DE60223149T2 - Nachweisverfahren mit biochip - Google Patents

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Frederic Ginot
Dominique Masse
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Biomerieux SA
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ablesen, ein Verfahren zur Detektion und ein Verfahren zur Quantifizierung von chemischen oder biologischen Reaktionen, die auf einem Träger durchgeführt werden, wobei der Träger aus einer Petrischale, einer Mikrotiterplatte, einem Biochip und Ähnlichem bestehen kann.
  • Mit dem Ausdruck Biochip ist vorliegend ein Chip gemeint, der auf seiner Oberfläche eine Vielzahl von Erkennungszonen aufweist, also mindestens 100 Erkennungszonen, welche mit Molekülen ausgestattet sind, die Erkennungseigenschaften aufweisen. Im Weiteren dieses Textes wird, auch wenn dies sprachlich falsch ist, der Ausdruck Biochip unabhängig davon verwendet, ob der Chip für chemische oder biologische Analysen vorgesehen ist. Die Konzeptentwicklung eines Biochips, genauer gesagt eines DNA-Chips, datiert in die 90-er Jahre zurück. Heutzutage ist dieses Konzept erweitert worden, da auch begonnen wurde, Proteinchips zu entwickeln. Das Konzept basiert auf einer multidisziplinären Technologie, einschließlich Mikroelektronik, Nukleinsäurenchemie, Bildanalyse und Informatik. Das Funktionsprinzip basiert auf einer molekularbiologischen Grundlage, nämlich dem Phänomen der Hybridisierung, also der Paarung von komplementären Basen zweier DNA- und/oder RNA-Sequenzen.
  • Das Biochipverfahren basiert auf der Verwendung von Sonden (DNA-Sequenzen, welche einen Abschnitt eines Gens oder eines Oligonukleotids darstellen), welche an einen festen Träger angebracht sind, auf welchen eine Probe von Nukleinsäuren, die entweder direkt oder indirekt mit Fluorochromen markiert sind, zur Reaktion gebracht wird.
  • Gleichwohl ist es auch möglich, andere, konventionellere Träger zu verwenden, wie beispielsweise Petrischalen, Mikrotiterplatten, die eine Reihe von getrennten Wells enthalten, und ähnliche. Der Ausdruck „Träger" wird vorliegend verstanden als eine analytische Oberfläche, die nur wenige Erkennungszonen enthält, im Allgemeinen höchstens 100 Erkennungszonen. Jede Erkennungszone weist zumindest ein Molekül auf, das Erkennungseigenschaften besitzt.
  • In all diesen Fällen sind die Sonden, die auch als Erkennungsmoleküle bezeichnet werden, auf eine spezifische Art und Weise auf dem Träger oder dem Chip angebracht, und jede Hybridisierung gibt Informationen über jedes präsentierte Gen. Diese Information ist kumulativ und ermöglicht es, das Vorliegen eines Gens zu detektieren, oder das Ausmaß der Expression dieses Genes in dem untersuchten Gewebe zu quantifizieren. Nach der Hybridisierung wird der Träger oder der Chip gewaschen, anschließend beispielsweise mit einem Scanner ausgelesen und die Analyse der Fluoreszenz durch einen Computer verarbeitet.
  • Der Träger oder der Chip, welche dazu dienen, die Sonden zu fixieren, besteht im Allgemeinen aus einer flachen oder porösen Oberfläche, die aus Materialien zusammengesetzt ist, wie beispielsweise:
    • • Glas, ein kostengünstiges, inertes und mechanisch stabiles Material; die Oberfläche kann mit einem Teflonschirm bedeckt sein, welcher hydrophile und hydrophobe Zonen begrenzt,
    • • Polymere,
    • • Silicium, und
    • • Metalle, insbesondere Gold und Platin.
  • Nichtsdestotrotz ist es auch möglich, Partikel einzusetzen, beispielsweise magnetische Partikel, wie in den Patentanmeldungen WO-A-97/34909 , WO-A-97/45202 , WO-A-98/47000 und WO-A-99/35500 einer der Anmelder beschrieben ist.
  • Zur Fixierung der Sonden (oder der Erkennungsmoleküle), werden drei Haupttypen zur Herstellung unterschieden.
  • Zunächst gibt es eine erste Technik, die aus der Anbringung von zuvor synthetisierten Sonden besteht. Die Anbringung der Sonden geschieht durch einen direkten Transfer, mit Hilfe von Mikropipetten, Mikrospitzen oder mit einer Ink-Jet-artigen Vorrichtung. Diese Technik ermöglicht die Anbringung von Sonden mit einer Größe im Bereich von wenigen Basen (5 bis 10) bis zu relativ großen Größen von 60 Basen (Imprinting) bis zu wenigen hundert Basen (Mikrodeposition):
    • • Imprinting ist eine Adaptierung des Verfahrens, das von Ink-Jet-Druckern verwendet wird. Es beruht auf Propulsion sehr kleiner Fluidsphären (Volumen < 1 nl) mit einem Rhythmus, der bis zu 4000 Tröpfchen/Sekunde schnell sein kann. Beim Imprinting besteht kein Kontakt zwischen dem das Fluid freisetzenden System und der Oberfläche, auf welche das Fluid angebracht wird.
    • • Die Mikrodeposition besteht aus der Fixierung von Sonden, die wenige zehn bis wenige hundert Basen lang sind, auf der Oberfläche eines Glasträgers. Diese Proben sind im Allgemeinen Datenbanken entnommen und existieren in Form amplifizierter oder gereinigter Produkte. Diese Technik ermöglicht es, Chips herzustellen, die Mikroarrays genannt werden, und die zehn tausend Spots, auch Erkennungszonen genannt, an DNA auf einer Oberfläche von etwas weniger als 4 cm2 tragen. Auch die Verwendung von Nylonmembranen sollte jedoch nicht vergessen werden, die auch als „Makroarrays" bezeichnet werden, die Produkte tragen, die im Allgemeinen durch PCR amplifiziert wurden, und die einen Durchmesser von 0,5 bis 1 mm besitzen, wobei die maximale Dichte 25 Spots/cm2 ist. Diese hoch flexible Technik wird von vielen Laboratorien eingesetzt. In der vorliegenden Erfindung wird letztere Technik als Teil von Biochips betrachtet. Es ist jedoch auch möglich, auf den Grund einer Mikrotiterplatte ein bestimmtes Volumen einer Probe in jedes Well einzubringen, wie es der Fall ist in der Patentanmeldung WO-A-00/71750 mit Priorität vom 20. Mai und vom 6. Dezember 1999, sowie der FR00/14896 vom 17. November 200 im Namen einer der Anmelder. Es ist auch möglich, am Boden der gleichen Petrischale eine bestimmte Anzahl von Tröpfchen anzubringen, die getrennt voneinander sind, gemäß der anderen Patentanmeldung FR00/14691 vom 15. November 2000 vom gleichen Anmelder.
  • Die zweite Technik zur Anbringung von Sonden auf dem Träger oder dem Chip wird in situ Synthese genannt. Diese Technik führt zur Herstellung kurzer Sonden direkt auf der Oberfläche des Chips. Sie basiert auf der in situ Synthese von Oligonukleotiden, erfunden von Edwin Southern, und wird von Oligonukleotid-Synthetisieren durchgeführt. Sie besteht darin, eine Reaktionskammer, in welcher die Oligonukleotid-Verlängerungsreaktion stattfindet, entlang der Oberfläche von Glas entlang zu bewegen.
  • Die dritte Technik schließlich wird Photolithographie genannt, welche ein Verfahren zu Beginn der Biochips darstellt, das von Affymetrix entwickelt wurde. Auch hier handelt es sich um eine in situ Synthese. Die Photolithographie ist von Mikroprozessor-Techniken abgeleitet. Die Oberfläche der Chips wird durch die Fixierung von photolabilen chemischen Gruppen modifiziert, die durch Licht aktiviert werden können. Wenn sie einmal beleuchtet werden, sind die Gruppen dazu in der Lage, mit dem 3'-Ende eines Oligonukleotids zu reagieren. Indem diese Oberfläche mit Masken definierter Formen geschützt wird, ist es möglich, selektiv Zonen des Chips zu beleuchten und dadurch zu aktivieren, an welchen eines der vier Nukleotide angebracht werden soll. Die aufeinanderfolgende Verwendung unterschiedlicher Masken ermöglicht es, Protektions-/Reaktionszyklen abzuwechseln, und dadurch die Oligonukleotidsonden auf Spots mit einer Größe von ungefähr wenigen Zehnteln eines Quadratmikrometers (μm2) herzustellen. Diese Lösung ermöglicht es, bis zu mehreren Hundertausend Spots auf einer Oberfläche mit wenigen Quadratzentimetern (cm2) herzustellen. Die Photolithographie hat Vorteile: Da sie massiv parallel arbeitet, wird es ermöglicht, einen Chip von N-meren in lediglich 4 × N-Zyklen herzustellen.
  • Es ist selbstverständlich, dass all diese Techniken in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
  • Verfahren zur Verwendung solcher Träger oder Biochips können im Wesentlichen eingesetzt werden für:
    • • der Suche für das Vorliegen oder die Abwesenheit eines pathogenen Agens, beispielsweise nach einem Bakterium in Fleisch,
    • • die Suche nach dem Vorliegen oder der Abwesenheit von Mutationen. In Kenntnis der Molekularstruktur eines Gens werden Oligonukleotide, die das ganze Gen oder den komplementären Abschnitt dieses Gens darstellen, hergestellt. In Gegenwart der biologischen Probe wird zwischen dem Gen oder einem Teil dieses Gens, das im Allgemeinen markiert ist, beispielsweise mit Fluoreszenz, und den Oligonukleotiden eine Hybridisierung stattfinden, und das durch die Fluoreszenz erhaltene Bild ermöglicht es, festzustellen, ob eine Mutation vorliegt, und an welcher Position sie liegt. In der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung von DNA-Chips äquivalent mit der Sequenzierung für die Diagnose einer Mutation, mit dem großen Vorteil hinsichtlich der Geschwindigkeit, und
    • • die Messung des Ausmaßes der Expression von Genen in einem Gewebe. Das Chipnetzwerk trägt eine sehr große Anzahl an Sonden, die sämtlichen Genen der zu untersuchenden Spezies entsprechen. Eine Probe, beispielsweise zuvor amplifizierte mRNAs, welche die aktiven Gene im Gewebe darstellen, wird hybridisiert. Die Fluoreszenzanalyse ermöglicht es, das Ausmaß der Expression jedes Gens kennenzulernen.
  • Die Effizienz solcher Träger und Biochips ist in gut bekannten biologischen Systemen, wie beispielsweise Hefe (Zelizykius, Atmungsmetabolismus, Fermentation und Ähnliches) getestet worden. Ein Vergleich der Ergebnisse, die mit dem Chip gewonnen wurden, mit denjenigen, die zuvor mit anderen Ansätzen erhalten wurden, zeigten eine Übereinstimmung hinsichtlich der Gene, deren Expression bereits gut in diesen biologischen Systemen bekannt war. Diese Arbeit hat es daher ermöglicht, die Technologie der Biochips im Vergleich zu den erwähnten konventionelleren Trägern zu untersuchen.
  • Darüber hinaus forschen Firmen auch bezüglich neuen Verfahren, mit welchem genomische Analysen parallel durchgeführt werden können. Daher ermöglicht es die Microbead-Technik, Proben an Mikrosphären anzubringen, welche einen individuellen „Tag" oder eine Markierung tragen, genauer gesagt einen genetischen Code. Nach der Reaktion ermöglicht es das Ablesen dieser Markierung, einen Micro bead und dadurch auch die an seiner Oberfläche vorliegende Sonde eindeutig zu indentifizieren. Die Mikrosphären werden mit der Testprobe, die mit einem oder mehreren Fluorochromen markiert ist, in Kontakt gebracht. Anschließend wird die Mischung durch Flusscytometrie analysiert, wodurch einerseits jeder Bead entsprechend seinem „Tag" identifiziert wird, und wodurch andererseits Fluoreszenz gemessen wird, was auf eine effektive Hybridisierungsreaktion hinweist.
  • DNA-Chips haben den Weg zu neuen Instrumenten in der Molekularbiologie geebnet, bei welchem sogar verschiedene Analyseschritte in miniaturisierter Form vorliegen können, siehe hierzu die Patentanmeldung WO-A-00/78452 mit Priorität vom 22. Juni 1999, und FR00/10978 , angemeldet am 28. August 2000 im Namen einer der Anmelder. Darüber hinaus, und wie bereits weiter oben dargestellt, ist das starke Interesse, das kürzlich durch die „Proteomik", der Schlüsseldisziplin nach der Genomik, geweckt wurde, mit der Entwicklung des Konzeptes von Proteinchips verbunden. Auch diese bilden einen Teil der Träger gemäß der Erfindung.
  • Die Erkennungsmoleküle können beispielsweise Oligonukleotide, Polynukleotide, Proteine, wie beispielsweise Antikörper oder Peptide sein, ferner Lektine oder irgend ein anderes Liganden-Rezeptor-artiges System. Die Erkennungsmoleküle können insbesondere DNA- oder RNA-Fragmente enthalten.
  • Wenn der Träger mit einer zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, können die Erkennungsmoleküle, beispielsweise durch Hybridisierung, wenn Nukleinsäuren vorliegen, oder durch Bildung eines Komplexes, wenn Antikörper oder Antigene vorliegen, mit in einer flüssigen biologischen Probe vorliegenden Zielmolekülen wechselwirken.
  • Dadurch kann durch Ausstattung eines Biochips mit einer Vielzahl von Erkennungszonen mit verschiedenen unterschiedlichen Erkennungsmolekülen, wobei jedes Erkennungsmolekül spezifisch für ein Zielmolekül ist, eine große Anzahl von in der Probe vorliegenden Molekülen detektiert und eventuell quantifiziert werden. Selbstverständlich ist es offensichtlich, dass jede Erkennungszone nur eine Art an Erkennungsmolekülen enthält, welche identisch miteinander sind.
  • Die Anordnung aus Träger-Erkennungsmolekül-Zielmolekül kann durch ein Detektionsmolekül detektiert werden. Die Anordnung aus Träger-Erkennungsmolekül-Zielmolekül-Detektionsmolekül stellt einen Test nach Art des Sandwichformats dar. Tests im Sandwichformat sind in der Diagnostik weit verbreitet, sei es in der Molekulardiagnose, bspw. ELOSA (Enzyme-Linked Oligo-Sorbent Assay, enzymgekoppelter Oligoabsorptionstest), oder in der immunologischen Diagnose, beispielsweise der ELISA-Test (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay, enzymgekoppelter Immunabsorptionstest). Allgemein weisen diese ein Erkennungsmolekül, wie beispielsweise eine Nukleinsäure-Sonde oder ein Antigen (im Fall eines Antigen-Sandwiches) oder ein Antikörper (im Fall eines Antikörpersandwiches) auf, welches dazu dient, ein Ziel einzufangen, welches jeweils aus einer Nukleinsäure-Sonde oder einem Antikörper oder einem Antigen bestehen wird. Dieses Erkennungsmolekül ist an einen festen Träger auf eine Art und Weise angebracht, die dem Fachmann bekannt ist, wie beispielsweise:
    • • durch Adsorption,
    • • durch direkte Kopplung,
    • • oder durch ein Zwischenprotein, beispielsweise wie bei Avidin oder Protein A,
    • • oder durch Polymere.
  • Die Anordnung aus Erkennungsmolekül und Zielmolekül wird anschließend durch ein Detektionsmolekül detektiert, welches jeweils aus einer Nukleinsäuresonde oder einem Antikörper oder einem Antigen bestehen wird. Dieses Detektionsmolekül trägt oder kann nachfolgend assoziiert werden mit einem Marker, wobei der Marker notwendig ist, um die Detektion und/oder Quantifizierung zu ermöglichen. Das Detektionsmolekül, entweder noch in Assoziation mit einem Marker oder nicht, wird dann noch Detektionsmolekül genannt werden.
  • Nachfolgend im Text wird der Ausdruck „Hybridisierung" mit der Fixierung einer Nukleinsäure an eine andere Nukleinsäure verbunden sein, wogegen der Ausdruck „Komplexierung" mit der Fixierung eines Antikörpers an ein Antigen verbun den sein wird. Auf der anderen Seite wird der Ausdruck „Fixierung" eine breitere Definition besitzen, welche sich gleichzeitig beziehen kann auf:
    • • die Fixierung einer Nukleinsäure an eine andere Nukleinsäure,
    • • die Fixierung eines Antikörpers an ein Antigen, oder
    • • die Fixierung eines biologischen Moleküls an einen Träger.
  • Die gegenwärtig verfügbaren Tests wie beispielsweise diejenigen, die von einem der Anmelder für immunologische Assays entwickelt wurden, oder aber die DNA-Chips, die von der Firma Affymetrix für die medizinische Diagnose entwickelt wurden („Accessing Genetic Information with High-Density DNA-arrays", M. Shee et al., Science, 274, 610–614. „Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022–5026). Bei dieser Technologie sind die Fängersonden im Allgemeinen von einer kleinen Größe, ungefähr 20 Nukleotide lang.
  • Im Gebiet des ELOSA, also im Gebiet der Detektion von Nukleinsäuren, siehe in diesem Zusammenhang die Patentanmeldung, die von einem der Anmelder eingereicht wurde WO-A-91/19812 , werden auf die gleiche Art und Weise ein Fängeroligonukleotid (Erkennungsmolekül), eine Zielnukleinsäure (Zielmolekül), das entweder DNA oder RNA ist, und ein Detektionsoligonukleotid (Detektionsmolekül) definiert. Fänger- und Detektions-Oligonukleotide sind zu einem Abschnitt des Ziels komplementär, jedoch hinsichtlich Regionen des Ziels, die jeweils strukturell und physikalisch unterschiedlich sind, so dass die Fänger- und Detektions-Oligonukleotide nicht miteinander hybridisieren können.
  • Die Detektionselemente tragen einen Marker, welcher die Detektion und/oder die Quantifizierung des Ziels ermöglicht, sowohl bei der molekularen Diagnose als auch bei immunologischen Assays. Mit Markierungen wird vorliegend die Fixierung eines Markers verstanden, der entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal erzeugen kann. Verschiedene Marker sind entwickelt worden, wobei ständig Aufgabe war, deren Sensitivität zu verbessern. Sie können entweder radioaktiv, enzymatisch, fluoreszierend, oder, wie erst kürzlich beschrieben, in Form von Nanopartikeln vorliegen. Diese Nanopartikel unterscheiden sich Mikropartikeln, insbesondere bezüglich deren Größe, die deutlich unterhalb eines Mikrometers bleibt. Da diese doch weniger trivial sind, sind sie Gegenstand einer nachstehenden detaillierten Offenbarung.
    • • Eine nicht einschränkende Liste dieser Marker, mit welchem es möglich ist, eine Bildgebung mit einem einzigen Marker durchzuführen, wird in der nachstehenden Beschreibung offenbart werden.
  • Es können auch indirekte Systeme eingesetzt werden, wie beispielsweise Liganden, die mit einem Antiliganden reagieren können. Die Liganden-/Antiliganden-Paare sind den Fachleuten hinreichend bekannt, und sind beispielsweise die folgenden Paare:
    • • Biotin/Streptavidin,
    • • Hapten/Antikörper,
    • • Antigen/Antikörper,
    • • Peptid/Antikörper,
    • • Zucker/Lektin,
    • • Polynukleotid/komplementär zum Polynukleotid,
    • • aufeinanderfolgende Histidin-Sequenzen, genannt „tag" für ein Metall, beispielsweise Nickel.
  • In diesem Fall ist es der Ligand, der das verbindende Agens trägt. Der Antiligand kann entweder direkt durch die in dem vorherigen Absatz beschriebenen Marker detektiert werden, oder kann wiederum selber durch einen Liganden/Antiliganden detektierbar sein.
  • Diese indirekten Detektionssysteme können unter bestimmten Bedingungen zu einer Signalamplifizierung führen. Diese Signalamplifizierungstechnik ist einem Fachmann hinreichend gut bekannt, und es wird beispielsweise auf frühere Patentanmeldungen wie die FR98/10084 oder die WO-A-95/08000 im Namen einer der Anmelder verwiesen oder aber auf den Artikel J. Histochem. Cytochem. 45: 481–491, 1997.
  • Darüber hinaus haben die Anmelder bezüglich einer Signalamplifizierungstechnik gemeinsam eine Patentanmeldung PCT/FR00/03359 eingereicht, unter Inanspruchnahme der französischen Priorität vom 2. Dezember 1999. Nichtsdestotrotz arbeitet diese nicht auf der Basis der in den vorstehenden Dokumenten dargestellten Lehren, bei welcher die Anzahl der Marker auf der Ebene der Bindungsstellen der Marker erhöht wird, sondern bei dieser wird vielmehr eine besondere Beschichtung auf der Oberfläche des Trägers eingesetzt, wobei die Beschichtung auf einer dünnen Schicht eines Materials basiert, das ausgewählt ist aus Siliconnitrid, Siliconcarbid, Titanoxid, Aluminiumoxid, ZrO2, ZrO4Ti, HfO2, Y2O3, Diamant, MgO, Oxynitride (SixOyNz), fluorierte Materialien, YF3, MgF2. Diese beiden Techniken können kumulativ sein.
  • Wie weiter oben erwähnt, können die Marker auch in Form von Nanopartikeln vorliegen. Die ersten Versuche, bei denen Konjugate mit Nanopartikeln eingesetzt wurden, datieren in die 80-er Jahre zurück. Die Versuche waren durch die Suche nach hoch sensitiven Markierungstechniken motiviert, bei welchen der Einsatz von Radioaktivität oder der Einsatz von enzymatischen Markierungen vermieden wird, welche nicht nur zeitaufwendig sind, sondern auch toxische Reagenzien einsetzen. Seit damals wurden sie grundlegend weiterentwickelt und eingesetzt, und viele Arten an Partikeln sind entwickelt worden, wie beispielsweise Mikropartikel, Nanopartikel aus Latex oder Partikel aus kolloidalem Gold oder alternativ fluoreszierende Partikel. Nachstehend wird der Ausdruck „Partikel" ohne Unterschied für Mikropartikel oder Nanopartikel oder andere Partikel unterschiedlicher Größe verwendet. Gegenwärtig sind viele Partikel kommerziell erhältlich (Gangs, Milteny, Molecular Probes, Polyscience, Immunicon).
  • Markierungsversuche, bei welchen Nanopartikel eingesetzt werden, wurden im Gebiet der immunologischen Assays von J. H. W. Leuvering, P. J. H. M. Thal, M. Van der Waart und A. H. W. M. Schuurs, Sol Particle Immunoassay (SPIA). Journal of Immunoassay 1(1): 77–91, 1980, eingesetzt.
  • Die Verwendung von Nanopartikeln ermöglichte den Zugang zu anderen Technologien, wie beispielsweise die Rasterkraftmikroskopie zum Ablesen immunologischer Assays; diese Technologie ermöglicht es auf einem TSH-Detektionsmodell, über ein Sandwichsystem, das auf einem Siliconträger unter Verwendung von Anti-TSH-Detektionsantikörperkonjugaten angebracht ist, die mit Goldnanopartikeln verbunden sind, eine Sensitivität in der Größenordnung von 1 pM zu erzielen. Diesbezüglich wird auf die folgenden zwei Publikationen Bezug genommen:
    • • Agnes Perrin, Alain Theretz, und Bernard Mandrand, Thyroid stimulating hormone assays based an the detection of gold conjugates by scanning force microscopy. Analytical biochemistry 256: 200–206, 1998, und
    • • Agnes Perrin, Alain Theretz, Veronique Lanet, S. Vialle, und Bernard Mandrand, Immunomagnetic concentration of antigens and detection based an a scanning force microscopic immunoassay. Journal of immunological methods 8313, 1999.
  • Die Verwendung von Nanopartikeln für die Detektion von Nukleinsäuren wurde erste kürzlich beschrieben. Die im Gebiet der Immunologie durchgeführten Arbeiten finden ihr Äquivalent im Gebiet der Nukleinsäuren. Es gibt keine fundamentale Innovation beim Markierungsverfahren oder beim Detektionsverfahren. Da keine ELISA-Platten mehr existieren, werden sie durch einen flachen Träger ersetzt. Die Nanopartikel werden anschließend durch Mikroskopie, durch Amplifikation hinsichtlich Oberflächenplasmonresonanz, genannt „Biosensor"-Technik oder durch Messung unter Einsatz von ASM detektiert. Insgesamt betrachtet bleiben die biologischen Modelle einfache Modelle.
  • Die Arbeiten von Taton, T. A. Mirkin C. A. und Letsinger R. L., die sich auf „Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes", Science 2000, 8. September 289 (5485): 1757–60, beziehen, offenbaren der Einsatz von Goldnanopartikeln, die mit Detektionsoligonukleotiden mit einer Länger von 15 Basen gekoppelt sind, zur Detektion eines Ziels mit 27 Basen, welches auf einer Sonde mit 12 Basen eingefangen wird. Das Detektionssignal wird durch eine Markierung mit Silber amplifiziert. Für hohe Zielkonzentrationen in der Größenordnung von 10 Nanomolar (nM) wird die Detektion der Partikel optisch ausgeführt, indem der Übergang einer Pink-Farbe beobachtet wird. Für niedrigste Konzentrationen, wie bspw. 100 Picomolar (pM), ist bei der Detektion beispielsweise der Einsatz eines Scanners notwendig. Die erreichte Sensitivität liegt in der Größenordnung von 50 Femtomolar (fM). Die Autoren sind in der Lage, Nanopartikel von der Oberfläche durch Erhitzen zu dissoziieren, was auf deren Spezifität für die Markierung hindeutet. Gleichwohl muss, gemäß dem Versuch der Anmelder und aufgrund der jeweiligen Größen der Detektionsoligonukleotide (15 Basen), der Zieloligonukleotide (27 Basen) und der Fängeroligonukleotide (12 Basen), notwendigerweise eine Dissoziation zwischen den Nanopartikeln und den Detektionsoligonukleotiden vorliegen. Diese Arbeiten basieren darüber hinaus auf Versuchsansätzen, die Gegenstand mehrerer Veröffentlichungen (1996; 1997; 1997; 2000) und mehrerer Patentanmeldungen und Patente waren, wie beispielsweise WO-A-98/04740 .
  • Diese Forscher führten eine Dissoziierung der Nanopartikel durch, die nicht zwischen Nanopartikeln, die mit einem Detektionsmolekül ohne Fehlanpassung mit dem Ziel assoziiert sind, und Nanopartikeln unterscheidet, die mit einem Detektionsmolekül mit einer Fehlanpassung mit dem Ziel assoziiert sind. In dem folgenden Text wird der Ausdruck „Dissoziierung" insbesondere als Trennung zwischen dem Erkennungsmolekül und dem Zielmolekül und/oder die Trennung des Zielmoleküls und dem Detektionsmolekül verstanden. Wenn diese Dissoziierung thermisch ist, besteht die beteiligte physikalische Eigenschaft aus dem Schmelzpunkt (Tm), welcher dem Temperaturbereich entspricht, in welchem die DNA- oder RNA-Moleküle denaturiert werden. Genauer gesagt entspricht diese Temperatur einem Zustand, bei welchem eine Population identischer Oligonukleotide, in Gegenwart einer identischen Menge von komplementären Oligonukleotiden, zu 50% in doppelsträngiger Form vorliegt, und somit also gepaart ist, und zu 50% in einzelsträngiger Form.
  • Obgleich es Markierungen mit Nanopartikeln ermöglichen, eine gute Sensitivität zu erreichen, so muss dennoch ein Kompromiss zwischen dem Anstieg im spezifischen Signal und dem Absenken im unspezifischen Signal gemacht werden. Das unspezifische Signal ist selbstverständlich hinsichtlich der Verbesserung der Sensitivität und der Dynamiken des Verfahrens limitierend. Die Autoren lösen diese Probleme durch die Optimierung der Versuchsbedingungen. Als ein Leitfaden haben einige Autoren (Okano et al.; Anal. Biochem. 202: 120–125; 1992) einerseits die Konzentration der Detektionsoligonukleotide je Partikel sowie andererseits die Konzentration der Partikel in der Lösung optimiert. Auch hatten sie darin Erfolg, unspezifische Signal durch Hinzufügen von BSA (bovines Serumalbumin) zu reduzieren.
  • Hinsichtlich des Einsatzes von Nanopartikeln zur Amplifizierung eines auf einem Biosensor gewonnenen Signals wird auf die Arbeiten von Lin He, Michael D. Musick, Scheila R. Nicewaener, Frank G. Salinas, Stephen J. Benkovic, Michael J. Natan, und Christine D. Keating Bezug genommen: Colloidal Au-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of DNA hybridization, J. Am. Chem. Soc. 122: 9071–9077, 200. Detektionsoligonukleotide (12 Basen), konjugiert mit Nanopartikeln aus kolloidalem Gold, wurden dazu eingesetzt, die Detektion eines Nukleinsäuren-Ziels mit kleiner Größe (24-mere) durch Oberflächenplasmonresonanz zu amplifizieren. Die Autoren erhielten eine Sensitivität von 10 pM, und somit eine Oberflächendichte von 8 × 108 Molekülen/cm2 mit einer Verbesserung in der Signalintensität um einen Faktor von 100.000. Ferner verifizierten sie die Hybridisierungsspezifität durch Desoziierung der Nanopartikel von der Oberfläche, entweder durch Erhitzen oder durch einen Verdau mit Restriktionsenzymen, wenn auf der hybridisierten Sequenz eine Restriktionsstelle vorlag. In diesem Fall wurde die Markierung zur Amplifizierung des Signals eingesetzt, und die Dissoziierung diente für den Nachweis, dass die Markierung aus einer spezifischen Hybridisierung herrührt.
  • Es handelt sich um eine Verifizierung der Hybridisierung. Entweder die Nanopartikel werden durch Erhitzen getrennt, wobei das Szenario wie von Taton (2000) beschrieben vorliegt, und es gibt keine Spezifität in der Entfernung des Markers, oder die Nanopartikel werden durch Restriktionsenzyme getrennt, wobei hier die Nanopartikel beispielsweise durch Waschen entfernt werden, während sie gleichzeitig mit allen oder Teilen der Detektionsmoleküle und/oder dem Hybrid assoziiert bleiben.
  • Diese Trennung besitzt einen ausgerichteten Charakter, jedoch ohne Dissoziierung oder mit einer teilweisen Dissoziierung der Doppelstränge.
  • Unter den im Stand der Technik verwendeten Verfahren, bei welchen Nanopartikel eingesetzt werden, schildert die Veröffentlichung von Kubitschko S., Spinke J., Bruckner T., Pohl S. und Oranth N. „Sensitivity enhancement of optical immunosensors with nanoparticles" Anal. Biochem. 253(1): 112–122 aus dem Jahr 1997 die Dissoziierung von Antikörperkonjugaten bezüglich Antigenen in der Immundiagnostik. Diese Dissoziierung wird mit Ameisensäure erreicht, welche dazu dient, eine Mikrokomponente zu regenerieren, die immer noch die Antikörper für nachfolgende Einsätze der Mikrokomponente enthält.
  • Das darin beschriebene Verfahren ist eher ein Verfahren zur Reinigung einer Mikrokomponente; als Ergebnis wird keine Defacto-Unterscheidung gemacht, wenn die Dissoziierung der Antikörperkonjugate bezüglich der Antigene durchgeführt wird, welche mit den Nanopartikeln verbunden sein können.
  • Das US-Patent mit der Nr. 6,093,370 offenbart ein anderes Verfahren, welches die Gewinnung einer auf einem DNA-Chip eingefangenen DNA zur Aufgabe hat. Dieses Verfahren stellt ein photothermisches Dissoziationsverfahren dar, das mit einem Infrarot(IR)-Laser bei 1053 Nanometern (nm) durchgeführt wird, welches mit einer Energie von zwischen 10 und 100 mW die Region auf dem Chip bestrahlt, in welcher die DNA wiedergewonnen werden soll. Die in Lösung gebrachte DNA wird durch PCR amplifiziert. Die Autoren zeigen, dass sie in der Lage sind, zumindest ein DNA-Molekül pro 169 nm2 zu extrahieren, was 10–17/1000 μm2 entspricht.
  • Nichtsdestotrotz benutzen sie keine physikalisch chemische Dissoziation zur Bestimmung der tatsächlichen Hybridisierungen, da diese die spezifischen (echt positive) der anderen Hybridisierungen darstellen.
  • Zusätzlich zu den oben erwähnten Dissoziationstechniken, also Dissoziation durch thermische Denaturierung (Erhitzen), durch photothermische Denaturierung (IR-Laser), durch Verdau (Restriktionsenzyme), durch Chemie (Ameisensäure), existieren im Stand der Technik auch andere Verfahren zur Dissoziierung von Nukleinsäuren.
  • Daher ist es möglich, die Ionenstärke des Hybridisierungspuffers zu modifizieren, um das Detektionsoligonukleotid vom Ziel zu dissoziieren. Tatsächlich variiert der Schmelzpunkt der Oligonukleotide entsprechend der Ionenstärke des Puffers. Je niedriger die Ionenstärke des Puffers ist, desto weniger stabil ist das Oligonukleotid. Es ist auch möglich, die Wirkung der Temperatur mit den Pufferbedingungen zu kombinieren.
  • Es ist auch möglich, PNA (Peptidische Nukleinsäuren) oder andere Moleküle zu verwenden, die im Stand der Technik zum Einfangen einer Nukleinsäure eingesetzt werden. Die PNA/Oligonukleotid-Hybride besitzen die gleiche thermische Stabilität, unabhängig von der Ionenstärke, was bedeutet, dass ihr Schmelzpunkt nicht mit der Ionenstärke des Hybridisierungspuffers variiert. Wenn die Fängersonde eine PNA ist, und die Detektionssonde ein Oligonukleotid, dissoziiert die Detektionssonde – bei Verwendung einer niedrigen Ionenstärke – vom Ziel, wohingegen das Ziel mit der Fängersonde (PNA) hybridisiert bleibt.
  • Es ist möglich, die Detektionssonden chemisch zu modifizieren, um die Dissoziierung der DNA unter bestimmten Bedingungen durchzuführen. Diese Dissoziierungsverfahren beziehen sich nicht auf die Partikel, die mit der Oberfläche über die Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel und des Trägers Wechselwirken.
  • Es ist auch möglich, eine Base des Oligonukleotids zu modifizieren, wie beispielsweise von Dreyer et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 968–972; 1985). Hier wird eine EDTA-Gruppe an Thymidin gekoppelt. In Gegenwart von DTT, Fe(II) und O2, findet eine Spaltung der DNA beim EDTA-tragenden Thymidin statt.
  • Da es auch möglich ist, ein Biotin an das Detektionsoligonukleotid zu koppeln, um es anschließend an Avidin anzuheften; ferner ist es auch möglich, eine chemische Gruppe eines homo-bifunktionalen oder hetero-bifunktionalen Typus (chemisch funktionale Gruppen, die notwendig für die Anhaftung an das Oligonukleotid und den Träger sind) zu koppeln, wobei die Gruppe eine zusätzliche chemisch funktionelle Gruppe enthält, die unter bestimmten Bedingungen gespalten werden kann: Beispielsweise eine photo-spaltbare Gruppe oder alternativ eine Gruppe, die durch DTT reduziert wird. Im Fall der photo-spaltbaren Gruppe wird durch die Exponierung des Oligonukleotids gegenüber einer bestimmten Wellenlänge die funktionelle Gruppe gespalten und das Oligonukleotid von seinem Träger dissoziiert.
  • Ein anderes Verfahren kann auch darin bestehen, eine bekannte Sequenz mit einer kleinen Größe, genannt „tag", hinzuzufügen, welche die Eigenschaft hat, mit einer chelatierenden Gruppe, die auf dem Nanopartikel vorliegt, über ein Metallion zu chelatieren. Der „tag" kann ein Histidin-Tag oder irgendein anderes Molekül sein, das im Stand der Technik beschrieben ist. Die chelatierende Gruppe kann ein NTA (Nitrilotriessigsäure) oder irgendeine andere Gruppe sein, die im Stand der Technik beschrieben ist. Die Dissoziierung wird darin bestehen, dass Verfahren eingesetzt werden, die im Stand der Technik zur Dissoziierung der Wechselwirkung der Tag-Metall-chelatierenden Gruppe beschrieben sind (beispielsweise durch Einsatz von EDTA).
  • Die Dissoziierung kann auch durch Entfernen der Detektionssonde durchgeführt werden, welche auf dem Nanopartikel vorliegt, und zwar durch Oligonukleotide mit identischen Sequenzen. Diese Oligonukleotide können entweder eine kürzere Sequenz oder die gleiche Sequenz besitzen, mit einer zusätzlichen Sequenz komplementär zum Ziel. Es ist auch möglich, Nukleinsäure-Analoga für diese Kompetitions-Verdrängung einzusetzen, beispielsweise PNAs (Peptidische Nukleinsäuren) oder ein anderes Analogon mit dem Vorteil eines neutralen Grundgerüsts.
  • Bezüglich der Dissoziierung von Proteinmolekülen wie Antigene und/oder Antikörpern ist es möglich, irgendeines der Verfahren anzuwenden, die im Stand der Technik für die Dissoziierung der Wechselwirkungen zwischen einem Antigen und einem Antikörper beschrieben sind (einige Techniken, die im Gebiet der Affinitätschromatographie bekannt sind). Beispielhaft ist es daher möglich, die Dissoziierung durch Anwendung von sauren Lösungen durchzuführen, wie beispielsweise Glyzinpuffer mit saurem pH-Wert oder Lösungen mit hoher Ionenstärke, wie beispielsweise SM LiCl (Kubitschko et al., Anal. Biochem. 253(1): 112–122; 1997). Es ist auch möglich, denaturierende Agenzien wie beispielsweise Guanidiumchlorid, Harnstoff oder alternative, Detergenzien enthaltende Lösungen einzusetzen, oder Verfahren zum Verdau von Proteinen mit Proteasen oder sogar Endoproteasen, die spezifisch für das Antigen oder den Antikörper sind, oder die alternativ unspezifisch für die Antigene oder die Antikörper sind.
  • Im Falle einer Doppelmarkierung sollte die Dissoziierung gerichtet sein, ohne für die Proteine denaturierend zu sein, so dass eine sekundäre Markierung ermöglicht wird. Dies kann beispielsweise durch Verdrängung durchgeführt werden, indem synthetische Peptide eingesetzt werden, deren Sequenzen den Sequenzen der Epitope moloclonaler Antikörper entsprechen, jedoch eine höhere Affinität besitzen.
  • Es ist auch möglich, Antigene und Antikörper zu modifizieren, und zwar chemisch oder durch Gentechnikverfahren, um die Dissoziierung unter bestimmten Bedingungen durchzuführen. Diese Verfahren betreffen jedoch nicht die Proteinmoleküle, die direkt mit der Oberfläche auf unspezifische Art und Weise Wechselwirken. Daher kann die Modifizierung eines der Proteine (Antigen oder Antikörper) betreffen, beispielsweise eine Einführung einer Sequenz mittels Gentechnik zur Spaltung durch eine Endoprotease. In Gegenwart des Enzym wird das zu detektierende Protein gespalten. Die zweite Markierung wird unter Verwendung eines zweiten monoclonalen Antikörpers durchgeführt, der für die verbleibende Proteinsequenz spezifisch ist. Die Modifizierung kann ein Ende des Proteins betreffen, indem beispielsweise mittels Gentechnikverfahren ein Tag hinzugefügt wird. Diese Tag kann durch monoclonale Antikörper erkannt werden, die Dissoziierung wird dann durch Verdrängung unter Verwendung von Kompetitorpeptiden oder Antikörpern durchgeführt. Beispielhaft kann der Tag eine „Polyhistidin"-Sequenz sein, die eine Spalt- Sequenz für Endoproteasen enthält, die zuvor nicht in der Sequenz vorliegt, wodurch die Dissoziierung dann durch enzymatische Spaltung durchgeführt wird. Andere Sequenzen, wie beispielsweise Protein-„Splice"-Sequenzen können ebenfalls in das Protein eingebaut werden. Die Spaltung wird in Gegenwart von beispielsweise DTT durchgeführt.
  • Schließlich ist es auch möglich, an das Detektionsprotein eine Nukleinsäuresequenz hinzuzufügen. Dadurch wird ein Tag erhalten, wie oben beschrieben wurde, der von einer Nukleinsonde erkannt werden kann, die selber mit einem Nanopartikel konjugiert ist. Die Dissoziierung, sei sie gerichtet oder auch nicht, kann anschließend durch eine der für Nukleinsäuren beschriebenen Techniken durchgeführt werden, vorausgesetzt, dass die Proteinanordnung nicht denaturiert ist, wenn eine gerichtete Dissoziierung vollzogen wird. Kompetitionsverfahren sind aus dieser Sicht vorteilhaft.
  • Sämtliche oben erwähnten Elemente können in die Erfindung aufgenommen werden, um deren Wirkungsweise weiter zu verbessern.
  • Gemäß der Patentanmeldung WO-A-99/65926 einer der Anmelder ist es auch möglich, im Falle der Nukleinsäuren auf das eigentliche Detektionsmolekül zu verzichten. Jedes Ziel kann chemisch, enzymatisch oder physikalisch gespalten werden, während es gleichzeitig einer Markierung oder etwas anderem unterzogen wird. Die Gegenwart eines Detektionsmoleküls ist damit nicht länger notwendig, da das Zielmolekül markiert wird.
  • Es existieren Vorrichtungen zum Ablesen von Molekülen, die markiert sind oder auch nicht, und welche in den Erkennungszonen des Chips vorliegen können.
  • Das Ablesen der Erkennungszonen kann tatsächlich auch ohne das Vorliegen des Markers durchgeführt werden, wobei eine solche Technologie bereits im Stand der Technik bekannt ist.
  • Unter den direkten Detektionsverfahren der Hybridisierung ist es auch möglich, insbesondere die Detektion der Variation in der Masse, der Variation in der Dicke und der Variation im Index zu unterscheiden. Es sind auch photothermische Verfahren bekannt, die in der Veröffentlichung von S. E. Bialkowski, Band 137 unter dem Titel beschrieben sind: „Photothermal spectrocopy methods for chemical analysis" taken from chemical analysis: a series of monographs an analytical chemistry and ist application, Wiley. Schließlich beschreibt das US-Patent mit der Nr. 4,299,494 ein Verfahren zur photothermischen Deflektion.
  • Daher findet die Erfindung Anwendungen im Gebiet der biologischen und chemischen Analysen.
  • Allgemein hat das Ablesen der molekularen oder immunologischen Diagnosen, wie zuvor erwähnt, den Hauptnachteil, dass sie durch Falsch-Positive limitiert sind, also durch Hybride oder Komplexe, die sich durch Hybridisierung oder Komplexbildung bilden, wenn sie sich nicht bilden sollten, und/oder durch Falsch-Negative, also durch Hybride oder Komplexe, die sich nicht durch Hybridisierung oder Komplexbildung bilden, wenn sie sich bilden sollen. Das Vorliegen von Falsch-Positiven oder Falsch-Negativen verursacht noch einen anderen Nachteil, was die Folge des ersten, oben erwähnten Nachteils ist; die molekulare Diagnose oder das immunologische Assay ist nicht sensitiv (die Fähigkeit, das gesuchte Hybrid oder den gesuchten Komplex zu identifizieren, wenn es in einer kleinen Menge in einer biologischen zu untersuchenden Probe vorliegt) und/oder nicht spezifisch (die Fähigkeit, das gesuchte Hybrid oder den gesuchten Komplex in der zu testenden biologischen Probe, die andere Hybride oder Komplexe enthält, zu detektieren). Dies kann diagnostische Fehler verursachen, die für Patienten, Praktiker und für Firmen, die solche Tests herstellen, nicht akzeptierbar sind.
  • Mit der vorliegenden Erfindung sollen sämtliche dieser zuvor erwähnten Nachteile des Standes der Technik überwunden werden, indem ein Verfahren zum Ablesen bereitgestellt wird, das nur wenig oder gar nicht durch das Vorliegen von Falsch-Positiven beeinflusst ist, und das daher die Sensitivität und Spezifität diagnostischer Tests wesentlich verbessert.
  • Hierzu bezieht sich die vorliegende Erfindung gemäß einer ersten Ausführungsform auf ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 2.
  • Gemäß einer zweiten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 3.
  • In den vorgenannten zwei Fällen kann das Verfahren zusätzlich die folgenden zusätzlichen nachfolgenden Schritte aufweisen:
    • • In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers, nach der spezifischen Trennung, mit einer zweiten flüssigen Probe oder mit einer anderen flüssigen Probe, um zumindest ein biologisches markiertes Zielmolekül von Neuem zu fixieren an – das oder die biologischen Erkennungsmolekül(e), von dem oder von denen sie getrennt wurden, und/oder – irgendein anderes Erkennungsmolekül oder andere Erkennungsmoleküle, die von der gleichen Erkennungszone abgeleitet sind,
    • • Herstellen eines dritten Bildes des Trägers nach dieser neuen Bindung der Zielmoleküle oder des Zielmoleküls,
    • • Analysieren des dritten Bildes im Vergleich zur vorherigen Analyse der zwei ersten Bilder zur Bestätigung der spezifischen Bindung zwischen den Erkennungsmolekülen und dem oder den Zielmolekül(en).
  • Gemäß einer dritten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch S.
  • Gemäß einer vierten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 6.
  • Gemäß einer fünften Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 7.
  • Gemäß einer sechsten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 8.
  • Gemäß einer siebten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 9.
  • Gemäß einer achten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen auf einem Träger von zumindest einer biologischen Reaktion gemäß Anspruch 10.
  • In den vorstehenden fünf Fällen kann das Verfahren die folgenden zusätzlichen nachfolgenden Schritte aufweisen:
    • • In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers, nach der spezifischen Trennung, mit einer dritten flüssigen Probe oder mit einer weiteren flüssigen Probe, um zumindest ein markiertes Detektionsmolekül von neuem zu binden an: – das oder die Zielmoleküle, von welchen dieses oder diese getrennt waren und/oder – jedes andere Zielmolekül oder Zielmoleküle (3), die an ein oder mehrere Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind, welche von einer Erkennungszone abgeleitet sind,
    • • Anfertigen eines dritten Bildes des Trägers nach dieser neuen Bindung der Detektionsmoleküle, und
    • • Analysieren des dritten Bildes im Vergleich zu der vorherigen Analyse der zwei ersten Bilder zur Bestätigung der spezifischen Bindungen zwischen den Ziel- und den Detektionsmolekülen.
  • Gemäß einer ersten Variante der Ausführungsform der Erfindung wird mindestens ein Waschschritt nach der Bindung von ausgeführt:
    • • den Erkennungsmolekülen an den Träger, wobei die Erkennungsmoleküle gegebenenfalls an die markierten Zielmoleküle gebunden sind und/oder an die unmarkierten Zielmoleküle, wobei die letzteren gegebenenfalls an Detektionsmoleküle gebunden sind, und/oder
    • • den markierten Zielmolekülen und/oder den unmarkierten Zielmolekülen an die Erkennungsmoleküle, welche vorzugsweise an den Träger gebunden sind, wobei die Zielmoleküle gegebenenfalls an die Detektionsmoleküle gebunden sind, und/oder den
    • • den Detektionsmolekülen an die unmarkierten Zielmoleküle, welche an die an den Träger gebundenen Erkennungsmoleküle gebunden sind.
  • Gemäß einer zweiten Variante der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der Trägern aus magnetischen Partikeln, und das Verfahren weist die Schritte der Magnetisierung der magnetischen Partikel auf, welche vorzugsweise eingesetzt werden:
    • • während irgendeines Schrittes der physikalisch-chemischen Behandlung und/oder der Herstellung des Bildes, wie weiter oben beschrieben, und/oder
    • • vor irgendeinem Waschschritt, wie weiter oben beschrieben.
  • Gemäß einer dritten alternativen Ausführungsform der Erfindung ermöglicht das In-Verbindung-Bringen des Trägers mit zumindest zwei ersten flüssigen unterschiedlichen Proben, die gegebenenfalls zuvor vermengt wurden, die Bindung von zumindest zwei unterschiedlichen Erkennungsmolekülen an den Träger in zumindest zwei unterschiedlichen Erkennungszonen.
  • Unabhängig von der Alternative, besteht das Detektionsmolekül, wenn mindestens zwei wahlweise unterschiedliche Zielmoleküle quantifiziert werden sollen, aus einem Molekül, das direkt oder indirekt mit zumindest einem Marker assoziiert ist, wie beispielsweise einem Nanopartikel, dessen Mittel, die die Bilder hervorrufen, eine individuelle Visualisierung ermöglichen, und zwar trotz des Vorliegens anderer benachbarter Detektionsmoleküle und Ähnlichem.
  • In allen Fällen können die physikalisch-chemischen Bedingungen, welche die Trennung der markierten Zielmoleküle bezüglich der Erkennungsmoleküle, oder der Detektionsmoleküle bezüglich der Zielmoleküle, ermöglichen, durch eine Erhitzung auf den Schmelzpunkt erreicht werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die markierten Zielmoleküle, die Erkennungsmoleküle oder die Zielmoleküle, aus Nukleinsäuren, oder die Detektionsmoleküle weisen Nukleinsäuren auf.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform bestehen die markierten Zielmoleküle, die Erkennungsmoleküle oder die Zielmoleküle aus Antikörpern und/oder Antigenen, oder die Detektionsmoleküle weisen Antikörper und/oder Antigene auf.
  • In jedem Fall kann die Markierung des Zielmoleküls oder der Detektionsmoleküle folgendermaßen durchgeführt werden:
    • • durch Partikel, die durch konventionelle optische Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie oder Rasterkraftmikroskopie visualisiert werden können,
    • • durch Moleküle, die durch Rasterkraftmikroskopie visualisiert werden können,
    • • durch Enzyme mit einem zu fällenden Produkt, welches ein detektierbares Signal produziert, beispielsweise durch Fluoreszenz, Lumineszenz, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase, β-Galactosidase oder Glukose-6-Phosphat-Dihydrogenase,
    • • durch Chromophore, wie beispielsweise fluoreszierende oder lumineszierende Verbindungen,
    • • durch elektronische Marker, die durch Elektronenmikroskopie detektiert werden können,
    • • durch absorbierende Moleküle, die durch thermische Linsenmikroskopie visualisiert werden können.
  • In dem Falle, wo drei aufeinander folgende Bilder des Trägers hergestellt werden, umfasst die andere flüssige Probe anstelle entweder der zweiten oder der dritten flüssigen Probe, einen Marker, der unterschiedlich ist zu demjenigen, der in zweiten oder dritten flüssigen Proben enthalten ist, zum In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers nach der spezifischen Trennung.
  • Die beigefügten Figuren und Beispiele sollen lediglich beispielhaft sein, und implizieren keinerlei Beschränkungen. Sie dienen dazu, die Anmeldung besser zu verstehen.
  • 1 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, der auf der Einführung einer zweiten Flüssigkeit, die Zielmoleküle enthält, in einen Biochip besteht, welcher seinerseits Erkennungsmoleküle trägt.
  • 2 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, bestehend aus einem Waschschritt, zur Entfernung der nicht hybridisierten oder nicht komplexierten Zielmoleküle, also der Moleküle, die nicht an den Chip fixiert sind.
  • 3 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, der aus der Einführung einer dritten Flüssigkeit, die Detektionsmoleküle enthält, in einen Biochip besteht, welcher sowohl Erkennungsmoleküle als auch Zielmoleküle trägt.
  • 4 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus einem Waschschritt, zur Entfernung der nicht hybridisierten oder nicht komplexierten Detektionsmoleküle, also der Moleküle, die nicht an dem Biochip anhaften.
  • 5 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus der Herstellung eines ersten Bildes, welches die auf dem Biochip detektierten Hybride oder Komplexe nach dem in den 1 bis 4 oben dargestellten Schritten wiedergibt.
  • 6 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus einer gerichteten Spaltung, mit welcher die Dissoziierung zwischen den Zielmolekülen und den Detektionsmolekülen ermöglicht wird.
  • 7 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus der Herstellung eines zweiten Bildes, welches die auf dem Biochip detektierten Hybride oder Komplexe nach dem in der 6 oben dargestellten Schritt wiedergibt.
  • 8 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus der Wiedereinführung der dritten Flüssigkeit, die Detektionsmoleküle aufweist, in einen Biochip dar, der sowohl Erkennungsmoleküle als auch Zielmoleküle trägt.
  • 9 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus einem Waschschritt zur Entfernung der Detektionsmoleküle, die sich nicht innerhalb des Biochips angeheftet haben.
  • 10 stellt einen Schritt des Verfahrens zum Ablesen dar, und besteht aus der Herstellung eines dritten Bildes, welches die auf dem Biochip nach den in den 8 und 9 oben dargestellten Schritten detektierten Hybride oder Komplexe wiedergibt.
  • 11 schließlich stellt den letzten Schritt des Verfahrens zum Ablesen gemäß der Erfindung dar, wobei dieser Schritt aus der gleichzeitigen Analyse des zweiten und dritten Bildes besteht, um ein viertes Bild zu erhalten, das die auf dem Biochip detektierten Hybride oder Komplexe wahrhaft wiedergibt.
  • Die oben dargestellten Beispiele ermöglichen es ferner, die Erfindung besser zu verstehen.
  • Beispiel 1: Spezifische Dissoziierung der Detektionsmoleküle, die mit magnetischen Nanopartikeln assoziiert sind, von den Zielmolekülen
  • Das Modell, das aus HIV-Sequenzen ausgewählt ist, besteht aus:
    • • einem Erkennungsmolekül 2, das 5' biotinyliert ist, um dessen Anhaftung an einen Träger 1 zu ermöglichen, und entspricht der Sequenz SEQ ID Nr. 1:
      Figure 00260001
    • • einem Zielmolekül 3, das der Sequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht:
      Figure 00260002
    • • einem Detektionsmolekül 4, das ein biotinyliertes Oligonukleotid an seinem 3'-Ende aufweist, und welches der Sequenz SEQ ID Nr. 3: 5'-TTCTGAACTTATTCTT-3' (Länge: 16 Nukleotide) entspricht, sowie einem Marker.
  • In der SEQ ID Nr. 2 ist ein Teil der Sequenz fett markiert und unterstrichen, und dieser Teil entspricht der Sequenz, die zu der SEQ ID Nr. 1 des Erkennungsmoleküls 2 komplementär ist. Ein anderer Teil der Sequenz ist lediglich unterstrichen, und dieser Teil entspricht der Sequenz, die zu der SEQ ID Nr. 3 des Detektionsmoleküls 4 komplementär ist.
  • Erster Schritt: Immobilisierung der Erkennungsmolekül auf den Träger:
  • Der Träger 1 wird als Corning Glasträger (Referenz 0211) mit dem Format 18 mm × 18 mm verwendet, der zuvor mit 1% AMPMES (Amino-Propyl-Dimethyl-Ethoxysilane) silanisiert wurde.
  • Auf diesem Träger 1 ist Neutravidin (Neutravidin Biotin-bindendes Protein Pierce Referenz 31000AH) über PDC (Phenylen Diisothiocyanat) mit einer Konzentration von 1 mm/ml PBS (Phosphat gepufferte Saline) in Form einer Ablagerung von 2 μl, also 2 mm im Durchmesser, angebracht. Dieser vorangehende Schritt, der nicht in den Figuren dargestellt ist, ermöglicht die nachfolgende Fixierung der Erkennungsmoleküle 2 an den Träger 1, indem die biotilysierten Enden der Erkennungsmoleküle 2 an das auf dem Träger 1 vorliegende Neutravidin immobilisiert werden.
  • Nach einem Waschschritt mit einer Lösung von 1%-igem wässrigem Ammoniak, 1M NaCl, 1% BSA (Bovines Serum Albumin) und nach Inkubierung in dem gleichen Puffer für 10 Minuten, wurde der Träger 1 mit Wasser und anschließend mit TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA), 1 M NaCl gewaschen, um das nicht angehaftete Neutravidin zu entfernen.
  • Der Träger 1, auf welchen das Neutravidin angehaftet ist, wird anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart der Erkennungsmoleküle 2 inkubiert, und zwar in Lösung in TE, 1M NaCl, mit einer Konzentration von 5 μm. Der Träger 1 wird in einer Lösung von 1%-igem wässrigen Ammoniak, 1 M NaCl, 1% BSA und für eine Inkubationszeit von 10 Minuten gewaschen. Der Träger 1 wird dann in diese gleiche Lösung eingebettet, um die Gesamtheit der Erkennungszonen 20 Minuten lang abzusättigen, anschließend wird mit Wasser und wiederum dann anschließend mit TE gewaschen, um die Entfernung der Erkennungsmoleküle 2, die nicht an das Neutravidin fixiert sind, zu entfernen.
  • Der Schritt der Fixierung der Erkennungsmoleküle 2 an den Träger 1 über deren biotinylierte 5'-Enden ist nicht in den Figuren dargestellt, da der Träger 1, gemäß 1, bereits funktionalisiert ist, um die Zielmoleküle 3 aufzunehmen.
  • Zweiter Schritt: Hybridisierung der Zielmoleküle an die Erkennungsmoleküle:
  • Nach Immobilisierung der Erkennungsmoleküle 2 wird deren Hybridisierung mit den Zielmolekülen 3 durch eine Inkubation des Trägers in TE 1 M NaCl, 0,05% Triton X100 über Nacht bei 35°C durchgeführt, was 1 entspricht. In dem vorliegenden Fall werden 70 komplementäre Basenpaare hybridisiert.
  • Der Träger 1 wird dann aufgenommen, in dem gleichen Puffer 15 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen, wie in 2 dargestellt, was es ermöglicht, die nicht hybridisierten Zielmoleküle 6 zu entfernen.
  • Es wird bemerkt, dass gemäß einer Alternative der Erfindung die Erkennungsmoleküle 2 im Voraus mit den Zielmolekülen 3 hybridisiert werden können, und die Mischung anschließend mit dem Träger 1 direkt in Kontakt gebracht werden kann.
  • Dritter Schritt: Markierung der Oligonukleotide mit Nanopartikeln zur Synthese der Detektionsmoleküle:
  • Um die Zielmoleküle 3, die mit den Erkennungsmolekülen 2 hybridisiert haben, zu detektieren, werden zuvor Detektionsmoleküle 4 mit magnetischen Nanopartikeln von Immunicon (Huntingdon Valley, USA, Ref.: F3106) markiert. Diese Nanopartikel haben einen Durchmesser von 145 nm und sind mit Streptavidin funktionalisiert, wobei im Allgemeinen 6.000 bis 20.000 Streptavidinmoleküle an einen einzelnen Nanopartikel angebracht sind, wobei jedes Streptavidin die Anbringung von vier Biotinen ermöglicht. Diese Nanopartikel werden mit einer Konzentration von 109-Partikeln/ml und 4°C über Nacht in TE-Puffer inkubiert, der 1 M NaCl, 0,14 mg/ml Lachs-DNA, 0,05% Triton X100 enthält. Das Oligonukleotid, das die Basis des Detektionsmoleküls 4 bildet, und das an einem seiner Enden biotinyliert ist, wird anschließend zu der Lösung der Nanopartikel hinzugefügt, und zwar in einer Größenordnung von eintausend Detektionsoligonukleotiden pro Nanopartikeln, und wird anschließend 30 Minuten lang bei 35°C inkubiert. Jedes Detektionsolionukleotid, das mit einem Nanopartikel assoziiert ist, stellt ein Detektionsmolekül 4 dar.
  • Vierter Schritt: Erste Hybridisierung der Detektionsmoleküle mit den Zielmolekülen:
  • Dieser Schritt, wie in 3 dargestellt, besteht aus dem In-Verbindung-Bringen der Zielmoleküle 3, die mit den Erkennungsmolekülen 2 hybridisiert sind, mit den Detektionsmolekülen 4. Hierzu wird der Träger 1, auf welchen die Zielmoleküle 3 mit den Erkennungsmolekülen 2 hybridisiert vorliegen, mit 1 mm der Lösung der Detektionsmoleküle 4 inkubiert, die gemäß dem vorhergehenden Schritt hergestellt wurden, und zwar in der Größenordnung von 109 Nanopartikeln/ml über eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Hybridisierung wird mit 16 komplementären Basenpaaren durchgeführt.
  • Der Träger 1 wird anschließend in TE-Puffer mit 1 M NaCl, 0,05% Triton X100 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen, um die nicht mit den Zielmolekülen 3 hybridisierten Detektionsmoleküle zu entfernen, wie in 4 dargestellt.
  • Es wird bemerkt, dass gemäß einer Alternative der Erfindung die Detektionsmoleküle 4 zuvor mit den Zielmolekülen 3 hybridisiert werden können, und die Mischung dann anschließend dann direkt mit dem Träger 1 in Kontakt gebracht wird, an welchen die Erkennungsmoleküle 2 angebracht sind.
  • Fünfter Schritt: Herstellung eines ersten Bildes:
  • Ein erstes Bild 10 wird mittels Dunkelfeldmikroskopie (zwanzig (20)-fache Vergrößerung mit einer Dunkelfeldlinse) produziert, wodurch es ermöglicht wird, kleine nicht-fluoreszierende Nanopartikel zu visualisieren, was 5 entspricht.
  • Sechster Schritt: Thermische Dissoziierung des Zielmoleküls und der Detektionsmoleküle:
  • Dieser Dissoziierungsschritt ist in 6 dargestellt. Das Detektionsmolekül 4 besitzt ein Schmelzpunkt von 51°C, wohingegen das Erkennungsmolekül 2 einen gemessenen Schmelzpunkt von 90,5°C besitzt. Eine Temperatur von 60°C stellt eine Temperatur dar, die größer ist als die des Schmelzpunkts des Detektionsmoleküls 4, und niedriger als die des Schmelzpunkts des Erkennungsmoleküls 2, was die Dissoziierung von Zielmolekül 3 und Detektionsmolekül 4 ermöglicht. Die Dissoziierung der Detektionsmoleküle 4 wird daher durch Behandlung des Trägers 1 in einem TE-Puffer mit 0,05% Triton X100 bei 60°C über eine Stunde hinweg durchgeführt. Einige Detektionsmoleküle 4 bleiben an der Oberfläche haften, jedoch entsprechen diejenigen, die haftenbleiben, den Detektionsmolekülen, die nicht spezifisch an der Oberfläche absorbiert haben.
  • Diese Dissoziierung kann auch durch eine Inkubation des Trägers 1 in Natriumphosphatpuffer, pH 5,5 mit einer Konzentration von 100 mM, 1 mM EDTA, 0,05% Triton X100 über eine Stunde bei 60°C erreicht werden. Die Dissoziierung hängt nicht von der Natur des Puffers ab, der für die Hybridisierung eingesetzt wird (100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton X100, oder 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,5, 0,1 M NaCl mM EDTA, 0,05% Triton X100). Die notwendigen Bedingungen sind der Einsatz eines Puffers mit niedriger Ionenstärke oder sogar eines salzfreien Puffers, sowie eine Erhitzung für eine Stunde bei 60°C.
  • Siebter Schritt: Herstellung eines zweiten Bildes:
  • Mittels Dunkelfeldmikroskopie wird ein zweites Bild 11 hergestellt, was die Beobachtung ermöglicht, dass die meisten der Detektionsmoleküle 4, die zuvor mit den Zielmolekülen hybridisiert haben und die Echt-Positive repräsentieren, verschwunden sind. Dies ist in 7 gezeigt.
  • Dieses zweite Bild 11 ermöglicht es daher, Detektionsmoleküle 4 zu detektieren, die lediglich an der Oberfläche absorbiert haben, oder die nicht richtig mit den Zielmolekülen 3 hybridisiert haben, also ohne Fehlanpassung, was Falsch-Positive darstellt.
  • Durch Abziehen der Detektionsspots, die auf dem ersten Bild 10 vorliegen, von denjenigen auf dem zweiten Bild 11, ist es möglich, das Vorliegen von Echt-Positiven und Falsch-Positiven zu unterscheiden.
  • Achter Schritt: Zweite Hybridisierung der Detektionsmoleküle mit den Zielmolekülen:
  • Mit dem Ziel einer weiteren Verfeinerung der Ergebnisse der vorhergehenden Schritte wird der Träger 1 ein zweites Mal mit den Detektionsmolekülen 4 unter identischen Bedingungen wie für die erste, oben beschriebene Hybridisierung im vierten Schritt inkubiert, so dass die Markierung der Zielmoleküle 3, die bereits mit den Erkennungsmolekülen 2 hybridisiert haben, mit den Detektionsmolekülen 4 wiederhergestellt wird. Dies ist in 8 dargestellt.
  • Der Träger 1 wird anschließend in TE-Puffer gewaschen, der 1 M NaCl, 0,05% Triton X100 enthält, und zwar 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, was in 9 dargestellt ist.
  • Neunter Schritt: Herstellung eines dritten Bildes:
  • Dieses dritte Bild 12 ermöglicht es, den Unterschied, der während des siebten Schrittes zwischen den Echt-Positiven und den Falsch-Positiven gemacht wurde, zu verfeinern. Darüber hinaus ermöglicht es das dritte Bild 12, da die Detektionsmoleküle 4 spezifisch für die Zielmoleküle 3 sind, zu verifizieren – wie in 10 dargestellt –, dass die Zielmoleküle 3 immer noch an den Erkennungsmolekülen 2 vorliegen, da man die gleiche Intensität des Detektionssignals erreicht wie für das erste Bild. Konsequenterweise dissoziieren die Zielmoleküle 3 während der Behandlung mit TE, Triton X100, bei 60°C nicht von den Erkennungsmolekülen 2: Somit ist die Dissoziierung gerichtet.
  • Es ist auch möglich, einen letzten Schritt durchzuführen, der 11 entspricht, bei welchem Computer-Mittel die drei erhaltenen Bilder 10, 11 und 12 weiterverarbeiten, so dass die Detektionsspots 18 präzise definiert werden können, die tatsächlich den Detektionsmolekülen 4 entsprechen, die mit den Erkennungsmoleküle 2 – Zielmoleküle 3 – Hybriden hybridisiert haben.
  • Beispiel 2: Gerichtete Dissoziierung der Detektionsmoleküle, die mit fluoreszierenden Nanopartikeln assoziiert sind, von den Zielmolekülen:
  • Bei diesem Beispiel wird das in Beispiel 1 beschriebene biologische Modell verwendet.
  • Die ersten zwei in Beispiel 1 beschriebenen Schritte, die jeweils der Immobilisierung der Erkennungsmoleküle 2 auf dem Träger 1 und der Hybridisierung der Zielmoleküle 3 mit den Erkennungsmolekülen 2 entsprechen, werden auf vergleichbare Art und Weise in dem vorliegenden Beispiel durchgeführt.
  • Der dritte Schritt, der der Markierung der Detektionsmoleküle entspricht, unterscheidet sich andererseits von Beispiel 1, da die Nanopartikel, die zur Markierung der Detektionsmoleküle 4 eingesetzt wurden, fluoreszierende Nanopartikel sind, die von Molecular Probe (Eugene Oregon, USA, Referenznr. T8860) erhalten wurden, einen Durchmesser von 100 nm aufweisen, und bereits mit Neutravidin funktionalisiert sind. Die dadurch gewonnenen Detektionsmoleküle 4 werden über Microcon YM30 (Amicon MILLIPORE Referenznr. 42409) gereinigt.
  • Die erste Hybridisierung der Detektionsmoleküle 4 mit den Zielmolekülen wird wie im vierten Schritt des Beispiels 1 beschrieben durchgeführt.
  • Die Auszählung der Detektionsspots wird mittels eines ersten Bildes 10 durchgeführt, welches durch Fluoreszenzmikroskopie gemäß 5 erhalten wird.
  • Der Dissoziierungsschritt wird in TE-Puffer mit 0,05% Triton X100 bei 60°C über eine Stunde hinweg durchgeführt, wie in 7 dargestellt, und wie weiter oben im sechsten Schritt des Beispiels 1 beschrieben.
  • Ein zweites Bild 11 wird mittels Fluoreszenzmikroskopie hergestellt. Durch Abziehen der Intensität der Fluoreszenz, die für das erste Bild gewonnen wurde, von derjenigen, die mit dem zweiten Bild gewonnen wurde, ist es möglich, hiervon die Fluoreszenzintensität abzuleiten, die auf das Vorliegen von Falsch-Positiven zurückzuführen ist. Auf vergleichbare Art und Weise wie es für Beispiel 1 beschrieben wurde, ermöglicht eine zweite Hybridisierung der Detektionsmoleküle 4 mit den Zielmolekülen 3, gefolgt von der Herstellung eines dritten Bildes 12 die Überprüfung, dass tatsächlich eine Fluoreszenzintensität erreicht wird, die vergleichbar ist zu derjenigen, die im ersten Bild 10 detektiert wurde, was wiederum zeigt, dass die Dissoziierung tatsächlich gerichtet ist.
  • Die Dissoziierung kann daher mit Detektionsmolekülen 4 durchgeführt werden, die mit Nanopartikeln einer anderen Natur markiert sind.
  • Beispiel 3: Gerichtete Dissoziierung eines Zielmoleküls, das zwischen zwei Oligonukleotiden hybridisiert ist, und das mit Nanopartikeln assoziiert ist
  • Die Sequenzen der Erkennungsmoleküle 2, Zielmoleküle 3 und Detektionsmoleküle 4, die in diesem Beispiel verwendet wurden, sind identisch mit denjenigen, wie sie für Beispiel 1 beschrieben wurden.
  • In diesem Beispiel wird die Erfindung mit einem doppelten Hybrid eingesetzt, bei welchem das Zielmolekül 3 assoziiert wird mit:
    • • dem Erkennungsmolekül 2, wobei dieses 2 mit einem magnetischen Partikel assoziiert ist, und
    • • dem Detektionsmolekül 4, das mit einem fluoreszierenden Nanopartikel markiert ist.
  • Die Verwendung eines magnetischen Partikels, das hier nicht als Marker fungiert, ermöglicht es, ein einfaches Reinigungsprotokoll durch bloße Magnetisierung zu verwenden, und die Verwendung eines fluoreszierenden Partikels ermöglicht es, Fluoreszenz als sensitives Verfahren zur Detektion und Auszählung der hergestellten Hybride einzusetzen.
  • Daher werden die Erkennungsmoleküle 2 mit magnetischen Partikeln assoziiert (Immunicon Streptavidine, Huntingdon Valley, USA, Referenznr. F3106; Durchmesser 145 nm; Konzentration 109 p/ml), wohingegen die Detektionsmoleküle 4 mit fluoreszierenden Nanopartikeln (Molecular Probes Neutravidine; Durchmesser 100 nm, Konzentration 109 p/ml) assoziiert werden.
  • In einem ersten Schritt werden die Zielmoleküle 3 mit den fluoreszierenden Detektionsmolekülen 4 hybridisiert. Die Zielmoleküle 3 (Konzentration: 106 p/μl) werden vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit den Detektionsmolekülen 4 (Konzentration: 1 nM) in TE-Puffer mit 1 M NaCl und 0,05% Triton (Endvolumen: 20 μl) inkubiert.
  • In einem zweiten Schritt werden die Zielmoleküle 3, die mit den Detektionsmolekülen 4 hybridisiert haben, eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit den Erkennungsmolekülen 2 hybridisiert, welche mit den magnetischen Partikeln assoziiert sind. Die Zielmoleküle 3 liegen daher im Sandwich zwischen einem magnetisierbaren Erkennungsmolekül 2 und einem fluoreszierenden Detektionsmolekül 4.
  • In einem dritten Schritt werden die Doppelhybride unter einem Mikroskop mit Epifluoreszenz-Beleuchtung oder mit Dunkelfeldbeleuchtung untersucht. Eine Vorrichtung mit einem Dauermagneten, die unter die Platte des Mikroskops platziert wird, ermöglicht die Anwendung eines magnetischen Feldes von 300 Gauss. Unter der Wirkung dieses magnetischen Feldes ordnen sich die magnetischen Partikel in Form von Stäbchen an, in welche sich die fluoreszierenden Partikel anordnen können. Zu diesem Zeitpunkt des Tests kann jedoch nicht geschlossen werden, ob diese Konjugate ein Zielmolekül mit einschließen, oder auch nicht.
  • In einem vierten Schritt wird diese Unsicherheit mit einem gerichteten Dissoziierungsschritt beseitigt. Hierfür wird der Puffer zur Suspendierung der Partikel unter einem magnetischen einengenden Feld durch einen TE-Puffer mit niedriger Ionenstärke und mit 0,05% Triton X100 ersetzt, und die Partikel bei 70°C 30 Minuten lang erhitzt.
  • Sofort danach wird ein magnetischer Waschschritt durchgeführt. Die erhaltene Suspension wird unter dem Mikroskop untersucht, wobei immer noch ein Magnetfeld von 300 Gauss angewandt wird. Die Kombination der Ionenstärke und der Temperatur ermöglichen es dadurch, die Zielmoleküle 3 von den Detektionsmolekülen 4 zu trennen. Das Ausmaß der Dissoziierung hängt von der genauen Natur der Funktionalisierungen der zwei Arten an Nanopartikeln ab, sowie von der Länge und der Sequenz der DNA-Moleküle, und von der Zusammensetzung des Puffers.
  • Diese Art der Anwendung der gerichteten Dissoziierung zwischen einem fluoreszierenden Partikel und einem magnetischen Partikel, oder genauer gesagt zwischen einem Zielmolekül 3 und einem Detektionsmolekül 4, kann mit anderen Arten von nicht-magnetischen oder nicht-fluoreszierenden Partikeln durchgeführt werden, oder aber mit Partikeln, deren Funktionalisierung unterschiedlich ist, oder mit Partikeln unterschiedlicher Größen.
  • Beispiel 4: Gerichtete Dissoziierung der markierten Zielmoleküle bezüglich den Erkennungsmolekülen
  • Das Hauptmerkmal dieses Beispiels ist es, direkt markierte Zielmoleküle einzusetzen, ohne wieder Detektionsmoleküle zur Detektion der Hybridisierung zwischen den Erkennungsmolekülen und den Zielmolekülen einzusetzen. Das Modell besteht aus:
    • • einem Erkennungsmolekül, dessen Sequenz identisch ist mit derjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurde
    • • einem Zielmolekül, dessen Sequenz identisch ist mit derjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, und das zuvor fragmentiert und markiert wurde.
  • Unter Verwendung dieses Verfahrens werden Fragmente von ungefähr 50 Nukleotiden gewonnen, die an deren 3'-Enden mit einem fluoreszierenden Marker markiert sind. Eines dieser Fragmente, das auch Detektionsfragment genannt wird, kann über seine Komplementarität mit dem Erkennungsmolekül gemäß einem Protokoll hybridisieren, welches zu dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist.
  • Daher wird die Immobilisierung der Erkennungsmoleküle auf dem Träger wie im ersten Schritt des Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Nach Immobilisierung der Erkennungsmoleküle wird die Hybridisierung der Erkennungsmoleküle mit den markierten Zielmolekülen durch Inkubierung des Trägers in TE mit 1 M NaCl durchgeführt.
  • Anschließend wird der Träger 1 aufgenommen, und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in dem gleichen Puffer gewaschen. Dieser Waschschritt ist sehr wichtig, da es dieser ermöglicht, die durch diese Verfahren erhaltenen Fragmente zu entfernen, welche Detektionsfragmente darstellen, die nicht hybridisiert sind, sowie Fragmente zu entfernen, die nicht die Sequenzregion besitzen, die zu dem Erkennungsmolekül komplementär ist.
  • Ein erstes Bild wird durch Fluoreszenzmikroskopie hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben ist, was es ermöglicht, das Ausmaß der Fluoreszenz aufgrund des Vorliegens von Echt-Positiven, jedoch auch von Falsch-Positiven zu gewinnen.
  • Die Dissoziierung der markierten Zielmoleküle von den Erkennungsmolekülen wird anschließend durch Inkubierung des Trägers in einem PE-Puffer mit 0,05% Triton X100 bei 95°C über eine Stunde lang durchgeführt.
  • Anschließend wird ein zweites Bild hergestellt, welches es ermöglicht, die Detektionsfragmente zu detektieren, die lediglich an der Oberfläche absorbiert sind, und die nicht hinreichend mit den Erkennungsmolekülen hybridisiert haben, wodurch Falsch-Positive gebildet werden. Wie für Beispiel 1 beschrieben ist es möglich, durch Abziehen der Detektionsspots, die in dem ersten Bild vorliegen, von denjenigen des zweiten Bildes, zwischen dem Vorliegen von Echt-Positiven und Falsch-Positiven zu unterscheiden.
  • Um die in den vorhergehenden Schritten erhaltenen Ergebnisse zu überprüfen, wird der Träger, an welche die Erkennungsmoleküle fixiert sind, ein zweites Mal mit den Zielmolekülen inkubiert, und zwar unter Bedingungen, die identisch sind wie für die erste Hybridisierung zwischen Erkennungsmolekül und Targetmolekül, wie oben beschrieben, und der Träger wird in TE-Puffer mit 1 M NaCl, 0,05% Triton X100 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Ein drittes Bild ermöglicht es, den zwischen den Echt-Positiven und den Falsch-Positiven gemachten Unterschied zu verifizieren. Darüber hinaus ermöglicht es dieses dritte Bild, zu verifizieren, dass die Erkennungsmoleküle immer noch auf dem Träger vorliegen, da die gleiche Intensität des Detektionssignals gewonnen wird wie für das erste Bild. Konsequenterweise müssen die Erkennungsmoleküle nicht vom Träger dissoziiert werden.
    • 1
    Träger des Biochips 5
    2
    Erkennungsmolekül
    3
    Zielmolekül
    4
    Detektionsmolekül
    5
    Biochip
    6
    Nicht hybridisiertes oder nicht komplexiertes Zielmolekül
    7
    Zielmolekül, das anderswo als an einem Erkennungsmolekül 2 hybridisiert oder komplexiert wurde
    8
    Nicht hybridisiertes oder nicht komplexiertes Detektionsmolekül
    9
    Detektionsmolekül, das irgendwo anders als an das Zielmolekül 3 absorbiert oder komplexiert ist
    10
    Erstes Bild
    11
    Zweites Bild
    12
    Drittes Bild
    13
    Viertes Bild
    14
    Detektionsspot, der einem Detektionsmolekül 4, 8 oder 9 entspricht
    15
    Position eines Detektionsspots, der verschwunden ist, entsprechend einem Detektions-Molekül 4
    16
    Detektionsspot, ensprechend einem Detektionsmolekül 9
    17
    Detektionsspot, der gerade aufgetreten ist, entsprechend einem Detektionsmolekül 9
    18
    Detektionsspot, entsprechend einem Detektionsmolekül 4

Claims (20)

  1. Verfahren zum Ablesen zumindest einer biologischen Reaktion auf einem Träger, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht: • Erhalten, gebunden auf einem Träger (1), von zumindest einem Komplex aus zumindest einem biologischen Erkennungsmolekül (2), das an zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) gebunden ist, und das markiert oder nicht markiert ist, und wenn das oder die biologische(n) Zielmolekül(e) (3) nicht markiert ist (sind), zumindest einem markierten Detektionsmolekül (4), das an das oder die biologische(n) Zielmolekül(e) (3) gebunden ist; wobei der Komplex auf dem Träger (1) über das oder die biologische(n) Erkennungsmolekül(e) (2) gebunden ist, • Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1), • Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, mit welchen eine Trennung ermöglicht wird von: – jedem markierten Zielmolekül (3) von einem Erkennungsmolekül (2), an welches es spezifisch fixiert ist, oder – jedem markierten Detektionsmolekül (4) von einem nicht markierten Zielmolekül (3), • Herstellen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, das die Detektion ermöglicht von: – dem oder den markierte(n) Zielmolekül(en) (3), das oder die nicht spezifisch an dem oder den Erkennungsmolekülen (2) gebunden ist (sind), oder – dem oder den markierte(n) Detektionsmolekül(en) (4), die nicht spezifisch an dem oder den unmarkierte(n) Zielmoleküle(n) (3) gebunden ist (sind), • Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen dem oder den biologischen Erkennungsmolekül(en) (2) und dem oder den markierten Zielmolekül(en) (3) oder zwischen dem oder den unmarkierten Zielmolekül(en) (3) und dem oder den markierten Detektionsmolekül(en) (4).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, das aus den folgenden Schritten besteht: – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthält, die identisch miteinander sind, um die identischen Erkennungsmoleküle (2) auf dem Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – In-Kontakt-Bringen des funktionalisierten Trägers mit zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches, markiertes Zielmolekül enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle an das oder die Erkennungsmoleküle (2) zu binden, – Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Bindung des oder der markierten Zielmoleküle, – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, die eine Trennung jedes Zielmoleküls von einem Erkennungsmolekül (2) ermöglichen, an welches dieses spezifisch gebunden ist, – Herstellen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Zielmoleküle (7) zu ermöglichen, das oder die nicht spezifisch an das oder die Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Erkennungsmolekülen (2) und dem (den) Zielmolekül(en).
  3. Verfahren nach Anspruch 1, das aus den folgenden Schritten besteht: – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) ent hält, die identisch miteinander sind, mit zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches markiertes Zielmolekül enthält, um dieses oder diese Zielmolekül(e) an das oder die Erkennungsmoleküle zu binden, – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit einer Mischung aus zumindest zwei ersten und zweiten flüssigen Proben, die zumindest die Gruppe der identischen biologischen Erkennungsmoleküle (2) enthalten, sowie Erkennungsmoleküle (2), die ggf. mit zumindest einem Zielmolekül komplexiert sind, um diese Erkennungsmoleküle oder den/die Komplexe auf dem Träger zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dem Binden des oder der markierten Zielmoleküle, – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, unter welchen die Trennung jedes Trägermoleküls von einem Erkennungsmolekül (2) ermöglicht wird, an welchem diese spezifisch gebunden sind, – Anfertigen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Zielmoleküle (7) zu ermöglichen, die nicht spezifisch an das oder die Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Erkennungsmolekülen (2) und dem/den Zielmolekül(en).
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden weiteren zusätzlichen Schritte aufweist: – In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers, nach der spezifischen Trennung, mit einer zweiten flüssigen Probe oder mit einer anderen flüssigen Probe, um zumindest ein biologisches markiertes Zielmolekül von neuem zu fixieren an: – das oder die biologischen Erkennungsmolekül(e) (2), von dem oder von denen sie getrennt wurden, und/oder – irgendein anderes Erkennungsmolekül oder andere Erkennungsmoleküle (2), die von der gleichen Erkennungszone abgeleitet sind, – Herstellen eines dritten Bildes (12) des Trägers (1) nach dieser neuen Bindung der Zielmoleküle oder des Zielmoleküls, – Analysieren des dritten Bildes im Vergleich zur vorherigen Analyse der zwei ersten Bilder zur Bestätigung der spezifischen Bindungen zwischen den Erkennungsmolekülen und dem oder den Zielmolekül(en).
  5. Verfahren nach Anspruch 1, das aus Folgendem besteht: – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthält, die identisch miteinander sind (2), um diese identischen Erkennungsmoleküle (2) auf dem Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten Trägers mit zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Erkennungsmoleküle (2) zu binden, –In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers mit zumindest einer dritten flüssigen Probe, die zumindest ein markiertes Detektionsmolekül (4) enthält, um dieses oder diese Detektionsmoleküle (4) an das oder die Zielmoleküle (3) zu binden, die an das oder die Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind, – Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Fixierung des oder der markierten Detektionsmoleküle (4) und/oder (9), – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, unter welchen die Trennung jedes Detektionsmoleküls (4) von einem Zielmolekül (3) ermöglicht wird, an welches dieses (4) spezifisch gebunden ist, – Anfertigen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Detektionsmoleküle (9) zu ermöglichen, die nicht spezifisch an das oder die Zielmoleküle (3) gebunden sind und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Zielmolekülen und den Detektionsmolekülen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, das aus den folgenden Schritten besteht: – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthält, die untereinander identisch sind, mit zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Erkennungsmoleküle (2) zu binden, – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit einer Mischung der zumindest zwei ersten und zweiten flüssigen Proben, die zumindest die Gruppe der identischen biologischen Erkennungsmoleküle (2) enthalten, sowie die Erkennungsmoleküle (2), die ggf. mit zumindest einem Zielmolekül komplexiert sind, um diese Erkennungsmoleküle (2) und/oder die Komplexe an den Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – In-Kontakt-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers mit zumindest einer dritten flüssigen Probe, die zumindest ein markiertes Detektionsmolekül (4) enthält, um dieses oder diese Detektionsmoleküle (4) an das oder die Zielmoleküle (3) zu binden, die an das oder die Erkennungsmoleküle gebunden sind (2), – Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Bindung des oder der markierten Detektionsmoleküle (4 und/oder 9), – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, unter welchen die Trennung jedes Detektionsmoleküls (4) von einem Zielmolekül (3) ermöglicht wird, an welches dieses (4) spezifisch gebunden ist, – Herstellen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Detektionsmoleküle (9) zu ermöglichen, die nicht spezifisch an das oder die Zielmoleküle (3) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Zielmolekülen und den Detektionsmolekülen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, das aus Folgendem besteht: – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthält, die identisch miteinander sind, mit zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Erkennungsmoleküle (2) zu binden, – In-Verbindung-Bringen der Mischung der zwei ersten und zweiten flüssigen Proben mit zumindest einer dritten flüssigen Probe, die zumindest ein markiertes Detektionsmolekül (4) enthält, um dieses oder diese Detektionsmoleküle (4) an das oder die Zielmoleküle (3) zu binden, welche an das oder die Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind, – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit einer Mischung der zumindest drei ersten, zweiten und drei flüssigen Proben, die zumindest die Gruppe der identischen biologischen Erkennungsmoleküle (2) enthalten, sowie die Erkennungsmoleküle (2), die ggf. mit zumindest einem Zielmolekül (3) komplexiert sind, welches (3) ggf. mit zumindest einem Detektionsmolekül (4) komplexiert ist, um diese Erkennungsmoleküle (2) oder Komplexe an den Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Bindung des oder der markierten Detektionsmoleküle (4 und/oder 9), – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, unter welchen die Trennung jedes Detektionsmoleküls (4) von einem Zielmolekül (3) ermöglicht wird, an welches dieses (4) spezifisch gebunden ist, – Herstellen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Detektionsmoleküle (9) zu ermöglichen, das oder die nicht spezifisch an das oder die Zielmoleküle (3) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Zielmolekülen und den Detektionsmolekülen.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, das aus folgenden Schritten besteht: – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) enthält, mit zumindest einer dritten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Detektionsmolekül (4) enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Detektionsmoleküle (4) zu binden, – In-Verbindung-Bringen der Mischung der zweiten und dritten flüssigen Proben mit zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an Erkennungsmolekülen (2) enthält, die identisch miteinander sind, um dieses oder diese Erkennungsmoleküle (2) an das oder die Zielmoleküle (3) zu binden, die ggf. an das oder die Detektionsmoleküle (4) gebunden sind, – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit einer Mischung der zumindest drei ersten, zweiten und dritten flüssigen Proben, die zumindest die Gruppe der identischen biologischen Erkennungsmoleküle (2) enthalten, sowie die Erkennungsmoleküle (2), die ggf. mit zumindest einem Zielmolekül (3) komplexiert sind, welche (3) ggf. mit zumindest einem Detektionsmolekül (4) komplexiert sind, um diese Erkennungsmoleküle (2) oder Komplexe an den Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – Anfertigen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Bindung des oder der markierten Detektionsmoleküle (4 und/oder 9), – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, unter welchen die Trennung jedes Detektionsmoleküls (4) von einem Zielmolekül (3) ermöglicht wird, an welche diese (4) spezifisch gebunden sind, – Anfertigen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Detektionsmoleküle (9) zu ermöglichen, das oder die nicht spezifisch an die Zielmoleküle (3) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Zielmolekülen und den Detektionsmolekülen.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, das aus folgenden Schritten besteht: – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthält, die identisch miteinander sind, um diese identischen Erkennungsmoleküle (2) an den Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) enthält mit zumindest einer dritten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Detektionsmolekül (4) enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Detektionsmoleküle (4) zu binden, – In-Verbindung-Bringen der Mischung aus den zumindest zwei zweiten und dritten flüssigen Proben, die zumindest ein Zielmolekül (3) enthalten, das ggf. mit einem Detektionsmolekül (4) komplexiert ist, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Erkennungsmoleküle (2) zu binden, – Anfertigen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Bindung des oder der markierten Zielmoleküle (4 und/oder 9), – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, die die Trennung jedes Detektionsmoleküls (4) von einem Zielmolekül (3) ermöglichen, an welches dieses (4) spezifisch gebunden ist, – Anfertigen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Detektionsmoleküle (9) zu ermöglichen, das oder die nicht spezifisch an das oder die Zielmoleküle (3) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Zielmolekülen und den Detektionsmolekülen.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, das aus folgenden Schritten besteht: – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer zweiten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Zielmolekül (3) enthält, mit zumindest einer dritten flüssigen Probe, die zumindest ein biologisches Detektionsmolekül (4) enthält, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Detektionsmoleküle (4) zu binden, – In-Verbindung-Bringen von zumindest einer ersten flüssigen Probe, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthält, die identisch untereinander sind, mit einer Mischung der zumindest zwei zweiten und dritten flüssigen Proben, die zumindest ein Zielmolekül (3) enthalten, das ggf. mit einem Detektionsmolekül (4) komplexiert ist, um dieses oder diese Zielmoleküle (3) an das oder die Erkennungsmoleküle (2) zu binden, – In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit der Mischung der zumindest drei ersten, zweiten und dritten Proben, die zumindest eine Gruppe an biologischen Erkennungsmolekülen (2) enthalten, die identisch miteinander sind, wobei die Erkennungsmoleküle (2) ggf. mit zumindest einem Zielmolekül (3) komplexiert sind, welches ggf. mit einem Detektionsmolekül (4) komplexiert ist, um die identischen Erkennungsmoleküle (2) an den Träger (1) zu binden, vorzugsweise auf der Höhe einer Erkennungszone, – Herstellen eines ersten Bildes (10) des Trägers (1) nach dieser Bindung des oder der markierten Detektionsmoleküle (4 und/oder 9), – Behandeln des Trägers unter physikalisch-chemischen Bedingungen, die die Trennung jedes Detektionsmoleküls (4) von einem Zielmolekül (3) ermöglichen, an welches dieses (4) spezifisch gebunden ist, – Anfertigen eines zweiten Bildes (11) des Trägers (1) nach dieser Trennung, um die Detektion des oder der markierten Detektionsmoleküle (9) zu ermöglichen, das oder die nicht spezifisch an das oder die Zielmoleküle (3) gebunden sind, und – Analysieren der zwei Bilder zur Bestimmung der spezifischen Bindungen zwischen den Ziel- und den Detektionsmolekülen.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden weiteren zusätzlichen Schritte aufweist: – In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers, nach der spezifischen Trennung, mit einer dritten flüssigen Probe oder mit einer weiteren flüssigen Probe, um zumindest ein markiertes Detektionsmolekül (4) von neuem zu binden an: – das oder die Zielmoleküle (3), von welchen dieses oder diese getrennt waren, und/oder – jedes andere Zielmolekül oder Zielmoleküle (3), die an ein oder mehrere Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind, welche von einer Erkennungszone abgeleitet sind, – Anfertigen eines dritten Bildes (12) des Trägers (1) nach dieser neuen Bindung der Detektionsmoleküle (4 und/oder 9), und – Analysieren des dritten Bildes im Vergleich zu der vorherigen Analyse der zwei ersten Bilder zur Bestätigung der spezifischen Bindungen zwischen den Ziel- und den Detektionsmolekülen.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Waschschritt durchgeführt wird nach der Bindung von: – den Erkennungsmolekülen (2) an den Träger (1), wobei die Erkennungsmoleküle (2) ggf. an die markierten Zielmoleküle gebunden sind und/oder an die unmarkierten Zielmolekülen (3), wobei die Letzteren ggf. an Detektionsmoleküle (4) gebunden sind, und/oder – den markierten Zielmolekülen und/oder den unmarkierten Zielmolekülen, (3) an die Erkennungsmoleküle (2), welche (2) vorzugsweise an den Träger (1) gebunden sind, wobei die Zielmoleküle ggf. an die Detektionsmoleküle (4) gebunden sind, und/oder den Detektionsmolekülen (4) an die unmarkierten Zielmoleküle (3), welche (3) an die an den Träger (1) gebundenen Erkennungsmoleküle (2) gebunden sind.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1) aus magnetischen Partikeln besteht, und dass das Verfahren die Schritte der Magnetisierung der magnetischen Partikel umfasst, welche vorzugsweise platziert werden: – während irgendeines Schrittes der physikalisch-chemischen Behandlung und/oder der Herstellung des Bildes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, und/oder – vor irgendeinem Waschschritt gemäß Anspruch 11.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Verbindung-Bringen des Trägers (1) mit zumindest zwei ersten flüssigen unterschiedlichen Proben, die ggf. zuvor vermengt wurden, die Bindung von zumindest zwei unterschiedlichen Erkennungsmolekülen (2) an den Träger (1) in zumindest zwei unterschiedlichen Erkennungszonen ermöglicht.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14 zur Quantifizierung von zumindest zwei Zielmolekülen (3), die sich ggf. unterscheiden, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmolekül (4) aus einem Molekül besteht, das entweder direkt oder indirekt mit zumindest einem Marker assoziiert ist, wie beispielsweise einem Nanopartikel, dessen Mittel, mit welchen die Bilder (10, 11 und/oder 12) hergestellt werden, die individuelle Visualisierung ermöglichen, und zwar trotz des Vorliegens benachbarter anderer Detektionsmoleküle (4 und/oder 9) und Ähnlichem.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die physikalisch-chemischen Bedingungen, die die Trennung der markierten Zielmoleküle von den Erkennungsmolekülen (2), oder der Detektionsmoleküle (4) von den Zielmolekülen (3) ermöglichen, durch ein Erhitzen auf einen Schmelzpunkt gewonnen werden.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Zielmoleküle, die Erkennungsmoleküle (2) oder die Zielmoleküle (3) aus Nucleinsäuren bestehen oder dass die Detektionsmoleküle (4) Nucleinsäuren aufweisen.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Zielmoleküle, die Erkennungsmoleküle (2) oder die Zielmoleküle (3) aus Antikörpern und/oder Antigenen bestehen, oder dass die Detektionsmoleküle (4) Antikörper und/oder Antigene aufweisen.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung der Zielmoleküle oder der Detektionsmoleküle (4) erreicht wird durch: – Partikel, die durch eine herkömmliche optische Mikroskopie, eine Fluoreszenzmikroskopie, eine Dunkelfeldmikroskopie oder Atomic-force-Mikroskopie visualisiert werden können, – Moleküle, die durch eine Atomic-force-Mikroskopie visualisiert werden können, – Enzyme mit einem zu fällenden Produkt, welche ein detektierbares Signal produzieren, wie beispielsweise Fluoreszenz, Lumineszenz, wie beispielsweise Meerrettichperoxydase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, – Chromophoren wie beispielsweise fluoreszierende oder lumineszierende Verbindungen, – elektronische Marker, die durch Elektronenmikroskopie detektierbar sind, – absorbierende Moleküle, die durch eine Mikroskopie mit thermischen Linsen visualisiert werden können.
  20. Verfahren nach einer Kombination gemäß den Ansprüchen 4 bis 7 einerseits und nach Anspruch 18 andererseits, dadurch gekennzeichnet, dass die andere flüssige Probe, anstelle entweder der zweiten oder der dritten flüssigen Probe einen Marker aufweist, der unterschiedlich ist zu demjenigen, der in der zweiten oder dritten flüssigen Probe enthalten ist, zum In-Verbindung-Bringen des funktionalisierten und behandelten Trägers nach der spezifischen Trennung.
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