DE60224287T2

DE60224287T2 - Lytische reagenszusammensetzung zur bestimmung zellkernhaltiger roter blutkörperchen

Info

Publication number: DE60224287T2
Application number: DE60224287T
Authority: DE
Inventors: Yi Miami LI; Jing Miami LI
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2022-07-16
Also published as: US6573102B2; JP4170903B2; JP2004537725A; EP1419381A4; US20030040115A1; EP1419381A1; WO2003012426A1; DE60224287D1; EP1419381B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine lytische Reagenszusammensetzung zur Bestimmung zellkernhaltiger Blutkörperchen in einer Blutprobe. Genauer gesagt, ermöglicht die lytische Reagenszusammensetzung die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten in einer Blutprobe durch eine Gleichstromimpedanzmessung. Überdies kann die lytische Reagenszusammensetzung ferner zum Messen der Gesamt-Hämoglobinkonzentration der Blutprobe verwendet werden.
Hintergrundtechnik
Normales peripheres Blut enthält reife rote Blutkörperchen, die keinen Zellkern aufweisen. Zellkernhaltige rote Blutkörperchen (NRBCs), oder Erythroblasten, sind unreife rote Blutkörperchen. Sie kommen normalerweise im Knochenmark, aber nicht im peripheren Blut vor. Bei bestimmten Krankheiten wie Anämie und Leukämie kommen NRBCs jedoch auch im peripheren Blut vor. Klinisch gesehen ist es daher wichtig, NRBCs zu messen. Traditionell wird die Differenzierung und Zählung von NRBCs manuell durchgeführt. Das Verfahren umfaßt das Ausstreichen einer Blutprobe auf einen Objektträger und das Färben des Trägers, gefolgt von der manuellen visuellen Analyse des einzelnen Trägers. Die NRBC-Konzentration wird als Anzahl an NRBCs pro 100 weiße Blutkörperchen angegeben. Für gewöhnlich werden 200 weiße Blutkörperchen und die Anzahl an NRBCs, die in derselben Region auf einem Blutabstrich vorhanden sind, gezählt und die Anzahl durch 2 geteilt, um die NRBC-Konzentration als die Anzahl an NRBCs/100 WBK auszudrücken. Dieser Ansatz ist extrem zeitaufwendig und auch in bezug die Interpretation desjenigen, der den Träger analysiert, subjektiv.
In den letzten Jahren sind mehrere Fluoreszenz-Durchflußzytometrie-Verfahren zur Differenzierung von NRBCs entwickelt worden. Diese Verfahren nutzen eine spezielle Kernfärbungstechnik zur Unterscheidung von NRBCs von anderen Zellarten, da es schwierig ist, NRBCs, basierend auf ihren elektronischen oder optischen Eigenschaften, zu differenzieren.
US-Patent Nr. 5,298,426 (Inami et al.) offenbart ein Fluoreszenzverfahren zur Differenzierung von NRBCs. Das Verfahren nutzt eine Zweischrittfärbung unter Verwendung eines ersten Fluids, das eine saure hypotonische fluoreszierende Farbstofflösung ist, und eines zweiten Fluids, das die Osmolalität und den pH des ersten Fluids verändert. Inami et al. lehren, daß das erste Fluid einen Erythroblast-färbenden Farbstoff enthält, der in zellkernhaltige rote Blutkörperchen diffundiert und speziell deren Kern färbt, und dann das Trennen einer Gruppe von NRBCs von anderen Zellgruppen auf einem zweidimensionalen Plot, wodurch die Ergebnisse der NRBC-Differenzierung berechnet werden.
Die US-Patente Nr. 5,516,695 und 5,648,225 (Kim et al.) offenbaren ein Mehrzweck-Lysereagenssystem und ein Verfahren der Verwendung zur Unterteilung zellkernhaltiger Blutkörperchen. Das Lysereagens umfaßt ein nicht-quartäres Ammoniumsalz, einen aliphatischen Aldehyd, einen Nicht-Phosphatpuffer, der gegenüber dem aliphatischen Aldehyd inert ist, und einen Kernfarbstoff. Das Verfahren umfaßt die Schritte der Lyse einer Blutprobe mit dem Lysereagens, das Inkubieren des Probegemisches bei einer erhöhten Temperatur und das Bestimmen der zellkernhaltigen Blutkörperchen, einschließlich NRBCs, mit einem automatischen elektrooptischen Hämatologieinstrument.
US-Patent Nr. 5,559,037 (Kim et al.) offenbart ein Verfahren für die durchflußzytometrische Analyse von NRBCs und Leukozyten. Das Verfahren umfaßt die Lyse von roten Blutkörperchen und NRBC-Zytoplasma aus einer Vollblutprobe, um den NRBC-Kern einem vitalen Kernfarbstoff auszusetzen und das Eindringen des vitalen Kernfarbstoffes in die Leukozyten zu minimieren, und die Analyse der Probe durch Messen der Fluoreszenz und zweier Lichtstreuungswinkel. Da Leukozyten auch zell kernhaltige Zellen sind, muß eine Färbung dieser Zellen verhindert werden, um eine Interferenz mit der Fluoreszenzmessung zu vermeiden. Die Konservierung der Leukozytenmembran und die Minimierung des Eindringens des Kernfarbstoffes in die Leukozyten werden durch gleichzeitige Fixierung der Leukozyten mit einem aliphatischen Aldehyd während der Lyse der roten Blutkörperchen erreicht. Aldehydfixative sind als gefährliche Chemikalien bekannt. Überdies erfordert dieses Verfahren das Erwärmen des Reagens auf 42°C, um die NRBC- und Leukozyten-Differenzierung zu erreichen.
EP 1 004 880 A2 offenbart Reagenzien und ein Verfahren zur Unterscheidung und Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Die Reagenzien umfassen ein hämolytisches Mittel zum Auflösen roter Blutkörperchen und konditionieren weißer Blutkörperchen und NRBCs in einer Probe, damit diese gefärbt werden kann; und mindestens einen fluoreszierenden Farbstoff, der so gewählt ist, daß er weiße Blutkörperchen und NRBCs differenziert färbt. Das Verfahren umfaßt die Schritte der Lyse roter Blutkörperchen, das Färben von weißen Blutkörperchen und NRBCs, das Analysieren der Probe durch Messen mindestens eines Streulichtparameters und mindestens eines Fluoreszenzparameters.
US-Patent Nr. 5,874,310 (Li et al.) offenbart Reagenzien und ein Verfahren zur Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Das Verfahren umfaßt das Aussetzen einer Blutprobe einem Lysereagenssystem zur Lyse reifer Blutkörperchen und Analyse der Probe in einer Durchflußzelle durch zwei Kleinwinkel-Lichtstreuungsmessungen zur Differenzierung von NRBCs von anderen Zellarten. Das Verfahren umfaßt ferner die gleichzeitige Differenzierung weißer Blutkörperchen unter Verwendung elektronischer und optischer Analyse, wobei die elektronische Analyse eine DC-Impedanzmessung ist.
US-Patent Nr. 5,917,584 (Li et al.) offenbart ein Verfahren zur Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Das Verfahren umfaßt die Lyse reifer roter Blutkörperchen in einer Blutprobe; die Analyse der Probe in einer Durchflußzelle durch zwei Winkel einer Lichtstreuungsmessung zur Differenzierung von NRBCs von ande ren Zellarten, wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Mittelwinkel- oder ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal ist.
Die oben beschriebenen Verfahren ermöglichen die Differenzierung und Zählung von NRBCs und Leukozyten durch Fluoreszenz-Durchflußzytometrie und Lichtstreuungsmessungen. Fluoreszenz- und Lichtstreuungsmessungen sind jedoch komplexe und teure Detektionsverfahren.
Viele der derzeitigen automatisierten Nicht-Fluoreszenz-Hämatologie-Analysegeräte wie Abbott Cell-Dyn^® 3500, COULTER^® Gen•S^TM, Bayer Advia*120^® und Sysmex^TM NE-9000 können nur eine NRBC-Markierung für die mögliche Gegenwart von NRBCs in einer analysierten Blutprobe liefern, wenn die Instrumente eine erhöhte Menge an Signalen nahe einem Debrisbereich roter Blutkörperchen eines erhaltenen Zellverteilungshistogramms erkennen. Solche Verfahren neigen jedoch dazu, falsche positive Markierungen zu erzeugen, da viele andere Blutanomalien verstärkte Signale in demselben Bereich verursachen können, wie Plättchenklumpen und Sichelzellen sowie Trümmer roter Zellen aus unzureichend lysierten Blutproben. In diesen Verfahren werden NRBCs nicht eindeutig identifiziert. Statt dessen wird von dem Instrument nur ein übliches NRBC-Probenverteilungsmuster in einem Histogramm oder einem Punktdiagramm erkannt, das mit einem ähnlichen Muster, erzeugt durch die oben genannten anderen Umstände, verwechselt werden kann. Die markierten Proben, einschließlich der falschen positiven Markierungen, müssen in Kliniklaboren mit einem manuellen Verfahren erneut überprüft werden.
Ferner ist ein allgemein bekanntes Problem mit NRBC-enthaltenden Proben die fehlerhafte Zählung weißer Blutkörperchen (WBK), aufgezeichnet mit einem Hämatologieanalysegerät, bei diesen Proben. Da die Zellkernvolumen der NRBCs nahe denen der weißen Blutkörperchen liegen, werden die NRBCs auf Hämatologieanalysegeräten, die die Größe der Blutkörperchen messen, üblicherweise als weiße Blutkörperchen gezählt, wodurch die WBK erhöht werden. Daher mußt die NRBC-Beteiligung an den WBK, aufgezeichnet mit einem Hämatologieanalysegerät für Proben, die NRBC enthalten, korrigiert werden. Derzeit werden in der Praxis in Kliniklaboren die NRBC-Zahlen, die durch manuelles Zählen erhalten wurden, von den WBK, aufge zeichnet von dem Hämatologieanalysegerät, subtrahiert. Das ist zeitaufwendig und fehleranfällig.
In einem anderen Aspekt sind verschiedene lytische Reagenszusammensetzungen für die Analyse weißer Blutkörperchen in der Technik bekannt. US-Patent Nr. 5,618,733 (Tsuji et al.) offenbart ein Reagens zur Analyse von Leukozyten, das ein ionisches oberflächenaktives Mittel; mindestens eine organische Verbindung mit einer hydrophoben Gruppe und einer Säuregruppe mit einer negativen Ladung in einer wäßrigen Lösung zur Konservierung der Leukozytenmorphologie durch das Vereinigen mit einer kationischen Komponente in Leukozyten; ein nicht-ionisches oberflächenaktiv Mittel und einen Puffer umfaßt.
US-Patent Nr. 4,528,274 (Carter et al.) offenbart ein Lysereagens zur Bestimmung von mindestens zwei Leukozytenpopulationen in Blut. Das Lysereagens umfaßt eine wäßrige Lösung aus mindestens zwei quartären Ammoniumsalzen und einem nicht-kationischen oberflächenaktiven Additiv, das nicht-ionisches polyoxyethyliertes Alkylphenol umfaßt. Der Stand der Technik lehrt, daß die quartären Ammoniumsalze und das Additiv in ausreichenden Mengen vorliegen, um die Populationen an weißen Blutkörperchen bezogen aufeinander innerhalb der Meßzeit des Blutanalysegerätes zu positionieren.
Die Lysereagenzien ermöglichen die Differenzierung von Subpopulationen weißer Blutkörperchen durch die Konservierung der Morphologie der weißen Blutkörperchen oder durch die Kontrolle der Größe der Subpopulationen. Diese Reagenzien differenzieren jedoch zellkernhaltige rote Blutkörperchen von anderen Zellarten nicht.
Ferner ist die Messung der Hämoglobinkonzentration (Hgb-Konzentration) von Blutproben ein wesentlicher Bestandteil der Blutanalyse, der für die Krankheitsdiagnose und zum Überwachen der Reaktionen auf eine medizinische Behandlung wichtig ist. Man sollte in der Lage sein, mehrere diagnostische Analysen wie die Zählung zellkernhaltiger Blutkörperchen und das Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe unter Verwendung desselben Reagens und gleichzeitige Detektionen zu bewerkstelligen.
Von den vielen allgemein bekannten Verfahren zur Hämoglobinbestimmung ist die Cyanmethämoglobin-Methode von dem International Committee for Standardization in Hematology als ein Standard empfohlen worden. Die Gegenwart von Cyanid im Reagensabfall hat jedoch zu ernsten Umweltproblemen geführt. In den letzten zehn Jahren sind enorme Bemühungen in die Entwicklung automatisierter Hämoglobinanalyseverfahren ohne die Nutzung von Cyanid gesteckt worden.
US-Patent Nr. 5,242,832 (Sakata) offenbart ein Cyanid-freies Lysereagens zum Zählen weißer Blutkörperchen und Messen der Hämoglobinkonzentration in einer Blutprobe. Das Lysereagens umfaßt mindestens ein erstes oberflächenaktives Mittel, das ein quartäres Ammoniumsalz ist, mindestens ein zweites oberflächenaktives Mittel, das kationische und amphotere oberflächenaktive Mittel umfaßt, und mindestens einen Hämoglobinstabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Tiron, 8-Hydroxychinolin, Bipyridin, 1-10-Phenanthrolin, phenolische Verbindungen, Eisphenol, Pyrazol und Derivate, 2-Phenyl-5-pyrazolon und Derivate, Phenyl-3-pyrazolon und Imidazol und seine Derivate.
PCT/US95/02897 (Kim) offenbart ein Cyanid-freies Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Hämoglobin in einer Vollblutprobe. Das Reagens umfaßt einen Liganden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol und Derivaten, N-Hydroxyacetamid, H-Hydroxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin, und ein oberflächenaktives Mittel mit einer starken erythrolytischen Fähigkeit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lauryldimethylaminoxid und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Das Analyseverfahren ist schnell, weniger als 10 Sekunden. Das Reagens funktioniert jedoch nur unter extrem alkalischen Bedingungen, pH 11 bis 14. Überdies wird von Kim weder die Fähigkeit zum Zählen von Leukozyten noch zur Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten gelehrt.
US-Patent Nr. 5,763,280 (Li et al.) offenbart Cyanid-freie Reagenzien zum Messen von Hämoglobin in einer Blutprobe, zum Zählen von Leukozyten und zur Differenzierung von Leukozyten-Subpopulationen. Das Reagens umfaßt ein hämolytisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus quartären Ammoniumsalzen, Pyridiniumsalzen, organischen Phosphatestern und organischen Sulfonaten zur Lyse von Erythrozyten und Freisetzung von Hämoglobin, und einen organischen Liganden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Triazol und seinen Derivaten, Tetrazol und seinen Derivaten, Alkalimetallsalzen von Oxonsäure, Melamin, Anilin-2-sulfonsäure, Chinaldinsäure, 2-Amino-1,3,4-thiadiazol, Triazin und seinen Derivaten, Urazol, DL-Pipecolinsäure, Isonicotinamid, Anthranilonitril, 6-Aza-2-thiothymin, Adenin, 3-(2-Thienyl)acrylsäure, Benzoesäure und Alkalimetall- und Ammoniumsalzen von Benzoesäure und Pyrazin und seinen Derivaten, um so ein stabiles Chromogen mit Hämoglobin zu bilden.
Auch US-Patent Nr. 5,882,934 (Li et al.) offenbart Cyanid-freie Reagenzien zur Messung von Hämoglobin in einer Blutprobe, zum Zählen von Leukozyten und zur Differenzierung von Leukozyt-Subpopulationen. Die Reagenzien umfassen ferner neben hämolytischen oberflächenaktiven Mitteln und organischen Liganden zum Einstellen der Leitfähigkeit der Reagenzien für die Impedanzmessung Salze. Keines der oben beschriebenen Cyanid-freien Reagenzien und Hämoglobinmeßverfahren ermöglicht jedoch die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten und die Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen in einer Blutprobe.
Basierend auf dem Vorstehenden besteht nach wie vor der Bedarf nach einem Reagens, das ein einfaches und kostengünstigeres Analyseverfahren zur Differenzierung und Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen ermöglicht. Ferner ist ein multifunktionales Reagens wünschenswert, das die Zählung zellkernhaltiger Blutkörperchen, Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten und Messung der Hämoglobinkonzentration in Abwesenheit von Cyanid ermöglicht.
EP0444241-A offenbart eine lytische Reagenszusammensetzung zur Lyse roter Blutkörperchen, umfassend ein quartäres Ammoniumsalz und ein oberflächenaktives Mittel. Es ist auf die Lyse roter Blutkörperchen, das Zählen von Leukozyten und das Messen der Hämoglobinkonzentration im Blut gerichtet.
EP0177137-A bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur Differenzierung weißer Blutkörperchen, aber auch auf die Quantifizierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Zusammensetzungen, die aliphatische Alkoholether und ein quartäres Ammoniumsalz umfassen, werden auch offenbart. Die Zusammensetzungen umfassen keine ethoxylierten Akylphenole.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine lyische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen in einer Blutprobe. Die lytische Reagenszusammensetzung umfaßt mindestens ein oberflächenaktives Mittel auf der Basis eines quartären Ammoniums, ein ethoxyliertes Phenol und einen ethoxylierten Alkohol, und hat einen pH im Bereich von etwa 2 bis etwa 11. Beim Mischen mit einer mit einem Verdünnungsmittel vorverdünnten Blutprobe lysiert die lytische Reagenszusammensetzung rote Blutkörperchen und ermöglicht eine Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten durch DC-Impedanzmessung.
Die lytische Reagenszusammensetzung kann weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfassen, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Bestimmen der Hämoglobingesamtkonzentration einer Blutprobe durch Messen des spektrophotometrischen Absorptionsvermögens bei vorbestimmten Wellenlängen zu bilden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein lytisches Reagenssystem zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen in einer Blutprobe, das eine lytische Reagenszusammensetzung und ein Verdünnungsmittel umfaßt. Die lytische Reagenszusammensetzung umfaßt mindestens ein oberflächenaktives Mittel auf der Basis eines quartären Ammoniums, ein ethoxyliertes Phenol und einen ethoxylierten Alkohol und hat einen pH im Bereich von etwa 2 bis etwa 11. Das Verdünnungsmittel ist eine neutrale wäßrige Lösung, umfassend ein Salz oder Salze zur Einstellung der Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels derart, daß sie für eine Impedanzmessung ausreichend ist, und ein antimikrobielles Mittel. Das lytische Reagenssystem kann ferner entweder in einer lytischen Reagenszusammensetzung oder in dem Verdünnungs mittel einen organischen Liganden zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine lytische Reagenszusammensetzung, umfassend mindestens ein oberflächenaktiv Mittel auf der Basis von quartärem Ammonium, ein ethoxyliertes Phenol, einen ethoxyliertes Alkohol und ein Salz oder Salze zur Einstellung der Leitfähigkeit der lytischen Reagenszusammensetzung derart, daß sie für eine Impedanzmessung ausreichend ist. Die lytische Reagenszusammensetzung kann ferner einen organischen Liganden für die Hämoglobinmessung umfassen. Diese lytische Reagenszusammensetzung kann zum kombinierten Verdünnen und Lysieren und zur Herstellung einer Blutprobe zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen in einem Schritt verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A, 1B und 1C sind die DC-Histogramme von Vollblutproben, verarbeitet gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt eine Reihe von Absorptionsspektren einer Blutprobe, verarbeitet gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 2. Insgesamt zwölf Spektren wurden in 120 Sekunden mit einem 10-Sekunden-Intervall gewonnen.
3A zeigt ein Spektrum einer Vollblutprobe, behandelt gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagens- und Verdünnungsmittelzusammensetzungen aus Beispiel 3. 3B zeigt ein Histogramm einer klinischen Vollblutprobe, erhalten gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagens- und Verdünnungsmittelzusammensetzungen aus Beispiel 3.
4A zeigt die Korrelation der NRBC-Konzentration, erhalten durch die Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, beschrieben in Beispiel 4, zu den manuellen Referenzergebnissen.
4B zeigt die Korrelation der Hämoglobinkonzentration, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, beschrieben in Beispiel 4, zu der, die unter Verwendung von Lyse S^® III diff auf COUNTER Gen•S erhalten wurde. 4C zeigt die Korrelation einer korrigierten WBK-Zählung, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, beschrieben in Beispiel 4, zu der korrigierten WBK-Zählung, erhalten durch Korrigieren der Zählung, die auf dem COULTER COUNTER^® ZBI mit manueller NRBC-Zählung erhalten wurde.
5A zeigt ein Histogramm einer Vollblutprobe, erhalten gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren unter Verwendung einer einzelnen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 5. 5B zeigt ein Spektrum derselben Probe, verarbeitet mit der einzelnen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 5 gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf eine lytische Reagenszusammensetzung zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen gerichtet. Genauer gesagt, ermöglicht die lytische Reagenszusammensetzung die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten in einer Blutprobe durch DC-Impedanzmessung. In diesem Zusammenhang können die zellkernhaltigen Blutkörperchen zellkernhaltige rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen umfassen.
Die lytische Reagenszusammensetzung umfaßt eine wäßrige Lösung von:

(a) einem quartären Ammoniumsalz oder -salzen, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur:
wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist; R₂, R₃ und R₄ Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind und X^– ein Chlorid- oder Bromidanion ist;
(b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 50 liegt; und
(c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H, wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist; R₂ -O- ist und n zwischen 20 und 35 liegt.

Der pH der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem breiten Bereich von etwa 2 bis etwa 11.
Quartäres Ammoniumsalz lysiert rote Blutkörperchen und die Zellmembranen zellkernhaltiger Blutkörperchen. Die Konzentration eines quartären Ammoniumsalzes in der lytischen Reagenszusammensetzung muß eine Menge sein, die zur Lyse roter Blutkörperchen ausreicht, während die Zellkernvolumen zellkernhaltiger Blutkörperchen konserviert werden. Mit der oben beschriebenen lytischen Reagenszusammensetzung werden rote Blutkörperchen einer Probe beim Mischen mit der lytischen Reagenszusammensetzung vollständig lysiert. Die Zellmembranen der zellkernhaltigen roten Blutkörperchen (NRBC) werden lysiert, und die Größen ihrer Kerne sind klein. Die Membranen weißer Blutkörperchen werden jedoch nur teilweise lysiert, und die verbleibenden Größen sind relativ groß. Ist die Konzentration eines quartären Ammoniumsalzes zu hoch, werden die weißen Blutkörperchen weiter schrumpfen und die Größen der Lymphozyten werden denen der NRBCs stark ähneln. Demzufolge werden NRBCs und weiße Blutkörperchen gemessen an ihrer Größe nicht unterscheidbar sein. Ist die Konzentration eines quartären Ammoniumsalzes zu gering, werden die roten Blutkörperchen nicht vollständig lysiert und können die Detektion zellkernhaltiger Blutkörperchen stören. Überdies können auch lysierte Zellmembrantrümmer die Detektion stören, wenn sie nicht gelöst und ihre Größe ausreichend reduziert wurde. Die Konzentration des quartären Ammoniumsalzes in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 6 g/L bis etwa 50 g/L, bevorzugt etwa 10 g/L bis etwa 40 g/L.
Auf der anderen Seite ist bekannt, daß sich die lytische Potenz eines quartären Ammoniumsalzes mit der Länge der R₁-Gruppe erhöht. Ein quartäres Ammoniumsalz mit einer 16-Kohlenstoffkette schrumpft die zellkernhaltigen Blutkörperchen wahrscheinlich mehr als die mit 12- oder 14-Kohlenstoffketten. Für eine optimale Trennung von NRBCs von den weißen Blutkörperchen ist eine richtige Kohlenstoffkettenlänge für die R1-Gruppe bestimmt worden. Bevorzugt wird Tetradecyltrimethylammoniumsalz oder ein Gemisch von Tetradecyltrimethylammoniumsalz mit Hexadecyltrimethylammoniumsalz oder Dodecyltrimethylammoniumsalz verwendet.
Es ist herausgefunden worden, daß das ethoxylierte Phenol in der lytischen Reagenszusammensetzung die Trennung zwischen den NRBCs und den weißen Blutkörperchen verbessert, indem die Größe der Lymphozyten konserviert wird. Darüber hinaus unterstützt das ethoxylierte Phenol auch die Auflösung von Zellmembrantrümmern und verringert die Möglichkeit einer Störung. Die Anzahl an Ethylenoxid in dem ethoxylierten Phenol liegt bevorzugt in einem Bereich von etwa 20 bis etwa 40. Die Konzentration des ethoxylierten Phenols in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 2 g/L bis etwa 40 g/L.
Auch der ethoxylierte Alkohol in der lytischen Reagenszusammensetzung erhält die Größe von Lymphozyten. Es ist entdeckt worden, daß eine Kombination von ethoxyliertem Alkohol und ethoxyliertem Phenol für eine bessere Trennung zwischen den NRBCs und den Lymphozyten sorgt als die Verwendung von entweder ethoxyliertem Alkohol oder ethoxyliertem Phenol allein. Daher wird eine Kombination von ethoxyliertem Phenol und ethoxyliertem Alkohol verwendet. Die Konzentration des ethoxylierten Alkohols in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 1 g/L bis etwa 20 g/L.
Geeignete Beispiele für ethoxylierten Alkohol sind das oberflächenaktive Mittel in Granulatform Plurofac A38 von BASF Corp., New Jersey und Hetoxol STA-30 von Heterene, Inc., New Jersey. Ein geeignetes Beispiel für ethoxyliertes Phenol ist Igepal SS-837 von Rhõne-Poulenc, New Jersey.
Gegebenenfalls kann die lytische Reagenszusammensetzung weiter Konservierungsmittel wie Antioxidationsmittel in einer Menge, die ausreicht, um die Haltbarkeit des Reagens zu verlängern, umfassen. Ein geeignetes Beispiel für ein Antioxidationsmittel ist Butylmethylphenol. Die Konservierungsmittel müssen mit den primären funktionalen Komponenten der lytischen Reagenszusammensetzung kompatibel sein.
In einer anderen Ausführungsform kann die lytische Reagenszusammensetzung ferner einen organischen Liganden für die Hämoglobinmessung umfassen. Wie oben beschrieben, lysiert die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung rote Blutkörperchen beim Mischen mit einer Blutprobe, die Hämoglobin in das Probengemisch freisetzt. In der Gegenwart eines organischen Liganden kann das freigesetzte Hämoglobin ein Chromogen bilden, das photometrisch gemessen werden kann. Geeignete Beispiele für organische Liganden umfassen Tetrazol und seine Derivate wie 5-Aminotetrazol; Imidazol und seine Derivate wie Methylimidazol und Ethylimidazol; Chinaldinsäure und Benzoesäure und Alkalimetallsalze von Benzoesäure.
In Gegenwart eines organischen Liganden kann die lytische Reagenszusammensetzung sowohl zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen als auch zur Hämoglobinmessung verwendet werden. Ein solches Multifunktionsmerkmal ist für ihre Anwendung in automatisierten Hämatologie-Analysegeräten von Vorteil, da weniger Reagenzien und Probentrennungsschritte erforderlich sind.
Die Konzentration des organischen Liganden in der lytischen Reagenszusammensetzung muß zur Bildung eines stabilen Hämoglobinchromogens ausreichen. Die Konzentration variiert mit der Ligandenart in Abhängigkeit der Affinität des Liganden für Hämoglobin. Allgemein gilt, daß, wenn die Menge an Ligand in der lytischen Reagenszusammensetzung nicht ausreichend ist, das gebildete Hämoglobinchro mogen instabil sein kann. Die Konzentration des organischen Liganden in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt im Bereich von etwa 1 g/L bis etwa 10 g/L.
Die Konzentrationen der chemischen Komponenten in der lytischen Reagenszusammensetzung sind die Konzentrationen unter Bedingungen, in denen die Zählung der zellkernhaltigen Blutkörperchen und die Hämoglobinmessung unter Verwendung eines geeigneten Blutverdünnungsmittels für den Vorteil der Verwendung der existierenden Blutanalysegeräte erreicht werden. Die Konzentrationen der chemischen Komponenten können jedoch in Abhängigkeit des Volumenverhältnisses zwischen der lytischen Reagenszusammensetzung und dem Verdünnungsmittel verändert werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Reagenssystem gerichtet, das zur Messung zellkernhaltiger Blutkörperchen verwendet wird. Das Reagenssystem umfaßt

(I) eine lytische Reagenszusammensetzung, umfassend eine wäßrige Lösung von:
(a) einem quartären Ammoniumsalz oder -salzen, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur:
wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist; R₂, R₃ und R₄ Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind und X^– ein Chlorid- oder Bromidanion ist;
(b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 50 liegt; und
(c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H, wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist; R₂ -O- ist und n zwischen 20 und 35 liegt und der pH der lytischen Reagenszusammensetzung in einem breiten Bereich von etwa 2 bis etwa 11 liegt; und
(II) ein Verdünnungsmittel.

Die lytische Reagenszusammensetzung des Reagenssystems ist oben beschrieben worden. Des weiteren kann die lytische Reagenszusammensetzung ferner einen organischen Liganden für die Hämoglobinmessung umfassen, wie vorstehend beschrieben.
Das Verdünnungsmittel ist eine wäßrige Lösung, die (a) ein Salz oder Salze zur Einstellung der Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels derart, daß sie für eine Impedanzmessung ausreichend ist, und (b) ein antimikrobielles Mittel umfaßt. Geeignete Beispiele für Salze sind Alkalimetallsalze. Bevorzugt werden in dem Verdünnungsmittel Natrium- oder Kaliumsulfat, -chlorid, -phosphat oder -citrat verwendet.
Ein Blutverdünnungsmittel wird auf einem Hämatologieanalysegerät üblicherweise zur Verdünnung einer Blutprobe auch zum Messen roter Blutkörperchen verwendet. In letzterem Fall ist ein isotonisches Verdünnungsmittel erforderlich, um das Volumen roter Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. Daher wird das Blutverdünnungsmittel für eine kombinierte Verwendung für Messungen roter Blutkörperchen und zellkernhaltiger Blutkörperchen bevorzugt isotonisch gemacht, obgleich Isotonizität für die Messung der zellkernhaltigen Blutkörperchen nicht erforderlich ist.
Das Verdünnungsmittel kann ferner einen Puffer umfassen. Es kann eine Vielzahl organischer und anorganischer Puffer in dem Verdünnungsmittel verwendet werden. Ähnlich wie oben für die Leitfähigkeit erörtert, ist das Verdünnungsmittel bevorzugt neutral, da das Verdünnungsmittel üblicherweise zur Messung roter Blutkörperchen verwendet wird, die einen neutral pH erfordert.
Das antimikrobielle Mittel muß in ausreichender Menge vorhanden sein, um das Verdünnungsmittel zu konservieren, die Funktionen des lytischen Reagens jedoch nicht zu stören.
Alternativ kann dem Verdünnungsmittel ein organischer Ligand für die Hämoglobinmessung zugegeben werden, statt es in die lytische Reagenszusammensetzung einzuführen.
Zur Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen und Differenzieren von NRBCs von anderen Zellarten wird eine Blutprobe mit einem geeigneten Blutverdünnungsmittel verdünnt, dann wird eine ausreichende Menge der lytischen Reagenszusammensetzung zugegeben und mit der verdünnten Probe in einer Kammer durch mechanisches oder Blasmischen gemischt, um so ein Probengemisch zu bilden (das Verdünnungsverhältnis des Gesamtreagensvolumens gegen Blut beträgt etwa 250:1). Etwa sieben bis neun Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung wird das Probengemisch mittels Vakuum durch eine nicht-fokussierende Öffnung abgezogen und mit einem DC-Detektor gemessen. Der DC-Detektor detektiert elektrische Signale, die aufgrund von Impedanzänderung erzeugt werden, wenn die verbleibenden zellkernhaltigen Blutkörperchen durch die Öffnung gehen. Aus der Messung wird ein Zellgrößenverteilungshistogramm erhalten. Überdies kann durch DC-Impedanzmessung auch eine Zählung aller zellkernhaltigen Zellen in dem Probengemisch erzeugt werden.
Alternativ kann für die DC-Impedanzmessung auch eine fokussierte Durchflußzelle verwendet werden. Bei der Verwendung einer fokussierten Durchflußzelle wird das Probenverdünnungsverhältnis niedriger sein, da ein Mantelfluid, das zur Fokussierung verwendet wird, die in der Durchflußzelle gemessene Anzahl an Zellen weiter verringern wird. Es ist herausgefunden worden, daß in diesem Fall ein Verdünnungsverhältnis von etwa 30:1 bis etwa 35:1 für die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
1A zeigt ein Histogramm einer frischen normalen Vollblutprobe, erhalten unter Verwendung einer lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 1 nach dem in Beispiel 1 aufgeführten Verfahren. Wie gezeigt, haben die zellkernhaltigen Blutkörperchen, in diesem Fall alle weißen Blutkörperchen, eine bimodale Verteilung. Ein Großteil der Population in dem Peak auf der linken Seite sind Lymphozyten. Es ist jedoch beobachtet worden, daß andere Populationen weißer Zellen auch in diesen Bereich fallen können. Auf der linken Seite dieses Peaks gibt es eine freie Fläche und in diesem Bereich erscheinen keine Zellen.
Die 1B und 1C zeigen Histogramme, die unter Verwendung derselben lytischen Reagenszusammensetzung und nach demselben Verfahren aus den beiden klinischen Vollblutproben, die zellkernhaltige rote Blutkörperchen enthielten, erhalten wurden (ausgewiesen durch das manuelle Referenzverfahren). Wie gezeigt, erschien ein weiterer Peak aus den zellkernhaltigen roten Blutkörperchen (NRBC) auf der linken Seite der weißen Blutkörperchen. Scheinbar hatten die Zellkerne der zellkernhaltigen roten Blutkörperchen kleinere Größen im Vergleich zu denen der weißen Blutkörperchen unter der beschriebenen Reaktionsbedingung. Eine solche Größentrennung, die durch die Nutzung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erreicht wird, ermöglicht eine Differenzierung der zellkernhaltigen roten Blutkörperchen von weißen Blutkörperchen unter Verwendung des eindimensionalen Histogramms, das aus der DC-Impedanzmessung erhalten wurde.
Unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann die Gegenwart einer NRBC-Population in einer Probe identifiziert und ausgewiesen werden, da die NRBC-Population von anderen Zellenarten differenziert wird. Das Ausweisen der Gegenwart klinisch anomaler Populationen in einer Blutprobe wird oftmals das Markieren auf Hämatologie-Analysegeräten genannt, das ein wichtiges Element zur Unterstützung einer klinischen Diagnose ist.
Ferner kann unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung die NRBC-Population gezählt werden. Wird der Schwellenwert eines DC-Detektors unter die Größe von NRBCs eingestellt, wie in den Figuren gezeigt, kann die NRBC-Population zusammen mit den weißen Blutkörperchen gezählt werden. Nach der Differenzierung der NRBC-Population von den anderen Zellarten, basierend auf der Populationsverteilung eines erhaltenen DC-Histogramms, kann die NRBC-Konzentration einer analysierten Probe berechnet werden. Die NRBC-Konzentration kann als die Anzahl an NRBCs pro Hundert weiße Blutkörperchen (NRBC/100 WBK), was dieselbe Einheit wie in der manuellen Referenz ist, ausge wiesen werden. Alternativ kann die Anzahl an NRBCs auch als eine absolute Anzahl pro Volumeneinheit einer Blutprobe ausgewiesen werden. In diesem Fall wird die Anzahl an NRBCs pro 100 weiße Blutkörperchen mit der Zählung der weißen Blutkörperchen derselben Probe multipliziert.
Überdies wurden, wie vorstehend beschrieben, in der Vergangenheit bei der Messung weißer Blutkörperchen der Größe nach NRBCs zusammen oder teilweise zusammen mit weißen Blutkörperchen gezählt, da sie nicht von anderen zellkernhaltigen Blutkörperchen differenziert werden konnten. Die durch NRBCs verursachte Störung kann zu erhöhten und fehlerhaften Zählungen weißer Blutkörperchen führen. Mit der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bei der Differenzierung der NRBCs der Beitrag dieser Population zu der Zählung weißer Blutkörperchen von der Gesamtzählung zellkernhaltiger Blutkörperchen subtrahiert werden, um so eine korrigierte Zählung weißer Blutkörperchen bereitzustellen.
2 zeigt eine Reihe photometrischer Hämoglobinabsorptionsspektren einer Vollblutprobe, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ferner einen organischen Liganden enthält und mit einem in Beispiel 2 aufgeführten manuellen Verfahren verarbeitet wurde. Insgesamt zwölf Spektren wurden in 120 Sekunden mit einem 10-Sekunden-Intervall erhalten. Wie gezeigt, wies das gebildete Hämoglobinchromogen eine maximale Absorption bei etwa 538 nm mit einer Schulter bei etwa 565 nm auf. Das Hämoglobinchromogen bildete sich schnell nach dem Mischen der lytischen Reagenszusammensetzung mit der vorverdünnten Probe. Wie durch eine vollständige Überlappung kontinuierlich erhaltener Spektren veranschaulicht, war das Hämoglobinchromogen während der 120 Sekunden der Analyse, was weit unter einer typischen Datenerfassungszeit lag, wie sie auf einem Hämatologie-Analysegerät verwendet wird, sehr stabil.
Wie vorstehend beschrieben, kann ein organischer Ligand für die Hämoglobinmessung entweder der lytischen Reagenszusammensetzung oder dem Verdünnungsmittel des lytischen Reagenssystems zugegeben werden. Die 3A und 3B veranschaulichen Ergebnisse der letzteren Alternative, worin das Verdünnungsmittel einen organischen Liganden enthält.
3A ist ein Spektrum einer Vollblutprobe, behandelt unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und der in Beispiel 3 beschriebenen Verdünnungsmittelzusammensetzung, die Imidazol als einen Hämoglobinliganden enthält. 3B zeigt ein Histogramm einer klinischen Blutprobe, die NRBC enthält, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagens- und Verdünnungsmittelzusammensetzungen aus Beispiel 3. Das Histogramm zeigt deutlich die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von den weißen Blutkörperchen.
Die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Zählung weißer Blutkörperchen, die Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen und die Hämoglobinmessung mit einem Probenpräparat.
Beispiel 4 demonstriert die Nützlichkeit der lytischen Reagenszusammensetzung bei der Analyse klinischer Proben. Insgesamt wurden 95 normale und 74 klinische Vollblutproben, die zellkernhaltige rote Blutkörperchen enthalten, auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät mit der in Beispiel 1 aufgeführten Instrumentenkonfiguration unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 2 und Isoton^®III (Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida) als Verdünnungsmittel analysiert. Dieselben Proben wurden auch auf einem COULTER^® GEN•S-Hämatologie-Analysegerät und COULTER COUNTER^® ZBI als Referenzen analysiert. Die Anzahl an NRBCs pro 100 WBK wurde aus einer manuellen 500-Zell-Zählung nach dem NCCLS-Standardverfahren erhalten und als Referenz verwendet.
Das auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät erhaltene DC-Histogramm wurde durch einen experimentellen Algorithmus analysiert, um die zellkernhaltigen roten Blutkörperchen von den weißen Blutkörperchen zu differenzieren und die Anzahl an NRBCs pro 100 WBK auszuweisen. Dann wurden die NRBCs von der gemessenen Gesamtanzahl zellkernhaltiger Blutkörperchen subtrahiert, um so eine korrigierte WBK-Zählung zu erhalten.
4A zeigt die Ergebnisse der NRBC-Zählung, die eine gute lineare Korrelation zwischen den unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen und der manuellen Referenz demonstriert.
4B zeigt die Korrelation zwischen der unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und der auf COULTER^® GENS erhaltenen Hämoglobinkonzentration. Die Ergebnisse demonstrieren eine hervorragende lineare Korrelation für die Hämoglobinmessung.
4C zeigt die Korrelation der korrigierten WBK-Zählung zwischen der Referenz und den unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen. Die Referenzergebnisse wurden durch Subtrahieren der manuellen NRBC-Ergebnisse von der WBK-Zählung, erhalten auf dem COULTER COUNTER^® ZBI, erhalten. Wie gezeigt, korrelieren die durch die Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse hervorragend mit der Referenz.
In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine einzelne Reagenszusammensetzung für die kombinierte Verdünnung und Lysierung einer Blutkörperchenprobe ohne Vorverdünnung mit einem Verdünnungsmittel. Setzt ein Hämatologie-Analysegerät ein einzelnes Reagens ein, ohne Vorverdünnung mit einem Verdünnungsmittel, kann man die Konzentrationen der chemischen Inhaltsstoffe der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung reduzieren und die Leitfähigkeit der lytischen Reagenszusammensetzung einstellen, damit sie für Impedanz-Messungen verwendet werden kann. Die Leitfähigkeit kann durch die Zugabe einer ausreichenden Menge eines Salzes oder von Salzen eingestellt werden. Geeignete Beispiele für Salze sind Alkalimetallsalze wie Sulfate, Chloride, Phosphate und Citrate. In einer einzelnen Reagenszusammensetzung sollten die Konzentrationen der chemischen Komponenten der lytischen Reagenszusammensetzung dieselben sein wie die Konzentrationen, die in dem fertigen Probengemisch enthalten sind, wenn das lytische Reagens und Verdünnungsmittel separat verwendet werden. Ist eine gleichzeitige Hämoglobinmessung gewünscht, kann die einzelne Reagenszusammensetzung ferner einen organischen Liganden, wie oben beschrieben, enthalten.
Die 5A und 5B veranschaulichen die Nützlichkeit einer einzelnen Reagenszusammensetzung für die kombinierte Verdünnung und Lysierung einer Blutprobe zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen und von Hämoglobin. 5A zeigt ein DC-Histogramm einer klinischen Vollblutprobe, die NRBC enthält, erhalten auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, das eine einzelne Reagenszusammensetzung aus Beispiel 5 als sowohl das lytische Reagens als auch das Verdünnungsmittel verwendete. Das Histogramm zeigt deutlich die Differenzierung von NRBCs von den weißen Blutkörperchen.
5B zeigt ein photometrisches Absorptionsspektrum einer Vollblutprobe, behandelt mit der einzelnen Reagenszusammensetzung. Das Spektrum zeigt dasselbe charakteristische Hämoglobinchromogen, das unter separater Verwendung von lytischer Reagenszusammensetzung und Verdünnungsmittel erhalten wurde.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, in keiner Weise einschränken. Es ist selbstverständlich, daß gemäß der weitergehenden Offenbarung verschiedene andere Inhaltsstoffe und Anteile eingesetzt werden. können.
Beispiel 1

Es wurde ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt.

Tetradecyltrimethylammoniumbromid	25,0 g
Igepal SS-837 (von Rhöne-Poulenc)	15,0 g
oberflächenaktives Mittel in Granulatform
Plurofac A38 (von BASF Corp.)	4,0 g
destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter
pH	5,0

28 μl einer Vollblutprobe wurden durch ein experimentelles Hämatologie-Analysegerät aspiriert, mit 6 ml Isoton^®III (Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida) verdünnt, dann mit 1 ml der obigen lytischen Reagenszusammensetzung gemischt, um so rote Blutkörperchen zu lysieren. Das Probengemisch wurde dann durch eine Reihe von drei nicht-fokussierten Durchflußöffnungen (parallel angeordnet) gezogen. Die Öffnungen hatten eine Länge von 120 μm und eine Breite von 100 μm. Die zellkernhaltigen Blutkörperchen wurden durch eine DC-Impedanz-Messung gezählt, und nach Pulseditierung wurde außerdem ein Histogramm der Blutkörperchen erstellt (gemittelt aus den Messungen der drei Öffnungen).
1A zeigt ein Histogramm einer frischen normalen Blutprobe, analysiert gemäß dem obigen Verfahren, das eine bimodale Verteilung der weißen Blutkörperchen zeigt. Die 1B und 1C zeigen zwei klinische anomale Proben, analysiert gemäß dem obigen Verfahren. Die klinischen Proben enthielten 230 NRBC/100 WBK bzw. 9 NRBC/100 WBK. Wie zu erkennen ist, erschien eine deutliche NRBC-Population auf der linken Seite der weißen Blutkörperchen. Die NRBC-Population wurde von den weißen Blutkörperchen differenziert und das Verhältnis zwischen den NRBCs und den weißen Blutkörperchen (× 100) wurde als die Anzahl an NRBC/100 WBK ausgewiesen. Alternativ können die NRBCs auch als absolute Zählung in einer Volumeneinheit der Blutprobe unter Einbeziehung der Gesamtzählung der weißen Blutkörperchen ausgewiesen werden.
Beispiel 2

Es wurde ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt.

Tetradecyltrimethylammoniumbromid	25,0 g
Igepal SS-837 (von Rhõne-Poulenc)	15,0 g
oberflächenaktives Mittel in Granulatform
Plurofac A38 (von BASF Corp.)	4,0 g
Tetrazol	2,0 g
BHT (vorgelöst in Ethanol)	0,04 g
destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter
pH	2,9

11,6 μl einer Vollblutprobe wurden mit 2500 μl Isoton^®III verdünnt, dann wurden 403 μl der obigen lytischen Reagenszusammensetzung manuell mit der vorverdünn ten Probe gemischt. Das photometrische Absorptionsspektrum der Probe wurde unmittelbar auf einem Beckman DU^® 7500-Spektrophotometer gemessen. 2 zeigt die Spektren der Blutprobe, verarbeitet gemäß dem obigen Verfahren. 2 ist eine Überlagerung von insgesamt zwölf Spektren. Das erste Spektrum wurde 10 Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung erhalten, und dann wurde ein Spektrum automatisch alle 10 Sekunden erhalten, wobei das letzte 130 Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung erhalten wurde.
Beispiel 3

Es wurden Reagenzien mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt. Lytisches Reagens

Tetradecyltrimethylammoniumbromid	25,0 g
Igepal SS-837 (von Rhõne-Poulenc)	15,0 g
oberflächenaktives Mittel in Granulatform
Plurofac A38 (von BASF Corp.)	4,0 g
destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter
pH	5,0

Verdünnungsmittel

Na₂SO₄	10,58 g
NaCl	3,0 g
Na₂EDTA	1,5 g
Imidazol	1,5 g
6N HCl, zugegeben zum Einstellen des pH auf neutral
destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter
pH	7,1
Osmolalität	308 mOsm

11,6 μl einer frischen normalen Vollblutprobe wurden mit 2500 μl des obigen Verdünnungsmittels verdünnt, dann wurden 403 μl der obigen lytischen Reagenszusammensetzung manuell mit der vorverdünnten Probe gemischt. Das photometrische Absorptionsspektrum der Probe wurde unmittelbar auf einem Beckman DU 7500-Spektrophotometer gemessen. 3A zeigt das Spektrum der Blutprobe, verarbeitet gemäß dem obigen Verfahren.
Eine klinische Vollblutprobe, die 19 NRBC/100 WBK enthält, wurde auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, beschrieben in Beispiel 1, mit derselben Instrumentenkonfiguration analysiert, außer daß nicht-fokussierte Durchflußöffnungen von 120 μm Länge mal 100 μm Breite und das Lysereagens und Verdünnungsmittel aus Beispiel 3 verwendet wurden. 3B zeigt das erhaltene Histogramm, das deutlich die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von weißen Blutkörperchen zeigt.
Beispiel 4
95 normale und 74 klinische Vollblutproben, die NRBCs enthalten, wurden auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, beschrieben in Beispiel 1, unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 2 und Isoton^®III als Verdünnungsmittel analysiert. Unmittelbar nach dem Messen der zellkernhaltigen Blutkörperchen wurde auch die Absorption eines Probengemisches bei 525 nm auf dem Analysegerät gemessen. Die Hämoglobinkonzentration der Probe wurde durch das Analysegerät ausgewiesen. Dann wurden dieselben Proben auch auf einem COULTER^® GEN•S-Hämatologie-Analysegerät und auf einem COULTER COUNTER^® ZBI analysiert. Der COUNTER^® GEN•S wurde unter seiner Standardkonfiguration gemäß dem Handbuch des Herstellers unter Verwendung von Lyse S^®III diff (Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida) als Lysereagens und Isoton^®III als Verdünnungsmittel betrieben. Die weißen Blutkörperchen der Blutproben wurden auf dem COUNTER COUNTER^®ZBI gemäß dem NCCLS-Referenzverfahren zur WBK-Zählung gezählt. Der Schwellenwert auf dem COUNTER COUNTER^®ZBI wurde auf 7,5 eingestellt, um so die Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen sicherzustellen. Eine manuelle 500-Zell-Zählung wurde durch drei medizinischen Technologen für alle klinischen Proben als Referenz für zellkernhaltige rote Blutkörperchen erhalten und als die Anzahl zellkernhaltiger roter Blutkörperchen, beobachtet pro 100 gezählter WBK, ausgewiesen (Anzahl NRBC/100 WBK).
Das erhaltene DC-Histogramm wurde durch einen experimentellen Algorithmus analysiert, um so die NRBCs von den weißen Blutkörperchen zu differenzieren und die Anzahl an NRBCs pro 100 WBK auszuweisen. Dann wurden die NRBCs von der Gesamtzahl der gezählten zellkernhaltigen Blutkörperchen subtrahiert, um so eine korrigierte WBK-Zählung zu erhalten.
4A zeigt die Ergebnisse der NRBC-Zählung, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, gegen die manuelle Referenz. Die Korrelationskoeffizienten, Anstiege und Achsenabschnitte der Regressionslinien zeigten eine gute lineare Korrelation für die NRBCs.
4B zeigt die Korrelation zwischen der Hämoglobinkonzentration, erhalten unter Verwendung des obigen lytischen Reagens auf einem experimentellen Hämatologieanalysegerät, und der, die auf einem COULTER^® GEN•S erhalten wurde. Das Ergebnis demonstriert eine hervorragende lineare Korrelation für die Hämoglobinkonzentration.
4C zeigt die Korrelation zwischen der korrigierten WBK-Zählung, erhalten unter Verwendung des obigen lytischen Reagens auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät und des oben beschriebenen Verfahrens, und der, die durch das Subtrahieren der manuellen NRBC-Ergenisse von der WBK-Zählung, erhalten auf dem COULTER COUNTER^®ZBI, erhalten wurden. Das Ergebnis veranschaulicht eine hervorragende Korrelation zwischen dem Verfahren der vorliegenden Erfindung und dem Referenzverfahren.
Beispiel 5

Es wurde ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt.

Tetradecyltrimethylammoniumbromid	3,48 g
Igepal SS-837 (von Rhõne-Poulenc)	2,09 g
oberflächenaktives Mittel in Granulatform
Plurofac A38 (von BASF Corp.)	0,56 g
Tetrazol	0,28 g
Na₂SO₄	7,94 g
NaCl	3,46 g
Na₂EDTA	0,09 g
ADA	1,21 g
antimikrobielle Mittel	0,98 g
BHT (vorgelöst in Ethanol)	0,01 g
destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter
pH	5,8
Osmolalität	312 mOsm

Eine klinische Vollblutprobe, die 31 NRBC/100 WBK enthält, wurde auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, beschrieben in Beispiel 1, mit derselben Instrumentenkonfiguration, aber unter Verwendung der obigen einzelnen Reagenszusammensetzung sowohl als Lysereagens als auch als Verdünnungsmittel analysiert. 5A zeigt das erhaltene Histogramm, das die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von weißen Blutkörperchen zeigt.
Des weiteren wurden 11,6 μl derselben Probe mit 2903 μl der obigen einzelnen Reagenszusammensetzung verdünnt und gemischt. Das photometrische Absorptionsspektrum der Probe wurde unmittelbar auf einem Beckman DU^® 7500-Spektrophotometer gemessen. 5B zeigt das erhaltene Spektrum, das dasselbe charakteristische Hämoglobinchromogen, das unter separater Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung und eines Verdünnungsmittels erhalten wurde, aufwies.

Claims

Lytische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen, umfassend eine wäßrige Lösung von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, R₂, R₃ und R₄ Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X^– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R₂ -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und wobei der pH der lytischen Reagenszusammensetzung in einem Bereich von 2 bis 11 liegt.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das quartäre Ammoniumsalz eine Konzentration im Bereich von etwa 6 g/L bis 50 g/L aufweist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das ethoxylierte Phenol eine Konzentration in einem Bereich von etwa 2 g/L bis 40 g/L aufweist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der ethoxylierte Alkohol eine Konzentration in einem Bereich von etwa 1 g/L bis 20 g/L aufweist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfasst, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der organische Ligand eine Konzentration in einem Bereich von etwa 1 g/L bis 10 g/L aufweist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der organische Ligand Tetrazol und dessen Derivate ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die zellkernhaltigen Blutkörperchen zellkernhaitige rote Blutkörperchen und weiße Blutkör perchen umfassen.
Lytische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen, zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen und der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe, umfassend eine wäßrige Lösung von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 14 Kohlenstoffatomen ist, R₂, R₃ und R₄ Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X^– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R₂ -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und (e) Tetrazol.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.
Reagenssystem zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen, umfassend (I) eine lytische Reagenszusammensetzung, wobei die lytische Reagens zusammensetzung eine wäßrige Lösung umfaßt von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, R₂, R₃ und R₄ Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X^– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R₂ -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und wobei der pH der lytischen Reagenszusammensetzung in einem Bereich von 2 bis 11 liegt, und (II) ein Verdünnungsmittel.
Reagenssystem nach Anspruch 13, wobei die lytische Reagenszusammensetzung weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfaßt, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.
Reagenssystem nach Anspruch 14, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.
Reagenssystem nach Anspruch 13, wobei das Verdünnungsmittel eine wäßrige Lösung ist, umfassend (a) mindestens ein Salz in einer Menge, um die Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels derart einzustellen, daß diese für eine Impedanzmessung ausreichend ist, und (b) ein antimikrobielles Mittel.
Reagenssystem nach Anspruch 16, wobei das Verdünnungsmittel weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfaßt, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.
Reagenssystem nach Anspruch 17, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.
Reagenssystem nach Anspruch 16, wobei das Verdünnungsmittel weiter einen Puffer umfaßt, um den pH des Verdünnungsmittels auf neutral einzustellen.
Lytische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen, umfassend eine wäßrige Lösung von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, R₂, R₃ und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X^– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H wobei R₁ eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R₂ -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und (d) mindestens einem Salz in einer Menge, um die Leitfähigkeit der lytischen Reagenszusammensetzung derart einzustellen, daß diese für eine Impedanzmessung ausreichend ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Salz aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen von Sulfat, Chlorid, Phosphat oder Citrat, ausgewählt ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die lytische Reagenszusammensetzung weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfaßt, um ein stabiles Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.
Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die zellkernhaltigen Blutkörperchen zellkernhaltige rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen umfassen.