erfindung, dass der 5'-Überhang
an dem ersten Strang und/oder dem zweiten Strang der Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung angeordnet ist. Das/die Nukleotid(e), die den Überhang
ausbildet/ausbilden, kann/können
(ein) Desoxyribonukleotid(e), (ein) Ribonukleotid(e) oder eine Fortsetzung
davon sein.
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Der Überhang
umfasst bevorzugterweise wenigstens ein Desoxyribonukleotid, wobei
das eine Desoxyribonukleotid bevorzugterweise das am meisten 5'-terminal gelegene
ist. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das 3'-Ende des entsprechenden
Gegenstranges der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure keinen Überhang
aufweist, bevorzugterweise keinen Desoxyribonukleotid-Überhang.
Hier wiederum kann eine jede der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäuren ein
Endmodifikationsschema aufweisen, wie im Zusammenhang mit Tabelle
1 dargestellt und/oder eine End-Modifikation, wie hierin dargelegt.
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Die
Strategie bei der Ausgestaltung der interferierenden Ribonukleinsäuren gemäß Anspruch
1 besteht in der Ausbildung eines bestimmten Musters aus modifizierten
Nukleotiden auf sowohl dem ersten als auch auf dem zweiten und genauer
auf dem ersten und zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden
der Ribonukleinsäure(n)
gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die Art von Modifikation der Nukleotide kann die gleiche
sein, wie im Zusammenhang mit den anderen Strategien zur Ausgestaltung
interferierender RNA diskutiert, wie sie hierin offenbart sind,
und genauer die Art von Modifikation, wie sie hierin beschrieben
ist, oder eine End-Modifikation, wie beispielsweise, ein invertiertes
abasisches Nukleotid, Methoxy oder Amino und dergleichen am Riboseteil
von wenigstens einem Nukleotid, das die Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung ausbildet. Es ist festzuhalten, dass die Modifikation
der Nukleotide eine jegliche Modifikationsform sein kann, wie sie
hierin beschrieben ist, insbesondere die Art von Modifikation, wie
sie hierin als End-Modifikation
beschrieben ist, mit der Vorgabe, dass die so genannte End-Modifikation
nicht notwendigerweise an terminalen Nukleotiden lokalisiert ist.
Vielmehr erfolgt die Modifikation an einem nicht-terminalen Nukleotid.
Unter derartigen Bedingungen ist die Modifikation bevorzugterweise
an den Riboseteil des – zu
modifizierenden – Nukleotids
und bevorzugterweise an die 2'-Position
des Riboseteils gebunden.
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Es
ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jede Ribonukleinsäure gemäß Anspruch 1
auch die Merkmale aufweisen kann, die einer Ribonukleinsäure gemäß Anspruch
1 durch irgendeine der anderen Ausgestaltungsstrategien verliehen
wird, wie sie hierin beschrieben sind. Entsprechend kann die interferierende
Ribonukleinsäure
ein Muster aus modifizierten Nukleotiden aufweisen, die eine End-Modifikation aufweisen,
ein Endmodifikationsschema aufweisen, können glattendig sein oder einen
5'-Überhang
oder eine Kombination aus zwei oder mehreren dieser Elemente oder
Merkmale aufweisen.
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Abgesehen
von den zuvor erwähnten
Modifikationen, die entweder als End-Modifikationen oder als Modifikationsmuster
vorhanden sein können,
kann das Ribonukleinsäurerückgrat als
solches weiter modifiziert sein durch Ausbilden verschiedener Verbindungen
zwischen den Nukleotiden. Derartige Verbindungen sind, unter anderen,
in dem europäischen
Patent
EP 0 586 520
B1 und dem europäischen
Patent
EP 0 681 925
B1 beschrieben. Von besonderem Interesse hierin sind/ist
eine interne Modifikation(en) des Ribonukleinsäurerückgrats, von der/denen gezeigt
wurde, dass sie den Ribonukleotiden eine höhere Nukleinsäureresistenz
verleihen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Modifikation
des modifizierten Nukleotid eine Methoxylierung der 2'-OH-Gruppe des Riboseteils
des Nukleotids.
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Gemäß Anspruch
1 zeigen beide Stränge
und insbesonderer sowohl der erste Abschnitt als auch der zweite
Abschnitt diese Art von Modifikation der Nukleotide, die die Stränge bzw.
Abschnitte ausbilden. Wie hierin verwendet kann der Begriff Gruppe
aus modifizierten Nukleotiden oder flankierende Gruppe von Nukleotiden
so wenig wie ein Nukleotid, d. h. ein oder mehrere Nukleotide umfassend
darstellen.
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Ausgehend
von einem Abschnitt von aufeinanderfolgenden Nukleotiden kann ein
Modifikationsmuster der Nukleotide, die den Abschnitt ausbilden,
so realisiert sein, dass ein einzelnes Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden,
die kovalent miteinander vermittels Standardphosphordiesterbindungen
verbunden sind oder, wenigstens teilweise, durch Phosphothioatbindungen
verbunden sind, eine derartige Modifikation aufweisen. In dem Falle,
dass ein derartiges Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden, die hierin
als Gruppe aus modifizierten Nukleotiden bezeichnet werden, nicht
das 5'-Ende oder
3'-Ende des Abschnittes
ausbildet/ausbilden, folgt ein Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden
auf beiden Seiten des Nukleotids, das die Modifikation des vorhergehenden
Nukleotids oder Gruppe von Nukleotiden nicht aufweist. Es wird verstanden,
dass diese Art von Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden jedoch
eine andere Modifikation aufweisen kann. Diese Gruppe von Nukleotiden
wird hierin auch als die flankierende Gruppe von Nukleotiden oder
flankierende Gruppe aus Nukleotiden bezeichnet. Diese Sequenz von
modifiziertem Nukleotid bzw. Gruppe von modifizierten Nukleotiden
und unmodifizierten oder unterschiedlich modifiziertem Nukleotid
oder Gruppe von unmodifizierten oder anders modifizierten Nukleotiden
kann ein oder mehrfach wiederholt sein. Bevorzugterweise ist die
Sequenz mehr als einmal wiederholt. Aus Gründen der Klarheit wird das
Muster detailliert im folgenden diskutiert, wobei allgemein auf
eine Gruppe modifizierter Nukleotide oder eine Gruppe von unmodifizierten
Nukleotiden Bezug genommen wird, wobei eine jede der Gruppe tatsächlich so
wenig wie ein Nukleotid umfassen kann. Unmodifiziertes Nukleotid,
wie hierin verwendet, bedeutet entweder, dass es keine der zuvor
erwähnten
Modifikationen an dem Nukleotid vorhanden ist, das das entsprechende
Nukleotid oder Gruppe von Nukleotiden ausbildet, oder eine Modifikation
aufweist, die verschieden ist von der des modifizierten Nukleotids
bzw. Gruppe von Nukleotiden.
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Es
ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Modifikation
der/des unmodifizierten Nukleotids/Nukleotide, wo (ein) derartige(s)
nicht-modifizierte(s) Nukleotid(e) tatsächlich anders modifiziert ist/sind
als die Modifikation der/des modifizierten Nukleotids/Nukleotide,
gleich oder sogar verschieden für
die verschiedenen Nukleotide sein kann, die die unmodifizierten
Nukleotide oder die verschiedenen flankierenden Gruppen von Nukleotiden
ausbilden.
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Das
Muster aus modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden kann so
sein, dass das 5'-terminale Nukleotid
des Stranges oder des Abschnittes mit einer modifizierten Gruppe
von Nukleotiden oder mit einer unmodifizierten Gruppe von Nukleotiden
beginnt. In einer alternativen Ausführungsform ist es jedoch auch
möglich,
dass das 5'-terminal
Nukleotid durch eine unmodifizierte Gruppe aus Nukleotiden gebildet
ist.
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Diese
Art von Muster kann entweder auf dem ersten Abschnitt oder dem zweiten
Abschnitt der interferierenden RNA oder auf beiden realisiert sein.
Man muss festhalten, dass ein 5'- Phosphat auf dem
zum Zielmolekül
komplementären
Strang des siRNA-Duplexes für
die Funktion der siRNA-Funktion erforderlich ist, was vorschlägt, dass
Zellen die Authentizität
von siRNAs durch ein freies 5'-OH überprüfen (das
phosphoryliert sein kann) und nur solchen bonafide siRNAs erlaubt,
eine Zerstörung
der Ziel-RNA zu steuern (Nykanen, et al. (2001), Cell 107, 309-21).
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Es
ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass sowohl der erste
als auch der zweite Abschnitt diese Art von Muster aufweisen. Bevorzugterweise
ist ein Muster aus Modifikation und Nicht-Modifikation das gleiche
für sowohl
den ersten als auch den zweiten Abschnitt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Gruppe aus Nukleotiden, die den zweiten Abschnitt ausbilden
und der modifizierten Gruppe aus Nukaeotiden des ersten Abschnittes
entspricht, ebenfalls modifiziert, wohingegen die unmodifizierte
Gruppe aus Nukleotiden, die den zweiten Abschnitt ausbilden oder
jene des zweiten Abschnittes, der unmodifizierten Gruppe aus Nukleotiden,
die den ersten Abschnitt ausbilden oder jene des ersten Abschnittes
entspricht. Diese Möglichkeit
ist schematisch in 2A dargestellt. Eine weitere Alternative
besteht darin, dass es eine Phasenverschiebung des Modifikationsmusters
des ersten Abschnittes bzw. ersten Stranges relativ zu dem Modifikationsmuster
des zweiten Abschnittes bzw. zweiten Stranges gibt. Bevorzugterweise
ist die Verschiebung von der Gestalt, dass die modifizierte Gruppe
aus Nukleotiden des ersten Stranges zu der unmodifizierten Gruppe
aus Nukleotiden des zweiten Stranges korrespondiert und umgekehrt.
Diese Möglichkeit
ist in 2B gezeigt. Es ist auch im
Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Phasenverschiebung des
Modifikationsmusters nicht vollständig ist, sondern, wie in 2C dargestellt, überlappt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das zweite Nukleotid am Ende des Stranges bzw. Abschnittes ein
unmodifiziertes Nukleotid oder der Beginn einer Gruppe von nicht-modifizierten Nukleotiden.
Bevorzugterweise ist dieses unmodifizierte Nukleotid oder diese
unmodifizierte Gruppe aus Nukleotiden am 5'-Ende des ersten bzw. zweiten Stranges
angeordnet und sogar bevorzugtererweise des ersten Stranges. In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das unmodifizierte Nukleotid oder die unmodifizierte Gruppe
aus Nukleotiden am 5'-Ende
des ersten Stranges bzw. ersten Abschnittes angeordnet. In einer
bevorzugten Ausführungsform
besteht das Muster aus alternierenden einzelnen modifizierten und
unmodifizierten Nukleotiden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
dieses Aspektes der Erfindung umfasst die interferierende Ribonukleinsäure zwei
Stränge,
wobei ein 2'-O-Methyl-modifiziertes
Nukleotid und ein nicht-modifiziertes Nukleotid, bevorzugterweise
ein Nukleotid, das nicht 2'-O-Methyl-modifiziert
ist, auf beiden Strängen
in einer alternierenden Art und Weise eingebaut ist, was bedeutet,
dass jedes zweite Nukleotid ein 2'-O-Methyl-modifiziertes bzw. ein nicht-modifiziertes
Nukleotid ist. Dies bedeutet, dass auf dem ersten Strang ein 2'-O-Methyl-modifiziertes
Nukleotid von einem nicht-modifizierten Nukleotid gefolgt ist, das
wiederum von einem 2'-O-Methyl-modifizierten
Nukleotid gefolgt ist und so weiter. Die gleiche Sequenz aus 2'-O-Methyl-Modifikation
und Nicht-Modifikation existiert auf dem zweiten Strang, wobei bevorzugterweise
eine Phasenverschiebung in der Form besteht, dass das 2'-O-Methyl-modifiziert
Nukleotid auf dem ersten Strang basenpaart mit (einem) nicht-modifizierten Nukleotid(en)
auf dem zweiten Strang und umgekehrt. Diese spezielle Anordnung,
d. h. Basenpaaren von 2'-O-Methyl-modifizierten
und nicht-modifizierten Nukleotid(en) auf beiden Strängen ist
besonders bevorzugt im Falle kurzer interferierender Ribonukleinsäuren, d.
h. kurzer basengepaarter doppelsträngiger Ribonukleinsäuren, da
angenommen wird, dass, obwohl die vorliegenden Erfinder nicht durch
diese Theorie beschränkt
sein wollen, eine bestimmte Abstoßung zwischen zwei basenpaarenden
2'-O-Methyl-modifizierten
Nukleotiden besteht, was einen derartigen Duplex destabilisieren
würde,
insbesondere kurze Duplexes. Hinsichtlich der speziellen Anordnung
ist bevorzugt, wenn der Antisense-Strang mit einem 2'-O-Methyl-modifizierten
Nukleotid am 5'-Ende
beginnt, wobei entsprechend das zweite Nukleotid nicht-modifiziert
ist, die dritten, fünften,
siebten usw. Nukleotide somit wieder 2'-O-Methyl-modifiziert sind, wohingegen
die zweiten, vierten, sechsten, achten und dergleichen Nukleotide
nicht-modifizierte Nukleotide sind. Wiederum ohne durch eine Theorie
gebunden zu sein, scheint, dass der Position 2 und optional der
Position 4, 6, 8 und ähnlichen Positionen
am 5'-terminalen
Ende des Antisense-Stranges
eine besondere Bedeutung zugemessen werden kann, die keine Modifikation
umfassen soll, wohingegen das am weitesten 5'-terminal gelegene Nukleotid, d. h.
das erste 5'-terminale
Nukleotid des Antisense-Stranges eine derartige Modifikation aufweisen
kann, wobei eine jegliche ungradzahlige Position wie die erste,
optional dritte, fünfte
und ähnliche
Position(en) des Antisense-Stranges modifiziert sein können. In
weiteren Ausführungsformen
kann die Modifikation bzw. Nicht-Modifikation der/des modifizierten
und nicht-modifizierten Nukleotide/Nukleotids eine jegliche der
hierin beschriebenen sein.
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Obwohl
nicht darauf beschränkt,
wird die doppel-strängige
Struktur der erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure, die
auch als Duplex bezeichnet wird, durch den ersten Strang und zweiten
Strang ausgebildet, oder den ersten und zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden. Die Länge
des ersten Abschnittes bzw. zweiten Abschnittes beträgt typischerweise
etwa 15 bis etwa 23, bevorzugtererweise 17 bis 21 und am bevorzugtesten
18 oder 19 Basen. Im Zusammenhang damit soll festgehalten werden,
dass eine Länge
von weniger als 30 Nukleotiden, bevorzugterweise weniger als 21
Nukleotiden, nicht dazu führt,
dass ein biologisches System, das grundsätzlich in der Lage ist, eine
RNA-Interferenz und auch eine Interferon-Antwort zu zeigen, eine
Interferon-Antwort entwickelt. Der Grund dafür liegt in der Beobachtung,
dass eine gegebene Zelle tiefreichende physiologische Änderungen
erfährt,
wenn doppel-strängige
RNA, die länger
als 30 Basenpaare ist, Proteinkinase PKR und 2',5'-Oligoadenylatsynthetase
bindet und aktiviert. Aktivierte PKR unterbindet die Translation
durch Phosphorylierung von eIF2a, aktivierte 2',5'-AS
bedingt mRNA-Abbau. Diese Wirkungen sind bei der Target-Validierung
und in Tiermodellen nicht erwünscht,
da sie über
die Wirkung des Target-spezifischen Knock-Downs auf den Phänotyp die
Oberhand gewinnen.
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Entsprechend
einer sechsten Strategie bei der Ausgestaltung von interferierenden
Ribonukleinsäuren gemäß Anspruch
1 umfasst die Ribonukleinsäure
eine doppel-strängige
Struktur, wobei die doppel-strängige Struktur
einen ersten Strang und einen zweiten Strang umfasst, wobei der
erste Strang einen ersten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden Nukleotiden
umfasst und wobei der erste Abschnitt wenigstens teilweise komplementär zu einer
Ziel-Nukleinsäure ist,
und der zweite Strang einen zweiten Abschnitt aus aufeinanderfolgenden
Nukleotiden umfasst, wobei der zweite Abschnitt wenigstens teilweise
identisch zu einer Ziel-Nukleinsäure ist,
wobei ein Terminus des ersten Stranges und ein Terminus des zweiten
Stranges durch eine Schleifen-Struktur verbunden sind.
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In
einer Ausführungsform
besteht die Schleifen-Struktur aus einem Nicht-Nukleinsäure-Polymer. Ein derartiges
Nicht-Nukleinsäure-Polymer
kann Polyethylenglycol oder ähnliche
Polymere sein. Die Nicht-Nukleinsäure-Polymere können im
Prinzip aus der Gruppe ausgewählt
sein, die Polymere umfasst, die kein Polynukleotid umfassen, und
erlauben, dass die zwei Stränge,
die verbunden werden sollen, tatsächlich miteinander hybridisieren.
Um eine derartige Hybridisierung zu erlauben, muss das Molekül oder der
Teil des Moleküls, das/der
die zwei Abschnitte, die miteinander hybridisieren, verbindet, eine
bestimmte Molekülstruktur
oder Molekülflexibilität aufweisen,
um das Biegen des Moleküls
zu erlauben, um wiederum zu erlauben, dass beide Stränge miteinander
in engen Kontakt und in eine 3-dimensionale Orientierung gelangen,
die eine Hybridisierung erlaubt. Ein derartiges Molekül oder Teil
fungiert faktisch als ein Gelenk. Im Prinzip kann ein jegliches
Molekül,
das diesem Erfordernis gerecht wird, in Verbindung mit der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Neben Polyethylenglycol können Aminosäure-basierte
Moleküle
verwendet werden. Derartige Aminosäure-basierte Moleküle können entweder
Homopolymere oder Heteropolymere sein. Ein nützliches Beispiel ist ein Homopolymer,
das aus sieben Glycin-Resten
besteht, das die Erzeugung eines Gelenkes erlaubt, wie es erforderlich
ist, um die beiden Abschnitte für
das Hybridisieren in die erforderliche räumliche Nähe zu bringen. Dieses Glycin-basierte
Gelenk ist, beispielsweise in Gaun K. L. und Dixon J. E. (1991),
Anal Biochem. 192, 262 beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform
kann das Gelenk durch Kronenether ausgebildet sein, die in der Technik
bekannt sind.
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In
einer alternativen Ausführungsform
besteht die Schleife aus einer Nukleinsäure. Wie hierin verwendet werden
LNA, wie in Elayadi und Corey (2001) Curr Opin Investig Drugs. 2(4):558-61
beschrieben, und PNA als Nukleinsäuren betrachtet und können auch
als Schleifen-bildende Polymere verwendet werden. Im Grunde kann
das 5'-Ende des
ersten Stranges mit dem 3'-Terminus
des zweiten Stranges verbunden sein. In einer Alternative kann das
3'-Ende des ersten
Stranges mit dem 5'-Terminus
des zweiten Stranges verbunden sein. Die Nukleotidsequenz, die die
Schleifenstruktur ausbildet, wird im Allgemeinen als nicht kritisch
betrachtet. Die Länge
der Nukleotidsequenz, die eine derartige Schleife ausbildet, scheint
jedoch aus sterischen Gründen
kritisch zu sein. Entsprechend scheint eine Minimallänge aus
vier Nukleotiden angemessen zu sein, um eine Schleifen-Struktur
auszubilden. Im Prinzip ist die maximale Anzahl von Nukleotiden,
die das Gelenk oder die Bindung zwischen beiden Strängen, die
hybridisiert werden sollen, nicht beschränkt. Je länger ein Polynukleotid jedoch
ist, desto wahrscheinlicher werden Sekundär- und Tertiär-Strukturen
ausgebildet und somit die erforderliche Orientierung der Abschnitte
beeinflusst. Bevorzugterweise ist eine maximale Anzahl von Nukleotiden,
die das Gelenk ausbilden, etwa 12 Nukleotide. Es ist im Rahmen der
Offenbarung dieser Anmeldung, dass eine jegliche der oben beschriebenen
Ausgestaltungen mit der vorliegenden sechsten Strategie kombiniert
werden kann, d. h. durch kovalentes Verbinden der zwei Strängen in
einer Art und Weise, dass eine Rückfaltung
(Schleife) durch eine Schleifen-Struktur oder ähnliche Struktur erfolgen kann.
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Die
vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise
festgestellt, dass, wenn die Schleife 3' zum Antisense-Strang angeordnet ist,
d. h. dem ersten Strang der Ribonukleinsäure(n) gemäß der vorliegenden Erfindung,
die Aktivitäten
dieser Art von RNAi größer sind
verglichen mit der Anordnung der Schleife 5' zu dem Antisense-Strang. Entsprechend
ist die spezielle Anordnung der Schleife relativ zu dem Antisense-Strang
und Sense-Strang, d. h. zum ersten Strang bzw. dem zweiten Strang,
entscheidend und ist somit im Gegensatz zu dem Verständnis, wie
es im Stand der Technik zum Ausdruck gebracht wird, wo ausgeführt wird,
dass die Orientierung keine Bedeutung hätte. Dies scheint jedoch mit
Blick auf die hierin präsentierten
experimentellen Ergebnisse nicht zutreffend zu sein. Das Verständnis, wie
im Stand der Technik zum Ausdruck gebracht, basiert auf der Annahme,
dass eine jegliche RNAi Gegenstand eines Prozessierens ist, währenddessen
eine nicht durch Schleifen verbundene RNAi erzeugt wird. Wenn dies
der Fall wäre,
könnte
die eindeutig beobachtete erhöhte
Aktivität
jener Strukturen nicht erklärt
werden, bei denen die Schleife 3' zum
Antisense angeordnet ist. Insoweit ist eine bevorzugte Anordnung
in 5'→3'-Richtung für diese
Art kleiner interferierender RNAi: zweiter Strang – Schleife – erster
Strang. Die entsprechenden Konstrukte können in geeignete Vektor-Systeme
eingebaut werden. Bevorzugterweise umfasst der Vektor einen Promotor
für die
Expression von RNAi. Bevorzugterweise ist der entsprechende Promotor
pol III und bevorzugtererweise sind die Promotoren U6, H1, 7SK-Promotor, wie in
Good et al. (1997) Gene Ther, 4, 45-54 beschrieben.
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Infolge
der allgemeinen Anwendbarkeit des Konzeptes der interferierenden
RNA und somit des Knock-Downs oder Knock-Outs für eine kodierende Nukleinsäure wie
beispielsweise eine mRNA, kann ein jedes Gen, das eine derartige
RNA produziert, hinsichtlich seiner Expression modifiziert werden,
indem eine der Ribonukleinsäuren
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird. Infolge des grundlegenden und allgemein
anwendbaren Mechanismus kann eine jegliche Anwendung auf der Basis
desselben realisiert werden, was den Knock-Down oder Knock-Out eines
Gens impliziert. Eine bevorzugte Anwendung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure für die Target-Validierung.
Wie hierin verwendet soll Target-Validierung einen Prozess bezeichnen,
der das Durchführen
von Schritten umfasst, um zu belegen, dass eine DNA, eine RNA oder
ein Proteinmolekül
direkt in einem biologischen Prozess involviert ist, bevorzugterweise
in einem Prozess, der – kausal – bei einer
Erkrankung oder einem Nicht-Standard-Zustand involviert ist, und
deshalb ein geeignetes Ziel für
die Entwicklung einer neuen therapeutischen Verbindung ist.
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Sequenzhomologiestudien
haben erfolgreich Gene in Ziel-Familien eingeteilt. Die enorme Aufgabe,
zu entschlüsseln,
welche dieser Ziele Schlüsselelemente
bei Erkrankungen sind und die für
eine nachfolgende Arzneimittelentwicklung verwendet werden sollten,
muss in effizienter Art und Weise angegangen werden. Deshalb sollte
der Knock-Down einer Genexpression um 50-100% verringert sein, bevorzugterweise
um 90%, um signifikante Wirkungen auf den Phänotyp zu sehen. In anderen
Fällen,
abhängig
von den Genen, kann ein Knock-Down von so wenig wie 20% ausreichend
sein, um einen Phänotyp
zu bedingen. Ein Phänotyp
wird durch Vergleich von Zellen definiert werden, die funktionelle
RNAi-Moleküle
enthalten, mit Zellen, die keine funktionelle RNAi-Moleküle enthalten.
Dies wird ein signifikantes Ableseergebnis gewährleisten, selbst unter Bedingungen,
wo die Proteinfunktion nur teilweise inhibiert ist. Im allgemeinen
besteht keine lineare Korrelation zwischen dem Umfang der mRNA-Reduktion
und dem Umfang der Änderung
im Phänotyp.
Man muss anerkennen, dass für
einige Proteine eine Verringerung von etwa 20% des Proteins ausreichend
ist, um eine Änderung
im Phänotyp
zu erzeugen, wohingegen im Falle von anderen Genen bzw. mRNA so
wenig wie 5-10% verbleibendes Protein ausreichend ist, um den beobachteten
Phänotyp
aufrechtzuerhalten.
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Eine
weitere Verwendung der Ribonukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung
besteht in deren Verwendung für
die Herstellung eines Medikaments oder die Verwendung als ein Medikament.
Ein derartiges Medikament könnte
entweder für
die Behandlung und/oder Prävention
von Erkrankungen oder Zuständen
verwendet werden, wie eine jegliche Art von Krebs, wo ein Gen und
sein Produkt mit dem Beginn, der Ursache oder dem Fortschreiten
dieser Erkrankung verknüpft
worden ist. Zusätzlich
könnte
ein derartiges Medikament verwendet werden, um Erkrankungen zu behandeln,
wo die Anwesenheit oder Überexpression
eines Genproduktes einen pathologischen Phänotyp erzeugt. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist die Erkrankung gekennzeichnet durch einen Zugewinn an Funktion
und kann durch Anwendung oder Verabreichung der entsprechenden,
biologisch aktiven RNAi geheilt werden. Erkrankungen oder Zustände, die
durch das Medikament behandelt werden können, das eine Ribonukleinsäure umfasst,
wie hierin offenbart, können
ausgewählt
sein aus der Gruppe umfassend Krebs, Herzerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen,
dermatologische Erkrankungen, entzündliche Erkrankungen, Immunsystemstörungen und
Autoimmunstörungen.
Die verschiedenen Formen von Krebs umfassen, sind aber nicht beschräkt auf solide
Tumoren und Tumoren des blutbildenden Systems, wie beispielsweise
Glioblastom, Prostatakrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs,
Pankreaskrebs und Leukämie.
Stoffwechselerkrankungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Fettleibigkeit und Diabetes. Dermatologische Erkrankungen umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Psoriasis.
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In
einem weiteren Aspekt können
die Ribonukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden
Erfindung als Diagnostika verwendet werden, bevorzugterweise für jene Erkrankungen,
wie sie im Zusammenhang mit den oben erwähnten Erkrankungen und Zuständen angegeben
sind. Eine derartige Diagnose könnte
auf der Beobachtung basieren, dass nach Anwenden der Ribonukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden
Erfindung im Zusammenhang mit einer Probe, die bevorzugterweise
Zellen enthält,
eine Änderung
des Expressionsmusters der Probe erfolgt. Bevorzugterweise umfasst
eine derartige Probe Zellen von einem Lebewesen, von dem angenommen
wird, dass es die Erkrankung oder den Zustand, die/der behandelt
werden soll, oder eine Prädisposition
dafür aufweist.
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Eine
weitere Anwendung der Nukleinsäuren
gemäß der vorliegenden
Erfindung besteht in ihrer Verwendung beim Screenen von pharmazeutisch
aktiven Verbindungen und/oder der Lead-Optimierung. Letzteres wird
so durchgeführt,
dass die Wirkung von Kandidatenarzneimitteln wie beispielsweise
kleinen Molekülen überwacht
oder bestimmt wird und die Wirkung, die durch die Kandidatenarzneimittel
bedingt werden, mit der Wirkung verglichen werden, die nach Verabreichung
von spezifischer RNAi beobachtet wird, die auf der Grundlage der
hierin offenbarten Prinzipien ausgestaltet ist. Indem so verfahren
wird, können
Kandidatenarzneimittel, die Off-Target-Wirkungen zeigen, aus dem
Screening-Prozess
eliminiert werden, wohingegen jene Kandidatenarzneimittel, die einen ähnlichen
oder identischen Phänotyp
erzeugen, als hochrelevante Lead-Verbindungen erachtet werden und
können
sogar selbst eine pharmazeutisch aktive Verbindung sein. Bei diesem
Ansatz fungieren die hochspezifischen RNAi-Moleküle als Goldstandard, gegen
die die Kandidatenarzneimittel gemessen werden.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle, bevorzugterweise
eine Knock-Down-Zelle, die
eine Ribonukleinsäure
enthält,
wie hierin offenbart. Eine derartige Zelle ist bevorzugterweise
eine Zelle, die entweder aus einem Gewebe oder sogar Organ, das
wiederum bevorzugterweise nicht in einem Organismus enthalten ist,
isoliert oder darin enthalten ist. Die Zelle kann jedoch auch in
einem Organismus enthalten sein. Die Zelle ist bevorzugterweise
eine Zelle, die an der Erkrankung oder dem Zustand, der durch die erfindungsgemäßen Ribonukleinsäuren behandelt
werden soll, involviert ist. Diese Art von Knock-Down-Zellen können verwendet
werden, um ein Expressionsprofil basierend, z. B., auf mRNA oder
Protein zu erzeugen, um die funktionelle Beziehung aufzuklären und
stromabwärtige
Ziele zu bestimmen. In dem Fall, wo die Zelle eine menschliche Zelle
ist, ist eine derartige menschliche Zelle eine isolierte menschliche
Zelle.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Organismus, der
eine Ribonukleinsäure
enthält, wie
hierin offenbart. Bevorzugterweise ist ein derartiger Organismus
ein Vertebraten-Organismus
und bevorzugterweise ist der Vertebraten-Organismus ein Säugetier.
Ein Säugetier,
wie hierin verwendet, ist, unter anderem, aber nicht beschräkt auf,
einen (Menschen)Affen, einen Hund, eine Katze, eine Ziege, ein Schaf,
ein Schwein, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, eine Maus und eine
Ratte. Der Organismus ist verschieden von einem Menschen.
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In
einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine
Zusammensetzung, die Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
enthält.
Bevorzugterweise umfasst eine derartige Zusammensetzung Negativ-
und Positivkontrollen, entweder in Kombination mit der wirksamen
Ribonukleinsäure
oder getrennt davon. Eine derartige Zusammensetzung kann weiter
ein Lösungsmittel,
bevorzugterweise einen Puffer umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die eine Ribonukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung
enthält
und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Pharmazeutisch akzeptable
Träger
sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und umfassen, unter anderem,
Verdünnungsmittel,
Puffer und dergleichen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann
weitere pharmazeutisch aktive Verbindungen umfassen. In dem Fall,
wo die Erkrankung oder der Zustand, der unter Verwendung der Ribonukleinsäuren gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt werden soll, bevorzugterweise jene sind, die
bereits jetzt im Zusammenhang mit der Behandlung der Erkrankungen
oder Verwendungen der Erkrankungen oder Zustände verwendet werden. Infolge
der verschiedenen Wirkweisen der Ribonukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung
und der Medikamente, die für
die Behandlung der Erkrankungen und Zustände gemäß dem Stand der Technik verwendet
werden, werden synergistische Wirkungen auftreten.
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Die
Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Figuren und Beispiele
veranschaulicht werden, aus denen weitere Merkmale, Ausführungsformen
und Vorteile der vorliegenden Erfindung entnommen werden können.
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1 zeigt
eine schematische Darstellung, die die hierin verwendete Terminologie
definiert. Der obere der zwei Stränge ist der erste Strang und
der Antisense-Strang der targetierten Nukleinsäure, wie beispielsweise mRNA.
Der zweite Strang ist derjenige, der im Wesentlichen hinsichtlich
seiner Sequenz der targetierten Nukleinsäure entspricht und somit den
Sense-Strang ausbildet. Beide, d. h. der erste und der zweite Strang bilden
eine doppelsträngige
Struktur, typischerweise durch Watson-Crick-Basenpaarung.
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2 veranschaulicht
einige Ausführungsformen
der Ribonukleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung mit Mustern aus modifizierten und unmodifizierten Gruppen
aus Nukleotiden, das hierin auch als Modifikationsmuster bezeichnet
wird. Die modifizierten Gruppen aus Nukleotiden werden hierin auch
als Gruppe aus modifizierten Nukleotiden bezeichnet. Die unmodifizierten
Nukleotide oder unmodifizierten Gruppen aus Nukleotiden, die hierin
als flankierende Gruppe(n) aus Nukleotiden bezeichnet werden, können, wie
hierin verwendet, auch eine oder mehrere der Modifikation(en), wie
hierin offenbart, aufweisen, die jedoch verschieden von der Modifikation
der Nukleotiden ist/sind, die die Gruppe(n) aus modifizierten Nukleotiden
ausbilden. In 2A sind die modifizierten und
unmodifizierten Gruppen aus Nukleotiden, d. h. Gruppen aus modifizierten Nukleotiden
und den flankierenden Gruppen aus Nukleotiden auf sowohl dem ersten
Abschnitt als auch auf dem zweiten Abschnitt auf entsprechenden
Teilen der Abschnitte angeordnet und somit miteinander ausgerichtet
(Gruppen aus modifizierten Nukleotiden auf dem ersten Strang ausgerichtet
mit Gruppen aus modifizierten Nukleotiden auf dem zweiten Strang
und flankierende Gruppen aus Nukleotiden auf dem ersten Strang ausgerichtet
mit flankierenden Gruppen aus Nukleotiden auf dem zweiten Strang),
wohingegen 2B das auf dem ersten Strang
realisierte Muster ebenfalls auf dem zweiten Strang realisiert ist,
jedoch mit einer Basenverschiebung, so dass die modifizierte Gruppe
aus Nukleotiden auf dem ersten Abschnitt basenpaart mit einer unmodifizierten
Gruppe aus Nukleotiden des zweiten Abschnittes und umgekehrt, so
dass eine Gruppe modifizierter Nukleotide auf dem ersten Strang
mit einer flankierenden Gruppe aus Nukleotiden auf dem zweiten Strang
ausgerichtet ist. In 2C ist eine weitere Möglichkeit
der Anordnung der modifizierten und unmodifizierten Gruppen aus
Nukleotiden realisiert. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung,
dass das Muster des ersten Abschnittes unabhängig von dem Muster des zweiten
Abschnittes ist und dass beide Muster teilweise hinsichtlich der
relativen Position zueinander in der doppel-strängigen Struktur, die durch
Basenpaarung definiert ist, überlappen.
In einer weiteren Ausführungsform
kann das Ausmaß dieser Überlappung über die
Länge des/der
Abschnittes/Abschnitte bzw. Strang/Stränge variieren.
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3 zeigt
das Ergebnis eines Knock-Down-Experimentes unter Verwendung von
RNAi-Molekülen mit
verschiedenen Endschutzgruppen. Genauer zeigt 3A, dass die verschiedenen Formen von endgeschützten RNAi-Molekülen hinsichtlich
des Knock-Downs von PTEN-mRNA funktionell sind.
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3B zeigt die Sequenz verschiedener RNAi-Moleküle, die
in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis in 3A dargestellt ist. 3C zeigt
das Ergebnis einer Immunoblot-Analyse von PTEN-Protein nach Behandlung
mit modifizierten RNAi-Molekülen verglichen
mit PTEN-spezifischen Antisense-Konstrukten.
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4 zeigt,
dass der 3'-Überhang
von RNAi-Molekülen
für RNA-Interferenz
nicht wichtig ist. Genauer zeigt 4A eine
Dosis-Antwort-Kurve verschiedener RNAi-Moleküle und 4B zeigt
die Sequenz von RNAi-Molekülen,
die in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis in 4A gezeigt ist.
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5 zeigt,
dass die Duplexlänge
der RNAi-Moleküle
wenigstens 18-19 Nukleotide lang sein muss. Genauer zeigt 5B die Sequenz der PTEN-spezifischen RNAi-Moleküle, die
in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis in 5A als Dosis-Antwort-Kurve dargestellt ist.
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6 zeigt,
dass vier terminale fehlgepaarte Nukleotide in RNAi-Molekülen mit
einer Länge
von 19 Nukleotiden hinsichtlich der Vermittlung eines Knock-Downs
von Akt1 noch funktionell sind. Genauer zeigt 6B die
Sequenz der in dem Experiment verwendeten RNAi-Moleküle, dessen
Ergebnis in 6A gezeigt ist.
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7 zeigt
weitere Ergebnisse hinsichtlich der Duplexlängenerfordernisse und Toleranz
gegenüber Mutationen
in siRNAs. Genauer zeigt 7A die verschiedenen
Konstrukte, die verwendet wurden (linke Tafel) und die entsprechende
Wirkung auf die Inhibition von Akt1- mRNA-Expression in HeLa-Zellen relativ
zur Expression von p110α,
die in den angegebenen siRNA-Molekülmengen verwendet wurden (rechte
Tafel). Die Nukleotidänderungen
in den Fehlpaarungs-siRNA-Molekülen
sind durch Pfeile angegeben. Das 3'-Desoxynukleotid, wenn es ein solches
gibt, ist in Großbuchstaben
angegeben. 7B zeigt die verschiedenen PTEN-spezifischen siRNAs
(linke Tafel), die Inhibition von PTEN-mRNA-Expression in HeLa-Zellen, ausgedrückt als
das Verhältnis
PTEN/p110α,
bei verschiedenen Mengen von siRNA (mittlere Tafel), und 7C eine Western Blot-Analyse, die die
Inhibition der PTEN-Proteinexpression
darstellt unter Verwendung von PTEN-spezifischer siRNA (30nM) und
entsprechender fehlpaarender siRNA nach 48 bzw. 96 Stunden, wobei p100α als Ladekontrolle
verwendet ist.
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8 zeigt
die Ergebnisse von Studien hinsichtlich der Stabilität in Serum,
die RNAi-Moleküle durch 2'-O-Methylierung verliehen
wird, und dass End-Modifikationen keine vorteilhafte Wirkungen auf
die RNAi-Stabilität
aufweisen. Genauer zeigt 8A das Ergebnis
einer Gel-Elektrophorese der verschiedenen, in 8B gezeigten
RNAi-Moleküle,
die eine Inkubation mit fötalem
Kälberserum
ausgesetzt waren.
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9 zeigt,
dass eine Amino-Endmodifikation zum Verlust an Aktivität führt. 9B zeigt die speziellen RNAi-Moleküle, die
in Experimenten verwendet wurden, deren Ergebnis in 9A gezeigt
ist, ausgedrückt als
PTEN/p 110α-Expressionsniveauverhältnis. 9C zeigt die Ausgestaltungsprinzipien,
die aus den in 9A dargestellten Ergebnissen
abgeleitet werden können.
Wie in 9C verwendet, bedeutet der
Begriff funktionell funktionell aktiv in dem speziellen Testsystem,
wie in dem Beispiel beschrieben und „nicht funktionell" bedeutet nicht funktionell
in dem besagten System.
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10 zeigt, dass 2'-O-Alkyl(Methyl)-Modifikationen RNAi-Moleküle stabilisieren,
aber auch zur Verringerung ihrer Aktivität führen. Genauer zeigt 10C die Sequenz der RNAi-Molekülen, die
in dem Experiment verwendet wurden, dessen Ergebnis als eine Dosis-Antwort-Kurve in 10A dargestellt ist. 10B zeigt
das Ergebnis einer Gel-Elektrophorese
der verschiedenen in 10C dargestellten
RNAi-Moleküle,
die einer zweistündigen
Inkubation in fötalem
Kälberserum
ausgesetzt waren.
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11 zeigt das Ergebnis eines Experiments hinsichtlich
der Wirksamkeit von RNAi-Molekülen mit Blöcken aus
2'-O-Methylmodifikationen,
wobei 11A graphisch die Ergebnisse
der Experimente als eine Dosis-Antwort-Kurve darstellt und 11C die Sequenzen der speziellen RNAi-Moleküle zeigt,
die in den Experimenten verwendet wurden, und 11B das Ergebnis einer Gel-Elektrophorese der
verschiedenen in 11C dargestellten RNAi-Moleküle zeigt,
die einer zweistündigen
Inkubation in fötalem
Kälberserum
unterzogen worden waren.
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12 zeigt, dass eine alternierende 2'-O-Methylmodifikation
zu einer Aktivität
der modifizierten RNAi-Moleküle
verglichen mit unmodifizierten Formen führt. Genauer zeigt 12B die Sequenz der in diesem Experiment
verwendeten RNAi-Moleküle,
deren Ergebnis in 12A gezeigt ist. 12C zeigt die Stabilität der RNAi-Moleküle nach
Inkubation in Serum für
zwei Stunden, wohingegen 12D einen
Immunoblot für
PTEN-Protein nach
Anwenden verschiedener RNAi-Moleküle auf HeLa-Zellen zeigt. Wie
daraus ersichtlich sind RNAi-Moleküle mit alternierenden Modifikationen
gegen Endonukleaseabbau stabilisiert und aktiv beim Vermitteln eines
PTEN-Protein-Knock-Downs.
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13 zeigt das Ergebnis einer Western Blot-Analyse,
um den Zeitverlauf eines PTEN-Protein-Knock-Downs
zu bestimmen. Die Zellen wurden kontinuierlich mit 2'-O-Methylmodifizierten
gegenüber
unmodifizierten RNAi-Molekülen
unter Verwendung von kationischen Lipiden für 72 Stunden transfiziert.
Proteinlysate wurden hergestellt und durch Immunoblot nach 48 und
120 Stunden analysiert. Für
die 96 Stunden- und 120 Stunden-Zeitpunkte
wurden die Zellen aufgeteilt, erneut ausplattiert und in Abwesenheit
von RNAi-Molekülen für weitere
20 und 48 Stunden inkubiert.
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14 zeigt einen Western Blot, der den Protein-Knock-Down
von PTEN darstellt, der persistent ist bei Verwendung von alternierend
modifizierten RNAi-Molekülen
verglichen mit unmodifizierten RNAi-Molekülen. Die Transfektion wurde
für nur
5 Stunden durchgeführt
und neues Medium ohne Transfektionsreagens wurde hinzugegeben. Die
Lysate wurden analysiert durch Immunoblot 72 und 96 Stunden nach
Transfektion mit den angegebenen RNAi-Molekülen.
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15 zeigt, dass siRNA-Moleküle mit distinkten 2'-O-Ribonukleotidmodifikationen
eine erhöhte
Stabilität
in Serum aufweisen und Protein-Knock-Down in HeLa-Zellen vermitteln.
Insbesondere zeigt 15A die verschiedenen
siRNA-Molekülkonstrukte,
die verwendet wurden (linke Tafel), wobei 2'-O-Methylribonukleotidmodifikationen
unterstrichen und durch Fettdruck in der Sequenz angegeben sind.
Die Inhibierung von PTEN-mRNA-Expression
in HeLa-Zellen, die mit den angegebenen Mengen modifizierter siRNA-Moleküle infiziert
waren, ist als Verhältnis
PTEN/p110α ausgedrückt und
auf der rechten Tafel angegeben. 15B zeigt auf
der linken Tafel die verschiedenen siRNA-Konstrukte, die verwendet
wurden, und auf der rechten Tafel eine PAA-Gel-Elektrophorese modifizierter
und unmodifizierter siRNA-Moleküle
nach Inkubation in Serum. Die verschiedenen Konstrukte mit 2'-O-Methylribonukleotiden
sind durch Unterstreichung und Fettdruck angegeben. 15C zeigt
einen SDS-PAGE-basierten Immunoblot, der die Inhibierung von PTEN-Proteinexpression
unter Verwendung verschiedener der siRNA-Konstrukte (30 nM), wie
in 15A bzw. 15B gezeigt,
veranschaulicht. Wiederum wird p110α als Ladekontrolle verwendet.
Schließlich
ist 15D ein Immunoblot, der einen
verlängerten
Protein-Knock-Down
zeigt, d. h. die Inhibierung von PTEN-Proteinexpression, nach Verabreichung
von siRNA-Molekülen
(30 nM) mit distinken 2'-O-Methylribonukleotidmodifikationen
nach 48 und 128 Stunden. Wie in 15C wird
p110α als
Ladekorolle verwendet.
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16 zeigt, dass siRNA-Moleküle mit distinkten 2'-O-Methylribonukleotidmodifikationen,
die für Akt1-
und p110β-mRNA
spezifisch sind, eine erhöhte
Stabilität
in Serum aufweisen und Protein-Knock-Down in HeLa-Zellen vermitteln.
Genauer zeigt 16C auf der linken Tafel
die verschiedenen Konstrukte, die verwendet wurden, wobei wiederum
2'-O-Methylribonukleotide
unterstrichen und in Fettdruck dargestellt sind. Die Integrität der angegebenen
siRNA-Moleküle
nach Inkubation in Serum ist in der rechten Tafel gezeigt. 16B zeigt einen Immunoblot von Akt1-,
Akt2- und Akt-Phosphorylierung und p110 ist als Ladekontrolle nach
Transfektion der Zellen mit den angegebenen siRNAs (30 nM) verwendet. 16C zeigt verschiedene p110β-spezifische
siRNA-Konstrukte (linke Tafel), wobei die 2'-O-Methylmodifikationen unterstrichen
und in Fettdruck gehalten sind, und das Ergebnis einer Immunoblot-Analyse
der Inhibierung der Phosphorylierung der stromabwärtigen Kinase
Akt1 durch die siRNA-Konstrukte (rechte Tafel). P110α ist als
Ladekontrolle verwendet worden.
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17 zeigt die Wirksamkeit verschiedener RNAi-Moleküle mit Hairpin-Strukturen
als Dosis-Antwort-Kurven, während 17B die Struktur der RNAi-Moleküle zeigt,
deren Ergebnis in 17A dargestellt ist.
Synthetische siRNAs mit unterschiedlichen Schleifen sind hinsichtlich
der Verringerung der Expression von p110β, Akt1 und Akt2 funktionell.
(14A) Inhibierung von p110b-mRNA-Expression in siRNA-transfizierten
HeLa-Zellen.
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Proben
wurden parallel auf das Niveau der p110β-mRNA-Expression 24 Stunden
nach Transfektion der angegebenen siRNAs analysiert. Die transfizierten
bimolekularen siRNAs (21mer mit 3'TT-Überhängen, Molekül 1AB) oder
die monomolekularen siRNAs mit Schleifen-Strukturen sind schematisch
gezeigt. Es ist beachtlich, dass die Position der Schleifen (HIV-abgeleitete
pA-Schleife; (A)12-Schleife) relativ zu
der Antisense-Sequenz in 3A, 4A relativ zu 3B, 4B umgekehrt ist.
Das 2AB siRNA-Molekül
enthält
6 Fehlpaarungen in dem 21mer-Duplex und dient als Negativkontrolle
zusammen mit der unbehandelten Probe. RNA wurde hergestellt und
einer Echtzeit-RT-PCR (Taqman)-Analyse unterzogen. p110β-mRNA-Niveaus sind
relativ zu den mRNA-Niveaus von p110α gezeigt, das als interne Referenz
dienen. Ein jeder Balken stellt Dreifachtransfektionen dar (± Standardabweichung).
HeLa-Zellen wurden bei einer Konfluenz von 50% (2500 Zellen pro
96 Napf) mit siRNAs bei den angegebenen Konzentrationen in Wachstumsmedium
transfiziert.
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18 zeigt die Wirksamkeit verschiedener RNAi-Moleküle mit intermolekularen
und intramolekularen Schleifenstrukturen als Dosis-Antwort-Kurven.
(18A) Inhibition von Akt1-mRNA-Expression
in siRNA-transfizierten HeLa-Zellen. Proben wurden parallel auf
das Niveau von Akt1- und Akt2-mRNA-Expression 24 Stunden nach Transfektion
der angegebenen siRNAs analysiert. Die verschiedenen Schleifen (A-Schleifen; GAGA-Schleife
und ein Polyethylenglycol (PEG)-Linker) und ihre mutmaßliche Sekundärstruktur
sind schematisch gezeigt. Das siRNA-Molekül 9A ist spezifisch für Akt2 und
dient als Negativkontrolle. Beachte, dass 10A und 10B keine selbst-komplementären Sequenzen
enthalten und in Kombination transfiziert sind. Akt1-mRNA-Niveaus
sind relativ zu den mRNA-Niveaus von p110β angegeben, die als interne
Kontrolle dienten. (18B) Inhibierung von Akt2-mRNA-Expression in
HeLa-Zellen, die mit den angegebenen siRNA-Molekülen transfiziert sind. Akt2-mRNA-Niveaus
sind relativ zu den mRNA-Niveaus von p110β gezeigt. Das Akt1-spezifische
Molekül
7A dient hier als Negativkontrolle.
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18C zeigt eine Western Blot-Analyse betreffend
Akt-Protein, die die Funktionalität von synthetischen siRNAs
mit verschiedenen Schleifen hinsichtlich des spezifischen Verringern
der Akt1- und Akt2-Expression darstellt. Die Inhibierung von Akt1-
und Akt2-Proteinexpression
wurde durch Immunoblot analysiert. Die Zellen wurden 48 Stunden
nach Transfektion der angegebenen Hairpin-siRNAs (20 nM) geerntet.
Zellextrakte wurden durch SDS-PAGE getrennt und durch Immunblotten
unter Verwendung von anti-p110-Antikörper anti-Akt 1/2 analysiert. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit einem Antikörper erhalten, der für die phosphorylierte Form
von Akt1 spezifisch ist. Die Positionen von p110α, einer weiteren katalytischen
Untereinheit der PI 3-Kinase, die als Ladekontrolle verwendet wurde,
und von Akt1, Akt2 und phosphoryliertem Akt (P*-Akt) sind auf der
linken Seite angegeben.
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19 zeigt eine NH2-Modifikation,
die hierin auch als Amino-Modifikation bezeichnet wird, die entweder
am 3'-OH-terminalen
Nukleotid oder dem 5'-terminalen
Nukleotid vorhanden sein kann. Die Aminogruppe ist an das Phosphat
gebunden, das wiederum an die OH-Gruppe des Zuckerteils gebunden
ist, durch eine Alkylgruppe, die eine Alkylkette aus 1 bis 8, bevorzugterweise
6 C-Atomen umfasst, wobei das zweite C-Atom nahe an der Phosphatgruppe
eine CH2OH-Gruppe daran gebunden aufweist.
Als eine Alternative kann der Linker durch einen Ether ausgebildet
sein, wobei der Ether aus zwei Alkoholen besteht, wobei ein Alkohol
ein Aminoalkohol und der andere ein Dialkohol ist, wobei eine Alkoholgruppe
an der Ausbildung der Ethergruppe beteiligt ist und die andere eine
OH-Gruppe ist, die an einem jeden der C-Atome angeordnet ist, bevorzugterweise
an dem zweiten C-Atom relativ zur Phosphatgruppe.
-
Beispiel 1: Dosis-Antwort
synthetischer Duplex-RNAi-Moleküle
-
Bei
diesem Beispiel wurde der Einfluss von NH2-Endschutzgruppen
auf die Aktivität
von Duplex-RNAi-Molekülen
untersucht. Synthetische siRNAs wurden von Biospring (Frankfurt,
Deutschland) gekauft. Die Ribo-Oligonukleotide wurden in RNase-freiem
TE auf eine Endkonzentration von 50 μM resuspendiert. Im Falle von
bimolekularen siRNA-Molekülen
wurden gleiche Aliquots (100 μM)
kombiniert zu einer Endkonzentration von 50 μM. Für die Ausbildung von intramolekularen
Duplexen wurden die siRNAs bei 50°C
für 2 Minuten
in Annelierungsbuffer (25 mM NaCl; 5 mM MgCl2)
inkubiert und Raumtemperatur abgekühlt. Transfektionen wurden
in Platten mit 96 Näpfen
oder 10cm-Platten (bei 30% bis 50% Konfluenz) unter Verwendung verschiedener
kationischer Lipide wie beispielsweise Oligofectamin, Lipofectamin
(Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder,
CO), oder FuGene 6 (Roche) gemäß den Anweisungen
der Hersteller durchgeführt.
RNAi-Moleküle
wurden transfiziert durch Hinzugeben von vorab ausgebildetem 5x-konzentriertem Komplex
aus annelierter RNAi und Lipid in Serum-freiem Medium zu Zellen
in vollständigem
Medium. Vor der Transfektion wurden 2500 HeLa-Zellen pro Napf 15
bis 18 Stunden vor der Transfektion für das 96-Napf-Format transfiziert.
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Das
Gesamttransfektionsvolumen beträgt
100 μl für Zellen,
die in Platten mit 96 Näpfen
ausplattiert waren, und 10 ml für
in 10cm-Platten ausplattierten Zellen. Die Lipidendkonzentration
betrug 0,8 bis 1,2 μg/ml, abhängig von
der Zelldichte; die RNAi-Konzentration
ist in einem jeden Experiment angegeben.
-
Man
erlaubte, dass die Komplexbildung für 30 Minuten bei 37°C stattfand.
Komplexe wurden zu den Zellen hinzugegeben, um eine 1 × Endkonzentration
von sowohl Lipid als auch RNAi zu ergeben. Abhängig von der nach Transfektion
durchgeführten
Analyse wurden Zellen lysiert unter Verwendung von Standardzelllysebuffer
für die
Proteinextraktion (Klippel, A., Escobedo, J. A., Hirano, M. and
Williams, L. T. (1994). Mol Cell Biol 14, 2675-2685) oder einen
denaturierenden Puffer für
RNA-Isolierung gemäß dem RNA-Isolierungskit
(Invitek, Berlin (Deutschland)), 24 bis 48 Stunden nach Transfektion
für RNA-Analyse
und 48 bis 72 Stunden nach Transfektion für Proteinanalyse durch Western
Blot.
-
Bestimmung von relativen
Mengen von RNA-Niveaus durch Taqman-Analyse:
-
24
Stunden nach Transfektion wurde die RNA von Zellen, die in Platten
mit 96 Näpfen
transfiziert waren, isoliert und gereinigt unter Verwendung des
Invisorb RNA HTS 96 kit (InVitek GmbH, Berlin). Inhibierung von
PTEN-mRNA-Expression wurde nachgewiesen durch Echtzeit-RT-PCR (Taqman)-Analyse
unter Verwendung von 300 nM PTEN 5'-Primer CACCGCCAAATTTAACTGCAGA, 300
nM PTEN 3'-Primer AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT
und 100 nM der PTEN-Taqman-Sonde Fam-TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA-Tamra
in Kombination mit 40 nM β-Actin 5'-Primer GTTTGAGACCTTCAACACCCCA, 40
nM β-Actin
3'-Primer GACCAGAGGCATACAGGGACA
und 100 nM der β-Actin
Taqman-Sonde Vic-CCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG-Tamra.
Die Akt-Primer- und Sonden wurden wie in Stemberger et al. bestimmt
(Stemberger, a.a.O.) und werden verwendet gemäß den Angaben des Herstellers
(Applied Biosystem; Verwendung des Amplicon-Sets). Die Primer und
Sonden können
auch ausgestaltet werden unter Verwendung des Software-Programms
Primer Express (Applied Biosystem). Die Reaktion wurde in 50 μl durchgeführt und
auf dem ABI PRISM 7700-Sequenz-Detektor (Applied Biosystem) gemäß den Anweisungen des
Herstellers unter den folgenden Bedingungen getestet: 48°C für 30 Minuten,
95°C für 10 Minuten,
gefolgt von 40 Zyklen aus 15 Sekunden bei 95°C und einer Minute bei 60°C.
-
RNA-Knock-Down
ist durch Echtzeit-RT-PCR-Analyse von HeLa-Zellen gezeigt, die mit
21 nt-langen Duplex-Molekülen
transfiziert waren, die entweder unmodifiziert oder mit entweder
NH2 oder invertierten abasischen Nukleotiden
am 5'-Ende modifiziert
waren, bei einer Lipidträgerkonzentration
von 1,0 μg/ml.
Die Zelldichte betrug 2000 Zellen/Napf. Modifikationen am 3'-Ende sind entweder
RNA-Überhänge, RNA-Überhänge mit
Aminogruppen oder DNA-Überhänge.
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Herstellung von Zellextrakten
und Immunbloten
-
Zellen
wurden zweifach mit kalter Phosphat-gepufferter Saline gewaschen
und bei 4° C
in Lysepuffer lysiert, der 20 mM Tris (pH 7,5), 137 mM NaCl, 15
% (Vol/Vol) Glycerol, 1 % (Vol/Vol) Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid,
10 mg Aprotinin pro ml, 20 mM Leupeptin, 2 mM Benzamidin, 1 mM Natriumvanadat,
25 mM β-Glycerolphosphat,
50 mM NaF und 10 mM NAPPi enthält.
Lysate wurden geklärt
durch Zentrifugation bei 14.000 xg für 5 Minuten und Aliquots der
Zellextrakte, die gleiche Mengen an Protein enthielten, wurden hinsichtlich
Proteinexpression durch Western-Bloten analysiert. Die Proben wurden
durch SDS-PAGE getrennt und auf Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) transferiert.
Die Filter wurden blockiert in TBST-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5),
150 mM NaCl, 0,05 % (Vol/Vol) Tween 20, 0,5% (Gew/Vol) Natriumazid),
der 5 % (Gew/Vol) getrocknete Milch enthält. Die entsprechenden Antikörper wurden
in TBST mit geeigneten Verdünnungen
hinzugegeben. Gebundener Antikörper
wurde nachgewiesen unter Verwendung von anti-Maus- oder anti-Kaninchen-konjugierter
Meerrettichperoxidase (Transduction Laboratories) in TBST, gewaschen
und entwickelt unter Verwendung des SuperSignal West Dura (Pierce)
oder von ECL (Amersham)-chemilumineszierenden Substraten (siehe
Sternberger et al. (2002). Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev. in press).
-
Antikörper
-
Der
murine monoklonale anti-p110-Antikörper U3A und der murine monoklonale
anti-p85-Antikörper N7B
sind beschrieben worden (Klippel et al., 1994, aaO). Polyklonale
Kaninchen-anti-AKT und anti-Phospho-Akt (S473)-Antikörper wurden
von Cell Signaling Technology erhalten. Der murine monoklonale anti-PTEN-Antikörper stammt
von Santa Cruz Biotechnology. Das PTEN 53-spezifische Antisensemolekül, d. h. GeneBloc,
ist beschrieben in Sternberger et al. (Sternberger aaO) mit der
folgenden Sequenz (ucuccuuTTGTTTCTGcuaacga), wobei die in Kleinbuchstaben
dargestellten Nukleotide Ribonukleotide sind, wohingegen die Nukleotide
in Großbuchstaben
Desoxyribonukleotide sind. Das Antisense-Molekül ist ebenfalls identisch zu
RNAi 1A ohne TT.
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Die
Ergebnisse sind in 3A und die entsprechenden RNAi-Moleküle in 3B gezeigt, die gegen die mRNA von PTEN gerichtet
sind. Die in Kleinbuchstaben geschriebenen Nukleotide stellen Ribonukleotide dar,
wohingegen Großbuchstaben
Desoxyribonukleotide darstellen. Der Begriff NH2 zeigt
an, dass die 3'-Position
des Ribonukleotids durch eine Amina-Gruppe modifiziert war. Die
RNAi-Moleküle,
die in diesem und anderen Beispielen, wie sie hierin offenbart sind,
verwendet sind, werden auch als kleine interferierende RNA-Moleküle, siRNA,
bezeichnet. Es soll festgehalten werden, dass in einer jeden der
hierin enthaltenen Figuren der obere Strang der Antisense- oder
erste Strang ist, wohingegen der untere Strang der Sense- oder zweite
Strang des interferierenden RNA-Moleküls ist.
-
Wie
aus 3A entnommen werden kann, sind
Endmodifikationen wie beispielsweise Aminomodifikationen und invertierte
abasische Nukleotide Modifikationen der terminalen OH-Gruppe der
Nukleinsäure ebenso
potent wie unmodifizierte Enden, wenn die Modifikation am 3'-Ende des Antisense-Stranges
angeordnet ist (siehe auch 8A; 8B). Deshalb werden chemische Modifikationen
zur Stabilisierung oder mit anderen vorteilhaften Eigenschaften
(Abgabe) toleriert werden ohne Aktivitätsverlust, wenn sie am 3'-OH lokalisiert sind;
insbesondere wenn das 3'-OH
an einem überhängenden
Nukleotid angeordnet ist.
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Für das in 3C gezeigte Experiment wurden ähnliche Bedingungen wie oben
angegeben verwendet. Der erste Strang und der zweite Strang der
RNAi waren entweder durch eine NH2-Gruppe an der 3'-Position des Riboseteils
oder durch ein invertiertes abasisches Nukleotid an der Position
modifiziert. Das erste Konstrukt ist als siRNA-NH2 (3A3B)
bezeichnet, das zweite als siRNA-iB (4A4B). Die Sequenz beider Moleküle ist in 3B dargestellt. Der Begriff 3A3B zeigt an, dass
die interferierende Ribonukleinsäure
aus Strang 3A als den Antisense-Strang und Strang 3B als den Sense-Strang
besteht. Aus Vergleichsgründen
wurde ein Antisense-Oligonukleotid erzeugt, das als GB53 bezeichnet
ist (Steinberger et al. aaO), das ebenfalls gegen die mRNA von PTEN
gerichtet war. Die Besonderheiten dieses letzteren Experimentes
waren die folgenden.
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Wie
aus 3C entnommen werden kann, sind
endgeschützte
RNAi-Moleküle,
wie sie in 3B dargestellt sind, funktionell
dahingehend, dass sie einen PTEN-Protein-Knock-Down ergeben.
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Aus
diesem Beispiel kann entnommen werden, dass beide Endschutzgruppen
RNAi-Moleküle
hinsichtlich des Knock-Downs von PTEN-Protein aktiv machen. Diese
Inhibierung ist so wirksam wie eine Inhibierung mit Antisense-Konstrukten,
aber bei niedrigeren verwendeten Konzentrationen, was einen klaren
Vorteil gegenüber
der bereits sehr leistungsfähigen
Antisense-Technologie darstellt.
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Beispiel 2: Überhang-Erfordernisse
für RNAi-Duplexaktivität in vivo
-
Die
experimentellen Vorgehensweisen waren die gleichen wie im Zusammenhang
mit Beispiel 1 dargestellt mit der Ausnahme, dass die PTEN-mRNA-targetierenden
interferierenden RNAi-Moleküle
unterschiedlich ausgestaltet waren. Die Ergebnisse sind in 4A als Dosis-Antwort-Kurven gezeigt, wobei 4B die besondere Sequenz und Modifikationen der
interferierenden RNAi-Moleküle
zeigt, die verwendet wurden, um die in 4A dargestellten
Daten zu erzeugen. Die Nomenklatur ist so, dass, beispielsweise,
RNAi 18 aus Strang 18A als Antisense-Strang und Strang 18B als Sense-Strang
zusammengesetzt ist.
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Glattendige
Moleküle
werden mit Molekülen
mit 3'-Überhängen (RNAi
18) und 5'-Überhängen (RNAi 30 und RNAi 31)
hinsichtlich ihrer Aktivität
verglichen, PTEN-mRNA in HeLa-Zellen herunterzuregulieren (Knock-Down).
Die Aktivität
von glattendigen Molekülen
(RNAi 28) und Molekülen
mit 5'-Überhängen ist
vergleichbar mit der Aktivität
von Molekülen
mit 3'-Überhängen. Dies
zeigt, dass 3'-Überhänge für RNAi-Aktivität nicht
essentiell sind.
-
Beispiel 3: Duplexlängenerfordernis
von interferierenden RNA-Molekülen
für RNAi-Aktivität in vivo
-
Der
experimentelle Ansatz war ähnlich
dem im Zusammenhang mit Beispiel 1 dargestellten, mit der Ausnahme,
dass die interferierenden RNA-Moleküle gegen die mRNA von Akt1
gerichtet waren. Die Negativkontrolle, um die Spezifität der RNAi-Moleküle zu zeigen,
war wiederum p110-mRNA. Die experimentellen Ergebnisse sind in 5A gezeigt, wobei die Besonderheiten der interferierenden
RNAi-Moleküle,
wie sie verwendet wurden, in 5B gezeigt
sind. Ähnliche
Experimente wurden durchgeführt
mit weiteren siRNA-Konstrukten, die in 7A,
linke Tafel dargestellt sind, wobei die Pfeile Fehlpaarungen angeben
und Desoxyribonukleotide in Großbuchstaben
dargestellt sind. Die Inhibierung von Akt1-mRNA-Expression in HeLa-Zellen, die mit den
angegebenen Mengen von siRNA-Molekülen transfiziert sind, ist
in der rechten Tafel von 7A gezeigt.
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Die
Taqman-Analyse von Akt-RNA von HeLa-Zellen, die mit verschiedenen
RNAi-Molekülen transfiziert
waren, zeigt, dass der doppelsträngige
Duplex der siRNA-Moleküle
länger
als 17 Basenpaare sein muss, um eine Aktivität zu zeigen, wohingegen Moleküle mit 17
Basenpaaren langen Duplexen oder kürzer nicht funktionell sind,
selbst wenn Sequenzspezifische Überhänge hinzugefügt sind.
Die kürzesten,
erfolgreich getesteten RNAi-Moleküle waren
18 bis 19 Nukleotide oder Basenpaare lang. Es soll festgehalten
werden, dass die Ausgestaltung des interferierenden RNA-Moleküls 51A/51B,
das als RNAi51 bezeichnet ist, derjenigen entspricht, wie sie in
der internationalen Patentanmeldung WO 01/75164 beschrieben ist.
Das RNAi-Molekül 55A/55B
umfasst einen Abschnitt aus 17 Nukleotiden und weist eine eindeutig
verringerte Aktivität
hinsichtlich des Abbaus von Akt1-mRNA auf.
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Wie
aus 7A entnommen werden kann, sind
17 nt lange Duplexe hocheffizient bei der Verringerung von Akt1-mRNA-Niveaus
unabhängig
von der Art (Desoxy- oder Ribonukleotide) des 3'-Überhanges
(vergleiche Moleküle
1AB, 2AB, 3AB, 4AB). Die 17 Nukleotid-lange siRNA (Molekül 5AB) zeigte
eine dramatisch verringerte Abschaltaktivität, was das oben ausgedrückte Verständnis bestätigt, dass
aktive siRNA-Duplexe wenigstens 18 nt oder länger sein sollten. Ohne durch
eine Theorie gebunden sein zu wollen, kann dieses Ergebnis mechanistisch
durch zwei unterschiedliche Erfordernisse erklärt werden. Erstens kann eine
minimale Basenpaarung aus 18 nt zwischen dem Antisense der siRNA
und der Ziel-mRNA obligatorisch sein, oder, zweitens, erfordert
der Einbau in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eine
Minimallänge
des siRNA-Duplex. Um diese Frage zu adressieren, wurde ein 19 nt
langes siRNA-Duplexmodell mit einer und zwei terminalen Mutationen
(CG und UA-Inversion) relativ zur Wildtyp-Sequenz synthetisiert
(Moleküle
6AB und 7AB). Beide Moleküle,
selbst das Molekül
mit einem Abschnitt aus nur 15 nt, der mit der Ziel-mRNA basenpaarte,
war bei der Induktion des Akt1-mRNA-Niveaus funktionell. Deshalb
kann gefolgert werden, dass die Duplexlänge selbst, aber nicht die
Basenpaarung der Antisense-siRNA mit der Ziel-RNA die Minimallänge funktioneller
siRNAs zu bestimmen scheint. Dies schlägt vor, dass die Länge der
doppel-strängigen
Helix eine wichtige Determinante für den Einbau in den RISC-Komplex
ist. Die eingeführten
Fehlpaarungen an den terminalen Enden der siRNA-Duplexe hatten einen
geringen Einfluss auf RNA-Interferenz.
-
Mit
Blick auf die experimentellen Ergebnisse ist das Minimalerfordernis
für optimale
RNAi-vermittelte Interferenz
einer Duplexlänge
von 18 oder 19 Nukleotiden, unabhängig von dem weiteren Design
der RNAi-Moleküle,
wie beispielsweise glattendig oder mit 5'-Überhang
oder irgendeiner anderen Form, wie hierin offenbart, sondern allgemein
auf RNAi-Moleküle
anwendbar. Es muss jedoch anerkannt werden, dass die spezielle Ausgestaltung
der RNAi-Moleküle diesen
Molekülen
weitere Vorteile verleihen kann, wie beispielsweise erhöhte Wirksamkeit
bzw. erhöhte
Stabilität.
-
Beispiel 4: Ziel-Antisense-Homologie-Erfordernis
für RNAi
in vivo
-
Der
experimentelle Aufbau war ähnlich
zu dem in Beispiel 1 beschriebenen, wobei die RNAi spezifisch für Akt1 ist.
Zusätzlich
wurde ein PTEN-spezifisches interferierendes RNA-Molekül konstruiert und als Negativkontrolle
verwendet. Die Ergebnisse sind in 6A und 6B gezeigt. Grundsätzlich wurde das gleiche Experiment
ausgeführt
unter Verwendung weiterer siRNA-Moleküle, wie in 7B dargestellt,
wobei die Ergebnisse in 7B (rechte
Tafel) bzw. 7C dargestellt sind.
-
Nachdem
die minimale Duplexlänge
von 18 oder mehr als 18 Nukleotiden für funktionelle siRNA-Moleküle etabliert
war, stellten wir die Frage, wie viele passende Nukleotide zwischen
Ziel-mRNA und siRNA für die
Abschaltaktivität
notwendig sind. Wie durch Taqman-Analyse an Akt1-RNA gezeigt, ist
ein Abschnitt aus 19 bis 15 Nukleotiden, die perfekt zu der Ziel-RNA
passen, in diesem Falle Akt1, ausreichend, um RNAi-Aktivität zu vermitteln.
Ein PTEN-spezifisches RNAi-Molekül
verringert die RNA-Mengen von Akt1 nicht, was somit die Spezifität dieses
Ansatzes bestätigt.
Fehlpaarungen aus einem oder zwei Nukleotiden an einem oder beiden
Enden eines Stranges sind funktionell, was nahelegt, dass ein homologer
Abschnitt aus 15 nt zwischen einer Ziel-mRNA und RNAi für das Abschalten
eines Gens ausreichend ist. Es kann aus diesen Daten gefolgert werden,
dass ein unspezifisches Abschalten eines Gens durch Zufall durch
unspezifisches Binden an nicht-verwandte
Ziele erfolgen kann. Dies basiert auf dem Verständnis, dass ein Abschnitt aus
15 bis 17 passenden Basenpaaren für ein einzelnes Gen nicht spezifisch
ist und durch Zufall, mit Blick auf die Komplexität und Größe des Genoms
oder Transkriptoms von Vertebraten, auftreten wird. Neben den zuvor
beschriebenen Experimenten wurde auch die Position der Fehlpaarung
nachfolgend analysiert. Zu diesem Zweck wurde eine 19 nt lange glattendige
siRNA verwendet, die gegen PTEN-mRNA gerichtet war. Die Sequenzänderungen
in einem siRNA-Strang wurden ausgeglichen durch komplementäre Änderungen
in dem anderen Strang, um ein Auseinanderreisen der Duplexbildung
zu vermeiden. Wie sowohl aus 7A als
auch C entnommen werden kann, war eine siRNA mit nur einer Punktmutation
im Zentrum des Moleküls
hinsichtlich seiner Fähigkeit
stark eingeschränkt,
mRNA und Protein-Niveaus
zu verringern. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die RNA-Maschinerie
stark zwischen perfektem und nicht-perfektem Basenpaaren zwischen
Ziel-mRNA und siRNA im Zentrum des Duplexes unterscheidet. Diese
extreme Abhängigkeit
von einer perfekten Komplementarität zwischen Ziel- und siRNA
ist bereits für
RNAi-Interferenz im Drosophila-System
beschrieben worden, jedoch noch nicht im Zusammenhang mit Säugersystemen
wie beispielsweise HeLa.
-
Auf
der Grundlage dieser Beobachtung verringert die vorliegende Erfindung
dieses Off-Target-Problem
von siRNA durch zwei Ansätze.
Zuerst durch Verringern der Moleküllänge der siRNA-Moleküle auf die minimalen
Erfordernisse (18-19 nt) und dadurch Verringern der Chance einer
Homologie zu einem Off-Target. Zweitens, durch Inaktivieren des
Sense-Stranges,
um eine unerwünschte
RNA-Abschaltung zu verhindern, die durch eine zufällige Komplementarität des Sense-Stranges
zu einer nicht-verwandten Ziel-RNA bedingt wird (siehe auch Beipsiel
6).
-
Beispiel 5: Stabilität von modifizierten
RNAi-Molekülen
in Serum
-
Oligonukleotide
wurden in menschlichem Serum für
15 Minuten und 2 Stunden inkubiert und auf 10 % Polyacrylamidgel
zusammen mit unbehandelten Kontrollen geladen. Die Ergebnisse sind
in 8A gezeigt. Die verschiedenen RNAi-Moleküle, die
verwendet wurden, sind in 8B gezeigt
und detaillierter beschrieben.
-
Aus
diesem Beispiel kann entnommen werden, dass die RNAi-Duplexe von
RNA-Molekülen,
bei denen alle Nukleotide mit 2'-O-Methylgruppen
modifiziert sind (RNAi-Moleküle
79A79B und 28A28B) eine höhere Stabilität in Serum
aufweisen. Es ist auch gezeigt, dass ein glattendiger Duplex stabiler
ist als das Duplexmolekül
mit Überhängen. Daraus
kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass der Endschutz (z.
B. iB oder Amino) die Stabilität
in Serum nicht erhöht.
-
Zusätzlich kann
auch gefolgert werden, dass im Gegensatz zu dem Verständnis in
der Technik vor dem Einreichen dieser Anmeldung Endonukleasen statt
Exonukleasen beim Schutz von RNAi-Molekülen wichtiger sind.
-
Im
Lichte dessen kann zusätzlich
zu den verschiedenen Modifikationen oder Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen RNAi-Molekülen, wie
sie in dieser Anmeldung offenbart sind, eine weitere oder zusätzliche Modifikation
der Nukleotide in der Verwendung eines Phosphothiatrückgrates
der RNAi-Moleküle
gesehen werden, die entweder vollständig oder teilweise sein kann,
um die Endonuklease-Funktion zu inhibieren. Ein vollständiges Phosphothioatrückgrat bedeutet,
dass ein jedes Nukleotid eine Phosphothioatgruppe aufweist, wohingegen
ein teilweises Phosphothioatrückgrat
bedeutet, dass nicht alle der Nukleotide, die das RNAi-Molekül ausbilden,
eine Phosphothioatmodifikation aufweisen. Diese Modifikation ist
geeignet, die Lebenszeit von RNAi-Molekülen unabhängig von der weiteren Ausgestaltung
von RNAi-Molekülen
zu erhöhen.
In dieser Hinsicht ist eine teilweise oder vollständig Phosphothioat-modifizierte
RNAi Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die im Zusammenhang
mit den verschiedenen Strategien für die Ausgestaltung von interferierenden RNA-Molekülen, wie
sie hierin offenbart sind, oder mit irgendeiner der in der Technik
bekannten Ausgestaltungen realisiert sein kann.
-
Beispiel 6: Inaktivierung
des Sense-Stranges durch NH2-Endschutzgruppen
an den 5'- und 3'-Enden
-
Der
experimentelle Aufbau war ähnlich
dem im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschriebenen, wobei die Zielnukleinsäuresequenz
PTEN-mRNA ist. Die Konzentration von HeLa-Zellen betrug 2.000 Zellen
pro Napf. RNA von PTEN wurde in Taqman-Tests nach Transfektion unterschiedlich
modifizierter RNAi-Moleküle analysiert.
Die verschiedenen interferierenden RNA-Moleküle, die verwendet wurden, sind
in 9B dargestellt, wohingegen die
experimentellen Ergebnisse in 9A gezeigt
sind.
-
Wie
aus diesen Dosis-Antwort-Kurven verschiedener RNAi-Moleküle, die
in 8A dargestellt sind, entnommen
werden kann, sind RNAi-Moleküle
funktionell, wenn der Sense- Strang,
d. h. der zweite Strang, an beiden Enden mit Aminogruppen modifiziert
ist. Besonders wirksam sind die RNAi-Moleküle 20A26B, 18A26B und 28A26B.
Die niedrigste Aktivität
wird von dem RNAi-Molekül
26A26B gezeigt, das einer Endmodifikation an allen vier Enden des
Duplexes entspricht (Tuschl ist 18AB).
-
Die
RNAi-Aktivität
wird jedoch auch erreicht, wenn der Antisense-Strang, d. h. der
erste Strang, nur an dem 3'-Ende
modifiziert ist, wodurch eine freie OH-Gruppe am 5'-Ende verbleibt (RNAi-Konstrukte
22A26B; 20A26B). Es gibt keine Aktivität, wenn der Antisense-Strang an sowohl
dem 5'- als auch
dem 3'-Ende mit
Aminogruppen modifiziert ist (26A26B). Dies führt zu der Schlussfolgerung,
dass ein jegliches Ende des Antisense-Stranges und spezieller das
5'-Ende des Antisense
ohne Modifikation verbleiben sollte. Zusätzlich ist es wert festzuhalten,
dass die NH2-Endmodifikation verwendet werden
kann, um den Sense-Strang
an dem 5'- und 3'-Ende zu inaktivieren
und deshalb off-target-Wirkungen zu verringern, die durch einen
ansonsten funktionellen Sense-Strang vermittelt werden, was zu einer
signifikant erhöhten
Spezifität
der RNAi-Moleküle
führt, was
für Target-Validierung
ebenso wie für
eine jegliche medizinische Verwendung von RNAi-Molekülen vorteilhaft
ist.
-
Die
weitere Verallgemeinerung der Ergebnisse aus diesem Experiment ist
in 9C dargestellt. Funktionell aktive
RNAi sind entsprechend jene, die keine Amino-Modifikation am Antisense-Strang
oder eine Aminomodifikation nur an dem 3'-Ende des Antisense-Stranges aufweisen, wohingegen eine
Aminomodifikation an beiden Enden des Antisense-Stranges nicht funktionell ist, d. h.
nicht zu einem Knock-Down der Ziel-mRNA führt.
-
Beispiel 7: Einfluss von
2'-O-Methyl-Modifikation
von RNAi-Molekülen
hinsichtlich Schutz vor Endonukleasen
-
RNA-Knock-Down
ist wiederum unter Verwendung der Echtzeit RT-PCR-Analyse an HeLa-Zellen gezeigt, die
mit RNAi-Duplex-Molekülen
transfiziert sind, die gegen die PTEN-mRNA gerichtet sind, wie in 10A dargestellt. Die experimentellen Verfahrensweisen
waren grundsätzlich
die gleichen wie in Beispiel 1 angegeben. Die Struktur der untersuchten
RNAi-Moleküle
und ihre Dosisantworten, die in 10A gezeigt sind,
sind in 10C gezeigt. Die in Fettdruck
gehaltenen Nukleotide sind jene mit einer 2'-O-Methyl-Modifikation.
-
Es
ist durch die Dosis-Antwort-Kurven, die für verschiedene RNAi-Moleküle in 10A gezeigt sind, veranschaulicht, dass
interne 2'-O-Alkylgruppen
RNAi-Aktivität
verringern. Bevorzugterweise sind solche 2'-O-Alkylgruppen 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Ethylgruppen. Moleküle mit unmodifizierten
Nukleotiden in Verbindung mit 2'-O-Alkyl-Modifikation
zeigen jedoch eine signifikante Aktivität. Wie auch in 10A dargestellt,
tritt keine Aktivität
auf, wenn der Antisense-Strang vollständig mit 2'-O-Methylgruppen modifiziert ist und
deren Sense-Strang nicht modifiziert ist (siehe, beispielsweise,
RNAi-Molekül
79A28B). Im Lichte dieser Ergebnisse eines Stabilitätstests
wie beispielsweise Inkubieren der verschiedenen RNAi-Moleküle in Serum,
wie in 10B gezeigt, zeigt, dass 2'-O-Alkyl-Modifikationen RNAi-Moleküle gegen
Abbau stabilisieren. Diese eindeutig vorteilhafte Wirkung wird jedoch
in einem bestimmten Umfang ausgeglichen durch die Wirkung, dass 2'-O-Alkyl-Modifikationen im Allgemeinen
zu einer verringerten Knock-Down-Aktivität führen. Entsprechend muss die
Ausgestaltung von RNAi-Molekülen
Stabilität
gegen Aktivität
ausbalancieren, was es wichtig macht, dass man sich der verschiedenen
Ausgestaltungsprinzipien, wie sie in der vorliegenden Anmeldung
offenbart sind, bewusst ist.
-
Beispiel 8: Einfluss von
Blöcken
interner 2'-O-Methyl-Modifikationen
auf die Stabilität
von RNAi-Molekülen
in Serum
-
Der
experimentelle Ansatz im Zusammenhang mit dieser Studie war tatsächlich der
gleiche, wie der in Beispiel 1 beschriebene. Wiederum wird PTEN-RNA
durch Echtzeit-FT-PCR an HeLa-Zellen bei einer Dichte von 2.000
Zellen pro Napf analysiert, die mit unterschiedlichen Dosen von
RNAi-Molekülen
transfiziert waren. RNAi-Moleküle
wurden in Serum für
2 Stunden inkubiert und auf einem 10 % Polyacrylamidgel analysiert.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in 11A bis 11C dargestellt, wobei 11A die
Dosis-Antwort verschiedener RNAi-Moleküle zeigt, die in 11C dargestellt sind, und 11B die
Ergebnisse eines Stabilitätstests
unter Verwendung von einigen der in 11C gezeigten
RNAi-Molekülen
zeigt. Es soll verstanden werden, dass die in 11C in Fettdruck dargestellten Nukleotide diejenigen
sind, die eine Modifikation tragen, die in diesem Falle eine 2'-O-Methyl-Modifikation des
Riboseteils der Nukleotide ist.
-
Es
existiert eine dosisabhängige
Inhibierung durch die unmodifizierten RNAi-Moleküle. Es ist auch gezeigt, dass
die 2'-O-Methyl-Modifikation
der neun Kernnukleotide die RNAi in Serum stabil macht und eine
Aktivität
des Duplexes im Sinne des Interferenz-Phänomens erlaubt, was zu einem
Abbau der PTEN-mRNA führt. Die
Gesamtmodifikation des Sense-Stranges
macht das RNAi-Molekül
in Serum stabil und erlaubt eine gewisse Aktivität.
-
Abwechselnde
Blöcke
aus für
Nukleotiden mit 2'-O-Methyl-Modifikation
machen das RNAi-Molekül stabil
in Serum und erlauben eine Aktivität auf PTEN-RNA, wie gezeigt
durch Inkubation des RNAi-Duplex in Serum für 2 Stunden und Laden der Proben
auf ein 10 % Polyacrylamidgel. Wie aus 11B entnommen
werden kann, ist der Duplex umfassend die Stränge 80A und 80B nach Inkubation
in Serum für
2 Stunden stark abgebaut. Der Duplex, der aus den Strängen 82A
und 82B besteht, bestätigt
das Ergebnis, dass das 5'-Ende des
ersten Stranges, der den Antisense-Strang umfasst, nicht am 5'-terminalen Nukleotid
modifiziert sein soll (vergleiche 82A und 82B mit dem umgekehrt
orientierten 81A81B). Dies wird auch bestätigt durch die Ergebnisse,
die erhalten wurden, wenn der Duplex aus den Strängen 86A und 86B besteht, der
sowohl aktiv als auch in Serum stabilisiert ist. Es ist beachtlich,
dass Moleküle
mit unmodifizierten Blöcken
am terminalen 5'-Ende des
Antisense-Stranges
aktiver sind, wobei die 5'-terminale
OH-Gruppe bevorzugterweise nicht derivatisiert ist.
-
Weitere
Experimente wurden durchgeführt
unter Verwendung verschiedener Modifikationsmuster aus 2'-O-Methylmodifikation
der Nukleotide. Die Ergebnisse davon sind in 12A bis 12C gezeigt und werden weiter hierin in
Beispiel 9 diskutiert.
-
Beispiel 9: Der Einfluss
von alternierender interner 2'-O-Alkyl-Modifikation
auf Serumstabilität
von RNAi-Molekülen
-
Der
experimentelle Aufbau für
die Durchführung
dieser Art von Studie war der gleiche, wie er im Zusammenhang mit
den in Beispiel 1 bzw. Beispiel 8 berichteten Studien verwendet
wurde, wobei die Ziel-Nukleinsäure
wiederum PTEN-mRNA war. HeLa-Zellen wurden mit den verschiedenen
RNAi-Molekülen
transfiziert, die in 12B dargestellt
sind, und RNA-Knock-Down
wurde gezeigt unter Verwendung von Echtzeit-RT-PCR an PTEN-RNA in
einer dosisabhängigen
Art (12A). Die Stabilität der verschiedenen RNAi-Moleküle nach
15 Minuten und 2 Stunden in Serum bei 37° C ist in 12C gezeigt
und ein Western Blot für
p110 und PTEN als das Zielprotein der verschiedenen RNAi-Moleküle ist in 12D gezeigt, wobei die getesteten RNAi-Moleküle in beiden
Experimenten, die 12C und 12D zugrunde liegen, identisch sind.
-
Wie
in 12A und 12C gezeigt,
machen Nukleotide, die mit 2'-O-Methylgruppen
modifiziert sind, und mit unmodifizierten Nukleotiden abwechseln,
RNAi-Moleküle
in Serum stabil, während
sie erlauben, dass sie in dem Sinne aktiv sind, dass sie mit Ziel-mRNA
interferieren. Es ist gezeigt, dass die Inkubation von RNAi-Duplexmolekülen für 15 Minuten
und 2 Stunden in Serum den unmodifizierten Duplex und den Duplex
abbauen wird, wo die zehn am meisten 5'-positionierten Nukleotide unmodifiziert
sind.
-
Bei
den in 12B dargestellten RNAi-Molekülen sind
verschiedene Muster aus modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden
realisiert. Das RNAi-Molekül
94A1/94B1 umfasst eine Struktur, wobei ein modifiziertes Nukleotid
von einem unmodifizierten Nukleotid flankiert ist, wobei das unmodifizierte
Nukleotid am 5'-Ende des
ersten Stranges angeordnet ist. Das RNAi-Molekül, das aus den Strängen 94A2
und 94B2 besteht, ist ein weiteres Beispiel, wo die modifizierten
Nukleotide und die unmodifizierten Nukleotide des ersten und zweiten Stranges
an gegenüberliegenden
Stellen angeordnet sind. Im Gegensatz dazu hat das RNAi-Molekül, das aus den
Strängen
94A1 und 94B2 besteht, das gleiche Muster aus modifizierten und
unmodifizierten Nukleotiden. Es existiert jedoch eine Phasenverschiebung,
so dass die modifizierten Nukleotide Basenpaare mit einem unmodifizierten
Nukleotid ausbilden. Die zwei RNAi-Moleküle, die aus den Strängen 94A1
und 94B1 und Strängen
94A2 und 94B2 bestehen, unterscheiden sich darin, dass im ersten
Falle der erste Strang mit einem unmodifizierten Nukleotid beginnt
und das korrespondierende erste Nukleotid auf dem zweiten Strang,
d. h. das Nukleotid am 3'-Ende
des zweiten Stranges mit einem unmodifizierten Nukleotid beginnt,
wobei die Anordnung dazu entgegengesetzt ist in dem RNAi-Molekül, das aus
94A2 und 94B2 besteht.
-
Zusätzlich sind
alternierend modifizierte RNAi-Moleküle, wie sie in 12B gezeigt
sind, funktionell hinsichtlich des Vermittelns eines PTEN-Protein-Knock-Downs
wie in 12D gezeigt, aber nur, wenn
das zweite 5'- und
zweite 3'-terminale
Nukleotid nicht modifiziert sind (siehe 94A294B1 und 94A294B2).
Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die stabilsten und aktivsten
RNAi-Moleküle
alternierende 2'-O-Alkyl-modifizierte
und unmodifizierte Nukleotidreste aufweisen. Es sollte festgehalten
werden, dass diese Moleküle
eine sehr ähnliche
mRNA-Verringerung aufweisen, wenn sie mit unmodifizierten siRNA-Molekülen verglichen
werden, was, da sie in Serum stabil sind, eine erhöhte oder
leichtere Handhabung erlaubt.
-
Beispiel 10: Durch intern
modifizierte RNAi-Moleküle
vermittelter funktioneller Protein-Knock-Down
-
Der
experimentelle Ansatz war ähnlich
dem im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschriebenen.
-
Western
Blots wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, die zu verschiedenen Zeitpunkten
nach Transfektion (48, 72, 96 und 120 Stunden) mit alternierend
modifizierten RNAi-Molekülen,
wie in 12B dargestellt, durchgeführt wurden.
Aus experimentellen Gründen
ist es beachtlich, dass die Zellen des 96 Stunden-Zeitpunktes aufgeteilt
worden sind und die Hälfte
der Population erneut ausplattiert wurde. Insgesamt 40 nM der verschiedenen
RNAi-Moleküle
wurden an diese Zellen verabreicht. Die Zellen wurden kontinuierlich
für 72 Stunden
mit kationischen Lipiden wie in Beispiel 1 beschrieben transfiziert;
dann in Abwesenheit von Transfektionsreagenzien erneut ausplattiert.
-
Die
Transfektionen wurden in Platten mit 96 Näpfen oder in 10 cm Platten
(bei Konfluenz von 30 % bis 50 %) unter Verwendung verschiedener
kationischer Lipide wie beispielsweise Oligofectamin, Lipofectamin (Life
Technologies), NC388, L8 (atugen, Berlin) durchgeführt. RNAi
wurde transfiziert durch Hinzugeben von zuvor ausgebildetem, fünfach konzentriertem
Komplex aus siRNAs und Lipid in serumfreiem Medium zu Zellen in
vollständigem
Medium. Das Gesamttransfektionsvolumen betrug 100 μl für Zellen,
die in Platten mit 96 Näpfen
ausplattiert waren, und 10 ml für
Zellen, die in 10 cm Platten ausplattiert waren. Die Lipidendkonzentration betrug
0,8 bis 1,2 μg/ml,
abhängig
von der Zelldichte; die siRNA-Konzentration
ist in einem jeden Experiment angegeben.
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Das
Ergebnis der Western Blot-Analyse ist in 13 dargestellt.
Wie aus dieser Figur ersichtlich, ergeben RNAi-Moleküle der Version
94A2B1 und 94A2B2 einen länger
andauernden PTEN-Protein-Knock-Down als unmodifizierte Moleküle. Das
Fehlen von Protein-Knock-Down, der auch in 12 mit
den Molekülen
der Version 94A1B1 und 94A1B2 beobachtet wird, wird in diesem Experiment
bestätigt.
Unmodifizierte Moleküle
(80AB) sind nicht so potent beim Unterstützen eines lang anhaltenden
Protein-Knock-Downs, wenn die Zellen nicht kontinuierlich transfiziert
werden.
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Beispiel 11: Persistenter
PTEN-Protein-Knock-Down mit RNAi-Molekülen mit alternierenden 2'-O-Methylmodifikationen
-
Der
experimentelle Ansatz war ähnlich
dem, wie er im Zusammenhang mit Beispiel 10 dargestellt ist, mit
der Ausnahme, dass die Transfektion nach 5 Stunden beendet wurde
durch Ersetzen des Transfektionsmediums durch neues Medium. Das
Protokoll war geringfügig
modifiziert derart, dass für
ein jedes der RNAi-Moleküle
eine 40 nM-Konzentration realisiert wurde unter Verwendung einer
Stammlösung
aus 1 μg RNAi/ml
kationischem Lipid, wie im Zusammenhang mit Beispiel 1 beschrieben.
5 Stunden nach Transfektion wurde das Medium abgezogen und frisches
EMEM hinzugegeben. Die Zellen wurden nach 72 Stunden aufgeteilt,
wobei die Hälfte
der Zellen lysiert wurde und die andere Hälfte erneut ausplattiert und
24 Stunden nach Transfektion später
lysiert wurde (96 Stunden nach Transfektion). Das Ergebnis einer
Western Blot-Analyse unter Verwendung dreier verschiedener RNAi-Moleküle (80AB,
94A1/B2, 94A2/B1) sind in 14 dargestellt. Als
Positivkontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet. 14 zeigt die Expression von PTEN nach 72 Stunden
bzw. 96 Stunden. Mit Blick auf die strukturellen Besonderheiten
der verschiedenen RNAi-Moleküle kann
man aus 14 entnehmen, dass der Protein-Knock-Down
mit alternierenden Molekülen
von der Art des 94A2B1 persistent ist, selbst nach 96 Stunden nach
Aufteilen und erneutem Ausplattieren von Zellen verglichen mit unmodifizierten
RNAi-Molekülen
(wie beispielsweise 80AB) und RNAi-Molekül 94A1B2.
-
Ein
weiteres Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung der siRNA-Konstrukte,
wie in 15A (linke Tafel) dargestellt.
Aus den Ergebnissen, dargestellt als Verhältnis von PTEN/p110α-mRNA-Abbau
bei verschiedenen Konzentrationen an siRNA-Konstrukten, die dem
Testsystem verabreicht wurden, kann entnommen werden, dass siRNA-Moleküle, wo entweder
einer oder beide Stränge
aus 2'-O-Methyl-Resten
bestehen, nicht in der Lage waren, RNAi-Interferenz in dem Säugetiersystem
zu induzieren (15A, Moleküle V2, V5,
V6). Die Abnahme an Aktivität
war jedoch weniger ausgeprägt,
wenn nur Teile der Stränge
modifiziert waren. Interessanterweise war ein Molekül mit einem
unmodifizierten Antisense-Strang
(das ist der obere Strang in der Darstellung im Rahmen dieser Beschreibung,
sofern nicht anders angegeben), und ein vollständig modifizierter Sense-Strang
signifikant aktiver verglichen mit der umgekehrten Version (5A, Moleküle V5
und V6). Dieses Ergebnis schlägt
vor, dass der Antisense-Strang von siRNA kritischer und hinsichtlich
Modifikation empfindlicher zu sein scheint. Die wirksamsten Moleküle, die
PTEN-mRNA induzierten, wiesen nur Bereiche von Modifikationen auf,
wobei das 5'-Ende
unmodifiziert war, oder waren an alternierenden Positionen an beiden
Strängen
modifiziert (15A, Moleküle V10,
V12).
-
Um
die Nukleaseresistenz zu testen, wurden die verschiedenen siRNA-Versionen
in Serum inkubiert, gefolgt von PAA-Gelelektrophorese. Das Ergebnis
ist in 15B gezeigt (rechte Tafel mit
den verschiedenen Sequenzen, die auf der linken Tafel von 15B angegeben sind). Wie früher gezeigt
wurden glattendige siRNA-Moleküle
mit unmodifizierten Ribonukleotiden sehr schnell abgebaut, wohingegen
eine vollständige
Substitution mit 2'-O-Methylnukleotiden
Resistenz gegen aus Serum stammenden Nukleasen vermittelte (15B, vergleiche Molekül AB mit V1). siRNA-Moleküle mit teilweiser
2'-O-Methylmodifikation
zeigten ebenso eine erhöhte
Stabilität
verglichen mit unmodifizierten siRNAs. Insbesondere Moleküle mit alternierenden Modifikationen
auf beiden Strängen
zeigten eine signifikante Verbesserung der Stabilität (15B, Moleküle V13, V14 und V16). Wichtiger
ist, dass die Transfektion von 3 dieser Moleküle in HeLa-Zellen zu einer
signifikanten Herunterregulierung der PTEN-Proteinexpression führte, wie
in 15C, Spuren 6, 9 und 10 dargestellt.
In diesem RNA-Interferenz-Aktivitätstest wurde eine unerwartete
Präferenz
für Moleküle beobachtet,
die an einem jeden zweiten Nukleotid beginnend mit dem am meisten
5'-terminal gelegenen
Nukleotid des Antisense-Stranges modifiziert waren (Moleküle V15 und
V12). Moleküle,
die Modifikationen enthielten beginnend mit dem zweiten Nukleotid
am 5'-Ende des Antisense-Stranges
waren stabiler, hatten aber eine stark verringerte Aktivität hinsichtlich
des Abschaltens von Genen (Moleküle
V13, V14). Dieses Ergebnis weist auf eine hochspezifische Wechselwirkungen
zwischen den beteiligten Enzymen und präzisen Nukleotiden in dem siRNA-Duplex
hin. Zusammengenommen belegen die hierin gezeigten Daten, dass 2'-O-Methylmodifikationen
an besonders ausgewählten
Positionen in dem siRNA-Duplex die Nukleaseresistenz erhöhen können und
RNAi nicht notwendigerweise vollständig beseitigen.
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Obwohl
eine erhöhte
Stabilität
von synthetischer siRNA primär
für in
vivo Anwendungen Implikationen aufweist, wurde auch analysiert,
ob die spezielle Modifikation auch zu einem verlängerten Protein-Knock-Down
in Zellkultursystemen führen
kann. In Übereinstimmung
damit wurden HeLa-Zellen transient für sechs Stunden transfiziert
unter Verwendung verschiedener Versionen von PTEN-spezifischen siRNAs. Der
Lipid-siRNA-Komplex wurde dann weggewaschen und der PTEN-Protein-Knock-Down
48 Stunden und 120 Stunden später analysiert.
Obwohl Knock-Down-Experimente ohne fortgesetzte Transfektion von
siRNAs infolge des schnellen Wachstums von nicht-transfizierten
Zellen in dieser Zeitspanne kompliziert sind, was zu einem sehr
transienten Knock-Down führt,
waren die vorliegenden Erfinder in der Lage, einen verlängerten PTEN-Protein-Knock-Down
mit siRNA-Molekülen
zu zeigen, die durch die beschriebene 2'-O-Methyl-Modifikation stabilisiert
sind. 48 Stunden nach Transfektion zeigte die unmodifizierte siRNA
(AB) die stärkste
Verringerung hinsichtlich des PTEN-Proteinniveaus, 120 Stunden nach
Transfektion ist jedoch die Verringerung der PTEN-Proteinexpression
mit der siRNA überlegen,
die durch alternierende 2'-O-Methylmodifikationen
stabilisiert ist (15D, vergleiche
Spur 2 mit Spuren 4, 6 und 7).
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Aus
diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass bevorzugterweise
die Startnukleotidposition der alternierenden Modifikation wichtig
zu sein scheint. Um diese Bevorzugung detaillierter zu testen, wurden
zwei zusätzliche
Serien von siRNAs synthetisiert, eine spezifisch für die Kinase
Akt1 und die andere für
p110β, was eine
der zwei katalytischen Untereinheiten von PI(3-)-Kinase ist. Die
speziellen Konstrukte sind in 16A gezeigt.
Wie daraus entnommen werden kann, wurden nur 19 nt lange siRNA-Duplexe
entweder ohne oder mit 2'-O-Methylmodifikation
an einem jeden zweiten Nukleotid verwendet. Unter Verwendung von
Akt1 als ein Zielmolekül
wurde ein wirksamer Protein-Knock-Down ebenso wie eine dramatische
Verringerung der Niveaus von Phospho-Akt mit glattendigen, unmodifizierten
siRNAs beobachtet (16A, rechte Tafel).
Aus diesen verschiedenen Versionen von Molekülen mit Modifikationen an nur
einem jeden zweiten Nukleotid war lediglich eine wirksam beim Vermitteln
von RNAi (16A, Molekül V5). Dieses
siRNA-Molekül enthielt
einen Antisense-Strang, der an dem am meisten 5'-terminal und 3'-terminal gelegenen Nukleotid modifiziert
war. Der Sense-Strang begann mit den unmodifizierten Nukleotiden
an der terminalsten Position, was zu einer Struktur führt, bei
der die modifizierten und unmodifizierten Ribonukleotide beider
Stränge
einander gegenüberliegen. Wie
erwartet war auch dieses Molekül
gegen aus dem Serum stammende Nukleasen geschützt, wie in 16B gezeigt
(Molekül
V5).
-
Interessanterweise
zeigt ein sehr ähnliches
19 nt langes siRNA-Molekül
(V5) mit Modifikationen beginnend an dem zweiten Nukleotid des Antisense-Stranges,
in dem speziell verwendeten Test keine RNA-Interferenz-Aktivierung.
Die Version V6, bei der die modifizierten Nukleotide des Antisense-Stranges
modifizierten Nukleotiden auf dem Sense- Strang gegenüberliegen, war bei diesem Experiment
ebenfalls inaktiv. Eine identische Serie aus 19 nt langen siRNA-Molekülen, die
für p110β spezifisch
waren, bestätigte
diese Beobachtung, wie in 16C dargestellt.
Wiederum war das ähnlich
modifizierte siRNA-Moleküe (V5) das
aktivste, wie angegeben durch Verringerung der Akt-Phosphorylierung,
was ein Zeichen für
eine verringerte P (I)-3-Kinaseaktivität infolge verringerter p110β-Niveaus ist. Die
verringerte Aktivität
der Moleküle
V6 könnte
durch verringerte Duplexstabilität
erklärt
werden, da die gleiche Struktur aktiv war in dem PTEN-Knock-Down-Experiment mit
21mer siRNAs. Obwohl bekannt ist, dass 2'-O-Methylmodifikationen auf beiden Strängen, die
einander gegenüberliegen,
die Stabilität
von Nukleinsäure-Duplexen
verringern wird, rührt
der Unterschied zwischen der Aktivität von siRNA-Molekülen V4 und
V5 (16B und C) wahrscheinlich nicht
von den Unterschieden der Duplexstabilität her, da die Anzahl von Basenpaarungen
von modifizierten und unmodifizierten Nukleotiden identisch ist.
Der Unterschied in der Aktivität
könnte
auf spezifischen Erfordernissen der interagierenden Proteine beruhen,
die beim Abbau der Ziel-mRNA beteiligt sind. Weiterhin kann diesen
Experimenten entnommen werden, dass die am meisten terminal gelegenen
Nukleotide des Antisense-Stranges an der 2'-OH-Gruppe ohne einen erheblichen Verlust
an Abschaltaktivität
modifiziert sein können.
-
Beispiel 12: Unterschiedliche
Schleifen-Strukturen sind funktionell bei der Vermittlung von RNA-Interferenz
-
Um
zu testen, ob RNAi-Moleküle,
bevorzugterweise synthetische RNAi-Moleküle mit selbstkomplementären Strukturen,
die Genexpression so wirksam inhibieren können, wie standardmäßige doppel-strängige siRNA-Moleküle, wurden
HeLa-Zellen mit p110β-spezifischen siRNAs
transfiziert. Die Transfektionen wurden in Platten mit 96 Näpfen oder
10 cm großen
Platten (bei einer Konfluenz von 30 bis 50%) unter Verwendung verschiedener
kationischer Lipide wie beispielsweise Oligofectamin, Lipofectamin
(Life Technologies) durchgeführt.
GeneBlocs wurden transfiziert durch Hinzugeben von vorab ausgebildeten
5 × konzentrierten
Komplexen aus GB und Lipid in Serum-freiem Medium zu Zellen in vollständigem Medium.
Das Gesamttransfektionsvolumen betrug 100 μl für Zellen, die in Platten mit
96 Näpfen
ausplattiert waren, und 10 ml für
Zellen in 10 cm Platten. Die letztendliche Lipidkonzentration betrug
0,8 bis 1,2 μg/ml,
abhängig
von der Zelldichte; die RNAi-Molekülkonzentration ist in einem
jeden Experiment angegeben.
-
Eine
Dosis-abhängige
Titration zeigte keinen signifikanten Unterschied der Wirksamkeit
von mRNA-Knock-Down, der durch das standardmäßige bimolekulare doppel-strängige 21
mer und die entsprechenden monomolekularen Moleküle erreicht wurden, wie analysiert
durch Echtzeit-PCR (Taqman) (17A). Zwei
unterschiedliche Schleifenstrukturen, eine (A)12-Schleife und eine
von HIV abgeleitete pA-Schleife, wurden parallel mit ähnlichen
Ergebnissen getestet. Ein Vergleich der Relativposition der Antisense-Sequenz
und der Schleifenstruktur ergab eine verbesserte Knock-Down-Wirksamkeit,
wenn die Antisense-Sequenz
3' zur Schleife
angeordnet ist (17B; vergleiche Konstrukt
3A, 3B und 4A, 4B).
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Beispiel 13: Studien zur
Wirksamkeit von unterschiedlichen intramolekularen Hairpin-Schleifen
und intermolekularen „Blasen"
-
Der
Einfluss verschiedener Schleifenstrukturen auf die Inhibierung von
mRNA und Proteinexpression wurde getestet. Für diese Experimente wurden
Akt1 und Akt2 als Ziele ausgewählt.
Der experimentelle Ansatz war ähnlich
dem in Beispiel 12 beschriebenen.
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Die
Verringerung von Akt1 mRNA, wie in 18A und 18B dargestellt, ebenso wie die der Akt1-Protein-Niveaus,
wie in 18C dargestellt, vollkommen
unabhängig
von der getesteten Schleifenstruktur (vergleiche Moleküle 5A, 6A,
7A, 8A) (die Struktur des getesteten RNAi-Moleküls ist jeweils unter dem Balkendiagramm
angegeben). Selbst ein Molekül,
das eine vergleichsweise unphysiologische Struktur wie beispielsweise
einen Polyethylenglycol-Linker (PEG) als eine Schleife enthielt,
verringerte die Expression von Akt1 wirksam, was anzeigt, dass die
Größe und die
Nukeotidsequenz der Schleife nicht kritisch sind (18A; Molekül 8A). Das
synthetische siRNA-Molekül,
dass für
Akt2 (9A) spezifisch ist, wurde verwendet, um auf Spezifität hin zu
kontrollieren und hatte keine Wirkung auf Akt1-Niveaus, wie in 15A gezeigt. Dieses Molekül schaltete
jedoch in wirksamer Weise die Expression von Akt2 aus (18B; 18C).
Selbst-komplementäre RNA-Moleküle mit Schleifenstrukturen
haben die Möglichkeit,
als Doppelstränge
in molekularen oder biomolekularen Strukturen unter physiologischen
Hybridisierungsbedingungen zu annelieren (18B,
Schleifen- oder Blasenstruktur). Um die Frage zu adressieren, ob
die siRNA-Moleküle
ihre Funktion durch Einnehmen einer intramolekularen Schleife oder
einer intermolekularen „Blase" (schematisch in 18B gezeigt) ausüben, wurden zwei Moleküle, die
nicht in der Lage sind, auf sich selbst zurückzufalten, transfiziert. Dieses
Strukturen enthielten Akt1- und Akt2-spezifische Sequenzen innerhalb
des gleichen Moleküls
(18B, Konstrukte 10A, 10B) und wurden
so konstruiert, dass sie dahingehend beschränkt waren, dass sie einen bimolekularen Komplex
ausbilden („Blase"). Überraschenderweise
vermittelte dieses Molekül
sowohl den Akt1- als auch Akt2-mRNA-Knock-Down, ebenso wie Protein-Knock-Down,
wenn nach dem Annelieren beider Stränge transfiziert wurde.
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Ob
Schleifen- und Blasenstrukturen tatsächlich Substrate für RNA-prozessierende
Enzyme, z. B. Dicer, sind, ist zu diesem Zeitpunkt nicht klar. Eine
kürzlich
durchgeführte
Studie von Paddison und Mitarbeitern schlägt vor, dass Hairpin-enthaltene
siRNAs stärker
von der Dicer-Aktivität
abhängen
als doppel-strängige -siRNAs.
Diese Daten, die eine RNA-Interferenz-Aktivität bei Verwendung
eines PEG-Linkermoleküls
zeigen, belegen, dass die Linkersequenz wahrscheinlich irrelevant
ist.
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