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FACHGEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft das Fachgebiet der Polynukleotidamplifizierung.
Genauer gesagt stellt die Erfindung Verfahren, Zusammensetzungen
und Kits zur Amplifizierung (d.h. Herstellung vielfacher Kopien)
von RNA-Sequenzen von Interesse bereit, die einen zusammengesetzten
RNA/DNA-Primer und gegebenenfalls eine Transkription anwenden.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Fähigkeit
der Amplifizierung von Ribonukleinsäure (RNA) stellt einen bedeutenden
Aspekt bei den Anstrengungen zur Aufklärung biologischer Prozesse
dar. Bis heute wird die Amplifikation der RNA (im Allgemeinen mRNA)
am häufigsten
mit Hilfe des als reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR) bezeichneten Verfahrens und Variationen davon durchgeführt. Diese
Verfahren beruhen auf der Replikation der RNA durch eine reverse
Transkriptase, um einzelsträngige
DNA (cDNA) zu bilden, die zu der RNA komplementär ist, und einer nachfolgenden
Amplifikation mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um
vielfache Kopien doppelsträngiger
DNA herzustellen. Obwohl diese Verfahren am weitesten verbreitet
sind, besitzen sie signifikante Nachteile: a) die Reaktionen erfordern
eine Thermozyklisierung; b) die Produkte sind doppelsträngig, was
sie folglich für
ein Binden an Sonden weniger zugänglich
macht; c) die Reaktionen sind für eine
Kontamination mit Produkten vor der Amplifikation anfällig, was
eine strikte Einschließung
der Reaktionsgemische erfordert; und d) die exponentielle Natur
der Amplifikation dieser Verfahren macht sie für eine Erzeugung von Produktpools
anfällig,
die nicht die Präsenz
der verschiedenen RNA-Sequenzen in der eingesetzten Gesamt-RNA-Probe
aufgrund der unterschiedlichen Amplifikationseffizienz der verschiedenen
Sequenzen und der Natur der exponentiellen Amplifikation, die eher
auf der Replikation von Amplifikationsprodukten als auf einer fortlaufenden
Replikation der eingesetzten Ziel-RNAs beruht, tatsächlich wiedergeben.
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Die
zelluläre
Gesamt-mRNA repräsentiert
die Aktivität
der Genexpression zu einem definierten Zeitpunkt. Die Genexpression
wird durch das Fortschreiten des Zellzyklus, Entwicklungsregulation,
Antwort auf interne und externe Stimuli und dergleichen beeinflusst.
Das Profil von exprimierten Genen für jeden Zelltyp in einem Organismus
spiegelt Normal- oder Krankheitsstadien, Antworten auf verschiedene
Stimuli, Entwicklungsstadien, Zelldifferenzierung und ähnliches
wider.
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Verschiedene
Verfahren zur Analyse der Genexpression sind in den letzten Jahren
entwickelt worden. Siehe zum Beispiel
US-Patente
Nrn. 5.744.308 ;
6.143.495 ;
5.824.517 ;
5.829.547 ;
5.888.779 ;
5.545.522 ;
5.716.785 ;
5.409.818 ;
5.665.545 ;
EP 0971039A2 ;
EP 0878553A2 . Diese beinhalten
eine Quantifizierung spezifischer mRNAs und die gleichzeitige Quantifizierung
einer großen
Anzahl an mRNAs, wie auch den Nachweis und die Quantifizierung von
Expressionsmustern von bekannten und unbekannten Genen. Die Analyse
von Genexpressionsprofilen ist gegenwärtig eines der mächtigsten
Werkzeuge bei der Untersuchung der Zelldifferenzierung und Zellentwicklung
und bei der Erforschung von Normal- und Krankheitsstadien verschiedener
Organismen, insbesondere beim Menschen. Diese Analyse ist für Prozesse
bei der Entdeckung von Genen, in der molekularen Medizin und bei
der Entdeckung von Arzneimitteln von entscheidender Bedeutung.
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Die
Amplifikation von zellulären
Gesamt-mRNAs, die aus einer beliebigen Zelle oder einem beliebigen Gewebe
präpariert
sind, ist im Allgemeinen für
ein Genexpressions-Profiling entscheidend. Obwohl eine Analyse von
nicht amplifizierter mRNA durchführbar
ist, so wäre
doch eine signifikante Menge an mRNA als Ausgangsmaterial erforderlich.
Allerdings ist die verfügbare
Gesamtmenge an Proben-mRNA durch die Menge der biologischen Probe,
aus der die mRNA stammt, häufig
begrenzt. Biologische Proben sind oftmals bezüglich Qualität und Quantität begrenzt.
Darüber
hinaus ist die Menge der verschiedenen mRNA-Spezies nicht gleich; manche
Spezies sind reichlicher vorhanden als andere, und diese sind wahrscheinlicher
und leichter zu analysieren. Die Fähigkeit, mRNA-Sequenzen zu
amplifizieren, ermöglicht
die Analyse weniger häufiger
vorhandener, seltener mRNA-Spezies. Die Fähigkeit, kleine Proben mit
Hilfe der Nukleinsäureamplifizierung
zu analysieren, ist ebenfalls für
die Gestaltung von Parametern für
eine umfangreiche Durchmusterung von Effektormolekül-Bibliotheken
vorteilhaft, für
die eine Verringerung des Probenvolumens ein wesentliches Problem
sowohl für
die Fähigkeit
zur Durchführung
einer sehr umfangreichen Durchmusterung als auch einer Durchmusterung
mit sehr hohem Durchsatz sowie im Hinblick auf die limitierenden
Mengen von Bibliothekskomponenten darstellt.
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Deshalb
besteht ein Bedarf an verbesserten RNA-Amplifizierungsverfahren,
welche die Nachteile bestehender Verfahren umgehen. Die hier bereitgestellte
Erfindung erfüllt
diesen Bedarf und liefert weitere Vorteile.
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OFFENLEGUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung wird ausschließlich
durch die angefügten
Ansprüche
definiert und stellt Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für RNA-Amplifikationen
sowie Anwendungen der Amplifikationsverfahren bereit.
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung vielfacher
Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist, welches Verfahren umfasst:
- (a) Bereitstellen
eines Komplexes, welcher Komplex umfasst:
(i) einen Komplex
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten, worin das erste
Primer-Extensionsprodukt durch Extension eines ersten Primers, der
an eine Ziel-RNA hybridisiert ist, mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase
erzeugt ist, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer
ist, umfassend einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt,
worin das zweite Primer-Extensionsprodukt durch Extension eines
zweiten Primers, der an das erste Primer-Extensionsprodukt hybridisiert
ist, erzeugt ist, und worin die RNA von dem Komplex der ersten und zweiten
Primer-Extensionsprodukte mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet, abgespalten wird; und
(ii) einen zusammengesetzten
Primer, welcher zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst, wobei der zusammengesetzte Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt hybridisiert
ist;
- und (b) Extendieren des zusammengesetzten Primers aus (ii),
wodurch das erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt wird, und wodurch vielfache
Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer
RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, wobei diese Verfahren die
Schritte umfassen: (a) Extendieren eines ersten Primers, der an
eine Ziel-RNA hybridisiert ist, mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt,
wodurch ein Komplex, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, erzeugt wird; (b) Abspalten der RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Enzym, das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet; (c) Extendieren eines zweiten Primers, der an das erste
Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wodurch
ein zweites Primer-Extensionsprodukt erzeugt wird, um einen Komplex
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten zu bilden; (d)
Abspalten der RNA von dem zusammengesetzten Primer in dem Komplex
der ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukte mit einem Enzym,
das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet, so dass ein zusammengesetzter
Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, wobei der
zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst;
(e) Extendieren des zusammengesetzten Primers, der an das zweite
Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wodurch das erste Primer-Extensionsprodukt
verdrängt
wird, und wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotidsequenz, die
zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer
RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, wobei diese Verfahren die
Schritte umfassen: (a) Extendieren eines zweiten Primers, der an
ein erstes Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, mit einer
DNA-abhängigen
DNA-Polymerase, wobei der erste Primer einen RNA-Abschnitt am 5'-Ende umfasst, wobei dieses erste Primer-Extensionsprodukt
eine Sequenz umfasst, die zu einer RNA-Sequenz komplementär ist, wodurch
ein zweites Primer-Extensionsprodukt erzeugt wird, um einen Komplex
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten zu bilden; (b)
Abspalten der RNA in dem Komplex aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten
mit einem Enzym, das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet,
so dass ein zusammengesetzter Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert, wobei der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst; (c) Extendieren des zusammengesetzten Primers, der an das
zweite Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wodurch dieses erste Primer-Extensionsprodukt
verdrängt
wird, und wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotidsequenz, die
zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, erzeugt werden. In einigen
Anwendungsformen der Erfindung wird das erste Primer-Extensionsprodukt
durch eine Extension eines ersten Primers, der an eine Ziel-RNA
hybridisiert ist, mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase erzeugt,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, der einen
RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer
RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, wobei diese Verfahren die
Schritte umfassen: (a) Abspalten der RNA von einem Komplex aus ersten
und zweiten Primer-Extensionsprodukten mit einem Enzym, das RNA
von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet, so dass ein zusammengesetzter Primer
an das zweite Primer-Extensionsprodukt hybridisiert, wobei der zusammengesetzte
Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst, wobei das erste
Primer-Extensionsprodukt durch Extension eines ersten Primers, der
an eine Ziel-RNA hybridisiert ist, mit einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase erzeugt
wird, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
(b) Hybridisieren eines zusammengesetzten Primers an das zweite
Primer-Extensionsprodukt und Extendieren des zusammengesetzten Primers
mit einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase, wodurch dieses erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt wird,
und wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu
der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer
RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, wobei diese Verfahren die
Schritte umfassen: (a) Extendieren eines zusammengesetzten Primers,
der an ein zweites Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, wobei
dieses Primer-Extensionsprodukt (i) ein Komplement oder eine Sequenz eines
ersten Primer-Extensionsprodukts umfasst, das durch Extension eines
ersten Primers, der an Template-RNA hybridisiert ist, erzeugt wird,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
und (ii) an ein zweites Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist,
das durch Extension eines zweiten Primers, der an das erste Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert ist, erzeugt wird, und Abspaltung der RNA von dem ersten
Primer mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet;
wodurch dieses erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt wird,
und wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu
der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, erzeugt werden.
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Mit
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse bereit, wobei
dieses Verfahren die Schritte umfassen:
Hybridisieren des verdrängten ersten
Primer-Extensionsprodukts eines beliebigen hier beschriebenen Verfahrens
zur Erzeugung vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz, die
zu einer RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, mit einem Polynukleotid,
umfassend einen Propromotor und eine Region, die an das verdrängte erste
Primer-Extensionsprodukt unter Bedingungen hybridisierbar ist, die
eine von einer RNA-Polymerase zu erfolgende Transkription zulassen,
so dass RNA-Transkripte
erzeugt werden, die zu dem verdrängten ersten
Primer-Extensionsprodukt komplementäre Sequenzen umfassen, wodurch
vielfache Kopien der RNA-Sequenz
von Interesse erzeugt werden.
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Mit
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse bereit, wobei
diese Verfahren die Schritte umfassen: Hybridisieren eines ersten Primer-Extensionsprodukts
eines beliebigen hier beschriebenen Verfahrens zur Erzeugung vielfacher
Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu einer RNA-Sequenz komplementär ist, mit
einem Polynukleotid, umfassend einen Propromotor und eine Region,
die an das verdrängte
erste Primer-Extensionsprodukt
unter Bedingungen hybridisierbar ist, die eine von einer RNA-Polymerase zu erfolgende
Transkription zulassen, so dass RNA-Transkripte erzeugt werden,
die zu dem verdrängten
ersten Primer-Extensionsprodukt komplementäre Sequenzen umfassen, wobei
das Primer-Extensionsprodukt ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt
ist, das erzeugt wird durch: (a) Extendieren eines ersten Primers,
der an eine Ziel-RNA hybridisiert ist, mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt,
wodurch ein Komplex, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, erzeugt wird; (b) Abspalten der RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Enzym, das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet;
(c) Extendieren eines zweiten Primers, der an das erste Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert ist, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wodurch
ein zweites Primer-Extensionsprodukt erzeugt wird, um einen Komplex
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten zu bilden; (d)
Abspalten der RNA von dem zusammengesetzten Primer in dem Komplex
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten mit einem Enzym,
das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet, so dass ein zusammengesetzter Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert, wobei der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt
umfasst; (e) Extendieren dieses zusammengesetzten Primers, der an
das zweite Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wodurch dieses erste Primer- Extensionsprodukt
verdrängt
wird, und wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz von Interesse
erzeugt werden.
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Mit
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer Polynukleotidsequenz bereit,
die zu einer RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Hybridisieren
eines ersten Primers an eine Ziel-RNA, wobei der erste Primer ein
zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt; (b) Extendieren
des ersten Primers mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, wodurch ein Komplex, umfassend
ein erstes Primer-Extensionsprodukt und die Ziel-RNA, erzeugt wird;
(c) Abspalten der RNA in dem Komplex von Schritt (b) mit einem Agens
(wie einem Enzym), das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; (d) Hybridisieren
eines zweiten Primers an das erste Primer-Extensionsprodukt; (e) Extendieren des
zweiten Primers mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wodurch
ein zweites Primer-Extensionsprodukt erzeugt wird, um einen Komplex
aus ersten und zweiten Extensionsprodukten zu bilden; (f) Abspalten
der RNA von dem zusammengesetzten Primer in dem Komplex aus ersten
und zweiten Extensionsprodukten mit einem Agens (wie einem Enzym),
das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet, so dass ein zusammengesetzter
Primer (welcher der gleiche Primer wie der erste Primer sein kann
oder nicht) an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert, wobei dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt
umfasst; (g) Extendieren dieses zusammengesetzten Primers von Schritt
(f) mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wodurch dieses erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt wird,
und wodurch vielfache Kopien eines Polynukleotids, das zu der RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist, erzeugt werden.
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Mit
einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung vielfacher
Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: Vereinigen und
Reagieren: des Komplexes aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten
von Schritt (e), der oben beschrieben ist; eines zusammengesetzten
Primers (welcher der gleiche Primer wie der erste Primer sein kann
oder nicht), der an das zweite Primer- Extensionsprodukt hybridisierbar ist, wobei
dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst;
einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase;
und eines Agens (wie einem Enzym), das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet;
wobei das Gemisch unter Bedingungen (welche erforderliche Substrate
und Pufferbedingungen umfassen) inkubiert wird, die eine Primer-Hybridisierung, RNA-Abspaltung
und Verdrängung
des ersten Primer-Extensionsprodukts von dem oben beschriebenen
Komplex von Schritt (e) zulassen, wenn seine RNA abgespalten ist
und ein zusammengesetzter Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt
in dem Komplex bindet.
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Dem
Fachmann ist es offensichtlich, dass eine Bezugnahme auf eine Erzeugung
von Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse oder von Kopien einer
Polynukleotidsequenz, die zu einer RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, sich
auf Produkte bezieht, die derartige Sequenzen enthalten, umfassen
oder daraus bestehen. Dem Fachmann ist es offensichtlich, dass Aspekte,
die sich auf ein Vereinigen und Inkubieren des resultierenden Gemisches
beziehen, ebenfalls Anwendungsformen von Verfahren umfassen, die
ein Inkubieren der verschiedenen Gemische (in verschiedenen Kombinationen
und/oder Subkombinationen) umfassen, so dass die erwünschten
Produkte gebildet werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer
RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, umfassend Inkubieren eines
Reaktionsgemisches, wobei dieses Reaktionsgemisch umfasst: (a) eine
Ziel-RNA; (b) einen ersten Primer, der an die Ziel-RNA hybridisierbar
ist, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
(c) einen zweiten Primer, der an ein Extensionsprodukt des ersten
Primers hybridisierbar ist; (d) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase; (e) eine
DNA-abhängige DNA-Polymerase;
(f) ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; wobei
die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die eine Primer-Hybridisierung,
Extension des ersten Primers und des zweiten Primers, um einen Komplex
zu bilden, bestehend aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten,
RNA-Abspaltung und Verdrängung
des ersten Primer-Extensionsprodukts von dem Komplex, wenn seine
RNA abgespalten ist und ein zusammengesetzter Primer an das zweite
Primer-Extensionsprodukt in dem Komplex bindet und extendiert wird,
zulassen, wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotidsequenz, die
zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Hybridisieren eines
ersten Primers an eine Ziel-RNA,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen
RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
(b) Extendieren des ersten Primers mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wodurch ein Komplex, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, erzeugt wird; (c) Abspalten der RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Agens (wie einem Enzym), das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet; (d) Hybridisieren eines zweiten Primers
an das erste Primer-Extensionsprodukt; (e) Extendieren des zweiten
Primers mit einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase, wodurch ein zweites Primer-Extensionsprodukt erzeugt
wird, um einen Komplex aus ersten und zweiten Extensionsprodukten
zu bilden; (f) Abspalten der RNA von dem zusammengesetzten Primer
in dem Komplex aus ersten und zweiten Extensionsprodukten mit einem
Agens (wie einem Enzym), das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet,
so dass ein zusammengesetzter Primer (welcher der gleiche Primer
wie der erste Primer sein kann oder nicht) an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert, wobei dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst; (g) Extendieren dieses zusammengesetzten Primers von Schritt
(f) mit einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase,
wodurch dieses erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt wird;
(h) Hybridisieren des verdrängten
ersten Primer-Extensionsprodukts mit einem Polynukleotid, umfassend
einen Propromotor und eine Region, die an das verdrängte erste
Primer-Extensionsprodukt unter Bedingungen hybridisierbar ist, welche
eine zu erfolgende Transkription durch die RNA-Polymerase zulassen,
so dass RNA-Transkripte erzeugt werden, umfassend Sequenzen, die
zu den verdrängten
Primer-Extensionsprodukten
komplementär
sind, wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz von Interesse erzeugt werden.
In einigen Anwendungsformen stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung vielfacher
Kopien bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a)
Vereinigen: eines ersten Komplexes, wobei der erste Komplex der
in diesem Absatz oben beschriebene Komplex aus ersten und zweiten
Primer-Extensionsprodukten
Schritt (e) ist; eines zusammengesetzten Primers (welcher der gleiche
Primer wie der erste Primer sein kann oder nicht), der an das zweite
Primer-Extensionsprodukt
hybridisierbar ist, wobei dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst; einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase; einer
RNA-Polymerase; eines Propromotor-Polynukleotids, umfassend einen
Propromotor und eine Region, die an ein zweites Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert; und eines Agens (wie ein Enzym), das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (b) Inkubieren des Gemisches von Schritt
(a) unter Bedingungen (welche erforderliche Substrate und Pufferbedingungen
umfassen), die eine Primer-Hybridisierung, RNA-Abspaltung
und Verdrängung
des ersten Primer-Extensionsprodukts
von dem ersten Komplex, wenn seine RNA abgespalten ist und ein zusammengesetzter
Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt in dem ersten Komplex
bindet, Hybridisierung des Propromotor-Polynukleotids an das verdrängte erste
Primer-Extensionsprodukt, um einen zweiten Komplex zu bilden, umfassend
das verdrängte
Primer-Extensionsprodukt und das Propromotor-Polynukleotid, und die RNA-Transktiption
von diesem zweiten Komplex zulassen.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse bereit, umfassend
Inkubieren eines Reaktionsgemisches, wobei besagtes Reaktionsgemisch
umfasst: (a) eine Ziel-RNA; (b) einen ersten Primer, der an die
Ziel-RNA hybridisierbar ist, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter
Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt; (c) einen zweiten Primer,
der an ein Extensionsprodukt des ersten Primers hybridisierbar ist;
(d) eine RNA-abhängige
DNA-Polymerase; (e) eine DNA-abhängige DNA-Polymerase;
(f) eine RNA-Polymerase; (g) ein Propromotor-Polynukleotid, umfassend
einen Propromotor und eine Region, die an ein Extensionsprodukt des
zweiten Primers hybridisiert; und (h) ein Enzym, das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet; wobei die Inkubation unter Bedingungen
erfolgt, die eine Primer-Hybridisierung, Extension von dem ersten
und zweiten Primer, um einen ersten Komplex zu bilden, bestehend
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten, RNA-Abspaltung,
Verdrängung
des ersten Primer-Extensionsprodukts von dem ersten Komplex, wenn seine
RNA abgespalten ist und ein zusammengesetzter Primer an das zweite
Primer-Extensionsprodukt in dem ersten Komplex bindet, Hybridisierung
des Propromotor-Polynukleotids an das verdrängte erste Primer-Extensionsprodukt,
um einen zweiten Komplex zu bilden, umfassend das verdrängte Primer-Extensionsprodukt
und das Propromotor-Polynukleotid, und die RNA-Transktiption von diesem zweiten Komplex
zulassen, wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz von Interesse
erzeugt werden.
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Mit
einem noch anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, umfassend Inkubieren eines Reaktionsgemisches, wobei besagtes
Reaktionsgemisch umfasst: (a) eine Ziel-RNA; (b) einen ersten Primer,
der an die Ziel-RNA hybridisierbar ist, wobei der erste Primer ein
zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt;
(c) einen zweiten Primer, der an ein Extensionsprodukt des ersten
Primers hybridisierbar ist; (d) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase; (e) eine DNA-abhängige DNA-Polymerase;
(f) ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; wobei
die Inkubation unter Bedingungen (welche erforderliche Substrate
und Pufferbedingungen umfassen) erfolgt, die eine Primer-Hybridisierung, Extension
von dem ersten und zweiten Primer, um einen Komplex zu bilden, bestehend
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten, RNA-Abspaltung und Verdrängung des
ersten Primer-Extensionsprodukts von dem Komplex, wenn seine RNA
abgespalten ist und ein weiterer zusammengesetzter Primer an das
zweite Primer-Extensionsprodukt in dem Komplex bindet, zulassen,
wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotid-Sequenz erzeugt werden,
die zu der RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, umfassend (a) Inkubieren eines Reaktionsgemisches, wobei dieses
Reaktionsgemisch umfasst: (i) eine Ziel-RNA; und (ii) einen ersten
Primer, der an eine Ziel-RNA hybridisierbar ist, wobei der erste
Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt;
und (iii) eine RNA-abhängige
DNA-Polymerase,
wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, welche eine Primer- Hybridisierung und
Bildung eines Komplexes, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, zulassen; (b) Inkubieren eines Reaktionsgemisches,
wobei dieses Reaktionsgemisch umfasst: (i) den Komplex, umfassend
ein erstes Primer-Extensionsprodukt und die Ziel-RNA; und (ii) ein
Enzym, das zur Abspaltung der RNA von einem RNA/DNA-Hybrid fähig ist;
wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die eine Abspaltung
von RNA in dem Komplex, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, zulassen; (c) Inkubieren eines Reaktionsgemisches,
wobei dieses Reaktionsgemisch umfasst: (i) das erste Primer-Extensionsprodukt;
(ii) einen zweiten Primer, der an das erste Primer-Extensionsprodukt
hybridisierbar ist; und (iii) eine DNA-abhängige DNA-Polymerase; wobei
die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die eine Primer-Hybridisierung
und Bildung eines Komplexes, umfassend das erste Primer-Extensionsprodukt
und ein zweites Primer-Extensionsprodukt, zulassen; (d) Inkubieren eines
Reaktionsgemisches, wobei dieses Reaktionsgemisch umfasst: (i) den
Komplex, umfassend das erste Primer-Extensionsprodukt und ein zweites
Primer-Extensionsprodukt; (ii) ein Enzym, das zur Abspaltung der RNA
von einem RNA/DNA-Hybrid fähig
ist; wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die eine Abspaltung
von RNA in dem Komplex, umfassend das erste Primer-Extensionsprodukt
und ein zweites Primer-Extensionsprodukt,
zulassen; (e) Inkubieren eines Reaktionsgemisches, wobei dieses
Reaktionsgemisch umfasst: (i) einen zusammengesetzten Primer, wobei
der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst;
(ii) den gespaltenen Komplex, umfassend das erste Primer-Extensionsprodukt
und ein zweites Primer-Extensionsprodukt; (iii) eine DNA-abhängige DNA-Polymerase;
wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt, die eine Hybridisierung
des zusammengesetzten Primers und Verdrängung des ersten Primer-Extensionsprodukts
von dem Komplex, umfassend das erste Primer-Extensionsprodukt und
ein zweites Primer-Extensionsprodukt, zulassen; wodurch vielfache
Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist, erzeugt werden.
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Die
Reaktionsgemische können
in beliebiger Weise mit einem oder mehreren oben vereinten Reaktionsgemischen
vereint werden (was folglich die Anzahl der Inkubationen verringert).
Dementsprechend sind in einigen Anwendungsformen die Reaktionsgemische
der Schritte (a) und (b) ein und dasselbe Reaktionsgemisch (vier
Inku bationen oder Inkubationsschritte). In anderen Anwendungsformen
sind die Reaktionsgemische der Schritte (d) und (e) ein und dasselbe
Reaktionsgemisch (vier Inkubationen oder Inkubationsschritte). In
einer noch anderen Anwendungsform sind die Reaktionsgemische der
Schritte (a) und (b) ein und dasselbe Reaktionsgemisch und die Reaktionsgemische
der Schritte (d) und (e) ein und dasselbe Reaktionsgemisch (drei
Inkubationen oder Inkubationsschritte). In noch anderen Anwendungsformen
sind die Reaktionsgemische der Schritte (a)-(c) ein und dasselbe
Reaktionsgemisch (drei Inkubationen oder Inkubationsschritte). In einer
noch weiteren Anwendungsform sind die Reaktionsgemische der Schritte
(a)-(c) ein und dasselbe Reaktionsgemisch und die Reaktionsgemische
der Schritte (d) und (e) ein und dasselbe Reaktionsgemisch (zwei Inkubationen
oder Inkubationsschritte). In anderen Anwendungsformen sind die
Reaktionsgemische der Schritte (a)-(d) ein und dasselbe Reaktionsgemisch
(zwei Inkubationen oder Inkubationsschritte). In anderen Anwendungsformen
sind die Reaktionsgemische von (b) und (c) ein und dasselbe Reaktionsgemisch
(vier Inkubationen oder Inkubationsschritte). In anderen Anwendungsformen
sind die Reaktionsgemische der Schritte (c) und (d) ein und dasselbe
Reaktionsgemisch (vier Inkubationen oder Inkubationsschritte). In
einer noch anderen Anwendungsform sind die Reaktionsgemische von
(a)-(e) ein und dasselbe Reaktionsgemisch (eine Inkubation). Es
ist zu verstehen, dass jede beliebige Kombination dieser Inkubationsschritte
und jeder einzelne Inkubationsschritt in dem Umfang, wo die Inkubation
als Teil eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren durchgeführt ist,
im Rahmen der Erfindung liegen.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, außerdem
umfassend (a) Inkubieren eines Reaktionsgemisches, wobei dieses
Reaktionsgemisch umfasst: (i) eine Kopie einer Polynukleotidsequenz,
die zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist; (ii) ein Propromotor-Polynukleotid,
umfassend einen Propromotor und eine Region, die an die Kopie einer
Polynukleotidsequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, hybridisiert;
und RNA-Polymerase; und wobei die Inkubation unter Bedingungen erfolgt,
die eine Hybridisierung des Propromotor-Polynukleotids an die Kopie
einer Polynukleotidsequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist, um einen zweiten Komplex zu bilden, umfassend die Kopie einer
Polynukleotidsequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, und
das Propromotor-Polynukleotid, und die RNA-Transkription von diesem zweiten Komplex
zulassen.
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Mit
noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Vereinigen:
einer Ziel-RNA; eines ersten Primers, der an die Ziel-RNA hybridisierbar
ist, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
eines zweiten Primers, der an ein Extensionsprodukt des ersten Primers
hybridisierbar ist; einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase; einer
DNA-abhängigen
DNA-Polymerase;
einer RNA-Polymerase; eines Propromotor-Polynukleotids, umfassend
einen Propromotor und eine Region, die an ein Extensionsprodukt
des zweiten Primers hybridisiert; und eines Agens (wie ein Enzym),
das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet; und (b) Inkubieren des Gemisches von Schritt (a) unter
Bedingungen (welche erforderliche Substrate und Pufferbedingungen
einschließen),
die eine Primer-Hybridisierung, Extension von dem ersten Primer
und dem zweiten Primer, um einen ersten Komplex, umfassend erstes
und zweites Extensionsprodukt, zu bilden, RNA-Abspaltung, Verdrängung des
ersten Primer-Extensionsprodukts von dem ersten Komplex, wenn seine
RNA abgespalten ist und ein anderer erster Primer an das zweite
Primer-Extensionsprodukt in dem ersten Komplex bindet, Hybridisierung
des Propromotor-Polynukleotids an das verdrängte erste Primer-Extensionsprodukt,
um einen zweiten Komplex, umfassend das verdrängte Primer-Extensionsprodukt
und das Propromotor-Polynukleotid, und die RNA-Transkription von
diesem zweiten Komplex zulassen, wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz
von Interesse erzeugt werden.
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Mit
noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer Polynukleotidsequenz bereit,
die zu einer RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Hybridisieren
eines Primers an eine Ziel-RNA, wobei der Primer ein zusammengesetzter
Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt; (b) Extendieren
des Primers mit einer RNA-abhängigen
DNA-Polymerase, wodurch ein Komplex, umfassend ein Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, erzeugt wird; (c) Abspalten von RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Agens (wie einem Enzym), das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet, so dass wenigstens ein Fragment der Ziel-RNA
an dem Primer-Extensionsprodukt hybridisiert verbleibt; (d) Extendieren
des wenigstens einen Fragments der Ziel-RNA mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wodurch ein Fragment-Extensionsprodukt, umfassend die Sequenz von
Interesse, erzeugt wird, um einen Komplex von Primer- und Fragment-Extensionsprodukten
zu bilden; (e) Abspalten von RNA von dem zusammengesetzten Primer
in dem Komplex aus Primer- und Fragment-Extensionsprodukt mit einem
Agens (wie einem Enzym), das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet,
so dass ein zusammengesetzter Primer (welcher der gleiche Primer wie
der erste Primer oder ein anderer sein kann) an das Fragment-Extensionsprodukt
hybridisiert und die Primerextension durch Strangverdrängung wiederholt,
wobei dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt
umfasst; wodurch vielfache Kopien einer Polynukleotidsequenz erzeugt werden,
die zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist. In einigen Anwendungsformen
stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung vielfacher Kopien einer
Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Vereinigen:
des Komplexes aus Primer- und
Fragment-Extensionsprodukt von Schritt (d), der in diesem Absatz
oben beschrieben ist; eines zusammengesetzten Primers (welcher der
gleiche Primer wie der erste Primer oder ein anderer sein kann),
der an das Fragment-Extensionsprodukt hybridisierbar ist, wobei
dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst;
einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase; und eines Agens (wie ein Enzym), das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (b) Inkubieren des Gemisches von Schritt
(a) unter Bedingungen (welche erforderliche Substrate und Pufferbedingungen
umfassen), die eine Primer-Hybridisierung, RNA-Abspaltung und Verdrängung des Primer-Extensionsprodukts
von dem Komplex von Schritt (d), der in diesem Absatz oben beschrieben
ist, zulassen, wenn seine RNA abgespalten ist und ein zusammengesetzter
Primer an das Fragment-Extensionsprodukt
in dem Komplex bindet.
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Mit
noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Hybridisieren
eines ersten Primers an eine Ziel-RNA, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter
Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt; (b)
Extendieren des ersten Primers mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, wodurch
ein Komplex, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt und die
Ziel-RNA, erzeugt wird; (c) Abspalten der Ziel-RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Agens (wie einem Enzym), das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet, so dass Fragmente der Ziel-RNA an dem Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert verbleiben; (d) Extendieren des wenigstens einen Fragments
der Ziel-RNA mit einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase, wodurch ein Fragment-Extensionsprodukt, umfassend die
Sequenz von Interesse, erzeugt wird, um einen Komplex von Primer-
und Fragment-Extensionsprodukten zu bilden; (e) Abspalten von RNA
von dem zusammengesetzten Primer in dem Komplex aus Primer- und
Fragment-Extensionsprodukten mit einem Agens (wie einem Enzym),
das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet, so dass ein zusammengesetzter
Primer (welcher der gleiche Primer wie der erste Primer oder ein
anderer sein kann) an das Fragment-Extensionsprodukt hybridisiert
und die Primerextension durch Strangverdrängung wiederholt, wobei dieser
zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst;
(f) Hybridisieren eines verdrängten
Primer-Extensionsprodukts mit einem Polynukleotid, umfassend einen
Propromotor und eine Region, die an das verdrängte Primer-Extensionsprodukt
unter Bedingungen hybridisierbar ist, die eine zu erfolgende Transkription
von RNA-Polymerase
zulassen, so dass RNA-Transkripte, umfassend zu dem verdrängten Primer-Extensionsprodukt
komplementäre
Sequenzen, erzeugt werden, wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz
von Interesse erzeugt werden. In einigen Anwendungsformen stellt
die Erfindung Verfahren zur Erzeugung vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz
bereit, die zu einer RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, wobei
diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Vereinigen: eines ersten
Komplexes, wobei der erste Komplex ein Komplex aus Primer- und Fragment-Extensionsprodukt
von Schritt (d) ist, der in diesem Absatz oben beschrieben ist;
eines zusammengesetzten Primers (welcher der gleiche Primer wie
der erste Primer oder ein anderer sein kann), der an das Fragment-Extensionsprodukt
hybridisierbar ist, wobei dieser zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst;
einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase; einer RNA-Polymerase; eines Propromotor-Polynukleotids,
umfassend einen Propromotor und eine Region, die an ein zweites
Primer-Extensionsprodukt hybridisiert; und eines Agens (wie ein
Enzym), das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (b) Inkubieren des
Gemisches von Schritt (a) unter Bedingungen (welche erforderliche
Substrate und Pufferbedingungen einschließen), die eine Primer-Hybridisierung,
RNA-Abspaltung, Verdrängung
des Primer-Extensionsprodukts von dem ersten Komplex, wenn seine
RNA abgespalten ist und ein zusammengesetzter Primer an das Fragment-Extensionsprodukt
in dem ersten Komplex bindet, Hybridisierung des Propromotor-Polynukleotids an das
verdrängte
Primer-Extensionsprodukt, um einen zweiten Komplex zu bilden, umfassend
das verdrängte Primer-Extensionsprodukt
und das Propromotor-Polynukleotid, und die RNA-Transkription von
diesem zweiten Komplex zulassen.
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Mit
noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer Polynukleotidsequenz bereit,
die zu einer RNA-Sequenz
von Interesse komplementär
ist, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Vereinigen:
einer Ziel-RNA; eines Primers, der an eine Ziel-RNA hybridisierbar
ist, wobei der Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt;
einer RNA-abhängigen
DNA-Polymerase; einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase;
und eines Agens (wie ein Enzym), das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet; und (b) Inkubieren des Gemisches von Schritt (a) unter
Bedingungen (welche erforderliche Substrate und Pufferbedingungen
einschließen),
die eine Primer-Hybridisierung, RNA-Abspaltung von einem ersten
Komplex, umfassend eine Ziel-RNA und ein Primer-Extensionsprodukt,
so dass ein Fragment der Ziel-RNA an das Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert verbleibt, Primerextension von dem Primer und dem Fragment
des RNA-Ziels, um einen zweiten Komplex zu bilden, umfassend ein
Primer-Extensionsprodukt und ein Fragment-Extensionsprodukt, das die Sequenz von
Interesse umfasst, und Verdrängung
des Primer-Extensionsprodukts von dem zweiten Komplex, wenn seine
RNA abgespalten ist und ein anderer Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt
in dem zweiten Komplex bindet, zulasen, wodurch vielfache Kopien
einer Polynukleotid-Sequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Vereinigen: einer
Ziel-RNA; eines Primers, der an eine Ziel-RNA hybridisierbar ist,
wobei der Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen
RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase;
einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase; einer RNA-Polymerase;
eines Propromotor-Polynukleotids; und eines Agens (wie ein Enzym),
das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (b) Inkubieren des
Gemisches von Schritt (a) unter Bedingungen (welche erforderliche
Substrate und Pufferbedingungen einschließen), die eine Primer-Hybridisierung,
RNA-Abspaltung, wobei eine RNA-Abspaltung von einem ersten Komplexes,
umfassend eine Ziel-RNA und ein Primer-Extensionsprodukt, erfolgt,
so dass ein Fragment der Ziel-RNA an das Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert verbleibt, Primerextension des Primers und des Fragments
der Ziel-RNA, um einen zweiten Komplex zu bilden, umfassend ein
Primer-Extensionsprodukt und ein Fragment-Extensionsprodukt, das
die Sequenz von Interesse umfasst, Verdrängung des Primer-Extensionsprodukts
von dem zweiten Komplex, wenn seine RNA abgespalten ist und ein
anderer Primer an den zweiten Komplex bindet, Hybridisierung des
Propromotor-Polynukleotids an ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt,
um einen dritten Komplex zu bilden, umfassend das verdrängte Primer-Extensionsprodukt
und das Propromotor-Polynukleotid, und die RNA-Transkription von
diesem dritten Komplex zulassen, wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz
von Interesse erzeugt werden.
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Mit
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse bereit, die auf
einer Ziel-RNA vorhanden ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
Bildung eines Komplexes aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten,
umfassend einen einzelsträngigen
3'-Abschnitt gemäß einem
beliebigen der hier beschriebenen Verfahren; (c) Hybridisieren eines Propromotor-Oligonukleotids
an den in Schritt (b) beschriebenen einzelsträngigen 3'-Abschnitt; und (d) Transkription unter
Verwendung einer DNA- abhängigen RNA-Polymerase,
wodurch vielfache Kopien von Sense-RNA-Produkten erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einer Sequenz, die zu einer RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist und auf einer Ziel-RNA vorhanden ist, und vielfacher Kopien
einer RNA-Sequenz von Interesse, die auf einer Ziel-RNA vorhanden
ist, bereit, wobei diese Verfahren die Schritte umfassen: (a) Extendieren
eines ersten Primers, der an eine Ziel-RNA hybridisiert ist, mit
einer RNA-abhängigen
DNA-Polymerase, wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer
ist, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt,
wodurch ein Komplex, umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt
und die Ziel-RNA, erzeugt wird; (b) Abspalten der RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Enzym, das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet; (c) Extendieren eines zweiten Primers, der an das erste
Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
wobei der zweite Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt, wodurch
ein zweites Primer-Extensionsprodukt erzeugt wird, um einen Komplex
aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten zu bilden; (d)
Abspalten der RNA von dem ersten und zweiten zusammengesetzten Primer
in dem Komplex aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten
mit einem Enzym, das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet,
so dass ein weiterer zusammengesetzter Primer an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert und ein weiterer Primer an das erste Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert; (e) Extendieren dieser zusammengesetzten Primer von
Schritt (d) mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase, wodurch
dieses erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt wird, und wodurch vielfache
Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu der RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
ist, erzeugt werden; und wodurch dieses zweite Primer-Extensionsprodukt
verdrängt
wird, und wodurch vielfache Kopien der RNA-Sequenz von Interesse
erzeugt werden.
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Mit
einem weiteren Aspekt umfassen die Verfahren zur Erzeugung vielfacher
Kopien einer Polynukleotidsequenz, die zu einer RNA-Sequenz von
Interesse komplementär ist,
die Erzeugung vielfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz, die
zu zwei oder mehreren verschiedenen Sequenzen von Interesse komplementär sind.
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Mit
einem weiteren Aspekt umfassen die Verfahren zur Erzeugung vielfacher
Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse die Erzeugung vielfacher
Kopien von zwei oder mehreren verschiedenen Sequenzen von Interesse.
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Verschiedene
Anwendungsformen des zusammengesetzten Primers und des zweiten Primers,
die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, sind hier beschrieben.
Zum Beispiel liegt in einigen Anwendungsformen der RNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers 5' bezüglich des
3'-DNA-Abschnitts.
In noch anderen Anwendungsformen ist der 5'-RNA-Abschnitt benachbart zu dem 3'-DNA-Abschnitt. In
einigen Anwendungsformen umfasst ein zusammengesetzter Primer einen
5'-Abschnitt (zum Beispiel
einen 5'-RNA-Abschnitt),
der an eine Ziel-RNA nicht unter Bedingungen hybridisierbar ist,
unter denen der zusammengesetzte Primer an eine Ziel-RNA hybridisiert.
In noch weiteren Anwendungsformen umfasst ein zusammengesetzter
Primer einen 3'-Abschnitt
(zum Beispiel einen 3'-DNA-Abschnitt),
der eine Zufallssequenz umfasst. In einigen Anwendungsformen, bei
denen eine Ziel-RNA eine mRNA ist, kann ein zusammengesetzter Primer
eine poly-dT-Sequenz umfassen. In anderen Anwendungsformen ist ein
zusammengesetzter Primer ein Zufallsprimer. In noch anderen Anwendungsformen
wird eine Vielzahl an zusammengesetzten Primern für eine Hybridisierung
an die Ziel-RNA verwendet. In einigen Anwendungsformen sind der
zusammengesetzte Primer, der an die Ziel-RNA hybridisiert, und der
zusammengesetzte Primer, der an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert, die gleichen Primer. In einigen Anwendungsformen sind
der zusammengesetzte Primer, der an die Ziel-RNA hybridisiert, und
der zusammengesetzte Primer, der an das zweite Primer-Extensionsprodukt
hybridisert, unterschiedliche Primer.
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In
noch weiteren Anwendungsformen ist der zweite Primer ein DNA umfassender
Primer (in einigen Anwendungsformen ein aus DNA bestehender Primer).
In anderen Anwendungsformen umfasst der zweite Primer ein oder mehrere
Fragmente der Ziel-RNA,
die an das erste Primer-Extensionsprodukt hybridisiert ist, wobei
dieses eine oder diese mehreren Fragmente durch Abspalten von RNA
in dem Komplex aus Ziel- RNA und
erstem Primer-Extensionsprodukt mit einem Enzym, das RNA von einem
RNA/DNA-Hybrid abspaltet, erzeugt werden. In anderen Anwendungsformen
umfasst der zweite Primer einen Abschnitt (zum Beispiel einen 3'-Abschnitt), der
eine Zufallssequenz umfasst. In noch anderen Anwendungsformen ist
der zweite Primer ein Zufallsprimer. In einigen Anwendungsformen
umfasst der zweite Primer einen 5'-Abschnitt,
der nicht an ein erstes Primer-Extensionsprodukt hybridisierbar
ist. Für
die hier beschriebenen Verfahren können ein oder mehrere zusammengesetzte
Primer verwendet werden.
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Die
Enzyme, die in den Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden
können,
sind hier beschrieben. Zum Beispiel kann das Agens (wie ein Enzym),
das RNA spaltet, eine RNase H sein, und die RNA-abhängige DNA-Polymerase
kann eine reverse Transkriptase sein. Die RNA-abhängige DNA-Polymerase
kann eine RNase H-Aktivität umfassen,
oder es können
verschiedene Enzyme verwendet werden. Ähnlicherweise kann eine DNA-Polymerase
sowohl RNA-abhängige
als auch DNA-abhängige DNA-Polymerase-Enzymaktivitäten umfassen,
oder es können
verschiedene Enzyme verwendet werden. Eine DNA-abhängige DNA-Polymerase
und ein Enzym, das RNA abspaltet, kann ebenfalls das gleiche Enzym
sein. Eine DNA-abhängige DNA-Polymerase,
eine RNA-abhängige
DNA-Polymerase und das Enzym, das die RNA abspaltet, kann ebenfalls
das gleiche Enzym sein.
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In
einigen Anwendungsformen werden die Verfahren der Erfindung zur
Erzeugung markierter Polynukleotidprodukte (im Allgemeinen DNA-
oder RNA-Produkte) verwendet. In einigen Anwendungsformen der Verfahren
zur Erzeugung markierter DNA-Produkte ist wenigstens ein eingesetzter
dNTP-Typ ein markiertes dNTP. In einigen Anwendungsformen der Verfahren
zur Erzeugung markierter RNA-Produkte ist wenigstens ein eingesetzter
rNTP-Typ ein markiertes rNTP. In anderen Anwendungsformen der Verfahren
zur Erzeugung markierter DNA-Produkte wird ein markierter zusammengesetzter
Primer verwendet.
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Bei
einigen Aspekten umfasst ein Propromotor-Polynukleotid (zum Beispiel
ein PTO) eine Region am 3'-Ende,
die an das verdrängte
Primer-Extensionsprodukt hybridi siert, wodurch eine DNA-Polymerase-Extension
des verdrängten
Extensionsprodukts einen doppelsträngigen Promotor erzeugt, von
dem aus die Transkription erfolgt.
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Die
Verfahren sind für
eine Amplifizierung eines beliebigen RNA-Ziels, einschließlich zum
Beispiel mRNA und ribosomaler RNA, anwendbar. Ein oder mehrere Schritte
können
zusammen und/oder sequentiell durchgeführt werden (oftmals in beliebiger
Reihenfolge, solange das(die) erforderliche(n) Produkt(e) gebildet werden
können),
und, wie es offensichtlich ist, umfasst die Erfindung verschiedene
Kombinationen der hier beschriebenen Schritte. Es ist ebenfalls
offensichtlich und hier beschrieben, dass die Erfindung Verfahren
umfasst, in denen der anfängliche
oder erste Schritt ein beliebiger der hier beschriebenen Schritte
ist. Zum Beispiel erfordern die Verfahren der Erfindung nicht, dass
der erste Schritt die Erzeugung des Extensionsprodukts des ersten
Primers von dem RNA-Template ist. Verfahren der Erfindung umfassen
Anwendungsformen, in denen spätere, „nachfolgende" Schritte ein anfänglicher
Schritt sind.
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Außerdem ist
es in verschiedenen Anwendungsformen der Erfindung zu verstehen,
dass das erste Primer-Extensionsprodukt umfasst: (a) eine Sequenz,
die zu einer RNA-Sequenz komplementär ist, und (b) einen 5'-Abschnitt, vorzugsweise
ein 5'-Ende, das aus RNA
besteht. Wie beschrieben, entsteht dieses Produkt im Allgemeinen
durch eine Primerextension eines zusammengesetzten Primers mit einem
RNA-Abschnitt entlang eines
RNA-Templates. Als solches bezieht sich ein erstes Primer-Extensionsprodukt
auf ein Produkt, das (a) und (b) oben umfasst.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls Verfahren bereit, welche die Produkte
der Amplifikationsverfahren der Erfindung verwenden (üblicherweise
analysieren), wie beispielsweise Sequenzierung, Nachweis von Sequenzänderung(en)
(z.B. Genotypisierung oder Nachweis einer Nukleinsäuremutation);
Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz von Interesse;
Genexpressionsprofiling; subtraktive Hybridisierung; Herstellung
einer subtraktiven Hybridisierungssonde; differenzielle Amplifikation;
Herstellung von Bibliotheken (einschließlich cDNA-Bibliotheken und
differenzieller Expressionsbibliotheken); Herstellung einer immobilisierten
Nukleinsäure
(die eine auf einem Mikroarray immobilisierte Nukleinsäure sein
kann) und Charakterisie rung (einschließlich Nachweis oder quantitativer
Bestimmung) amplifizierter Nukleinsäureprodukte, die mit den Verfahren
der Erfindung erzeugt sind.
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Mit
einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zur Sequenzierung
einer RNA-Sequenz
von Interesse bereit, wobei diese Verfahren eine Amplifizierung
einer Ziel-RNA,
die die Sequenz von Interesse enthält, mit den Amplifikationsverfahren
der Erfindung in Gegenwart eines Gemisches aus dNTPs und dNTP-Analoga (die
markiert oder unmarkiert sein können),
so dass eine Primerextension nach Einbau eines dNTP-Analogon, das
markiert oder unmarkiert sein kann, abbricht, und Analysieren der
Amplifikationsprodukte zwecks Bestimmung der Sequenz umfassen. In
Anwendungsformen, wo die amplifizierten Produkte RNA-Transkripte
sind, können
die Verfahren umfassen (a) Amplifizieren einer Ziel-RNA, welche
die Sequenz von Interesse enthält, mit
den Amplifikationsverfahren der Erfindung in Gegenwart eines Gemisches
aus rNTPs und rNTP-Analoga (die markiert oder unmarkiert sein können), so
dass die RNA-Transkription nach Einbau eines rNTP-Analogon, das
markiert oder unmarkiert sein kann, abbricht; und (b) Analysieren
der Amplifikationsprodukte, um die Sequenz zu ermitteln.
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Mit
einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis einer
Mutation (oder bei einigen Aspekten zur Charakterisierung einer
Sequenz) in einer Ziel-RNA bereit, umfassend (a) Amplifizieren der Ziel-RNA
mit einem hier beschriebenen Verfahren; und (b) Analysieren der
Amplifikationsprodukte des Verfahrens auf eine Einzelstrang-Konformation,
wobei ein Unterschied in der Konformation verglichen mit einer einzelsträngigen Referenz-RNA
eine Mutation in der Ziel-RNA anzeigt. In anderen Anwendungsformen
stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis einer Mutation (oder
bei einigen Aspekten zur Charakterisierung einer Sequenz) in einer
Ziel-RNA bereit, umfassend ein Analysieren der Amplifikationsprodukte
eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren auf eine Einzelstrang-Konformation,
wobei ein Unterschied in der Konformation verglichen mit einer einzelsträngigen Referenz-RNA
eine Mutation in der Ziel-RNA anzeigt (oder bei einigen Aspekten
die Zielsequenz charakterisiert).
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Bestimmung
der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz von Interesse bereit,
wobei diese Verfahren umfassen (i) Amplifizieren einer Ziel-RNA,
die eine Sequenz von Interesse enthält, wobei diese Amplifikation
die Extension eines zusammengesetzten Primers umfasst, der an einen
gespaltenen Komplex aus ersten und zweiten Primer-Extensionsprodukten
hybridisiert ist, der mit einem beliebigen der hier beschriebenen
Verfahren hergestellt ist, wobei die Sequenz des RNA-Abschnitts
des zusammengesetzten Primers bekannt ist, und (ii) Vergleich der
Amplifikationsprodukte, sofern vorhanden, von Schritt (i) mit der
Menge an Amplifikationsprodukten von einem Referenztemplate; worin
(1) eine Produktion von nachweislich weniger Amplifikationsprodukten
von dem Template im Vergleich zu der Menge an Amplifikationsprodukten
von dem Referenztemplate, das eine an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbare Region umfasst, anzeigt, dass das zweite
Primer-Extensionsprodukt keine an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbare Sequenz umfasst und eine Sequenzvariante
bezüglich
der Sequenz ist, die an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbar ist; oder (2) eine Produktion von nachweislich
mehr Amplifikationsprodukten von dem Template im Vergleich zu der
Menge an Amplifikationsprodukten von dem Referenztemplate, das keine
an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers hybridisierbare
Region umfasst, anzeigt, dass das zweite Primer-Extensionsprodukt eine an den RNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers hybridisierbare Sequenz umfasst und
keine Sequenzvariante bezüglich
der Sequenz ist, die an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbar ist.
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Mit
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung
einer Nukleinsäure
bereit, die auf einem Substrat immobilisiert ist (welches Verfahren
zur Herstellung eines Mikroarrays umfasst), umfassend (a) Amplifizieren
einer Ziel-RNA mit einem beliebigen der hier beschriebenen Verfahren;
und (b) Immobilisieren der Amplifikationsprodukte auf einem Substrat.
Die Amplifikationsprodukte können
markiert oder unmarkiert sein. Mit anderen Aspekten stellt die Erfindung
Verfahren zur Herstellung eines Mikroarrays bereit, umfassend (a)
Amplifizieren einer Ziel-RNA mit einem hier beschriebenen Amplifikationsverfahren;
und (b) Immobilisieren der Amplifikationsprodukte auf einem Substrat
(das fest oder halbfest sein kann). In einigen Anwendungsformen
werden die Mikroarrays durch Immobilisieren der Amplifikationsprodukte
auf einem Substrat hergestellt, um ein Mikroarray von Amplifikationsprodukten
herzustellen. Das Mikroarray kann wenigstens ein Amplifikationsprodukt
umfassen, das auf einem festen oder halbfesten Substrat immobilisiert
ist, wobei das Mikroarray aus einem Material hergestellt ist, das
aus der Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus Papier, Glas, Keramik, Kunststoff, Polystyrol,
Polypropylen, Nylon, Polyacrylamid, Nitrocellulose, Silikon und
anderen Metallen und optischer Faser. Ein Amplifikationsprodukt
kann auf dem festen oder halbfesten Substrat in einer zweidimensionalen
oder dreidimensionalen Konfiguration, umfassend Nadeln, Stäbchen, Fasern,
Bänder,
Fäden,
Kügelchen,
Partikel, Mikrotitervertiefungen, Kapillaren und Zylinder, immobilisiert
sein.
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Jedes
beliebige der Verfahren der Erfindung kann zur Erzeugung von Polynukleotidprodukten
(im Allgemeinen DNA oder RNA) angewandt werden, die für eine Charakterisierung
einer RNA-Sequenz von Interesse in einer Probe geeignet sind. In
einer Anwendungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Charakterisierung
(zum Beispiel Nachweis (Anwesenheit oder Abwesenheit) und/oder quantitative
Bestimmung) einer RNA-Sequenz von Interesse bereit, umfassend: (a)
Amplifizieren einer Ziel-RNA mit einem beliebigen der hier beschriebenen
Verfahren; und (b) Analysieren der Amplifikationsprodukte. Der Schritt
(b) der Analyse der Amplifikationsprodukte kann mit einem beliebigen
in der Technik bekannten oder hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden,
zum Beispiel mittels Nachweis und/oder quantitativer Bestimmung
der Amplifikationsprodukte, die an eine Sonde hybridisiert sind.
Diese Amplifikationsprodukte können
markiert oder unmarkiert sein. Jedes beliebige der Verfahren der
Erfindung kann zur Erzeugung von DNA- oder RNA-Produkten, die mittels Einbau
markierter Nukleotide und/oder markierter zusammengesetzter Primer
in geeigneten Schritten der Verfahren markiert werden, angewandt
werden. Diese markierten Produkte sind besonders für eine Quantifizierung
und/oder Identifizierung mit in der Technik bekannten Verfahren
besonders geeignet, die den Einsatz von Arrays, wie cDNA-Mikroarrays
und Oligonukleotid-Arrays, umfassen. Mit einem Aspekt stellt die
Erfindung ein Verfahren zur Charakterisierung einer RNA-Sequenz
von Interesse bereit, umfassend (a) Amplifizieren einer Ziel-RNA
mit einem hier beschriebenen Verfahren, um markierte DNA-Produkte
zu erzeugen; und (b) Analysieren der mar kierten DNA-Produkte. In
einigen Anwendungsformen umfasst der Schritt der Analyse der DNA-Produkte
die Mengenbestimmung dieser Produkte, wodurch die in einer Probe
vorhandene Menge der RNA-Sequenz von Interesse quantitativ bestimmt
wird.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Charakterisierung
einer RNA-Sequenz von Interesse bereit, umfassend (a) Amplifizieren
einer Ziel-RNA mit einem hier beschriebenen Verfahren, um markierte
RNA-Produkte zu erzeugen; und (b) Analysieren der markierten RNA-Produkte.
In einigen Anwendungsformen umfasst der Schritt der Analyse der
RNA-Produkte die Mengenbestimmung dieser Produkte, wodurch die in
einer Probe vorhandene Menge der RNA-Sequenz von Interesse quantitativ
bestimmt wird. Die DNA- oder RNA-Produkte können zum Beispiel durch Inkontaktbringen
dieser mit wenigstens einer Sonde analysiert werden. In einigen
Anwendungsformen wird die wenigstens eine Sonde als ein Mikroarray
bereitgestellt. Das Mikroarray kann wenigstens eine Sonde umfassen,
die auf einem festen oder halbfesten Substrat immobilisiert ist,
das aus einem Material hergestellt ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist,
bestehend aus Papier, Glas, Keramik, Kunststoff, Polystyrol, Polypropylen,
Nylon, Polyacrylamid, Nitrocellulose, Silikon und anderen Metallen
und optischer Faser. Eine Sonde kann auf dem festen oder halbfesten
Substrat in einer zweidimensionalen oder dreidimensionalen Konfiguration,
umfassend Nadeln, Stäbchen,
Fasern, Bänder,
Fäden, Kügelchen,
Partikel, Mikrotitervertiefungen, Kapillaren und Zylinder, immobilisiert
sein.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Bestimmung
des Genexpressionsprofils in einer Probe bereit, wobei die Verfahren
umfassen: (a) Amplifizieren wenigstens einer RNA-Sequenz von Interesse
in einer Probe unter Anwendung eines beliebigen der hier beschriebenen
Verfahren; und (b) Bestimmen der Menge an Amplifikationsprodukten
jeder RNA-Sequenz von Interesse, wobei jede dieser Menge indikativ
ist für
eine Menge jeder RNA-Sequenz von Interesse in der Probe, wodurch
das Genexpressionsprofil der Probe ermittelt wird.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung
einer Bibliothek (einschließlich
cDNA- und subtraktiver Hybridisierungsbibliotheken) bereit, wo bei
diese Verfahren umfassen: Amplifizieren wenigstens einer RNA-Sequenz
von Interesse unter Anwendung eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren,
um ein einzel- oder doppelsträngiges
Nukleinsäureprodukt
zu erzeugen.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung
einer subtraktiven Hybridisierungssonde bereit, wobei diese Verfahren
die Erzeugung vielfacher Kopien eines einzelsträngigen Polynukleotids, vorzugsweise
DNA, des Komplements wenigstens einer RNA-Sequenz von Interesse
von einer ersten RNA-Population
unter Anwendung eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren
umfassen.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Ausführung der
subtraktiven Hybridisierung bereit, wobei diese Verfahren umfassen:
(a) Erzeugung vielfacher Kopien des Komplements wenigstens einer
RNA-Sequenz von Interesse von einer ersten RNA-Population unter
Anwendung eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren; und
(b) Hybridisieren der vielfachen Kopien an eine zweite mRNA-Population, wodurch
eine Subpopulation der zweiten mRNA-Population einen Komplex mit
einer DNA-Kopie bildet. In einigen Anwendungsformen umfasst das
Verfahren außerdem:
(c) Spalten der RNA in dem Komplex von Schritt (b) mit einem Enzym,
das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (d) Amplifizieren
einer unhybridisierten Subpopulation der zweiten mRNA-Population
(unter Anwendung eines beliebigen Verfahrens, einschließlich der
hier beschriebenen Verfahren), wodurch vielfache Kopien einzelsträngiger DNA,
die zu der unhybridisierten Subpopulation der zweiten mRNA-Population
komplementär
ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur differenziellen
Amplifikation bereit, wobei die Verfahren umfassen: (a) Erzeugung
vielfacher Polynukleinsäure-Kopien,
im Allgemeinen DNA, des Komplements wenigstens einer RNA-Sequenz
von Interesse von einer ersten RNA-Population unter Anwendung eines
beliebigen der hier beschriebenen Verfahren; (b) Hybridisieren der
vielfachen Kopien an eine zweite mRNA-Population, wodurch eine Subpopulation
der zweiten mRNA-Population
einen Komplex mit einer DNA-Kopie bildet; (c) Spalten der RNA in
dem Komplex von Schritt (b) mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet;
und (d) Amplifizieren einer unhybridisierten Subpopulation der zweiten
mRNA-Population unter Anwendung eines beliebigen Verfahrens, einschließlich derjenigen,
der hier beschriebenen, wodurch vielfache Kopien von einzelsträngiger DNA,
die zu der unhybridisierten Subpopulation der zweiten mRNA-Population
komplementär
ist, erzeugt werden.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung
einer Bibliothek bereit, wobei diese Verfahren die Herstellung einer
subtraktiven Hybridisierungssonde, wie sie hier beschrieben ist,
oder eine differenzielle Amplifikation, wie sie hier beschrieben
ist, umfassen.
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Für jede dieser
Anwendungen kann jedes beliebige der Amplifizierungsverfahren (einschließlich verschiedener
Komponenten und verschiedener Anwendungsformen jeder dieser Komponenten),
wie sie hier beschrieben sind, genutzt werden. Zum Beispiel kann
der eingesetzte zusammengesetzte Primer einen 5'-RNA-Abschnitt besitzen, der zu dem
3'-DNA-Abschnitt
benachbart sein kann.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls Kits bereit, die verschiedene Komponenten
(und verschiedene Kombinationen der Komponenten) umfassen, die in
den hier beschriebenen Amplifikationsverfahren verwendet werden. Wir
beschreiben zum Beispiel die Zusammensetzungen, die einen zusammengesetzten
Primer, wobei der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst, und einen zweiten Primer umfassen, wobei der zweite Primer
ein Zufallsprimer ist. In einigen Anwendungsformen umfassen diese
Zusammensetzungen außerdem
eine RNA-abhängige DNA-Polymerase
(die eine reverse Transkriptase sein kann). Wir beschreiben ebenfalls
eine Zusammensetzung, die einen zusammengesetzten Primer und einen zweiten
Primer umfasst, der eine Sequenz umfasst, die nicht an ein Extensionsprodukt
eines zusammengesetzten Primers (im Allgemeinen, aber nicht notwendigerweise,
führt die
Verwendung dieses Primers zu einer Erzeugung von Primer-Extensionsprodukten,
an die ein Propromotor-Polynukleotid hybridisieren kann) hybridisiert
werden kann (unter Bedingungen, bei denen eine Region des Primers
hybridisierbar ist). In einigen Anwendungsformen ist der 5'-RNA-Abschnitt eines
zusammengesetzten Primers benachbart zu seinem 3'-DNA-Abschnitt. In noch anderen Anwendungsformen
besteht der 5'-RNA-Abschnitt
aus etwa 5 bis etwa 20 Nukleotiden und sein 3'-DNA-Abschnitt aus etwa 5 bis etwa 15
Nukleotiden. In einigen Anwendungsformen ist das Propromotor-Polynukleotid
ein Propromotor-Template-Oligonukleotid
(PTO). In noch weiteren Anwendungsformen stellt die Erfindung eine
Zusammensetzung bereit, umfassend: (a) einen zusammengesetzten Primer;
(b) einen zweiten Primer (der ein Zufallsprimer sein kann); und
(c) ein Propromotor-Polynukleotid
(das in einigen Anwendungsformen ein PTO ist).
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Wir
beschreiben ebenfalls Zusammensetzungen, die einen beliebigen der
hier beschriebenen Komplexe umfassen (die im Allgemeinen als Intermediate
bezüglich
der Amplifikationsendprodukte zu betrachten sind) (siehe ebenfalls
die Figuren für
beispielhafte schematische Darstellungen dieser verschiedenen Komplexe).
Zum Beispiel beschreiben wir Zusammensetzungen, umfassend einen
Komplex aus (a) einem ersten Primer-Extensionsstrang, wobei der
erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist und einen RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst; und (b) einen Ziel-RNA-Strang. Mit einem noch anderen Aspekt
beschreiben wir Zusammensetzungen, umfassend einen Komplex aus:
(a) einem ersten Primer-Extensionsprodukt,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist und einen
RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst; und (b) einem Extensionsprodukt eines zweiten Primers (oder
Fragments). Wir beschreiben ebenfalls einen Komplex aus (a) einem
abgespaltenen Primer-Extensionsprodukt, wobei der Primer ein zusammengesetzter
Primer ist und einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt
umfasst; (b) einem Extensionsprodukt eines zweiten Primers (oder
Fragments); und (c) einem zusammengesetzten Primer.
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Wir
beschreiben ebenfalls irgendein oder mehrere Produkte (einschließlich Intermediate)
und Zusammensetzungen, umfassend die Produkte (einschließlich Intermediate),
die mit einem beliebigen Aspekt der Verfahren der Erfindung hergestellt
werden. Die Produkte umfassen Bibliotheken und jede andere erzeugte Population,
die im Allgemeinen auf der Natur des Primers oder der Primer basieren,
die in den hier beschriebenen Verfahren eingesetzt sind.
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Wir
beschreiben ebenfalls Reaktionsgemische (oder Zusammensetzungen,
die Reaktionsgemische umfassen), welche verschiedene Kombinationen
der hier beschriebenen Komponenten enthalten. Zum Beispiel beschreiben
wir Reaktionsgemische, umfassend (a) eine Ziel-RNA; (b) einen zusammengesetzten
Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt
und einen RNA-Abschnitt; (c) einen zweiten Primer; und (d) eine DNA-Polymerase.
Wie hier beschrieben, kann ein beliebiger der zusammengesetzten
Primer (oder viele zusammengesetzte Primer), einschließlich eines
zusammengesetzten Primers, der einen zu dem 3'-DNA-Abschnitt benachbarten 5'-RNA-Abschnitt umfasst,
in dem Reaktionsgemisch enthalten sein. Das Reaktionsgemisch könnte ebenfalls
außerdem
ein Enzym, wie RNase H, umfassen, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet.
Ein Reaktionsgemisch kann ebenfalls ein Propromotor-Polynukleotid
(das in einigen Anwendungsformen PTO ist) und/oder eine RNA-Polymerase
umfassen. Ein Reaktionsgemisch kann ebenfalls umfassen (a) ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt
(das eine 5'-Endsequenz
enthält,
die zu einem 3'-DNA-Abschnitt eines
zusammengesetzten Primers komplementär ist, aber keine Sequenzen
enthält,
die zu dem RNA-Abschnitt eines zusammengesetzten Primers komplementär sind);
(b) ein Propromotor-Polynukleotid (wie ein PTO); und (c) eine RNA-Polymerase.
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Mit
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Kits für die Durchführung der
hier beschriebenen Verfahren bereit. Diese Kits, die in einer geeigneten
Weise verpackt sind und im Allgemeinen (aber nicht notwendigerweise)
geeignete Anleitungen enthalten, enthalten eine oder mehrere Komponenten,
die in den Amplifikationsverfahren verwendet werden. Zum Beispiel
stellt die Erfindung Kits bereit, die einen ersten zusammengesetzten
Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt
und einen RNA-Abschnitt (der 5' liegen
kann und außerdem
zu dem 3'-DNA-Abschnitt
benachbart sein kann), und einen zweiten zusammengesetzten Primer
(der gesondert verpackt sein kann oder nicht) umfassen, wobei der
zweite zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt umfasst
und wobei der zweite zusammengesetzte Primer eine Sequenz umfasst,
die an ein Polynukleotid, umfassend ein Komplement des RNA-Abschnitts
des ersten zusammengesetzten Primers, hybridisierbar ist. In einigen
Anwendungsformen umfassen diese Kits außerdem Gebrauchsanleitungen
der Primer für
eine RNA-Amplifikation. Die zusammengesetzten Primer in den Kits
können
beliebige Primer sein, die hier beschrieben sind. Die Kits können beliebig
weitere Komponenten enthalten, wie (a) ein Propromotor-Polynukleotid (wie
ein PTO); und (b) ein beliebiges der hier beschriebenen Enzyme,
wie ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet (zum Beispiel
RNase H), DNA-Polymerase (RNA-abhängig oder DNA-abhängig) und
RNA-Polymerase. Jedes dieser Kits kann außerdem Gebrauchsanleitungen der
Komponenten für
eine RNA-Amplifikation enthalten.
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Wir
beschreiben ebenfalls Systeme für
die Durchführung
der hier beschriebenen Amplifikationsverfahren. Zum Beispiel beschreiben
wir Systeme für
eine Amplifizierung einer Ziel-RNA, umfassend (a) einen zusammengesetzten
Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt
und einen RNA-Abschnitt; (b) einen zweiten Primer; (c) eine RNA-abhängige DNA-Polymerase;
(d) eine DNA-abhängige
DNA-Polymerase; und (e) ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet (wie beispielsweise RNase H). Der zusammengesetzte Primer
kann ein beliebiger (ein oder mehrere) der hier beschriebenen Primer
sein, einschließlich
eines zusammengesetzten Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt umfasst, der zu dem 3'-DNA-Abschnitt benachbart
ist. Die Systeme können
außerdem
ein Propromotor-Polynukleotid (wie ein PTO) und/oder eine RNA-Polymerase
umfassen. Wie hier beschrieben, können die Systeme im Allgemeinen
ein oder mehrere Geräte
für die
Ausführung
der Verfahren der Erfindung umfassen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A-1B zeigen eine schematische
Darstellung eines linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses
unter Verwendung eines zusammengesetzten Primers, eines zweiten
Primers und einer Strangverdrängung,
um vielfache Kopien eines einzelsträngigen DNA-Produkts zu erzeugen,
das zu der Ziel-RNA komplementäre
Sequenzen umfasst.
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2A-2C zeigen eine schematische
Darstellung eines verstärkten
linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses unter Verwendung
eines zusammen gesetzten Primers, eines zweiten Primers, einer Strangverdrängung und
einer Transkription, um vielfache Kopien der Ziel-RNA zu erzeugen.
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3A-3B zeigen eine schematische
Darstellung eines linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses
unter Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers und einer
Strangverdrängung,
um vielfache Kopien eines einzelsträngigen DNA-Produkts zu erzeugen,
das zu der Ziel-RNA komplementäre
Sequenzen umfasst.
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4A-4B zeigen eine schematische
Darstellung eines verstärkten
linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses unter Verwendung
eines einzigen zusammengesetzten Primers, einer Strangverdrängung und
einer Transkription, um vielfache Kopien der Ziel-RNA zu erzeugen.
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5 zeigt eine schematische Darstellung
eines linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses unter
Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers, der eine poly-dT-Sequenz
enthält,
und einer Strangverdrängung,
um vielfache Kopien eines einzelsträngigen DNA-Produkts zu erzeugen,
das zu der Ziel-RNA komplementäre
Sequenzen umfasst.
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6 zeigt eine schematische Darstellung
eines linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses unter
Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers, der eine Zufallssequenz
enthält,
und einer Strangverdrängung,
um vielfache Kopien eines einzelsträngigen DNA-Produkts zu erzeugen,
das zu der Ziel-RNA komplementäre
Sequenzen umfasst.
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7 zeigt
eine schematische Darstellung eines verstärkten linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses
unter Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers und einer
Transkription, um vielfache Kopien eines einzelsträngigen DNA-Produkts
zu erzeugen, das zu der Ziel-RNA komplementäre Sequenzen umfasst.
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8A-8E zeigen eine
schematische Darstellung eines linearen isothermen RNA-Amplifikationsprozesses
unter Verwendung zweier zusammengesetzter Primer und einer Strangverdrängung, um
vielfache Kopien von einzelsträngigen
DNA-Produkten zu
erzeugen, das zu der Ziel-RNA komplementäre Sequenzen und zu der Ziel-RNA
identische Sequenzen umfasst.
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9 zeigt
ein Foto eines Gels, das unter Anwendung der isothermen RNA-Amplifikationsverfahren erzeugte
PCR-Produkte zeigt, die von einer doppelsträngigen cDNA amplifiziert worden
sind, die eine angefügte
definierte Sequenz auf dem zweiten cDNA-Strang umfasst.
-
10 zeigt Schaubilder, welche die Ergebnisse von
PCR-Echtzeitexperimenten zur quantitativen Bestimmung von Produkten
darstellen, die unter Anwendung einer linearen isothermen RNA-Amplifikation
erzeugt worden sind.
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AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
-
Überblick über die
Erfindung und ihre Vorteile
-
Die
Erfindung legt neuartige Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für eine Amplifikation
von RNA-Sequenzen offen. Die Verfahren ermöglichen eine isotherme Amplifikation
einer einzigen RNA-Spezies oder eines Pools von RNA-Spezies. Einige
Verfahren stellen die Erzeugung vielfacher Kopien von DNA bereit, die
zu einer RNA-Sequenz
von Interesse komplementäre
Sequenzen umfasst. Andere Verfahren stellen die Erzeugung vielfacher
Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse bereit. Diese Verfahren sind
zum Beispiel für die
Erzeugung von cDNA-Bibliotheken und subtraktiven Hybridisierungssonden
geeignet. Sie erzeugen einzelsträngige
DNA- oder RNA-Produkte,
die ohne weiteres für
eine Reihe von Verwendungen, einschließlich Expressionsprofiling,
z.B. durch Multiplexanalyse mit Hilfe von Mikroarray-Technologien, ebenso
wie für
Elektrophorese-gestützte
Technologien, wie differenzielles Display, geeignet sind. Diese
Verfahren sind für
eine Automatisierung geeignet und erfordern keine Thermozyklisierung.
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Die
Verfahren der Erfindung beziehen sich auf die Amplifikation einer
oder mehrerer RNA-Spezies, wie beispielsweise einen Pool von RNA-Sequenzen,
und sind für
die Amplifikation aller RNA-Sequenzen (wie mRNA) in einem Gesamt-RNA-Präparat von
einer biologischen Probe besonders geeignet. Folglich ist einer der
Hauptvorteile der Verfahren der Erfindung die Fähigkeit zur Amplifizierung
eines vollständigen
Pools von Sequenzen, was eine wesentliche Voraussetzung für die Analyse
des Genexpressionsprofils in Zellen ist, wie beispielsweise in den
Zellen in einer biologischen Probe von Interesse. Die Verfahren
der Erfindung können ebenfalls
für eine
Amplifizierung einer spezifischen RNA-Sequenz von Interesse oder
einer Vielzahl an RNAs, zum Beispiel von Mitgliedern einer Familie
verwandter RNAs, angewandt werden. Die Verfahren der Erfindung sind
ebenfalls für
eine Amplifizierung einer großen
Vielzahl und am bevorzugtesten aller RNA-Sequenzen (wie mRNA) in
einer Probe geeignet.
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Insofern
als viele mRNAs ein einzigartiges poly-A 3'-Ende besitzen, wird eine von der 3'-Endsequenz ausgehende
Amplifikation von mRNAs üblicherweise
zur Herstellung von cDNA-Bibliotheken und anschließende Sequenzanalyse
für eine
Bestimmung des Genexpressionsprofils oder für andere Anwendungen ausgeführt. Die
Verfahren der Erfindung sind für
eine Herstellung von Bibliotheken amplifizierter 3'-Abschnitte von mRNAs ähnlich geeignet.
Ein in den Verfahren der Erfindung verwendeter zusammengesetzter
Primer kann unter Verwendung von Zufallssequenzen gemäß in der
Technik bekannter Verfahren so gestaltet werden, dass er an eine
Vielzahl oder an sämtliche
RNA-Spezies in der Probe hybridisierbar ist. Wenn eine ausgewählte RNA
oder eine Familie verwandter RNAs amplifiziert werden soll, umfasst
alternativ der zusammengesetzte Primer eine Sequenz oder Sequenzen,
die an die ausgewählte
RNA oder an eine Familie verwandter RNAs hybridisierbar sind.
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Die
Verfahren umfassen im Allgemeinen die Verwendung speziell gestalteter
Primer, im Allgemeinen eines oder mehrerer zusammengesetzter RNA/DNA-Primer,
um einen Komplex aus Erst- und Zweitstrang-cDNAs zu erzeugen, der
einen Abschnitt mit einem besonderen Merkmal (z.B. von einem Enzym
spaltbar) umfasst. Wie hier verwendet, versteht es sich, dass „cDNA" ein Polynukleotid-Primer-Extensionsprodukt
bezeichnet. Im Allgemeinen umfasst der Komplex einen RNA/DNA-Heteroduplex
an einem Ende des doppelsträngigen
cDNA-Komplexes. Der RNA/DNA-Heteroduplex an einem Ende des doppelsträngigen cDNA-Komplexes kann
eine definierte Endsequenz umfassen, die im Allgemeinen von dem
RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers eingefügt ist.
Der zusammengesetzte Primer gemäß den Verfahren
der Erfindung umfasst einen 3'-DNA-Abschnitt,
der im Allgemeinen so gestaltet ist, dass er an eine Ziel-RNA oder
Ziel-RNAs hybridisierbar ist. Der/die verbleibende Abschnitt(e)
(wie der 5'-RNA-Abschnitt)
des zusammengesetzten Primers umfasst im Allgemeinen, aber nicht
notwendigerweise, eine Sequenz, die nicht an eine Ziel-RNA hybridisierbar
ist (die einen Schwanz bilden würde,
wenn der Primer an eine Ziel-RNA
gebunden ist). Folglich und wie es aus der Beschreibung ersichtlich
ist, umfasst die Bezugnahme auf einen Primer, der an eine Sequenz
(oder Hybridisierungstemplate) hybridisiert, Anwendungsformen, in
denen wenigstens ein Teil des Primers hybridisiert ist, wie auch
diejenigen Anwendungsformen, in denen der ganze Primer hybridisiert
ist.
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Der
doppelsträngige
cDNA-Komplex ist ein Substrat für
eine lineare Amplifikation, die folgendermaßen abläuft: ein Enzym, das RNA von
einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet (wie RNase H), spaltet die RNA-Sequenz von
dem Hybrid ab, lässt
dabei eine 3'-DNA-Sequenz auf dem
zweiten cDNA-Strang zurück,
die für
ein Binden eines zusammengesetzten Primers verfügbar ist, welcher der gleiche
oder ein anderer Primer als der erste zusammengesetzte Primer sein
kann. Die Extension eines gebundenen zusammengesetzten Primers durch
die DNA-Polymerase erzeugt ein Primer-Extensionsprodukt, welches das zuvor
gebundene abgespaltene erste Primer-Extensionsprodukt verdrängt, wodurch
ein einzelsträngiges
DNA-Produkt angehäuft
wird. Das einzelsträngige
DNA-Produkt ist eine Kopie des Komplements der Ziel-RNA (oder „Antisense"-DNA). Diese lineare Amplifikation
wird als „SPIA" (steht für Single
Primer Linear Amplification) bezeichnet und ist von Kurn et al., in
U.S. Patent Nr. 6.251,639
B1 , beschrieben.
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Ein
Aspekt der Erfindung funktioniert folgendermaßen: ein zusammengesetzter
RNA/DNA-Primer bildet die Basis für eine Replikation der Template-RNA.
Der zusammengesetzte Primer (hier ebenfalls als „der erste Primer" bezeichnet) hybridisiert
an Template-RNA, welche die RNA-Sequenz(en) von Interesse umfasst, und
der zu sammengesetzte Primer wird von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase
verlängert,
um ein erstes Primer-Extensionsprodukt (austauschbar auch als „Extensionsprodukt
des zusammengesetzten Primers" oder „Erststrang-cDNA" bezeichnet) zu bilden.
Nach Abspaltung der Template-RNA wird ein zweites Primer-Extensionsprodukt
(austauschbar als „Zweitstrang-cDNA" bezeichnet) in einem
Komplex mit dem ersten Primer-Extensionsprodukt gebildet (wie unten
beschrieben). Der Komplex aus ersten und zweiten Extensionsprodukten
besteht, aufgrund des Vorhandenseins des zusammengesetzten Primers
in dem ersten Primer-Extensionsprodukt, aus einem RNA/DNA-Hybrid
an einem Ende. Ein Agens, wie ein Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet (wie RNase H), spaltet die RNA-Sequenz von dem Hybrid ab und lässt dabei
eine Sequenz auf dem zweiten Primer-Extensionsprodukt zurück, die
für ein
Binden eines weiteren zusammengesetzten Primers verfügbar ist,
der der gleiche oder ein anderer Primer als der erste zusammengesetzte
Primer sein kann. Ein weiteres Extensionsprodukt des ersten (zusammengesetzten)
Primers wird von der DNA-Polymerase erzeugt, die das zuvor gebundene
abgespaltene Extensionsprodukt des ersten Primers verdrängt, was ein
verdrängtes
abgespaltenes Extensionsprodukt des ersten Primers ergibt.
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In
einigen Anwendungsformen der Erfindung wird ein zweites Primer-Extensionsprodukt
folgendermaßen
gebildet: nach Abspaltung des RNA-Templates wird dann ein zweiter
Primer an das Extensionsprodukt des ersten Primers hybridisiert
und extendiert, um ein zweites Primer-Extensionsprodukt in einem
Komplex mit dem ersten Primer-Extensionsprodukt zu bilden. Der Komplex
aus ersten und zweiten Extensionsprodukten besteht aufgrund des
Vorhandenseins des zusammengesetzten Primers in dem ersten Primer-Extensionsprodukt
aus einem RNA/DNA-Hybrid an einem Ende. Der zweite Primer ist eine
beliebige Sequenz, die an den ersten DNA-Strang hybridisierbar ist,
so dass er geeignet ist, von einer DNA-Polymerase entlang des ersten Primer-Extensionsprodukt
extendiert zu werden, um ein zweites Primer-Extensionsprodukt zu bilden. Folglich ist
in einigen Anwendungsformen der zweite Primer ein Oligonukleotid,
der eine Zufallssequenz (d.h. eine Sequenz, die so gestaltet ist,
dass sie (unter einer Reihe an gegebenen Bedingungen) an eine oder
mehrere Sequenzen in der Probe hybridisierbar ist) umfassen kann
oder nicht. In anderen Anwendungsformen umfasst er eine Sequenz
des ersten DNA-Strangs (im Allgemei nen am 3'-Ende), die an eine Sequenz im ersten DNA-Strang
(zum Beispiel eine Haarnadelstruktur oder selbstassoziierte Struktur)
hybridisiert wird.
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Bei
einem anderen Aspekt der Amplifikationsverfahren dient ein oder
mehrere Fragmente der Ziel-RNA als der Primer des Extensionsprodukts
des zweiten Primers. Die Ziel-RNA in dem anfänglichen Komplex, umfassend
die Ziel-RNA und ein erstes Primer-Extensionsprodukt, wird mit einem
Agens (wie RNase H) gespalten, so dass wenigstens ein Fragment der
Template-RNA an dem ersten Primer-Extensionsprodukt hybridisiert verbleibt.
Bei diesem Aspekt der Erfindung dient ein (oder mehrere) Fragment(e)
der Template-RNA als ein „zweiter" Primer in der oben
beschriebenen Art und Weise, um ein Extensionsprodukt des Fragments zu
erzeugen, das dieselbe Funktion wie das zweite Primer-Extensionsprodukt
in den oben beschriebenen Amplifikationsverfahren besitzt. Ein geeignetes
RNA-Fragment in den Verfahren der Erfindung ist lang genug, so dass
es nicht von der Erststrang-cDNA abdissoziiert, bevorzugt ist es
etwa 3 bis etwa 30, bevorzugter etwa 5 bis etwa 25, noch bevorzugter
etwa 10 bis etwa 20 und am bevorzugtesten etwa 12 bis etwa 17 Nukleotide lang.
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In
Anwendungsformen, die eine Transkription einbeziehen (hier werden
sie als „verstärkte" Verfahren bezeichnet),
kann der zweite Primer außerdem
eine Sequenz umfassen, so dass verdrängte Extensionsprodukte des
ersten Primers (anders als das allererste Extensionsprodukt des
ersten zusammengesetzten Primers) eine Sequenz enthalten, an die
ein Polynukleotid, umfassend einen Propromotor (hier auch als „Propromotor-Polynukleotid" bezeichnet), hybridisieren
kann. Die Hybridisierung des Propromotor-Polynukleotids an ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt
und Extension des 3'-Endes
des verdrängten
ersten Primer-Extensionsprodukts (falls dort ein Überhang
vorhanden ist) ergibt eine doppelsträngige Promotorregion, die die
Transkription steuert (über
eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase), um Sense-RNA-Produkte
zu erzeugen. Dieser „verstärkte" Ansatz ist in Kurn
et al.,
U.S. Patent
Nr. 6.251.639 B1 , beschrieben.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung wenigstens einer Kopie
einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu einer RNA-Sequenz von
Interesse komplementär
ist, umfassend Vereinigen und Reagieren des folgenden: (a) einer
Ziel-RNA, umfassend eine RNA-Sequenz von Interesse; (b) eines ersten (zusammengesetzten)
Primers, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt; (c) eines
zweiten Primers, der an ein Extensionsprodukt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbar ist; (d) einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase; (e)
einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase; (f) eines Agens (wie ein Enzym), das die RNA von
einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (g) Desoxyribonukleosidtriphosphate
oder geeigneter Analoga (die markiert oder unmarkiert sein können). In
Anwendungsformen, die eine Transkription einbeziehen (d.h. verstärkte Verfahren),
sind folgende ebenfalls in der Amplifikationsreaktion enthalten
(entweder zum selben Zeitpunkt wie die oben angeführten Komponenten
oder separat zugegeben): (h) ein Propromotor-Polynukleotid, umfassend
einen Propromotor und eine Region, die an ein Hybridisierungsprodukt des
ersten Primers (ein verdrängtes
Primer-Extensionsprodukt) hybridisiert; (i) eine RNA-Polymerase;
und (j) Ribonukleosidtriphosphate oder geeignete Analoga (die markiert
oder unmarkiert sein können).
Die Kombination wird für
eine Primer-Hybridisierung, Primer-Extension, RNA-Abspaltung und
Verdrängung
des ersten Primer-Extensionsprodukts geeigneten Bedingungen ausgesetzt,
wenn dessen RNA abgespalten wird und ein anderer erster Primer an
die von der abgespaltenen RNA frei gemachte Stelle bindet. In Anwendungsformen, die
eine Transkription umfassen, sind die angewandten Bedingungen ebenfalls
für eine
Hybridisierung des Propromotor-Polynukleotids an das verdrängte abgespaltene
erste Primer-Extensionsprodukt, Extension des 3'-Endes des abgespaltenen ersten Primer-Extensionsprodukts
(falls erforderlich), um eine doppelsträngige Promotorregion zu erzeugen,
und eine von dem Promotor gesteuerte RNA-Transkription geeignet.
Wie hier beschrieben und beispielhaft dargestellt kann das oben
erwähnte
Reaktionsgemisch in zwei oder mehrere verschiedene Reaktionsgemische
für getrennte,
im Allgemeinen sequenzielle Inkubationen unterteilt werden, die den
verschiedenen Aspekten des Amplifikationsprozesses entsprechen (siehe
beispielsweise Beispiel 1).
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Bei
einem anderen Aspekt der Amplifikationsverfahren dienen Fragmente
der Ziel-RNA als
ein Primer für
die Synthese des zweiten DNA-Strangs. Die Ziel-RNA in dem anfänglichen
Komplex, umfassend die Ziel-RNA und das Extensionsprodukt des zu sammengesetzten
Primers, wird mit einem Agens (wie RNase H) gespalten, so dass wenigstens
ein Fragment der Template-RNA an dem ersten Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert verbleibt. Bei diesem Aspekt der Erfindung dient ein
(oder mehrere) Fragment(e) der Template-RNA als ein „zweiter" Primer in der oben
beschriebenen Art und Weise, um ein Extensionsprodukt des Fragments zu
erzeugen, das dieselbe Funktion wie das zweite Primer-Extensionsprodukt
in den oben beschriebenen Amplifikationsverfahren besitzt.
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In
einigen Anwendungsformen stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
wenigstens einer Kopie einer Polynukleotidsequenz bereit, die zu
einer RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, umfassend Vereinigen
und Reagieren des folgenden: (a) eines Komplexes aus ersten und
zweiten Primer-Extensionsprodukten; (b) eines ersten (zusammengesetzten)
Primers, umfassend einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt; (c) einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase;
(d) eines Agens (wie ein Enzym), das die RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet; und (e) Desoxyribonukleosidtriphosphate oder geeigneter
Analoga (die markiert oder unmarkiert sein können). In Anwendungsformen,
die eine Transkription einbeziehen, sind folgende ebenfalls in der
Amplifikationsreaktion enthalten (entweder zum selben Zeitpunkt
wie die oben angeführten Komponenten
oder separat zugegeben): (f) ein Propromotor-Polynukleotid, umfassend einen Propromotor
und eine Region, die an ein Hybridisierungsprodukt des ersten Primers
(ein verdrängtes
Primer-Extensionsprodukt) hybridisiert; (g) eine RNA-Polymerase;
und (h) Ribonukleosidtriphosphate oder geeignete Analoga (die markiert
oder unmarkiert sein können).
Die Kombination wird für
eine Primer-Hybridisierung, Primer-Extension, RNA-Abspaltung und
Verdrängung
des ersten Primer-Extensionsprodukts geeigneten Bedingungen ausgesetzt,
wenn dessen RNA abgespalten wird und ein anderer erster Primer an
die von der abgespaltenen RNA frei gemachte Stelle auf dem zweiten
Primer-Extensionsprodukt bindet. In Anwendungsformen, die eine Transkription
einbeziehen, sind die angewandten Bedingungen ebenfalls für eine Hybridisierung
des Propromotor-Polynukleotids an das verdrängte abgespaltene erste Primer-Extensionsprodukt,
Extension des 3'-Endes des
abgespaltenen ersten Primer-Extensionsprodukts (falls erforderlich),
um eine doppelsträngige
Promotorregion zu erzeugen, und eine von dem Promotor gesteuerte
RNA-Transkription geeignet.
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Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung
einzelsträngiger
Antisense- und Sense-DNA-Kopien einer RNA-Sequenz von Interesse
unter Verwendung eines ersten zusammengesetzten Primers, eines zweiten
zusammengesetzten Primers (als der „reverse zusammengesetzte" Primer bezeichnet)
und eines Ziel-RNA-Fragments bereit. Das Verfahren umfasst folgendes:
(a) Bildung einer doppelsträngigen
cDNA, umfassend einen RNA-DNA-Heteroduplex an jedem Ende der doppelsträngigen cDNA;
und (b) die lineare Amplifikation der Erststrang-(Sense)-cDNA und Zweitstrang-(Antisense)-cDNA
durch eine Primerextension von zwei zusammengesetzten Primern und
Strangverdrängung.
Das einzelsträngige
Produkt der Erst- und Zweitstrang-cDNA wird erzeugt. Dieses Produkt
ist z.B. für
die Erzeugung von cDNA-Bibliotheken zweckdienlich. Es ist bei diesem
Aspekt der Erfindung offensichtlich, dass das Extensionsprodukt
des zweiten Primers von einem zusammengesetzten Primer gestartet
wird.
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Die
Verfahren der Erfindung umfassen Verfahren, die amplifizierte Produkte
nutzen, (sogenannte „Anwendungen"). In einigen Anwendungsformen
stellt die Erfindung Verfahren zur Sequenzierung von RNA-Sequenzen
bereit. Für
Sequenzierungsverfahren, die auf hier beschriebene Verfahren beruhen,
wo DNA das amplifizierte Produkt ist, werden geeignete dNTPs oder
Analoga davon, die markiert oder unmarkiert sein können, verwendet.
Für Sequenzierungsverfahren,
die auf hier beschriebene Verfahren beruhen, wo RNA das amplifizierte
Produkt ist, werden geeignete rNTPs oder Analoga davon, die markiert
oder unmarkiert sein können, verwendet.
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In
anderen Anwendungsformen stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis
von Mutationen der Nukleinsäuresequenz
bereit. In einer Anwendungsform werden die amplifizierten Produkte
verwendet, um einen Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus nachzuweisen und/oder
zu identifizieren.
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Die
Erfindung stellt Verfahren zur Charakterisierung (zum Beispiel Nachweis
der Anwesenheit oder Abwesenheit von und/oder Quantifizierung) einer
RNA-Sequenz von Interesse durch Erzeugung von DNA- oder RNA-Produkten
unter Anwendung von Amplifikationsverfahren der Erfindung und Analyse
der Produkte mit Nach weis/Quantifizierungsverfahren bereit, wie
diejenigen, die auf Array-Technologien oder Flüssigphasen-Technologien basieren.
Diese amplifizierten Produkte können
markiert oder unmarkiert sein.
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In
einer noch weiteren Anwendungsform stellt die Erfindung Verfahren
zum Immobilisieren von Nukleinsäuren
bereit, einschließlich
Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays von Nukleinsäuren (DNA
oder RNA) unter Verwendung von amplifizierten Produkten der Amplifikationsverfahren
der Erfindung.
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In
einer weiteren Anwendungsform stellt die Erfindung Verfahren zur
Erzeugung von cDNA-Bibliotheken, Verfahren zur Erzeugung subtraktiver
Hybridisierungssonden und Verfahren zur Erzeugung subtraktiver Hybridisierungsbibliotheken
bereit.
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Verschiedene
Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Genexpressionslevels sind
in den letzten Jahren entwickelt worden. Zum Beispiel ermöglichen
Mikroarrays, in denen entweder definierte cDNAs oder Oligonukleotide
an diskreten Stellen, zum Beispiel auf festen oder halbfesten Substraten oder
auf definierten Partikeln immobilisiert sind, den Nachweis und/oder
die quantitative Bestimmung der Expression einer Vielzahl an Genen
in einer gegebenen Probe.
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Die
Anwendung dieser bereits bekannten Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit
oder Abwesenheit von und/oder zur Quantifizierung vieler mRNA-Spezies
in einer Probe, die wiederum als Maß des Genexpressionsprofilings
verwendet wird, erfordert im Allgemeinen ein direktes Markieren
von cDNA, das eine große Menge
von einzusetzender Gesamt-RNA erfordert, zum Teil weil die mRNA
nur eine kleine Teilmenge des Gesamt-RNA-Pools darstellt. Wenn Gesamt-RNA-Präparate von
einer gegebenen Zell- oder Gewebeprobe verwendet werden, erfordert
folglich die Analyse der Genexpression in der Probe unter Anwendung
von Verfahren, wie Arrays, eine wesentliche Menge an einzusetzender
RNA, die im Allgemeinen im Bereich von 50 bis 200 μg liegt. Ähnlicherweise
wären im
Allgemeinen 2 bis 5 μg
mRNA, aus einem Gesamt-RNA-Präparat
aufgereinigt, für
eine einzige Analyse des Genexpressionsprofils bei Anwendung von
Array-Technologien erforderlich. Dies bedeutet eine eindeutige Beschränkung für solche
Verfahren, die auf der Array-Technologie basieren, insofern als
die benötigte
Zellzahl oder Größe der Gewebeprobe
sehr groß ist
und diese Zell- oder
Gewebeproben oftmals kaum für
ein Testen zur Verfügung
stehen oder zu wertvoll sind. Diese Beschränkung ist besonders bei der
Untersuchung klinischer Proben, wo die zu untersuchenden Zellen
selten und/oder schwierig in vitro zu kultivieren sind, und bei
Hochdurchsatz-Durchmusterung von Bibliotheken von Effektormolekülen besonders
besauerlich. Ebenfalls sind die vorigen Transkriptions-gestützten Verfahren
der Amplifikation von mRNA (zum Beispiel in Lockhart et al., Nature
Biotechnology (1996), 14, 1675-1680); van Gelder et al.,
U.S. Patent Nr. 5.716.783 ,
beschrieben) hinsichtlich der Amplifikationseffizienz von DNA-abhängigen RNA-Polymerasen
begrenzt und einige dieser Verfahren erfordern mehrere Schritte.
Darüber
hinaus ist der Prozess, bei dem die Polymerase-Promotorsequenz eingebaut
wird, für
eine unspezifische Amplifikation anfällig.
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Die
Verfahren der Erfindung bieten die Möglichkeit, mRNA unter Bedingungen
zu amplifizieren, die für eine
hochspezifische Ziel-Amplifikation sorgen, und geben im Allgemeinen
die Verteilung der eingesetzten RNA wieder. Folglich sollte der
Nutzen der Nachweis/Quantifizierungsverfahren stark verbessert sein,
die mit den Amplifikationsprodukten angewandt werden können, wie
diejenigen Verfahren, die auf der leistungsfähigen Array-Technologie, Echtzeit-PCR,
quantitativen TaqMan, quantitativen PCR unter Verwendung von molekularen
Leuchtsignalen und dergleichen basieren.
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Der
lineare Aspekt der Amplifikationsverfahren der Erfindung wächst signifikant
mit der Spezifität
der Ziel-Amplifikation. Da die Erzeugung vielfacher Kopien einer
Sequenz von Interesse von einer zyklischen, exponentiellen Amplifikation
von Amplifikationsprodukten weder abhängig ist noch darauf beruht,
ist die Spezifität von
der erhaltenen Produkten stark verbessert. Die Verteilung der verschiedenen
Spezies amplifizierter Produkte gibt im Allgemeinen die Verteilung
der eingesetzten RNA wieder.
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Die
Verfahren der Erfindung erfordern keine Thermozyklisierung und die
gesamten Schritte können isotherm
ausgeführt
werden, obwohl die verschiedenen Schritte bei verschiedenen Temperaturen
ausgeführt werden
können.
Dieses Merkmal liefert zahlreiche Vorteile, einschließlich einer
Erleichterung der Automatisierung und An passung für Hochdurchsatzverfahren.
Die isotherme Reaktion ist schneller als die Reaktion, die mit Hilfe
einer Thermozyklisierung erhalten wird, und ist für die Durchführung der
Verfahren der Erfindung in miniaturisierten Vorrichtungen geeignet.
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Der
intermediäre
doppelsträngige
cDNA-Komplex, umfassend einen RNA/DNA-Heteroduplex, liefert ein Substrat für eine lineare
Amplifikation. Die Abspaltung des RNA-Abschnitts vom RNA/DNA-Heteroduplex lässt eine
weitere Amplifikation zu, ohne den intermediären doppelsträngigen cDNA-Komplex
denaturieren zu müssen.
Darüber
hinaus ist es weniger wahrscheinlich, dass die Sekundärstruktur
eines einzelsträngigen
Templates mit der nachfolgenden Amplifikation interferiert, da der
abgespaltene doppelsträngige
cDNA-Komplex größtenteils
doppelsträngig
ist.
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Schließlich erzeugen
die meisten Verfahren der Erfindung Produkte, die einzelsträngig sind,
was sie für
ein Binden an Sonden zugänglicher
macht, entweder auf homogene Weise, d.h. in Lösung, oder für ein Binden
an Sonden, die auf festen Trägem
immobilisiert sind. Die doppelsträngigen Produkte der Verfahren
der Erfindung sind, zum Beispiel für die Herstellung von DNA-Bibliotheken,
zweckdienlich.
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Die
Fähigkeit
zur effizienten Amplifikation von mRNA (oder jeder anderen erwünschten
RNA-Spezies oder Population) unter Bedingungen, die für eine hochspezifische
Ziel-Amplifikation sorgen und die im Allgemeinen die Repräsentation
der verschiedenen mRNA-Spezies in dem Präparat nicht verändern, verbessert sehr
stark den Nutzen der Nachweis/Quantifizierungsverfahren, wie derjenigen
Verfahren, die auf einer leistungsfähigen Array-Technologie gestützt sind.
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Allgemeine Techniken
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Bei
der praktischen Umsetzung der Erfindung werden, außer anderes
ist angegeben, herkömmliche Techniken
der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken),
Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie eingesetzt,
die im Rahmen der Fachkenntnisse liegen. Derartige Techniken sind
in der Literatur, wie „Molecular
Cloning: A Laborstory Manual",
zweite Ausgabe (Sambrook et al., 1989); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed.,
1984); „Animal
Cell Culture" (R.
I. Freshney, ed., 1987); „Methods
in Enzymology" (Academic
Press, Inc.); „Current
Protocols in Molecular Biology" (F.
M. Ausubel et al., eds., 1987, und regelmäßige Aktualisierungen); „PCR: The
Polymerase Chain Reaction",
(Mullis et al., eds. 1994). umfassend beschrieben.
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In
der Erfindung eingesetzte Primer, Oligonukleotide und Polynukleotide
können
unter Anwendung in der Technik bekannter Standardtechniken hergestellt
werden.
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Definitionen
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Eine „Zielsequenz", „Zielnukleinsäure" oder „Ziel-RNA", wie hier verwendet,
ist ein Polynukleotid, umfassend eine Sequenz von Interesse, für die eine
Amplifikation erwünscht
ist. Die Zielsequenz kann, bezüglich ihrer
tatsächlichen
Sequenz, eine bekannte oder unbekannte Sequenz sein. In einigen
Fällen
werden die Ausdrücke „Ziel", „Template" oder Variationen
davon austauschbar verwendet.
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„Amplifikation" oder „Amplifizieren", wie hier verwendet,
bezeichnet im Allgemeinen den Prozess der Erzeugung vielfacher Kopien
einer erwünschten
Sequenz. „Vielfache
Kopien" bedeutet
wenigstens 2 Kopien. Eine „Kopie" bedeutet nicht notwendigerweise
vollkommene Sequenzkomplementarität oder -identität zu der Sequenz
des Templates. Zum Beispiel können
Kopien Nukleotidanaloga, wie Desoxyinosin, beabsichtigte Sequenzänderungen
(wie Sequenzänderungen,
die durch einen Primer eingeführt
sind, der eine Sequenz umfasst, die an das Template hybridisierbar
ist, aber nicht zu diesem komplementär ist, oder eine Nichtzielsequenz,
die durch einen Primer eingeführt
ist) und/oder Sequenzfehler, die während der Amplifikation erfolgen, umfassen.
Das „Amplifizieren" einer Sequenz kann
im Allgemeinen die Herstellung von Kopien einer Sequenz oder ihres
Komplements bezeichnen, unter der Bedingung, dass, wie oben angeführt, das
Kopieren nicht notwendigerweise eine vollkommene Sequenzkomplementarität oder -identität bezüglich der
Templatesequenz bedeutet.
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„Polynukleotid" oder „Nukleinsäure", wie hier austauschbar
verwendet, bezeichnen Polymere von Nukleotiden einer beliebigen
Länge und
umfassen DNA und RNA. Die Nukleotide können Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide,
modifizierte Nukleotide oder Basen und/oder ihre Analoga oder ein
beliebiges Substrat sein, das in ein Po lymer von einer DNA- oder
RNA-Polymerase eingebaut werden kann. Ein Polynukleotid kann modifizierte
Nukleotide, wie methylierte Nukleotide und ihre Analoga, umfassen.
Sofern vorhanden, kann eine Modifikation der Nukleotidstruktur vor
oder nach dem Zusammenfügen
des Polymers erfolgen. Die Sequenz der Nukleotide kann durch Nichtnukleotid-Komponenten
unterbrochen sein. Außerdem
kann ein Polynukleotid nach einer Polymerisation, wie durch Konjugation
mit einer markierenden Komponente, modifiziert werden. Weitere Arten
von Modifikationen umfassen zum Beispiel „Caps", eine Substitution eines oder mehrerer
natürlich
vorkommender Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotidmodifikationen,
wie zum Beispiel solche mit ungeladenen Bindungen (z.B. Methylphosphonate,
Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen
Bindungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate, etc.), solche,
die Pendant-Komponenten enthalten, zum Beispiel Proteine (z.B. Nukleasen,
Toxine, Antikörper,
Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), solche mit interkalierenden
Substanzen (z.B. Acridin, Psoralen, etc.), solche, die Chelatoren
enthalten (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle,
etc.), solche, die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten
Bindungen (z.B. alpha anomere Nukleinsäuren, etc.), wie auch nichtmodifizierte
Formen des oder der Polynukleotide. Außerdem kann jede beliebige
Hydroxylgruppe, die normalerweise in den Zuckern vorhanden ist,
ersetzt werden durch beispielsweise Phosphonatgruppen, Phosphatgruppen,
die mit Standardschutzgruppen geschützt werden, oder aktiviert
werden, um weitere Bindungen zu zusätzlichen Nukleotiden herzustellen,
oder an feste Träger
gebunden werden können.
Die 5'- und 3'-terminale OH-Gruppe
kann phosphoryliert oder mit Aminen oder organischen Capping-Gruppenresten
mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen substituiert werden. Weitere Hydroxyle
können
ebenfalls zu Standardschutzgruppen derivatisiert werden. Polynukleotide
können
ebenfalls analoge Formen von Ribose- oder Desoxyribosezuckern enthalten,
die im Allgemeinen in der Technik bekannt sind, einschließlich zum
Beispiel 2'- -O-Methyl-,
2'-O-Allyl-, 2'-Fluor- oder 2'-Azidoribose, carbocyclischer Zuckeranaloga, α-anomerer
Zucker, epimerer Zucker, wie Arabinose, Xylosen oder Lyxosen, Pyranosezucker, Furanosezucker,
Sedoheptulosen, acyclischer Analoga und abasischer Nukleosidanaloga,
wie Methylribosid. Eine oder mehrere Phosphodiesterbindungen können durch
alternative bindende Gruppen ersetzt sein. Diese alternativen bindenden
Gruppen umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Anwendungsformen, wo Phosphat
durch P(O)S („Thioat"), P(S)S („Dithioat"), (O)NR2 („Amidat"), P(O)R, P(O)OR', CO oder CH2 (Formacetal") ersetzt ist, in denen jeweils R oder
R' unabhängig voneinander
H oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (1-20 C), das
gegebenenfalls eine Ether-(-O-)-Bindung
enthält,
Aryl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Araldyl ist. Nicht
alle Bindungen in einem Polynukleotid müssen identisch sein. Die vorangehende
Beschreibung ist auf alle hier genannten Polynukleotide anwendbar,
einschließlich
RNA und DNA.
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Ein „markiertes
dNTP" oder „markiertes
rNTP", wie hier
verwendet, bezeichnet ein dNTP oder rNTP oder Analoga davon, das
an eine Markierung direkt oder indirekt gebunden ist. Zum Beispiel
kann ein „markiertes" dNTP oder rNTP zum
Beispiel mit einem Farbstoff und/oder einer detektierbaren Komponente,
wie einem Element eines spezifischen bindenden Paars (wie Biotin-Avidin),
direkt markiert sein. Ein „markiertes" dNTP oder rNTP kann
ebenfalls indirekt über
seine Befestigung an, zum Beispiel eine Komponente, an die eine
Markierung angeheftet ist/sein kann, markiert sein. Ein dNTP oder
rNTP kann einen Molekülrest
(zum Beispiel eine Aminogruppe) umfassen, an den eine Markierung
nach dem Einbau des dNTP oder rNTP in ein Extensionsprodukt angeheftet
wird. Zweckdienliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung
umfassen fluoreszierende Farbstoffe (z.B. Fluoresceinisothiocyanat,
Texas Red, Rhodamin, grün
fluoreszierendes Protein und dergleichen), Radioisotope (z.B. 3H, 35S, 32P, 33P, 125I oder 14C), Enzyme
(z.B. LacZ, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase), Digoxigenin
und kolorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder farbige Glas-
oder Kunststoffkügelchen
(z.B. aus Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.). Verschiedene Antiliganden
und Liganden können
verwendet werden (als Markierungen selbst oder als ein Mittel zum
Anheften einer Markierung). Im Falle eines Liganden, der einen natürlichen
Antilagend besitzt, wie Biotin, Thyroxin und Cortisol, kann der
Ligand zusammen mit markierten Antiliganden verwendet werden.
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Der „Typ" dNTP oder rNTP,
wie hier verwendet, bezeichnet die bestimmte Base eines Nukleotids,
nämlich
Adenin, Cytosin, Thymin, Uridin oder Guanin.
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„Oligonukleotid", wie hier verwendet,
bezeichnet im Allgemeinen kurze, im Allgemeinen einzelsträngige, im
Allgemeinen synthetische Polynukleotide, die im Allgemei nen, aber
nicht notwendigerweise, weniger als 200 Nukleotide lang sind. Oligonukleotide
in der Erfindung umfassen zusammengesetzte Primer und Propromotor-Polynukleotide (wie
das PTO). Die Ausdrücke „Oligonukleotid" und „Polynukleotid" schließen sich
gegenseitig nicht aus. Die obere Beschreibung für Polynukleotide ist für Oligonukleotide
gleich und voll anwendbar.
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Ein „Primer", wie hier verwendet,
bezeichnet eine Nukleotidsequenz, im Allgemeinen mit einer freien 3'-OH-Gruppe, die mit
einer Templatesequenz (wie einer Ziel-RNA, oder einem Primer-Extensionsprodukt)
hybridisiert und die Fähigkeit
besitzt, die Polymerisierung eines Polynukleotids zu fördern, das
zum Template komplementär
ist. Ein „Primer" kann zum Beispiel
ein Oligonukleotid sein. Er kann ebenfalls zum Beispiel eine Sequenz
des Templates (wie ein Primer-Extensionsprodukt oder ein Fragment
des Templates, das nach einer RNase-Spaltung eines Template-DNA-Komplexes gebildet
wird) sein, die an eine Sequenz in dem Template selbst (zum Beispiel
als eine Haarnadelschleife) hybridisiert wird, und die die Fähigkeit
besitzt, eine Nukleotidpolymerisierung zu fördern. Folglich kann ein Primer
ein exogener Primer (d.h. zugefügter
Primer) oder ein endogener Primer (z.B. Template-Fragment) sein.
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Ein „Zufallsprimer", wie hier verwendet,
ist ein Primer, der eine Sequenz umfasst, die nicht notwendigerweise
basierend auf einer bestimmten oder spezifischen Sequenz in einer
Probe, sondern eher basierend auf einer statistischen Erwartung
(oder einer empirischen Beobachtung) konstruiert ist, so dass die
Sequenz des Zufallsprimers an eine oder mehrere Sequenzen in der
Probe (unter einer gegebenen Reihe an Bedingungen) hybridisierbar
ist. Die Sequenz eines Zufallsprimers (oder seines Komplements)
kann eine natürlich
vorkommende Sequenz sein oder nicht, oder kann in einem Pool von
Sequenzen in einer Probe von Interesse vorkommen oder nicht. Die
Amplifikation einer Vielzahl an RNA-Spezies in einem einzigen Reaktionsgemisch würde im Allgemeinen,
aber nicht notwendigerweise, eine Vielzahl, bevorzugt eine große Vielzahl,
an Zufallsprimer verwenden. Wie es in der Technik verstanden wird,
kann ein „Zufallsprimer" ebenfalls einen
Primer bezeichnen, der ein Element einer Population von Primern
ist (eine Vielzahl an Zufallsprimern), die insgesamt konstruiert
sind, um an eine erwünschte
und/oder eine signifikante Anzahl an Zielsequenzen zu hybridisieren. Ein
Zufallsprimer kann an viele Stellen auf einer Nukleinsäuresequenz
hybridisieren. Die Verwendung von Zufallsprimer stellt ein Verfahren
zur Erzeugung von Primer-Extensionsprodukten bereit, die zu einem
Zielpolynukleotid komplementär
sind, wobei das Verfahren nicht die vorherige Kenntnis der genauen
Sequenz des Ziels erfordert.
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„Protopromotorsequenz" und „Propromotorsequenz", wie hier verwendet,
bezeichnet eine einzelsträngige
DNA-Sequenzregion, die in doppelsträngiger Form in der Lage ist,
die RNA-Transkription zu vermitteln. In manchen Zusammenhängen werden „Protopromotorsequenz", „Protopromotor", „Propromotorsequenz", „Propromotor", „Promotorsequenz" und „Promotor" austauschbar verwendet.
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Ein „Propromotor-Polynukleotid", wie hier verwendet,
bezeichnet ein Polynukleotid, umfassend eine Propromotorsequenz.
Beispiele für
ein Propromotor-Polynukleotid ist ein Propromotor-Template-Oligonukleotid
(PTO).
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„Propromotor-Template-Oligonukleotid
(PTO)" und „Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO)", wie hier verwendet,
bezeichnen ein Oligonukleotid, das eine Propromotorsequenz und einen
Abschnitt, im Allgemeinen einen 3'-Abschnitt, umfasst, der (unter einer
gegebenen Reihe an Bedingungen) an die 3'-Region eines Primer-Extensionsprodukts
hybridisierbar ist. Die Propromotorsequenz und der hybridisierbare
Abschnitt können
die gleichen, unterschiedliche oder überlappende Nukleotide eines
Oligonukleotids sein.
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„Hemmen" heißt Vermindern
oder Reduzieren einer Aktivität,
Funktion und/oder Menge im Vergleich mit einer Referenz.
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Ein „Komplex" ist ein Zusammenlagerung
von Komponenten. Ein Komplex kann stabil sein oder nicht und kann
direkt oder indirekt nachgewiesen werden. Wie es hier beschrieben
ist, kann zum Beispiel aus bestimmten gegebenen Komponenten einer
Reaktion und der Art des Produkts oder der Produkte der Reaktion das
Vorliegen eines Komplexes gefolgert werden. Im Sinne der Erfindung
ist ein Komplex im Allgemeinen ein Intermediat bezüglich des/der
Endprodukte der Amplifikation. Ein wei teres Beispiel für einen
Komplex ist ein Nukleinsäureduplex,
umfassend ein erstes Primer-Extensionsprodukt und ein zweites Primer-Extensionsprodukt.
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Ein „Abschnitt" oder eine „Region", wie hier austauschbar
verwendet, eines Polynukleotids oder Oligonukleotids ist eine zusammenhängende Sequenz
aus zwei oder mehr Basen. In anderen Anwendungsformen besteht eine
Region oder ein Abschnitt aus wenigstens etwa 3, 5, 10, 15, 20,
25 zusammenhängenden Nukleotiden.
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Eine
Region, ein Abschnitt oder eine Sequenz, der/die zu einer anderen
Sequenz „benachbart" ist, grenzt direkt
an diese Region, Abschnitt oder Sequenz. Zum Beispiel grenzt ein
RNA-Abschnitt, der zu einem 5'-DNA-Abschnitt
eines zusammengesetzten Primers benachbart ist, direkt an diese
Region. Zur Veranschaulichung dieses Beispiels siehe 1A und 2A.
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Ein „Reaktionsgemisch" ist ein Gemenge
von Komponenten, die unter geeigneten Bedingungen reagieren, um
einen Komplex (der ein Intermediat sein kann) und/oder ein Produkt(e)
zu bilden.
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„Ein", „eine" und „der", „die", „das" und dergleichen
schließen
die Pluralformen mit ein, außer
anderes ist angegeben. „Ein" Fragment bedeutet
ein oder mehrere Fragmente.
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„Umfassen" heißt einschließen.
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Bedingungen,
die ein zu geschehendes Ereignis „zulassen", oder Bedingungen, die für ein zu
geschehendes Ereignis „geeignet" sind, wie Hybridisierung,
Strangextension und dergleichen, oder „geeignete" Bedingungen sind Bedingungen, die nicht
verhindern, dass ein derartiges Ereignis eintritt. Folglich erlauben,
verstärken,
fördern
diese Bedingungen das Ereignis und/oder sind ihm dienlich. Derartige
Bedingungen, die in der Technik bekannt und hier beschrieben sind,
hängen
zum Beispiel von der Art der Nukleotidsequenz, Temperatur und Pufferbedingungen
ab. Diese Bedingungen sind ebenfalls davon abhängig, welches Ereignis, wie
Hybridisierung, Spaltung, Strangextension oder Transkription erwünscht ist.
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Eine „Mutation" einer Sequenz, wie
hier verwendet, bezeichnet eine beliebige Sequenzänderung
in einer Sequenz von Interesse im Vergleich mit einer Referenzsequenz.
Eine Referenzsequenz kann eine Wildtyp-Sequenz oder eine Sequenz
sein, mit der man eine Sequenz von Interesse vergleichen möchte. Eine
Sequenzmutation umfasst einzelne Nukleotidänderungen oder Änderungen
von mehr als einem Nukleotid in einer Sequenz aufgrund von Mechanismen,
wie eine Substitution, Transversion, Deletion oder Insertion. Ein
Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP), wie hier verwendet, ist ebenfalls
eine Sequenzmutation.
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„Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus" und „SSCP", wie hier verwendet,
bezeichnen im Allgemeinen die spezifische Konformation einer einzelsträngigen Nukleinsäure, wie
sie durch ihre spezifische Nukleinsäuresequenz beeinflusst wird.
Eine Änderung
der Sequenz des einzelsträngigen
Polynukleotids, wie eine einzelne Nukleotidsubstitutionen, -deletionen
oder -insertionen führen
zu einer Änderung
oder einem Polymorphismus der Konformation des einzelsträngigen Polynukleotids.
Die Konformation des Polynukleotids ist im Allgemeinen nachweisbar,
identifizierbar und/oder unterscheidbar mit Hilfe in der Technik
bekannter Verfahren, wie elektrophoretische Mobilität, wie sie
mit Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese und/oder Empfindlichkeit
für einen
Endonuklease-Verdau bestimmt wird.
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„Mikroarray" und „Array", wie hier austauschbar
verwendet, umfassen eine Oberfläche
mit einem Array, vorzugsweise einem geordneten Array, von mutmaßlichen
bindenden Stellen (z.B. durch Hybridisierung) für eine biochemische Probe (Ziel),
das oftmals unbestimmte Charakteristika aufweist. In einer bevorzugten Anwendungsform
bezeichnet Mikroarray eine Ansammlung verschiedener Polynukleotid- oder Oligonukleotidsonden,
die an definierten Positionen auf einem Substrat immobilisiert sind.
Arrays werden auf Substraten gebildet, die aus Materialien wie Papier,
Glas, Kunststoff (z.B. Polypropylen, Nylon, Polystyrol), Polyacrylamid, Nitrocellulose,
Silikon, optischer Faser oder einem beliebigen anderen geeigneten
festen oder halbfesten Träger
herstellt sind und in planarer (z.B. Glasplatten, Siliziumchips)
oder dreidimensionalener (z.B. Nadeln, Fasern, Kügelchen, Partikel, Mikroplattenvertiefungen,
Kapillaren) Konfiguration vorliegen. Die Arrays bildende Sonden
kön nen
an das Substrat mit Hilfe zahlreicher Möglichkeiten gebunden werden,
einschließlich
(i) in situ Synthese (z.B. hochdichte Oligonukleotid-Arrays) unter
Anwendung photolithographischer Techniken (siehe Fodor et al., Science
(1991), 251:767-773;
Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1994), 91:5022-5026; Lockhart
et al., Nature Biotechnology (1996), 14:1675;
U.S. Pat. Nr. 5.578.832 ;
5.556.752 und
5.510.270 ); (ii) Spotting/Printing
mit mittlerer bis geringer Dichte (z.B. cDNA-Sonden) auf Glas, Nylon
oder Nitrocellulose (Schena et al., Science (1995), 270:467-470;
DeRisi et al., Nature Genetics (1996), 14:457-460; Shalon et al., Genome
Res. (1996), 6:639-645 und Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. (1995), 93:10539-11286);
(iii) mittels Maskieren (Maskos und Southern, Nuc. Acids. Res. (1992),
20:1679-1684) und (iv) mittels Dot-Blotting auf eine Nylon- oder
Nitrocellulose-Hybridisierungsmembran
(siehe z.B. Sambrook et al., eds., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory
Manual, 2. Ausgabe, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laborstory (Cold
Spring Harbor, N.Y.)). Sonden können
ebenfalls auf dem Substrat mittels Hybridisierung an Ankern, mit
Hilfe von magnetischen Kügelchen
oder in flüssiger
Phase, wie in einer Mikroplattenvertiefung oder Kapillaren, nichtkovalent
immobilisiert sein. Die Sondenmoleküle sind im Allgemeinen Nukleinsäuren, wie
DNA, RNA, PNA und cDNA, können
aber ebenfalls Proteine, Polypeptide, Oligosaccharide, Zellen, Gewebe
und beliebige Permutationen davon sein, welche die Zielmoleküle spezifisch
binden können.
-
Der
Ausdruck „3" bezeichnet im Allgemeinen
eine Region oder Position in einem Polynukleotid oder Oligonukleotid
3' (stromabwärts) von
einer anderen Region oder Position im selben Polynukleotid oder
Oligonukleotid.
-
Der
Ausdruck „5'" bezeichnet im Allgemeinen eine Region
oder Position in einem Polynukleotid oder Oligonukleotid 5' (stromaufwärts) von
einer anderen Region oder Position im selben Polynukleotid oder
Oligonukleotid.
-
Die
Ausdrücke „3'-DNA-Abschnitt", „3'-DNA-Region", „3'-RNA-Abschnitt" und „3'-RNA-Region" bezeichnen den Abschnitt oder die Region
eines Polynukleotids oder Oligonukleotids, der/die in Richtung des 3'-Endes des Polynukleotids
oder Oligonukleotids liegt und die äußersten 3'-Nukleotide oder Reste umfassen können oder nicht
umfassen können,
die an das äußerste 3'-Nukleotid des gleichen
Polynukleotids oder Oligonukleotids gebunden sind. Die äußersten
3'-Nukleotide können bevorzugt
etwa 1 bis etwa 50, bevorzugter etwa 10 bis etwa 40, noch bevorzugter
etwa 20 bis etwa 30 Nukleotide umfassen.
-
Die
Ausdrücke „5'-DNA-Abschnitt", „5'-DNA-Region", „5'-RNA-Abschnitt" und „5'-RNA-Region" bezeichnen den Abschnitt oder die Region
eines Polynukleotids oder Oligonukleotids, der/die in Richtung des 5'-Endes des Polynukleotids
oder Oligonukleotids liegt und die äußersten 5'-Nukleotide oder Reste umfassen können oder
nicht umfassen können,
die an das äußerste 5'-Nukleotid des gleichen
Polynukleotids oder Oligonukleotids gebunden sind. Die äußersten
5'-Nukleotide können bevorzugt
etwa 1 bis etwa 50, bevorzugter etwa 10 bis etwa 40, noch bevorzugter
etwa 20 bis etwa 30 Nukleotide umfassen.
-
Der
Fachmann versteht unter einer „Schwanz"-Sequenz eines Primers
eine Sequenz, die nicht an die Zielsequenz unter den Bedingungen
hybridisiert, unter denen andere Regionen oder Abschnitte des Primers an
das Ziel hybridisieren.
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„Abwesend" oder „Abwesenheit" eines Produkts und „fehlender
Nachweis eines Produkts",
wie hier verwendet, umfasst unwesentliche oder minimale Levels,
im Allgemeinen aufgrund einer ausbleibenden signifikanten Anhäufung des
Produkts durch die Zyklisierung.
-
Amplifikationsverfahren der
Erfindung
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Nachfolgend
werden Beispiele der Amplifikationsverfahren der Erfindung angeführt. Es
versteht sich, dass verschiedene weitere Anwendungsformen praktisch
umgesetzt werden können,
die in der oben gegebenen allgemeinen Beschreibung aufgeführt sind.
Zum Beispiel bedeutet die Bezugnahme auf die Verwendung eines zusammengesetzten
Primers, dass ein beliebiger der hier beschriebenen zusammengesetzten
Primer verwendet werden kann.
-
Mit
einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung vielfacher
Kopien (Amplifizierung) einer Polynukleotid-(DNA)-Sequenz, die zu
einer RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, unter Verwendung eines
zusammengesetzten Primers und eines zweiten Primers bereitgestellt.
In diesem Verfahren wird eine isotherme lineare Nukleinsäuresequenz-Amplifikation
unter Verwendung zweier Primer (eines zusammengesetzten Primers
und eines zweiten Primers) und Strangverdrängung erreicht. In einigen
Anwendungsformen ist ein Transkriptionsschritt (d.h. ein „verstärktes" Verfahren) mit eingeschlossen
und das amplifizierte Produkt wird in Form einer Sense-RNA erzeugt.
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Mit
einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien (Amplifizierung) einer DNA-Sequenz, die zu einer
RNA-Sequenz von Interesse komplementär ist, unter Verwendung eines
einzigen Primers (welcher ein zusammengesetzter Primer ist) bereitgestellt.
In diesem Verfahren wird eine isotherme lineare Nukleinsäuresequenz-Amplifikation
unter Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers, eines
Fragments einer Ziel-RNA (welche als ein endogener Primer dient)
und einer Strangverdrängung
erreicht. In einigen Anwendungsformen ist ein Transkriptionsschritt
(d.h. ein „verstärktes" Verfahren) mit eingeschlossen
und das amplifizierte Produkt wird in Form einer Sense-RNA erzeugt.
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Wie
hier beschrieben, können
die Amplifikationsverfahren der Erfindung außerdem einen Transkriptionsschritt
umfassen. Falls ein Primer-Extensionsprodukt, das transkribiert
werden soll, eine Propromotorsequenz umfasst, wird im Allgemeinen
eine doppelsträngige
Promotorregion durch Hybridisieren eines Polynukleotids, umfassend
einen Propromotor (hier ebenfalls als „Propromotor-Polynukleotid" bezeichnet), an
das Primer-Extensionsprodukt erzeugt. Falls ein Primer-Extensionsprodukt
keine erwünschte
Propromotorsequenz umfasst, ist der Transkriptionsschritt im Allgemeinen
von dem Einbau einer RNA-Polymerase-Propromotorsequenz mit Hilfe
eines Propromotor-Polynukleotids, wie eines Promotorsequenz-Oligonukleotids
(PTO), abhängig.
Ein Propromotor-Polynukleotid, wie das PTO, kann als ein Template
für eine
Extension eines einzelsträngigen
Primer-Extensionsprodukts und Bildung eines partiellen Duplexes
dienen, der einen doppelsträngigen Promotor
an einem Ende umfasst. Die Fähigkeit,
das einzelsträngige
Produkt an das Propromotor-Polynukleotid (wie ein PTO) zu hybridisieren,
wird im Allgemeinen durch die Bildung eines Primer-Extensionsprodukts mit
einer definierten 3'-Endsequenz
erreicht, die zu der 3'-Endsequenz des Propromotor-Polynukleotids
komplementär
ist.
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Ein
Aspekt der Verfahren der Erfindung umfasst die Gestaltung von Primern,
die in der Lage sind, an RNA-Sequenzen zu hybridisieren, wie beispielsweise
eine Vielzahl an RNA-Sequenzen, für eine Initiation der Primerextension
und Erzeugung von Amplifikationssubstraten und -produkten.
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Lineare Nukleinsäuresequenz-Amplifikation
unter Verwendung eines zusammengesetzten Primers und eines zweiten
Primers
-
Die
Erfindung stellt Verfahren zum Amplifizieren einer RNA-Sequenz von
Interesse unter Verwendung eines zusammengesetzten Primers und eines
zweiten Primers und Strangverdrängung
bereit. Die Amplifikation mit diesen Verfahren ist linear und kann
isotherm durchgeführt
werden. In Anwendungsformen, die keinen Transkriptionsschritt umfassen,
sind die amplifizierten Produkte einzelsträngige DNA, umfassend Sequenzen, die
zu RNA-Sequenzen von Interesse in der Ziel-RNA komplementär sind.
In Anwendungsformen, die eine Transkription umfassen, sind die amplifizierten
Produkte Sense-RNA-Kopien der RNA-Sequenz von Interesse in der Ziel-RNA.
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Eine
schematische Beschreibung einer Anwendungsform der Verfahren, die
auf dem zusammengesetzten Primer, zweiten Primer und Strangverdrängung basieren,
ist in 1A-B und 2A-C
gegeben. 1A-B veranschaulichen ein nicht
verstärktes
lineares Verfahren. 2A-C veranschaulichen ein verstärktes Verfahren
(d.h. einschließlich
Transkriptionsschritt). Die Verfahren umfassen die folgenden Schritte:
(a) Bildung einer Zweitstrang-cDNA, der den gleichen Sinn wie die
eingesetzte RNA besitzt; (b) lineare Amplifikation des Komplements
eines Zweitstrang-cDNA-Strangs
mittels Primerextension (von einem zusammengesetzten Primer) entlang
der Zweitstrang-cDNA und Strangverdrängung; und in dem verstärkten Verfahren
(c) Transkription des Produkts des linearen Amplifikationsschritts,
um vielfache Kopien von Sense-RNA-Produkten zu erzeugen. Wie gezeigt,
sind alle Schritte iso therm, obwohl die Temperaturen für jeden
Schritt gleich oder verschieden sein können.
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Die
in 1A-B gezeigte Anwendungsform verwendet zwei Oligonukleotide:
einen zusammengesetzten Primer (als 1 bezeichnet),
der für
die Amplifikation verwendet wird, und einen zweiten Primer (als 2 bezeichnet), der für die Bildung
der Sense-Komplement-DNA
(cDNA) (austauschbar „zweites
Extensionsprodukt" oder „Zweitstrang-cDNA" genannt) verwendet
wird. Die in 2A-C gezeigte Anwendungsform
verwendet drei Oligonukleotide: einen zusammengesetzten Primer (als 1 bezeichnet), der für die Amplifikation
verwendet wird, einen zweiten Primer (als 2 bezeichnet), der für die Bildung der Zweitstrang-(Sense)-cDNA
verwendet wird; und ein Polynukleotid, umfassend eine Propromotorsequenz
einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase, d.h. ein Promotor-Template-Oligonukleotid (PTO)
(als 3 bezeichnet).
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Der
3'-Abschnitt des
zusammengesetzten Primers kann auf mehrere Weisen konstruiert werden
(bezüglich
der Sequenz), abhängig
davon, welcher Typ, Klasse, Population und/oder Spezies an RNA amplifiziert werden
soll. In einigen Anwendungsformen umfasst der 3'-Abschnitt des zusammengesetzten Primers 1, wie in 1 und 2 gezeigt, eine Sequenz, die zu dem poly-A-Schwanz
der mRNA komplementär
ist, und kann außerdem
zusätzliche
Zufallssequenzen (die im Allgemeinen zu einer poly-A-Sequenz nicht
komplementär
sind) am 3'-Ende
des 3'-Abschnitts
umfassen. In anderen Anwendungsformen ist der 3'-Abschnitt des zusammengesetzten Primers 1 ein Zufallsprimer, umfassend
Sequenzen, die an eine Vielzahl an RNA-Spezies (die von 2 oder mehr
bis zu mehreren Hundert oder Tausend oder mehr reichen können) hybridisierbar
sind. Zufallsprimer sind in der Technik bekannt, zum Beispiel sind
sie bei der Herstellung von cDNA-Bibliotheken unter Anwendung PCR-gestützter Verfahren
weit verbreitet eingesetzt worden. Wie es in der Technik bekannt
ist, kann ein „Zufallsprimer" einen Primer bezeichnen,
der ein Element einer Primerpopulation (eine Vielzahl an Zufallsprimern)
sein, die insgesamt gestaltet sind, um an eine erwünschte und/oder
eine signifikante Anzahl an Zielsequenzen zu hybridisieren. Ein
Zufallsprimer kann an viele Stellen auf einer Nukleinsäuresequenz
hybridisieren.
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In
anderen Anwendungsformen kann der 3'-Abschnitt des zusammengesetzten Primers 1 eine Sequenz umfassen, die
zu einer spezifischen RNA oder Familie von RNAs (oder Abschnitten
davon) komplementär
ist oder an diese hybridisierbar ist.
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In
einigen Anwendungsformen, wie in 1 und 2 gezeigt, kann der 5'-Abschnitt des zusammengesetzten Primers 1 eine Sequenz sein, die nicht
an die Zielsequenz hybridisierbar ist (unter Bedingungen, bei denen
der 3'-Abschnitt
an das RNA-Ziel hybridisiert), z.B. eine Sequenz, die einen „Schwanz" bildet, wenn der Primer
an ein Ziel hybridisiert ist. Diese „Schwanz"-Sequenz wird im Allgemeinen in das
erste Primer-Extensionsprodukt eingebaut (Erststrang-cDNA) und das
Komplement dieses Schwanzes wird am 3'-Ende des zweiten Primer-Extensionsprodukt
(Zweitstrang-cDNA)
eingebaut. Dementsprechend ist in einigen Anwendungsformen der zusammengesetzte
Primer 1 ein Gemisch aus zusammengesetzten
Primern, die den gleichen 5'-RNA-Abschnitt
und eine Vielzahl an 3'-DNA-Abschnitten
umfassen, die ausgewählt
sind, um eine Vielzahl (die von klein bis zu sehr groß reichen
kann) an RNA-Sequenzen
von Interesse zu amplifizieren. In anderen Anwendungsformen kann
der 5'-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers 1 an
die Ziel-RNA hybridisierbar sein. Obwohl 1 und 2 einen 3'-Abschnitt, der an die Zielsequenz hybridisiert
ist und ein DNA-Abschnitt ist, und einen 5'-Abschnitt, der nicht an das Ziel hybridisiert
ist und ein RNA-Abschnitt ist, zeigen, ist es zu verstehen, dass
DNA-Abschnitte einen Teil eines „Schwanzes" umfassen können, und umgekehrt, dass RNA-Abschnitte
an Ziel-RNA hybridisierbar sein können. Zum Beispiel kann der
5'-RNA-Abschnitt
eines zusammengesetzten Primers teilweise hybridisierbar und teilweise
nicht hybridisierbar sein oder der DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten
Primers kann teilweise hybridisierbar und teilweise nicht hybridisierbar
sein oder beides kann zutreffen.
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Wie
in diesen Figuren gezeigt, umfasst der zusammengesetzte Primer 1 einen DNA-Abschnitt, A, an seinem
3'-Ende und einen
RNA-Abschnitt, B, an seinem 5'-Ende.
Wie es hier diskutiert ist, ist es ebenfalls möglich, einen zusammengesetzten
Primer zu verwenden, bei dem auf den 3'-DNA-Abschnitt in 5'-Richtung ein RNA-Abschnitt folgt, auf
den wiederum ein Abschnitt folgt, der aus DNA besteht. Die Länge jedes
dieser Segmente wird im Allgemeinen durch die maximale Effizienz
für die
Amplifika tion festgelegt. Nur der aus zwei Abschnitten (d.h. 3'-DNA-RNA-5') zusammengesetzte
Primer ist in 1A-B und 2A-C gezeigt.
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Primer 2 kann, muss aber nicht, wie
in 1A-B und 2A-C
gezeigt, aus DNA bestehen und kann zwei Segmente (austauschbar „Abschnitte" oder „Regionen" genannt) umfassen.
Der 3'-Abschnitt,
F, von Primer 2 kann für ein Zufallspriming
von vielen, der meisten und/oder allen möglichen RNA-Sequenzen in einer biologischen
Probe ausgewählt
werden. Zufallsprimer sind in der Technik bekannt und sind zum Beispiel
bei der Herstellung von cDNA-Bibliotheken unter Anwendung PCR-gestützter Verfahren
weit verbreitet eingesetzt worden. Der 5'-Abschnitt, E, von Primer 2 kann eine Sequenz sein, die nicht zu
einer spezifischen Zielsequenz komplementär ist und im Wesentlichen nicht
an diese hybridisierbar ist, d.h. sie würde nicht hybridisieren (unter Bedingungen,
bei denen der 3'-Abschnitt
an das RNA-Ziel hybridisiert) und würde einen Schwanz bilden. Die „Schwanz"-Sequenz würde im Allgemeinen
in das zweite Primer-Extensionsprodukt eingebaut werden und die 3'-Endsequenz des DNA-Produkts der linearen
Amplifikationsschritte würde
im Allgemeinen das Komplement dieser Sequenz umfassen. In anderen
Anwendungsformen kann, falls eine verstärkte Amplifikation nicht erwünscht ist
(wie unten beschrieben), der 5'-Endabschnitt,
E, von Primer 2 an die Zielsequenz
in dem ersten Primer-Extensionsprodukt
hybridisierbar sein.
-
Wie
in 2A-C gezeigt, kann ein Promotor-Template-Oligonukleotid, 3 (PTO), folgendermaßen gestaltet
werden: der 3'-Abschnitt
ist der gleiche wie der Abschnitt E von Primer 2. Diese Gestaltung ermöglicht dem PTO an das 3'-Ende des linearen
Amplifikationsprodukts zu hybridisieren. Der äußerste 5'-Abschnitt des PTO ist eine Promotorsequenz
für eine
DNA-abhängige
RNA-Polymerase, die, wie es oben beschrieben ist, in bestimmten
(nämlich
dem „verstärkten" Verfahren) Anwendungsformen
der Amplifikationsverfahren der Erfindung verwendet wird. Im Allgemeinen
wird die Sequenz zwischen diesen beiden Segmenten für eine optimale
Transkription durch die bevorzugte Polymerase gestaltet. Kriterien
für die
Auswahl und Gestaltung dieser Sequenz sind in der Technik bekannt.
-
Der
Einfachheit halber sind nur ein erstes Primer-Extensionsprodukt
(Erststrang-cDNA)
und Zweitstrang-Primer-Extensionsprodukt (Zweitstrang-cDNA) in 1 und 2 beschrieben
und gezeigt. Es ist zu verstehen, dass die Verfahren der Erfindung
nicht nur zur Erzeugung großer
Mengen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sondern auch für ein gleichzeitiges
Amplifizieren von mehr als einer verschiedenen spezifischen Nukleinsäuresequenz,
die sich auf demselben oder auf verschiedenen Zielnukleinsäuremolekülen befindet,
zweckdienlich sind. Zum Beispiel sind die Verfahren für ein Amplifizieren
aller mRNAs in einer Probe oder für ein Amplifizieren einer Vielzahl
spezifischer RNA-Familien oder RNA-Spezies in einer Probe zweckdienlich.
-
Wie
in 1A-B gezeigt, ist in einer Anwendungsform der
auf RNA basierende Prozess der Amplifikationsverfahren der Erfindung,
der zur Erzeugung von DNA-Produkten
führt,
die zu einer RNA-Sequenz(en) von Interesse komplementäre Sequenzen
umfassen, folgendermaßen:
-
A) Bildung eines doppelsträngigen cDNA-Substrats
für eine
lineare Amplifikation
-
- 1. Primer 1 bindet
an eine RNA-Spezies in einer Probe durch Hybridisierung des Abschnitts
A der Zufallssequenz (die wenigstens zum Teil auf der poly-A-Sequenz der mRNA
basiert), um Komplex I zu bilden (1A).
- 2. Eine reverse Transkriptase (als „RT" bezeichnet), extendiert den hybridisierten
Primer 1 entlang des Ziel-RNA-Strangs,
an den der Primer hybridisiert ist, um einen RNA/DNA-Duplex zu bilden.
RNase H baut den Ziel-RNA-Strang des hybriden Duplexes ab, um eine
einzelsträngige
Erststrang-cDNA (als „II" bezeichnet) zu erzeugen.
Das 5'-Ende von
II ist Primer 1.
- 3. Primer 2 bindet an die
Erststrang-cDNA, II, durch Hybridisierung von Sequenz F, um Komplex
III zu bilden.
- 4. Primer 2 wird entlang
des cDNA-Strangs II durch eine DNA-Plymerase extendiert, um ein
doppelsträngiges
Produkt (als „IV" bezeichnet) zu bilden.
Primerextension entlang des 5'-RNA-Abschnitts
von 2 durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie eine
reverse Transkriptase, führt
zu einer Bildung eines RNA/DNA-Hybridabschnitts an einem Ende von
Komplex IV.
- 5. RNase H baut den RNA-Abschnitt des RNA/DNA-Hybrids an einem
Ende von Komplex IV ab, um einen teilweise doppelsträngigen Komplex
(als Komplex „V" bezeichnet) mit
einem 3'-DNA einzelsträngigen Ende zu
bilden, das eine Sequenz aufweist, die das Komplement von Abschnitt
B des zusammengesetzten Primers 1 ist.
Die RNase H-Aktivität
kann von der RNA-abhängigen
DNA-Polymerase (wie
einer reversen Transkriptase) stammen oder kann von einem separaten
Enzym geliefert werden. Die für
dieses Verfahren zweckdienliche reverse Transkriptase kann entweder
eine RNase H-Aktivität
besitzen oder nicht.
-
B) Isotherme lineare Amplifikation
-
- 1. Primer 1 bindet
an Komplex V durch Hybridisierung des RNA-Abschnitts, B, an das
einzelsträngige DNA-Ende,
das zu diesem komplementär
ist, um den Komplex VI zu bilden. Die 3'-DNA-Sequenz von Primer 1 ist nicht hybridisiert.
- 2. Das 3'-Ende
des gebundenen Primers 1 in
Komplex VI und das 5'-Ende
des DNA-Strangs unmittelbar stromaufwärts sind gleich und konkurrieren
um eine Hybridisierung an den Gegenstrang. Ohne dass wir einer Theorie
folgen wollen, wäre
es zu erwarten, dass die hohe Affinität der DNA-Polymerase für das hybridisierte
3'-Ende eines Primers
das Gleichgewicht der beiden konkurrierenden Strukturen in Richtung
Hybridisierung des 3'-Endes
des neuen Primers und Verdrängung
des 5'-Endes des
vorherigen Primer-Extensionsprodukts (als „VII" bezeichnet) verschiebt. Eine Primerextension
entlang des Zweitstrang-(Sense)-cDNA-Strangs
führt zu
einer Verdrängung
des vorherigen zweiten Primer-Extensionsprodukts
(VII) und repliziert die E-Sequenz von Primer 2, um Komplex VIII zu bilden.
- 3. Komplex VIII besitzt, an einem Ende, ein RNA/DNA-Hybrid,
das aus Sequenz B und seinem Komplement besteht. Das RNA-Segment
des Hybrids wird von RNase H abgebaut, um Komplex IX zu bilden,
was zu der Bildung eines einzelsträngigen 3'-Endes führt, an das ein neuer Primer 1 mit seinem 5'-B-Abschnitt gebunden
werden kann.
- 4. Der Hybridisierungsprozess der 3'-Endsequenz A des gebundenen Primers 1 durch Verdrängung des äußersten
5'-Endes des vorherigen
Primer-Extensionsprodukts in dem Duplex, Primerextension und Verdrängung des
vorherigen Produkts läuft
so weiter ab, wie es in 1A-B
gezeigt ist, und führt
zu einer Anhäufung
von vielfachen Kopien einzelsträngiger
Antisense-DNA-Produkte (als „XII" gekennzeichnet).
Diese Produkte besitzen an ihren 3'-Enden eine Sequenz, die zum Abschnitt
E von Primer 2 komplementär ist, und
an ihren 5'-Enden eine Sequenz,
die im Wesentlichen (im Allgemeinen identisch) mit Sequenz A des zusammengesetzten
Primers identisch ist. Kurn, U.S. Patent Nr. 6.251.639 B1 .
-
Eine
Anwendungsform des verstärkten
Verfahrens ist in 2A-C veranschaulicht. In dieser
Anwendungsform werden im Anschluss an die Erzeugung des DNA-Produkts,
das von einer RNA-Sequenz von Interesse komplementäre Sequenzen
umfasst, die folgenden Schritte ausgeführt:
-
C) Transkription der DNA-Produkte
-
- 1. Ein PTO (siehe 2C)
bindet an DNA-Produkt XII durch Hybridisierung seiner 3'-Endsequenz an die 3'-Endsequenz von DNA-Produkt
XII, um Komplex XIII zu bilden. Das 3'-Ende des PTO wird vorzugsweise, aber
nicht erforderlicherweise, blockiert, so dass es nicht von einer
DNA-Polymerase extendiert werden kann.
- 2. DNA-Polymerase extendiert das 3'-Ende von Produkt XII im Komplex XIII
entlang des PTO-Templates, um Komplex XIV, umfassend eine doppelsträngige Promotorsequenz
an einem Ende, zu bilden.
- 3. DNA-abhängige
RNA-Polymerase bindet an den doppelsträngigen Promotor in Komplex
XIV, um das einzelsträngige
Antisense-DNA-Produkt zu transkribieren, um vielfache Kopien von
Sense-RNA-Produkten (als „XV" bezeichnet) zu erhalten.
Mehrere Spezies von Produkt XV würden
vielfache Kopien mehrerer Sequenzen von einem Pool eingesetzter
RNA repräsentieren.
Kurn, U.S. Patent Nr.
6.251.639 B1 .
-
Die
Verfahren der Erfindung können
zur Erzeugung vielfacher Kopien einer Vielzahl an RNA-Sequenzen
in der Probe verwendet werden. Zum Beispiel kann der zusammengesetzte
Primer eine poly-dT-Sequenz umfassen, von der zu erwarten wäre, dass
sie an die poly-A-Schwänze
sämtlicher
mRNAs in der Probe hybridisiert, oder der zusammengesetzte Primer
kann im Allgemeinen wenigstens einen 3'-Abschnitt umfassen, der an zufällige oder
partiell zufällige
Sequenzen hybridisierbar ist (z.B. der eine poly-dT-Sequenz und
eine Zufallsequenz umfasst, von denen zu erwarten wäre, dass
sie an den Anfang der poly-A-Schwänze von mRNAs hybridisieren).
In einem anderen Aspekt können
die Verfahren der Erfindung zur Erzeugung vielfacher Kopien einer
spezifischen RNA-Spezies oder Klasse von RNA-Spezies (z.B. Familie
oder Superfamilie von RNA-Spezies) verwendet werden. Im diesem letzteren
Fall umfasst der zusammengesetzte Primer im Allgemeinen einen 3'-Abschnitt, der zu
einer Sequenz eines spezifischen RNA-Ziels (oder Familie von RNA-Zielen) komplementär ist.
-
Der
5'-RNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers kann mit der spezifischen RNA-Zielsequenz verwandt
sein oder nicht und kann an das RNA-Ziel hybridisieren oder nicht,
zum Beispiel kann er einen Schwanz bilden, wie es hier zudem beschrieben
ist.
-
Obwohl
nur ein zusammengesetzter Primer in den obigen Anwendungsformen
beschrieben ist, ist es zu verstehen, dass ein anderer zusammengesetzter
Primer in Schritt (b) oben verwendet werden kann. Der andere zusammengesetzte
Primer umfasst Sequenzen, die an den einzelsträngigen DNA-Abschnitt des oben beschriebenen
Komplexes IX hybridisierbar sind. Der zweite zusammengesetzte Primer
kann außerdem
Sequenzen umfassen, die an einen Abschnitt der Sequenzen des zweiten
Primer-Extensionsprodukts unmittelbar 5' zu dem einzelsträngigen DNA-Abschnitt des oben
beschriebenen Komplexes IX hybridisierbar sind. Der zweite zusammengesetzte
Primer umfasst im Allgemeinen mit dem ersten zusammengesetzten Primer überlappende
Sequenzen. Der zweite zusammengesetzte Primer wird an das zweite
Primer-Extensionsprodukt hybridisiert und durch Primerextension
erweitert. Die Abspaltung des DNA-RNA-Heteroduplexes durch eine RNase
lässt ein
Binden eines weiteren zweiten Primers, die Extension und Strangverdrängung zu,
wodurch vielfache Kopien des einzelsträngigen Produkts erzeugt werden.
-
Der
Einfachheit halber sind nur ein erstes Primer-Extensionsprodukt
(Erststrang-cDNA)
und Zweitstrang-Primer-Extensionsprodukt (Zweitstrang-cDNA) in 1 und 2 beschrieben
und gezeigt. Es zu verstehen, dass die Verfahren der Erfindung nicht
nur zur Erzeugung großer
Mengen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sondern auch für ein gleichzeitiges
Amplifizieren von mehr als einer verschiedenen spezifischen Nukleinsäuresequenz,
die sich auf demselben oder auf verschiedenen Zielnukleinsäuremolekülen befinden,
zweckdienlich sind. Zum Beispiel sind die Verfahren für ein Amplifizieren
aller mRNAs in einer Probe oder für ein Amplifizieren einer Vielzahl
an spezifischen RNA-Spezies (in diesem Fall könnte eine Vielzahl an ersten
zusammengesetzten Primern verwendet werden, wobei jeder einen 3'-Abschnitt umfasst, der an spezifischen
Sequenzen spezifischer RNA-Spezies hybridisierbar ist) oder Familien
von RNA-Spezies in einer Probe zweckdienlich.
-
Lineare Nukleinsäuresequenz-Amplifikation
unter Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers und eines
Ziel-RNA-Fragments
-
Die
Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Amplifizieren einer RNA-Sequenz
von Interesse unter Verwendung eines einzigen Primers (der ein zusammengesetzter
Primer ist), eines Ziel-RNA-Fragments und Strangverdrängung bereit.
Die Amplifikation mit diesen Verfahren ist linear und kann isotherm
durchgeführt werden.
In Anwendungsformen, die keinen Transkriptionsschritt einschließen, sind
die amplifizierten Produkte DNA, die zu RNA-Sequenzen von Interesse
in der Ziel-RNA komplementäre
Sequenzen umfassen. In Anwendungsformen, die eine Transkription
einschließen,
sind die amplifizierten Produkte Sense-RNA-Kopien der RNA-Sequenz
von Interesse in der Ziel-RNA.
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Eine
schematische Beschreibung einer nicht verstärkten (linearen) Anwendungsform
der Verfahren der Erfindung, die auf dem einzigen zusammengesetzten
Primer und Strangverdrängung
basieren, wird in den 3A-B bereitgestellt. Das Verfahren
umfasst die folgenden Schritte: (a) Primer-Extension, um einen RNA/DNA-Heteroduplex
aus einer Ziel-RNA und einer Erststrang-cDNA zu bilden; (b) unvollständigen Abbau des
RNA-Ziels des Heteroduplexes, um einen Komplex aus der Erststrang-cDNA und wenigstens
einem RNA-Fragment zu bilden, das wiederum als ein Primer dienen
kann; (c) Bildung einer Zweitstrang-cDNA, die den gleichen Sinn
wie die eingesetzte Ziel-RNA aufweist; (d) lineare Amplifikation
des Komplements einer Zweitstrang-DNA durch Primerextension (von
einem zusammengesetzten Primer) entlang der Zweitstrang-cDNA und
Strangverdrängung,
um vielfache Kopien einzelsträngiger
Antisense-DNA-Produkte zu erzeugen. Wie gezeigt, sind alle Schritte
isotherm, obwohl die Temperatur für jeden der Schritte gleich
oder verschieden sein kann. Eine schematische Beschreibung einer
Anwendungsform von verstärkten
Verfahren der Erfindung, die auf einem einzigen zusammengesetzten
Primer und Strangverdrängung
beruhen, wird in den 4A-B gezeigt. Das Verfahren
umfasst die folgenden Schritte: (a) Primerextension, um einen RNA/DNA-Heteroduplex aus
einer Ziel-RNA und
einer Erststrang-cDNA zu bilden; (b) unvollständigen Abbau des RNA-Ziels
des Heteroduplexes, um einen Komplex aus der Erststrang-cDNA und
wenigstens einem RNA-Fragment zu bilden, das wiederum als ein Primer
dienen kann; (c) Bildung einer Zweitstrang-cDNA, die den gleichen
Sinn wie die eingesetzte Ziel-RNA aufweist; (d) lineare Amplifikation
des Komplements einer Zweitstrang-DNA durch Primerextension (von
einem zusammengesetzten Primer) entlang der Zweitstrang-cDNA und Strangverdrängung, um
vielfache Kopien einzelsträngiger
Antisense-DNA-Produkte
zu erzeugen; und (e) Transkription des Produkts des linearen Amplifikationsschritts,
um vielfache Kopien von Sense-RNA-Produkten zu erzeugen.
-
Ein
zusammengesetzter Primer, wie hier beschrieben, wird für die Amplifikation
in diesen Verfahren verwendet. Wie in den 3A und 4A gezeigt,
kann der einzige (zusammengesetzte) Primer (als „1" bezeichnet) aus einem 3'-DNA-Abschnitt (als „A" bezeichnet), der
zu einer Sequenz auf der Ziel-RNA komplementär ist, und aus einem 5'-RNA-Abschnitt (als „B" bezeichnet) zusammengesetzt
sein, der eine Nichtziel-verwandte Sequenz umfasst (d.h. weder komplementär zu noch
hybridisierbar an eine Sequenz auf der Ziel-RNA ist (unter einer
Reihe gegebener Bedingungen)). Der 3'-DNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers kann poly-dT-Nukleotide umfassen, die ihn komplementär zu oder
hybridisierbar an das poly-A 3'-Ende von
mRNA, die von einer eukaryotischen Zelle stammt, machen (unter einer
Reihe gegebener Bedingungen).
-
Ein
zusammengesetzter Primer, der an eine Ziel-RNA hybridisiert ist,
wird durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
wie eine reverse Transkriptase, extendiert, um einen RNA/DNA-Heteroduplex
aus der Ziel-RNA und einer Erststrang-cDNA zu bilden. Ein Abbau
der Ziel-RNA des Heteroduplexes wird dann unter Verwendung einer
Ribonuklease, wie RNase H, erreicht, um einen Komplex aus der Erststrang-cDNA
und einem oder mehreren RNA-Fragmenten (Oligonukleotiden) zu bilden.
Die RNase H-Aktivität
kann von der RNA-abhängigen
DNA-Polymerase (wie einer reversen Transkriptase) stammen oder kann
von einem separaten Enzym geliefert werden. Für dieses Verfahren zweckdienliche
reverse Transkriptasen können
eine RNase H-Aktivität besitzen
oder nicht. Die Fragmente sind ein Ergebnis eines unvollständigen Abbaus
der Ziel-RNA in dem Heteroduplex. Diese Fragmente fungieren als
Primer für
eine DNA-abhängige
DNA-Polymerase, um einer Zweitstrang-cDNA zu bilden. Okayama & Berg, Molecular
and Cell Biology (1982), 2:161; und Gubler & Hoffman, Gene (1983), 25:263. Die
reverse Transkriptase extendiert dann das 3'-Ende der Zweitstrang-cDNA in dem Duplex
entlang der 5'-RNA-Sequenz
des zusammengesetzten Primer-Extensionsprodukts (der Erststrang-cDNA),
um einen RNA/DNA-Heteroduplex
am Ende des doppelsträngigen
cDNA-Produkts zu bilden.
-
Der
Heteroduplex am Ende der doppelsträngigen cDNA ist ein Substrat
für die
RNase H. Die RNase H baut den 5'-RNA-Abschnitt
der Erststrang-cDNA ab, um eine Stelle für eine Hybridisierung des zusammengesetzten
Primers zu schaffen, der mit seinem 5'-RNA-Abschnitt an das 3'-Ende der Zweitstrang-cDNA
in dem cDNA-Duplex
hybridisiert. Der 3'-Abschnitt
des neuen Primers verdrängt
das 5'-Ende der
Erststrang-cDNA durch Hybridisierung an seine komplementäre Sequenz
auf der Zweitstrang-cDNA. Eine DNA-Polymerase mit einer starken
strangverdrängenden
Aktivität
extendiert dann den neuen Primer entlang der Zweitstrang-cDNA und
verdrängt
das zuvor gebildete cDNA-Produkt. Eine RNase H baut den 5'-Abschnitt des neuen
Primer-Extensionsprodukt in dem Heteroduplex ab, um eine freie Stelle
für eine
Hybridisierung eines neuen zusammengesetzten Primers zu schaffen,
was folglich zu einer kontinuierlichen linearen Amplifikation der
Zielsequenz und Erzeugung vielfacher Kopien eines einzelsträngigen DNA-Produkts
führt,
das gegensinnig zu der Ziel-RNA-Sequenz ist.
-
Wie
in 4A-B dargestellt und wie es aus der Beschreibung
hier hervorgeht, können
die Amplifikationsverfahren mit einem einzigen zusammengesetzten
Primer ebenfalls einen Transkriptionsschritt umfassen, die ein Propromotor-Polynukleotid
auf die selbe Art und Weise verwenden, wie diejenigen Verfahren,
die unter Bezugnahme auf die verstärkten Amplifikationsverfahren,
die einen zusammengesetzten Primer und einen zweiten Primer nutzen,
beschrieben sind.
-
Die
Verfahren der Erfindung können
zur Erzeugung vielfacher Kopien einer Vielzahl an RNA-Sequenzen
in der Probe oder einer spezifischen RNA-Spezies oder Gruppe von
Spezies verwendet werden. Im letzteren Fall umfasst der zusammengesetzte
Primer im Allgemeinen einen 3'-Abschnitt,
der zu einer Sequenz eines spezifischen RNA-Ziels oder Gruppe von
RNA-Zielen komplementär
ist und/oder an diese hybridisierbar ist (z.B. homologe RNA-Ziele
oder Ziele, die Mitglieder einer Familie oder Superfamilie von Sequenzen
sind). Zum Beispiel kann der Primer eine Kollektion von Primersequenzen
umfassen, beispielsweise wo es mehr als eine Zielsequenz gibt.
-
Eine
weitere Anwendung der Verfahren der Erfindung ist der Nachweis von
verschiedenen Regionen, die eine weitverbreitete Sequenz flankieren.
Durch die Gestaltung eines ersten zusammengesetzten Primers, der
eine weitverbreitete Sequenz erkennt, wird ein einzelsträngiges DNA-
oder RNA-Produkt erzeugt, das nicht nur die von dem Primer erkannte
weitverbreitete Sequenz enthält,
sondern auch 5'-flankierende Sequenzen, die
für den
Nachweis von Sequenzvarianten zweckdienlich sind. Folglich kann
zum Beispiel ein einzelsträngiges
DNA- oder RNA-Produkt von einer begrenzten Menge an klinischem Material
hergestellt werden, um eine Identifizierung von Pathogen-spezifischen
Sequenzen (wie solche, die Virus-Typen differenzieren), einen Nachweis
eines genetischen Polymorphismus oder eine Charakterisierung von
veränderten
Spleißvarianten, sämtliches
in Übereinstimmung
mit Standardtechniken, zu gestatten. In anderen Anwendungsformen
wird ein einzelsträngiges
DNA- oder RNA-Produkt erzeugt, das nicht nur die von dem Primer
erkannte weitverbreitete Region, z.B. ein konserviertes oder funktionales
Sequenzmotiv, sondern auch 5'-flankierende
Sequenzen enthält,
die eine Identifizierung von Gruppen von RNA-Spezies gestatten,
die ähnliche
Sequenzmotive umfassen.
-
Der
5'-RNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers kann mit der spezifischen RNA-Zielsequenz verwandt
sein oder nicht und kann an das RNA-Ziel hybridisieren oder nicht.
Verfahren der Erfindung, die zusammengesetzte Primer „mit Schwanz" verwenden, sind
hier zudem beschrieben.
-
Lineare mRNA-Amplifikation
unter Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers und eines Ziel-RNA-Fragments
-
Wie
hier beschrieben, kann Gesamt-mRNA unter Verwendung eines zusammengesetzten
Primers, umfassend ein poly(T) hinreichender Länge für eine Hybridisierung mit im
Wesentlichen einer vollständigen Population
von mRNAs (d.h. poly(T)n, worin n üblicherweise etwa 5 bis etwa
50 oder mehr ist), amplifiziert werden. 5 gibt
eine schematische Darstellung einer nicht verstärkten Anwendungsform der auf
Strangverdrängung
basierenden Verfahren der Erfindung beispielhaft wieder, umfassend
die Verwendung eines einzigen zusammengesetzten Primers, umfassend
einen 3'-DNA-Abschnitt,
umfassend eine poly-dT-Sequenz, und außerdem umfassend eine Zufallssequenz
3' zu der poly-dT-Sequenz.
Der zusammengesetzte Primer 1 umfasst außerdem einen
5'-RNA-Abschnitt,
der im Wesentlichen an die RNA-Zielsequenzen
nicht hybridisierbar ist (d.h. der Primer besitzt unter Bedingungen,
bei denen die poly-dT-Sequenz hybridisiert, einen Schwanz). Wahlweise
kann ein zweiter zusammengesetzter Primer verwendet werden, wie
es unten beschrieben ist.
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Das
Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte: (a) eine Primer-Extension,
um einen RNA/DNA-Heteroduplex aus einer Ziel-RNA und einer Erststrang-cDNA
zu bilden; (b) Bildung eines zweiten Primer-Extensionsprodukts (Zweitstrang-cDNA),
das den gleichen Sinn wie die eingesetzte Ziel-RNA aufweist. Das
zweite Primer-Extensionsprodukt
umfasst im Allgemeinen einen 3'-Abschnitt,
der zu dem 5'-RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers (d.h. zum Schwanz) komplementär ist; (c) eine lineare Amplifikation
des Komplements der Zweitstrang-cDNA durch Primerextension (von
einem zusammengesetzten Primer) und Strangverdrängung, um vielfache Kopien
einzelsträngiger
Antisense-DNA-Produkte (die zu der RNA-Sequenz von Interesse komplementär sind)
zu erzeugen.
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6 gibt eine schematische Darstellung einer
nicht verstärkten
Anwendungsform der auf Strangverdrängung basierenden Verfahren
der Erfindung beispielhaft wieder, umfassend die Verwendung eines
einzigen zusammengesetzten Primers, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt, umfassend
eine Zufallssequenz und außerdem
umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt,
der im Wesentlichen an die RNA-Zielsequenzen nicht hybridisierbar ist
(d.h. der Primer besitzt unter Bedingungen, bei denen die Zufallssequenz
hybridisiert, einen Schwanz). Wahlweise kann ein zweiter zusammengesetzter
Primer verwendet werden, wie es unten beschrieben ist.
-
Das
Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte: (a) eine Primerextension,
um RNA/DNA-Heteroduplexe aus einer Ziel-RNA und einer Erststrang-cDNA
zu bilden; (b) Bildung von zweiten Primer-Extensionsprodukten (Zweitstrang-cDNA),
die den gleichen Sinn wie die eingesetzte Ziel-RNA aufweisen. Das
zweite Primer-Extensionsprodukt
umfasst im Allgemeinen einen 3'-Abschnitt,
der zu dem 5'-RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers (d.h. zum Schwanz) komplementär ist; (c) eine lineare Amplifikation
des Komplements des Sense-DNA-Strangs durch Primerextension von
einem zusammengesetzten Primer und Strangverdrängung, um vielfache Kopien
einzelsträngiger
Antisense-DNA-Produkte zu erzeugen, die zu der RNA-Sequenz von Interesse
komplementär
sind.
-
Wie
in diesen Anwendungsformen dargestellt, sind sämtliche Schritte isotherm,
obwohl die Temperatur für
jeden Schritt gleich oder verschieden sein kann. Es ist zu verstehen,
dass verschiedene weitere Anwendungsformen durchgeführt werden
können,
die in der oben gemachten allgemeinen Beschreibung angeführt sind.
Es ist darüber
hinaus zu verstehen, dass die Bildung eines zweiten Primer-Extensionsprodukts
mit einem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren oder hier
beschriebenen Verfahren erhalten werden kann (z.B. Extension eines
hybridisierten zweiten Primers oder RNA-Fragments).
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Wie
es aus der hier gegebenen Beschreibung ersichtlich ist, können die
Amplifikationsverfahren ebenfalls einen Transkriptionsschritt einschließen, der
ein Propromotor-Polynukleotid
auf die gleiche Art und Weise nutzt, wie es mit Bezug auf die verstärkten Amplifikationsverfahren
beschrieben ist, die einen zusammengesetzten Primer und einen zweiten
Primer nutzen. Die einzelsträngigen
RNA-Produkte der verstärkten
Amplifikationsverfahren würden
im Allgemeinen eine 3'-Region
umfassen, die zu dem 5'-RNA-Abschnitt
des ersten zusammengesetzten Primers komplementär ist.
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7 gibt
eine schematische Darstellung einer verstärkten Anwendungsform der auf
Strangverdrängung
basierenden Verfahren der Erfindung beispielhaft wieder, umfassend
die Verwendung (a) eines einzigen zusammengesetzten Primers, umfassend
einen 3'-DNA-Abschnitt,
umfassend eine Zufallssequenz, und außerdem umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt, der
im Wesentlichen an die RNA-Zielsequenzen nicht hybridisierbar ist
(d.h. der Primer besitzt unter Bedingungen, bei denen die Zufallssequenz
hybridisiert, einen Schwanz); und (b) eines Propromotor-Oligonukleotids.
Wahlweise kann ein zweiter zusammengesetzter Primer verwendet werden,
wie es unten beschrieben ist.
-
Das
Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte: (a) eine Primerextension,
um RNA/DNA-Heteroduplexe aus einer Ziel-RNA und einer Erststrang-cDNA
zu bilden; (b) Bildung von zweiten Primer-Extensionsprodukten (Zweitstrang-cDNA),
die den gleichen Sinn wie die eingesetzte Ziel-RNA aufweisen, und
Abspaltung der in einem RNA/DNA-Heteroduplex vorhandenen RNA mit
einem Agens (wie RNase H), das in der Lage ist, in einem RNA/DNA-Heteroduplex
vorhandene RNA abzuspalten, wodurch ein doppelsträngiger Komplex
von erstem und zweiten Primer-Extensionsprodukt, umfassend einen
einzelsträngigen
3'-Abschnitt, erzeugt
wird (Komplex IX in 8, der Komplex
IX wie in 1 dargestellt, entspricht);
und (c) ein PTO bindet an das doppelsträngige Produkt IX, um Komplex
X zu bilden, wie in 8 gezeigt. DNA-Polymerase
extendiert das 3'-Ende
des zweiten Primer-Extensionsprodukts in Komplex XIII entlang des
PTO-Templates, um Komplex XI, umfassend eine doppelsträngige Promotorsequenz
an einem Ende, zu bilden; und (d) Transkription unter Verwendung
einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase, um vielfache Kopien von Sense-RNA-Produkten zu erzeugen. Wie
dargestellt, sind sämtliche
Schritte isotherm, obwohl die Temperatur für jeden Schritt gleich oder
verschieden sein kann.
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Wie
in 8 dargestellt, kann ein Promotor-Template-Oligonukleotid, 3 (PTO), folgendermaßen gestaltet
werden: der 3'-Abschnitt
ist der gleiche wie der 5'-RNA- Abschnitt des ersten
zusammengesetzten Primers (der an Template-RNA hybridisiert). Diese
Gestaltung ermöglicht
dem PTO, an den einzelsträngigen 3'-Abschnitt des zweiten
Primer-Extensionsprodukts (welches in einem Komplex mit dem ersten
Primer-Extensionsprodukt vorliegt) zu hybridisieren. Der äußerste 5'-Abschnitt des PTO
ist eine Promotorsequenz für
eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase, die, wie oben beschrieben, in bestimmten (nämlich den
anderen „verstärkten") Anwendungsformen
der Amplifikationsverfahren der Erfindung verwendet wird.
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Lineare mRNA-Amplifikation unter Verwendung
eines ersten zusammengesetzten Primers eines zweiten zusammengesetzten
Primers und einer Ziel-RNA
-
Die
Erfindung stellt Verfahren zur Erzeugung einzelsträngiger Antisense-
und Sense-Polynukleotid-Kopien,
im Allgemeinen DNA, einer RNA-Sequenz von Interesse unter Verwendung
eines ersten zusammengesetzten Primers, eines zweiten zusammengesetzten
Primers, der zur Erzeugung der Zweitstrang-cDNA verwendet wird,
und einer Ziel-RNA bereit. In diesem Aspekt der Erfindung wird ein
erster zusammengesetzter Primer verwendet, um ein erstes Extensionsprodukt
(im Allgemeinen cDNA) zu erzeugen, das ein Substrat für die lineare
Amplifikation unter Verwendung eines zusammengesetzten Primers darstellt,
wie es oben beschrieben ist. Zusätzlich
wird ein zweiter zusammengesetzter Primer eingesetzt, um einer Zweitstrang-cDNA
zu erzeugen, der ein Substrat für
eine lineare Amplifikation darstellt, was zur Erzeugung einzelsträngiger Polynukleotid-Kopien
der RNA-Sequenz von Interesse führt.
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Das
Verfahren beinhaltet folgendes: (a) Bildung einer doppelsträngigen cDNA,
umfassend einen RNA-DNA-Heteroduplex an jedem Ende der cDNA; und
(b) lineare Amplifikation von Erststrang-(Sense)-cDNA und Zweitstrang-(Antisense)-cDNA
durch Primerextension von dem ersten zusammengesetzten Primer und dem
zweiten zusammengesetzten Primer (welcher an die Erststrang-cDNA
bindet) und Strangverdrängung. Einzelsträngiges erstes
und zweites cDNA-Produkt wird erzeugt, das, zum Beispiel für die Herstellung
von cDNA-Bibliotheken, zweckdienlich ist. Es ist offensichtlich,
dass bei diesem Aspekt der Erfindung das zweite Primer-Extensionsprodukt
von einem zusammengesetzten Primer gestartet wird.
-
8 veranschaulicht eine Anwendungsform
der Erfindung. Zwei zusammengesetzte Primer, umfassend verschiedene „Schwanz"-Sequenzen, werden
zur Erzeugung einer doppelsträngigen
cDNA, umfassend einen RNA-DNA-Heteroduplex an jedem Ende der cDNA,
verwendet. Die Abspaltung der RNA mit einem Agens, das RNA von einem
RNA/DNA-Heteroduplex abspaltet, lässt ein Binden eines weiteren
ersten zusammengesetzten Primers, eines weiteren zusammengesetzten
zweiten Primers (der an das erste Primer-Extensionsprodukt hybridisiert),
Extension und Strangverdrängung
zu, wodurch vielfache Kopien eines einzelsträngigen Antisense-Produkts und vielfache
Kopien eines einzelsträngigen
Sense-DNA-Produkts erzeugt werden. Eine Kombination von einzelsträngigem Sense-
und Antisense-Produkt besitzt die Fähigkeit, doppelsträngige cDNA
zu erzeugen. Der Prozess der Amplifikationsverfahren der Erfindung,
der zur Erzeugung einzelsträngiger
cDNA-Produkte führt,
die Sequenzen, die zu einer RNA-Sequenz(en) von Interesse komplementär sind, und
Sequenzen umfassen, umfassend eine RNA-Sequenz(en) von Interesse,
läuft folgendermaßen ab (eine Anwendungsform
davon ist in 7 dargestellt):
-
A) Bildung eines doppelsträngigen cDNA-Substrats
für eine
lineare Amplifikation
-
- 1. Zusammengesetzter Primer 1 bindet an ein RNA-Ziel in einer Probe
durch Hybridisierung des Primer-Abschnitts A (welcher wenigstens
zum Teil auf der poly-A-Sequenz
der mRNA basiert), um Komplex I zu bilden.
- 2. Eine reverse Transkriptase extendiert den hybridisierten
Primer 1 entlang des Ziel-RNA-Strangs,
an den er hybridisiert ist, um einen als II bezeichneten RNA/DNA-Heteroduplex
zu bilden. Ein Agens (wie RNase H) baut den Ziel-RNA-Strang des hybriden Duplex ab, um
eine einzelsträngige
Erststrang-cDNA (als „III" bezeichnet) zu erzeugen.
Das 5'-Ende von
III ist Primer 1.
- 3. Zusammengesetzter Primer 2 bindet
an die Erststrang-cDNA, III, durch Hybridisierung von Sequenz F, um
Komplex IV zu bilden.
- 4. Zusammengesetzter Primer 2 wird
entlang des cDNA-Strangs III durch eine DNA-Polymerase extendiert, um
ein doppelsträngiges
Produkt (als „V" bezeichnet) zu bilden,
das aus Erst- und Zweitstrang-cDNA besteht. Primerextension entlang
des 5'-RNA-Abschnitts
von IV durch eine RNA-abhängige
DNA- Polymerase,
wie eine reverse Transkriptase, führt zur Bildung eines RNA/DNA
hybriden Abschnitts an einem Ende von Komplex V.
- 5. Ein Agens (wie RNase H) baut den RNA-Abschnitt des RNA/DNA-Hybrids
an einem Ende von Komplex V ab, um einen zum Teil doppelsträngigen Komplex
(als „VI" bezeichnet) mit
einem 3'-DNA einzelsträngigen Ende
zu schaffen, das eine Sequenz aufweist, die das Komplement von Abschnitt
B des zusammengesetzten Primers 1 ist.
- 6. Zusammengesetzter Primer 1 bindet
an Komplex VI durch Hybridisierung des RNA-Abschnitts an das einzelsträngige DNA-Ende,
das zu ihm komplementär
ist, um Komplex VII zu bilden.
- 7. Primerextension des gebundenen Primers 1 in Komplex VII entlang des Sense-cDNA-Strangs führt zu einer
Verdrängung
des vorherigen Primer-Extensionsprodukts (VII) und repliziert Abschnitt „G" des zweiten zusammengesetzten
Primers, um Komplex VIII zu bilden.
- 8. Ein Agens (wie RNase H) spaltet die RNA-Abschnitte der RNA/DNA-Heteroduplices ab,
wobei Komplex VIII gebildet wird. Komplex VIII besitzt zwei RNA/DNA-Heteroduplices,
bestehend aus zusammengesetztem Primer 1 und
dem Komplement des zusammengesetzten Primers 1 an einem Ende und dem zweiten zusammengesetzten
Primer und dem Komplement des zweiten zusammengesetzten Primers
an dem anderen Ende. Komplex VIII ist ein Substrat für nachfolgende
Reaktionen, die als „A" und „B" bezeichnet werden.
-
B) Isotherme lineare Amplifikation
-
- 9. Bei der Reaktion A bindet ein erster zusammengesetzter
Primer an Komplex VIII. Primerextension und Verdrängung erzeugt
das erste Verdrängungsprodukt
A. RNase H-Spaltung schafft eine Stelle für ein Binden eines ersten zusammengesetzten
Primers und anschließend
Primer-Extension, wodurch ein einzelsträngiges Antisense-DNA-Produkt
angehäuft
wird.
- 10. Bei der Reaktion B bindet ein zweiter zusammengesetzter
Primer an Komplex VIII (oder an das erste Verdrängungsprodukt A). Primerextension
und Verdrängung
erzeugt einzelsträngige
Sense-DNA-Produkte.
-
Die
einzelsträngigen
Produkte können
assoziieren, um einen doppelsträngigen
Komplex aus Erst- und Zweitstrang-cDNA zu bilden, oder das Assoziieren
kann verhindert werden (oder sie werden anschließend denaturiert), um ein Gemisch
aus einzelsträngigen
Erst- und Zweitstrang-cDNAs herzustellen.
-
In den Verfahren der Erfindung
eingesetzte Komponenten und Reaktionsbedingungen
-
Template-Nukleinsäure
-
Das
RNA-Ziel, das amplifiziert werden soll, umfasst RNAs aus einer beliebigen
Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, die RNA sein kann,
wie Gesamt-RNA, tRNA, mRNA, rRNA, mitochondriale RNA, Chloroplasten
RNA, DNA-RNA-Hybride oder Gemische davon, aus beliebigen Quellen
und/oder Spezies, einschließlich
Mensch, Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen,
Viren, Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen und Fragmente davon.
Die RNAs können
unter Anwendung von Standardverfahren in der Technik gewonnen und
gereinigt werden. Eine Amplifikation eines DNA-Ziels (einschließlich genomischer DNA)
würde zuerst
eine Transkription des DNA-Ziels in eine RNA-Form erfordern, was
unter Anwendung von Verfahren, die in Kurn,
U.S. Patent Nr. 6.251.639 B1 ,
offen gelegt sind, oder mit anderen in der Technik bekannten Verfahren
(wie Expressionssysteme) erreicht werden kann. Eine Amplifikation
eines DNA-RNA-Hybrids würde
eine Denaturierung des Hybrids erfordern, um eine ssRNA zu erhalten,
oder eine Denaturierung nach einer Transkription des DNA-Strangs
erfordern, um eine RNA zu erhalten. Die Ziel-RNA kann nur einen kleinen Teil eines
komplexen Gemisches, wie einer biologischen Probe, ausmachen und
kann von verschiedenen biologischen Materialien mit Hilfe von in
der Technik gut bekannten Verfahren erhalten werden. Die Ziel-RNA
kann eine bekannte oder unbekannte RNA sein und kann mehr als eine
spezifische Nukleinsäuresequenz
von Interesse enthalten, wobei diese gleich oder verschieden sein
können.
Deshalb ist der Amplifikationsprozess nicht nur für eine Erzeugung
großer
Mengen einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sondern auch für ein gleichzeitiges
Amplifizieren von mehr als einer unterschiedlichen spezifischen
Nukleinsäure sequenz
auf den gleichen oder verschiedenen Nukleinsäuremolekülen zweckdienlich.
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Der
erste Schritt der Amplifikation einer Ziel-RNA-Sequenz ist, das
Ziel einzelsträngig
zu machen. Falls die Zielnukleinsäure doppelsträngig ist
(z.B. RNA/DNA-Hybrid) könnte
der erste Schritt eine Denaturierung des Ziels sein. Eine Denaturierung
kann ebenfalls durchgeführt
werden, um in einem RNA-Zielmolekül vorhandene Sekundärstrukturen
zu entfernen. Der Denaturierungsschritt kann eine thermische Denaturierung oder
ein in der Technik bekanntes beliebiges anderes Verfahren sein.
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Der zusammengesetzte Primer
-
Die
Verfahren der Erfindung verwenden einen zusammengesetzten Primer,
der aus RNA- und DNA-Abschnitten zusammengesetzt ist. Wie hier beschrieben,
umfasst der zusammengesetzte Primer im Allgemeinen, wenn er für die Hybridisierung
und Initiierung der hier beschriebenen Verfahren der RNA-Amplifikation
verwendet wird, einen DNA-Abschnitt, der an das RNA-Ziel hybridisiert
(welches, wie hier beschrieben, eine beliebige Anzahl an Sequenzpermutationen
abhängig
von der Natur der RNA (entweder eine Spezies oder eine Population),
die amplifiziert werden soll, aufweisen kann). Wenn der Primer für eine Amplifikation eines
cDNA-Strangs verwendet wird, der mit hier beschriebenen Verfahren
der Erfindung erzeugt ist, ist der zusammengesetzte Primer so gestaltet,
dass eine anschließende
Verdrängung
des Primer-Extensionsprodukts
durch ein Binden eines neuen (weiteren) zusammengesetzten Primers
und die Extension des neuen Primers durch die Polymerase erhalten
werden kann. Zusätzlich
führt die
Abspaltung des RNA-Abschnitts des Primer-Extensionsprodukts zur Erzeugung eines
Amplifikationsprodukts, das kein Substrat für eine Amplifikation durch
den zusammengesetzten Primer darstellt. Es ist zu verstehen, dass
im nachfolgenden Abschnitt, wo Aspekte der in den Verfahren der
Erfindung eingesetzten Primer allgemein beschreiben sind, die beschriebenen
Charakteristika auf die Primer übertragbar
sind, falls sie für
eine Hybridisierung und Initiierung der RNA-Amplifikation (Erzeugung
des ersten Extensionsprodukts) und/oder für eine lineare Verdrängungsamplifikation
verwendet werden.
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Zusammengesetzte
Primer für
eine Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
umfassen eine Sequenz, die in der Lage ist, an eine Ziel-RNA zu hybridisieren.
Die Sequenz, die in der Lage ist, an die Ziel-RNA zu hybridisieren,
kann auf der bestimmten Sequenz einer spezifischen Ziel-RNA (z.B.
der mRNA eines bestimmten Gens) basieren oder kann auf einem allgemeineren
Sequenztyp basieren, von dem bekannt ist, dass er in vielen RNA-Spezies
vorkommt, wie die poly-A-Schwanz-Sequenz, von der generell vermutetet
wird, dass sie in jeder eukaryotischen mRNA vorkommt. Zusätzlich kann
die Sequenz, die in der Lage ist, an die Ziel-RNA zu hybridisieren,
eine Sequenz umfassen, die zu dem poly-A-Schwanz von mRNA komplementär ist, oder
kann außerdem
eine zusätzliche
Zufallssequenz (welche im Allgemeinen zu einer poly-A-Sequenz nicht
komplementär
ist) am 3'-Ende
des 3'-Abschnitts
(oder eine Population von Zufallssequenzen) umfassen.
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Die
Sequenz, die in der Lage ist, an die Ziel-RNA zu hybridisieren,
kann ebenfalls eine Zufallssequenz umfassen. Zufallsprimer sind
in der Technik bekannt, siehe z.B., und umfassen wenigstens folgendes:
Primer, die an zwei oder mehrere Sequenzen in einer Probe hybridisierbar
sind; und Primer, die poly-dT-Sequenzen umfassen, die an eine Vielzahl
an RNAs in einer Probe (wie beispielsweise an alle mRNAs) hybridisierbar
sind. Der Einfachheit halber wird oben ein einziger zusammengesetzter
Zufallsprimer diskutiert. Allerdings ist es zu verstehen, dass der
Ausdruck „Zufallsprimer" einen Primer bezeichnen
kann, der ein Element einer Population von Primern ist, die insgesamt
gestaltet sind, um an eine erwünschte
und/oder signifikante Population von Zielsequenzen zu hybridisieren.
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Es
ist ebenfalls zu verstehen, dass die Amplifikation einer Vielzahl
an mRNA-Spezies in einem einzigen Reaktionsgemisch eine Vielzahl
an Primern (von zwei bis zu sehr vielen), aber nicht notwendigerweise, erfordert.
Folglich wird in der Erfindung die Verwendung einer Vielzahl an
verschiedenen zusammengesetzten Primern (zufälligen oder nicht zufälligen)
erwogen, wenn eine Vielzahl an mRNA-Spezies in einem einzigen Reaktionsgemisch
amplifiziert werden.
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In
einigen Anwendungsformen wird ein erster zusammengesetzter Primer
in den Verfahren der Erfindung eingesetzt, die jene Schritte beinhalten,
die eine lineare Verdrängungsamplifikation
(SPIA) des zweiten cDNA-Strangs umfassen. In anderen Anwendungsformen
werden ein erster und ein zweiter, anderer, zusammengesetzter Primer
in den Verfahren der Erfindung eingesetzt. Der zweite zusammengesetzte
Primer wird für
den linearen Verdrängungsamplifikation-(SPIA)-Schritt
verwendet und kann ein Teil oder die gesamte Sequenz des ersten
zusammengesetzten Primers umfassen, und der erste zusammengesetzte
Primer kann ein Teil oder die gesamte Sequenz des zweiten zusammengesetzten
Primers umfassen. In einigen Anwendungsformen umfasst der zweite
zusammengesetzte Primer eine andere Sequenz als der erste zusammengesetzte Primer.
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In
einigen Anwendungsformen ist ein Primer so gestaltet, dass der gesamte
Primer an die Ziel-RNA hybridisiert. In anderen Anwendungsformen
umfasst ein zusammengesetzter Primer eine Sequenz, vorzugsweise
am 5'-Ende, die
nicht (unter einer gegebenen Reihe an Bedingungen) an das Ziel hybridisierbar
ist (zum Beispiel einen nicht hybridisierten 5'-Abschnitt, der einen Schwanz bilden
würde,
wenn der Primer an das Ziel gebunden ist). Einzelne DNA- und RNA-Abschnitte
des zusammengesetzten Primers können
komplett oder partiell an die Ziel-RNA hybridisieren. Zum Beispiel
kann der 5'-RNA-Abschnitt
eines zusammengesetzten Primers partiell hybridisierbar und partiell
nicht hybridisierbar sein oder der DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten
Primers kann partiell hybridisierbar und partiell nicht hybridisierbar
oder beides kann zutreffen. Eine andere Möglichkeit ist, dass DNA-Abschnitte
einen Teil eines „Schwanzes" bilden können und
RNA-Abschnitte partiell oder komplett an Ziel-RNA hybridisierbar
sein können.
Zum Beispiel kann der 5'-RNA-Abschnitt
eines zusammengesetzten Primers partiell hybridisierbar und partiell
nicht hybridisierbar sein oder der DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten
Primers kann partiell hybridisierbar und partiell nicht hybridisierbar
oder beides sein.
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Für eine Verwendung
bei der linearen Verdrängungsamplifikation
umfasst ein Primer wenigstens einen RNA-Abschnitt, der in der Lage
ist (a) an eine Sequenz auf der Zweitstrang-cDNA (austauschbar „zweites
Primer-Extensionsprodukt" oder „zusammengesetztes
Primer-Extensionsprodukt" genannt)
zu binden (hybridisieren), unab hängig
von einer Hybridisierung des DNA-Abschnitts oder der DNA-Abschnitte
an eine Sequenz auf derselben Zweitstrang-cDNA; und (b) mit einem
Agens, wie einer Ribonuklease, abgespalten zu werden, wenn er an
das Extensionsprodukt des zweiten Primers oder Fragments hybridisiert
ist. Der zusammengesetzte Primer bindet an die Zweitstrang-cDNA,
um einen partiellen Heteroduplex zu bilden, in dem nur der RNA-Abschnitt
des Primers nach Kontakt mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet, wie einem Enzym, wie Ribonuklease (wie RNase H), abgespalten
wird, während
die Zweitstrang-cDNA intakt bleibt, was die Assoziierung eines weiteren
zusammengesetzten Primers ermöglicht.
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Wenn
der zusammengesetzte Primer für
die hier beschriebene lineare Verdrängungsamplifikation verwendet
wird, umfasst er ebenfalls einen 3'-DNA-Abschnitt, der in der Lage ist,
an eine Sequenz auf der Zweitstrang-cDNA zu hybridisieren, so dass
seine Hybridisierung an der Zweitstrang-cDNA gegenüber der
Hybridisierung des Nukleinsäure-Strangs
begünstigt
wird, der von der Zweitstrang-cDNA von der DNA-Polymerase verdrängt wird. Derartige Primer
können
basierend auf gut bekannten Faktoren, welche die Bindungsaffinität der Nukleinsäure, wie
Sequenzlänge
und/oder -identität,
wie auch Hybridisierungsbedingungen beeinflussen, rational gestaltet
werden. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Hybridisierung
des 3'-DNA-Abschnitts des zusammengesetzten
Primers an seine komplementäre
Sequenz in der Zweitstrang-cDNA gegenüber der Hybridisierung der
homologen Sequenz in dem 5'-Ende
des verdrängten
Strangs an der Zweitstrang-cDNA begünstigt.
-
Die
Erzeugung von Primern, die für
eine Extension mittels Polymerisierung geeignet sind, ist in der Technik
gut bekannt, wie es beispielsweise in PCT Pub. Nr.
WO99/42618 (und darin zitierten Referenzen)
beschrieben ist. Der zusammengesetzte Primer umfasst eine Kombination
aus RNA und DNA (siehe obige Definition), wobei das 3'-Endnukleotid ein
Nukleotid ist, das sich für
eine Nukleinsäure-Extension eignet.
Das 3'-Endnukleotid
kann ein beliebiges Nukleotid oder Analogon sein, das, wenn es in
einem Primer vorhanden ist, von einer DNA-Polymerase extendierbar
ist. Im Allgemeinen weist das 3'-Endnukleotid
ein 3'-OH auf. Geeignete
Primer umfassen diejenigen, die wenigstens einen RNA-Abschnitt und
wenigstens einen DNA-Abschnitt umfassen. Zum Beispiel können zusammengesetzte
Primer einen 5'-RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt
umfassen (wo der RNA-Abschnitt
zu dem 3'-DNA-Abschnitt
benachbart ist); oder 5'-
und 3'-DNA-Abschnitte
mit einem dazwischen liegenden RNA-Abschnitt umfassen. Dementsprechend
umfasst in einer Anwendungsform der zusammengesetzte Primer einen
5'-RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt, vorzugsweise
worin der RNA-Abschnitt zu dem 3'-DNA-Abschnitt
benachbart ist. In einer anderen Anwendungsform umfasst der zusammengesetzte
Primer 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit
wenigstens einem dazwischen liegenden RNA-Abschnitt (d.h. einen
RNA-Abschnitt zwischen zwei DNA-Abschnitten).
In einer noch anderen Anwendungsform umfasst der zusammengesetzte
Primer der Erfindung einen 3'-DNA-Abschnitt
und wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt (d.h. einen
RNA-Abschnitt zwischen zwei DNA-Abschnitten).
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Die
Länge eines
RNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer, umfassend einen
3'-DNA-Abschnitt
und einen RNA-Abschnitt, kann bevorzugt etwa 1 bis etwa 50, bevorzugter
etwa 3 bis etwa 20, noch bevorzugter etwa 4 bis etwa 15 und am bevorzugtesten
etwa 5 bis etwa 10 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
einen RNA-Abschnitt, kann ein RNA-Abschnitt beliebig wenigstens
etwa 1, 3, 4, 5 Nukleotide mit einer Obergrenze von beliebig etwa
10, 15, 20, 25, 30, 50 Nukleotiden umfassen.
-
Die
Länge des
5'-RNA-Abschnitts
in einem zusammengesetzten Primer, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt,
kann bevorzugt etwa 3 bis etwa 50 Nukleotide, bevorzugter etwa 5
bis etwa 20 Nukleotide, noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 18 Nukleotide,
bevorzugt etwa 8 bis etwa 17 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa
10 bis etwa 15 Nukleotide betragen. In anderen Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt, kann
der 5'-RNA-Abschnitt
beliebig wenigstens etwa 3, 5, 7, 8, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 15, 17, 18, 20, 50 Nukleotiden umfassen. In einer
Anwendungsform besitzt der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt
von etwa 14 Nukleotiden.
-
In
Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen
5'-RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt,
umfassend außerdem
nicht-5'-RNA-Abschnitt(e), kann
ein nicht-5'-RNA-Abschnitt
bevorzugt etwa 1 bis etwa 7 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa
6 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 5 Nukleotide
enthalten. In bestimmten Anwendungsformen eines zusammengesetzten
Primers, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt,
umfassend außerdem
nicht-5'-RNA-Abschnitt(e),
kann ein nicht-5'-RNA-Abschnitt
beliebig wenigstens etwa 1, 2, 3, 5 mit einer Obergrenze von beliebig
etwa 5, 6, 7, 10 Nukleotiden enthalten.
-
In
Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen
5'-RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt,
in dem der 5'-RNA-Abschnitt
zu dem 3'-DNA-Abschnitt benachbart
ist, kann die Länge des
5'-RNA-Abschnitts
bevorzugt etwa 3 bis etwa 50 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis
etwa 20 Nukleotide, noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 18 Nukleotide,
bevorzugt etwa 8 bis etwa 17 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa
10 bis etwa 15 Nukleotide betragen. In bestimmten Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt,
in dem der 5'-RNA-Abschnitt
zu dem 3'-DNA-Abschnitt benachbart
ist, kann der 5'-RNA-Abschnitt
beliebig wenigstens etwa 3, 5, 7, 8, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 15, 17, 18, 20, 50 Nukleotiden enthalten.
-
Die
Länge eines
dazwischen liegenden RNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer,
umfassend 5'- und
3'-DNA-Abschnitte
mit wenigstens einem dazwischen liegendenden RNA-Abschnitt, kann
bevorzugt etwa 1 bis etwa 7 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa
6 Nukleotide, und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 5 Nukleotide
betragen. In einigen Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers,
umfassend 5'- und
3'-DNA-Abschnitte
mit wenigstens einem dazwischen liegendenden RNA-Abschnitt, kann
ein dazwischen liegender RNA-Abschnitt
wenigstens beliebig etwa 1, 2, 3, 5 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 5, 6, 7, 10 Nukleotiden enthalten. Die Länge eines
dazwischen liegenden RNA-Abschnitts in einem zusammengesetzten Primer,
umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
wenigstens einen dazwischen liegendenden RNA-Abschnitt, kann bevorzugt
etwa 1 bis etwa 7 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis etwa 6 Nukleotide,
und am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 5 Nukleotide betragen. In
einigen Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers, umfassend
einen 3'-DNA-Abschnitt und wenigstens
einen dazwischen liegendenden RNA-Abschnitt, kann ein dazwischen
liegender RNA-Abschnitt wenigstens beliebig etwa 1, 2, 3, 5 Nukleotide
mit einer Obergrenze von beliebig etwa 5, 6, 7, 10 Nukleotiden enthalten.
In einem zusammengesetzten Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt und außerdem umfassend
einen 5'-RNA-Abschnitt, kann
der 5'-RNA-Abschnitt
etwa 3 bis etwa 25 Nukleotide, bevorzugter etwa 5 bis etwa 20 Nukleotide,
noch bevorzugter etwa 7 bis etwa 18 Nukleotide, bevorzugt etwa 8
bis etwa 17 Nukleotide und am bevorzugtesten etwa 10 bis etwa 15
Nukleotide enthalten. In einigen Anwendungsformen eines zusammengesetzten
Primers, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt
und wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, außerdem umfassend
einen 5'-RNA-Abschnitt,
kann der 5'-RNA-Abschnitt wenigstens
beliebig etwa 3, 5, 7, 8, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze von
beliebig etwa 15, 17, 18, 20 Nukleotiden enthalten.
-
Die
Länge des
3'-DNA-Abschnitts
in einem zusammengesetzten Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
einen RNA-Abschnitt, kann bevorzugt etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter
etwa 3 bis etwa 18, noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 und am bevorzugtesten
etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
einen RNA-Abschnitt, kann der 3'-DNA-Abschnitt
wenigstens beliebig etwa 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden enthalten.
-
Die
Länge des
3'-DNA-Abschnitts
in einem zusammengesetzten Primer, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt und
einen 3'-DNA-Abschnitt,
kann bevorzugt etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18,
noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 und am bevorzugtesten etwa 7
bis etwa 12 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen eines
zusammengesetzten Primers, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt, kann
der 3'-DNA-Abschnitt
wenigstens beliebig etwa 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden enthalten.
-
In
Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen
5'-RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt,
außerdem
umfassend einen nicht-3'-DNA-Abschnitt(e),
kann ein nicht-3'-DNA-Abschnitt
bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 Nukleotide, bevorzugter etwa 2 bis
etwa 8 Nukleotide und am bevorzugtesten 3 bis etwa 6 Nukleotide
enthalten. In einigen Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers, umfassend
einen 5'-RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt,
außerdem
umfassend einen nicht-3'-DNA-Abschnitt(e),
kann ein nicht-3'-DNA-Abschnitt wenigstens
beliebig etwa 1, 2, 3, 5 Nukleotide mit einer Obergrenze von beliebig
etwa 6, 8, 10, 12 Nukleotiden enthalten.
-
In
Anwendungsformen eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen
5'-RNA-Abschnitt und einen
3'-DNA-Abschnitt,
in dem der 5'-RNA-Abschnitt
benachbart zu dem 3'-DNA-Abschnitt
ist, kann die Länge des
3'-DNA-Abschnitts
bevorzugt etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18, noch
bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 und am bevorzugtesten etwa 7 bis
etwa 12 Nukleotide betragen. In bestimmten Anwendungsformen des
Primers, umfassend einen 5'-RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt, in
dem der 5'-RNA-Abschnitt
benachbart zu dem 3'-DNA-Abschnitt
ist, kann der 3'-DNA-Abschnitt
wenigstens beliebig etwa 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden enthalten.
-
Die
Länge eines
nicht-3'-DNA-Abschnitts
in einem zusammengesetzten Primer, umfassend 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit wenigstens einem
dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann bevorzugt etwa 1 bis etwa
10, bevorzugter etwa 2 bis etwa 8 und am bevorzugtesten etwa 3 bis
etwa 6 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen eines Primers,
umfassend 5'- und
3'-DNA-Abschnitte
mit wenigstens einem dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann ein
nicht-3'-DNA-Abschnitt
wenigstens beliebig etwa 1, 2, 3, 5 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 6, 8, 10, 12 Nukleotiden enthalten.
-
Die
Länge des
3'-DNA-Abschnitts
in einem zusammengesetzten Primer, umfassend 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit wenigstens einem
dazwischen liegenden RNA-Abschnitt,
kann bevorzugt etwa 1 bis etwa 20, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18,
noch bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide und am bevorzugtesten
etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit wenigstens einem
dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann der 3'-DNA-Abschnitt wenigstens beliebig etwa
1, 3, 5, 7, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze von beliebig etwa
10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden enthalten.
-
Die
Länge eines
nicht-3'-DNA-Abschnitts
(d.h. jeder beliebige DNA-Abschnitt außer dem 3'-DNA-Abschnitt) in einem zusammengesetzten
Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann bevorzugt
etwa 1 bis etwa 10, bevorzugter etwa 2 bis etwa 8 und am bevorzugtesten
etwa 3 bis etwa 6 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann ein nicht-3'-DNA-Abschnitt wenigstens
etwa beliebig 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze von
beliebig etwa 6, 8, 10, 12 Nukleotiden enthalten. Die Länge des
3'-DNA-Abschnitts
in einem zusammengesetzten Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann bevorzugt
etwa 1 bis etwa 20 Nukleotide, bevorzugter etwa 3 bis etwa 18, noch
bevorzugter etwa 5 bis etwa 15 Nukleotide und am bevorzugtesten
etwa 7 bis etwa 12 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen
eines zusammengesetzten Primers, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
wenigstens einen dazwischen liegenden RNA-Abschnitt, kann der 3'-DNA-Abschnitt wenigstens
beliebig etwa 1, 3, 5, 7, 10 Nukleotide mit einer Obergrenze von
beliebig etwa 10, 12, 15, 18, 20, 22 Nukleotiden enthalten. Es ist zu
verstehen, dass die Längen
der verschiedenen Abschnitte größer oder
kleiner sein können,
so wie es unter den Reaktionsbedingungen der Verfahren der Erfindung
geeignet ist.
-
In
einigen Anwendungsformen umfasst der 5'-DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten
Primers das 5' äußerste Nukleotid
des Primers. In einigen Anwendungsformen umfasst der 5'-RNA-Abschnitt eines
zusammengesetzten Primers das 5' äu ßerste Nukleotid
des Primers. In anderen Anwendungsformen umfasst der 3'-DNA-Abschnitt eines zusammengesetzten
Primers das 3' äußerste Nukleotid
des Primers. In anderen Anwendungsformen ist der 3'-DNA-Abschnitt zu
dem 5'-RNA-Abschnitt
benachbart und umfasst das 3' äußerste Nukleotid
des Primers (und der 5'-RNA-Abschnitt umfasst
das 5' äußerste Nukleotid
des Primers).
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Die
Gesamtlänge
des zusammengesetzten Primers kann bevorzugt etwa 10 bis etwa 50
Nukleotide, bevorzugter etwa 15 bis etwa 30 Nukleotide und am bevorzugtesten
etwa 20 bis etwa 25 Nukleotide betragen. In einigen Anwendungsformen
kann die Länge
wenigstens beliebig etwa 10, 15, 20, 25 Nukleotide mit einer Obergrenze
von beliebig etwa 25, 30, 50, 60 Nukleotiden betragen. Es ist zu
verstehen, dass die Länge
der verschiedenen Abschnitte größer oder
kleiner sein kann, so wie es unter den Reaktionsbedingungen der
Verfahren der Erfindung geeignet ist.
-
Um
eine Hybridisierung an die Zielnukleinsäure zu erreichen (die, wie
es in der Technik gut bekannt ist, von weiteren Faktoren, wie zum
Beispiel Ionenstärke
und Temperatur, abhängig
ist), ist der Abschnitt des Primers, der an die Ziel-RNA hybridisierbar
ist, bevorzugt wenigstens etwa zu 60%, bevorzugter wenigstens etwa
zu 75%, noch bevorzugter wenigstens etwa zu 90% und am bevorzugtesten
wenigstens etwa zu 95% zu der Zielnukleinsäure komplementär.
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Wie
es hier beschrieben ist, können
ein oder mehrere Primer in einer Amplifikationsreaktion eingesetzt werden.
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Der zweite Primer
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Der
zweite Primer in den Verfahren der Erfindung (welcher die Erzeugung
des zweiten Primer-Extensionsprodukts startet, das austauschbar
als Zweitstrang-cDNA bezeichnet wird) umfasst eine Sequenz (welche
der gesamte Primer sein kann oder nicht), die (unter einer gegebenen
Reihe an Bedingungen) an einer Erststrang-cDNA (austauschbar als
erstes Primer-Extensionsprodukt bezeichnet) an eine Stelle auf der
Erststrang-cDNA hybridisierbar ist, so dass die Zweitstrang-cDNA
die RNA-Sequenz
von Interesse enthalten würde.
In einigen Anwendungsformen wird die hy bridisierbare Sequenz des
zweiten Primers basierend auf einer bekannten Sequenz der erwünschten
Bindungsstelle auf einer Erststrang-cDNA gestaltet. In anderen Anwendungsformen
basiert die hybridisierbare Sequenz auf Zufallssequenzen, zum Beispiel
von denen in der Technik bekannt ist, dass sie sich für ein Zufallspriming
der Erststrang-cDNAs eignen, die aus einer Vielzahl an RNA-Spezies
erzeugt sind. In anderen Anwendungsformen umfasst der zweite Primer
ein Strang-„Switch"-Oligonukleotid, das in
U.S. Patent Nr. 5.962.271 und
5.962.272 beschrieben ist,
das an die Cap-Sequenzen, die auf der mRNA vorhanden sind, hybridisierbar
ist und das die Ursache dafür
ist, dass die reverse Transkriptase von dem mRNA-Template zu dem „Switch"-Oligonukleotid wechselt,
was die Erzeugung einer von dem „Switch"-Oligonukleotid
gestarteten Zweitstrang-cDNA zulässt.
Alternativ wird ein homopolymerer Schwanz an den 3'-Terminus des ersten
Primer-Extensionsprodukts angefügt
und der zweite Primer umfasst das Komplement des homopolymeren Schwanzes.
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In
einigen Anwendungsformen umfasst der zweite Primer DNA. In anderen
Anwendungsformen besteht der zweite Primer aus DNA. In anderen Anwendungsformen,
wie hier beschrieben, ist der zweite Primer ein Fragment der Ziel-RNA,
wobei das Fragment durch Abspaltung von der Ziel-RNA erzeugt wird.
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In
einigen Anwendungsformen ist der zweite Primer (welcher die Erzeugung
der Zweitstrang-cDNA startet) ein zusammengesetzter Primer (wie
oben beschrieben). In diesen Anwendungsformen umfasst das Verfahren
folgendes: (a) Bildung einer doppelsträngigen cDNA, umfassend einen
RNA-DNA-Heteroduplex an einem Ende der cDNA; und (b) lineare Amplifikation
der Erststrang-(Sense)-cDNA, wodurch vielfache Kopien einer einzelsträngigen Erststrang-cDNA
erzeugt werden.
-
Um
eine Hybridisierung an die Erststrang-cDNA zu erreichen (die, wie
es in der Technik gut bekannt ist, von weiteren Faktoren, wie zum
Beispiel Ionenstärke
und Temperatur, abhängig
ist), ist die Sequenz des zweiten Primers, der an die Erststrang-cDNA
hybridisierbar ist, bevorzugt wenigstens etwa zu 60%, bevorzugter
wenigstens etwa zu 75%, noch bevorzugter wenigstens etwa zu 90%
und am bevorzugtesten wenigstens etwa zu 95% zu der Erststrang-cDNA
komplementär.
-
In
bestimmten Anwendungsformen (welche üblicherweise, aber nicht notwendigerweise,
eine Transkription einschließen)
kann der zweite Primer ebenfalls eine Sequenz, bevorzugt eine Sequenz
am 5'-Ende (welches
im Allgemeinen das 5' äußerste Nukleotid
umfasst) umfassen, die nicht an die Erststrang-cDNA unter einer
gegebenen Reihe an Bedingungen hybridisierbar ist. Diese Sequenz
ermöglicht
die Erzeugung einer definierten Endsequenz für das 5'-Ende der Zweitstrang-cDNA (und folglich
darauffolgend das 3'-Ende
der einzelsträngigen
DNA-Produkte). Eine definierte Endsequenz am 3'-Ende der einzelsträngigen DNA-Produkte ist besonders
vorteilhaft bezüglich
einer Hybridisierung eines Propromotor-Polynukleotids (in Anwendungsformen,
die einen Transkriptionsschritt einschließen) an verdrängte erste
Primer-Extensionsprodukte in den nachfolgenden Schritten. In bestimmten
Anwendungsformen umfasst eine nicht-hybridisierbare 5'-Sequenz eine Sequenz,
deren Komplement von einem Propromotor-Polynukleotid hybridisierbar
ist. Einzelsträngige DNA-Produkte,
umfassend eine 3' definierte
Endsequenz, sind ebenfalls für
eine Hybridisierung an ein komplementäres Oligonukleotid zweckdienlich,
das an einen bindenden Partner oder Substrat, zum Beispiel ein generisches
Mikroarray, wie hier beschrieben, geheftet ist. Dementsprechend
stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Produkte mit
einem, wie hier beschriebenen, definierten 3'-Ende bereit.
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In
einer Anwendungsform umfasst der zweite Primer DNA. In einer anderen
Anwendungsform umfasst der zweite Primer RNA. In einer noch weiteren
Anwendungsform umfasst der zweite Primer DNA und RNA.
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In
einigen Anwendungsformen wird der Primer durch Selbstpriming (z.B.
durch eine Haarnadelschleife) am 3'-Ende des Extensionsprodukts des zusammengesetzten
Primers bereitgestellt. In diesen Anwendungsformen hybridisiert
eine Sequenz am 3'-Ende des Extensionsprodukts
des zusammengesetzten Primers selbst an eine andere Sequenz in dem
Extensionsprodukt des zusammengesetzten Primers, zum Beispiel wie im
U.S. Patent Nr. 6.132.997 beschrieben.
In diesen Anwendungsformen wird diese Sequenz am 3'-Ende des Extensionsprodukts
des zusammengesetzten Primers im Allgemeinen (zum Beispiel mit S1-Nuklease)
im Anschluss an ihre Hybridisierung an das Extensionsprodukt des
zusammengesetzten Primers und/oder ihrer Extension entlang des Extensionsprodukts
des zusammengesetzten Primers gespalten.
U.S. Patent Nr. 6.132.997 .
-
In
einigen Anwendungsformen wird der zweite Primer von einem oder mehreren
Ziel-RNA-Fragmenten
bereitgestellt. Ein derartiges RNA-Fragment kann als ein Ergebnis
eines unvollständigen
Verdaus einer Ziel-RNA in einem Komplex aus Ziel-RNA und erstem
Primer-Extensionsprodukt von einem Agens (wie einem Enzym) erzeugt
sein, das RNA in einem RNA/DNA-Hybrid spaltet, so dass ein oder
mehrere RNA-Fragmente an
dem ersten Primer-Extensionsprodukt gebunden bleiben.
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Polynukleotid, umfassend einen Propromotor
und eine Region, die an ein Primer-Extensionsprodukt hybridisiert.
-
Einige
Anwendungsformen verwenden ein Propromotor-Polynukleotid, umfassend
einen Propromotor und eine Region, die an ein Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert. In einigen Anwendungsformen ist das Propromotor-Polynukleotid
als ein PTO bereitgestellt, wie es unten detaillierter beschrieben
wird.
-
Propromotor-Template-Oligonukleotid
-
In
einigen Anwendungsformen verwenden die Verfahren eine Propromotorsequenz
für die
Transkription, die von einem Propromotor-Template-Oligonukleotid
(PTO) bereitgestellt ist.
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Ein
PTO für
eine Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
ist ein einzelsträngiges
Polynukleotid, im Allgemeinen DNA, umfassend eine Propromotorsequenz,
die für
eine Bildung eines doppelsträngigen
Promotors einer RNA-Polymerase gestaltet ist, und einen Abschnitt,
der zur Hybridisierung an das 3'-Ende eines Primer-Extensionsprodukts
fähig ist.
In einer Anwendungsform der Erfindung umfasst der Abschnitt, der
zur Hybridisierung an das 3'-Ende
eines Primer-Extensionsprodukts
fähig ist,
eine Sequenz, deren Komplement an eine definierte Endsequenz des
zweiten Primer-Extensionsprodukts hybridisierbar ist (und folglich
nachfolgend das 3'-Ende
der einzelsträngigen
DNA-Produkte). In einer anderen An wendungsform umfasst der Abschnitt,
der zur Hybridisierung an das 3'-Ende
eines Primer-Extensionsprodukts fähig ist, eine Zufallssequenz.
In einer weiteren Anwendungsform umfasst der Abschnitt, der zur
Hybridisierung an das 3'-Ende
eines Primer-Extensionsprodukts fähig ist, eine Sequenz, deren
Komplement zur Hybridisierung an Sequenzen fähig ist, die am 3'-Ende einer Vielzahl
an Erststrang-cDNAs gefunden werden.
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In
einer bevorzugten Anwendungsform ist die Propromotorsequenz im 5'-Abschnitt des Oligonukleotids
lokalisiert und die hybridisierende Sequenz ist im 3'-Abschnitt des Oligonukleotids
lokalisiert. In einer Anwendungsform, und am üblichsten, sind die Promotorsequenz
und die hybridisierende Sequenz verschiedene Sequenzen. In einer
anderen Anwendungsform, sind die Promotorsequenz und die hybridisierende
Sequenz überlappend
identisch. In einer noch anderen Anwendungsform sind die Promotorsequenz
und die hybridisierende Sequenz dieselbe Sequenz und sind folglich
an derselben Stelle auf dem PTO. In Anwendungsformen, wo die Hybridisierung
des PTO an das Primer-Extensionsprodukt einen Duplex ergibt, der
einen Überhang
umfasst (das 5'-Ende
des PTO, das nicht an das verdrängte
Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert, umfasst üblicherweise
die gesamte oder einen Teil der Propromotorsequenz), füllt DNA-Polymerase
den Überhang
auf, um einen doppelsträngigen
Promotor zu schaffen, der in der Lage ist, die Transkription durch
eine geeignete RNA-Polymerase zu bewirken.
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Promotorsequenzen,
die eine Transkription einer Template-DNA zulassen, sind in der
Technik bekannt und sind oben diskutiert worden. Vorzugsweise sind
die Promotorsequenzen so ausgewählt,
dass sie für
eine optimale Transkriptionsaktivität der eingesetzten speziellen
RNA-Polymerase sorgen. Auswahlkriterien, d.h. eine bestimmte Promotorsequenz,
die von einer speziellen RNA-Polymerase besonders bevorzugt wird,
sind in der Technik ebenfalls bekannt. Zum Beispiel sind die Sequenzen
des Promotors für
eine Transkription von T7-DNA-abhängiger RNA-Polymerase und SP6
in der Technik bekannt. Die Promotorsequenz kann aus einer prokaryotischer
oder eukaryotischer Quelle stammen.
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In
einigen Anwendungsformen umfasst das PTO eine dazwischen liegende
Sequenz zwischen einer Propromotorsequenz und einem Abschnitt, der
zur Hybrisierung an das 3'-Ende
des Primer-Extensionsprodukts fähig
ist. Geeignete Längen
der dazwischen liegenden Sequenz können empirisch bestimmt werden
und können
wenigstens etwa 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 Nukleotide betragen. Eine
geeignete Sequenzidentität
der dazwischen liegenden Sequenz kann ebenfalls empirisch bestimmt
werden, und die Sequenz wird so gestaltet, dass sie vorzugsweise,
aber nicht notwendigerweise, das Ausmaß der Amplifikation verglichen
mit dem Fall, wo die Sequenz weggelassen ist, verstärkt. In
einer Anwendungsform ist die dazwischen liegende Sequenz eine Sequenz,
die so gestaltet ist, dass sie für
eine verstärkte
oder bessere Transkription durch die eingesetzte RNA-Polymerase
sorgt. Im Allgemeinen ist die Sequenz nicht mit der Zielnukleinsäure verwandt
(d.h. sie hybridisiert im Wesentlichen nicht an die Zielnukleinsäure). Eine
bessere Transkription wird erhalten, wenn die Transkriptionsaktivität der Polymerase
von einem Promotor, der an dieser Sequenz operativ gebunden ist,
größer ist
als die Aktivität
eines Promotors, der nicht auf diese Weise gebunden ist. Die Sequenzvoraussetzungen für eine optimale
Transkription sind im Allgemeinen in der Technik bekannt und sind
bereits für
verschiedene DNA-abhängige
RNA-Polymerasen, wie in
U.S.
Patent Nr. 5766849 und
5654142 ,
beschrieben, und können ebenfalls
empirisch bestimmt werden.
-
In
einer anderen Anwendungsform umfasst das PTO eine Sequenz, die 5' zur Propromotorsequenz liegt,
d.h. das PTO umfasst weitere Nukleotide (welche transkriptionale
regulatorische Sequenzen sein können oder
nicht), die 5' zu
der Propromotorsequenz liegen. Im Allgemeinen, aber nicht notwendigerweise,
ist die Sequenz (unter einer gegebenen Reihe an Bedingungen) nicht
an das Primer-Extensionsprodukt
hybridisierbar.
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In
einer Anwendungsform kann das PTO nicht als ein Primer für eine Nukleinsäure-Extension wirksam fungieren.
Techniken zur Blockierung der Primerfunktion des PTO umfassen jede
beliebige Technik, die eine Addition von Nukleotiden an das 3'-Ende des PTO durch eine DNA-Polymerase
verhindert. Derartige Techniken sind in der Technik bekannt, einschließlich zum
Beispiel Substitution oder Modifikation der 3'-Hydroxylgruppe oder Einbau eines modifizierten
Nukleotids, wie ein Didesoxy nukleotid, in die äußerste 3'-Position des PTO, das nicht zu einer
festen Addition von Nukleotiden durch eine DNA-Polymerase fähig ist.
Es ist möglich, das
3'-Ende durch Verwendung
einer Markierung oder eines kleinen Moleküls, das ein Element eines spezifischen
Bindungspaars ist, wie Biotin, zu blockieren. Es ist ebenfalls möglich, das
3'-Ende durch Addition
von Nukleotiden nicht extendierbar zu machen, die entweder wegen
einer Nichtkomplementarität
oder wegen struktureller Modifikationen, die für Wasserstoffbindungen nicht
förderlich
sind, nicht an ein Primer-Extensionsprodukt
hybridisieren können.
In anderen Anwendungsformen ist das PTO nicht blockiert.
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Die
Länge des
PTO-Abschnitts, der an ein Primer-Extensionsprodukt von Interesse
hybridisiert, beträgt
bevorzugt etwa 5 bis etwa 50 Nukleotide, bevorzugter etwa 10 bis
etwa 40 Nukleotide, noch bevorzugter etwa 15 bis etwa 35 Nukleotide
und am bevorzugtesten etwa 20 bis 30 Nukleotide. In einigen Anwendungsformen
enthält
der hybridisierende Abschnitt wenigstens beliebig des folgenden:
3, 5, 10, 15, 20; und weniger als etwa beliebig des folgenden: 30,
40, 50, 60. Die Komplementarität
des hybridisierenden Abschnitts beträgt bevorzugt wenigstens etwa
25%, bevorzugter wenigstens etwa 50%, noch bevorzugter wenigstens
etwa 75% und am bevorzugtesten wenigstens etwa 90% zu der Sequenz
auf dem Primer-Extensionsprodukt von Interesse, an die er binden
soll.
-
DNA-Polymerase, ein Agens, das zur Spaltung
eines RNA-DNA-Hybrids fähig
ist, und RNA-Polymerase
-
Die
Amplifikationsverfahren der Erfindung verwenden folgende Enzyme:
eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
eine DNA-abhängige
DNA-Polymerase, und ein Agens, das zur Abspaltung eines RNA-Strangs
von einem RNA-DNA-Hybrid fähig
ist (zum Beispiel eine Ribonuklease, wie RNase H) und bei manchen
Aspekten eine DNA-abhängige RNA-Polymerase.
Eine oder mehrere dieser Aktivitäten
können
in einem einzigen Enzym vorgefunden und genutzt werden. Zum Beispiel
kann die RNase H-Aktivität von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase
geliefert werden (wie beispielsweise von einer reversen Transkriptase) oder
kann von einem separaten En zym bereitgestellt werden. Für dieses
Verfahren zweckdienliche reverse Transkriptasen können entweder
eine RNase H-Aktivität
besitzen oder nicht.
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Ein
Aspekt der Erfindung ist die Bildung doppelsträngiger cDNA von einem Primer-RNA-Komplex. Dieser
Prozess nutzt im Allgemeinen die Enzymaktivitäten einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase,
einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase und eines Agens, das zur Spaltung eines RNA/DNA-Hybrids
fähig ist
(wie RNase H).
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RNA-abhängige DNA-Polymerasen
für eine
Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
sind in der Lage, eine Extension eines Primers gemäß den Verfahren
der Erfindung zu bewirken. Dementsprechend ist eine bevorzugte RNA-abhängige DNA-Polymerase
eine Polymerase, die zur Extension eines Nukleinsäure-Primers
entlang eines Nukleinsäure-Templates
fähig ist,
das überwiegend
aus Ribonukleotiden besteht. Geeignete RNA-abhängige DNA-Polymerasen für eine Verwendung
in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen eine
reverse Transkriptase. Viele reverse Transkriptasen, wie diejenigen
vom avianen Myeloblastosevirus (AMV-RT) und Moloney murinen Leukämievirus
(MMLV-RT), umfassen
mehr als ein Aktivität
(zum Beispiel Polymeraseaktivität
und Ribonukleaseaktivität)
und können
bei der Bildung der doppelsträngigen
cDNA-Moleküle
wirken. Allerdings ist es in manchen Fällen vorzuziehen, eine reverse
Transkriptase ohne die RNase H-Aktivität zu verwenden. Reverse Transkriptasen
frei von RNase H-Aktivität
sind in der Technik bekannt, einschließlich solcher Transkriptasen,
die eine Mutation der reversen Wildtyp-Transkriptase aufweisen,
wo die Mutation die RNase H-Aktivität eliminiert. In diesen Fällen kann
die Zugabe einer RNase H aus anderen Quellen, wie eine aus E. coli
isolierte, für
die Bildung der doppelsträngigen cDNA
genutzt werden.
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DNA-abhängige DNA-Polymerasen
für eine
Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
sind in der Lage, eine Extension des zusammengesetzten Primers gemäß den Verfahren
der Erfindung zu bewirken. Dementsprechend ist eine bevorzugte Polymerase
diejenige, die zur Extension eines Nukleinsäure-Primers entlang eines Nukleinsäure-Templates
fähig ist,
das überwiegend
aus Desoxynukleotiden besteht. Die Bildung der doppelsträngigen cDNA
kann mit einer reversen Transkriptase ausgeführt werden, die sowohl RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivitäten als
auch DNA-abhängige
DNA-Polymeraseaktivitäten
aufweist. Die Amplifikation einer RNA-Sequenz gemäß den Verfahren
der Erfindung umfasst die Verwendung einer DNA-Polymerase, die in
der Lage ist, einen Nukleinsäurestrang
von dem Polynukleotid zu verdrängen,
an das der zu verdrängende
Strang gebunden ist, und im Allgemeinen wird die Polymerase bevorzugt,
die mehr Strangverdrängungsvermögen zeigt
(d.h. im Vergleich mit anderen Polymerasen, die kein so hohes Strangverdrängungsvermögen zeigen).
Vorzugsweise besitzt die DNA-Polymerase
eine hohe Affinität für ein Binden
an das 3'-Ende eines
Oligonukleotids, das am Nuleinsäurestrang
hybridisiert ist. Vorzugsweise besitzt die DNA-Polymerase keine
wesentliche Strangbruchaktivität.
Im Allgemeinen besitzt die DNA-Polymerase vorzugsweise eine geringe
oder keine 5' → 3' Exonukleaseaktivität, um so
den Abbau von Primer oder Primer-Extensionspolynukleotiden zu minimieren.
Im Allgemeinen ist diese Exonukleaseaktivität von Faktoren, wie pH, Salzkonzentration,
ob das Template doppel- oder einzelsträngig ist und so weiter abhängig, die
dem Fachmann geläufig
sind. Mutierte DNA-Polymerasen, in denen die 5' → 3'-Exonukleaseaktivität verloren
gegangen ist, sind in der Technik bekannt und sind für die hier
beschriebenen Amplifikationsverfahren geeignet. Mutierte DNA-Polymerasen,
denen sowohl 5' nach
3'-Nukleaseaktivitäten als
auch 3' nach 5'-Nukleaseaktivitäten fehlen,
sind ebenfalls beschrieben worden, zum Beispiel die exo
-/-Klenow
DNA-Polymerase. Es ist bevorzugt, dass die DNA-Polymerase die Primer-Extensionsprodukte
von der Template-Nukleinsäure
bei wenigstens etwa 25%, bevorzugter wenigstens etwa 50%, noch bevorzugter
wenigstens etwa 75% und am bevorzugtesten wenigstens 90% aller Kontaktereignisse
zwischen der Polymerase und dem 5'-Ende des Primer-Extensionsprodukts verdrängt. In
einigen Anwendungsformen wird die Verwendung thermostabiler DNA-Polymerasen
mit Strangverdrängungsaktivität bevorzugt.
Derartige Polymerasen sind in der Technik bekannt, wie in
U.S. Patent Nr. 5744312 (und
darin zitierten Referenzen) beschrieben. Vorzugsweise besitzt die
DNA-Polymerase eine geringe bis keine Korrekturleseaktivität.
-
Geeignete
DNA-Polymerasen für
eine Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
umfassen diejenigen, die in
U.S.
Patent Nr. 5648211 und
5744312 offen
gelegt sind, die exo
- Vent (New England
Biolabs), exo
- Deep Vent (New England Biolabs),
Bst (BioRad), exo
- Pfu (Stratagene), Bca
(Panvera), Sequencing grade Taq (Promega), exo
-/- Klenow
DNA-Polymerase und thermostabile DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus umfassen.
-
Die
Ribonukleasen für
eine Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
besitzen die Fähigkeit,
Ribonukleotide in einem RNA/DNA-Hybrid abzuspalten. Vorzugsweise
spaltet die Ribonuklease in einem RNA/DNA-Hybrid Ribonukleotide
ab ungeachtet der Identität
und Art der Nukleotide, die den abzuspaltenden Nukleotiden benachbart
sind. Es ist bevorzugt, dass die Ribonuklease unabhängig von der
Sequenzidentität
spaltet. Beispiele für
geeignete Ribonukleasen für
die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind in der Technik
gut bekannt, und schließen
Ribonuklease H (RNase H), einschließlich Hybridase, ein.
-
Die
DNA-abhängigen
RNA-Polymerasen für
eine Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
sind in der Technik bekannt. Es können entweder eukoryotische
oder prokaryotische Polymerasen verwendet werden. Beispiele umfassen
T7, T3 und SP6 RNA-Polymerase. Im Allgemeinen ist die ausgewählte RNA-Polymerase
zur Transkription von der Promotorsequenz ausgehend fähig, die
von dem Propromotor-Polynukleotid bereitgestellt ist, wie es hier
beschrieben ist. Im Allgemeinen ist die RNA-Polymerase eine DNA-abhängige Polymerase,
die bevorzugt die Fähigkeit
besitzt, von einem einzelsträngigen
DNA-Template zu transkribieren, sofern die Promotorregion doppelsträngig ist.
-
Im
Allgemeinen sollten die in den Verfahren und Zusammensetzungen der
Erfindung verwendeten Enzyme nicht einen wesentlichen Abbau der
Nukleinsäure-Komponenten besagter
Verfahren und Zusammensetzungen bewirken.
-
Reaktionsbedingungen und Nachweis
-
Geeignete
Reaktionsmedien und -bedingungen für die Ausführung der Verfahren der Erfindung
sind diejenigen, die eine Nukleinsäure-Amplifikation gemäß den Verfahren
der Erfindung zulassen. Derartige Medien und Bedingungen sind dem
Fachmann bekannt und sind in den verschiedenen Veröffentlichungen,
wie
U.S. Pat. Nrn. 5.554.516 ;
5.716.785 ;
5.130.238 ;
5.194.370 ;
6.090.591 ;
5.409.818 ;
5.554.517 ;
5.169.766 ;
5.480.784 ;
5.399.491 ;
5.679.512 ; und PCT Pub. Nr.
WO99/42618 . Zum Beispiel
kann der eingesetzte Puffer ein Tris-Puffer sein, obwohl andere
Puffer ebenfalls verwendet werden können, solange die Puffer-Komponenten
für die
Enzym-Komponenten
der Verfahren der Erfindung nicht hemmend sind. Der pH liegt bevorzugt
bei etwa 5 bis etwa 11, bevorzugter bei etwa 6 bis etwa 10, noch
bevorzugter bei etwa 7 bis etwa 9 und am bevorzugtesten bei etwa
7,5 bis etwa 8,5. Das Reaktionsmedium kann ebenfalls zweiwertige
Metallionen enthalten, wie Mg
2+ oder Mn
2+, mit Endkonzentrationen der freien Ionen,
die im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 15 mM und am bevorzugtesten
von etwa 1 bis etwa 10 mM liegen. Das Reaktionsmedium kann ebenfalls
weitere Salze, wie KCl oder NaCl, enthalten, die zur Gesamtionenstärke des
Mediums beitragen. Zum Beispiel reicht der Konzentrationsbereich
eines Salzes, wie KCl, bevorzugt von etwa 0 bis etwa 125 mM, bevorzugter
von etwa 0 bis etwa 100 mM und am bevorzugtesten von 0 bis etwa
75 mM. Das Reaktionsmedium kann außerdem Additive enthalten,
welche die Leistung der Amplifikationsreaktionen beeinflussen könnten, die
aber für
die Aktivität
der Enzym-Komponenten der Verfahren nicht wesentlich sind. Derartige
Additive umfassen Proteine, wie BSA, Einzelstrang bindende Proteine
(z.B. T4-Gene 32 protein) und nichtionische Detergenzien, wie NP40 oder
Triton. Reagenzien, wie DTT, die in der Lage sind, Enzymaktivitäten aufrechtzuerhalten,
können
ebenfalls enthalten sein. Derartige Reagenzien sind in der Technik
bekannt. Wo es geeignet erscheint, kann ebenfalls ein RNase-Inhibitor (wie Rnasin)
enthalten sein, der nicht die Aktivität der im Verfahren eingesetzten
RNase hemmt. Jeder Aspekt der Verfahren kann bei gleichen oder bei
variierenden Temperaturen erfolgen. Bevorzugt werden die Amplifikationsreaktionen
(insbesondere Primer-Extension, außer den Syntheseschritten der
Erst- und Zweitstrang-cDNA und Strangverdrängung) isotherm durchgeführt, was
die aufwändige
Thermozyklisierung vermeidet. Die Amplifikationsreaktion wird bei
einer Temperatur ausgeführt,
die eine Hybridisierung der Oligonukleotide (Primer und/oder PTO)
der Erfindung an das Template-Polynukleotid und an die Primer-Extensionsprodukte
zulässt
und nicht wesentlich die Aktivität
der eingesetzten Enzyme hemmt. Die Temperatur kann im Bereich von
etwa 25°C
bis etwa 85°C,
bevorzugter von etwa 30°C
bis etwa 80°C
und am bevorzugtesten von etwa 37°C
bis etwa 75°C
liegen. In einigen Anwendungsformen, die eine RNA-Transkription
einschließen, ist
die Tempe ratur für
den Transkriptionsschritt geringer als die Temperatur(en) für die vorhergehenden
Schritte. In diesen Anwendungsformen kann die Temperatur für den Transkriptionsschritt
bevorzugt im Bereich von etwa 25°C
bis etwa 85°C,
bevorzugter von etwa 30°C
bis etwa 75°C
und am bevorzugtesten von etwa 37°C bis
etwa 70°C
liegen.
-
Nukleotide
und/oder Nukleotidanaloga, wie Desoxyribonukleosidtriphosphate,
die für
die Synthese der Primer-Extensionsprodukte in den Verfahren der
Erfindung verwendet werden können,
werden in einer Menge bevorzugt von etwa 50 bis etwa 2500 μM, bevorzugter
von etwa 100 bis etwa 2000 μM,
noch bevorzugter von etwa 200 bis etwa 1700 μM und am bevorzugtesten von
etwa 250 bis etwa 1500 μM
bereitgestellt. In einigen Anwendungsformen ist ein Nukleotid oder
Nukleotidanalogon enthalten, dessen Vorhandensein in dem Primer-Extensionsstrang
eine Verdrängung
des Strangs verstärkt
(zum Beispiel durch die Ausbildung einer Basenpaarung, die schwächer als
die normale AT- oder CG-Basenpaarung ist). Derartige Nukleotide
oder Nukleotidanaloga umfassen Desoxyinosin und andere modifizierte
Basen, die alle in der Technik bekannt sind. Nukleotide und/oder
Analoga, wie Ribonukleosidtriphosphate, die für die Synthese der RNA-Transkripte
in den Verfahren der Erfindung verwendet sein können, werden in einer Menge
bevorzugt von etwa 0,25 bis etwa 6 mM, bevorzugter von etwa 0,5
bis etwa 5 mM, noch bevorzugter von etwa 0,75 bis etwa 4 mM und
am bevorzugtesten von etwa 1 bis etwa 3 mM bereitgestellt.
-
Die
Oligonukleotid-Komponenten der Amplifikationsreaktionen der Erfindung
liegen im Allgemeinen im Überschuss
zur Anzahl an Zielnukleinsäure-Sequenz
vor, die amplifiziert werden soll. Sie können beliebig mit etwa oder
wenigstens etwa der folgenden Menge bereitgestellt werden, welche
der 10, 102, 104,
106, 108, 1010, 1012-fachen der
Menge an Zielnukleinsäure
entspricht. Zusammengesetzte Primer und PTO können jeweils beliebig mit etwa
oder wenigstens etwa der folgenden Konzentrationen bereitgestellt
werden: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1000 nM, 2500 nM, 5000 nM.
-
In
einer Anwendungsform werden die zuvor erwähnten Komponenten gleichzeitig
am Anfang des Amplifikationsprozesses zugegeben. In einer anderen
Anwendungsform werden die Komponenten in einer beliebigen Reihenfolge
vor oder nach geeigneten Zeitpunkten während des Amplifikationsprozesses
zugegeben, wie es die Amplifikationsreaktion erfordert und/oder
zulässt.
Derartige Zeitpunkte, wovon einige unten angegeben sind, können ohne
weiteres von einem Fachmann ermittelt werden. Die Enzyme, die für eine Nukleinsäure-Amplifikation
gemäß den Verfahren
der Erfindung verwendet werden, können entweder vor dem Zielnukleinsäure-Denaturierungsschritt,
nach dem Denaturierungsschritt oder nach der Hybridisierung des
Primers an die Ziel-RNA zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden,
wie es mit Hilfe ihrer thermischen Stabilität und/oder anderer Überlegungen,
die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt wird. Synthesereaktionen
der Erststrang-cDNA (Extensionsprodukt des zusammengesetzten Primers)
und der Zweitstrang-cDNA (Extensionsprodukt des zweiten Primers)
können
aufeinanderfolgend durchgeführt
werden, gefolgt von den Amplifikationsschritten (Binden von einem
weiteren zusammengesetzten Primer, Primerextension und Strangverdrängung).
In diesen Anwendungsformen können
die Reaktionsbedingungen und Komponenten bei den verschiedenen Reaktionen
variieren.
-
Der
Amplifikationsprozess kann zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt
und zu einem späteren
Zeitpunkt wieder aufgenommen werden. Diese Zeitpunkte können ohne
weiteres von einem Fachmann ermittelt werden. Ein Zeitpunkt ist
das Ende der Synthese der Erststrang-cDNA. Ein weiterer Zeitpunkt
ist das Ende der Synthese der Zweitstrang-cDNA. Verfahren zum Stoppen
der Reaktionen sind in der Technik bekannt, einschließlich zum
Beispiel Kühlen
des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur, welche die Enzymaktivität hemmt,
oder Erwärmen
des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur, welche ein Enzym zerstört. Verfahren zur
Wiederaufnahme der Reaktionen sind in der Technik bekannt, einschließlich zum
Beispiel Erhöhen
der Temperatur des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur, welche
eine Enzymaktivität
zulässt
oder ein zerstörtes
(erschöpftes)
Enzym wiederherstellt. In einigen Anwendungsformen wird eine oder
mehrere Komponenten der Reaktion vor, bei oder nach der Wiederaufnahme
der Reaktionen ergänzt.
Zum Beispiel kann es erforderlich sein, den zusammengesetzten Primer
vor dem Beginn der linearen Amplifikationsreaktion zu ergänzen, falls
der gleiche Primer weiter verwendet wird. Alternativ darf die Reaktion
ohne eine Unterbrechung ablaufen (d.h. vom Start zum Ende).
-
Die
Reaktion darf ohne eine Reinigung der intermediären Komplexe ablaufen, zum
Beispiel um Primer zu entfernen. Produkte können zu verschiedenen Zeitpunkten
gereinigt werden, die ohne weiteres vom Fachmann ermittelt werden
können.
Ein Zeitpunkt ist das Ende der Synthese der Erststrang-cDNA. Ein
weiterer Zeitpunkt ist das Ende der Synthese der Zweitstrang-cDNA.
Wir haben beobachtet, dass eine routinemäßige Reinigung des Komplexes
aus erster und zweiter cDNA zu einer geringfügig höheren Amplifikationseffizienz in
den nachfolgenden linearen Amplifikationsschritten führt.
-
Der
Nachweis des Amplifikationsprodukts ist ein Hinweis auf das Vorhandensein
der Zielsequenz. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls durchführbar. Direkte
und indirekte Nachweisverfahren (einschließlich quantitativer Bestimmung)
sind in der Technik gut bekannt. Zum Beispiel kann durch Vergleich
der Menge an amplifiziertem Produkt von einer Testprobe, die eine
unbekannte Menge eines eine Zielsequenz enthaltenden Polynukleotids
enthält,
mit dem Amplifikationsprodukt einer Referenzprobe, die eine bekannte
Menge eines Polynukleotids besitzt, das eine Zielsequenz enthält, die
Menge an Zielsequenz in der Testprobe bestimmt werden. Die Amplifiaktionsverfahren
der Erfindung können
ebenfalls auf eine Analyse von Sequenzänderungen und Sequenzierung
der Zielnukleinsäure
erweitert werden. Außerdem
könnte
ein Nachweis mit Hilfe, zum Beispiel einer Untersuchung von Translationsprodukten
von RNA-Amplifikationsprodukten, bewerkstelligt werden.
-
Zusammensetzungen und Kits
der Erfindung
-
Die
Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen und Kits bereit, die
in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die Zusammensetzungen
können
hier beschriebene beliebige Komponente(n), Reaktionsgemische und/oder
Intermediate, wie auch beliebige Kombinationen davon, sein. Zum
Beispiel stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend
einen zusammengesetzten Primer und einen zweiten Primer, wobei der
zweite Primer ein Zufallsprimer ist. In einigen Anwendungsformen
umfasst der zweite Primer DNA. In anderen Anwendungsformen besteht
der zweite Primer aus DNA. In einem noch anderen Beispiel umfasst
die Zusammensetzung einen zusammengesetzten Primer und einen zweiten
Primer, der eine Nichtzielsequenz umfasst, der zum Zwecke der Erzeugung
verdrängter
Primer-Extensionsprodukte
enthalten ist, an die ein Propromotor-Polynukleotid hybridisieren
kann. Dieser zweite Primer kann ebenfalls ein Zufallsprimer sein.
-
In
einigen Anwendungsformen umfasst der zusammengesetzte Primer einen
zu dem DNA-Abschnitt benachbarten RNA-Abschnitt. In einer weiteren
Anwendungsform umfasst der zusammengesetzte Primer 5'- und 3'-DNA-Abschnitte mit
wenigstens einem dazwischen liegenden RNA-Abschnitt. In anderen
Anwendungsformen umfasst der zusammengesetzte Primer einen poly-dT-Abschnitt.
In einem weiteren Beispiel umfasst die Erfindung einen zusammengesetzte
Primer, der ein Zufallsprimer ist. In einigen Anwendungsformen umfasst
der zusammengesetzte Zufallsprimer oder zusammengesetzte Primer,
der einen poly-dT-Abschnitt umfasst, außerdem einen Abschnitt, der
an ein Ziel nicht hybridisierbar ist (unter Bedingungen, bei denen
ein Abschnitt des Primers an ein Ziel hybridisiert). In anderen
Beispielen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend
einen zusammengesetzten Primer, der außerdem durch Anheften einer
Komponente derivatisiert ist, die zur Bewerkstelligung einer Bindung
eines Polynukleotids fähig
ist, umfassend den zusammengesetzten Primer, an ein festes Substrat,
das zur Herstellung von Nukleinsäure-Mikroarrays verwendet
wird. In einigen Anwendungsformen ist der zusammengesetzte Primer
außerdem
durch Anheften einer positiv geladenen Komponente, wie ein Amin,
derivatisiert.
-
In
einigen Anwendungsformen stellt die Erfindung eine Zusammensetzung
bereit, umfassend einen zusammengesetzten Primer und ein Polynukleotid,
umfassend eine Propromotorsequenz, wie ein PTO (d.h. in einer beliebigen
der hier beschriebenen Anwendungsformen). Bezüglich der Zusammensetzungen,
die einen Zufallsprimer enthalten, können diese Zusammensetzungen
ebenfalls eine Vielzahl an Zufallsprimern (d.h. eine Population
an Zufallsprimern mit verschiedenen Sequenzen) enthalten.
-
In
bestimmten Anwendungsformen umfasst die Zusammensetzung (a) einen
zusammengesetzten Primer; (b) einen zweiten Primer (welcher ein
Zufallsprimer sein kann); und (c) eine reverse Transkriptase. In
noch anderen Anwendungsformen um fasst die Zusammensetzung (a) einen
zusammengesetzten Primer; (b) einen zweiten Primer (welcher ein
Zufallsprimer sein kann); (c) eine reverse Transkriptase; und (d)
eine DNA-Polymerase. In einigen Anwendungsformen umfasst die Zusammensetzung
(a) einen zusammengesetzten Primer; (b) einen zweiten Primer (welcher
ein Zufallsprimer sein kann); und (c) ein Polynukleotid, umfassend
eine Propromotorsequenz (welche ein PTO sein kann). Jede beliebige
dieser oberen Zusammensetzungen kann außerdem Ziel-RNA (welche eine
RNA-Sequenz von Interesse umfasst) und/oder beliebige der hier beschriebenen
Enzyme (wie DNA-Polymerase, zum Beispiel reverse Transkriptase,
RNase H und/oder RNA-Polymerase) umfassen. Die Zusammensetzungen
liegen im Allgemeinen in lyophilisierter oder wässriger Form, vorzugsweise
in einem geeigneten Puffer, vor.
-
Die
Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen bereit, umfassend die
hier beschriebenen Amplifikationsprodukte. Dementsprechend stellt
die Erfindung eine Population an DNA- oder RNA-Molekülen bereit, die
Kopien oder das Komplement einer Zielsequenz sind, die mit Hilfe
eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren (oder Zusammensetzungen,
umfassend die Produkte) erzeugt werden.
-
Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Population von Sense-Polynukleotidmolekülen (vorzugsweise
DNA) und Antisense-Polynukleotidmolekülen (vorzugsweise DNA) bereit,
die Kopien und Komplemente einer Zielsequenz sind und mit einem
beliebigen der hier beschriebenen Verfahren erzeugt sind. Die Erfindung
umfasst ebenfalls Zusammensetzungen und verschiedene Konfigurationen
(wie Arrays) dieser Populationen, die homogen (gleiche Sequenz)
oder heterogen (unterschiedliche Sequenz) sein können. Diese Populationen können eine
Ansammlung von Sequenzen sein, die mit den hier beschriebenen Verfahren
erhalten sind, einschließlich
basierend auf mRNA, ebenso wie bestimmte mRNA-Spezies oder mRNA-Klassen.
-
Die
Zusammensetzungen liegen im Allgemeinen in einem geeigneten Medium
vor, obwohl sie in lyophilisierter Form vorliegen können. Geeignete
Medien umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, wässrige Medien (wie reines Wasser
oder Puffer).
-
Die
Erfindung stellt Kits für
die Durchführung
der Verfahren der Erfindung bereit. Dementsprechend werden eine
Reihe verschiedener Kits in einer geeigneten Verpackung bereitgestellt.
Die Kits können
für eine oder
mehrere hier beschriebene Verwendungen eingesetzt werden und dementsprechend
können
sie Anleitungen für
eine oder mehrere der folgenden Verwendung enthalten: Amplifizieren
einer RNA-Sequenz;
Sequenzierung einer RNA-Sequenz von Interesse; Nachweis einer Sequenzmutation
basierend auf der Amplifizierung einer RNA-Sequenz (z.B. Genotypisierung
oder Nachweis einer Nukleinsäuremutation);
Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz von Interesse;
Verfahren zum Expressionsprofiling, Verfahren zur subtraktiven Hybridisierung;
Verfahren zur Herstellung einer subtraktiven Hybridisierungssonde;
Verfahren zur differenziellen Amplifikation; Verfahren zur Herstellung
von Bibliotheken (einschließlich
cDNA- und differenzieller Expressionsbibliotheken); Verfahren zur
Herstellung einer immobilisierten Nukleinsäure (die eine auf einem Mikroarray
immobilisierte Nukleinsäure
sein kann) und Verfahren zur Charakterisierung amplifizierter Nukleinsäureprodukte,
die mit den Verfahren der Erfindung erzeugt werden.
-
Die
Kits der Erfindung umfassen ein oder mehrere Behälter, die eine beliebige Kombination
der hier beschriebenen Komponenten umfassen, und nachfolgend sind
Beispiele für
derartige Kits angeführt.
Ein Kit kann einen beliebigen der hier beschriebenen Primer umfassen.
In einigen Anwendungsformen umfasst ein Kit zwei oder mehrere zusammengesetzte
Primer, die separat verpackt sein können. Ein Kit kann einen zusammengesetzten
Primer und ein Polynukleotid umfassen, das eine Propromotorsequenz
(die ein PTO sein kann) umfasst. Ein Kit kann außerdem einen zweiten Primer
(der ein Zufallsprimer sein kann) umfassen. Der zusammengesetzte
Primer kann markiert oder unmarkiert sein. Die Kits können gegebenenfalls
außerdem
irgendeines oder mehrere der hier beschriebenen Enzyme (zum Beispiel
RNA-abhängige DNA-Polymerase, wie
reverse Transkriptase, und Ribonuklease, wie RNase H) wie auch Desoxynukleosidtriphosphate
(markiert oder unmarkiert) und/oder Ribonukleosidtriphosphate (markiert
oder unmarkiert) enthalten. Die Kits können ebenfalls einen oder mehrere
geeignete Puffer enthalten (wie hier beschrieben). Die für eine Nukleinsäure-Sequenzierung
zweckdienlichen Kits können
gegebenenfalls markierte oder unmarkierte Nukleotidanaloga enthalten,
die nach einem Einbau in ein Primer-Extensionsprodukt oder RNA-Transkript
einen Abbruch der Nukleotidpolymerisierung bewirken. Ein oder mehrere
Reagenzien in dem Kit können
als ein trockenes Pulver, üblicherweise
lyophilisiert, einschließlich
Exzipienten, geliefert werden, die nach einem Auflösen eine
Reagenzlösung
mit den geeigneten Konzentrationen für eine Durchführung eines
beliebigen der hier beschriebenen Verfahren bereitstellen. Jede
Komponente kann in separaten Behältern
oder einige Komponenten können
in einem Behälter
gemeinsam enthalten sein, wo es die Kreuzreaktivität und Haltbarkeit
zulassen.
-
Die
Kits der Erfindung können
gegebenenfalls eine Reihe von Anleitungen, im allgemeinen in Papierform,
enthalten, obwohl elektronische Speichermedien (z.B. magnetische
Diskette oder optische Diskette), welche die Anleitungen enthalten,
ebenfalls geeignet sind, die sich auf die Verwendung von Komponenten
der Verfahren der Erfindung für
die beabsichtigte Nukleinsäure-Amplifikation
und/oder, wenn geeignet, für
eine Verwendung der Amplifikationsprodukte für Zwecke, wie Nukleinsäure-Sequenzierung und
Nachweis von Sequenzmutationen, beziehen. Die dem Kit beigefügten Anleitungen
enthalten im Allgemeinen Informationen über Reagenzien (ob im Kit enthalten
oder nicht), die für
die praktische Anwendung der Verfahren erforderlich sind, Anleitungen über die
Einsatzmöglichkeiten
des Kits und/oder geeignete Reaktionsbedingungen. Zum Beispiel können die
Kits der Erfindung umfassen: einen zusammengesetzten Primer (der
einen poly-dT-Abschnitt umfassen kann und/oder ein Zufallsprimer
sein kann), einen zweiten Primer (der ein Zufallsprimer sein kann)
und Anleitungen für
eine Verwendung der Primer für
eine Amplifizierung von RNA gemäß den Verfahren der
Erfindung. In einem weiteren Beispiel umfassen die Kits der Erfindung:
einen zusammengesetzten Primer (der einen poly-dT-Abschnitt umfassen
kann und/oder ein Zufallsprimer sein kann) und Anleitungen für eine Verwendung
der Primer für
eine Amplifizierung von RNA gemäß den Verfahren
der Erfindung. In einem weiteren Beispiel umfassen die Kits der
Erfindung: einen zusammengesetzten Primer, einen zweiten Primer
(der ein Zufallsprimer sein kann) und Anleitungen für eine Erzeugung
doppelsträngiger
komplementärer
DNA von einem RNA-Ziel und/oder für eine Amplifizierung von RNA
gemäß den Verfahren
der Erfindung. In einem noch weiteren Beispiel umfasst jedes dieser
Kits außerdem
ein Propromotor-Polynukleotid
und Anleitungen zur Herstellung eines Duplex von Primer- Extensionsprodukt
und dem Propromotor-Polynukleotid, so dass eine doppelsträngige Promotorregion
erzeugt wird und/oder für
eine Amplifizierung von RNA gemäß den Verfahren
der Erfindung. In einem anderen Beispiel umfassen die Kits der Erfindung
einen zusammengesetzten Primer (der einen poly-dT-Abschnitt umfassen
kann und/oder ein Zufallsprimer sein kann), der in der Lage ist,
eine Erststrang-cDNA zu erzeugen, einen zweiten zusammengesetzten
Primer, der in der Lage ist, an eine Erststrang-cDNA zu hybridisieren,
und Anleitungen für
die Verwendung der Primer, um doppelsträngige cDNA gemäß einem
beliebigen Verfahren der Erfindung zu erzeugen. In einem anderen
Beispiel umfassen die Kits der Erfindung einen doppelsträngigen cDNA-Komplex
(umfassend Erst- und Zweitstrang-cDNA), der einen einzelsträngigen 3'-Abschnitt umfasst.
In einem noch anderen Beispiel umfasst außerdem jedes dieser Kits eine
oder mehrere Kontrollen (die zum Beispiel ein RNA-Template, zusammengesetzte
Primer und/oder ein doppelsträngiger
cDNA-Komplex (umfassend Erst- und Zweitstrang-cDNA), der einen einzelsträngigen 3'-Abschnitt umfasst,
sein können).
-
Die
Komponente(n) des Kits können
in jeder beliebigen passenden, geeigneten Verpackung verpackt sein.
Die Komponenten können
getrennt oder in einer oder vielen Kombinationen verpackt sein.
Wo die Kits für
die praktische Durchführung
von Amplifikationsverfahren der Erfindung, die eine Transkription
umfassen, bereitgestellt sind, so wird die RNA-Polymerase (falls
enthalten) vorzugsweise getrennt von den Komponenten bereitgestellt,
die in den Schritten vor den Transkriptionsschritten verwendet werden.
-
Die
relativen Mengen der verschiedenen Komponenten in den Kits können sehr
weit variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien bereitzustellen,
welche die Reaktionen wesentlich optimieren, die bei der praktischen
Umsetzung der hier offen gelegten Verfahren erfolgen müssen und/oder
um die Empfindlichkeit eines jeden Assays noch weiter optimieren.
-
Die
Erfindung stellt ebenfalls Systeme für eine erfolgreiche Durchführung der
hier beschriebenen Verfahren bereit. Diese Systeme umfassen verschiedene
Kombinationen der oben diskutierten Komponenten. Zum Beispiel stellt
in einigen Anwen dungsformen die Erfindung ein System bereit, das
für eine
Erzeugung einer Zielpolynukleotidsequenz (oder Amplifizierung einer
Zielpolynukleotidsequenz) geeignet ist, umfassend (a) einen zusammengesetzten
Primer (einen beliebigen der hier beschriebenen Primer), (b) DNA-Polymerase; und
(c) Ribonuklease. In einigen Anwendungsformen umfasst das System
außerdem
ein Polynukleotid, umfassend eine Propromotorsequenz (welche ein
PTO sein kann) und eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase.
In anderen Anwendungsformen umfasst das System außerdem eine
RNA-abhängige
DNA-Polymerase. Jede beliebige Anwendungsform der Systeme kann ebenfalls
eine Template-(Ziel)-Sequenz umfassen, wie es hier beschrieben ist.
Ein System umfasst im Allgemeinen ein oder mehrere Geräte für die Ausführung der
Amplifikationsverfahren der Erfindung. Derartige Geräte umfassen
zum Beispiel Heizvorrichtungen (wie Heizblöcke oder Wasserbäder) und
Geräte,
die eine Automatisierung von einem oder mehreren Schritten der hier
beschriebenen Verfahren bewirken. Die Verfahren der Erfindung sind
besonders für
eine Verwendung mit miniaturisierten Geräten geeignet, wenn ein Temperaturwechsel
nicht bei jedem Schritt erforderlich ist. Ein nicht einschränkendes
Beispiel geeigneter Geräte
umfasst den BioAnalyzer (Agilant und Caliper) und den eSensor.
-
Die
Erfindung stellt ebenfalls Reaktionsgemische (oder Zusammensetzungen,
die Reaktionsgemische umfassen) bereit, die verschiedene Kombinationen
von hier beschriebenen Komponenten enthalten. Beispiele für Reaktionsgemische
sind beschrieben worden. In einigen Anwendungsformen stellt die
Erfindung Reaktionsgemische bereit, umfassend (a) eine Ziel-RNA;
(b) einen zusammengesetzten Primer, umfassend einen 3'-DNA-Abschnitt und
einen RNA-Abschnitt; (c) einen zweiten Primer; und (d) DNA-Polymerase.
Wie hier beschrieben, kann ein beliebiger der zusammengesetzten
Primer in dem Reaktionsgemisch enthalten sein (oder eine Vielzahl
an zusammengesetzten Primern), einschließlich eines zusammengesetzten
Primers, der einen 5'-RNA-Abschnitt
umfasst, der zu dem 3'-DNA-Abschnitt
benachbart ist. Das Reaktionsgemisch könnte ebenfalls außerdem ein
Enzym, wie RNase H, umfassen, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet.
Ein Reaktionsgemisch der Erfindung kann ebenfalls außerdem ein
Polynukleotid umfassen, das eine wie hier beschriebene Propromotorsequenz
umfasst. Ein weiteres Beispiel für
ein Reaktionsgemisch ist (a) ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt
(das als sol ches an seinem 5'-Ende
eine Sequenz enthält,
die zu dem 3'-DNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers komplementär ist, aber keine Sequenz enthält, die
zu dem RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers komplementär ist);
(b) ein Polynukleotid, umfassend eine Propromotorsequenz (zum Beispiel
ein PTO); und (c) eine RNA-Polymerase. Weitere Reaktionsgemische
sind hier beschrieben und werden von der Erfindung umfasst.
-
Die
Erfindung umfasst ebenfalls Zusammensetzungen, umfassend einen beliebigen
der hier beschriebenen Komplexe (welche in den hier beschriebenen
Verfahren Intermediate sind). Beispiele für derartige Komplexe sind in 1-8 schematisch
dargestellt. Als ein Beispiel für
einen Komplex der Erfindung dient ein Komplex, umfassend: (a) einen
Ziel-RNA-Strang; und (b) einen zusammengesetzten Primer, wobei dieser
Primer einen 3'-DNA-Abschnitt
und einen RNA-Abschnitt umfasst. Der zusammengesetzte Primer kann
einen RNA-Abschnitt besitzen, der 5' liegt und zu dem 3'-DNA-Abschnitt benachbart ist. Als ein
weiteres Beispiel für einen
Komplex der Erfindung dient ein Komplex, umfassend: (a) ein Extensionsprodukt
eines zusammengesetzten Primers; und (b) einen Ziel-RNA-Strang.
In einem noch weiteren Beispiel ist ein Komplex der Erfindung ein
Komplex, umfassend: (a) ein erstes Primer-Extensionsprodukt, wobei der erste Primer
ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen RNA-Abschnitt
und einen 3'-DNA-Abschnitt;
und (b) einen zweiten Primer. In einem wiederum weiteren Beispiel
ist ein Komplex der Erfindung ein Komplex, umfassend: (a) ein erstes Primer-Extensionsprodukt,
wobei der erste Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend
einen RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt; und (b)
ein zweites Primer-Extensionsprodukt. In einem noch weiteren Beispiel
ist ein Komplex der Erfindung ein Komplex, umfassend: (a) ein verdrängtes Primer-Extensionsprodukt,
wobei der Primer ein zusammengesetzter Primer ist, umfassend einen
RNA-Abschnitt und einen 3'-DNA-Abschnitt;
und (b) ein Propromotor-Polynukleotid
(wie ein PTO).
-
In
einem noch weiteren Beispiel ist ein Komplex der Erfindung ein doppelsträngiger cDNA-Komplex, umfassend
außerdem
einen RNA/DNA-Abschnitt an einem Ende, der mit einem beliebigen
der hier beschriebenen Verfahren erzeugt wird. In einigen Anwendungsformen
umfasst außerdem
der doppelsträngige
cDNA-Komplex einen zweiten RNA/DNA-Abschnitt an einem zweiten Ende.
In einem noch anderen Beispiel ist der Komplex der Erfindung ein
erstes und zweites Primer-Extensionsprodukt, umfassend einen einzelsträngigen 3'-DNA-Abschnitt, umfassend
einen einzelsträngigen
3'-DNA-Abschnitt,
der mit einem beliebigen der hier beschriebenen Verfahren erzeugt
wird. In einigen Anwendungsformen umfasst die Zusammensetzung außerdem eine
zweite 3' einzelsträngige Region.
In einem anderen Beispiel ist der Komplex der Erfindung (a) ein Komplex
aus erstem und zweitem Primer-Extensionsprodukt,
umfassend einen einzelsträngigen
3'-DNA-Abschnitt,
und (b) ein zusammengesetzter Primer, der an ein zweites Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert ist. In einem anderen Beispiel ist der Komplex der
Erfindung ein Komplex aus einer Erststrang-cDNA und einer Zweitstrang-cDNA
(der mittels Extension entlang der Erststrang-cDNA von einem Primer
erzeugt wird). In einigen Anwendungsformen umfasst der Primer ein
Fragment von Template-RNA, das an die Erststrang-cDNA hybridisiert
ist. In einigen Anwendungsformen ist der Primer DNA.
-
Verfahren, die Amplifikationsverfahren
und Zusammensetzungen der Erfindung nutzen
-
Die
Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können für verschiedene Zwecke genutzt
werden. Zum Zweck der Veranschaulichung sind Verfahren zur Sequenzierung,
Genotypisierung (Nachweis einer Nukleinsäuremutation), Bestimmung der
Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz von Interesse, Präparierung
einer immobilisierten Nukleinsäure
(die eine auf einem Mikroarray immobilisierte Nukleinsäure sein kann)
und Charakterisierung von Nukleinsäuren unter Verwendung amplifizierter
Nukleinsäureprodukte,
die mit den Verfahren der Erfindung erzeugt werden, beschrieben.
Verfahren zum Genexpressionsprofiling, Verfahren zur subtraktiven
Hybridisierung und der Herstellung von Sonden für eine subtraktive Hybridisierung,
und Verfahren zur Herstellung von Bibliotheken (welche cDNA- und
differenzielle Expressionsbibliotheken sein können) sind ebenfalls beschrieben.
-
Sequenzierung von RNA-Zielen unter Anwendung
der Verfahren der Erfindung
-
Die
Amplifikationsverfahren der Erfindung sind, zum Beispiel für eine Sequenzierung
von einer RNA-Sequenz von Interesse, zweckdienlich. Das Sequenzierungsverfahren
wird durch Amplifizierung einer Ziel-RNA, welche die Sequenz von
Interesse enthält,
mit einem beliebigen der hier beschriebenen Verfahren ausgeführt. Die
Addition von Nukleotiden während
der Primerextension wird mit Hilfe in der Technik bekannter Verfahren
analysiert, zum Beispiel Einbau eines Terminator-Nukleotids oder
Sequenzierung mittels Synthese (z.B. Pyrosequenzierung).
-
In
Anwendungsformen, wo das Endprodukt in Form von verdrängten DNA-Primer-Extensionsprodukten
vorliegt, können
zusätzlich
zu den Nukleotiden, wie natürliche
Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs), die in den Amplifikationsverfahren
verwendet werden, geeignete Nukleotidtriphosphat-Analoga, die markiert oder
unmarkiert sein können
und nach einem Einbau in ein Primer-Extensionsprodukt den Abbruch
der Primerextension bewirken, zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden.
Vorzugsweise werden die dNTP-Analoga nach einem hinreichend langen,
seit dem Start der Amplifikationsreaktion vergangenen Reaktionszeitraum zugegeben,
so dass eine erwünschte
Menge an zweitem Primer-Extensionsprodukt oder Fragment-Extensionsprodukt
erzeugt worden ist. Dieser Zeitraum kann von einem Fachmann empirisch
bestimmt werden.
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In
Anwendungsformen, wo das Endprodukt in Form von RNA-Produkten vorliegt,
kann eine Sequenzierung auf einer vorzeitigen (absichtlichen) Beendigung
der RNA-Transkription
beruhen. Die Zugabe von rNTP-Analoga zu dem Reaktionsgemisch, die
markiert oder unmarkiert sein können
und nach Einbau in ein RNA-Transkript den Abbruch der rNTP-Polymerisierung
bewirken, führt
zur Produktion verkürzter
RNA-Produkte, die
aus der Blockierung der RNA-Polymerase an den Einbaustellen der
Analoga resultieren.
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Geeignete
Analoga (dNTP und rNTP) umfassen diejenigen, die in anderen Sequenzierungsverfahren üblicherweise
verwendet werden und in der Technik gut bekannt sind. Beispiele
für dNTP-Analoga
umfassen Didesoxyribonukleotide. Beispiele für rNTP-Analoga (wie RNA-Polymerase-Terminatoren)
umfassen 3'-dNTP. Sasaki
et al., Biochemistry (1998) 95:3455-3460. Diese Analoga können markiert
sein, zum Beispiel mit Fluorochromen oder Radioisotopen. Diese Markierungen
können
ebenfalls Markierungen sein, die sich für die Massenspektroskopie eignen.
Die Markierung kann ebenfalls ein kleines Molekül sein, das ein Element eines
spezifischen Bindungspaars ist und nach dem Binden des anderen Elements
des spezifischen Bindungspaars detektiert werden kann, wie beispielsweise
Biotin und Streptavidin, wobei das letztgenannte Element des Bindungspaars
an ein Enzym konjugiert ist, das die Erzeugung eines detektierbaren
Signals katalysiert, das mit Verfahren, wie Kolorimetrie, Fluorometrie
oder Chemolumineszenz, detektiert werden könnte. Alle oberen Beispiele
sind in der Technik bekannt. Diese werden in das Primer-Extensionsprodukt
oder in die RNA-Transkripte durch die Polymerase eingebaut und dienen
der Beendigung der weiteren Extension entlang einer Templatesequenz.
Die resultierenden verkürzten
Polymerisierungsprodukte sind markiert. Die angehäuften verkürzten Produkte
variieren in ihrer Länge,
je nach der Einbaustelle des jeweiligen Analogons, welche die verschiedenen
Sequenzpositionen eines komplementären Nukleotids auf der Templatesequenz
darstellen.
-
Eine
Analyse der Reaktionsprodukte zur Aufklärung der Sequenzinformation
kann unter der Anwendung beliebiger verschiedener in der Technik
bekannter Verfahren ausgeführt
werden. Derartige Verfahren umfassen Gelelektrophorese und Detektion
markierter Banden mit Hilfe eines geeigneten Scanners, Sequenzierungs-Gelelektrophorese
und direkte Detektion der radiomarkierten Banden mit Phosphoreszenz,
wie beispielsweise einen Molecular Dynamics Reader, Kapillarelektrophorese
mit Hilfe eines Detektors, der für
in der Reaktion eingesetzte spezifische Markierungen angepasst ist,
und dergleichen. Die Markierung kann ebenfalls ein Ligand für ein Bindeprotein
sein, das für
die Detektion der Markierung zusammen mit einem an das Bindeprotein
konjugierten Enzym, wie Biotin-markierten Ketten-Terminator und
an ein Enzym konjugiertes Streptavidin, verwendet wird. Die Markierung
wird mit der Enzymaktivität
des Enzyms detektiert, das ein detektierbares Signal erzeugt. Wie
bei anderen in der Technik bekannten Sequenzierungsverfahren werden
die Sequenzierungsreaktionen für
die verschiedenen Nukleotidtypen (A, C, G, T oder U) entweder in
einem einzigen Reaktionsgefäß oder in
separaten Reaktionsgefäßen (wobei
jedes einen der verschiedenen Nukleotidtypen repräsentiert)
ausgeführt.
Die Wahl des anzuwendenden Verfahrens hängt von praktischen Überlegungen
ab, die dem Fach mann ohne weiteres einleuchten, wie den eingesetzten
Nukleotidtriphosphat-Analoga und/oder der verwendeten Markierung.
Folglich kann zum Beispiel, wenn jedes der Analoga unterschiedlich
markiert ist, die Sequenzierungsreaktion ein einem einzigen Gefäß ausgeführt werden.
Die Überlegungen
zur Wahl der Reagenzien und Reaktionsbedingungen für eine optimale
Durchführung
der Sequenzierungsanalyse gemäß den Verfahren
der Erfindung sind den für
die anderen zuvor beschriebenen Sequenzierungsverfahren ähnlich.
Die Reagenzien und Reaktionsbedingungen sollten den für die Nukleinsäure-Amplifikation
beschriebenen Verfahren der Erfindung gleichen.
-
Nachweis von Mutationen, einschließlich des
Nachweises von Mutationen, die auf einem Einzelstranq-Konformations-Polymorphismus
basieren, unter Anwendung der Amplifikationsverfahren der Erfindung
-
Die
DNA- oder RNA-Amplifikationsprodukte, die gemäß den Verfahren der Erfindung
erzeugt sind, sind ebenfalls für
eine Analyse für
den Nachweis einer beliebigen Änderung
in der Zielnukleinsäure
verglichen mit einer Referenznukleinsäuresequenz, die mit der Zielnukleinsäuresequenz
bis auf die Sequenzänderung identisch
ist, geeignet. Die Sequenzänderungen
können
in der genomischen Sequenz vorliegende Sequenzänderungen sein oder Sequenzänderungen
sein, die nicht in den genomischen DNA-Sequenzen enthalten sind,
zum Beispiel Änderungen
aufgrund von posttranslationalen Änderungen und/oder mRNA-Prozessierung, einschließlich Spleißvarianten.
Sequenzänderungen
(austauschbar als „Mutationen" bezeichnet) umfassen eine
Deletion, Substitution, Insertion und/oder Transversion eines oder
mehrerer Nukleotide.
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Die
DNA- oder RNA-Produkte der Amplifikationsverfahren sind für einen
auf einen Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP oder rSSCP)
basierenden Mutationsnachweis geeignet. Die Amplifikationsverfahren
der Erfindung können
direkt mit einem geeigneten Nachweismittel für einen Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus verbunden
werden, wie einem elektrophoretischen Trennverfahren für die Identifizierung
eines spezifischen Mobilitätsmusters
der einzelsträngigen
DNA- oder RNA-Produkte, für
die Aufklärung des
Vorliegens eines spezifischen Se quenzmerkmals oder -merkmale und/oder
des Vorliegens irgendeines Unterschieds in einer Testnukleinsäure verglichen
mit einer Referenznukleinsäure.
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Auf
Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese basierende Verfahren
können
für den
Nachweis und die Analyse verschiedener Einzelstrang-Konformationsisomere
genutzt werden. Alternativ ist es ebenfalls wahrscheinlich, dass
eine Spaltung eines DNA- oder RNA-Produkts mit Hilfe von Nukleasen,
die Sequenz-abhängige
Sekundärstrukturen
erkennen, für
die Bestimmung eines Sequenz-spezifischen Konformations-Polymorphismus
zweckdienlich sein kann. Derartige Nukleasen sind, wie der Cleavase
Assay (Third Wave), in der Technik bekannt. Die elektrophoretischen
Verfahren sind für
Hochdurchsatznachweisverfahren oder Genotypisierung potenziell geeigneter.
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Die
Bestimmung Sequenz-spezifischer elektrophoretischer Muster für eine gegebene
Nukleinsäuresequenz
ist, zum Beispiel für
den Nachweis spezifischer Allele einer Testsequenz, zweckdienlich.
Darüber
hinaus ist es zu erwarten, dass ein elektrophoretisches Mobilitätsmuster
für die
verschiedenen Allele sehr gut differenziert werden könnte, was
folglich den Nachweis zweier Allele in einer Nukleinsäureprobe
von einem einzelnen Individuum, wie es für den heterozygoten Genotyp
erforderlich ist, oder vieler Allele zuließe. Jede beliebige Änderung
in der Testnukleinsäuresequenz,
wie Basensubstitution, -insertionen oder -deletion, könnte unter Anwendung
dieses Verfahrens nachgewiesen werden. Von dem Verfahren ist zu
erwarten, dass es für
den Nachweis eines spezifischen einzelnen Basenpolymorphismus, SNP,
und die Entdeckung neuer SNPs zweckdienlich ist. Folglich stellt
sie Erfindung ebenfalls Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotids
bereit, umfassend einen einzelnen Nukleotid-Polymorphismus, umfassend:
(a) Amplifizieren eines Zielpolynukleotids unter Anwendung eines
beliebigen hier beschriebenen Verfahrens; und (b) Analysieren der
Amplifikationsprodukte auf eine Einzelstrang-Konformation, wobei
ein Unterschied in der Konformation im Vergleich mit einem einzelsträngigen Referenzpolynukleotid
einen einzelnen Nukleotidpolymorphismus in dem Zielpolynukleotid
anzeigt, wodurch ein Polynukleotid nachgewiesen wird, das einen
einzelnen Nukleotidpolymorphismus umfasst.
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Weitere
in der Technik bekannte Analyseverfahren für den Nachweis einer beliebigen Änderung
in der Zielnukleinsäuresequenz
im Vergleich mit einer Referenznukleinsäuresequenz sind für eine Verwendung
mit den einzelsträngigen
Nukleinsäureprodukten
der Amplifikationsverfahren der Erfindung geeignet. Derartige Verfahren
sind in der Technik gut bekannt und umfassen verschiedene Verfahren
für den
Nachweis von spezifischen definierten Sequenzen, einschließlich Verfahren,
die auf Allel-spezifischer Primerextension, Allel-spezifischer Sondenligation,
differenzieller Sondenhybridisierung und begrenzter Primerextension
basieren. Siehe zum Beispiel Kurn et al.,
U.S. Patent, Nr. 6.251.639 B1 ;
U.S. Patent Nrn. 5.888.819 ;
6.004.744 ;
5.882.867 ;
5.854.033 ;
5.710.028 ;
6.027.889 ;
6.004.745 ;
5.763.178 ;
5.011.769 ;
5.185.243 ;
4.876.187 ;
5.882.867 ;
5.731.146 ; WO
US88/02746 ;
WO 99/55912 ;
WO 92/15712 ;
WO 00/09745 ;
WO 97/32040 ;
WO 00/56925 und
5.660.988 . Folglich stellt die Erfindung
ebenfalls Verfahren zum Nachweis einer Mutation in einer RNA-Sequenz von Interesse
bereit, umfassend einen einzelnen Nukleotid-Polymorphismus, umfassend: (a)
Amplifizieren einer Ziel-RNA mit Hilfe eines beliebigen der hier
beschriebenen Verfahren; und (b) Analysieren der Amplifikationsprodukte
auf das Vorliegen einer Änderung
(Mutation) im Vergleich mit einem einzelsträngigen Referenzpolynukleotid.
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Verfahren zur Bestimmung der
Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz von Interesse
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Die
einzigartigen Eigenschaften des zweiten zusammengesetzten Primers
für eine
Verwendung in den isothermen Amplifikationsverfahren der Erfindung
liefern die Basis für
ein isothermes Verfahren für
den Nachweis definierter Mutationen (in dem Sinne definiert, dass
der Ort der Mutation definiert ist) oder polymorpher Stellen (wie
SNPs) in einer Zielnukleinsäuresequenz.
Das Verfahren ist für
eine Genotypisierung, Nachweis einer Mutation, die zu einer Arzneimittelresistenz
und dergleichen führt,
zweckdienlich.
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Der
oder die RNA-Abschnitte des zusammengesetzten Primers sind so gestaltet,
dass der Primer an die Sequenz der Test-Ziel-RNA, in der die Anwesenheit
einer Sequenzänderung
vermutet wird, hybridisierbar ist. Alternativ ausgedrückt, umfasst der
Primer einen RNA-Abschnitt(e), umfassend eine Sequenz, die an die RNA-Referenzsequenz hybridisierbar
ist (zum Beispiel eine Wildtyp-Sequenz), die mit der Sequenz in
der Test-Ziel-RNA verglichen werden soll. In einigen Anwendungsformen
sind die geänderte
Sequenz (d.h. die Sequenz, die eine Sequenzänderung umfasst) und die Referenzsequenz
Allele. Die Sequenzänderung
kann eine einzelne Nukleotidsubstitution, eine Deletion oder Insertion
sein.
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In
einer anderen Anwendungsform ist der oder die RNA-Abschnitte des
zusammengesetzten Primers so gestaltet, dass der Primer an die geänderte Sequenz,
deren Anwesenheit in der Test-Ziel-RNA vermutet wird, hybridisierbar
ist. Alternativ ausgedrückt,
umfasst der Primer einen RNA-Abschnitt(e), umfassend eine Sequenz,
die an die Test-Ziel-RNA und folglich nicht an die Referenzsequenz
(zum Beispiel eine Wildtyp-Sequenz) hybridisierbar ist, die mit
der Sequenz in der Test-Ziel-RNA verglichen werden soll. In einigen
Anwendungsformen sind die geänderte
Sequenz (d.h. die Sequenz, die eine Sequenzänderung umfasst) und die Referenzsequenz
Allele.
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Der
RNA-Abschnitt, im Allgemeinen ein 5'-RNA-Abschnitt, des zusammengesetzten
Primers umfasst eine Sequenz, die an eine bekannte normale Wildtyp-Sequenz
oder an einen bekannten mutierten Genotyp oder an einen polymorphen
Genotyp hybridisierbar ist. Im Allgemeinen umfasst ein geeigneter
zusammengesetzter Primer einen RNA-Abschnitt, der dem Primer ein
bevorzugtes Hybridisieren an eine Zielnukleinsäure gestattet, falls die Zielnukleinsäure eine
Sequenz umfasst, die an den RNA-Abschnitt
des Primers hybridisierbar ist, verglichen mit dem Fall, falls eine
Fehlpaarung vorhanden ist (d.h. der Primer besitzt die mutierte
Sequenz und das Ziel besitzt sie nicht oder umgekehrt), wobei die
Zielnukleinsäure
ein gebundenes Primer-Extensionsprodukt
aufweist und sein 5'-RNA-Abschnitt
abgespalten worden ist. Das Vorhandensein einer Sequenzänderung
verhindert im Allgemeinen nicht den anfänglichen Schritt der Amplifikationsverfahren,
so dass ein doppelsträngiger
Komplex aus ersten und zweiten Extensionsprodukten, umfassend einen
RNA/DNA-Heteroduplex, gebildet wird. Eine Ribonuklease, wie RNase
H, spaltet dann den RNA-Abschnitt des RNA/DNA-Heteroduplexes ab.
Während
es wahrscheinlich ist, dass das Vorliegen eines fehlgepaarten Basenpaars
das Spaltungsmuster des RNA/DNA-Hybrids beeinflusst, findet die
Abspaltung dennoch wahrscheinlich statt. Der nächste Schritt, die Bindung
eines weiteren zusammengesetzten Primers an den Komplex mittels Hybridisierung
des 5'-RNA-Abschnitts,
wird durch eine Fehlpaarung gehemmt, vorzugsweise verhindert. Dieser
Effekt hängt
von verschiedenen Faktoren ab, wie der Größe des hybridisierenden Oligonukleotids
und der Stringenz der Reaktionsbedingung. Diese Faktoren werden
bei der Gestaltung des zusammengesetzten Primers gemäß den bekannten
Techniken und Erfahrungen in der Technik berücksichtigt. Es ist ebenfalls
möglich, dass
die Fehlpaarung die Abspaltung des oder der RNA-Abschnitte des zusammengesetzten
Primers hemmt, was folglich die Amplifikation des Extensionsprodukt
des zweiten Primers verhindert. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Fehlpaarung
zu einer verminderten Effizienz der Abspaltung des RNA-Abschnitts
des Primers führt,
was zu einer verminderten Amplifikationseffizienz oder zur Produktion
von weniger Amplifikationsprodukt führt. Die Unfähigkeit
des zusammengesetzten Primers, an das Ziel bei diesem Schritt der
Amplifikation zu hybridisieren, verhindert weitere Schritte der
Primer-Extensionsstrangverdrängung
und die Erzeugung von vielfachen Kopien der Amplifikationsprodukte.
Es ist zu verstehen, dass der Nachweis einer Mutation mit den Verfahren
der vorliegenden Erfindung auf Basis der Abwesenheit oder Anwesenheit
einzelsträngiger
Amplifikationsprodukte oder durch quantitative Vergleiche der Menge
an angehäuftem
Primer-Extensionsprodukt erfolgen kann. Wenn zum Beispiel der zusammengesetzte
Primer die Referenzsequenz (zum Beispiel Wildtyp) umfasst, kann
die Anwesenheit einer Mutation zu keinen nachweisbaren Amplifikationsprodukten
führen;
alternativ kann sie zu nachweisbaren Produkten führen, aber zu weniger als sonst
von einem Templatestrang ohne Mutation erzeugt wird.
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Wenn
der zusammengesetzte Primer einen RNA-Abschnitt, im Allgemeinen
einen 5'-RNA-Abschnitt, umfasst,
der an einen mutierten Genotyp vollständig hybridisierbar ist, wird
eine Amplifikation einer Sequenz des normalem Genotyps verhindert
werden, während
ein Ziel eines mutierten Genotyps amplifiziert werden wird. Folglich
wird in diesem Fall der Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung
von vielfachen Kopien des Amplifikationsprodukts indikativ für die Anwesenheit
einer Zielsequenz des mutierten Genotyps sein. Zum Beispiel könnten parallele
Reaktionen, die entweder die Nukleinsäureprobe von Interesse oder
eine Referenzprobe einer Zielnukleinsäure mit einer Wildtyp-Sequenz
umfassen, durchgeführt
werden. Eine Anhäufung
von mehr Primer-Extensionsprodukt in der vorherigen Reaktion verglichen
mit der letzteren wäre
für die
Anwesenheit eines mutierten Genotyps in der Probe von Interesse
indikativ. Alternativ wird, wenn der zusammengesetzte Primer eine
5'-RNA-Sequenz umfasst,
die an eine normale Genotyp-Sequenz des Test-Ziels vollständig hybridisierbar
ist, eine Amplifikation einer Zielsequenz des mutierten Genotyps
verhindert und der Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung
von Amplifikationsprodukten ist für einen normalen Genotyp indikativ.
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Jedes
beliebige der Amplikationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist
für einen
wie oben beschriebenen Nachweis einer Mutation geeignet.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit
oder Abwesenheit einer Sequenz von Interesse bereit, wobei dieses
Verfahren umfasst (i) Amplifizieren einer Ziel-RNA, die eine Sequenz
von Interesse enthält,
wobei diese Amplifikation die Extension eines zusammengesetzten
Primers umfasst, der an einen gespaltenen Komplex von erstem und
zweitem Primer-Extensionsprodukt
hybridisiert ist, der mit einem beliebigen der hier beschriebenen
Verfahren hergestellt ist, wobei die Sequenz des RNA-Abschnitts
des zusammengesetzten Primers bekannt ist, und (ii) Vergleich der
Amplifikationsprodukte, falls vorhanden, von Schritt (i) mit der
Menge an Amplifikationsprodukten von einem Referenztemplate; worin (1)
eine Produktion von nachweisbar weniger Amplifikationsprodukten
von dem Template verglichen mit der Menge an Amplifikationsprodukten
von dem Referenztemplate, das eine an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbare Region umfasst, anzeigt, dass das zweite
Primer-Extensionsprodukt keine an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbare Sequenz umfasst und eine Sequenzvariante
bezüglich
der Sequenz ist, die an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbar ist; oder (2) eine Produktion von nachweisbar
mehr Amplifikationsprodukten von dem Template verglichen mit der
Menge an Amplifikationsprodukten von dem Referenztemplate, das keine
an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers hybridisierbare
Region umfasst, anzeigt, dass das zweite Primer-Extensionsprodukt eine an den RNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers hy bridisierbare Sequenz umfasst und
keine Sequenzvariante bezüglich
der Sequenz ist, die an den RNA-Abschnitt des zusammengesetzten
Primers hybridisierbar ist.
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Verfahren zur Herstellung auf einem Substrat
immobilisierter Nukleinsäuren,
einschließlich
eines Mikroarrays von Nukleinsäuren
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Die
einzelsträngigen
Produkte einiger Amplifikationsverfahren der Erfindung sind für eine Immobilisierung
auf einer Oberfläche
geeignet. Die einzelsträngigen
Produkte sind besonders für
die Herstellung von Mikroarrays geeignet, welche die einzelsträngigen Amplifikationsprodukte
umfassen.
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Einzelsträngige Amplifikationsprodukte
können
an einen festen oder halbfesten Träger oder Oberfläche befestigt
werden, der/die z.B. aus Glas, Kunststoff (z.B. Polystyrol, Polypropylen,
Nylon), Polyacrylamid, Nitrocellulose oder anderen Materialien hergestellt
sein können.
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Mehrere
Techniken sind in der Technik zum Befestigen von Nukleinsäuren an
ein festes Substrat, wie an einen Objektträger aus Glas, bekannt. Ein
Verfahren ist der Einbau von modifizierten Basen oder Analoga, die
einen Molekülrest
enthalten, der zur Befestigung auf einem festen Substrat fähig ist,
wie eine Aminogruppe, ein Derivat einer Aminogruppe oder eine andere
Gruppe mit einer positiven Ladung, in die amplifizierten Nukleinsäuren. Das
amplifizierte Produkt wird dann mit einem festen Substrat in Kontakt
gebracht, wie einem Glasobjektträger,
der mit einem Aldehyd oder einer anderen reaktiven Gruppe beschichtet
ist, die eine kovalente Bindung mit der reaktiven Gruppe eingeht,
die sich auf dem amplifizierten Produkt befindet und an den Glasobjektträger kovalent
gebunden wird. Mikroarrays, die die amplifizierten Produkte umfassen,
können
mit Hilfe eines Biodot (BioDot, Inc. Irvine, CA) Tüpfelgeräts und Aldehyd-beschichteten
Glasobjektträgern
(CEL, Associates, Houston, TX) hergestellt werden. Die Amplifikationsprodukte
können
auf die Aldehyd-beschichteten Glasobjektträger getüpfelt und
gemäß publizierten
Verfahren (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1995) 93:10614-10619)
bearbeitet werden. Die Arrays können
ebenfalls mit Robotern auf Glas, Nylon (Ramsay, G., Nature Biotechnol.
(1998), 16:40-44), Polypropylen (Matson, et al., Anal Biochem. (1995), 224(1):110-6)
und Silikonträgern
(Marshall, A. und Hodgson, J., Nature Biotechnol. (1998), 16:27-31)
gedruckt werden. Weitere Ansätze
für die
Herstellung von Arrays umfassen feines Mikropipettieren in elektrischen
Feldern (Marshall, A. und Hodgson, J., oben) und direktes Tüpfeln der
Polynukleotide auf positiv beschichtete Platten. Verfahren mit Hilfe
der Aminopropyl-Silikonoberflächenchemie
sind ebenfalls in der Technik bekannt, wie es unter http://www.cmt.corning.com
und http://cmgm.stanford.edu/pbrown offen gelegt ist.
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Ein
Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays erfolgt mittels Herstellung
hochdichter Polynukleotid-Arrays. Techniken für eine schnelle Anlagerung
von Polynukleotiden sind bekannt (Blanchard et al., Biosensors & Bioelectronics,
11:687-690). Weitere Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays,
z.B. mittels Maskierung (Maskos und Southern, Nuc. Acids Res. (1992),
20:1679-1684), können
ebenfalls angewandt werden. Prinzipiell könnte, wie oben angegeben, jeder
beliebige Array-Typ, zum Beispiel Dot-Blots auf einer Hybridisierungsmembran
aus Nylon, verwendet werden. Allerdings werden, wie es vom Fachmann
einzusehen ist, sehr kleine Arrays häufig bevorzugt, weil die Hybridisierungsvolumina
geringer sind.
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Die
amplifizierten Polynukleotide können
als eine Matrix auf Substrate getüpfelt werden, die Papier, Glas,
Kunststoff, Polystyrol, Polypropylen, Nylon, Polyacrylamid, Nitrocellulose,
Silikon, optische Faser oder irgendeine geeignete feste oder halbfeste
(z.B. dünne
Schicht eines Polyacrylamidgels (Khrapko, et al., DNA Sequence (1991),
1:375-388) Oberfläche
umfassen.
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Ein
Array kann als eine zweidimensionale Matrix auf einem ebenen Substrat
zusammengefügt
werden oder kann eine dreidimensionale Konfiguration einnehmen,
umfassend Nadeln, Stäbchen,
Fasern, Bänder,
Fäden,
Kügelchen,
Partikel, Mikrotitervertiefungen, Kapillaren und Zylinder und jede
beliebige andere Anordnung, die sich für eine Hybridisierung und Nachweis
von Zielmolekülen
eignet. In einer Anwendungsform ist das Substrat, an das die Amplifikationsprodukte
geheftet sind, magnetische Kügelchen
oder Partikel. In einer anderen Anwendungsform umfasst das Substrat
eine optische Faser. In einer noch weiteren Anwendungsform sind
die Amplifi kationsprodukte in einer flüssigen Phase in einer Kapillare
dispergiert, die wiederum bezüglich einer
festen Phase immobilisiert ist.
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Charakterisierung von Nukleinsäuren
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Die
Amplifikationsprodukte, die mit den Verfahren der Erfindung erhalten
werden, sind für
eine weitere Charakterisierung geeignet. Die einzelsträngige Natur
einiger Produkte der Verfahren erleichtert eine Charakterisierung.
Die Verfahren der Erfindung, die einzelsträngige Produkte erzeugen, sind
besonders für
eine quantitative Analyse geeignet, da hinreichend einzelsträngige DNA-
und RNA-Produkte erzeugt werden, die im Allgemeinen das Vorliegen
der verschiedenen mRNA in dem Ausgangsmaterial genau widerspiegeln.
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Die
amplifizierten Polynukleotidprodukte, entweder DNA oder RNA (d.h.
Produkte eines beliebigen der hier beschriebenen Amplifikationsverfahren),
können
zum Beispiel unter Anwendung von in der Technik bekannten Sondenhybridisierungstechniken,
wie Southern- und Northern-Blotting, und Hybridisierung an Sondenarrays
analysiert werden. Sie können
ebenfalls mit Hilfe Elektrophorese-gestützter Verfahren, wie differenzielles
Display und Größen-Charakterisierung,
die in der Technik bekannt sind, analysiert werden. Zusätzlich können die
einzelsträngige
DNA- und RNA-Produkte
als Ausgangsmaterial für
andere Ausgangsmaterialien für
weitere in der Technik bekannte analytische und/oder quantitative
Verfahren dienen, wie Echtzeit-PCR, quantitative
TaqMan, quantitative PCR unter Verwendung von molekularen Leuchtsignalen,
Verfahren, die in Kurn,
U.S.
Patent Nr. 6.251.639 etc. beschrieben sind. Folglich umfasst
die Erfindung solche weiteren analytischen und/oder quantitativen
Verfahren, wie sie für
jedes der Produkte der Verfahren hier angewandt werden.
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In
einer Anwendungsform werden die Amplifikationsverfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einzelsträngiger
Produkte genutzt und die einzelsträngigen Produkte werden durch
einen Kontakt mit einer Sonde analysiert.
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In
einer Anwendungsform werden die Amplifikationsverfahren zur Erzeugung
vielfacher Kopien einzelsträngiger
Polynukleotidprodukte (im Allgemeinen DNA) genutzt, die unter Verwendung
eines zusammengesetzten Primers markiert werden, die markiert sind
(in dem oder den Abschnitten, die nicht abgespalten werden). In
einer anderen Anwendungsform werden die Amplifikationsverfahren
zur Erzeugung vielfacher Kopien einzelsträngiger Polynukleotidprodukte
(DNA oder RNA) genutzt, die durch den Einbau markierter Nukleotide während der
DNA- oder RNA-Polymerisierung markiert werden. Zum Beispiel kann
eine Amplifikation gemäß den Verfahren
der Erfindung mit geeigneten markierten dNTPs oder rNTPs ausgeführt werden.
Diese markierten Nukleotide können
an eine Markierung direkt angeheftet werden oder können eine
Komponente umfassen, die an eine Markierung geheftet werden könnte. Die
Markierung kann an die Amplifikationsprodukte kovalent oder nichtkovalent
geheftet sein. Geeignete Markierungen sind in der Technik bekannt
und umfassen zum Beispiel einen Liganden, der ein Element eines
spezifischen Bindungspaars ist, das unter Verwendung eines detektierbaren
zweiten Elements des Bindungspaars detektiert/quantifiziert werden
kann. Folglich führt
die Amplifikation von Gesamt-mRNA gemäß den Verfahren der Erfindung
bei Anwesenheit zum Beispiel von Cy3-dUTP oder Cy5-dUTP zum Einbau
dieser Nukleotide in die Amplifikationsprodukte.
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Die
markierten amplifizierten Produkte sind besonders geeignet für eine Analyse
(zum Beispiel Nachweis und/oder quantitative Bestimmung) mittels
Inkontaktbringen dieser zum Beispiel mit Mikroarrays (mit jeder
beliebigen geeigneten Oberfläche,
umfassend Glas, Chips, Kunststoff), Kügelchen oder Partikeln, die
geeignete Sonden, wie cDNA- und/oder Oligonukleotid-Sonden, umfassen.
Folglich stellt die Erfindung Verfahren zur Charakterisierung (zum
Beispiel Nachweis und/oder quantitative Bestimmung) einer RNA-Sequenz
von Interesse bereit durch die Erzeugung markierter Polynukleotidprodukte
(im Allgemeinen DNA oder RNA) unter Anwendung von Amplifikationsverfahren
der Erfindung und die Analyse der markierten Produkte. Eine Analyse der
markierten Produkte kann zum Beispiel durch Hybridisierung der markierten
Amplifikationsprodukte, zum Beispiel an Sonden, die an spezifischen
Stellen auf einem festen oder halbfesten Substrat immobilisiert
sind, an Sonden, die auf definierten Partikeln immobilisiert sind,
oder an Sonden, die auf Blots (wie eine Mem bran), zum Beispiel Arrays,
immobilisiert sind, die oben beschrieben worden sind, ausgeführt werden.
Weitere Verfahren zur Analyse markierter Produkte sind in der Technik
bekannt, wie zum Beispiel durch Inkontaktbringen dieser mit einer
Lösung,
die Sonden enthält,
und anschließende
Extraktion der Komplexe, die die markierten Amplifikationsprodukte
und Sonden umfassen, aus der Lösung. Über die
Identität
der Sonden erfolgt die Charakterisierung der Sequenzidentität der amplifizierten
Produkte und folglich mittels Extrapolation die Identität der in
einer Probe vorliegenden Ziel-RNA.
Eine Hybridisierung der markierten Produkte ist detektierbar und
die Menge an spezifischen Markierungen, die detektiert wird, ist
zur Menge an markierten Amplifikationsprodukten einer spezifischen
RNA-Sequenz von Interesse proportional. Diese Messung ist, zum Beispiel
zum Messen der relativen Mengen der verschiedenen RNA-Spezies in
einer Probe, zweckdienlich, die mit den relativen Genexpressionslevels
in Beziehung stehen, wie es hier beschrieben ist. Die Menge an markierten
Produkten (wie zum Beispiel mit einem detektierbaren Signal angezeigt,
das mit der Markierung assoziiert ist), die an definierten Stellen
auf einem Array hybridisiert sind, können für den Nachweis und/oder die
quantitative Bestimmung der entsprechenden Ziel-RNA-Spezies in der
Probe indikativ sein.
-
Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Quantifizierung
eines einzelsträngigen Polynukleotids
(im Allgemeinen DNA oder RNA) bereit, umfassend die Verwendung eines
Oligonukleotids (Sonde) mit definierter Sequenz (das zum Beispiel
auf einem Mikroarray immobilisiert sein kann). Bei diesem Aspekt
der Erfindung sind markierte einzelsträngige Polynukleotidprodukte
(im Allgemeinen DNA oder RNA), umfassend definierte Sequenzen am
5' und/oder 3'-Ende (unter Verwendung
eines ersten oder zweiten Primers eingeführt, der mit einem Schwanz
versehen sind, wie es hier beschrieben ist), an definierte Oligonukleotide
hybridisierbar, wobei das Oligonukleotid das Komplement der definierten
Sequenz umfasst, die am 5' und/oder
3'-Ende eingeführt ist.
In einigen Anwendungsformen werden spezifische mRNA-Spezies unter
Verwendung eines zusammengesetzten und/oder zweiten Primers amplifiziert,
der einen Schwanz mit einer definierten Sequenz aufweist, die an
eine Sequenz hybridisierbar ist, die auf einem Array immobilisiert
ist (abhängig
davon, ob die definierte Sequenz in den zusammengesetzten oder zweiten
Primer eingebaut ist). Zum Beispiel umfasst in einer Anwendungsform
ein erster Primer einen 3'-Abschnitt,
der an eine Sequenz einer spezifischen RNA-Spezies hybridisierbar
ist, und einen 5'-Abschnitt,
der nicht an ein spezifisches RNA-Template hybridisierbar ist, sondern
an ein definiertes Oligonukleotid hybridisierbar ist. In einer anderen
Anwendungsform umfasst ein zweiter Primer einen 3'-Abschnitt, der an
eine Sequenz eines ersten Primer-Extensionsprodukts hybridisierbar
ist, und einen 5'-Abschnitt,
der nicht an ein erstes Primer-Extensionsprodukt hybridisierbar
ist, sondern er umfasst eine Sequenz eines definierten Oligonukleotids.
Vielfache Kopien einzelsträngiger
markierter DNA- oder RNA-Produkte werden erzeugt, die an ein Oligonukleotid
hybridisierbar sind. Es ist zu verstehen, dass, obwohl eine einzige
RNA-Spezies oben diskutiert ist, mehrere Spezies gleichzeitig amplifiziert werden
können,
jede mit einem zusammengesetzten Primer oder zweiten Primer, der
einen Schwanz umfasst, mit dem er an verschiedene definierte Oligonukleotide
hybridisierbar ist.
-
Bestimmung des Genexpressionsprofils
-
Die
Amplifikationsverfahren der Erfindung sind besonders für eine Anwendung
bei Bestimmung der Expressionslevels eines oder mehrerer Gene in
einer Probe geeignet, da die hier beschriebenen Verfahren zur Amplifikation
eines oder mehrerer, vorzugsweise einer Vielzahl an Ziel-RNAs in
der gleichen Probe fähig
sind. Wie es oben beschrieben ist, können die Amplifikationsprodukte
mit verschiedenen Verfahren, die hier beschrieben und/oder in der
Technik bekannt sind, nachgewiesen und quantifiziert werden. Da
die RNA ein Produkt einer Genexpression ist, sind die Levels der
verschiedenen RNA-Spezies, wie mRNAs, in einer Probe für die relativen
Expressionslevels der verschiedenen Gene (Genexpressionsprofil)
indikativ. Folglich liefert eine Bestimmung der Menge an RNA-Sequenzen
von Interesse, die in einer Probe vorliegt, wie durch eine quantitative
Bestimmung der Amplifikationsprodukte der Sequenzen ermittelt, eine
Bestimmung des Genexpressionsprofils der Probenquelle.
-
Dementsprechend
stellt die Erfindung Verfahren zur Bestimmung des Genexpressionsprofils
in einer Probe bereit, wobei diese Verfahren umfassen: Amplifizieren
eines einzelsträngigen
Produkts von wenigstens einer RNA-Sequenz von Interesse in der Probe
unter Anwendung eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren;
und Bestimmen der Menge an amplifizierten Produkten jeder RNA-Sequenz
von Interesse, wobei jede dieser Menge für die Menge jeder RNA-Sequenz
von Interesse in der Probe indikativ ist, wodurch das Genexpressionsprofil
in der Probe bestimmt wird. Im Allgemeinen werden markierte Produkte
erzeugt. In einer Anwendungsform ist die Ziel-RNA mRNA in einer
noch anderen Anwendungsform umfasst der zusammengesetzte Primer
eine poly-dT-Sequenz (so dass mRNA in einer Probe amplifiziert wird).
Es ist zu verstehen, dass die Menge an Amplifikationsprodukt mit
Hilfe quantitativer und/oder qualitativer Verfahren bestimmt werden
kann. Eine Bestimmung der Menge an Amplifikationsprodukt umfasst
die Bestimmung, ob ein Amplifikationsprodukt in der Probe vorliegt
oder nicht. Folglich kann ein Expressionsprofil eine Information über Anwesenheit
oder Abwesenheit einer oder mehrerer RNA-Sequenzen von Interesse beinhalten. „Abwesend" oder „Abwesenheit" des Produkts und „fehlender
Nachweis des Produkts",
wie hier verwendet, beinhaltet unwesentliche oder minimale Levels.
-
Die
Verfahren des Genexpressionsprofilings sind bei einem sehr breiten
Spektrum molekularer Diagnosen und insbesondere bei der Untersuchung
der Genexpression im Wesentlichen jeder beliebigen Säugerzelle
(einschließlich
einer einzigen Zelle) oder Zellpopulation zweckdienlich. Eine Zelle
oder Zellpopulation (z.B. ein Gewebe) kann zum Beispiel aus Blut,
Gehirn, Milz, Knochen, Herz, Gefäßen, Lunge,
Niere, Hypophyse, Embryozellen, Tumoren und dergleichen stammen.
Ein Expressionsprofiling ist ebenfalls für den Vergleich einer Kontrollprobe
(normal) mit einer Testprobe, einschließlich Testproben, die zu verschiedenen
Zeitpunkten gesammelt werden, einschließlich vor, nach und/oder während einer
Entwicklung, einer Behandlung und dergleichen, zweckdienlich.
-
Verfahren zur Herstellung
einer Bibliothek
-
Die
einzelsträngigen
DNA- und RNA-Produkte der Verfahren der Erfindung sind zur Herstellung
von Bibliotheken, einschließlich
cDNA-Bibliotheken und subtraktiver Hybridisierungsbibliotheken,
zweckdienlich. Unter Anwendung der Verfahren der Erfindung können Bibliotheken
von einer begrenzten Menge Ausgangsmaterial, zum Beispiel aus einer
begrenzten Menge Gewebe oder sogar aus einzelnen Zellen extrahierter mRNA,
hergestellt werden. Dementsprechend stellen mit einem Aspekt die Verfahren
der Erfindung die Herstellung einer Bibliothek von den einzelsträngigen DNA-
oder RNA-Produkten der Erfindung bereit. Mit einem anderen Aspekt
stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek
von der doppelsträngigen
cDNA bereit, die mit den Verfahren der Erfindung, die zwei zusammengesetzte
Primer umfassen, erzeugt ist. Verfahren zur Herstellung von Bibliotheken
von doppelsträngiger
cDNA sind in der Technik gut bekannt. Mit einem noch weiteren Aspekt
stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek
bereit, wobei diese Verfahren umfassen: Herstellen einer subtraktiven
Hybridisierungssonde mit Hilfe eines beliebigen der hier beschriebenen
Verfahren.
-
In
einigen Anwendungsformen ist der erste zusammengesetzte Primer an
die poly-A-Sequenz
hybridisierbar, die eigentlich in allen mRNAs vorgefunden wird.
In anderen Anwendungsformen ist der erste zusammengesetzte Primer
ein Zufallsprimer.
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Verfahren zur subtraktiven
Hybridisierung
-
Die
Amplifikationsverfahren der Erfindung sind besonders für eine Anwendung
in subtraktiven Hybridisierungsverfahren geeignet, in denen (wenigstens)
eine erste und zweite Ziel-RNA-Population verglichen wird, da die
hier beschriebenen Verfahren zur Amplifizierung vieler Ziel-RNAs
in der gleichen Probe fähig
sind, und die Verfahren der Erfindung zur Erzeugung großer Mengen
an einzelsträngiger
Antisense-Nukleinsäure geeignet
sind, die sich für
eine Verwendung als „Driver" bei einer subtraktiven
Hybridisierung eignet. Zum Beispiel ist es möglich, zwei Nukleinsäure-Populationen, eine
Sense- und eine Antisense-Population, zusammenzumischen, wobei eine
Population in einem molaren Überschuss
(„Driver") vorliegt. Sequenzen,
die in beiden Population vorkommen, werden Hybride bilden, während Sequenzen,
die nur in einer Population vorkommen, einzelsträngig bleiben. Anschließend werden
mit verschiedenen, gut bekannten Techniken die unhybridisierten Moleküle, die
differenziell exprimierte Sequenzen repräsentieren, abgetrennt. Siehe
z.B. Hamson et al.,
U.S. Patent
Nr. 5.589.339 ; Van Gelder,
U.S.
Patent Nr. 6.291.170 .
-
Dementsprechend
stellt die Erfindung Verfahren zur Durchführung einer subtraktiven Hybridisierung bereit,
wobei diese Verfahren umfassen: (a) Erzeugung vielfacher DNA-Kopien
des Komplements wenigstens einer RNA-Sequenz von Interesse von einer
ersten RNA-Population unter Anwendung eines beliebigen der hier
beschriebenen Verfahren; und (b) Hybridisieren der vielfachen Kopien
an eine zweite mRNA-Population, wodurch
eine Subpopulation der zweiten mRNA-Population einen Komplex mit
einer Nukleotid-DNA-Kopie bildet. Die Erfindung stellt ebenfalls
Verfahren zur Durchführung
einer subtraktiven Hybridisierung bereit, wobei diese Verfahren
umfassen: Hybridisieren vielfacher Kopien des Komplements wenigstens
einer RNA-Sequenz von
Interesse von einer ersten RNA-Population unter Anwendung eines
beliebigen der hier beschriebenen Amplifikationsverfahren an eine
zweite mRNA-Population,
wodurch eine Subpopulation der zweiten mRNA-Population einen Komplex
mit einer Kopie bildet. In einigen Anwendungsformen wird „Driver" einzelsträngiges Antisense-DNA-Produkt
der Verfahren der Erfindung mit Tester-(Sense)-mRNA-Spezies vereinigt. In
einigen Anwendungsformen wird „Driver" einzelsträngiges Antisense-Nukleinsäureprodukt
(im Allgemeinen DNA) unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren
der Erfindung und eines ersten zusammengesetzten Primers, der an
die poly-A-Sequenz hybridisierbar ist, erzeugt (im Wesentlichen
werden alle mRNA-Spezies amplifiziert). In einer anderen Anwendungsform
ist der erste zusammengesetzte Primer ein Zufallsprimer.
-
Mit
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur differenziellen
Amplifikation bereit, in denen einzelsträngige Driver (Antisense)-DNA-Sequenzen,
die mit Tester-mRNA-Sequenz hybridisieren, mit Hilfe eines Agens,
wie RNase H, das die in einem DNA/RNA-Hybrid vorhandene RNA abspaltet,
einer Spaltung unterzogen werden. Die Abspaltung der mRNA führt zu der
Unfähigkeit,
einzelsträngiges
DNA-Produkt von den
Test-mRNA-Strängen
zu erzeugen. Umgekehrt kann nicht-gespaltener Tester (d.h. Tester-mRNA,
die nicht an Driver DNA-Moleküle
hybridisierte) als ein Substrat für die nachfolgende Amplifikation
dienen. Amplifizierte differenziell exprimierte Produkte werden
vielfältig
genutzt, einschließlich
als eine differenzielle Expressionssonde für die Herstellung differenzieller
Expressionsbibliotheken. Dementsprechend stellt die Erfindung Verfahren
zur differenziellen Amplifikation einer oder mehrerer RNA-Sequenzen
von Interesse bereit, wobei die Verfahren umfassen: (a) Erzeugung
vielfacher Polynukleotid-Kopien (im Allgemeinen DNA) des Komplements wenigstens
einer RNA-Sequenz von Interesse von einer ersten RNA- Population unter
Anwendung eines beliebigen der hier beschriebenen Verfahren; (b)
Hybridisieren der vielfachen Kopien an eine zweite mRNA-Population,
wodurch eine Subpopulation der zweiten mRNA-Population einen Komplex
mit einer DNA-Kopie bildet; (c) Abspalten der RNA in dem Komplex
von Schritt (b) mit einem Enzym, das RNA von einem RNA/DNA-Hybrid
abspaltet; und (d) Amplifizieren einer unhybridisierten Subpopulation
der zweiten mRNA-Population, wodurch vielfache Kopien einzelsträngiger DNA,
die zu der unhybridisierten Subpopulation der zweiten mRNA-Population komplementär ist, erzeugt
werden. In einigen Anwendungsformen wird Schritt (d) unter Anwendung
eines beliebigen der hier beschriebenen Amplifikationsverfahren
ausgeführt.
In einigen Anwendungsformen umfassen die Verfahren eine Hybridisierung
vielfacher Polynukleotid-Kopien (im Allgemeinen DNA) des Komplements
wenigstens einer RNA-Sequenz von Interesse von einer ersten RNA-Population unter Anwendung
eines beliebigen der hier beschriebenen Amplifikationsverfahren
an eine zweite mRNA-Population, wodurch eine Subpopulation der zweiten
mRNA-Population einen Komplex mit einer DNA-Kopie bildet; (b) Abspalten
der RNA in dem Komplex von Schritt (a) mit einem Enzym, das RNA
von einem RNA/DNA-Hybrid abspaltet; und (c) Amplifizieren einer
unhybridisierten Subpopulation der zweiten mRNA-Population, wodurch vielfache
Kopien einzelsträngiger
DNA, die zu der unhybridisierten Subpopulation der zweiten mRNA-Population
komplementär
ist, erzeugt werden.
-
Die
folgenden Beispiele werden für
eine Veranschaulichung aber nicht Beschränkung der Erfindung gegeben.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Amplifikation von Gesamt-poly-A-mRNA
-
Poly-A-mRNA
von der MOLT-4 Zelllinie (CLONTECH 6587-1) wurde als ein Ziel für eine Amplifikation eingesetzt.
Der Amplifikationsprozess erfolgte in drei Schritten: 1) Synthese
des ersten cDNA-Strangs; 2) Synthese des zweiten cDNA-Strangs, um
eine doppelsträngige
cDNA von der Gesamt-mRNA der Probe herzustellen; und 3) Amplifikation
der Gesamt-mRNA. Das doppelsträngige
cDNA-Produkt umfasst an einem Ende einen RNA/DNA-Heteroduplex, der
ein Substrat für
RNase H darstellt. Die Sequenz der beiden Stränge dieses Abschnitts des Heteroduplexes
ist nicht mit dem Ziel verwandt und wird durch die Verwendung eines
zusammengesetzten (ersten) Primers eingebaut.
-
Primer-Sequenzen:
-
- MTA1: GACGGAUGCGGUCUTTTTTTT
- MTA2: GACGGAUGCGGUCUTTTTTTTN
- MTA3: GACGGAUGCGGUCUTTTTTTTNN
worin kursive Nukleotide
für Ribonukleotide
stehen und „N" für ein degeniertes
Nukleotid steht (d.h., es kann A, T, C oder G sein).
-
Schritt 1: Synthese der Erststrang-cDNA
von poly-A-mRNA
-
- 0,1 μg
Gesamt-poly-A-mRNA wurde mit den folgenden Reagenzien in ei nem
Gesamtvolumen von 10 μl
gemischt:
- 0,2 μl
Primer MTA3 (100 μM)
- 0,5 μl
dNTPs (25 mM)
- 0,1 μl
Rnasin
- 0,1 μl
DTT
- 2 μl
5X AMV reverse Transkriptase Reaktionspuffer
- DEPC-behandeltes Wasser ad 10 μl Gesamtvolumen
-
Das
Reaktionsgemisch wurde 2 min bei 75°C inkubiert und dann auf 37°C gekühlt. 1 μl AMV reverse Transkriptase
(USB 70041Y, 15 U/μl)
wurde zu jeder Reaktion gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei dieser
Temperatur weitere 60 min inkubiert.
-
Schritt 2: Synthese der Zweistrang-cDNA
-
Das
Reaktionsgemisch für
die Erststrang-cDNA wurde mit 10 μl
Synthesegemisch für
die Zweitstrang-cDNA gemischt, das folgendes enthielt:
- 1 μl 10X Klenow
Reaktionspuffer
- 0,1 μl
dNTPs (25 mM)
- 0,5 μl
Klenow (USB 2141Y 5 U/μl)
DNA-Polymerase
- 8,4 μl
Wasser
-
Das
Reaktionsgemisch wurde 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend wurde
5 min auf 75°C
erhitzt, um die Reaktionen durch Inaktivierung der Enzyme zu stoppen.
-
Schritt 3: Amplifikation der Gesamt-cDNA
-
Zwei
zusammengesetzte Primer wurden getestet - - MTA1 und MTA2.
-
Die
Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt, das folgendermaßen zusammengesetzt
war:
- 1 μl
cDNA-Reaktion
- 0,2 μl
MTA1 oder MTA2 (beide mit 100 μM)
- 0,2 μl
25 mM dNTPs
- 0,1 μl
Rnasin
- 0,1 μl
DTT
- 17,2 μl
Wasser
-
Das
obige Gemisch wurde bei 94°C
20 Sekunden inkubiert und dann auf 50°C gekühlt. Ein Gemisch aus 2U BOA,
0,02 U Hybridase (RNase H) und 0,4 μg T4 Gene 32 protein (einzelsträngige DNA
bindendes Protein) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde
bei 50°C
60 min inkubiert.
-
Je
5 μl Reaktionsgemisch
wurde mittels Elektrophorese auf 5-20% PAGE (Novex) analysiert.
Eine erfolgreiche Amplifikation wurde durch die Reaktionsprodukte
der amplifizierten Gesamt-mRNA angezeigt, die als ein Schmier auftraten,
was aufgrund einer Amplifikation einer Vielzahl an mRNA-Spezies
erwartet war. Kein Produkt wurde in Reaktionen beobachtet, die ohne
eine der folgenden Komponenten ausgeführt wurden: a. eingesetzte
doppelsträngige
cDNA; b. Primer für
die Synthese des Erststrangs; und c. eingesetzte mRNA für die Synthese
der Erststrang-cDNA.
-
Beispiel 2: Charakterisierung von Produkten
aus Reaktionsschritt 2 und 3 von Beispiel 1
-
In
den Amplifikationsreaktionen von Beispiel 1 wird erwartet, dass
eine „einzigartige" Sequenz (d.h. eine
Sequenz, die nicht an ein RNA-Template hybridisierbar ist) am 3'-Ende der Zweitstrang-cDNA aufgrund der „einzigartigen" Sequenz des 5'-RNA-Abschnitts des eingesetzten
zusammengesetzten Primers geschaffen wird. Diese Sequenz (des 3'-Endes der Zweitstrang-cDNA)
ist zu dem 5'-RNA-Abschnitt
des zusammengesetzten Primers komplementär und ist nicht mit den Sequenzen
in der Ziel-RNA verwandt. Um das Vorhandensein dieser Sequenz in
der erhaltenen Zweitstrang-cDNA zu bestimmen, wurde eine PCR-Amplifikation
der Reaktionsprodukte (wie sie im Reaktionsgemisch von Schritt 2
des Beispiels 1 gefunden wurden) unter Verwendung eines Primers,
der zu der erwarteten Sequenz am 3'-Ende der Zweitstrang-cDNA komplementär ist, als
Vorwärts-Primer,
und eines G3PDH-spezifischen Primers als ein PCR-Rückwärts-Primer
ausgeführt.
Von diesem Primerpaar wäre
zu erwarten, dass es ein spezifisches Produkt einer doppelsträngigen cDNA,
die eine „einzigartige" Sequenz aufweist,
amplifizieren würde.
Es würde
allerdings nicht erwartet werden, dass das Paar ein spezifisches
Produkt von der PCR-Amplifikation der Antisense-DNA-Produkte (wie
sie im Reaktionsgemisch von Schritt 3 des Beispiels 1 gefunden werden)
erzeugen würde,
weil von diesen Produkten nicht erwartet wird, dass sie die „einzigartige" Sequenz enthalten
(die von dem RNA-Abschnitt des zusammengesetzten Primers eingeführt wird,
der von RNase H abgespalten wird). Da das Reaktionsgemisch von Schritt
3 des Beispiels 1 überwiegend
amplifizierte DNA-Produkte enthält
(die keine „einzigartige" Sequenz enthalten
sollten), wäre
von einer PCR-Amplifikation dieses Reaktionsgemisches zu erwarten,
dass sie viel weniger effizient ist (und folglich wesentlich weniger
Produkte erzeugt) als die PCR-Amplifikation
des Reaktionsgemisches von Schritt 2 (der primär doppelsträngiges cDNA-Produkt enthält).
-
PCR-Reaktionen
wurden folgendermaßen
ausgeführt:
Je
50 μl PCR-Reaktion
enthält:
- je 0,4 μM
Primer (Biosource International)
- je 100 μM
dNTP (Epicenter)
- 2 mM Magnesiumchlorid (Epicenter)
- 1-2 Einheiten Polymerase (entweder Master Amp taq oder Master
Amp Tfl, beide von Epicenter)
- 5 μl
10X Puffer, mit dem Enzym supplementiert
-
Entweder
0,5 μl lineare
PCR-Amplifikationsreaktion des dritten Schritts in Beispiel 1 oder
eine 1:20 Verdünnung
der in Schritt 2 von Beispiel 1 erzeugten cDNA.
-
Die
PCR-Amplifikationszyklen waren 94°C
30 Sekunden, 51°C
30 Sekunden und 72°C
30 Sekunden. Im Allgemeinen durchliefen die Proben 20 oder 25 Zyklen.
Es erfolgte eine fünfminütige finale
Extension bei 72°C
bevor die Proben bei 4°C
gehalten wurden.
-
Ähnliche
Versuche wurden mit einem Primer ausgeführt, der für die T-Zellrezeptor-spezifische mRNA (TCR),
die von der MOLT4-Zelllinie exprimiert wird, spezifisch war. Erwartete PCR-Produktgröße (Basenpaare)
unter Verwendung der G3PDH-Primer
RÜCKWARTS-PRIMER | VORWÄRTS-PRIMER | VORWÄRTS-PRIMER |
| G3PDH3 | dMTA1 |
G3PDH5-2 | 18 | 62 |
G3PDH5-3 | 110 | 156 |
G3PDH5-4 | 157 | 203 |
G3PDH5 | 253 | 299 |
G3PDH5-6 | 309 | 354 |
G3PDH5-7 | 361 | 405 |
Primer-Sequenzen
G3PDH5: | 5' TTT CCT GGT ATG
ACA ACG AA |
G3PDH5-4: | 5' CCA GCA AGA GCA
CAA GAG GA |
G3PDH3: | 5' GAT GGT ACA TGA
CAA GGT |
dMTA1: | 5' GAC GGA TGC GGT
CTT TTT TTT |
Erwartete PCR-Produktgröße (Basenpaare)
unter Verwendung von T-Zellrezeptor-Primern
| TCR3 | dMTA1 |
TCR5-2 | 160 | ungefähr 440 |
TCR5 | 238 | ungefähr 500 |
Primer-Sequenzen
TCR5: | 5' CCC GCA ACC ACT
TCC GCT GTC |
TCR5-2: | 5' CAA ACC CGT CAC
CCA GAT CGT |
TCR3: | 5' CAA CAC AAG GGC
GCT GAC C |
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die einzigartige Sequenz in der Zweitstrang-cDNA
eingebaut wird, wie es angezeigt wird mit der Anwesenheit des Produkts,
das etwa 250 Basenpaare lang ist, wenn das Reaktionsgemisch von
Schritt 2 unter Verwendung der Primer DMTA1 und G3PDH5 (Amplifikation
einer G3PDH mRNA-Sequenz) einer PCR-Amplifikation unterzogen wurde,
und eines Produkts mit etwa 400 Basenpaa ren, wenn die Primer DMTA1
und TCR5-2 verwendet wurden (Amplifikation einer Sequenz einer TCR-beta-Kette mRNA).
Die PCR-Amplifikation des Reaktionsgemisches des Schritts 3 mit
den gleichen Primerpaaren zeigte andererseits eine wesentlich verringerte
Menge an Amplifikationsprodukten. Folglich zeigten die Ergebnisse den
Einbau der „einzigartigen" Sequenz (des RNA-Abschnitts
des in Beispiel 1 eingesetzten zusammengesetzten Primers) in die
erzeugten doppelsträngigen
cDNA-Produkte und
die Abwesenheit der Sequenz in den amplifizierten cDNA-Endprodukten (aufgrund
der Abspaltung des RNA-Abschnitts).
-
Beispiel 3: Amplifikation von Gesamt-mRNA
ausgehend von einem Präparat
der Gesamt-RNA
-
Die
Fähigkeit,
Gesamt-mRNA von einem Gesamt-RNA-Präparat zu amplifizieren, vereinfacht
aufgrund des Wegfalls des mRNA-Reinigungsschritts den Prozess wesentlich.
Die experimentelle Demonstration der Amplifizierung von Gesamt-mRNA
von einem Gesamt-RNA-Präparat
unter Anwendung der Verfahren der Erfindung wurde unter Verwendung
eines im Handel erhältlichen
Gesamt-RNA-Präparats
von einem Brustkrebstumor (CLONTECH; Kat.-Nr. 64015-1) ausgeführt. Der
Amplifikationsprozess von Gesamt-mRNA wurde in drei Schritten folgendermaßen ausgeführt.
-
Primer-Sequenz:
-
- MTB2: GAC GGA UGC GGU CUTTTTTTTTTTTTTTNN
- BA5: AAC TAC CTT CAA CTC CAT CA
- BA3: GGA CTC GTC ATA CTC CTG C
worin die kursiven Nukleotide
für Ribonukleotide
stehen und „N" für ein degeneriertes
Nukleotid steht (d.h. es kann A, T, C oder G sein).
-
Schritt 1: Synthese der Erststrang-cDNA
-
Jedes
Reaktionsgemisch umfasste folgendes:
- 4 μl 5X Puffer (250 mM Tris-HCl,
pH 8,3; 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)
- MTB2-Primer ad 1 μM
- 25 mM dNTPs
- 0,2 μl
RNasin Ribonuklease-Inhibitor (Promega N2511, 40 U/μl)
- 1 μl
0,1 M DTT
- 5 μg,
1 μg, 0,2 μg oder 40
ng Gesamt-RNA pro Reaktion
- DEPC-behandeltes Wasser ad 19 μl Gesamtvolumen
-
Die
Reaktionsgemische wurden bei 75°C
2 Minuten inkubiert und dann auf 42°C abgekühlt. SuperScript II RNase H- reverse Transkriptase (200 U, BRL 18064-022)
wurde zu jeder Reaktion gegeben und die Reaktionen wurden bei 42°C 50 Minuten
inkubiert.
-
Schritt 2: Synthese der Zweitstrang-cDNA
-
10 μl Reaktionsgemisch
der Synthese der Erststrang-cDNA wurden in die einzelnen Reaktionsröhrchen gleichmäßig aufgeteilt.
20 μl Stammreaktionsgemisch
der Synthese des zweiten Strangs wurde zu jedem Röhrchen gegeben.
Das Stammreaktionsgemisch der Synthese des zweiten Strangs enthielt
folgendes:
- 2 μl
10X Klenow Reaktionspuffer (10X Puffer: 500 mM Tris-HCl, pH 8,0;
100 mM MgCl2, 500 mM NaCl)
- 2 U Klenow DNA-Polymerase (BRL 18012-021)
- 0,1 μl
AMV reverse Transkriptase (BRL 18020-016, 25 U/μl)
- 0,2 μl
E. coli Ribonuklease H (BRL 18021-014, 4 U/μl)
- 0,2 μl
(25 mM) dNTPs
- 0 oder 0,2 μl
E. coli DNA-Ligase (BRL 18052-019, 10 U/μl)
-
Die
Reaktionsgemische wurden bei 37°C
30 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch 5 Minuten Erhitzen
auf 75°C,
um die Enzyme zu inaktivieren, gestoppt.
-
Schritt 3: Amplifikation von Gesamt-cDNA
-
Die
Amplifikation wurde unter Verwendung von 1 μl Reaktionsgemisch der Zweitstrang-cDNA
oben unter Verwendung des MTA1 zusammengesetzten Primers in Gegenwart
von T4 Gene 32 Protein bei 50°C
60 Minuten ausgeführt.
-
Jedes
Reaktionsgemisch umfasste folgendes:
- 2 μl 10X Puffer (200 mM Tris-HCl,
pH 8,5; 50 mM MgCl2, 1% NP-40)
- 0,2 μl
dNTPs (25 mM)
- 0,2 ml MTA1 (100 μM)
- 1 μl
Synthesegemisch der Zweitstrang-cDNA
- 0,1 μl
RNasin
- 0,1 μl
DTT (0,1 M)
- DEPC-behandeltes Wasser ad 18,8 μl Gesamtvolumen
-
Die
Reaktionsgemische wurden bei 94°C
20 Sekunden inkubiert und dann auf 50°C abgekühlt. 2 U Bca (Takara Kat.-Nr.
2710A) 0,02 U Hybridase Thermostable RNase H (Epicentre H39100)
und 0,4 μg
T4 Gene 32 Protein (USB 70029Z) wurden zugegeben und die Reaktionen
wurden weitere 60 Minuten bei dieser Temperatur inkubiert.
-
Das
Reaktionsgemisch des Schritts 3 (von dem erwartet wurde, dass es
amplifizierte DNA-Produkte enthält)
wurde mittels Gelektrophorese (5-20% PAGE, Novex) analysiert. Eine
erfolgreiche Amplifikation wurde durch die Amplifikationsprodukte
der Gesamt-mRNA angezeigt, die als ein Schmier auftraten, was aufgrund der
Amplifikation einer Vielzahl an mRNA-Spezies in der Probe erwartet
wurde.
-
Der
Einbau einer „einzigartigen" (definierten) Sequenz
(welche zu dem RNA-Abschnitt
am 5'-Ende des zusammengesetzten
Primers komplementär
ist) in der Zweitstrang-cDNA wurde mit Hilfe einer PCR-Amplifikation
unter Verwendung spezifischer Primerpaare gezeigt. Aliquote der
Reaktionsgemische von Schritt 2 und Schritt 3 wurden einer PCR-Amplfikation
unter Verwendung der Primer G3PDH5-4/G3PDH3 oder BA5/BA3 (beta Aktin) unter
den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen unterzogen. Die PCR-Amplifikation
der Reaktionsgemische von Schritt 2 führte zu wesentlichen Mengen
an Produkten der korrekten Größe, wohingegen die
Amplifikation der Reaktionsgemische von Schritt 3 zu wesentlich
kleineren Mengen der gleichen Produkte führte. Folglich demonstrierten
die Ergebnisse den Einbau der „einzigartigen" Sequenz (des RNA-Abschnitts des
in diesem Beispiel eingesetzten zusammengesetzten Primers) in die
doppelsträngigen
DNA-Produkte und das Fehlen der Sequenz in den amplifizierten DNA-Endprodukten
(aufgrund der Abspaltung des RNA-Abschnitts).
-
Beispiel 4: Herstellung doppelsträngiger cDNA,
umfassend eine angefügte
definierte Sequenz in der Zweitstrang cDNA, von einem Gesamt-RNA-Präparat und
gereinigter mRNA
-
Es
wurde Gesamt-RNA (1 μg),
die von der HCT116-Zelllinie präpariert
war, oder mRNA (100 ng), die von der MOLT4-Zelllinie (Clontech)
präpariert
war, als ein Ziel für
die Erzeugung des intermediären
doppelsträngigen
cDNA-Produkts verwendet, das eine angefügte definierte Sequenz in dem
zweiten cDNA-Strang umfasst. Die angefügte Sequenz wird durch die
Verwendung eines zusammengesetzten (ersten) Primers eingebaut.
-
Der
Herstellungsprozess der Erst- und Zweitstrang-cDNA wurde, im Wesentlichen,
wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben, ausgeführt und beinhaltete die folgenden
Schritte: (1) Synthese eines ersten cDNA-Strangs; (2) Synthese eines
zweiten cDNA-Strangs,
um ein doppelsträngiges
Produkt zu erzeugen, das an einem Ende einen RNA/DNA-Heteroduplex
umfasst, der ein Substrat für
die RNase H ist. Von den intermediären doppelsträngigen cDNA-Produkten
wird erwartet, dass sie cDNA-Kopien von mehreren RNAs von der Ziel-RNA-Probe
umfassen, wobei jede cDNA die gleiche angefügte definierte Sequenz enthält. Es wird
erwartet, dass die Sequenz der angefügten definierten Sequenz das
Komplement der Sequenz des 5'-RNA-Abschnitts des zusammengesetzten
(ersten) Primers ist, der an die Ziel-RNA hybridisiert.
-
PCR-Experimente
wurden ausgeführt,
um die Anwesenheit der Zweitstrang-cDNA zu bestätigen, der umfasst (a) Zweitstrang-cDNA-Kopie
von einer Sequenz der GAPDH mRNA, die bekanntlich in der mRNA von beiden
RNA-Ziel-Proben repräsentiert
wird, und (b) die definierte Sequenz (d.h. das Komplement des 5'-RNA-Abschnitts des
ersten zusammengesetzten Primers) am 3'-Ende. Die PCR-Primerpaare wurden folgendermaßen verwendet:
- 1) Ein Primer, der zu der einzigartigen Sequenz
(DMTA1) komplementär
ist, und ein Primer, der zu der Sequenz der GAPDH mRNA (GAPDH5-4)
komplementär
ist, für
die Erzeugung eines 203 bp Produkt, die von einem Anfügen der
Sequenz am 3'-Ende des zweiten
cDNA-Strangs abhängig
ist.
- 2) Zwei Primer, die zu der Sequenz der GAPDH mRNA komplementär sind,
GAPDH3 und Primer GAPDH5-4, die für die Erzeugung eines 157 bp
Produkts verwendet werden, das für
GAPDH spezifisch ist und unabhängig
von einem Anfügen
der einzigartigen Sequenz am 3'-Ende
des zweiten cDNA-Strangs ist.
-
PCR
wurde, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, unter Verwendung
zweier separater cDNA-Präparate
von jedem Ausgangstemplate ausgeführt, wie es oben beschrieben
ist. PCR-Reaktionen wurden mit Hilfe der Gelelektrophorese analysiert.
Die Ergebnisse sind in
9 gezeigt. Die Spuren entsprechen den
Reaktionsgemischen, welche die folgenden Templates und Primerpaare
enthalten:
1.
Markierung | |
2.
cDNA von HCT116 | GAPDH3/GAPDH5-4 |
3.
cDNA von HCT116 | GAPDH3/GAPDH5-4 |
4.
cDNA von MOLT4 | GAPDH3/GAPDH5-4 |
5.
cDNA von MOLT4 | GAPDH3/GAPDH5-4 |
6.
kein Template | GAPDH3/GAPDH5-4 |
7.
cDNA von HCT116 | dMTA1/GAPDH5-4 |
8.
cDNA von HCT116 | dMTA1/GAPDH5-4 |
9.
cDNA von MOLT4 | dMTA1/GAPDH5-4 |
10.
cDNA von MOLT4 | dMTA1/GAPDH5-4 |
11.
kein Template | dMTA1/GAPDH5-4 |
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Pfeile
markieren die Position des erwarteten PCR-Produkts.
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Wie
erwartet, wurde ein längeres
Produkt in HCT116- und MOLT4-Proben gebildet, die unter Verwendung
des Primerpaars (1) amplifiziert wurden, und ein kürzeres Produkt
wurde in HCT116- und MOLT4-Proben erzeugt, die unter Verwendung
des Primerpaars (2) amplifiziert wurden. Kein Produkt wurde in den
Kontrollproben ohne Template gebildet. Dieses Beispiel demonstriert
das effiziente Anfügen
einer definierten Sequenz am 3'-Ende
der zweiten cDNA unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren.
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Beispiel 5: Amplifikation von poly-A-Gesamt-mRNA
und quantitative Bestimmung der Produkte mit Hilfe der Echtzeit-PCR
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200
ng Gesamt-RNA von humaner Darmtumor-Gesamt-RNA (Clontech Kat.-Nr.
64014-1) wurde als Ziel für
die Amplifikation eingesetzt. Die Herstellung von erstem und Zweitstrang-cDNA
und der anschließende Amplifikationsschritt
wurde, im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben, mit den folgenden
Veränderungen ausgeführt:
- (1) Das Reaktionsgemisch für die Synthese der Zweitstrang-cDNA
enthielt Klenow DNA-Polymerase (der 3' und 5'-Exonukleaseaktivitäten fehlen) und keine Ligase.
- (2) Die Amplifikation der resultierenden cDNA wurde unter Verwendung
von Bst-Polymerase
(4 Einheiten, NEB) anstatt Bca-Polymerase ausgeführt.
-
Die
quantitative Bestimmung der cDNA-Intermediate (Zweitstrang-cDNA)
und der Antisense-Amplifikationsprodukte erfolgte unter Verwendung
von vier Primerpaaren, die vier verschiedenen mRNAs entsprachen,
und Echtzeit-PCR gemäß dem folgenden
Protokoll:
cDNA- oder Amplifikationsprodukte wurden 1:10 oder
1:100 in TE-Puffer verdünnt.
Die Reaktionsgemische für die
Echtzeit-PCR wurden auf ein Gesamtvolumen von 20 μl folgendermaßen eingestellt:
Für jede Reaktion
- 10 μl
2X ABI SYBR Green master mix (ABI Kat.-Nr. 4309155)
- 0,6 μl
10 μM Vorwärts-Primer
- 0,6 μl
10 μM Rückwärts-Primer
- 1 μl
Template (die Verdünnung
entweder von cDNA oder Amplifikati onsprodukten ist oben angegeben)
- 7,8 μl
H2O
-
Die
folgenden Primerpaare wurden für
die quantitative Bestimmung von vier spezifischen exprimierten Genen
entweder in wie oben beschriebenen erzeugten cDNA- oder Amplifikationsprodukten
verwendet: G6PD
G6PD5 | 5' AGGCAGCCTCTCTGCTATAAGAAA
3' |
G6PD3 | 5' GCAGGGCATTGAGGTTGG
3' |
LGALS1
LGALS15 | 5' ATGGCAGCTGACGGTGACTT
3' |
LGALS13 | 5' CATGGGCTGGCTGATTT
3' |
MT2A
MT2A5 | 5' CGCCTGATGCTGGGACAG
3' |
MT2A3 | 5' GTTGTACATAAAAAATCCAGGTTTGTG
3' |
RPL27
RPL275 | 5' GATCCTGCTCTTAAACGCAAGG
3' |
RPL273 | 5' TGCCTGTCTTGTATCTCTCTTCAAAC
3' |
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Die
PCR-Reaktion wurde in einem iCycler (BioRad) unter Anwendung des
folgenden Protokolls ausgeführt:
94°C 10 Minuten
zur Aktivierung der DNA-Polymerase
40 Zyklen: 94°C 30 Sekunden,
anschließend
60°C 30
Sekunden.
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Datenanalyse
wurde nach Herstellerempfehlung ausgeführt.
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10 zeigt vier Kurven von Fluoreszenzwerten, die
in Abhängigkeit
der Zykluszahl für
die PCR-Reaktion das cDNA-Produkt (durch Amplifizieren der Zweitstrang-cDNA) oder
der entsprechenden SPIA-Amplifikationsprodukte (durch Amplifizieren
der angehäuften
Zweitstrang-cDNA) quantifizieren. Die Teilbilder zeigen die Ergebnisse
der Quantifizierungsversuche unter Verwendung (von oben nach unten)
der Primerpaare MTA2, RPL27, LGALS1 beziehungsweise G6PD. Jedes
Teilbild zeigt die Ergebnisse von 6 Versuchen unter Verwendung eines
Amplifikationsproduktpräparats
(als „SPIA" bezeichnet) und
2 Versuchen unter Verwendung eines cDNA-Produktpräparats (als „cDNA" bezeichnet). Die
x-Achse stellt die PCR-Zyklen und die y-Achse stellt die PCR-Grundlinie
minus RFU dar.
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Der
Amplifikationslevel eines jeden Genprodukts unter Anwendung des
Verfahrens der Erfindung ist durch die unterschiedliche Anzahl an
PCR-Zyklen definiert, die für
die Erzeugung eines Fluoreszenzsignals (als „CT" bezeichnet) oberhalb einer bestimmten
Schwelle erforderlich sind, zwischen einer Reaktion, die unter Verwendung
eines cDNA-Produkttemplates ausgeführt ist, und Reaktionen, die
unter Verwendung der entsprechenden Amplifikationprodukte als Templates
ausgeführt
sind. Tabelle 1 zeigt eine Berechnung eines „delta CT"-Werts für jedes Genprodukt (gibt den
Vergleich zwischen CT-Werten wieder, die Reaktionen entsprechen,
die unter Verwendung eines cDNA-Produkttemplates ausgeführt ist,
und Reaktionen, die unter Verwendung der entsprechenden Amplifikationprodukte
als Templates ausgeführt
sind) und die zeigten, dass ungeachtet ihres Expressionslevels in
der eingesetzten Gesamt-RNA, die mRNAs, die den vier Genprodukten
entsprechen, mit dem Verfahren der Erfindung in gleichem Maße amplifiziert
werden. Tabelle 1: Berechnung des CT-Werts für jedes
Genprodukt
Gen | cDNA
CT | SPIA
CT | delta
CT |
MTA2 | 37 | 26 | 11 |
RPL27 | 30 | 19 | 11 |
LGAL | 31 | 21 | 10 |
G6PD | 35 | 26 | 9 |
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Obwohl
die voranstehende Erfindung mit Hilfe von Abbildungen und Beispielen
für ein
klares Verständnis
recht genau beschrieben worden ist, wird es dem Fachmann offensichtlich
sein, dass bestimmte Veränderungen
und Modifikationen daran vorge nommen werden können. Deshalb sollten die Beschreibungen
und Beispiele nicht als eine Begrenzung des Rahmens der Erfindung,
der durch die angefügten
Ansprüche
definiert ist, erachtet werden.
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