DE60225589T2

DE60225589T2 - Träger zur freisetzung von nanopartikeln

Info

Publication number: DE60225589T2
Application number: DE60225589T
Authority: DE
Inventors: Stefan Apex FRANZEN; Daniel L. Cary FELDHEIM; Alexander G. Raleigh TKACHENKO; Marisha L. Fort Collins GODEK; Joseph A. 6 10 Dabney Hall Raleigh RYAN; Miles F. Raleigh ANDERSON
Original assignee: North Carolina State University; University of California
Current assignee: North Carolina State University; University of California
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: US20080199529A1; ATE388691T1; DE60225589D1; EP1450751B1; EP1450751A4; JP2005511761A; WO2003051278A2; WO2003051278A3; ES2304467T3; US20030147966A1; EP1450751A2; US7332586B2; AU2002364927A1; CA2453417A1; EP1990040A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen für und Verfahren zum Freisetzen eines Wirkstoffs an und in Zellen. Das Verfahren verwendet insbesondere einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln als Träger zum Tragen von Proteinen, Nukleinsäuren, Protein- und Nukleinsäureanaloga, kleinen Molekülen und anderen Verbindungen an die Oberfläche einer Zelle, in das Zytoplasma einer Zelle oder in den Kern einer Zelle.
Abkürzungstabelle

ATP

Adenosintriphosphat

ADP

Adenosindiphosphat

AS

antisense

AS-ODN

antisense-Oligodesoxynukleotide

bipy

Bipyridin

cDNA

komplementäre DNA

DNA

Desoxyribonukleinsäure

dsDNA

doppelsträngige DNA

EDTA

Ethylendiamintetraessigsäure

HEPES

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

ITO

Indiumzinnoxid

IV

intravenös

KDa

Kilodalton

LB

Luria-Brühe

MES

2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure

mRNA

Messenger-RNA

NDP

Nukleotiddiphosphat

NLS

nukleäres Lokalisierungssignal

nt

Nukleotid

NTP

Nukleotidtriphosphat

ODN

Oligodesoxynukleotid

PACVD

plasmaunterstützte chemische Gasphasenabscheidung

PAGE

Polyacrylamidgelelektrophorese

PBS

phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PCR

Polymerasekettenreaktion

pI

isoelektrischer Punkt

PNA

Peptidnukleinsäure-Analogon

RES

Retikuloendotheliales System

RME

rezeptorvermittelte Endozytose

RNA

Ribonukleinsäure

SDS

Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelektrophorese

ssDNA

einzelsträngige DNA

TEM

Transmissionselektronenmikroskopie

Abkürzungen der Aminosäuren

Einbuchstabencode	Dreibuchstabencode	Name
A	Ala	Alanin
V	Val	Valin
L	Leu	Leucin
I	Ile	Isoleucin
P	Pro	Prolin
F	Phe	Phenylalanin
W	Trp	Tryptophan
M	Met	Methionin
G	Gly	Glycin
S	Ser	Serin
T	Thr	Threonin
C	Cys	Cystein
Y	Tyr	Tyrosin
N	Asn	Asparagin
Q	Gln	Glutamin
D	Asp	Asparaginsäure
E	Glu	Glutaminsäure
K	Lys	Lysin
R	Arg	Arginin
H	His	Histidin

Stand der Technik
Die Entwicklung neuer Formen Therapeutika, die Makromoleküle, wie beispielsweise Proteine oder Nukleinsäuren, als Therapeutika verwenden, hat einen Bedarf für die Entwicklung neuer und effektiver Ansätze zum Freisetzen solcher Makromoleküle an ihre entsprechenden zellulären Ziele geschaffen. Therapeutik, die entweder auf Verwendung spezifischer Polypeptid-Wachstumsfaktoren oder spezifischer Gene, um fehlende oder defekte Gene zu ersetzen oder zu ergänzen, basieren, sind Beispiele für Therapeutika, die solche neuen Systeme zur Freisetzung benötigen könnten. Therapeutika, die Oligonukleotide einschließen, die mit der DNA Wechselwirken, um die Expression eines Gens oder eines anderen Abschnitts der DNA zu modulieren, könnten ebenfalls ein neues Freisetzungssystem erfordern. Die klinische Anwendung solcher Therapien hängt nicht nur von der Zuverlässigkeit und Effizienz der neuen Freisetzungssysteme, sondern auch von ihrer Sicherheit und der Leichtigkeit, mit der die diesen Systemen zugrunde liegenden Technologien für eine großtechnische Produktion und Lagerung von Pharmazeutika und die Verteilung der therapeutischen Formulierungen angepasst werden kann, ab.
Die Gentherapie wurde zu einer zunehmend wichtigen Weise, verschiedene genetische Störungen zu behandeln. Das Potential für die Bereitstellung wirksamer Behandlungen hat intensive Bemühungen hervorgerufen, diese Technologie bei Erkrankungen anzuwenden, für die es keine wirksamen Behandlungen gab. Ein kürzlicher Fortschritt in diesem Bereich hat gezeigt, dass die Gentherapie einen signifikanten Einfluss auf nicht nur die Behandlung einzelner Genstörungen, sondern auch auf komplexere Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, haben kann. Ein wesentliches Hindernis bei der Erzielung einer effizienten Gentherapiekur war die Schwierigkeit, neue und effektive Ansätze zum Freisetzen von therapeutischen Nukleinsäuren an Zellen und intrazelluläre Ziele zu konstruieren. In der Tat sollte ein idealer Träger für die Freisetzung von Nukleinsäuren oder Proteinen in Zellen und Geweben hocheffizient sein, sicher zu verwenden sein, leicht in großen Mengen herzustellen sein und eine ausreichende Beständigkeit aufweisen, um als pharmazeutischer Träger zu Freisetzung anwendbar zu sein.
Wenn Nukleinsäuren als „Wirkstoffe" in einer Gentherapiekur verwendet werden, liegen im Wesentlichen zwei Systeme vor, die auf viralen Vektoren oder nicht-viralen Vektoren basieren, die in der Wissenschaft beschrieben sind: (1) Retro-, Adeno- und Herpesviren (oder ihre Rekombinanten) werden derzeit in vivo als virale Vektoren untersucht; und (2) Liposome und Liganden zelloberflächenspezifischer Rezeptoren werden in vivo als nicht-virale Vektoren erforscht (Wu & Wu, (1991) Biotherapy 3: 87–95; Ledley, (1993) Clin. Invest. Med. 16: 78–88). Ebenso werden nanokristalline Partikel untersucht ( U.S. Patent Nr. 5,460,831 von Kossovsky). Jeder dieser Ansätze leidet an einer Reihe von Nachteilen die einen unerwünschte Abbau in vivo und einen Mangel an Spezifität für eine gegebene Zielstruktur, zum Beispiel den Kern einer Zelle oder die Oberfläche einer Zelle, die einen bestimmten Strukturtyp exprimieren, einschließen.
Die Technologie der Nanopartikel hat Anwendung in einer Reihe von Disziplinen gefunden, wurde jedoch nur wenig in der Pharmakologie und der Freisetzung von Wirkstoffen angewendet. Die Entwicklung therapeutischer Nanopartikel wurde zum ersten Mal um 1970 herum versucht und es wurde angestrebt, dass die vorgeschlagenen Nanopartikel als Träger von Antikrebs- oder anderen Wirkstoffen fungieren (Couvreur et al., (1982) J. Pharm. Sci., 71: 790–92). Es wurden auch Versuche unternommen, Verfahren zu erläutern, durch die die Aufnahme der Nanopartikel durch die Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) minimiert würde (Couvreur et al., (1986) in Polymeric Nanoparticles and Microspheres, (Guiot & Couvreur, Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, S. 27–93). Andere Versuche verfolgten die Verwendung von Nanopartikeln für die Behandlung spezieller Erkrankungen. Siehe z. B. Labhasetwar et al., (1997) Adv. Drug. Del. Rev., 24: 63–85.
Die WO9856363 offenbart einen festen Nanopartikel für eine Freisetzung an Zielzellen, wobei der Nanopartikel ein polymeres Kation und ein Polyanion umfasst, wobei das Polyanion aus Nukleinsäuren (DNA, RNA) besteht. An die Oberfläche des Nanopartikels ist ein Polypeptid gebunden, wobei dieses Polypeptid die knob-Domäne des Adenovirus-Faserproteins umfasst, das für eine gezielte Freisetzung therapeutischer Mittel an Zellen und für eine Bindung an die Zellen geeignet ist.
In der WO9913719 ist eine Zusammensetzung beschrieben, die ein Nukleinsäuremolekül (DNA, RNA), ein konjugiertes Peptid-Nukleinsäure-(PNA)Molekül, das mit dem DNA-Molekül verbunden ist, umfasst. Dieses PNA-Molekül ist bevorzugt ein nukleäres Kernlokalisierungssignal-Peptid, das die Aufnahme in den Kern erleichtert und einen Bereich enthält, der zu dem DNA-Molekül komplementär ist. Als therapeutische Mittel werden Insulin, Interferon, Erythropoietin verwendet.
Die am 30.05.2002 veröffentlichte WO0242325 beansprucht das früheste Prioritätsdatum vom 31.10.2000 (Prioritätsdokument: 60/244,501) und zeigt eine Mikropartikelzusammensetzung, die eine polymere Matrix oder Hülle umfasst, die Nukleinsäure ferner eine Transkriptionseinheit, die auf einer für ein Polypeptid kodierenden Kodiersequenz basiert und ein nukleäres Lokalisierungssignal, das die Translokation der Nukleinsäure in den Kern begünstigt (hnRNPA-Sequenzen und das nukleäre Lokalisierungssignal SV40), umfasst.
Obwohl Nanopartikel als nützliche Werkzeuge für Systeme zur Freisetzung von Medikamenten viel versprechend sind, bleiben viele Probleme. Einige ungelöste Probleme betreffen die Kontrolle, die Auswahl und das Verhalten unterschiedlicher Partikelgrößen sowie Probleme, die die Beladung von Partikeln mit Therapeutika umgeben. Daneben blieb das Abzielen des Nanopartikels an den geeigneten Zellort problematisch. Die Konstruktion und Bereitstellung eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der diese Probleme angeht, stellt daher einen anhaltenden und lang gehegten Bedarf in der Wissenschaft dar.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln offenbart. In einer Ausführungsform umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln: (a) einen Nanopartikel; (b) einen Wirkstoff; und (c) ein nukleäres Lokalisierungssignal. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln (a) eine Vielzahl von Targeting-Mitteln; (b) ein Nanopartikelgerüst; und (c) einen Wirkstoff.
Der Wirkstoff ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus doppelsträngigen Nukleinsäure, einzelsträngigen Nukleinsäuren, chemisch modifizierten Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Vorzugsweise ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Optional kann der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ferner zwei oder mehr verschiedene Wirkstoffe umfassen. Ebenso optional kann der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln weiter ein die Biokompatibilität erhöhendes Mittel umfassen. Als weitere Option kann der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ferner eine Schutzhülle umfassen, die wenigstens einen Teil des Trägers zur Freisetzung bedeckt. In einer Ausführungsform kann die Schutzhülle den gesamten Träger zur Freisetzung, einschließlich dem (den) Wirkstoff(en) und Targeting-Mittel(n), bedecken. Die Schutzhülle kann auch ein Polymer umfassen. Die Schutzhülle kann auch ein biologisches Material umfassen. Das biologische Material kann ein Protein, Lipid, Kohlehydrat oder eine Kombination davon sein.
Es wird ein Verfahren zum Freisetzen eines Wirkstoffs in den Kern einer Zelle offenbart. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der Nanopartikel mit einem Durchmesser von 30 nm oder weniger umfasst; und (b) das In-Kontakt-Bringen einer Zielzelle mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, wodurch ein Wirkstoff in den Kern einer Zielzelle freigesetzt wird. Der Wirkstoff ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus doppelsträngigen Nukleinsäuren, einzelsträngigen Nukleinsäuren, chemisch modifizierten Nukleinsäuren, Peptid-Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es wird ein Verfahren zum Freisetzen eines Wirkstoffs in das Zytoplasma einer Zelle angegeben. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der einen Nanopartikel mit einem Durchmesser von gleich oder größer als ungefähr 30 nm umfasst; und (b) das In-Kontakt-Bringen einer Zielzelle mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln. Der Wirkstoff ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus doppelsträngigen Nukleinsäuren, einzelsträngigen Nukleinsäuren, chemisch modifizierten Nukleinsäuren, Peptid-Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es wird ein Verfahren zum Modulieren der Expression einer Zielnukleinsäuresequenz offenbart. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der einen Wirkstoff umfasst, der dazu in der Lage ist, mit einer Zielnukleinsäuresequenz, deren Expression moduliert werden soll, wechselzuwirken; (b) In-Kontakt-Bringen einer Zielzelle, die eine Zielnukleinsäuresequenz umfasst, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) Modulieren der Expression der Zielnukleinsäuresequenz durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b). Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es wird ein Verfahren zum Modulieren der Expression eines Zielproteins offenbart. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der eine einzelsträngige antisense-Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die für ein Zielprotein kodiert; (b) das In- Kontakt-Bringen einer Zielzelle, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Zielprotein kodiert, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) Modulieren der Expression des Zielproteins durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b). Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es wird ein Verfahren zum Modulieren der Transkription in einer Probe offenbart. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der einen Wirkstoff umfasst, der einen Liganden umfasst, zu dem ein Wildtyp-Transkriptionsbestandteile eine höhere Affinität als ein natürlicher Ligand des Wildtyp-Transkriptionsbestandteils hat; (b) das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die den Wildtyp-Transkriptionsbestandteil umfasst, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) das Modulieren der Transkription in der Probe durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b). Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es wird ein Verfahren zum Modulieren von RNA-Splicing in einer Probe offenbart. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das Splicing-Muster für ein Zielgen ändert; und (b) das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die das Zielgen umfasst, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) das Modulieren des RNA-Splicing in einer Probe durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b). Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es wird ein Verfahren zum Modulieren der Translation einer mRNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, offenbart. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu einer Nukleinsäuresequenz einer mRNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Protein von Interesse kodiert; (b) das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die die mRNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein von Interesse kodiert, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) das Modulieren der Translation einer mRNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b). Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst ferner bevorzugt eine Zelloberflächenerkennungssequenz. Bevorzugt ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet. Ferner umfasst der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bevorzugt einen nachweisbaren Rest.
Es ist dementsprechend eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bereitzustellen. Dieses und andere Ziele werden vollständig oder teilweise durch die vorliegende Erfindung erreicht.
Einige Aufgaben der Erfindung wurden vorher angegeben, andere Aufgaben werden beim Lesen der Beschreibung ersichtlich, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Figuren betrachtet wird, wie sie nachfolgend am besten beschrieben sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A ist die Aufnahme eines Transemissionselektronenmikroskops von Hepatozyten, die in einem Medium angezüchtet wurden, das 5 nm große Nanopartikel umfasst. Ein Bereich des Kerns ist in dem Einsatz hervorgehoben.
1B ist die Aufnahme eines Transemissionselektronenmikroskops von Hepatozyten, die in einem Medium angezüchtet wurden, das 30 nm große Nanopartikel umfasst. Ein Bereich des Zytoplasmas, einschließlich einer Vakuole, ist in dem Einsatz hervorgehoben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln als Träger zum Tragen von Proteinen, Nukleinsäuren, Protein- und Nukleinsäureanaloga, kleinen Molekülen und anderen Verbindungen zu der Oberfläche einer Zelle, in das Zytoplasma einer Zelle und/oder in den Kern einer Zelle bereit. Mit einem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln kann eine Vielzahl von Sequenzen, bevorzugt eine Vielzahl verschiedener Sequenzen, wie beispielsweise RME-Sequenzen und NLS-Sequenzen, verbunden werden. Diese Sequenzen können bei der Translokation eines Trägers über verschiedene Membranen, wie beispielsweise der Kernmembran einer Zelle oder der Außenmembran einer Zelle, helfen. Wenn Membranen und andere Strukturen, die generell die Translokation eines Trägers zu einer gegeben Position in oder auf einer Zelle hemmen, als „Schlösser" bezeichnet werden, können daher NLS- und RME-Sequenzen als „Schlüssel" bezeichnet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann daher ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln eine Vielzahl verschiedener Sequenzen oder „Schlüssel" umfassen, die es einem gegebenen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ermöglichen können, durch verschiedene Potentialbarrieren zu einer Translokation in einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen zu gelangen.
I. Definitionen
In Anlehnung an die langjährige Übereinkunft des Patentgesetzes meinen die Begriffe „ein" und „einer, eine, eines" „eines oder mehrere", wenn sie in dieser Anmeldung, einschließlich der Ansprüche, verwendet werden.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Wirkstoff" ein therapeutisches Mittel einschließlich, aber nicht beschränkt auf, chemotherapeutische Mittel, Radiotherapeutika oder radiosensibilisierende Mittel; ein Mittel zur Bildgebung; ein diagnostisches Mittel; oder ein anderes Mittel, von dem bekannt ist, dass es mit einem intrazellulären Protein, einer Nukleinsäure oder einem löslichen oder unlöslichen Liganden wechselwirkt.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Aminosäuresequenz" ein Oligopeptid, Peptid, Polypeptid oder eine Proteinsequenz und deren Fragmente und natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle. Wobei eine „Aminosäuresequenz" hierin dazu angegeben ist, um eine Aminosäuresequenz eines synthetischen Peptids oder eines natürlich vorkommenden Proteinmoleküls, einer Aminosäuresequenz und dergleichen zu bezeichnen. Der Begriff soll die Aminosäuresequenz nicht auf eine vollständige, native Aminosäuresequenz, die mit einem angegebenen Proteinmolekül verbunden ist, beschränken, sondern soll ebenso Variationen an der nativen Aminosäuresequenz umfassen.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „biologisch abbaubar" jede Struktur, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen Nanopartikel, die nach längerem Aussetzen gegenüber physiologischen Bedingungen abgebaut oder anderweitig zersetzt wird. Um biologisch abbaubar zu sein, sollte die Struktur innerhalb weniger Wochen nach Einführen in den Körper zersetzt werden. Brushit ist ein bevorzugtes biologisch abbaubares Material für Nanopartikel.
Wie sie hierin verwendet werden, sind die Begriffe „extrazelluläres Targeting-Mittel" und „Zelloberflächenerkennungssequenz" gegeneinander austauschbar und bezeichnen ein kleines Molekül oder eine Proteinsequenz, die an einen oder mehrere Rezeptoren, die auf der Oberfläche einer bestimmten Zelle vorhanden sind, erkannt werden und an diese(n) binden. Zelloberflächenerkennungssequenzen können HIV-Hüllproteine (gp160, 41, 120), Coronavirus-Hüllproteine, EBV-Hüllproteine (gp350) und Peptide einschließen. Andere charakteristische, jedoch nicht einschränkende Zelloberflächenerkennungssequenzen können Kohlenhydrate und Lipide, Kohlenhydrate, Peptidnukleinsäuren, Morpholino-Oligonukleotide und Polymere umfassen. Der Begriff „Zelloberflächenerkennungssequenz" soll jede Sequenz oder jedes Molekül umfassen, dass von einem Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt und/oder an diesen gebunden wird. Es ist bevorzugt, jedoch nicht erforderlich, dass eine „Zelloberflächenerkennungssequenz", die von einem Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt und/oder gebunden wird, zu einer rezeptorvermittelten Endozytose (RME) führt. Eine Liste charakteristischer Reste, die als Targeting-Mittel für eine Internalisierung durch RME verwendet werden kann, ist in Tabelle 1 dargestellt.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „chemische Modifikation" eine Änderung eines ersten Rests durch kovalentes, nicht-kovalentes oder ionisch Binden eines zweiten Rests an den ersten Rest. Eine chemische Modifikation kann das Anfügen eines nachweisbaren Rests an ein Peptid oder Protein umfassen.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Nachweisen” das Bestätigen des Vorhandenseins einer Zieleinheit durch Beobachten des Erscheinens eines nachweisbaren Signals, wie beispielsweise eines elektrischen, radiologischen oder spektroskopischen Signals, das ausschließlich in der Gegenwart der Zieleinheit erscheinen wird. Der Begriff umfasst die Verwendung von Elektrophoresetechniken und Blotting-Techniken, einschließlich Northern, Southern, Western und Far Western Blot. Der Begriff „Nachweisen" schließt auch die Verwendung von Mikroskopietechniken, wie beispielsweise Transmissionselektronenmikroskopie, ein. Das „Nachweisen" eines Ereignisses oder das Vorhandensein einer Verbindung kann direkt oder indirekt, zum Beispiel durch Monitoring der Transkriptionsrate zum Nachweisen des Vorhandenseins von Transkriptionsfaktoren, erfolgen. De Begriff „Nachweisen" meint daher weitgehend das Identifizieren des Vorliegens oder Nicht-Vorliegens eines Ereignisses, einer Verbindung, eines Moleküls usw.
Wie er hierin verwendet wird, wird der Begriff „Gen" der Einfachheit halber verwendet und bezeichnet eine für ein funktionelles Protein, Polypeptid oder Peptid kodierende Einheit. Wie von Fachleuten verstanden wird, schließt dieser funktionelle Begriff sowohl genomische Sequenzen als auch cDNA-Sequenzen ein.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Gold" das Element 79, das das chemische Symbol Au besitzt; der Begriff schließt spezifisch jede Nebenbedeutung, die mit der Farbe oder anderen kolorimetrischen Eigenschaften in Verbindung steht, aus.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Homologie" einen Grad von Komplementarität. Es kann eine partielle Homologie oder vollständige Homologie (z. B. Identität) vorliegen. Eine Sequenz mit partieller Komplementarität, die zumindest teilweise verhindert, dass eine identische Sequenz an eine Zielnukleinsäure hybridisiert, kann als „im Wesentlichen homolog" angesehen werden. Die Hemmung der Hybridisierung der vollständig komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann unter Verwenden eines Hybridisierungs-Assays (Southern oder Northern Blot, Lösungshybridisierung und dergleichen) unter den Bedingungen einer geringen Stringenz untersucht werden. Eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder Hybridisierungssonde wird unter den Bedingungen einer geringen Stringenz um die Bindung einer vollständig homologen Sequenz an die Zielsequenz konkurrieren und diese hemmen. Dies soll nicht heißen, dass die Bedingungen einer geringen Stringenz so sind, dass eine unspezifische Bindung zugelassen wird; die Bedingungen einer geringen Stringenz erfordern, dass die Bindung der beiden Sequenzen eine spezifische (d. h. selektive) Wechselwirkung sein muss. Das Nicht-Vorhandensein einer unspezifischen Bindung kann durch die Verwendung einer zweiten Zielsequenz, der sogar ein partieller Grad von Komplementarität (z. B. weniger als ungefähr 30% Identität) fehlt, getestet werden. Bei Nicht-Vorhandensein einer unspezifischen Bindung wird die Sonde nicht an die zweite, nicht-komplementäre Zielsequenz hybridisieren.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Hybridisierung" die Bindung einer Sondenprobe an eine Zielprobe. Die Sondenprobe kann ein Molekül umfassen, an das ein nachweisbarer Rest gebunden wurde, wodurch es möglich wird, das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein einer Sondenprobe nachzuweisen.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „wechselwirken" nachweisbare Wechselwirkungen zwischen Molekülen, wie sie beispielsweise unter Verwenden von zum Beispiel Transmissionselektronenmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie, nachgewiesen werden können. Der Begriff „wechselwirken" soll auch „bindende" Wechselwirkungen zwischen Molekülen einschließen. Wechselwirkungen können zum Beispiel Nukleinsäure-Nukleinsäure, Protein-Protein oder Protein-Nukleinsäure in der Natur sein.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „isoliert" Oligonukleotide, die im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren, Proteinen, Lipiden, Kohlehydraten oder anderen Materialien, mit denen sie verbunden sein können, sind, wobei eine solche Verbindung entweder in einem zellulären Material oder in einem Synthesemedium erfolgt. Der Begriff kann auch auf Polypeptide angewendet werden, in denen das Polypeptid im Wesentlichen frei von Nukleinsäuren, Kohlehydraten, Lipiden und anderen unerwünschten Polypeptiden ist.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „markiert" die kovalente, nicht-kovalente oder ionische Verknüpfung eines zum Nachweis mittels elektrochemischen, spektroskopischen, radiologischen oder anderen Verfahren fähigen Rests an ein Sondenmolekül.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „modifiziert" eine Änderung von dem normalerweise vorkommenden Zustand eines Rests. Ein Rest kann durch Entfernen einzelner chemischer Einheiten oder durch Anfügen einzelner chemischer Einheiten modifiziert werden. Der Begriff „modifiziert" umfasst nachweisbare Markierungen sowie solche Einheiten, die als Reinigungshilfen angefügt wurden. Jede Variation vom normalerweise vorkommenden Zustand, ungeachtet des Grades, wird vom Begriff „modifiziert" umfasst.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „modulieren" einen Anstieg, eine Abnahme oder eine andere Änderung irgendeiner oder aller chemischen und biologischen Aktivitäten oder Eigenschaften einer Probe, die durch eine Nukleinsäuresequenz, ein Peptid oder ein kleines Molekül vermittelt werden. Der Begriff „Modulation", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet sowohl eine Hochregulierung (d. h. Aktivierung oder Stimulation) als auch eine Herunterregulierung (d. h. Hemmung oder Unterdrückung) einer Reaktion oder Eigenschaft.
Wie er hierin verwendet wird, besitzt der Begriff „Mutation" seinen üblichen Bedeutungsumfang und bezeichnet eine ererbte, natürlich vorkommende oder eingeführte Änderung in einer Nukleinsäure oder einer Polypeptidsequenz und wird in diesem Sinn verwendet, wie Fachleuten allgemein bekannt ist.
Wie er hierin verwendet wird, werden die Begriffe „nano", „nanoskopisch", „in der Größenordnung von Nanometern", „nanostrukturiert", „in Maßstab von Nanometern", „DNA-Nanopartikelkomplexe" und deren grammatikalische Ableitungen synonym und gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen Nanopartikel, Verbunde von Nanopartikeln und hohle Nanokapseln mit einem Durchmesser von weniger oder gleich ungefähr 100 Nanometern (nm), bevorzugt einem Durchmesser von weniger als ungefähr 30 Nanometern und besonders bevorzugt einem Durchmesser von weniger als ungefähr 10 Nanometern. Ein Nanopartikel kann aus jedem beliebigen Material hergestellt sein. Ein bevorzugter Nanopartikel ist aus einem Halbleitermaterial oder Metall und besonders bevorzugt aus Gold, TiO₂ oder TiO₂ enthaltenden Materialien hergestellt. Biologisch abbaubare Materialien sind ebenso bevorzugt, z. B. Polypeptide. Die Begriffe können nicht nur den Metallbestandteil eines Nanopartikels, sondern auch den Verbund aus Metall und anderen Bestandteilen bezeichnen.
Der Begriff „Nanopartikel", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Trägerstruktur, die biokompatibel mit und ausreichend widerstandsfähig gegen chemische und/oder physikalische Zerstörung durch die Umgebung der Verwendung, so dass eine ausreichende Menge der Nanopartikel nach der Injektion in den Blutstrom, die intraperitoneal oder oral oder mit einer in vitro-Probe inkubiert gegeben wurde, im Wesentlichen intakt bleiben, um so in der Lage zu sein, den Kern einer Zelle oder eine andere Zellstruktur zu erreichen. Wenn das Medikament in der Form in eine Zelle eindringen kann, in der er an die Nanopartikel adsorbiert ist, müssen die Nanopartikel auch ausreichend intakt bleiben, um in die Zelle eindringen zu können. Ein biologischer Abbau des Nanopartikels ist während des Eintritts in den Zellkern zulässig. Nanopartikel können feste kolloidale Partikel mit einer Größe von 1 bis 1000 nm sein. Ein Nanopartikel kann einen beliebigen Durchmesser von weniger als oder gleich 1000 nm, einschließlich 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500 und 750 nm haben. Medikamente, Wirkstoffe, bioaktive oder andere relevante Materialien können mit den Nanopartikeln inkubiert werden, wodurch die an den Nanopartikel adsorbiert oder mit diesem verknüpft werden.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Nanopartikelmetallbestandteil" einen Bestandteil aus einem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, an den ein nukleäres Kernlokalisierungssignal, Medikamente, bioaktive und andere relevante Materialien gebunden sind. Üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, umfasst ein Nanopartikelmetallbestandteil einen ein annähernd kugelförmiges Metallatom umfassenden Rest. Bevorzugt ist der Nanopartikelmetallbestandteil ein elementares Metall oder ein Halbleitermaterial, wie beispielsweise ein Gold- oder TiO₂-Partikel.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „nukleäres Lokalisierungssignal" eine Aminosäuresequenz, von der bekannt ist, dass sie in vivo direkt ein in dem Zytoplasma einer Zelle angeordnetes Protein über die Kernmembran und in den Kern einer Zelle leitet. Ein nukleäres Lokalisierungssignal kann auch auf die Außenfläche einer Zelle abzielen. Ein nukleäres Lokalisierungssignal kann daher den Rest, mit dem es verbunden ist, zu der Außenseite einer Zelle und zu dem Kern einer Zelle leiten. Solche Sequenzen können von beliebiger Größe und Zusammensetzung, zum Beispiel mehr als 25, 25, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5 oder 4 Aminosäuren, sein, werden jedoch vorzugsweise wenigstens vier bis acht Aminosäuresequenzen umfassen, von denen bekannt ist, dass sie als nukleäres Lokalisierungssignal (NLS) fungieren.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „pharmazeutisch annehmbar" und dessen grammatikalische Variationen, soweit sie sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, dass die Materialien dazu in der Lage sind, an oder bei einem Wirbeltierpatienten verabreicht zu werden, ohne unerwünschte physiologische Effekte, wie beispielsweise Übelkeit, Schwindel, Magenstörungen, Fieber und dergleichen zu erzeugen.
Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „Polypeptid, „Protein", „Genprodukt" und „Peptid" gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen jedes Polymer, das eine der 20 Proteinaminosäuren, ungeachtet ihrer Größe, umfasst. Obwohl ein „Protein" oft in Bezug auf relativ große Polypeptide verwendet wird und ein „Peptid" oft in Bezug auf kleine Polypeptide verwendet wir, überschneidet sich die Verwendung dieser Begriffe in der Wissenschaft und variiert. Der Begriff „Polypeptid", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet, soweit es nicht anders angegeben ist, Peptide, Polypeptide und Proteine. Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „Protein", „Polypeptid" und „Peptid" hierin, wenn sie ein Genprodukt bezeichnen, gegeneinander austauschbar verwendet.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Sequenzieren" das Bestimmen der angeordneten linearen Sequenz von Nukleinsäuren oder Aminosäuren einer Zielprobe aus DNA oder Peptiden (Proteinen) unter Verwenden von in der Wissenschaft bekannten manuellen oder automatisierten Labortechniken.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „kleines Molekül" ein Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als oder gleich 5000 Dalton.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „im Wesentlichen rein", dass das Polynukleotid oder Polypeptid im Wesentlichen frei von den Sequenzen und Molekülen, mit denen es in seinem natürlichen Zustand verbunden ist, und solchen Molekülen, die bei dem Isolierungsverfahren verwendet werden, ist. Der Begriff „im Wesentlichen frei" meint, dass die Probe zu wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 70%, besonders bevorzugt 80% und ganz besonders bevorzugt 90% frei von den Materialien und Verbindungen ist, mit denen es in der Natur verbunden ist.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Targeting-Mittel" jedes Mittel mit der Fähigkeit, einen mit dem Targeting-Mittel verbundenen Rest zu der Oberfläche einer Zelle oder zu der Oberfläche eines bestimmten Typs von Zelle oder zu dem Kern einer Zelle zu leiten. Ein Targeting-Mittel kann Proteine, Peptide, kleine Moleküle, Oligonukleotide, Morpholino-Oligonukleotide und Peptidnukleinsäuren umfassen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein Targeting-Mittel kann jede Größe aufweisen, solange es seine Fähigkeit behält, einen mit dem Targeting-Mittel verbundenen Rest zu der Oberfläche einer Zelle oder zu der Oberfläche eines bestimmten Typs von Zelle zu leiten.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „therapeutisches Mittel" jedes Mittel mit einem therapeutischen Effekt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Chemotherapeutika, Toxine, Radiotherapeutika oder radiosensibilisierende Mittel. Von dem Begriff werden auch Vektoren für eine Gentherapie, antisense-Nukleinsäurekonstrukte und Transkriptionsfaktor-Lockmittel umfasst.
Wie er hierin verwendet wird, bezeichnet der Begriff „Transkriptionsfaktor" ein Polypeptid, das an der Transkription von DNA beteiligt ist. Transkriptionsfaktoren können, müssen aber nicht, an DNA binden. Ein Transkriptionsfaktor kann als Reaktion auf einen äußeren Reiz funktionieren oder die Wirkung eines Transkriptionsfaktors kann konstitutiv sein.
Wie sie hierin verwendet werden, werden die Begriffe „Transkriptionsfaktor-Lockmittel" und „Lockmittel" gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen Moleküle, die an Transkriptionsfaktoren binden oder mit diesen Wechselwirken und/oder deren Bindung an native Enhancer-Sequenzen hemmen. Lockmittel schließen Nukleinsäuresequenzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Oligonukleotide, die dem nativen Enhancer entsprechen (d. h. identisch oder im Wesentlichen identisch zu diesem sind), ein. Solche Oligonukleotide schließen: einzelsträngige palindromische Oligonukleotide, die eine oder mehrere Wiederholungen der Enhancer-Sequenz umfassen; sense- und antisense-Oligonukleotide, die eine oder mehrere Wiederholungen der Enhancer-Sequenz umfassen; Oligonukleotide, die Haarnadelstrukturen bilden, so dass eine doppelte Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor erzeugt wird; und ein oder mehrere Oligonukleotide, die eine kreuzförmige Struktur bilden, so dass eine oder mehrere Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor erzeugt werden; und doppelsträngige DNA-Sequenzen, die eine höhere Affinität für eine genomische Bindungsstelle eines Transkriptionsfaktors als die natürliche DNA-Sequenz besitzen, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Wie er hierin verwendet wird, meint der Begriff „Wildtyp" die natürlich vorkommende Form eines Proteins oder einer Nukleinsäuresequenz. Der Begriff wird nicht dazu verwendet, eine Ausgangslinie zu bezeichnen, bei der eine Mutation etabliert wird. Der Begriff „Wildtyp" soll die Form eines Proteins oder einer Nukleinsäuresequenz beschreiben, wie sie am häufigsten in der Natur gefunden wird.
II. Allgemeine Betrachtungen
Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil die Regulierung und Modulation der Genexpression. Die Genexpression kann durch Anordnen eines fremden DNA- oder RNA-Oligonukleotids (oder eines Analogons, wie beispielsweise einer Phosphorthionat-DNA/-RNA) in der Zelle für den Zweck (a) des Einbaus in das Genom; (b) der Expression eines Gens (das manchmal als „transiente Transfektion" („vorübergehende Transfektion") betrachtet wird; (c) des Änderns der Konzentrationen regulatorischer Proteine (wobei ein Träger als Transkriptionsfaktor-Lockmittel fungieren kann); (d) des Änderns des RNA-Splicing; (e) des Bindens an Messenger-RNA in dem Zytoplasma; (f) von RNA-Interferenz oder (g) des Änderns der Expression eines DNA-Abschnitts durch Induzieren der Bildung nicht-transkribierbarer Strukturen, wie beispielsweise einer Tripelhelix reguliert werden. Die Strategie für (a), (b) und (g) beinhaltet allgemein die Freisetzung eines relativ langen, doppelsträngigen DNA-Oligomers in den Kern. Die Strategie für (c) bis einschließlich (g) kann ein kurzes DNA-Oligomer beinhalten, das ein Operator (d. h. eine DNA-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie als Bindungsstelle fungiert) für ein bestimmtes regulatorisches Protein ist.
Die Strategie für (d) und (e) kann RNA, DNA oder Analoga, wie beispielsweise Nukleinsäuren und Morpholino-DNA/RNA-Oligonukleotide sowie die Verwendung von antisense-Oligonukleotiden einschließen. Bei der Durchführung von antisense-Strategien gab es jedoch viele Schwierigkeiten. Heutzutage wird vermutet, dass dies möglicherweise mit einem Problem der Freisetzung zusammenhängt, oder alternativ, dass die Zelle einen Mechanismus besitzt, um eine Verringerung der Konzentration einer bestimmten Nachricht zu überwinden. Auf jeden Fall ist die Freisetzung von Oligonukleotiden in den Kern noch ein Erfordernis bei den Strategien (a) bis einschließlich (d).
Bei den Strategien (e) und (f) könnte es lediglich erforderlich sein, ein Oligonukleotid in das Zytoplasma freizusetzen, dies wird jedoch davon abhängen, wie das Oligonukleotid abgefangen wird. Folglich spielt die kontrollierte Freisetzung der Oligonukleotide eine Schlüsselrolle für das Verständnis des Mechanismus und des Ausführens einer Steuerung der Genexpression. Die vorliegende Erfindung geht das historische antisense-Problem direkt an.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Regulierung und/oder Störung der Genexpression. Dies ist sowohl für Forschungszwecke als auch für therapeutische Anwendungen von Nutzen. Die Freisetzung ist ein Haupthindernis bei der Verwendung von Oligonukleotiden und chemisch modifizierten Oligonukleotiden für diese Anwendungen. Um eines gewünschten Ergebnis zu erreichen, können Nanopartikel verschiedener Zusammensetzungen verwendet werden. Es können Materialien, wie beispielsweise Titan, Titandioxid, Zinn, Zinnoxid, Silizium, Siliziumdioxid, Eisen, Eisen(III)oxid, Silber, Nickel, Gold, Kupfer, Aluminium und andere Materialien verwendet werden, wobei Gold jedoch ein bevorzugtes Material ist. Nanopartikel aus Gold besitzen verschiedene Vorteile. Zunächst bieten Nanopartikel aus Gold die Fähigkeit, leicht die Größe von Nanopartikeln und, wie unten erläutert wird, eine subzelluläre Lokalisierung zu regulieren. Daneben ist die Synthese solcher Nanopartikel einfach und es sind viele in der Wissenschaft bekannte Techniken verfügbar.
Nanopartikel können in geeigneter Weise mit bekannten Verfahren, einschließlich einer Emulsionspolymerisation in einer kontinuierlichen wässrigen Phase, einer Emulsionspolymerisation in einer kontinuierlichen organischen Phase, einer Grenzflächenpolymerisation, einer Abscheidung aus Lösungsmitteln, einer Verdampfung aus Lösungsmitteln, der Auflösung einer organischen Polymerlösung, der Vernetzung wasserlöslicher Polymere in einer Emulsion, der Auflösung von Makromolekülen und der Vernetzung von Kohlehydraten, hergestellt werden. Diese Herstellungsverfahren können mit einem breiten Bereich von Materialien durchgeführt werden. Metallatome und Strukturen, die Metallatome umfassen, können auch als effektive Nanopartikel dienen. Die Nanopartikel können fest sein oder eine hohle Struktur umfassen, die ein Material enthalten kann.
Ein Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung kann eines oder mehrere geeignete Oligonukleotide umfassen, die mit einem Nanopartikel verbunden sind. Als nächstes werden ein nukleäres Lokalisierungssignal oder andere Lokalisierungspeptide, die beim Transport und Leiten des Nanopartikels zu dem Kern helfen werden, mit dem Nanopartikel verbunden. Die Größe des Nanopartikels kann dazu verwendet werden, den Transport zu dem Kern zu verhindern, wenn dies erforderlich ist. Schließlich können geeignete Proteine auch auf der Oberfläche des Partikels lokalisiert sein. Geeignete Proteine können Ligasen, Restriktionsenzyme oder andere DNA verarbeitende Enzyme, die für eine gegebene Anwendung von Nutzen sind, umfassen. Die Lokalisierung und Wirkung des Trägers zur Freisetzung kann dann unter Verwenden von Transmissionselektronenmikroskopie, Raman-Mikroskopie, Konfokalmikroskopie und anderer analytischer Techniken zum Bestimmen der Konzentration und Lokalisierung der aktiven Nanopartikel in der Zelle identifiziert werden. Selbst Träger zur Freisetzung, die Nanopartikel umfassen, die so klein wie 5 nm sind, können unter Verwenden von einer oder mehreren der obigen analytischen Techniken identifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt daher einen neuen Ansatz zum Lösen der Probleme von Nanopartikeln als Träger zur Freisetzung von Medikamenten, auf die man in der Wissenschaft stößt, bereit. Die vorliegende Erfindung offenbart insbesondere Nanopartikel, die nicht notwendigerweise eine biologisch wirksame Struktur einschließen, sondern eher als Gerüst für die biologisch wirksame Struktur dienen, die mit der Oberfläche des Nanopartikels verknüpft werden soll. Signifikanter Weise können die Nanopartikel der vorliegenden Erfindung auch ein nukleäres Lokalisierungssignal umfassen, das ein therapeutisches Mittel zu dem Kern einer Zelle leitet. Bis zur Offenbarung der vorliegenden Erfindung wurden nukleäre Lokalisierungssignale nicht dazu verwendet, einen Nanopartikel über sowohl die Plasmamembran als auch die Kernmembran zu leiten.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Sequenzen mit einem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln verbunden sein. Es können auch verschiedene Sequenzen, wie beispielsweise RME-Sequenzen, mit einem Träger verbunden sein. Diese weiteren Sequenzen können bei der Translokation eines Trägers über verschiedene Membranen, wie beispielsweise die Kernmembran einer Zelle oder der Außenmembran einer Zelle, helfen. Wenn Membrane und andere Strukturen, die allgemein die Translokation eines Trägers zu einer gegebenen Position in oder an einer Zelle hemmen, als „Schlösser" bezeichnet werden, können daher NLS- und RME-Sequenzen als „Schlüssel" bezeichnet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl verschiedener Sequenzen oder „Schlüssel" umfassen, die einem gegebenen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ermöglichen können, durch verschiedene Potentialbarrieren zu einer Translokation zu gelangen und zum Abzielen auf eine Vielzahl verschiedener Zelltypen dienen können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der bei einer Vielzahl von Patienten, einschließlich warmblütiger Tiere, insbesondere Säugetiere, einschließlich Menschen, Hunden, Katzen und anderen kleinen Tieren und Tieren auf dem Bauernhof, verwendet werden kann. Daneben können die Nanopartikel der vorliegenden Erfindung bei prokaryotischen und eukaryotischen Mikroorganismen und in vitro-Kulturen verwendet werden. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung kann als diagnostisches Mittel bei allen obigen Patienten sowie bei der Funktion eines therapeutischen Mittels verwendet werden. Es besteht keine Einschränkung hinsichtlich des Typs der biologisch wirksamen Struktur des Patienten, in den ein Nanopartikel der vorliegenden Erfindung eingebracht werden kann. Siehe z. B. die U.S. Patente Nr. 5,783,263 und 6,106,798 . Siehe auch, Colloidal Drug Delivery Systems, (1994) (Kreuter, Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., New York, S. 219–342; Kreuter, (1994) Eur. J. Drug Metab. Ph. 3: 253–56.
IV. Auswahl und Herstellung eines zielbaren Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln
Ein zielbarer Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt wenigstens drei Bestandteile: einen Nanopartikel; eines oder mehrere Targeting-Mittel (z. B. „Schlüssel", wie beispielsweise nukleäre Lokalisierungssignale und auf die Zelloberfläche abzielende Signale [Zelloberflächen-Targeting-Signale]) und einen oder mehrere Wirkstoffe. Der Wirkstoff kann einer oder mehrere eines beliebigen chemischen Rests, zum Beispiel, eine Peptidsequenz, ein einzelsträngiges Nukleinsäureoligomer, ein doppelsträngiges Nukleinsäureoligomer, eine Peptid-Nukleinsäure oder ein kleines Molekül sein. Diese drei Bestandteile werden zubereitet und miteinander verbunden, um als Träger zur Freisetzung zu dienen, der über das nukleäre Lokalisierungssignal zu dem Kern einer Zelle geleitet werden kann. Wirkstoffe und nukleäre Lokalisierungssignale können unter Verwenden von Primern oder Templaten, die vorher mit dem Nanopartikel verbunden wurden, synthetisiert werden. Das nukleäre Lokalisierungssignal steuert die Translokation des Trägers zur Freisetzung zu dem Kern einer Zelle, woraufhin der Wirkstoff mit einem oder mehreren Proteinen oder Nukleinsäuren Wechselwirken kann, um einen gewünschten Effekt zu ermöglichen. Wenn ein größerer Nanopartikel, zum Beispiel größer oder gleich ungefähr 30 nm, ausgewählt wird, wird der Träger zur Freisetzung zu dem Zytoplasma einer Zelle transloziert werden.
Ein zielbarer Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung kann ferner ein extrazelluläres Targeting-Mittel umfassen. In dieser Ausführungsform kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln zwei Targeting-Signale umfassen. Erstens kann ein Targeting-Mittel ausgewählt werden, das einen Träger zur Freisetzung zu der Oberfläche einer Zielstruktur, die das ausgewählte Targeting-Mittel erkennt, steuern kann. Zweitens kann ein nukleäres Lokalisierungssignal eingeschlossen sein, das einen Träger zur Freisetzung zu dem Kern einer Zielstruktur steuern wird.
IV. A Auswahl und Herstellung eines Nanopartikels
Es gibt keine Beschränkungen hinsichtlich der physikalischen Parameter eines Nanopartikelbestandteils der vorliegenden Erfindung, obwohl die Konstruktion eines Trägers zur Freisetzung, wenn es geeignet ist, die Biokompatibilität des Trägers zur Freisetzung berücksichtigen sollte. Die physikalischen Parameter eines Nanopartikelträgers können mit dem gewünschten Effekt optimiert werden. die Auswahl der Größe, der Form und des Materials zu steuern. Bevorzugte Partikelgrößen für den Transport zum Kern einer Zelle liegen in der Größenordnung von 5 nm, obwohl, wie unten erörtert wird, größere Partikel für eine gegebene Anwendung gewünscht sein können. Daneben werden Partikel, die einen Durchmesser von weniger als ungefähr 25 nm aufweisen, für eine Verwendung beim Abzielen auf den Kern bevorzugt, um den Eintritt in den Kern durch eine Pore des Kerns zu ermöglichen. (Feldherr & Akin, (1990) Electron Microsc. Rev. 3 (1): 73–86; Feldherr et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 11002–5; Feldherr & Akin, (1999) J. Cell Sci. 112: 2043–48; Feldherr & Akin, (1994) Exp. Cell Res. 215: 206–10).
Der Nanopartikel, der auch als Gerüst bezeichnet werden kann, eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln kann eine Vielzahl anorganischer Materialien umfassen, die Metalle, Halbleitermaterialien oder Keramiken einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Bevorzugte, auf Metall basierende Verbindung für die Herstellung von Nanopartikeln schließen Titan, Titanoxid, Zinn, Zinnoxid, Silizium, Siliziumdioxid, Eisen, Eisen(III)oxid, Silber, Gold, Kupfer, Nickel, Aluminium, Stahl, Cobalt-Chrom-Legierungen, Cadmium (vorzugsweise Cadmiumselenid) und Titanlegierungen ein. Bevorzugte keramische Materialien schließen Brushit, Tricalciumphosphat, Aluminiumoxid, Siliziumoxid und Zirkoniumoxid ein. Der Nanopartikel kann aus organischen Materialien, einschließlich Kohlenstoff (Diamant) hergestellt werden. Bevorzugte Polymere schließen Polystyrol, Siliziumgummi, Polycarbonat, Polyurethane, Polypropylene, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyester, Polyether und Polyethylen ein. Biologisch abbaubare, Biopolymer- (z. B. Polypeptide, wie beispielsweise BSA, Polysaccharide usw.), andere biologische Materialien (z. B. Kohlenhydrate) und/oder polymere Verbindungen sind ebenso zur Verwendung als Nanopartikelgerüst geeignet. Aufgrund seiner allgemein bekannten Reaktivitätsprofile und biologischen Inertheit wird insbesondere Gold bevorzugt.
Nanopartikel, die die obigen Materialien umfassen und Durchmesser von weniger als 1.000 Nanometer aufweisen, sind kommerziell erhältlich oder können durch fortschreitende Keimbildung in Lösung (z. B. durch eine Kolloid-Reaktion) oder durch verschiedene Prozesse zur physikalischen und chemischen Dampfabscheidung, wie beispielsweise Sputter-Abscheidung, hergestellt werden. Siehe z. B. Hayashi, (1987) Vac. Sci. Technol. Juli/August 1987, A5 (4): 1375–84; Hayashi (1987) Physics Today, Dezember 1987, S. 44–60; MRS Bulletin, Januar 1990, S. 16–47.
Alternativ dazu können Nanopartikel unter Verwenden von HAuCl₄ und einem Citrat reduzierenden Mittel unter Verwenden von in der Wissenschaft bekannten Verfahren hergestellt werden. Siehe z. B. Marinakos et al., (1999) Adv. Mater. 11: 34–37; Marinakos et al., (1998) Chem. Mater. 10: 1214–19; Enustun & Turkevich, (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 3317. Zinnoxidnanopartikel mit einer (in H₂O) dispergierten Aggregatpartikelgröße von ungefähr 140 nm sind kommerziell von Vacuum Metallurgical Co., Ltd. von Chiba, Japan, erhältlich. Andere kommerziell erhältliche Nanopartikel mit verschiedenen Zusammensetzungen und Größenbereichen sind zum Beispiel von Vector Laborstories, Inc. aus Burlingame, Kalifornien erhältlich. Biologisch abbaubare, keramische und polymere Materialien für Nanopartikel werden Fachleuten bekannt sein und können eine biologisch abbaubare Zusammensetzung umfassen.
Neben Sputter-Abscheidung, ist die plasmaunterstützte chemische Dampfabscheidung (PACVD) eine weitere Technik, die zum Herstellen geeigneter Nanopartikel verwendet werden kann. Eine PACVD funktioniert bei relativ hohen Atmosphärendrücken (in der Größenordnung von einem Torr und mehr) und ist zum Erzeugen von Partikeln mit Durchmessern von ungefähr 1000 Nanometern und weniger nützlich. Zum Beispiel können Aluminiumnitridpartikel mit Durchmessern von weniger als 1000 Nanometern mittels PACVD unter Verwenden von Al(CH₃)₃ und NH₃ als Recktanten synthetisiert werden. Das PACVD-System beinhaltet üblicherweise ein horizontal angebrachtes Quarzrohr und damit verbundene Pumpsysteme und Systeme für die Gaszufuhr. Ein Suszeptor ist in der Mitte des Quarzrohrs angeordnet und wird unter Verwenden einer 60 kHz-Radiofrequenzquelle beheizt. Die synthetisierten Aluminiumnitridpartikel werden an den Wänden des Quarzrohrs gesammelt. Gewöhnlich wird Stickstoffgas als Träger für Al(CH₃)₃ verwendet. Das Verhältnis von Al(CH₃)₃ zu NH₃ in der Reaktionskammer wird durch Variieren der Fließgeschwindigkeiten des N₂/Al(CH₃)₃- und NH₃-Gases in die Kammer gesteuert. Allgemein wird in der Reaktionskammer ein konstanter Druck von 10 Torr aufrechterhalten, um eine Abscheidung und Bildung der ultrafeinen Aluminiumnitridpartikel bereitzustellen. PACVD kann zum Herstellen einer Vielzahl anderer geeigneter biologisch abbaubarer Nanopartikel verwendet werden.
Die Größe eines Nanopartikels kann eine wichtige Überlegung darstellen. Es wird beobachtet, dass größere Nanopartikel, in der Größenordnung von mehr als oder gleich ungefähr 30 nm, in Zellen eindringen, jedoch nicht über die Kernmembran in den Kern einer Zelle transloziert werden, wie in 1B zu sehen ist. Vermutlich steht dieser Effekt mit der Größe des Nanopartikels in Verbindung, da 5 nm große Nanopartikel die Kernmembran überqueren und in den Kern transloziert werden, wie in 1A zu sehen ist. Die Auswahl einer geeigneten Größe des Trägers zur Freisetzung wird daher wichtig sein, bietet jedoch auch eine weitere Stufe der Zielbarkeit (der Fähigkeit, auf ein Target gerichtet zu werden) und ermöglicht die Konstruktion und Verwendung von Nanopartikeln, die Wirkstoffe tragen, die in dem Zytoplasma und nicht in dem Kern positioniert werden müssen.
IV.B. Auswahl und Herstellung eines Wirkstoffs
Nach der Auswahl und Herstellung eines Nanopartikels, der mit wenigstens einem nukleären Lokalisierungssignal und vorzugsweise einem weiteren Targeting-Mittel verknüpft wurde, wird ein gewünschter Wirkstoff ausgewählt und hergestellt. Geeignete Wirkstoffe können jedes beliebige kleine Molekül, jedes beliebige Protein oder jede beliebige Nukleinsäuresequenz umfassen und die Auswahl wird durch die angestrebte Anwendung des Trägers zur Freisetzung gesteuert. Nachstehend werden eingehend verschiedene Anwendungen von Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung erörtert und schließen eine Gentherapie, die Modulation der Genexpression, das Ändern des RNA-Splicing und die Modulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen ein. Geeignete Wirkstoffe werden einem Fachmann bei Durchsicht der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein und werden auf ein gewünschtes Versuchsergebnis oder klinisches Ergebnis ausgewählt werden.
Es ist auch ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bereitzustellen, der zwei oder mehrere verschiedene Wirkstoffe, z. B. 2, 3, 4, 5 oder eine andere gewünschte Anzahl an verschiedenen Wirkstoffen umfasst. In Abhängigkeit von den verwendeten Targeting-Sequenzen kann daher die Freisetzung verschiedener Wirkstoffe an der gleichen Position in der Zelle oder in einem Gewebe oder an zwei oder mehr verschiedenen Positionen in einer Zelle oder in einem Gewebe ausgeführt werden.
Es kann jede beliebige Kombination der hierin offenbarten Wirkstoffe bereitgestellt werden. Zum Beispiel kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der ein therapeutisches Mittel und ein Mittel zur Bildgebung umfasst, bereitgestellt werden, um zum Beispiel bei der Freisetzung an einen Tumor verwendet zu werden. Als weiteres Beispiel kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der ein chemotherapeutisches Mittel und ein radiosensibilisierendes Mittel umfasst, bereitgestellt werden. Als noch weiteres Beispiel kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der verschiedene Polynukleotidsequenzen zur Verwendung bei der Modulation der Transkription und/oder der Translation des gleichen oder verschiedener Gene umfasst, bereitgestellt werden.
IV.B.1. Auswahl eines Wirkstoffs
Allgemein kann eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die zur Verwendung als Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, auf der Basis des Zusammenhangs, in dem die vorliegende Erfindung verwendet wird, ausgewählt werden. In einer Ausführungsform ist eine geeignete einzelsträngige DNA zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie in einem Erkrankungszustand vorhanden ist. In einer anderen Ausführungsform ist eine geeignete einzelsträngige DNA zu einem überexprimierten Gen komplementär. Funktionelle Äquivalente bekannter Sequenzen können ebenso als Wirkstoffe verwendet werden und werden als ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet. Es können Nukleinsäuresequenzen mit jeder beliebigen handhabbaren Länge als Wirkstoff verwendet werden. Üblicherweise weisen solche Stoffe eine Länge von zwischen ungefähr 20 und ungefähr 50 Nukleotiden aus, obwohl längere Sequenzen verwendet werden können. In noch einer weiteren Ausführungsform kann eine Nukleinsäuresequenz, die einem vollständig langen Gen oder einem Fragment davon entspricht, als Wirkstoff verwendet werden.
Doppelsträngige DNA mit verschiedenen Längen und Zusammensetzungen ist für eine Verwendung als Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung geeignet. Die doppelsträngige DNA kann jede beliebige Länge, von einigen wenigen Basenpaaren bis hin zu der Länge eines vollständig langen Gens, aufweisen. Wie unten erörtert wird, finden DNA mit großer Länge und insbesondere vollständig lange Gene eine Verwendung bei Anwendung der Gentherapie. In dieser Ausführungsform können vollständig lange Gene in das Genom einer Wirtszelle eingebaut oder vorübergehend in der Zelle exprimiert werden. In dieser Ausführungsform fehlt dann einer Zelle ein bestimmtes Gen und eine geeignete doppelsträngige DNA-Sequenz, die als Wirkstoff ausgewählt wurde, stellt dann das im Genom der Zelle fehlende Gen dar.
In der vorliegenden Erfindung können auch Nukleinsäureanaloga als Wirkstoffe verwendet werden. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können Peptid-Nukleinsäureanaloga (PNAs) als Wirkstoffe verwendet werden. Ein Peptid-Nukleinsäureanalogon ist ein DNA-Analogon, bei dem das Rückgrat des Analogons, bei der DNA normalerweise ein Zuckerrückgrat, ein Pseudopeptid ist. Das Rückgrat einer PNA kann eine Sequenz umfassen aus wiederholten N-(2-Aminoethyl)glycineinheiten umfassen. Peptid-Nukleinsäureanaloga reagieren so, wie eine DNA in einer gegebenen Umgebung reagieren würde und können daneben an komplementäre Nukleinsäuresequenzen binden. Peptid-Nukleinsäureanaloga bieten den möglichen Vorteil gegenüber unmodifizierter DNA, infolge des neutral geladenen Peptidrückgrats der Analoga stärkere Bindungen einzugehen und können einen höheren Grad an Spezifität verleihen, als er mit unmodifizierter DNA erreichbar ist.
PNAs wurden in einem breiten Bereich biochemischer Funktionen, der in der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, einschließlich der Kartierung einer Sequenz, verwendet. In vitro-Studien geben an, dass die PNA sowohl die Transkription als auch die Translation von Genen hemmen könnte, zu denen es mit einer komplementären Sequenz konstruiert wurde. Dies legt nahe, dass PNAs bei einer Antigen- und antisense-Therapie von Nutzen sein könnten. Siehe z. B. Norden et al., (2000) FASER J. 14 (9): 1041–60. Bis heute war es Forschern jedoch nicht möglich, eine solche Sequenz reproduzierbar von der Außenseite der Plasmamembran zum Zellkern zu leiten.
Die vorliegende Erfindung geht dieses Problem an und bietet das Potential für vordem nicht erreichbare Anwendungen von PNAs. PNAs, die für eine Verwendung als Wirkstoffe in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden daher eine Sequenz umfassen, die zu einer Sequenz von Interesse komplementär ist. Andere Nukleinsäureanaloga, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, schließen Morpholinonukleinsäureanaloga ein. Morpholino-Analoga können für eine Nukleinsäuresequenz eingesetzt werden und weisen sowohl den Vorteil der Komplementarität als auch die Vorteile einer einzigartigen chemischen Reaktion und des nicht in nativen Nukleinsäuresequenzen gefundenen Bindungsprofils auf. Siehe z. B. Chakhmakhcheva et al., (1999) Nucleos. Nucleot. 18: 1427–28.
Daneben sind Proteine für eine Verwendung als Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung geeignet. In einer Ausführungsform umfassen geeignete Proteine Proteine, von denen bekannt ist, dass sie mit Proteinen Wechselwirken, die mit der Replikation von DNA und der Expression von zum Beispiel Ligasen verbunden sind. In dieser Ausführungsform kann ein an Nanopartikel gebundenes Protein ein Protein sein, das mit DNA- oder RNA-Sequenzen, möglicherweise als Hoch- oder Herunterregulator des Transkriptionsprozesses, des Translationsprozesses oder von beiden, wechselwirkt. In einer alternativen Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, eine mögliche Protein-Protein-Wechselwirkung zu belegen oder zu widerlegen. In diesem Fall ist die an Nanopartikel gebundene Sequenz ein Sondenprotein und die Anwendung der Erfindung kann Daten liefern, die denjenigen ähneln, die unter Verwenden des gut charakterisierten Hefe-Zwei-Hybrid-Systems oder anderer analytischer Systeme erreichbar sind, obwohl die vorliegende Erfindung die Gelegenheit bieten, eine solche Wechselwirkung in situ zu untersuchen. Insbesondere können Proteine, die dazu in der Lage sind, mit Rezeptoren auf nuklearen regulatorischen Proteinen wechselzuwirken, als Wirkstoffe verwendet werden.
Schließlich können kleine Moleküle, die mit einem Nanopartikel verknüpft sind, als Wirkstoffe in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete kleine Moleküle werden die Fähigkeit besitzen, mit Enzymen, Cofaktoren, Nukleinsäuren und anderen intrazellulären Strukturen wechselzuwirken. Kleine Moleküle können solche sein, die als natürliche Liganden, (kompetitive, unkompetitive und nicht-kompetitive) Inhibitoren oder konstruierte Modulatoren identifiziert werden. Als Wirkstoffe können ebenso chemotherapeutische Mittel, Radiotherapeutika oder radiosensibilisierende Mittel; ein Mittel zur Bildgebung; ein diagnostisches Mittel; oder ein anderes Mittel, von dem bekannt ist, dass es mit einem intrazellulären Protein, einer Nukleinsäure oder einem löslichen oder unlöslichen Liganden wechselwirkt, verwendet werden.
Es sollte beachtet werden, dass die Verwendung eines der obigen Wirkstoffe nicht die Bindung eines anderen Wirkstoffs an den Nanopartikels ausschließt und es können mehrere Wirkstoffe an einen einzigen Nanopartikel gebunden werden. Des Weiteren können die Wirkstoffe multivalent und/oder multifunktional sein.
IV.B.2. Herstellung eines Wirkstoffs
Nukleinsäuresequenzen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als Wirkstoffe von Nutzen sind, können auf viele Arten hergestellt werden und werden einem Fachmann bei Durchsicht der vorliegenden Offenbarung ersichtlich. Zum Beispiel kann eine geeignete DNA-Sequenz unter Verwenden von Restriktionsendonukleasen, die Nukleinsäuresequenzen an bekannten Sequenzen abtrennen, aus einer größeren DNA-Probe herausgeschnitten werden. Herausgeschnittene Nukleinsäuresequenzen können unter Verwenden von in der Wissenschaft bekannten Verfahren herausgeschnitten und gereinigt werden. Siehe z. B. Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York für eine allgemeine Erörterung von Klonierungsstrategien. Alternativ dazu und besonders bevorzugt können Nukleinsäuresequenzen unter Verwenden allgemein bekannter manueller und automatisierter Verfahren zur Synthese von Nukleinsäure synthetisiert werden. Alle Nukleinsäuresequenzen, die als Wirkstoffe verwendet werden, sollten, unabhängig davon, ob sie herausgeschnitten, synthetisiert oder anderweitig hergestellt wurden, im Wesentlichen rein sein. Die Synthese von Nukleinsäure- oder Protein-Wirkstoffen kann unter Verwenden eines vorher mit einem Nanopartikel verbundenen Templats erfolgen.
Die Isolation und Reinigung von Proteinen wird Techniken entsprechen, die für die Herstellung eines gegebenen Proteins etabliert wurden; diejenigen Proteine von Interesse, die nicht gereinigt wurden, können unter Verwenden von Fachleuten bekannten Verfahren isoliert werden und werden hier nicht erörtert. In ähnlicher Weise können in der Wissenschaft Strategien zum Synthetisieren und Reinigen kleiner Moleküle gefunden werden, die einem Fachmann im Bereich der organischen Chemie oder eines anderen chemischen Fachbereichs ersichtlich sind.
IV.C. Auswahl und Herstellung eines nuklearen Lokalisierungssignals
Der Einschluss eines nukleären Lokalisierungssignals (NLS) als Trägerbestandteil zur Freisetzung ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ein charakteristisches nukleäres Lokalisierungssignal ist eine Peptidsequenz, die das Protein zum dem Kern der Zelle steuert, in der die Sequenz exprimiert wird. Ein nukleäres Lokalisierungssignal ist vorwiegend basisch, kann fast überall in der Aminosäuresequenz eines Proteins positioniert sein, umfasst allgemein eine kurze Sequenz aus vier Aminosäure (Autieri & Agrawal, (1998) J. Biol. Chem. 273: 14731–37) bis acht Aminosäuren und ist üblicherweise reich an Lysin- und Argininresten (Magin et al., (2000) Virology 274: 11–16). Nukleäre Lokalisierungssignale umfassen oft Prolinreste. Es wurde eine Vielzahl nukleärer Lokalisierungssignale identifiziert und dazu verwendet, den Transport biologischer Moleküle aus dem Zytoplasma zu dem Kern einer Zelle zu bewirken. Siehe z. B. Tinland et al., (1992) Proc. Nazi. Acad. Sci. U. S. A. 89: 7442–46; Moede et al., (1999) FEBS Lett. 461: 229–34. Derzeit wird angenommen, dass an einer Translokation Kernporenproteine beteiligt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein nukleäres Lokalisierungssignal mit dem Nanopartikel verknüpft sein. Das nukleäre Lokalisierungssignal kann synthetisiert oder aus einer längeren Sequenz herausgeschnitten sein. Wie angemerkt ist eine Vielzahl von nukleären Lokalisierungssignalen bekannt und basierend auf den bekannten Eigenschaften dieser verschiedenen Sequenzen kann eine Auswahl einer geeigneten Sequenz getroffen werden. Charakteristische NLSs schließen die monopartite Sequenz PKKKRKV (SEQ ID NO: 1) und die bipartite Sequenz KRPAAIKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 2) ein.
Nukleäre Lokalisierungssignale erscheinen an verschiedenen Stellen in den Aminosäuresequenzen von Proteinen. NLSs wurden am N-Terminus, am C-Terminus und in dem mittleren Bereich von Proteinen identifiziert. Eine ausgewählte Sequenz kann daher als funktionaler Bestandteil einer längeren Peptidsequenz dienen. Die Reste einer längere Sequenz, die nicht als Bestandteil von NLS-Resten dienen, sollten so ausgewählt werden, dass sie nicht, zum Beispiel ionisch oder sterisch, mit dem nukleären Lokalisierungssignal selbst Wechselwirken. Obwohl in der Praxis keine strikten Beschränkungen für die Zusammensetzung einer NLS umfassenden Sequenz vorliegen, kann eine solche Sequenz daher bezüglich ihrer Länge und Zusammensetzung funktional eingeschränkt sein.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Sequenzen mit einem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln verbunden sein. Es können ebenso verschiedene Sequenzen, wie beispielsweise RME-Sequenzen, mit einem Träger verbunden sein. Diese weiteren Sequenzen können bei der Translokation eines Trägers über verschiedene Membrane, wie beispielsweise die Kernmembran einer Zelle oder der Außenmembran einer Zelle, helfen. Wenn Membrane und andere Strukturen, die allgemein die Translokation eines Trägers an eine gegebene Position in oder an einer Zelle hemmen, als „Schlösser" bezeichnet werden, können daher NLS- und RME-Sequenzen als „Schlüssel" bezeichnet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann daher ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl verschiedener Sequenzen oder „Schlüssel" umfassen, die einem gegebenen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ermöglichen können, durch verschiedene Potentialbarrieren zu einer Translokation zu gelangen.
IV.D. Auswahl und Herstellung eines Rests zur Erkennung eines Rezeptors auf der Zelloberfläche
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Rest, der die Fähigkeit verleiht, von einem Rezeptor an der Zelloberfläche erkannt und/oder gebunden zu werden, an den Nanopartikel gebunden. Dieser Rest wird allgemein eine Proteinsequenz umfassen, von der bekannt ist, dass sie von einem Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt wird. Der Rest zur Erkennung eines Rezeptors auf der Zelloberfläche kann ferner eine Nukleinsäuresequenz, entweder allein oder als Teil eines Nukleinsäure-Protein-Hybrids oder Peptid-Analogons umfassen. Es ist eine große Anzahl an Rezeptoren auf der Zelloberfläche bekannt und kann in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein, wobei der Makrophagen-Mannose-Rezeptor und dessen verschiedene Homologe und solche, die mit Retroviren, wie beispielsweise HIV verbunden sind, eingeschlossen sind.

Eine charakteristische, jedoch nicht einschränkende, Liste von Resten, die als Targeting-Mittel in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist in Tabelle 1 angegeben. Es können ebenso Homologe der vorliegenden Reste verwendet werden. Diese Targeting-Mittel können mit einem Nanopartikel verbunden werden und zum Steuern des Nanopartikels zu einer Zielstruktur verwendet werden, wo es anschließend eingebaut werden kann. Es besteht keine Anforderung daran, den gesamten Rest als Targeting-Mittel zu verwenden. Kleinere Fragmente dieser Reste, von denen bekannt ist, dass sie mit einem spezifischen Rezeptor oder einer anderen Struktur Wechselwirken, können ebenfalls als Targeting-Mittel verwendet werden. Die Targeting-Mittel aus Tabelle 1 können dazu dienen, ein Mittel zur Freisetzung, das mit einem Targeting-Mittel wechselwirkt, (z. B. durch eine rezeptorvermittelte Endozytose) einzubauen. Tabelle 1

Diphterie-Toxin

Pseudomonas-Toxin

Cholera-Toxin

Ricin

Concanavalin A

Rous-Sarkoma-Virus

Semliki-Forest-Virus

vesikulärer Stomatitis-Virus

Adenovirus

Transferrin

Low Density-Lipoprotein

Transcobalamin

Dotter-Protein

IgE

polymeres IgA

mütterliches IgG

IgG, über Fc-Rezeptoren

Insulin

epidermaler Wachstumsfaktor

Wachstumshormon

schilddrüsenstimulierendes Hormon

Nervenwachstumsfaktor

Calcitonin

Glucagon

Prolactin

luteinisierendes Hormon

Schilddrüsenhormon

Platelet Derived Growth Factor

Interferon

Catecholamine

nukleäres Lokalisierungssignal

Der Erkennungsrest kann ferner eine Sequenz umfassen, die einer enzymatischen oder elektrochemischen Spaltung unterzogen wird. Der Erkennungsrest kann daher eine Sequenz umfassen, die für eine Spaltung durch Enzyme, die an verschiedenen Positionen in einer Zelle vorhanden sind, wie beispielsweise Proteasen oder Restriktionsendonukleasen (z. B. DNAse oder RNAse) empfänglich ist.
Es muss betont werden, dass eine Zelloberflächenerkennungssequenz kein absolutes Erfordernis für die vorliegende Erfindung darstellt. Wie in 1A gezeigt ist, wurden Hepatozyten, die in Medien angezüchtet wurden, die Nanopartikel enthalten, denen eine Zelloberflächenerkennungssequenz fehlt, bei Fehlen einer solchen Sequenz tatsächlich über die Zellmembran transloziert. Obwohl eine Sequenz für einen Rezeptor auf der Zelloberfläche zum Abzielen auf einen gegebenen Zelltyp oder zum Induzieren der Verbindung eines Nanopartikels mit einer Zelloberfläche nützlich sein kann, besteht daher keine Anforderung danach, dass eine Zelloberflächenerkennungssequenz auf der Oberfläche eines Nanopartikels vorhanden ist, um die vorliegende Erfindung auszuführen.
Das Vorhandensein eines Rezeptors auf der Zelloberfläche, der für einen gegebenen Zelltyp einzigartig ist, kann bei der Auswahl und der Freisetzung eines Wirkstoffs an diesen Zelltyp helfen. Zum Beispiel exprimieren Makrophagen einen Rezeptor auf der Zelloberfläche (den Makrophagen-Mannose-Rezeptor), der eine Pinozytose von Partikeln vermittelt, die Mannose durch Kohlenhydraterkennungsdomänen umfassen. Siehe Mullin et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 5668–81. Die Auswahl eines geeigneten Rezeptors auf der Zelloberfläche kann daher eine zellspezifische Auswahl durch einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln und infolgedessen eine zellspezifische Wechselwirkung ermöglichen.
IV.E. Auswahl und Herstellung einer Anbindungssequenz
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine kurze Anbindungssequenz zwischen dem Nanopartikel und einer Zelloberflächenerkennungssequenz eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung angeordnet sein. Die Anbindung kann eine Proteinsequenz, eine Nukleinsäuresequenz oder irgendeine andere Zusammensetzung sein, die mit einer intrazellularen Umgebung kompatibel ist. In der vorliegenden Erfindung werden Protein- und Nukleinsäuresequenzen aufgrund ihrer enzymatischen Spaltbarkeit bevorzugt. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäureanbindung, die eine bekannte Schnittstelle für eine in der angezielten Zelle gefundenen Restriktionsendonuklease umfasst, verwendet werden. Alternativ dazu kann eine Proteinanbindung verwendet werden, die eine Schnittstelle für eine Protease umfasst, die gewöhnlich in dem angezielten Zelltyp gefunden wird. Schließlich kann eine Anbindung konstruiert werden, die chemisch oder elektrochemisch gespalten werden kann.
Die Spaltung einer Anbindung ist ein Verfahren, durch den der Nanopartikel, der einen Wirkstoff und ein nukleäres Lokalisierungssignal umfassen wird, befreit werden kann, um über die Kernmembran und in den Kern einer Zelle transloziert zu werden. In einem Beispiel ist der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln bei eine Verbindung eines Rezeptors auf der Zelloberfläche mit einer auf der Oberfläche eines Nanopartikels eines Trägers zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung angeordneten Zelloberflächenerkennungssequenz in der Tat an die Zelloberfläche gebunden. Bei der Translokation des Trägers zur Freisetzung, durch Endozytose oder einen anderen Mechanismus, in das Innere einer Zelle bleibt der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln an den Rezeptor gebunden. Um den Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln und dessen verbundenen Wirkstoff zu befreien, kann die Anbindung durch endogene Proteasen, Nukleasen oder andere chemische oder elektrochemische Techniken gespalten werden. Die Abspaltung der Anbindungssequenz befreit den Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln und ermöglicht das anschließende Steuern des Trägers zur Freisetzung über das auf der Oberfläche des Nanopartikels angeordnete nukleäre Lokalisierungssignal zum Kern.
IV.F. Zusammenbau eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln
Nach Auswahl und Herstellung der verschiedenen Einzelbestandteile eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung wird dann das Mittel selbst zusammengebaut. Die Reihenfolge des Zusammenbaus ist nicht entscheidend und kann in erster Linie durch die Anforderungen einer gewünschten chemischen Reaktion gesteuert werden. Die chemischen Eigenschaften eines Wirkstoffs, einer NLS, eines Nanopartikels sowie physiologische und verschiedene andere Überlegungen sollten ebenso abgewogen werden. Die nachfolgend beschriebene Vorgehensweise für den Zusammenbau ist in willkürlicher Reihenfolge angegeben. Des Weiteren sind die beschriebenen Materialien, d. h. die Zusammensetzung der Nanopartikel usw., nur beispielhaft angegeben und sollen in keinster Weise einschränken. Geeignete Materialien und Sequenzen werden Fachleuten im Licht der vorliegenden Offenbarung und des Wissens und den Forschern in den anwendbaren Bereichen zugänglichen Mitteln bekannt sein.
IV.F.1. Verbindung eines Wirkstoffs mit einem Nanopartikel
Nach der Auswahl und Herstellung eines Nanopartikels und eines geeigneten Wirkstoffs werden die beiden Bestandteile unter Bilden eines Komplexes verbunden. In einer Ausführungsform ist der Nanopartikel aus Gold hergestellt. Aufgrund seines gut bekannten Reaktivitätsprofils und seiner relativen Inertheit im Zusammenhang mit biologischen Systemen ist Gold in der vorliegenden Erfindung insbesondere von Nutzen. Es kann kolloidales Gold verwendet werden, obwohl die insgesamt negative Ladung gewöhnlicher Goldzubereitungen die Eigenschaft verleiht, dass kolloidales Gold eine hohe nicht-spezifische Affinität für bestimmte Proteine aufweist. Die negative Ladung einer Zubereitung kann durch Verbinden von Goldmolekülen mit negativ geladenen Liganden, wie beispielsweise Citrat oder Bissulfonatotriphenylphosphin verliehen werden. Diese negativ geladenen Liganden und damit die insgesamt negative Ladung, die mit einer kolloidalen Goldzubereitung verbunden ist, werden vorzugsweise durch Austauschen beliebiger negativ geladener Liganden gegen neutrale Liganden, wie beispielsweise Polyethylenglykol, oder positiv geladene Liganden, wie beispielsweise Amine, verringert oder eliminiert.
Alternativ dazu kann die Verwendung von kolloidalem Gold durch zusätzliche Behandlungen begleitet werden, so dass es an einem bestimmten Punkt in dem Herstellungsprozess mit einem anderen Protein, wie beispielsweise BSA, beschichtet werden kann, um eine unerwünschte, nicht-spezifische Proteinbindung zu blockieren. Beschichtungen aus kleinen Molekülen und Peptide können ebenso dazu verwendet werden, um spezifische Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen zu vermeiden. Zum Beispiel wurde kolloidales Gold mit einer Beschichtung aus Glutathion hergestellt. Da Glutathion, ein natürliches Antioxidationsmittel, eines der am meisten im Überfluss vorkommenden Peptide in der Zelle ist, kann diese Beschichtung dem Nanopartikel einen tarnungsgleichen Effekt verleihen. Alternativ dazu sind einige Goldcluster und Partikel kommerziell erhältlich und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel sind NANOGOLD^®-Goldpartikel von Nanoprobes, Inc. Yaphank, New York erhältlich. Für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind auch biologisch abbaubare Partikel bevorzugt, die aus einem geeigneten Polymer oder einem anderen Material hergestellt werden können. Einige kommerziell erhältliche Nanopartikel werden für eine Markierung vor dem Versand hergestellt und sind zum Verknüpfen von Einheiten an die Nanopartikel geeignet.
In einer Ausführungsform kann unter Verwenden eines Goldnanopartikels als Nanopartikel und einer einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäure als Wirkstoff eine Thiolierungsreaktion durchgeführt werden, um eine Thiolgruppe an das 5'-Ende des Nukleinsäureoligomers anzufügen. Alternativ dazu kann eine Aminierungsreaktion durchgeführt werden und wird mutatis mutandis (mit den nötigen Änderungen) zu der hierin beschriebenen Thiolierungsreaktion führen. Der generelle Zweck der Reaktion ist, ein nukleophiles Zentrum einzuführen, das anschließend mit einem gewünschten Rest funktionalisiert werden kann. Ein charakteristisches Thiol-Modifikator-Phosphoramiditreagens ist als Verbindung 1 angegeben, das von Glen Research, Inc. aus Sterling, Virginia erhältlich ist.
Verbindung 1
Nukleinsäureoligomere werden unter Bedingungen, die eine Verknüpfung des Phosphins mit dem 5'-Ende der Sonden-DNA zulassen, mit einem Thiol-Modifikator-Phosphoramidit inkubiert. Die Reaktion kann in einer DNA-Synthetisiervorrichtung unter Verwenden von Standardbedingungen ausgeführt werden. Die Verbindung 1 kann als Schritt in einer automatisierten DNA-Synthese unter Verwenden einer automatisierten Vorrichtung, wie beispielsweise der ABI^TM 3900-Hochdurchsatz-DNA-Synthetisiervorrichtung (Applied Biosystems; Foster City, Kalifornien) angefügt werden. Der Thiol-Modifikator wird in dem letzten Schritt der Synthese eines Oligonukleotids angefügt. Das Phosphin wird unter Verwenden von Iod oxidiert und die Reinigung ist exakt die gleiche, die für nicht-markierte Oligonukleotide verwendet wird. Der Reinigungsprozess ist bei markierten Oligonukleotiden leichter, da markierte Oligonukleotide wesentlich hydrophober sind und daher dazu neigen, bei typischen HPLC-Bedingungen viel langsamer zu eluieren. Das Phosphoramidit reagiert spontan mit dem 5'-Hydroxyl der DNA, die in Acetonitril angeordnet sein kann. Bei dieser Reaktion ist die Thiolgruppe durch eine Trityl- oder Essigsäurethioester-Schutzgruppe geschützt und wird durch einen Kohlenstoff-Linker mit variabler Länge von dem 5'-Phosphodiester abgetrennt. In der Verbindung 1 ist ein Linker aus sechs Kohlenstoffen vorhanden.
Dann wird der Nukleinsäurekomplex dem Entfernen der Thiol-Schutzgruppen unterzogen, um die Tritylgruppe zu entfernen. Insbesondere wird die Trityl-Schutzgruppe durch eine Behandlung mit Silbernitrat und Dithiothreitol (DTT) entfernt. Der Nukleinsäurekomplex wird mit einem Nanopartikelmetallbestandteil inkubiert. Die beiden Einheiten werden miteinander an dem Thiol verbunden, das durch die Entfernung der Tritylgruppe während der Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppen ungeschützt war. Die gebildeten Wirkstoff-Nanopartikel-Komplexe (in dieser Ausführungsform Nukleinsäure-Nanopartikel-Komplexe) können bis zur Verwendung in dem Reaktionsgefäß behalten werden.
IV.F.2. Verbindung eines nukleären Lokalisierungssignals mit einem Nanopartikel
Ein geeignetes nukleares Lokalisierungssignal wird mit dem Wirkstoff-Nanopartikel-Komplex verbunden. Nukleäre Lokalisierungssignale können unter Verwenden standardmäßiger Peptid-Chemie-Techniken synthetisiert oder durch proteolytische Spaltung aus einem größeren Protein isoliert werden. Isolierte oder synthetisierte nukleäre Lokalisierungssignale können von beliebiger Größe sein, wobei die einzige Anforderung die ist, dass die Sequenz wenigstens ein bekanntes NLS umfasst, das üblicherweise vier bis acht Aminosäuren lang ist. Verfahren zur Reinigung von Proteinen und Peptiden, die zum Herstellen nukleärer Lokalisierungssignale, die aus größeren Proteinen gereinigt werden, geeignet sind, sind in der Wissenschaft bekannt. Siehe allgemein Protein Purification Applications: A Practical Approach, (1989) (Harris & Angal, Hrsg.) IRL Press; Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, Applications, (1989) (Janson & Ryden, Hrsg.) VCH Publishers.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Herstellung von und Verbindung eines Protein-Peptid-Konjugats mit einem Nanopartikel. Ein solches Konjugat kann zum Beispiel ein vergleichsweise großes Protein und ein vergleichsweise kleines NLS umfassen. Obwohl beide Einheiten Aminosäuren umfassen, wird die Unterscheidung zwischen einem Protein und einem Peptid basierend auf, neben anderen Kriterien, der Funktionalität von jeder Einheit gemacht. In einem spezifischen Beispiel kann ein Protein-Peptid-Konjugat BSA und ein NLS umfassen. Anschließend können Protein-Peptid-Konjugate an Goldnanopartikel gebunden werden.
Die Chemie des Verknüpfens von Proteinen und Peptiden an Goldnanopartikeln ähnelt der Chemie, die für das Verknüpfen von Nukleinsäuren mit Goldnanopartikeln erforderlich ist. In einem Aspekt wird eine Thiolreaktion durchgeführt. Die Reaktion kann eine auf dem nukleären Lokalisierungssignal angeordnete Thiolgruppe, die die Form eines endständigen Cystein- oder Methioninrests annehmen kann, oder auf dem Nanopartikel angeordnete Thiolgruppe beinhalten. Die Thiolgruppe kann in geeigneter Weise mit einem primären Amin auf der anderen Einheit umgesetzt werden. Das primäre Amin kann in geeigneter Weise die Form eines endständigen Lysin- oder Argininrests in dem nukleären Lokalisierungssignal annehmen, es kann jedoch auch auf der Oberfläche des Nanopartikels angeordnet sein. Siehe z. B. Hainfeld & Furuya, (1992) J. Histochem. Cytochem. 40: 177–84; Hainfeld, (1992) Ultramicroscopy 46: 135–44.
IV.F.3. Verbindung einer Zelloberflächenerkennungssequenz mit einem Nanopartikel
Es kann eine geeignete Zelloberflächenerkernnungssequenz ausgewählt (zum Beispiel eine, die aus den in Tabelle 1 angegebenen ausgewählt wurde oder eine, die auf diesen basiert) und, wie oben in Abschnitt IV.D beschrieben ist, hergestellt werden. Die Sequenz kann im Wesentlichen ein Protein oder ein Peptid sein, von dem bekannt ist, dass es an einen Rezeptor bindet, der an der Oberfläche eines gegebenen Zelltyps exprimiert wird. Es können daher die gleichen chemischen Reaktionen zum Verbinden einer Zelloberflächenerkennungssequenz mit einem Nanopartikel durchgeführt werden, die zum Verbinden eines nukleären Lokalisierungssignals oder eines Protein-Wirkstoffs mit einem Nanopartikel durchgeführt werden. Unter Fortsetzung des Beispiels aus Abschnitt IV.F.2 oben kann eine Thiol-Amin-Reaktion zum Verbinden eines auf entweder dem Nanopartikel oder der Zelloberflächenerkennungssequenz angeordneten Thiols mit einem auf dem anderen Teil eines Thiol-Amin-Reaktionspaares angeordneten, primären Amin durchgeführt werden. In Abhängigkeit von den Reaktivitätsprofilen und der Reihenfolge, in der die verschiedenen Bestandteile eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln an den Nanopartikel gebunden werden, kann ein Schema zur Blockierung von Stellen entwickelt werden. Ein solches Schema kann das Binden eines Rests an unerwünschte Stellen auf dem Nanopartikel oder auf den Bestandteilen selbst verhindern.
IV.F.4. Verbindung einer Anbindungssequenz mit einem Nanopartikel
Ebenso kann eine Anbindungssequenz an einen Nanopartikel gebunden werden. Eine solche Sequenz kann zwischen dem Nanopartikel und einer Zelloberflächenerkennungssequenz oder einer anderen mit dem Nanopartikel verbundenen Einheit angeordnet sein. Um diesem Zweck zu dienen umfasst die Anbindungssequenz bevorzugt eine Stelle, an der eine chemische, elektrochemische oder enzymatische Spaltung erfolgen kann. Wenn eine Anbindungssequenz eine einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuresequenz umfasst, kann die Sequenz eine Schnittstelle für eine Nuklease umfassen, von der bekannt ist, dass sie in den Zellen vorhanden ist, in die der Träger zur Freisetzung eingebracht wird. Wenn die Anbindung ein Protein ist kann es eine proteolytische Stelle umfassen. Wenn gewünscht wird, dass die Anbindung photolytisch gespalten wird, kann sie schließlich ein Material umfassen, das für eine Photospaltung zugänglich ist. Kommerziell erhältliche, photospaltbare Anbindungssequenzen schließen verschiedene Spacer-Phosphoramidite, die von Glen Research aus Sterling, Virginia, erhältlich sind, ein.
IV.F.5. Biokompatibilität und Schutz des Trägers zur Freisetzung
Wenn der Nanopartikel einen Metallbestandteil, wie beispielsweise Gold umfasst, ist gewünscht, die Biokompatibilität zwischen dem Nanopartikel und einem Patienten, dem der Träger zur Freisetzung verabreicht wird, sicherzustellen. Gold ist relativ inert und ist weniger physiologisch intrusiv als andere Metalle, wobei die schädlichen Effekte jedes Metall- oder Polymermaterials für Nanopartikel durch Beschichten oder anderweitig insgesamt oder teilweises Beschichten des Nanopartikels mit einer biokompatiblen Substanz minimiert werden können. Verbindungen, die zum Erreichen einer Biokompatibilität verwendet werden können, schließen Polymere (wie beispielsweise Polyethylenglykol – PEG), Proteine (wie beispielsweise BSA), Lipide (einschließlich Membranumhüllungen) und Kohlenhydrate ein. Das Hinzufügen dieser Biokompatibilitätsverbindungen kann nach Hinzufügen der anderen Bestandteile des Trägers zur Freisetzung durchgeführt werden und kann als letzter Syntheseschritt vor dem Einbringen des Trägers zur Freisetzung in einen Patienten oder ein System dienen.
Diese Materialien können auch schützende oder maskierende Mittel für den Träger zur Freisetzung und den (die) damit verknüpften Wirkstoff(e) und das (die) damit verknüpfte(n) Targeting-Mittel sein, um eine Erkennung durch das Immunsystem oder andere biologische Systeme (z. B. Proteasen, Nukleasen (z. B. DNAse oder RNAse) oder andere Enzyme oder biologische Einheiten, die mit einem unerwünschten Abbau verbunden sind) zu verhindern. Die schützende Beschichtung oder Hülle stellt verhüllende oder verdeckende Eigenschaften bereit, um zu ermöglichen, dass der Träger zur Freisetzung eine gewünschte Zelle oder ein gewünschtes Gewebe erreicht und der (die) Wirkstoff(e) und das (die) Targeting-Mittel dabei intakt bleiben.
IV.F.6. Verbinden mehrerer Sequenzen mit einem Träger zur Freisetzung
Es können mehrere Sequenzen mit einem Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung verbunden werden. Durch Verbinden mehrerer Sequenzen mit einem einzigen Träger kann der Träger daran angepasst werden, durch verschiedene zelluläre Barrieren, wie beispielsweise die Zellmembran oder eine Kernmembran zu gelangen. Zum Beispiel kann ein Träger von Nanopartikeln eine NLS- und eine-RME-Sequenz umfassen. Die RME-Sequenz kann bei der Translokation eines Trägers über die Membranen einer Zelle helfen. Wenn es einmal in der Zelle ist, kann das NLS den Träger zu dem Kern der Zelle leiten.
Bevorzugt können alle Sequenzen, die mit einem Träger zur Freisetzung verbunden sind, eher unabhängig voneinander mit dem Träger verbunden werden, statt dass Bestandteile aus einer einzelnen langen Sequenz gebildet werden. Wie durch die im Laborversuch 1 offenbarten Ergebnisse angegeben ist, stellt eine unabhängige Verbindung von mehreren Sequenzen (bevorzugt mehreren verschiedenen Sequenzen) ein effizienteres Verfahren dar, das einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln auf eine gewünschte Zellstruktur abzielt. Das nacheinander erfolgende Verbinden mehrerer Sequenzen kann jedoch ein ebenso effektives Verfahren zum Steuern eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln an eine gegebene Stelle sein und dieser Ansatz bildet einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
V. Einbringen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln in einen Patienten oder eine Probe
Nachdem ein ausreichend reiner Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der bevorzugt einen Nanopartikel, einen Wirkstoff und ein NLS umfasst) hergestellt wurde, kann es gewünscht sein, den Träger in einer pharmazeutischen Zusammensetzung herzustellen, die an einen Patienten oder eine Probe verabreicht werden kann. Bevorzugte Techniken zur Verabreichung schließen eine parenterale Verabreichung, eine intravenöse Verabreichung und eine direkte Infusion in ein beliebiges, gewünschtes Zielgewebe, das einen festen Tumor oder ein anderes neoplastisches Gewebe einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist, ein. Dies kann durch Verwenden eines finalen Reinigungsschritts, der den Träger in einem Medium anordnet, das eine geeignete pharmazeutische Zusammenfassung enthält, erreicht werden. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung umfassen entsprechend den Dosierungsinformationen (die auf einer von-Fall-zu-Fall-Basis bestimmt wurden) allgemein eine Menge des gewünschten Trägers zur Freisetzung – Wirkstoffs, der ein annehmbares pharmazeutisches Verdünnungsmittel oder ein annehmbarer pharmazeutischer Hilfsstoff, wie beispielsweise eine sterile wässrige Lösung, beigemischt sind, um entsprechend den unter Bezugnahme auf den Wirkstoff oben angegebenen Dosierungsinformationen eine geeignete Endkonzentration zu ergeben. Solche Formulierungen werden üblicherweise Puffer, wie beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), oder weitere Zusatzstoffe, wie beispielsweise pharmazeutische Hilfsstoffe, Stabilisierungsmittel, wie beispielsweise BSA oder HSA, oder Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid, einschließen.
Bei einer parenteralen Verabreichung ist allgemein gewünscht, die Zusammensetzungen weiter pharmazeutisch annehmbar zu machen, indem ihre Sterilität, Nicht-Immunogenität und Nicht-Pyrogenität sichergestellt wird. Solche Techniken sind allgemein gut in der Wissenschaft bekannt, wie beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, (1980) (Osol, Hrsg.) 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Esston, Pennsylvania, auf das hierin Bezug genommen wird, veranschaulicht. Für die Anwendung am Menschen sollten die Zubereitungen des Weiteren eine Sterilität, Pyrogenität, allgemeine Sicherheits- und Reinigungsstandards, wie sie vom FDA Office of Biological Standards gefordert werden, erfüllen.
Wenn die Träger zur Freisetzung in Zellen eingebracht werden, die in einer Zellkultur suspendiert sind, reicht es aus, die Zellen zusammen mit den Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem geeigneten Wachstumsmedium, zum Beispiel Luria-Brühe (LB) oder einem geeigneten Zellkulturmedium, zu inkubieren. Obwohl andere Verfahren zum Einbringen möglich sind, werden diese Behandlungen zum Einbringen bevorzugt und können ohne Berücksichtigung der Einheiten, die auf der Oberfläche eines Trägers zur Freisetzung vorhanden sind, durchgeführt werden.
Wenn in vitro-Versuche durchgeführt werden sollen, können die Träger zur Freisetzung direkt einem ausgewählten Zellwachstumsmedium zugesetzt werden, bevor die Zellen in das Medium eingebracht werden. Ein solches Medium muss offensichtlich nicht nur mit den physiologischen Anforderungen der Zellen, sondern auch mit dem chemischen Profil und dem Reaktivitätsprofil des Trägers zur Freisetzung kompatibel sein. Das Profil des Trägers zur Freisetzung wird einem Fachmann nach Durchsicht der vorliegenden Offenbarung und im Hinblick auf die an den Nanopartikel gebundenen Reste ersichtlich sein.
V.A. Rezeptorvermittelte Endozytose eines Trägers zur Freisetzung
Die Erkennung und das Binden einer auf einem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung angeordneten Zelloberflächenerkennungssequenz ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung nutzt den Vorteil zu verstehen, dass ein Bindungsereignis an der Zelloberfläche oft eine beginnender Schritt in einer zellulären Kaskade ist, der zu mehreren Ereignissen, insbesondere einer rezeptorvermittelten Endozytose, führt.
Die obigen Verfahren beschreiben Verfahren, durch die ein Träger zur Freisetzung in eine Probe oder einen Patienten eingebracht werden kann. Diese Mittel werden auf viele Arten über die Zellmembran transloziert. Wenn eine Zellerkennungssequenz an einen Nanopartikel gebunden ist, kann jedoch eine andere Art von Internalisierung, nämlich eine rezeptorvermittelte Endozytose auftreten.
Der Begriff „rezeptorvermittelte Endozytose" („RME") beschreibt allgemein einen Mechanismus, durch den, durch die Bindung eines Liganden an einen auf der Oberfläche einer Zelle angeordneten Rezeptor katalysiert, ein an einen Rezeptor gebundener Ligand in einer Zelle internalisiert wird. Viele Proteine und andere Strukturen dringen über eine rezeptorvermittelte Endozytose in Zellen ein, einschließlich Insulin, epidermaler Wachstumsfaktor, Wachstumshormon, schilddrüsenstimulierendes Hormon, Nervenwachstumsfaktor, Calcitonin und Glucagon und vielen anderen, einschließlich jenen, die in Tabelle 1 angegeben sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bietet eine rezeptorvermittelte Endozytose einen geeigneten Mechanismus zum Transportieren eines Nanopartikels in das Innere einer Zelle.
Bei einer RME kann die Bindung eines Liganden durch einen an der Oberfläche einer Zelle angeordneten Rezeptor ein intrazelluläres Signal initiieren, dass eine Endozytosereaktion einschließen kann. Dadurch wird ein Mittel, das an die Oberfläche einer Zelle gebunden ist, invaginiert und in der Zelle internalisiert. Anschließend kann eine beliebige Anbindungssequenz, die auf einem Nanopartikel vorhanden ist, durch die endogenen Enzyme der Zelle gespalten werden, wodurch das Mittel befreit wird, um seinen Wirkstoff an die geeignete Struktur freizusetzen.
Es muss erneut betont werden, dass RME kein ausschließliches Verfahren ist, durch das ein Träger zur Freisetzung in eine Zelle transloziert werden kann. Andere Verfahren der Aufnahme, die durch Verknüpfen der geeigneten Einheit mit einem Nanopartikel ausgenutzt werden können, schließen die vorteilhafte Verwendung von Membranporen ein. Ebenso bieten phagozytotische und pinozytotische Mechanismen vorteilhafte Mechanismen, durch die ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln internalisiert werden kann.
VI. Nachweis eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können auf viele Arten sowohl im Inneren als auch außerhalb der Zellen nachgewiesen werden. In der Tat ist die Fähigkeit, eine von mehreren Techniken zum Nachweis auszuwählen, ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandensein eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln ist das Monitoring einer Probe bezüglich einer homöostatischen Änderung, für die der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln zu erzeugen, konstruiert wurde. Bei manchen Anwendungen könnte es jedoch gewünscht sein, das Vorhandensein eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln mit einem anderen Ansatz zu überwachen. Verschiedene, jedoch nicht alle, Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von Mitteln zur Freisetzung von Nanopartikeln können die Verwendung von Transmissionselektronen-, Fluoreszenz- und anderen Mikroskopietechniken; einen auf Spektroskopie basierenden Nachweis; und Nachweisverfahren, die Proteine, wie beispielsweise immunologische Verfahren beinhalten, einschließen. Andere Verfahren sind möglich und werden von den spezifischen Umständen des Versuchs oder Behandlungsprotokolls abhängen.
IV.A. Nachweis eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln mittels Transmissionselektronenmikroskopie
Zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln kann Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden. Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, die 5 nm große und größere Nanopartikel umfassen, können mittels TEM deutlich visualisiert werden, wie durch die in den 1A und 1B gezeigten TEM-Aufnahmen bewiesen ist. 1A zeigt Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, die 30 nm große Nanopartikel umfassen. In beiden Figuren umfassen die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ein nukleäres Lokalisierungssignal. Die 1A und 1B geben an, dass TEM ein nützliches Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins und zur subzellulären Lokalisierung von Trägem zur Freisetzung von Nanopartikeln ist. Wie in 1A gezeigt ist, sind Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, die Nanopartikel umfassen, die so klein wie 5 nm sind, sichtbar.
Die 1A und 1B zeigen, dass TEM zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln in dem Kern einer Zelle verwendet werden kann. Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, die 5 nm große Nanopartikel umfassen, ordnen sich in dem Kern einer Zelle an, wie in 1A gezeigt ist. Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, die 30 nm große Nanopartikel umfassen, bleiben in dem Zytoplasma der Zelle, wie in 1B gezeigt ist. Die TEM ermöglicht daher den Nachweis von Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln und die subzelluläre Lokalisierung der Träger zur Freisetzung.
Die TEM kann ebenso zum Abschätzen der Dichte von Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem Bereich verwendet werden. Eine Berechnung der Dichte kann durch Zählen der Anzahl an beobachteten Partikeln in einem gegebenen, mittels TEM gescannten Bereich durchgeführt werden. Ein Verständnis der Dichte von Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem definierten Bereich, wie beispielsweise dem Kern oder Zytoplasma einer Zelle, kann Informationen bereitstellen, die die Anforderungen an die Größe eines Nanopartikels, die Effektivität eines gegebenen nukleären Lokalisierungssignals und andere Parameter berücksichtigen.
VI.B. Spektroskopischer Nachweis eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können auch spektroskopisch nachgewiesen werden. In der vorliegenden Erfindung können UV-, sichtbar- und IR-spektroskopische Verfahren verwendet werden. Die Auswahl eines Nachweisverfahrens wird üblicherweise von der Versuchskonstruktion abhängen. In einer Ausführungsform können die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln indirekt unter Verwenden von Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen werden.
Die Expression von GFP und anderen fluoreszierenden Markerproteinen, die durch einen Wirkstoff eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, kann mittels Fluoreszenz nachgewiesen werden und kann als Indikator für das Vorhandensein eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln fungieren. Alternativ dazu kann ein fluoreszierender Rest mit dem Nanopartikelbestandteil eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln verbunden werden und auf diese Weise kann das Vorhandensein des Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln selbst identifiziert werden.
VI.C. Auf Mikroskopie basierender Nachweis eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln
Wie in Abschnitt VI.A oben angegeben ist, ist eine TEM eine Form von Mikroskopie, die zum Nachweis von Trägern zur Freisetzung von Nutzen ist. Andere Formen von Mikroskopie können jedoch ebenso verwendet werden. Zum Nachweis des Vorhandenseins von Trägern zur Freisetzung können Mikroskopietechniken, wie beispielsweise Hellfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Konfokalmikroskopie und andere Techniken verwendet werden.
Für die Sichtbarmachung zellulärer Organellen wird üblicherweise Phasenkontrastmikroskopie verwendet und sie kann dazu verwendet werden, das Vorhandensein von Trägem zur Freisetzung nachzuweisen. Konfokalmikroskopie kann ebenso für den Nachweis von Trägern zur Freisetzung von Nutzen sein. Die Auflösung irgendeiner der obigen Mikroskopietechniken kann durch Einführen verschiedener Kontrastverstärker oder andere Mittel, von denen bekannt ist, dass sie die Aufnahmen verfeinern und die Auflösung erhöhen, verbessert werden.
VI.D. Auf Proteinen basierender Nachweis eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln
Ein auf Proteinen basierender Nachweis eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln ist ebenso möglich. Zum Beispiel kann ein zweites Protein, von dem bekannt ist, dass es an ein erstes, an den Nanopartikel gebundenes Protein bindet, markiert und als Sonde verwendet werden. Geeignete Marker schließen fluoreszierende Reste und andere Marker ein. Nach der Bindung des ersten mit dem zweiten Protein und daher der Bindung des markierten zweiten Proteins mit dem Träger zur Freisetzug von Nanopartikeln ist das Vorhandensein eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln durch Nachweisen des Vorhandenseins der Sonde nachweisbar. Zum Nachweisen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung kann jedes geeignete Proteinpaar verwendet werden; vorzugsweise wird ein erstes Protein mit einem Nanopartikel verbunden und ein zweites Protein wird mit einem nachweisbaren Marker markiert und von den beiden Proteinen ist bekannt, dass sie aneinander binden.
VII. Anwendungen der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung
Die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, eine Vielzahl von Wirkstoffen an eine Vielzahl verschiedener zellulärer und subzellulärer Positionen freizusetzen. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben ist, ist die vorliegende Erfindung zur Analyse der Genexpression; zum Einbauen einer Nukleinsäuresequenz oder einer Sequenz, die Nukleinsäureanaloga umfasst, in das Genom einer Zelle; zum Ändern der Konzentration eines regulatorischen Proteins in einer Zelle; zum Ändern eines RNA-Splicing-Musters; und zum Wechselwirken mit der mRNA in dem Zytoplasma einer Zelle von Nutzen.
Als generelle Regel sollte, wenn Nukleinsäuresequenzen ausgewählt und manipuliert werden, wenn immer es möglich ist, Sorgfalt darauf verwendet werden, das Potential für die Bildung von Strukturen, die ein Selbst-Annealing durchführen, zu minimieren. Es sollten Sequenzen mit beliebiger chemischer Zusammensetzung, von denen vorhergesagt werden kann, dass sie zu Strukturen führen, die ein Selbst-Annealing durchführen, vermieden werden, wenn die vorliegende Erfindung ausgeführt wird.
Daneben kann die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen unter der allgemeinen Regel, dass die Temperatur innerhalb von annähernd 10°C der vorhergesagten T_m der Duplex bleiben sollte, die diejenige Temperatur (bei definierter Innenstärke und pH) ist, bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt abgestimmten Sonde hybridisiert, variiert werden. Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen für die Analyse komplementärer Nukleinsäuren mit mehr als 100 komplementären Resten ist eine Inkubation über Nacht in 50% Formamid mit 1 mg Heparin bei 42°C. Einer Wäsche unter hoher Stringenz kann einer Wäsche unter geringer Stringenz vorausgehen, um das Untergrundsignal der Sonde aufzuheben. Ein Beispiel für Waschbedingungen unter mittlerer Stringenz für eine Duplex mit mehr als ungefähr 100 Nukleotiden ist eine 15-minütige Inkubation in 1 × SSC bei 45°C. Ein Beispiel für eine Wäsche unter niedriger Stringenz für eine Duplex mit mehr als ungefähr 100 Nukleotiden ist eine 15-minütige Inkubation in 4–6 × SSC bei 40°C. Für kurze Sonden (z. B. ungefähr 10 bis 50 Nukleotide) beinhalten stringente Bedingungen üblicherweise eine Inkubation in Salzkonzentrationen von weniger als ungefähr 1,0 M Natriumionen-, üblicherweise ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionen- (oder einer anderen Ionen-) konzentration, bei einem pH von 7,0 bis 8,3 bei einer Temperatur von mindestens ungefähr 30°C. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe destabilisierender Mittel, wie beispielsweise Formamid, erreicht werden, Allgemein gibt ein Signal-Rausch-Verhältnis von 2-mal (oder mehr) als demjenigen, das bei einer Sonde ohne Bezug in dem bestimmten Hybridisierungs-Assay beobachtet wird, den Nachweis einer spezifischen Hybridisierung an.
VII.A. Modulation und Analyse der Genexpression
Die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können zum Modulieren und Analysieren der Genexpression in einem Modellsystem verwendet werden. Es ist wesentlich, dass die Expression eines Gens von Interesse mit der Herstellung von mRNA übereinstimmt, die von der DNA-Sequenz des Gens transkribiert wird. Eine transkribierte mRNA wird standardmäßigen Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung unterzogen. In einer Ausführungsform kann daher ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln zum direkten Modulieren der Expression eines Gens verwendet werden, indem ein Wirkstoff ausgewählt wird, der alle die Expression hemmenden Strukturen entfernen oder die Expression fördernde Strukturen einführen wird. In einer anderen Ausführungsform wird ein Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung zum Nachahmen eines Bestandteils des natürlichen zweiten Messenger-Systems einer Zelle und dadurch zum Modulieren der Transkription und der Translation eines gegebenen Gens verwendet.
In einer Ausführungsform moduliert ein Transkriptionsfaktor oder ein anderes Protein mit der Fähigkeit, die Proteinexpression zu modulieren, das dem Zytoplasma oder dem Kern einer Zelle durch einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung präsentiert wurde, die Genexpression. Die Modulation umfasst sowohl die Hoch- als auch die Herunterregulierung eines Gens. In dieser Ausführungsform umfasst ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln entweder einen kompetenten Transkriptions- oder Translationsmodulator (z. B. einen Transkriptionsfaktor) oder eine Nukleinsäuresequenz, die für einen Transkriptions- oder Translationsmodulator in der Rolle eines Wirkstoffs kodiert. Kompetente Modulatoren können in der Form aktiv sein, in der sie an einen Nanopartikel gebunden sind oder sie können in einer Form vorliegen, die durch proteolytische oder ein andere enzymatische oder chemische Behandlung in dem Zytoplasma oder dem Kern einer Zielzelle aktiviert wird. In ähnlicher Weise können Nukleinsäuresequenzen, die für einen Transkriptions- oder Translationsmodulator kodieren, durch die Translationsmaschinerie der Zielzelle translatiert werden, die in einem Verfahren verwendet kann, das zu einer Feedback-Inhibition-Schleife (Rückkopplungshemmungsschleife) analog ist: die Expressionsmaschinerie der Zielzelle kann zum Exprimieren der durch einen Träger zur Freisetzung eingeführten Nukleinsäure verwendet werden, die dann ein Protein erzeugen wird, das eine weitere Expression des Proteins verhindern kann.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Genexpression in einer Zelle moduliert, die ein Protein aufweist, dessen Expression von einem gegebenen Splicing-Muster abhängt. In dieser Ausführungsform wird ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der ein Morpholino-Oligonukleotid, eine PNA oder ein andere Oligonukleotid mit geeigneter Sequenz umfasst, die das Splicing ändert, in Zielzellen eingebracht, die ein Gen umfassen, dessen Expression von einem Splicing-Ereignis abhängt. Wenn ein Gen, das für das grüne fluoreszierende Protein („GFP") kodiert, dazu verwendet wird, diese Ausführungsform der Erfindung, in der Abwesenheit eines solchen Morpholino-Oligonukleotids nachweisbar zu zeigen, liegt keine Expression von GFP vor. In Zellen, in denen das durch einen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung freigesetzte Morpholino-Oligonukleotid vorhanden ist, treten wechselnde Splicing-Ereignisse auf und das GFP-Gen wird exprimiert und kann spektrophotometrisch nachgewiesen werden. Dieses Beispiel kann für jedes beliebige Gen erweitert werden, bei dem ein Splicing durchgeführt werden kann, um ein funktionelles Protein zu erzeugen, wobei ein geeignetes Nukleotid als an einen Träger zur Freisetzung gebundener Wirkstoff dient.
VII.B. Modulieren der Translation eines Proteins
Ein Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung kann zum Freisetzen einer Nukleinsäuresequenz für den Einbau in das Genom einer Zielzelle verwendet werden. Dieses Konzept wird manchmal als „antisense-„ oder „Gentherapie" bezeichnet. Durchbrüche in der Molekularbiologie und das Humangenomprojekt haben vorher nicht vorhersehbare Möglichkeiten für einen gezielten Eingriff in die Genexpression eröffnet. Diese schließen dauerhafte Ansätze, wie beispielsweise eine transgene Überexpression oder eine rekombinante Unterbrechung spezifischer Gene sowie neue Ansätze für eine vorübergehende Unterdrückung der Genfunktion ein. Kurze synthetische antisense-(AS-)Oligodesoxynukleotide (ODN), die so konstruiert sind, dass sie mit spezifischen Sequenzen innerhalb einer angezielten mRNA hybridisieren, gehören zur letzteren Klasse. Der Einbau eines fehlenden Gens in das Genom eines Wirts war ebenso von wesentlichem Interesse.
Ein AS-Eingriff in die Expression spezifischer Gene kann durch die Verwendung synthetischer antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODNs) erreicht werden. Siehe allgemein Agrawal, (1996) Trends Biotechnol. 14 (10): 376–87; Lev-Lehman et al., (1997) in Antisense Therapeutics, (Cohen & Smisek, Hrsg.), Plenum Press, New York; und Lefebvre-D'Hellencourt et al., (1995) Eur. Cytokine Netw., 6: 7–19; Oligonucleotide & Gene Therapy-Base Antisense Therapeutics, (1997), (Morl, Hrsg.) Drug & Market Development Publications, Westborough, Massachusetts; Antisense Therapeutics, (1996) (Agrawal, Hrsg.) Humana Press, Totowa, New Jersey für einen allgemeinen Überblick über antisense. AS-ODNs sind kurze DNA-Sequenzen mit üblicherweise 15 bis 25 Basen Länge und sind so konstruiert, dass sie eine Ziel-mRNA von Interesse komplementieren und eine RNA:ODN-Duplex bilden. Diese Duplexbildung kann ein Verarbeiten, ein Splicing, einen Transport oder eine Translation der relevanten mRNA verhindern. Des Weiteren können bestimmte AS-ODNs eine zelluläre RNase H-Aktivität auslösen, wenn sie mit ihrer Ziel-mRNA hybridisiert werden, was zu einem Abbau der mRNA führt. Calabretta et al., (1996) Semin. Oncol., 23: 78–87. In diesem Fall wird die RNase H den RNA-Bestandteil der Duplex spalten und kann möglicherweise das AS-ODN freisetzen, um weiter mit den anderen Molekülen der Ziel-RNA zu hybridisieren. Eine weitere Wirkungsweise resultiert aus der Wechselwirkung an AS-ODNs mit genomischer DNA unter Bildung einer Tripelhelix, die transkriptionell inaktiv sein könnte.
Die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, das Expressionsprofil einer Zielzelle unter Verwenden der obigen Erörterung als allgemeine Anleitung zu verändern. In einer Ausführungsform kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln hergestellt werden, der wenigstens eine AS-Sequenz, eine ODN-Sequenz, eine AS-ODN-Sequenz oder eine andere Nukleinsäure- oder eine modifizierte Nukleinsäuresequenz umfasst. Diese Sequenz kann als Wirkstoff in einem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln dienen. Der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln umfasst auch ein nukleäres Lokalisierungssignal, das den Träger zur Freisetzung zu dem Kern einer Zelle leitet. Alternativ dazu können, wenn gewünscht ist, dass der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in dem Zytoplasma bleibt, größere Nanopartikel (z. B. 30 nm) verwendet werden. Die genaue Sequenz und/oder Zusammensetzung eines Wirkstoffs spiegelt die Rolle oder die Rollen des Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln wieder. Zum Beispiel kann ein Wirkstoff zu einem Gen von Interesse komplementär sein.
In der Praxis kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der konstruiert ist, dass sie das Translationsprofil eines Proteins der Zielzelle ändert, einem Patienten durch Injektion verabreicht werden, oder, wenn die Zielzellen in einem in vitro-Versuch vorhanden sind, kann der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln direkt in das Wachstumsmedium der Zellen gegeben werden. Beide Verfahren zum Einbringen sind nachstehend beschrieben und andere werden einem Fachmann nach Studium der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein.
VII.C. Modulieren der Konzentration regulatorischer Proteine
Die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können zum Modulieren der Konzentration verschiedener zellulärer regulatorischer Proteine verwendet werden. Ein spezifisches Beispiel der Regulation ist als das Verwenden eines Transkriptionsfaktor-Lockmittels bekannt. Wie hierin vorstehend angegeben ist, beziehen sich die Begriffe „Lockmittel" und „Transkriptionsfaktor-Lockmittel" auf Moleküle, die an Transkriptionsfaktoren binden oder mit diesen Wechselwirken und deren Bindung an native Enhancer-Sequenzen verhindern. Es ist möglich, Transkriptionsfaktor-Lockmittel zu konstruieren, die spezifisch mit Transkriptionsfaktoren Wechselwirken und die natürliche Bindungsstelle auf dem Genom für den bestimmten Transkriptionsfaktor nachahmen oder diese ähneln. Manche Transkriptionsfaktor-Lockmittel können den Transkriptionsfaktor mit einer Affinität binden, die nahe seiner Affinität für die natürliche Bindungsstelle auf dem Genom ist oder diese übersteigt.
Neben einer Bindung an eine endogene Bindungsstelle auf dem Genom können manche Transkriptionsfaktoren auch an intrazelluläre löslichen Liganden binden. Die Bindung eines solchen Transkriptionsfaktors an einen geeigneten Liganden ändert anschließend das Bindungsprofil des Transkriptionsfaktors an dessen Bindunkstelle oder Bindungsstellen auf dem Genom. Erneut dargestellt kann die Bindung eines Liganden durch einen Transkriptionsfaktor die Fähigkeit des Transkriptionsfaktors modulieren, an dessen angestrebte Stelle auf dem Genom zu binden. Solche Transkriptionsfaktoren werden in der Wissenschaft auch als intrazelluläre oder nukleare Rezeptoren für lösliche Liganden bezeichnet.
Transkriptionsfaktor-Lockmittel können auf viele Arten funktionieren und können daher eine Vielzahl von Elementen umfassen. Zum Beispiel können Nukleinsäuresequenzen mit zellulärer Ziel-DNA um die Bindung an einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren konkurrieren. In diesem Beispiel können Nukleinsäuresequenzen eine Duplex mit einer Zielsequenz bilden und die Sequenz effektiv inaktivieren. Es können Nukleinsäuresequenzen eingebracht werden, die duplexartige Strukturen, wie beispielsweise Haarnadelstrukturen, kreuzförmige Strukturen oder andere Strukturen bilden, die die zelluläre Ziel-DNA effektiv inaktivieren werden.
Es besteht keine Anforderung, dass eine in die zelluläre Ziel-DNA eingebrachte Sequenz unmodifizierte Nukleinsäuren umfasst. Die Sequenzen können Nukleinsäuremoleküle umfassen, die modifizierte Phosphodiesterbindungen enthalten. Modifizierte Phosphodiesterbindungen können zum Beispiel Phosphorthioat, Phosphoramidit und Methylphosphatderivate einschließen.
Die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung können eine Modulation der Konzentration regulatorischer Moleküle ermöglichen. Die Modulation kann durch Verbinden eines geeigneten Wirkstoffs mit einem Nanopartikel erreicht werden. Zum Beispiel kann eine kurze Sequenz doppelsträngiger DNA, zu der ein gegebenes regulatorisches Protein (z. B. ein Transkriptionsfaktor) eine hohe Affinität besitzt, als Transkriptionsfaktor-Lockmittel, wie er hierin vorstehend beschrieben wurde, verwendet werden. Weitere Anwendungen zum Modulieren regulatorischer Proteine für einen Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung werden einem Fachmann unter Berücksichtigung des Gesichtspunkts der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein.
VII.D Modulieren des RNA-Splicing
Allgemein kann die Expression eines spezifischen Gens in jedem beliebigen Schritt in dem Prozess des Herstellens eines Wirkstoffs reguliert werden. Die Modulation der gesamten Proteinaktivität kann über transkriptionale, Transkript verarbeitende, translationale oder posttranslationale Mechanismen erfolgen. Eine Rolle eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung ist, die Transkription einer Nukleinsäuresequenz zu modulieren.
Die Transkription bezeichnet einen zellulären Prozess, der die Wechselwirkung einer RNA-Polymerase mit einem Gen beinhaltet, was die Expression als RNA anhand der strukturellen Informationen, die in den Kodierungssequenzen des Gens vorhanden sind, steuert. Der Prozess schließt die folgenden Schritte ein, ist jedoch nicht auf diese beschränkt:
(1) Initiierung der Transkription, (2) Transkriptelongation, (3) Transkript-Splicing, (4) Transkript-Capping (Verschließen des Transkripts), (5) Terminierung des Transkripts, (6) Polyadenylierung des Transkripts, (7) nukleärer Export des Transkripts, (8) Editierung des Transkripts und (9) Stabilisieren des Transkripts. Die Transkription kann durch Ändern der transkriptionalen Initiierungsrate oder des Fortschreitens der RNA-Polymerase geändert werden (Maniatis et al., (1987) Science, 236: 1237–45). Die Verarbeitung des Transkripts kann durch Begebenheiten, wie beispielsweise das Muster des RNA-Splicing (das Splicing der RNA, um eine oder mehrere mRNA-Spezies zu erhalten), die Rate des mRNA-Transports zu dem Zytoplasma oder die Stabilität der mRNA beeinflusst werden.
Obwohl manche eukaryotische mRNA-Transkripte direkt translatiert werden, enthalten daneben viele einen oder mehrere Bereiche, die als „Introns" bekannt sind und aus einem Transkript herausgeschnitten werden, bevor es transkribiert wird. Die übrig bleibenden (und daher translatierten) Bereiche sind als „Exons" bekannt und werden miteinander gespleisst (verbunden), um eine kontinuierliche mRNA-Sequenz zu bilden. mRNA-Splicingstellen, d. h. Intron-Exon-Verbindungen, können Zielbereiche für einen Wirkstoff der vorliegenden Erfindung sein und können insbesondere in Situationen von Nutzen sein, in denen bei einer Erkrankung ein anomales Splicing auftritt oder in denen eine Überproduktion eines bestimmten mRNA-Splicing-Produkts bei einer Erkrankung auftritt. Anomale Fusionsverbindungen aufgrund von Umordnungen oder Deletionen können ebensolche Ziele sein.
Die vorliegende Erfindung kann zum Modulieren des RNA-Splicing verwendet werden. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch Auswählen eines geeigneten Wirkstoffs, wie beispielsweise einer Nukleinsäuresequenz, von der bekannt ist, dass sie das Splicing-Muster für ein gegebenes Gen ändert, ausgeführt werden. Die Verwendung einer geeigneten Sequenz (z. B. DNA, RNA, Morpholinonukleotid usw.) kann das Splicing-Muster und daher das Expressionsprofil eines Proteins bei einer Zelle beeinflussen. Die Freisetzung der geeigneten Sequenz stellt das größte Hindernis bei therapeutischen Anwendungen des RNA-Splicing dar, das durch das Verwenden von Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln, die die Fähigkeit besitzen, auf den Kern abzuzielen, überwunden werden kann.
VII.E. Wechselwirkung mit der mRNA im Zytoplasma
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, mit einem mRNA-Iranskript für ein gegebenes Protein, während sich das Iranskript im Zytoplasma befindet wechselzuwirken. Die Wechselwirkung kann viele Formen, einschließlich einer Modulation der Menge eines gegebenen, von einer Zelle erzeugten Proteins, annehmen. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung ein antisense-Nukleotid zum Wechselwirken mit der mRNA, die in das Zytoplasma exportiert wurde, verwenden. Siehe z. B. Bassell et al., (1999) FASER J. 13: 447–54.
Ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung kann so konstruiert sein, dass er mit der mRNA in dem Zytoplasma einer Zelle wechselwirkt. Die spezifische Hybridisierung einer oligomeren Verbindung mit der mRNA kann die normale Funktion der mRNA beeinträchtigen. Diese Modulation der Funktion einer Nukleinsäure durch Verbindungen, die spezifisch an diese hybridisieren, wird allgemein als „antisense" bezeichnet und ist hierin vorstehend erörtert. Antisense-Verbindungen können verschiedene Funktionen der RNA unterbrechen, wobei alle vitalen Funktionen, wie zum Beispiel die Translokation der RNA an die Stelle einer Proteintranslation, die Translation eines Proteins aus der RNA, das Splicing der RNA, um eine oder mehrere mRNA-Spezies zu erhalten und eine katalytische Aktivität, die an der RNA beteiligt ist oder durch die RNA ermöglicht wird, einschließen. Der Gesamteffekt einer solchen Beeinträchtigung der mRNA-Funktion ist die Modulation der Expression des Proteins, für das die mRNA kodiert.
Die Verbindung einer antisense-Verbindung mit zum Beispiel einer mRNA kann für Diagnostika, Therapeutika, zur Prophylaxe und als Forschungsreagenzien und -kits verwendet werden. Wenn es als Therapeutikum verwendet wird, kann ein Patient, bei dem vermutet wird, dass er eine Erkrankung oder Störung aufweist, die durch Modulieren der Expression eines gegebenen Proteins behandelt werden kann, durch Verabreichen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung, der einen antisense-Wirkstoff umfasst, behandelt werden. Die Verwendung von Trägern zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung kann, wenn antisense-Verbindungen als Wirkstoff eingeschlossen sind, auch prophylaktisch, z. B. zum Verhindern oder Verzögern von zum Beispiel einer Infektion, einer Entzündung oder der Bildung eines Tumors, verwendet werden.
Antisense tragende Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung sind für Forschungs- und Diagnosezwecke von Nutzen, da der antisense-Bestandteil mit Nukleinsäuren hybridisieren kann, die für ein bestimmtes Protein von Interesse kodieren, wodurch es möglich ist, leicht Sandwich- und andere Assays zu konstruieren, um diese Tatsache auszunutzen.
Daneben können die Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung durch die Auswahl eines Nanopartikels mit geeigneter Größe subzellulär lokalisiert werden. Wie in 1B gezeigt ist, bleiben Träger zur Freisetzung, die 30 nm große oder größere Nanopartikel umfassen, ungeachtet des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins eines nukleären Lokalisierungssignals, in dem Zytoplasma einer Zelle lokalisiert und werden nicht im Kern einer Zelle lokalisiert. Diese Beobachtung gibt an, dass größere Nanopartikel in das Zytoplasma geleitet werden können, in der nicht-translatierte mRNA lokalisiert ist. Kleinere Nanopartikel können dazu verwendet werden, eine Vor-mRNA in den Kern zu leiten. Ein Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung kann daher in das Zytoplasma einer Zelle geleitet werden, wo er mit den darin angeordneten RNA-Sequenzen Wechselwirken kann.
VIII. Vorteile der Träger zur Freisetzung der vorliegenden Erfindung
Gegenüber den derzeit in der Wissenschaft bekannten Verfahren zur Freisetzung weist die vorliegende Erfindung eine Reihe von Vorteilen auf. Zunächst besteht ein entscheidender Vorteil in der Verwendung eines nukleären Lokalisierungssignals. Der Einschluss eines NLS als Bestandteil eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln gewährleistet, dass, unter der Annahme der Optimierung anderer Variablen, der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln direkt zu dem Kern einer Zelle geleitet wird. Dieser Vorteil steigert in hohem Maße die Effizienz eines Wirkstoffs, der dazu konstruiert wurde, mit nuklearen Strukturen wechselzuwirken, indem die Menge an Material erhöht wird, die an den Kern einer Zielzelle freigesetzt wird; der Einschluss des NLS führt dazu, dass weniger Material für eine kürzere Dauer in dem Zytoplasma angeordnet ist und sehr viel weniger Material abgebaut wird. Das NLS bietet daneben die Möglichkeit, effektiv auf zelluläre Prozesse, die in dem Kern auftreten, wie beispielsweise DNA-Replikation, -Transkription und verschiedene Splicing-Ereignisse, abzuzielen.
Die Bindung weiterer Targeting-Mittel kann bei der Translokation eines Trägers über verschiedene Membranen, wie beispielsweise die Kernmembran einer Zelle oder die Außenmembran einer Zelle, helfen, wodurch ein weiterer Vorteil bereitgestellt wird. Wenn Membrane und andere Strukturen, die allgemein die Translokation eines Vehikels an eine gegebene Position in oder an einer Zelle behindern, als „Schlösser" bezeichnet werden, können NLS- und RME-Sequenzen als „Schlüssel" bezeichnet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann daher ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl verschiedener Sequenzen oder „Schlüssel" umfassen die einem gegebenen Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln ermöglichen können, durch verschiedene Potentialbarrieren zu einer Translokation zu gelangen.
Ein weiterer Vorteil einer bevorzugten Ausführungsform der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, Nanopartikel zu erzeugen, die ein Material umfassen, das biologisch inert ist. Es ist zum Beispiel möglich, Nanopartikel aus Gold und anderen Materialien herzustellen. Anders als andere Materialien ist Gold biologisch inert und kann, ohne wesentliche ungünstige Effekte durch biologische Systeme, physiologisch toleriert werden. Ferner kann ein Nanopartikel ein biologisch abbaubares Material umfassen, das nach Aufbrechen die Bestandteile des Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, die alle selbst biologisch abbaubar sind, liefern kann.
Ein noch weiterer Vorteil einer bevorzugten Ausführungsform der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung ist ihre Fähigkeit, aufgrund der fehlenden Einschränkung des Wirkstoffs in irgendeiner von vielen Rollen zu fungieren. Ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln der vorliegenden Erfindung kann daher eine Vielzahl von Rollen ausfüllen, indem einfach der Wirkstoff je nach Bedarf geändert wird. Ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der dazu konstruiert ist, die Genexpression durch Freisetzen eines antisense-Strangs zu dem Kern einer Zelle zu modulieren, kann auch als Transkriptionsfaktor-Lockmittel fungieren, indem der antisense-Strang-Wirkstoff gegen eine doppelsträngige DNA-Sequenz ausgetauscht wird.
Schließlich kann die Größe des Nanopartikels variiert werden, was ein unterschiedliches Abzielen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln bereitstellen kann. Die Größe der Nanopartikel kann das Abzielen eines Trägers zur Freisetzung beeinflussen. Ein Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, der einen Nanopartikel von ungefähr 30 nm oder mehr umfasst, wird nicht in den Kern einer Zelle transportiert werden und wird im Zytoplasma der Zelle bleiben, selbst wenn ein NLS vorhanden ist. Obwohl ein solcher Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nicht zu dem Kern einer Zelle transportiert werden könnte, kann der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln jedoch durch die Zelle internalisiert werden und in dem Zytoplasma lokalisiert bleiben. Solche Träger können daher zum Modulieren von Prozessen, die im Zytoplasma auftreten, wie beispielsweise der Translation und Translokation, von Nutzen sein.
Laborbeispiel
Das folgende Laborbeispiel wurde aufgenommen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen. Bestimmte Aspekte des folgenden Laborbeispiels sind in Bezug auf Techniken und Vorgehensweisen beschrieben, die durch die vorliegenden Erfinder im Rahmen ihrer allgemeinen Arbeitspraxis der Erfindung gefunden oder in Erwägung gezogen wurden. Dieses Laborbeispiel ist beispielhaft durch die Verwendung von standardmäßigen Labortätigkeiten der Erfinder veranschaulicht. Im Licht der vorliegenden Offenbarung und des allgemeinen Fachwissens wird ein Fachmann erkennen, dass das folgende Laborbeispiel lediglich beispielhaft sein soll und dass zahlreiche Änderungen, Modifikationen und Abänderungen eingeführt werden können, ohne von dem eigentlichen Sinn und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Laborbeispiel
Ein gezieltes Eindringen in Zellen stellt einen zunehmend wichtigen Forschungsbereich dar. Der Kern ist ein wünschenswertes Ziel, da die genetischen Informationen der Zelle und die Transkriptionsmaschinerie dort vorliegen. Die Diagnosen des Phänotyps einer Erkrankung, die Identifizierung potentieller Wirkstoffkandidaten und die Behandlung von Erkrankungen durch neue Verfahren, wie beispielsweise eine antisense-Therapie, würde durch den effizienten Transport von Materialien zu lebenden Zellkernen wesentlich verbessert werden (Kole & Sazani, (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3: 229–234). In dem vorliegenden Laborbeispiel wird über das intrazelluläre Schicksal von Goldnanopartikeln berichtet, die chemisch so konstruiert wurden, dass sie vom Äußeren einer lebende Zelle in den Kern gehen.
Obwohl bereits Metall-, Halbleiter-Polymer- und magnetische Partikel in Zellen eingeschleust wurden (Liu et al., (2001) Biomacromolecules 2: 362–368; Marinakos et al., (2001) J. Phys. Chem. B. 105: 8872–8876; West & Halas, (2000) Curr. Opin. Biotech. 11: 215–217; Hogemann et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 116–121) existiert kein umfassender zytochemischer Ansatz dafür, auf den Kern von außerhalb der Plasmamembran lebender Zellen abzuzielen. Die Entwicklung eines Ansatzes, der den Transport Nanometergroßer Partikel in Zellen zulässt, weist wichtige Anwendungen in der Zellbiologie, als Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung und Differenzierung von Zellen, auf.
Es wurde bereits eine Reihe von Techniken verwendet, um zelluläre Bewegungsabläufe von Partikeln zu bestimmen. In der Tat war die Verwendung der Elektronenmikroskopie mit kolloidalen Goldstämmen vielleicht das erste moderne Verfahren der Charakterisierung von Zellstrukturen (Hayat (Hrsg.), (1998) Colloidal Gold. Principles, Methods, and Applications; Academic Press, Inc.: San Diego, Ausg. 1). Kürzlich wurde Fluoreszenzmikroskopie zum Lokalisieren von Fluorophoren, einschließlich lumineszenten CdSe-Nanopartikeln in Zellen, verwendet (Bruchez et al., (1998) Science 281: 2013–2016; Nie & Chan, (1998) Science 281: 2016–2018). Vorher wurden jedoch Untersuchungen der nuklearen Translokation von Nanopartikeln unter Verwenden von Mikroinjektion oder chemisch modifzierten Zellen durchgeführt, wodurch ein Eindringen durch die Zellmembran umgangen wurde. Vor der vorliegenden Offenbarung wurde noch nicht die Kombination aus einer gezielten Endozytose und einer Aufnahme in den Kern in einem Träger von Nanopartikeln unter Verwenden intakter Zellen gezeigt.
Eine gezielte Freisetzung in den Kern ist eine herausfordernde Aufgabe, da jede zellspezifische, nukleäre Sonde mindestens die folgenden Anforderungen erfüllen muss (Hallenbeck & Stevenson, (2000) Targetable Gene Delivery Vectors (Habib, Hrsg.), Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, S. 37–46): sie muss (i) klein genug sein, um in die Zelle eindringen und die Kernmembran überqueren zu können; (ii) mittels zum Beispiel rezeptorvermittelter Endozytose (RME) an zellspezifische Rezeptoren auf der Plasmamembran binden; (iii) endosomalen/lysosomalen Pfaden entgehen; (iv) durch den Kernporenkomplex gelangen und (v) eine geringe Toxizität aufweisen. In dem vorliegenden Laborbeispiel werden Ergebnisse der Untersuchungen intrazellulären Verkehrs von Nanopartikeln, die so konstruiert sind, dass sie diese und andere Funktionen ausführen, berichtet.
Ein Nanopartikel des vorliegenden Laborbeispiels umfasst einen Kern aus einem 20 nm großen Goldpartikel und eine Hülle aus Rinderserumalbumin (BSA), das mit verschiedenen zellulären Targeting-Peptiden konjugiert ist, die in der folgenden Tabelle mit charakteristischen Peptidsequenzen angegeben sind.
Tabelle der charakteristischen Peptidsequenzen
Wenn die in der Tabelle der charakteristischen Peptidsequenzen offenbarten Peptide hergestellt wurden, waren sie mit einem 3-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester-Linker mit BSA konjugiert. Zum Quantifizieren des Verhältnisses von Peptid zu BSA wurde eine Gelelektrophorese (SDS-PAGE und IEF) verwendet. Jedes Peptid wurde so ausgewählt, dass es eine bestimmte Aufgabe (z. B. RME) durchführt. Einzelne Peptide wurden bereits vorher als therapeutische Vektoren zu Freisetzung erforscht (Morris et al., (2000) Curr. Opin. Biotech. 11: 461–466). Ein hocheffizientes Abzielen auf den Kern in der Biologie wird jedoch mit Viren durchgeführt, die für jede oben erwähnte Barriere verschiedene Peptide verwenden. Eine signifikante Beobachtung des vorliegenden Laborbeispiels ist, dass virale Peptide, die mit Proteinen auf der Oberfläche eines Nanopartikels konjugiert sind, ihre Funktion zum Fördern des Eindringens in die Zelle und des Abzielens auf den Kern behalten. Des Weiteren führen einzelne kurze Peptide auf einem einzigen Partikel zu einem effizienteren Abzielen auf den Kern als ein einziges langes Peptid. Zusammen stellen der Goldkern und die multifunktionale Peptidhülle ein flexibles Gerüst bereit, dass so eingestellt werden kann, dass es für intrazelluläre Assays oder eine therapeutische Freisetzung auf bestimmte Zellen abzielt.
Als intrazellulärer Targeting-Vektor wurde Gold vorwiegend aus drei Gründen ausgewählt. Erstens kann Gold routinemäßig in Größen synthetisiert werden, die kontinuierlich von 0,8 nm bis 200 nm mit einer Größenverteilung von < 5% variieren. Zweitens kann Gold mit einer großen Anzahl an kleinen Molekülen, Peptiden, Proteinen, DNA und Polymeren modifiziert werden. Ferner können alle diese funktionellen Elemente, oftmals über einfache Verfahren in einem Reaktionsgemß („One-Pot Procedures"), auf einem einzigen Partikel kombiniert werden. Schließlich weisen Goldpartikel kräftig sichtbare Lichtextinktionen auf, die zum Monitoring ihrer Bewegungsabläufe in den Zellen unter polarisiertem Licht verwendet werden können. Diese Eigenschaften wurden in vorteilhafter Weise in einer neuartigen Kombination einer videoverstärkten Farb-(video-enhanced color, VEC-)Mikroskopie und Differential Interference Contrast-Mikroskopie (DIC) verwendet, die die Beobachtung des Bewegungsablaufs 20 nm großer Goldnanopartikel in Zellen ermöglichten.
Dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie offenbarten, dass BSA-Peptid-Konjugate < 2 nm an den Radius des Nanopartikelkomplexes anfügen. Die Tatsache, dass BSA nicht wesentlich zu der Größe des Goldpartikels beiträgt, ist bei dessen Verwendung zum Konstruieren auf den Kern abgezielter Träger wichtig, da der Durchmesser des Kernporenkomplexes je nach Zelllinie 20 bis 50 nm beträgt (Feldherr & Akin, (1990) J. Cell Biol. 111: 1–8). Die in dem vorliegenden Laborbeispiel verwendeten, 20 nm großen Goldpartikel weisen einen maximalen Durchmesser von 25 nm auf, wenn sie mit irgendeinem der untersuchten BSA-Peptid-Konjugate komplexiert sind (siehe weiterführende Informationen).
Eine nukleäre Translokation durch den Kernporenkomplex wurde bereits unter Verwenden von Goldnanopartikeln, die mit einer NLS aus em SV-40-Virus (großes T-Antigen) markiert worden waren, untersucht. In den klassischen Untersuchungen wurde das Abzielen auf den Kern mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), gefolgt von Mikroinjektion in die Zelle, beobachtet (Feldherr et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A 89: 11002–11005). Als Testfall wurden Nanopartikelkomplexe, die das Peptid N0 umfassen, in das Wachstumsmedium von HepG2-Zellen eingebracht. Überraschenderweise wurden die N0-Komplexe in dem Zytoplasma der HepG2-Zellen beobachtet, N0 drang jedoch nicht in den Kern ein. Versuche bei 4°C zeigten, dass das Eindringen in die Zelle über einen energieabhängigen Pfad erfolgte. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass N0 mittels rezeptorvermittelter Endozytose in die Zelle eindrang, jedoch nicht dazu in der Lage war, dem Endosom zu entkommen und in den Kern zu gelangen (eine TEM- und Konfokal-Fluoreszenzmikroskopie bestätigten, dass die Nanopartikel auf Endosome beschränkt waren). Diese Ergebnisse heben die Herausforderungen hervor, die mit einem Abzielen auf den Kern in Verbindung stehen: obwohl ein bekanntes NLS-Peptid dazu in der Lage ist, in HepG2-Zellen einzudringen, kann es nicht zu dem Kern gelangen, solange es nicht dazu in der Lage ist, dem Endosom zu entkommen.
In dem Bemühen, die Effizienz des Abzielens auf den Kern in HepG2-Zellen zu verbessern, wurden Peptide aus Adenoviren untersucht. Der Adenovirus wird weithin bei der Freisetzung von Genen verwendet und es besteht ein großer Anteil des Interesses daran, den gesamten Virus zu ersetzen, der potential infektiös und immunogen ist und Peptidsequenzen aufweist, die von dem Adenovirus-Faserprotein stammen (Seth, (2000) Adenoviral Vectors; (Habib, Hrsg.) Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, S. 13–22; Bilbao et al., (1998) Targeted Adenoviral vectors for Cancer Gene Therapy, Plenum Press: New York, Ausg. 57, S. 365–374). Es ist bekannt, dass dieses Protein sowohl RME- als auch NLS-Sequenzen (N1 und N2 in der Tabelle der charakteristischen Peptidsequenzen) enthält. Die vollständig lange Faser, die sowohl die RME als auch das NLS enthält, ist das Peptid N3 in der Tabelle der charakteristischen Peptidsequenzen. Ein Vergleich der Funktionen dieser Targeting-Peptide, wenn sie mit einem Goldnanopartikel komplexiert sind, ist folgendermaßen. N1 dringt nicht in die Zelle ein. N2 dringt in die Zelle ein, bleibt jedoch in den Endosomen gefangen und erreicht nicht den Kern. N3 gelangt zu dem Kern, obwohl N1/N2 einen größeren Hang für ein Abzielen auf den Kern als N1, N2 oder N3 aufweist.
Diese Ergebnisse werden wie folgt interpretiert. N1 zeigt nur das Adenovirus-NLS (Tabelle der charakteristischen Peptidsequenzen). Dieses Peptid fungiert nicht als RME und weist keinen anderen chemischen Rest auf, der ein Eindringen in die Zelle zulässt. N2 zeigt die RME (NPXY-(SEQ ID NO: 7)Motiv) und dringt in die Zelle ein, es ist jedoch nicht dazu in der Lage, zu dem Kern zu gelangen (Chen et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 3116–3123).
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Nanopartikelkomplex sowohl RME als auch NLS zeigen muss, um sowohl in die Zelle eindringen zu können, als auch eine nukleäre Lokalisierung zu erreichen. In Übereinstimmung mit einer Untersuchung der Freisetzung von Genen unter Verwenden dieses Peptids (Zhang et al., (1999) Gene Ther. 6: 171–181) zeigen die VEC-DIC-Ergebnisse deutlich signifikante Mengen von N3 in dem Kern. Der mit N1/N2 markierte Nanopartikel ist noch effizienter, wie mittels VEC-DIC-Mikroskopie gesehen werden kann.
Ein weiterer Vergleich, der angestellt werden muss, ist der zwischen einem multifunktionalen Nanopartikel N1/N2, der die RME und das NLS auf verschiedenen BSA-Biokonjugaten zeigt, und N3, der das vollständig lange adenovirale Faserpeptid zeigt. N1/N2 war in größeren Mengen in dem Kern vorhanden als N3. Der Ursprung der höheren Effizienz des Abzielens auf den Kern in Partikeln, die zwei kurze Peptide tragen, gegenüber einer langen Sequenz könnte strukturell oder räumlich sein. Eine Infrarotspektroskopie zeigt an, dass alle in diesem Beispiel verwendeten Peptide, einen erweiterten Nachweis annehmen, wenn sie mit Nanopartikeln verknüpft sind. Wenn ein langes Peptid mit zwei aufeinander folgenden Signalen synthetisiert ist, ist es jedoch wahrscheinlich, dass eines der Signale für zelluläre Rezeptoren weniger zugänglich sein wird. Dies ist zum Beispiel für NPXY-(SEQ ID NO: 7)Motive wichtig, da gezeigt wurde, dass eine gleichzeitige Wechselwirkung von zwei NPXY-(SEQ ID NO: 7)Bereichen eine RME ermöglicht (Hussain, (2001) Front. Biosci. 6: 417–428). Das Verknüpfen der Zwei-Peptid-Signale mit einem Nanopartikel als einzelne, kürzere Abschnitte verleiht diesen wahrscheinlich einen gleichen Zugang zu zellulären Rezeptoren.
Die hier verwendeten Verfahren stellen einen Ansatz zum schnellen Beurteilen der Effizienz verschiedener Kombinationen von Targeting-Peptiden unter Verwenden von Nanopartikelkomplexem zum Abzielen auf den Kern bereit. Die Kombination aus VEC-DIC- Mikroskopie lässt eine Untersuchung von hunderten von Proben pro Tag zu, was eine Verbesserung gegenüber den kostenintensiven und zeitaufwendigen Elektronen- und Konfokalmikroskopietechniken darstellt.
Der unter Verwenden adenoviraler Targeting-Sequenzen gezeigte, multifunktionale Ansatz stellt einen Test der Funktion einzelner Peptidsequenzen bereit, was ein effektives und zellspezifisches Abzielen für einen Bereich wissenschaftlicher und medizinischer Anwendungen erlauben wird.
Druckschriften
Auf die unten angegeben Druckschriften sowie alle in der Beschreibung genannten Druckschriften wird hierin in dem Ausmaß Bezug genommen, indem sie einen Hintergrund oder eine Lehre für die Methodik, Techniken und/oder Zusammensetzungen, die hierin offenbart sind, ergänzen, erläutern, bereitstellen.

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Sequenzprotokoll

Claims

Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, umfassend: (a) einen Nanopartikel; (b) einen Wirkstoff; (c) ein nukleäres Lokalisierungssignal; und (d) eines oder mehrere extrazelluläre Targeting-Mittel.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1, wobei der Nanopartikel ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Metallen, Keramiken, Halbleitern und Polymeren.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1, wobei der Nanopartikel biologisch abbaubar ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1, wobei jede Sequenz unabhängig mit dem Nanopartikel assoziiert ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1, ferner umfassend eine Schutzhülle, die wenigstens einen Teil des Trägers zur Freisetzung bedeckt.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, umfassend: (a) eine Vielzahl verschiedener Targeting-Mittel, wobei die Vielzahl verschiedener Targeting-Mittel ein nukleäres Lokalisierungssignal und eines oder mehrere extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; (b) ein Nanopartikelgerüst, wobei das Nanopartikelgerüst ein Material umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cadmiumselenid, Titan, Titandioxid, Zinn, Zinnoxid, Silizium, Siliziumdioxid, Eisen, Eisen(III)oxid, Silber, Nickel, Gold, Kupfer, Aluminium, Stahl, Cobalt-Chrom-Legierung, Titanlegierung, Brushit, Tricalciumphosphat, Aluminiumoxid, Siliziumoxid, Zirkoniumoxid, Diamant, Polystyrol, Siliziumgummi, Polycarbonat, Polyurethane, Polypropylene, Polymethylmethacrylat, Polyvinylchlorid, Polyether und Polyethylen; und (c) einen Wirkstoff.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 6, wobei jedes Targeting-Mittel unabhängig mit dem Nanopartikel assoziiert ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei das extrazelluläre Targeting-Mittel ein RME-Motiv ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei das extrazelluläre Targeting-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Diphtherie-Toxin, Pseudomonas-Toxin, Cholera-Toxin, Ricin, Concanavalin A, Rous-Sarkoma-Virus, Semliki-Forest-Virus, vesikulärem Stomatitis-Virus, Adenovirus, Transferrin, Low Density-Lipoprotein, Transcobalamin, Dotter-Proteinen, IgE, polymerem IgA, mütterlichem IgG, Insulin, epidermalem Wachstumsfaktor, Wachstumshormon, schilddrüsenstimulierendem Hormon, Nervenwachstumsfaktor, Calcitonin, Glucagon, Prolactin, luteinisierendem Hormon, Schilddrüsenhormon, Platelet derived Growth Factor, Interferon, nukleärem Lokalisierungssignal und Catecholaminen.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei das extrazelluläre Targeting-Mittel ein Fragment eines Moleküls umfasst, das ausgewählt ist, aus der Gruppe, bestehend aus Diphtherie-Toxin, Pseudomonas-Toxin, Cholera-Toxin, Ricin, Concanavalin A, Rous-Sarkoma-Virus, Semliki-Forest-Virus, vesikulärem Stomatitis-Virus, Adenvirus, Transferrin, Low Density-Lipoprotein, Transcobalamin, Dotter-Proteinen, IgE, polymerem IgA, mütterlichem IgG, Insulin, epidermalem Wachstumsfaktor, Wachstumshormon, Schilddrüsestimulierendem Hormon, Nervenwachstumsfaktor, Calcitonin, Glucagon, Prolactin, luteinisierendem Hormon, Schilddrüsenhormon, Platelet derived Growth Factor, Interferon und Catecholaminen.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei die Targeting-Mittel ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 4 bis 6 und Kombinationen davon.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 6, wobei das Nanopartikelgerüst biologisch abbaubar ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei der Nanopartikel einen Durchmesser von ungefähr 30 nm oder weniger aufweist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oligomeren von doppelsträngigen Nukleinsäuren, einzelsträngigen Nukleinsäuren, chemisch modifizierten Nukleinsäuren, Peptid-Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, weiter umfassend eine Anbindungssequenz, die mit dem Wirkstoff und dem Nanopartikel verknüpft und zwischen diesen angeordnet ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, weiter umfassend zwei oder mehrere verschiedene Wirkstoffe.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, wobei der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel angeordnet ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, weiter umfassend einen nachweisbaren Rest, wobei der nachweisbare Rest vorzugsweise eine fluoreszierende Verbindung ist.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, weiter umfassend ein die Biokompatibilität erhöhendes Mittel.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach Anspruch 1 oder 6, weiter umfassend eine Schutzhülle, die wenigstens einen Teil des Trägers zur Freisetzung bedeckt.
Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln nach einem der Ansprüche 5 oder 20, weiter umfassend eine Schutzhülle, die den gesamten Träger zur Freisetzung bedeckt, wobei die Schutzhülle vorzugsweise ein Polymer oder ein biologisches Material umfasst, wobei das biologische Material vorzugsweise ein Protein, Lipid, Kohlenhydrat oder eine Kombination davon ist.
In vitro-Verfahren zum Freisetzen eines Wirkstoffs in den Kern einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der ein Nanopartikel-Gerüst mit einem Durchmesser von ungefähr 30 nm oder weniger und einen Wirkstoff und eine Vielzahl von Targeting-Mitteln umfasst, wobei die Vielzahl von Targeting-Mitteln ein nukleäres Lokalisierungssignal und eines oder mehrere verschiedene, extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; und (b) In-Kontakt-Bringen einer intakten Zielzelle mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, wobei der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in die Zelle eindringt und die Kernmembran überquert, wodurch ein Wirkstoff in den Kern einer Zielzelle freigesetzt wird.
In vitro-Verfahren zum Modulieren der Expression einer Zielnukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der einen Nanopartikel, eine Vielzahl von Targeting-Mitteln und einen Wirkstoff umfasst, der dazu in der Lage ist, mit einer Zielnukleinsäuresequenz, deren Expression moduliert werden soll, wechselzuwirken, wobei die Vielzahl von verschiedenen Targeting-Mitteln ein nukleäres Lokalisierungssignal und eines oder mehrere verschiedene, extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen einer Zielzelle, die eine Zielnukleinsäuresequenz umfasst, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln, wobei der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln in die Zelle eindringt und die Kernmembran überquert; und (c) Modulieren der Expression der Zielnukleinsäuresequenz durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b), wodurch die Expression einer Zielnukleinsäuresequenz moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, weiter umfassend das Bestimmen eines Grades, bis zu dem die Zielnukleinsäuresequenz exprimiert wird.
In vitro-Verfahren zum Modulieren der Expression eines Zielproteins, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der einen Nanopartikel, eine Vielzahl von Targeting-Mitteln und eine einzelsträngige antisense-Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die für ein Zielprotein kodiert, wobei die Vielzahl von verschiedenen Targeting-Mitteln ein nukleares Lokalisierungssignal und eines oder mehrere verschiedene, extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen einer Zielzelle, die eine Zielnukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Zielprotein kodiert, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) Modulieren der Expression des Zielproteins durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b), wodurch die Expression eines Zielproteins moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, weiter umfassend das Bestimmen eines Grades, bis zu dem das Zielprotein exprimiert wird.
In vitro-Verfahren zum Modulieren der Transkription in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der einen Nanopartikel, eine Vielzahl von Targeting-Mitteln und einen Wirkstoff umfasst, der einen Liganden umfasst, zu dem ein Wildtyp-Transkriptionsbestandteil eine höhere Affinität als ein natürlicher Ligand des Wildtyp-Transkriptionsbestandteils hat, wobei die Vielzahl von verschiedenen Targeting-Mitteln ein nukleäres Lokalisierungssignal und eines oder mehrere verschiedene, extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die den Wildtyp-Transkriptionsbestandteil umfasst, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) Modulieren der Transkription in der Probe durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b), wodurch die Transkription in einer Probe moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Ligand, zu dem ein Wildtyp-Transkriptionsbestandteil eine höhere Affinität als ein natürlicher Ligand des Wildtyp-Transkriptionsbestandteils hat, ein Morpholino-Oligonukleotid umfasst; oder wobei der Ligand, zu dem ein Wildtyp-Transkriptionsbestandteil eine höhere Affinität als ein natürlicher Ligand des Wildtyp-Transkriptionsbestandteils hat, modifizierte Phosphodiesterbindungen umfasst; oder wobei der Ligand, zu dem ein Wildtyp-Transkriptionsbestandteil eine höhere Affinität als ein natürlicher Ligand des Wildtyp-Transkriptionsbestandteils hat, die Fähigkeit besitzt, mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein regulatorisches Protein kodiert, wechselzuwirken, um dadurch wenigstens eines von (a) einer nicht-transkribierbaren, dreidimensionalen Struktur und (b) einer nicht-translatierbaren, dreidimensionalen Struktur zu bilden, oder wobei der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln weiter eine Anbindungssequenz umfasst, die mit dem Liganden, zu dem ein Wildtyp-Transkriptionsbestandteil eine höhere Affinität als ein natürlicher Ligand des Wildtyp-Transkriptionsbestandteil hat, und dem Nanopartikel verknüpft ist und zwischen diesen angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 27, weiter umfassend das Bestimmen eines Grades, bis zu dem eine Transkription moduliert wird.
Verfahren zum Modulieren von RNA-Splicing in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der einen Nanopartikel, eine Vielzahl von Targeting-Mitteln und eine Nukleinsäuresequenz umfasst, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das Splicing-Muster für ein Zielgen ändert, wobei die Vielzahl von verschiedenen Targeting-Mitteln ein nukleäres Lokalisierungssignal und eines oder mehrere verschiedene, extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die das Zielgen umfasst, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) Modulieren des RNA-Splicing in einer Probe durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b), wodurch das RNA-Splicing in einer Probe moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Nukleinsäuresequenz, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das Splicing-Muster für ein Zielgen ändert, ein Morpholino-Oligonukleotid umfasst, oder wobei die Nukleinsäuresequenz, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das Splicing-Muster für ein Zielgen ändert, modifizierte Phosphodiesterbindungen umfasst, oder wobei der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln weiter eine Anbindungssequenz umfasst, die mit der Nukleinsäuresequenz, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie das Splicing-Muster für ein Zielgen ändert, und dem Nanopartikel verknüpft ist und zwischen diesen angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 30, weiter umfassend das Bestimmen eines Grades, bis zu dem das RNA-Splicing in einer Probe moduliert wird.
In vitro-Verfahren zum Modulieren der Translation einer mRNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln, der einen Nanopartikel, eine Vielzahl von Targeting-Mitteln und eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu einer Nukleinsäuresequenz einer mRNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Protein von Interesse kodiert, wobei die Vielzahl von verschiedenen Targeting-Mitteln ein nukleäres Lokalisierungssignal und eines oder mehrere verschiedene, extrazelluläre Targeting-Mittel umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die die mRNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein von Interesse kodiert, mit dem Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln; und (c) Modulieren der Translation einer mRNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, durch das In-Kontakt-Bringen in Schritt (b), wodurch die Translation einer mRNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, moduliert wird.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 33, wobei die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz der mRNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Protein von Interesse kodiert, ein Morpholino-Oligonukleotid umfasst, oder wobei die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz der mRNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Protein von Interesse kodiert, modifizierte Phosphodiesterbindungen umfasst, oder wobei die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz der mRNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Protein von Interesse kodiert, die Fähigkeit besitzt, mit der Nukleinsäuresequenz der mRNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, wechselzuwirken, um dadurch wenigstens eine von (a) einer nicht-transkribierbaren, dreidimensionale Struktur und (b) einer nicht-translatierbaren, dreidimensionalen Struktur zu bilden, oder wobei der Träger zur Freisetzung von Nanopartikeln weiter eine Anbindungssequenz umfasst, die mit der einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz der mRNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Protein von Interesse kodiert, und dem Nanopartikel verknüpft ist und zwischen diesen angeordnet ist.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 33, weiter umfassend das Bestimmen eines Grades, bis zu dem die Konzentration eines regulatorischen Proteins in Lösung moduliert wird.
In vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 23, 24, 25, 29, 32, 33 oder 35, wobei das Bestimmen durch eine Technik erfolgt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SDS-PAGE, Enzymaktivitätstest, auf ELISA basierendem Test, spektroskopischem Test, Northern Blot, Southern Blot und auf Radiologie basierendem Test.
Verwendung eines Trägers zur Freisetzung von Nanopartikeln gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Gentherapie, zur Modulation von Genexpression oder zur Modulation von RNA-Splicing.