-
Gebiet der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft ein diagnostisches Testverfahren und insbesondere
eine Vorrichtung für
die Verwendung bei der Durchführung
eines Untersuchungsvorganges und ein Verfahren zur Durchführung eines Untersuchungsvorganges
unter Verwendung dieser Vorrichtung.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Hintergrundtechnik
-
Die
Lateralfluß-
und die Durchflußtechnologie
wurden für
diagnostische Untersuchungen seit fast 20 Jahren verwendet. Die
Lateralflußtechnologie
ist derzeit vorherrschend, denn Lateralflußvorrichtungen sind leicht
herzustellen, und die Untersuchung kann in einem einfachen Zweistufenvorgang
durchgeführt
werden, der für
die Vollbluttrennung angepaßt
werden kann. Dies führt
zu einer einfachen Vorrichtung, die auf dem Gebiet als eine schnelle
Diagnose an der Behandlungsstelle verwendet werden kann (Cole et
al. 1996 Tuberc. Lung. Dis. 77:363-368). Jedoch ist die Mehrfacherkrankungs-Diagnose
unter Verwendung der Lateralflußtechnologie
sehr schwierig wegen Unterschieden der Querdiffusion zwischen Proben
und der Variation der Fließgeschwindigkeiten
zwischen Chargen der Partitionsmembran. Dies bedeutet, daß Antigen-
oder Antikörpersignalstärken sowohl
innerhalb der Versuche als auch zwischen Versuchschargen variieren
können,
was zu uneinheitlichen Ergebnissen führt.
-
Vorhandene
Durchfluß-Diagnosetests
können
in weniger als 2 Minuten vollendet werden im Vergleich zu typischen
Zeiten von 5 bis 15 Minuten für
Lateralflußtests.
Dieser Vorteil bei der Geschwindigkeit geht jedoch oft auf Kosten
der Empfindlichkeit. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß höhere Probenvolumina
erforderlich sind, um dieselbe Empfindlichkeit wie der Lateralfluß zu erreichen.
Dies kann bei einigen Situationen problematisch sein. Z. B. erfordert
die Diagnose von Analyten (Reagenzien) im Vollblut die Trennung
von Plasma aus Vollblutzellen. Die höheren Volumina des Vollblutes,
die hierfür
erforderlich sind, würden
die Membranen in der Durchflußausführung schnell
blockieren.
-
Das
Grundprinzip von Durchflußuntersuchungen
ist gut festgelegt. Die Versuche sind ausgestaltet, um die Existenz
und in einigen Fällen
die Menge eines vorbestimmten Analyten/Reagenzes in einer Probe
zu bestimmen. Das Reagenz ist oft ein Protein, aber andere Reagenzien
können
darauf getestet werden. Wenn die Untersuchung vorgesehen ist, auf
die Existenz einer besonderen Krankheit in einem Patienten zu prüfen, können die
Körperfluide
des Patienten auf einen Antikörper
oder ein anderes Protein getestet werden, welches von einem Patienten
in Reaktion auf die Infektion produziert ist, oder auf ein Protein,
welches durch das Bakterium oder das virale Agens oder dergleichen,
welches die Krankheit hervorruft, exprimiert wird. Bei einer typischen
Durchflußuntersuchung
wird eine flüssige
Probe, von der man glaubt, daß sie
das Reagenz enthält, über eine
Membran in eine Absorbensunterlage gesaugt, wobei an der Membran
ein Einfanganalyt angelagert ist, von dem man weiß, daß er das
Reagenz bindet. Die Membran wird dann in typischer Weise mit einer
Pufferlösung
gewaschen, und eine einen Nachweisanalyten enthaltende Flüssigkeit,
wobei der Analyt sich auch an das Reagenz anlagert und einen Tracer
oder einen Marker einschließt,
der nachweisbar ist, wird auf die Membran aufgebracht. Der Nachweisanalyt
lagert sich an das immobilisierte Reagenz an, welches an der Membran
angelagert ist, und kann gesehen oder anderweitig erkannt werden,
um die Gegenwart des Reagenzes anzuzeigen.
-
US 4,246,339 offenbart eine
Versuchsvorrichtung für
die Untersuchung von flüssigen
Proben auf die Gegenwart eines vorbestimmten Reagenzes. Die Vorrichtung
weist ineinanderschiebende obere Bodenteile auf, welche zwischen
sich einen Flüssigkeitsvorrat
bilden, sowie Federmittel für
das Vorspannen der Teile in die offene Position. Das obere Teil
bildet eine Reihe von Testwannen, deren jede eine Basis hat, die
durch eine mikroporöse
Membran mit einem Einfanganalyten gebildet wird, der auf der Membranoberfläche immobilisiert ist.
Absorbensmittel sind in dem Bodenteil angeordnet, im Abstand von
der Membran in der offenen Position, aber in Kontakt mit dieser
in der geschlossenen Position.
US
4,246,339 beschreibt die Zugabe des Testserums, welches
mit einer Pufferlösung
verdünnt
ist, zu einer Erprobungswanne und das Inkubieren der Vorrichtung
bei Raumtemperatur 10 Minuten lang vor dem Niederdrücken der
Kassette in die geschlossene Position, um die Probe durch die Membranen
in das Absorbensmaterial zu bringen. Wenn die Membranen trocken
sind, wird die Membran gewaschen und dann mit einer Lösung abgedeckt,
welche einen Nachweisanalyten enthält, der sich an das immobilisierte
Reagenz anlagert, gefolgt von einem nachfolgenden Schritt, bei welchem
ein Färbemittel
angewendet wird.
-
Man
erkennt, daß das
in der
US 4,246,339 beschriebene
Verfahren etwas lang, zeitaufwendig und ein ermüdender Vorgang ist, dem es
auch an Empfindlichkeit mangelt.
-
Eine
jüngere
Durchflußvorrichtung
ist in der
US 5,185,127 beschrieben,
die eine Untersuchungsvorrichtung zeigt mit einem Filterstapel und
einer Einschließung
mit einem Basisabschnitt und einem Deckel. Der Filterstapel hat
eine hydrophile Membran und einen Einfanganalyten auf dieser, welcher
in der
US 5,185,127 Binder
genannt wird. Eine hydrophobe Membran ist unter der hydrophilen
Membran angebracht, und eine Unterlage aus Absorbensmaterial befindet
sich unter der hydrophoben Membran. Der Deckel weist eine sich nach oben
erstreckende Rippe auf, die eine Ausnehmung bildet, in welcher sich
ein Einsatz befindet. Bei der Benutzung wird eine das Reagenz enthaltende
(in der
US 5,185,127 das
Analyt genannte) Probe in der Wanne der Untersuchungsvorrichtung
angeordnet, wobei sich zu dieser Zeit das Reagenz/der Analyt an
den Einfanganalyt/Binder anlagert. Der Fluß der Untersuchungslösung findet
jedoch nicht statt, denn die wässrige
Lösung
benetzt nicht die hydrophobe Membran, die in dem Filterstapel unter
der hydrophilen Membran angeordnet ist. Somit ist so viel Zeit erlaubt
wie nötig,
um das Anlagern des Nachweisanalyten an das Reagenz zu vollenden. Wenn
man entscheidet, daß das
Anlagern vollendet ist, kann der Fluß dadurch begonnen werden,
daß ein
Benetzungsmittel zugegeben wird, welches die hydrophobe Membran
befeuchtet. Nach dieser Zeit fließt die wässrige Flüssigkeit in die Unterlage des
Absorbensmaterials. Die Membran kann dann gewaschen und mit einem
Nachweisanalyten/Tracer behandelt werden, der ein Antikörper sein
kann, welcher sich speziell an den Analyten anlagert, wobei der
Antikörper
eine Markierung hat, welches versteckt mit diesem verbunden ist.
Wieder fehlt die Empfindlichkeit der
US
5,185,127 und ist nicht äquivalent derjenigen, die man
bei Lateralflußausführungsformen
oder ELISA-Ausführungsformen
erhältlich
hat.
-
Allgemeine Information
-
Die
hier benutzten Begriffe „abgeleitet
von" oder „Derivat" sollen andeuten,
daß ein
spezielles Ganzes aus einer besonderen Quelle, wenngleich nicht
notwendigerweise direkt aus dieser Quelle, erhalten werden kann.
-
Wenn
der Kontext nicht etwas anderes erfordert oder speziell das Gegenteil
ausdrückt,
umfassen ganze Dinge, Schritte oder Elemente der hier erwähnten Erfindung,
die als einzelne ganze Teile, Schritte oder Elemente erwähnt sind,
klar sowohl einzelne als auch Mehrfachformen der erwähnten ganzen
Teile, Schritte oder Elemente.
-
Die
hier beschriebenen Ausführungsformen
der Erfindung bezüglich
einer beliebigen einzelnen Ausführungsform
und insbesondere bezüglich
einer Vorrichtung und eines Verfahrens zum Untersuchen sollen mutatis
mutandis auch für
andere Ausführungsformen
der hier beschriebenen Erfindung gelten.
-
Durchweg
verstehen sich in dieser Beschreibung, wenn der Kontext nicht etwas
anderes verlangt, die Worte „aufweisen" oder Variationen,
wie z. B. „aufweist" oder „aufweisend", so, daß sie das
Einschließen
eines angegebenen Schrittes oder Elementes oder ganzen Teiles oder
einer Gruppe von Schritten oder Elementen oder ganzen Teilen beinhalten,
ohne irgendwelche anderen Schritte oder Elemente oder ganze Teile
oder Gruppen von Elementen oder ganzen Teilen auszuschließen.
-
Der
Fachmann erkennt, daß die
hier beschriebene Erfindung auch auf andere Weise als speziell beschrieben
verändert
und modifiziert werden kann.
-
Die
vorliegende Erfindung ist mit ihrem Geltungsbereich nicht durch
die speziellen hier beschriebenen Beispiele beschränkt.
-
Die
vorliegende Erfindung wird ohne ungebührliche Versuche durchgeführt, wobei – sofern
nicht anders ausgeführt – herkömmliche
Techniken der Immuncytochemie verwendet werden, wie z. B. die Immungold-Markierung
und die Proteomik. Diese Vorgänge
werden z. B. in den folgenden Texten beschrieben:
Colloidal
Gold – A
New Perspective For Cytochemical Marking, Beesley J. (1989), Royal
Microscopical Society Handbook No. 17, Oxford Science Publications.
Oxford University Press. (Paperback),
An Introduction to Immunocytochemistry:
Current techniques and problems, Polak J. and Van Noorden S. (1984)
Royal Microscopical Society Handbook No. 11. Oxford Science Publications.
Oxford University Press. (Paperback),
Immunocytochemistry – Modern
Methods and Applications, Polak J. and Van Noorden S. (1986) (2.
Ausgabe), Butterworth Heinemann, Oxford. (Hardback),
Techniques
in Immunocytochemistry, Bullock G. and Petrusz P. (1982-1989) (4
Bände)
Academic Press. (Paperback), und
Colloidal Gold – Principles,
Methods and Applications, Hayat M., (1989-1990) (3 Bände), Academic
Press. (Hardback).
-
Weil
der Stand der Technik mit einer Terminologie nicht einheitlich ist,
werden zur Vermeidung von Zweifeln und zwecks Klarheit die folgenden
Begriffe, die in der nachfolgenden Beschreibung benutzt werden, wie
folgt bestimmt. Der Begriff „Reagenz" oder „Zielanalyt" (Targetanalyt) wird
verwendet, um sich auf ein Makromolekül (z. B. Protein oder Enzym)
oder sein Fragment oder dergleichen zu beziehen, welches durch eine Untersuchung
nachzuweisen ist. Der Begriff „Einfanganalyt" wird verwendet,
um sich auf eine „Einfang"-Verbindung zu beziehen,
die an einer Membran angelagert ist und an welche sich das Reagenz
anlagert. Der Begriff „Nachweisanalyt" wird benutzt, um
sich auf einen Analyten zu beziehen, der eine „Nachweis"-Verbindung aufweist,
die sich auch an das Reagenz anlagert, und ebenso ein „nachweisbares" Element. Das nachweisbare
Element wird in typischer Weise visuell nachgewiesen, entweder unter
sichtbarem Licht oder Fluoreszenz.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Nach
einem ersten breiten Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für eine Vorrichtung
und ein Verfahren für
die Verwendung in einem Untersuchungsvorgang, der gekennzeichnet
ist durch Schaffung eines „Vorinkubationsschrittes", bei welchem ein
Reagenz und ein Mehrfacherfassungsanalyt sich aneinander anlagern können, was
die Wirkung hat, daß sowohl
die Empfindlichkeit der Untersuchung verbessert wird als auch das Volumen
der Probe reduziert wird, welches für eine Untersuchung vor der
Reaktion des Proben-/Analyt-Komplexes mit einer Reaktionsmembran
erforderlich ist, an welcher ein oder mehrere Liganden angelagert
sind.
-
Bei
einer Ausführungsform
ist der Erfassungsanalyt ein Mehrfacherfassungsanalyt mit mehr als
einer Erfassungsverbindung, die an einem erfassbaren Element angelagert
ist.
-
Deshalb
ist bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung
zur Verwendung in einem Untersuchungsvorgang vorgesehen mit:
einem
ersten Teil mit einer ersten, porösen Reaktionsmembran, an welche
ein Einfanganalyt angelagert ist für das Anlagern an ein zu erfassendes
Reagenz, wobei das Teil eine obere und eine untere Fläche hat;
einem
zweiten Teil, welches ein Körper
eines absorbierenden Materials ist, wie z. B. Seidenpapier oder
dergleichen, welches unter der unteren Fläche des ersten Teils angeordnet
ist und diese berührt;
einer
Kammer für
die Aufnahme einer flüssigen
Probe, die im Abstand über
dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände und
eine Basis hat, die von einer zweiten Membran festgelegt ist; wobei
die Kammer in der Lage ist, eine vorbestimmte Inkubationszeit lang
eine flüssige
Probe zurückzuhalten;
und
Mitteln für
das Halten der Kammer über
dem ersten Teil in zwei Positionen, einer ersten Position, in welcher die
Membran in einem ausreichenden Abstand von dem ersten Teil so angeordnet
ist, daß sie
nicht einen Fluidtransfer von der Kammer zu dem Körper des
absorbierenden Materials gestattet, und einer zweiten Position, in
welcher sich die Membran mit dem ersten Teil in Berührung befindet,
wobei diese Berührung
eines Fluidtransfer von der Kammer durch die erste und zweite Membran
zu dem Körper
von absorbierendem Material gestattet.
-
Nach
einem ähnlichen
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Untersuchen
auf die Gegenwart eines vorbestimmten Reagenzes in einer flüssigen Probe
vorgesehen, wobei eine Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, mit folgenden Schritten:
- a) Anordnen
einer flüssigen,
zu untersuchenden Probe und eines Erfassungsanalyten in der Kammer,
wobei sich die Kammer in der ersten Position befindet;
- b) Erlauben des Durchgangs für
den Erfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang, um sich an das
Reagenz anzulagern, falls es vorhanden ist;
- c) Niederdrücken
der Kammer zu der zweiten Position, um die Basis der Kammer mit
der ersten porösen Membran
in Berührung
zu bringen;
- d) Vorsehen der Möglichkeit,
daß die
Probe durch die erste und zweite Membran fließt, um es dem Reagenz zu ermöglichen,
wenn es vorhanden ist, sich an den Einfanganalyten anzulagern, der
auf der ersten Membran getragen wird,
vorzugsweise wenn
der Erfassungsanalyt ein Mehrfacherfassungsanalyt ist.
-
Der
hier verwendete „Mehrfacherfassungsanalyt" bezieht sich auf
einen Erfassungsanalyten, der mehr als eine Erfassungsverbindung
aufweist, die an einem nachweisbaren Element angelagert ist.
-
Die
Erfinder haben in überraschender
Weise gefunden, daß ein
Mehrfacherfassungsanalyt eine Anzahl von Vorteilen gemäß der Erfindung
hat, einschließlich
einem beliebigen von den folgenden, z. B.
- – Mehrfacherfassungsverbindungen
können
mit optimaler Bindeeffizienz an nachweisbare Elemente angelagert
werden,
- – Erfassungsanalyte,
die mit Mehrfacherfassungsverbindungen erzeugt sind, haben eine ähnliche
Größe und physikalische
Eigenschaften für
jede der Erfassungsverbindungen,
- – das
Verhältnis
von Erfassungsverbindungen auf dem erfaßbaren Element kann geändert werden,
ohne daß relative
Bindungsprofile des erfaßbaren
Elementes beeinflußt
werden,
- – quantitative
Vergleiche können
durchgeführt
werden, und
- – das
erfaßbare
Element hat eine reduzierte Kapazität für nichtspezifische Bindungen.
-
Demgemäß schafft
die Erfindung bei einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zum
Untersuchen auf die Gegenwart mindestens eines vorbestimmten Reagenzes
mit folgenden Schritten:
- a) Vorsehen einer
ersten porösen
Membran, an welcher Einfanganalyte zum Anlagern an das mindestens eine
Reagenz angebunden worden;
- b) Anordnen einer flüssigen,
zu untersuchenden Probe und eines Mehrfacherfassungsanalyten in
einer Kammer mit einer Basis, welche durch eine zweite poröse Membran
festgelegt ist;
- c) Ermöglichen
des Durchgangs für
den Mehrfacherfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang zum Anlagern
an das mindestens eine Reagenz, wenn es vorhanden ist;
- d) Inberührungbringen
der Basis der Kammer mit der ersten porösen Membran;
- e) Veranlassen der Probe, durch die Membranen zu fließen, um
für das
Reagenz: die Möglichkeit
vorzusehen, sich an den auf der ersten Membran getragenen Einfanganalyten
anzulagern.
-
Vorzugsweise
ist die Erfassungsverbindung ein Antigen, ein Antikörper oder
ein Ligand.
-
Antikörper, Antigene
und Liganden können
als Erfassungsverbindungen verwendet werden, da sie Bindestellen
haben, die in der Lage sind, sich speziell an die interessierenden
Proteine oder ihre Fragmente oder Epitopen anzulagern im Vorzug
zu anderen Molekülen.
-
Antikörper sind
aus einer handelsüblichen
Quelle erhältlich
oder sind alternativ durch herkömmliche Mittel
erzeugt. Handelsübliche
Quellen sind dem Fachmann in der Technik gut bekannt.
-
Der
hier benutzte Begriff „spezifisch
angelagert" unter
Bezugnahme auf ein Komplexbildendes Agens, wie z. B. einen Antikörper, bezieht
sich auf den Wirkstoff, der vorzugsweise einem Targetanalyten zugeordnet ist
(z. B. interessierendes Protein). Bezüglich Antikörpern weiß man speziell, daß ein gewisser
Grad an nichtspezifischer Wechselwirkung zwischen einem Molekül und einem
Nicht-Targetprotein auftreten kann. Nichts desto weniger kann eine
spezielle Anlagerung angesehen werden, als sei sie durch eine spezielle
Erkennung des Antigens vermittelt worden.
-
Bei
alternativen Ausführungsformen
ist die Erfassungsverbindung bzw. Nachweisverbindung (Antikörper oder
Ligand) mit einem Element verknüpft,
um einen Targetanalyten in einer Probe durch direktes oder indirektes
Markieren des Antikörpers
oder Liganden nachzuweisen, z. B. mit radioaktiven, fluoreszierenden
oder Enzymmarkierungen, wie z. B. Meerrettichperoxidase), so daß sie unter
Verwendung von gut bekannten Techniken erfaßt werden können. Direkt markierte Analyten
haben eine Markierung (erfaßbares
Element), welches der Erfassungsverbindung zugeordnet ist oder an
diese angekoppelt ist. Indirekt markierte Erfassungselemente können in
der Lage sein, sich an einer markierten Spezies anzulagern (z. B.
ein markierter Antikörper
mit der Fähigkeit,
sich an das Entwicklungsmittel anzulagern), oder sie können auf
eine weitere Spezies einwirken, um ein erfaßbares Ergebnis zu erzeugen.
-
Erfaßbare Elemente
können
mit Antikörpern
(oder anderen Liganden) verbunden sein und makromolekulare kolloidale
Teilchen einschließen
(z. B. kolloidale Goldteilchen) oder korpuskulares Material, wie
z. B. Latexperlen, die gefärbt,
magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch
aktive Wirkstoffe, die direkt oder indirekt erfaßbare Signale erzeugen können, die
visuell beobachtet werden sollen, elektronisch erfaßt oder
anderweitig aufgezeichnet werden sollen. Diese Moleküle können Enzyme
sein, welche Reaktionen katalysieren, die Farben entwickeln oder ändern oder
z. B. Änderungen
elektrischer Eigenschaften hervorrufen. Sie können molekular anregbar sein,
so daß elektronische Übergänge zwischen
Energiezuständen
zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie
können
chemische Gebilde einschließen,
die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Bei einer Ausführungsform
ist die Erfassungsverbindung (Antikörper) mit einem kolloidalen
Goldteilchen konjugiert. Die Anlagerung des konjugierten Antikörpers an
das Probenprotein erzeugt ein visuelles Signal, welches durch das
Auge erfaßt
werden kann oder elektronisch gelesen werden kann, um ein quantitatives
Ergebnis zu liefern. Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin und
Nachweissysteme mit alkalischer Phosphatase können auch verwendet werden.
-
Dem
Fachmann sind andere Markierungen bekannt.
-
Vorzugsweise
wird das Erfassungselement aus der Gruppe ausgewählt mit kolloidalem Goldpartikel, Latexperle,
gefärbter
Farbstoff und kolloidaler Kohlenstoff.
-
Bei
einer Ausführungsform
ist das erfaßbare
Element kolloidales Gold. Vorzugsweise schafft das kolloidale Gold
gleichmäßige Reflektionseigenschaften.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
ist das erfaßbare
Element eine Latexperle, die mit einem gefärbten Farbstoff verknüpft ist.
-
Bei
einer anderen Ausführungsform
ist das erfaßbare
Element kolloidaler Kohlenstoff.
-
Vorzugsweise
ist ein positives Ergebnis dort, wo das Signal aus einer „Test"-Probe in der Untersuchung
merklich höher
oder niedriger ist als eine Probe aus einer Kontrollprobe.
-
Somit
stellt die vorliegende Erfindung eine Kammer zur Verfügung, die
als Vorinkubationskammer dienen kann, in welcher ein Vorinkubationsschritt
erfolgen kann, bei welchem die Probe und der Mehrerfassungsanalyt
sich vereinen, wodurch die Empfindlichkeit des Tests verbessert
und das Volumen der Probe verringert wird, welches für die Untersuchung
erforderlich ist. Man hat gefunden, daß die Vorinkubation die Testempfindlichkeit
für eine
typische vorhandene Durchflußvorrichtung
um etwa das Zehnfache gegenüber äquivalenten Empfindlichkeitsniveaus erhöht wird
im Vergleich zu der Lateralflußtechnologie,
wobei doch für
die Untersuchung die Möglichkeit
gegeben ist, in etwa 2 Minuten abgeschlossen zu sein im Vergleich
zu 10 Minuten für Lateralflußausführungen.
-
Bei
einer Ausführungsform
wird die Probe aus der Gruppe ausgewählt oder wird aus dieser abgeleitet, welche
aufweist:
landwirtschaftliches Produkt, mikrobielles Produkt
und biologisches Produkt.
-
Bei
einer Ausführungsform
wird das landwirtschaftliche Produkt aus der Gruppe ausgewählt, welche Saatgut,
Getreidekorn oder Pflanzenextrakt aufweist.
-
Bei
einer Ausführungsform
enthält
die Probe korpuskulare bzw. partikuläre Materialien, die aus der Gruppe
ausgewählt
sind, welche Getreidekornextrakt, Zellenextrakt und mikrobielles
Extrakt enthält.
Bei einer anderen Ausführungsform
ist die biologische Probe ein körperliches
Fluid oder eine Gewebeprobe, die aus der Gruppe ausgewählt ist,
welche Blut, Serum, Sputum und Lunge aufweist.
-
Andere
Proben sind nicht ausgeschlossen.
-
Standardmethoden
können
verwendet werden, um Proben für
die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zu erhalten, vorzubereiten
und/oder zu speichern. Z. B. kann bei einer Ausführungsform ein Adsorptionsmitteltupfer,
der eine Baumwollmatrix oder ein ähnliches Material aufweist,
für die
Probe bzw. den Meßfühler oder
für die
Oberfläche
oder das Medium verwendet werden, welches einen Zielanalyt enthält. Bei
einer Ausführungsform
wird der Adsorptionsmitteltupfer gewaschen, um den Zielanalyten
zu entfernen. Vorzugsweise wird dann der Zielanalyt und/oder das
korpuskulare Material, welches den Zielanalyten enthält, gelöst.
-
Demgemäß kann bei
einer Ausführungsform
eine Suspension von zerkleinertem Weizenkopf löslich gemacht werden und dann
in der Kammer mit einem Mehrfacherfassungsanalyten, welcher einen
primären Antikörper gegen
Alpha-Amylase, verknüpft
mit einem kolloidalen Goldpartikel, und einen sekundären Kontrollantikörper, ebenfalls
verknüpft
mit dem kolloidalen Goldpartikel, umfaßt, vermischt und vorinkubiert
werden. Die Inhalte der Kammer läßt man dann
durch die erste Membran fließen,
die einen Einfanganalyten in der Form eines immobilisierten Anti-Amylase-Antikörpers oder
eines Anti-Kontrollantikörpers
enthält,
und die Antikörper/Gold-Komplexe werden an
den immobilisierten Antikörper
unter Erzeugung eines nachweisbaren Signals gebunden. Das Signal
kann erfaßt
werden, indem man die Vorinkubationseinheit entfernt und die Reaktionsmembran
mit einem Puffer wäscht.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
kann die Erfindung auch verwendet werden für den Nachweis von Reagenzien
in Vollblut, da vollständige
rote Blutkörperchen
in der Vorinkubationskammer entfernt werden können und man das Plasma durch
die Reaktionsmembran, die einen angelagerten Einfanganalyten enthält, fließen lassen
kann. Bei dieser Form wird die Basismembran, die an der Basis der
Vorinkubationskammer definiert ist, typischerweise eine Membran
sein, die die richtige Porengröße aufweist,
um die roten Blutkörperchen zurückzuhalten
und um das Plasma beim Kontakt mit der ersten Membran hindurch passieren
zu lassen. Gleichsam kön nen
bestimmte Proben, die Getreideextrakte, Zell- oder mikrobielle Extrakte
enthalten, mit dieser Durchflußform
analysiert werden, da bestimmte Materie in der Vorinkubationskammer
entfernt werden kann und daher den Reaktionsbereich auf der oberen
Oberfläche
der Reaktionsmembran nicht blockieren kann.
-
Die
Vorrichtung kann auch verwendet werden, um Analyten in Körperflüssigkeit
nachzuweisen, die von Blut verschieden sind, wie z. B. Plasma, Seren,
Urin, Speichel und Sputum. In diesem Fall kann die Probe in der
Vorinkubationskammer zurückgehalten
werden, indem man eine hydrophobe Membran verwendet. Um einen effizienten
Fluß durch
Kapillarkraft zu dem zweiten Teil zu erreichen, wenn die Vorinkubationskammer
abgesenkt wird, wird die Reaktionsmembran mit einem Benetzungsmittel,
welches ein Detergens enthält,
zuvor angefeuchtet, oder die Reaktionsmembran wird mit einer hygroskopischen
Lösung,
wie z. B. Saccharose, Trehalose, Fructose oder alternativ Glycerol,
blockiert.
-
Dies
verändert
die Eigenschaften der Reaktionsmembran von einer nicht-hygroskopischen
zu einer hygroskopischen Membran, was es ermöglicht, daß die Probe beim Kontakt der
Membran an der Basis der Vorinkubationskammer mit der Reaktionsmembran
durch das zweite Teil fließen
kann.
-
Bei
noch einer weiteren Ausführungsform
kann die Vorrichtung, wenn eine hydrophobe Membran als die Basis
der Vorinkubationskammer verwendet wird, mit der hydrophoben Membran
und der Reaktionsmembran in Kontakt verwendet werden, wobei der
Bediener, falls dies gewünscht
ist, ein Benetzungsmittel zu der Probe zugeben kann, um den Durchfluß zu verursachen.
-
Demnach
wird bei einem verwandten Aspekt eine Vorrichtung zur Verwendung
in einem Testverfahren bereitgestellt, welche ein Gehäuse umfaßt, das
einschließt:
ein
erstes Teil mit einer ersten, porösen Membran, an welcher ein
Einfanganalyt für
die Anlagerung an ein zu erfassenden Reagenz angelagert ist, wobei
die Membran eine obere Oberfläche
und eine untere Oberfläche aufweist,
ein
zweites Teil, welches ein Körper
von absorbierendem Material ist, wie z. B. Seidenpapier oder dergleichen, welches
unterhalb angeordnet ist und die untere Oberfläche des ersten Teils berührt,
eine
Kammer, die über
dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände aufweist,
sowie eine Basis, die eine zweite, hydrophobe Membran mit einer
oberen und einer unteren Oberfläche
einschließt,
wobei die Vorinkubationskammer über
dem ersten Teil gehalten ist, wobei die untere Oberfläche der
hydrophoben Membran in Kontakt mit der oberen Oberfläche des
ersten Teils steht.
-
Die
Vorinkubationskammer kann auch verwendet werden, um Analyten zu
entfernen, die den Test stören
können,
wie z. B. humane Anti-Maus-Antikörper
(HAMAS), wobei dies in Lösung
erfolgen kann oder indem Anti-Analyt-Antikörper an die Oberfläche der
Kammer angelagert werden. Die Kammer kann auch verwendet werden,
um den interessierenden Analyten von einer Adsorbensoberfläche, wie
z. B. einem Tupfer, der dem Rachen eines Patienten entnommen worden
ist, zu extrahieren, indem man den Tupfer in einer Extraktionslösung in
der Kammer herumschwenkt. Die Vorinkubationskammer kann Teil einer
Vorfiltereinheit sein, weiche auch so wirkt, daß sie die Probe vor dem Kontakt
mit der oberen Oberfläche
des ersten Teils vorfiltert.
-
Die
Beispiele für
Tests, die nach diesem Verfahren durchgeführt werden können, bei
dem zwei Reaktionsstufen erforderlich sind (die Inkubation des Analyten
mit dem markierten Anti-Analyten,
gefolgt von dem Anlagern dieses Komplexes an einen Anti-Analyten
an einer festen Phase), sind:
-
Direkte Antigenuntersuchung
-
- 1. Ag*(Analyt) + Ab*1(Anti-Ag)-Markierung
- 2. Feste Phase-Ab2(Anti-Ag) + Ag/Ab1(Anti-Ag)-Markierungskomplex
-
Direkte Antikörperuntersuchung (i)
-
- 1. Ab1(Analyt = Anti-Ag)
+ Ab2(Anti-Ab1)-Markierung
- 2. Feste Phase-Ag + Ab1(Anti-Ag)/Ab2(Anti-Ab1)-Markierungskomplex
-
Direkte Antikörperuntersuchung (ii)
-
- 1. Ab1(Analyt = Anti-Ag)
+ Ab2(Anti-Ab1)-Markierung
- 2. Feste Phase-Ab3(Anti-Ag)/Ag + Ab1(Anti-Ag)/Ab2(Anti-Ab1)-Markierungskomplex
-
Indirekte Antigenuntersuchung
-
- 1. Ag (Analyt) + Ab1(Anti-Ag)
+ Ab2(Anti-Ab1)-Markierung
- 2. Feste Phase-Ab3(Anti-Ag) + Ag/Ab1(Anti-Ag)/Ab2(Anti-Ab1)-Markierungskomplex
-
Indirekte Antikörperuntersuchung (i)
-
- 1. Ab1(Analyt = Anti-Ag)
+ Ab2(Anti-Ab1)
+ Ab3(Anti-Ab2)-Markierung
- 2. Feste Phase Ag + Ab1(Anti-Ag)/Ab2(Anti-Ab1)/Ab3(Anti-Ab2)-Markierungskomplex
-
Indirekte Antikörperuntersuchung (ii)
-
- 1. Ab1(Analyt = Anti-Ag)
+ Ab2(Anti-Ab1)
+ Ab3(Anti-Ab2)-Markierung
- 2. Feste Phase Abo (Anti-Ag)/Ag + Ab1(Anti-Ag)/Ab2(Anti-Ab1)/Ab3(Anti-Aba)-Markierungskomplex
-
- *Ag bedeutet Antigen
- *Ab bedeutet Antikörper
-
Andere
Typen von Untersuchungen sind nicht ausgeschlossen.
-
Ein
piezoelektrisch angetriebener Drucker kann verwendet werden, um
genaue Mengen von Mehrfacherkrankungsliganden auszugeben, wie z.
B. Antigene oder Antikörper
oder einen Analyten als eine Mikroanordnung auf eine Reaktionsmembran
für die
Verwendung in der Vorrichtung nach dem ersten Aspekt der vorliegenden
Erfindung. Die Liganden oder Analyte können in besonderen Mustern
ausgegeben werden, z. B. Buchstaben für die leichte Erkennung von
Ergebnissen. In typischer Weise werden 100 pl eines Fluidreagenzes
(1 Tropfen) oder Mehrfaches davon ausgegeben, dies aber verändert sich
in Abhängigkeit
von der Anwendung. Die sich ergebende Größe des Fleckes auf der Membran
beträgt
etwa 55 μm
im Durchmesser in Abhängigkeit
von der Fluiddiffusion auf der Membran, aber dies variiert wiederum
je nach der Anwendung. Es ist möglich,
Tröpfchen
mit Durchmessern von 5-10 μm
auszugeben, und deshalb können
kleinere Volumina an Fluidreagenz (z. B. 1-10 pl) angewendet werden.
Die Verwendung von exakten quantitativen Aufdrucken von Mikroarrays
von Antikörpern,
Antigenen oder anderen Analyten bedeutet, daß Tests unter Verwendung von
exakten Mengen dieser Reagenzien für die Mehrfachdiagnose von
Erkrankungen einer einzelnen Probe hergestellt werden können. Diese
Array-Technologie kann auf Tests, auf Arzneistoffe oder andere Marken über alle diagnostischen
Gebiete angewendet werden.
-
Alternativ
kann eine Spritzenpumpe 1235 von ATOM Medical Corporation, Japan,
die typischerweise verwendet wird, um kleine Mengen an intravenösen Flüssigkeiten über einen
Katheter an Krankenhauspatienten zu verabreichen, angepaßt werden,
um einzelne oder mehrere Spuren eines Einfanganalyten auf die erste Membran,
zum Beispiel Nitrozellulose, aufzubringen.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
können
Liganden für
die Erfassung von Tuberkulose-, HIV-, Hepatitis-, Syphilis- und
Malaria-Antikörpern
auf einer Reaktionsmembran abgeschieden werden. Dies würde die
gleichzeitige Diagnose von Tuberkulose, HIV, Hepatitis, Syphilis
und Malaria aus einer einzelnen Blutprobe ermöglichen, ohne daß es notwendig
wäre Probenzwischenbehandlungsstufen
vorzusehen.
-
Die
Anwendung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Testung von kleinen
Volumina an Vollblut, und daher stellt die vorliegende Erfindung
eine sehr schnelle diagnostische Testvorrichtung dar, die einfach
zu verwenden ist und die sowohl im Labor als auch vor Ort bei der
Felddiagnose verwendet werden kann. Zum Beispiel wäre die Menge
an Blut, die man erhält,
wenn man mit einer Nadel in die Fingerspitze sticht, ausreichend,
um einen Test durchzuführen.
Gleichsam können
große
Probenvolumina in dieser Vorrichtung verwendet werden, indem die
Menge an Adsorbensmaterial (zweites Teil) erhöht wird. Zum Beispiel können 10
ml an verdünnten
Flüssigkeiten,
wie zum Beispiel Urin, untersucht werden, um selten vorkommende
Moleküle
zu erfassen.
-
Die
Analyten und/oder Liganden (zum Beispiel Antigene oder Antikörper) können in
Titriermengen und/oder Titrierkonzentrationen aufgedruckt werden.
Demnach würde
dies in einem individuellen Screen ein Mittel zur Quantifizierung
der Analyt-Ligand-Niveaus in der Probenlösung bereitstellen.
-
Kurze Beschreibung der Figuren
-
Eine
spezifische Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird nun beispielhaft und unter Bezugnahme
auf die begleitenden Figuren beschrieben, von denen:
-
1 eine
schematische Zeichnung einer Vorrichtung ist, in der Aspekte der
vorliegenden Erfindung in einer ersten Konfiguration ausgeführt sind,
-
2 eine
schematische Zeichnung der Vorrichtung von 1 in einer
zweiten Konfiguration ist,
-
3 eine
perspektivische Ansicht einer Testvorrichtung oder -kassette ist,
in der Aspekte der vorliegenden Erfindung ausgeführt sind,
-
4 eine
Explosionsansicht der Komponenten der Kassette, die in 3 dargestellt
ist, ist,
-
die 5a bis 5d verschiedene
Stufen bei der Verwendung der Vorrichtung von 3 bei
der Durchführung
eines Tests darstellen und
-
6 eine
graphische Darstellung ist, in der Testergebnisse von Proben, die
mit alpha-Amylase
gespiket sind und die keiner Vorinkubation unterzogen wurden, mit
Proben, die einer Vorinkubation von einer Minute unterzogen wurden,
verglichen wurden.
-
Kurze Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
-
Herstellung des Erfassungsanalyten.
-
Die
Einheiten, die an Goldkolloid angeheftet sind, um das Immunogold-Konjugat
(normalerweise Immunglobiline) zu erzeugen, sind passiv gebunden,
um einen stabilen Komplex zu ergeben, der die Zielaktivität des Antikörpers zurückhält. Die
ursprüngliche
Goldkolloid-Dispersion,
wie sie bei Proteome Systems Limited (PSL) hergestellt wird, wird
mit einem Hydroxylamin-Reduktionsmittel initialisiert. Ausgehend
von der Annahme, daß das
Oxim teilweise als ein Rest in dem Kolloid zurückbehalten wird, wird das Immunogold-Konjugat durch
Zugabe von Glutaraldehyd während
der Stufe des Anheftens unter Ausbildung einer Schiff-Base zwischen
jedem verbliebenem Oxim in der Kolloidstruktur und in freien Aminen
des Immunglobulins stabilisiert.
-
Das
optimale Anheftungsprofil für
das Immunglobulin (Konzentration und pH-Wert) wird erhalten durch Titrierung
der Antikörperkonzentration
gegen fixierte Aliquots von Goldkolloid bei spezifischen pH-Werten
und durch Behandlung der Gemische mit Salzlösung. Ein ausreichendes Konzentrationsverhältnis für die Bindung zwischen
Kolloid und Antikörper
beugt dem Ausflocken oder der Aggregation des Kolloids aus/in der
Suspension vor, wenn sie mit der Salzlösung behandelt wird. Demnach
führt bei
geringen Proteinkonzentrationen die Zugabe der Salzlösung dazu,
daß das
Kolloid aus der Suspension heraus Aggregate bildet, wenn jedoch
das optimale Niveau an Antikörper
erreicht wird, bleibt das Kolloid in der Suspension stabil (die
Integrität
der Kolloid-Suspension wird spektroskopisch im Wellenlängenbereich
zwischen 450 nm und 600 nm gemessen). Dieser Wert der Antikörperkonzentration
ergibt die minimale schützende
Konzentration, die erforderlich ist, um den stabilen Immunogold-Konjugatkomplex
zu bilden. Eine Antikörperkonzentration
von 0,1 bis 0,2 mg/ml in 5 mM Borat wird bei der Titration verwendet,
und für
polyklonale Antikörper
wird ein pH-Wert von 9 gewählt:
dieser pH-Wert ist normalerweise deutlich überhalb des Bereichs der Werte
des isoelektrischen Punkts (pl), die zusammentreffen mit dem Bereich
der Immunglobuline in einem polyklonalen Serum. Im Fall von monoklonalen
Antikörpern
aus Hybridom haben die Immunglobuline einen einzigartigen isoelektrischen
Punkt, und der pH-Wert
des Kolloids wird üblicherweise
eingestellt auf 0,5 bis 1 Einheit über dem pl des Antikörpers.
-
Die
Konzentration des Antikörpers,
der für
die Konjugation verwendet wird, beträgt 110% der minimalen „Schutz"-Konzentration, die
aus den hier beschriebenen Titrationsverfahren bestimmt wurde.
-
Konjugationsprotokoll (für einzelnen
Antikörper)
-
Das
erforderliche Volumen an Kolloid wird ausgemessen (unter der Annahme,
daß ein
90%-Gehalt des Volumens nahezu äquivalent
zu demjenigen des fertigen Konjugats bei der optischen Dichte, die
für das Kolloid
gemessen wurde, ist).
-
Es
wird ein Volumen einer 5%-Glutaraldehydlösung zu dem schnellen gerührten Kolloid
zugegeben, um einer Glutaraldehyd-Endkonzentration von 0,002% zu
ergeben.
-
Fünf Minuten
nach der Zugabe des Glutaraldehyds wird die berechnete Menge an
Antikörperlösung zu
der schnell gerührten
Suspension zugegeben. Wenn ein signifikantes Volumen an Antikörper zugegeben werden
soll (> 10 ml), wird
dies in einem gleichförmigen
Fluß von
Tröpfchen
(vorzugsweise über
einen Tropftrichter) zugegeben.
-
In
Abhängigkeit
des Volumens des Kolloids (von 200 ml bis 5 l) wird 30 bis 90 Minuten
danach der pH-Wert der Suspension von pH 9 auf pH 7 abgesenkt (es
sei denn, die Konjugation wird zwischen pH 7,5 und 6 durchgeführt) mit
0,2 M Phosphorsäure.
Ein berechnetes Volumen von 10% (m/V) Winterserumalbumin wird zu
der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von Rinderserumalbumin
in der Suspension von 0,5% zu ergeben.
-
Man
läßt die Suspension
für 3 bis
4 Stunden über
Nacht rühren,
sobald das Volumen > 1
L beträgt, und
dann wird die Suspension bei 10.000 UpM über zwischen 35 Minuten und
60 Minuten (in Abhängigkeit
von Volumen und Kolloidgröße) lang
zentrifugiert.
-
Der Überstand
wird von der zentrifugierten Suspension entfernt und das konzentrierte
flüssige
Zentrifugat wird 2 mM Borat bei einem pH-Wert von 7,2 enthaltend
0,2% Rinderserumalbumin und 0,1% Natriumazid (als Konservierungsmittel)
aufgenommen.
-
Konjugationsprotokoll (für mehrere
Antikörper)
-
Für den Fall,
daß mehr
als ein Antikörper
an das Kolloid angeheftet wird, werden die schützenden Konzentrationstitrationen
(sondiert mit Salzlösung
für die
Aggregation) für
jeden der Antikörper
durchgeführt.
Die Volumina der verwendeten Antikörper sind diejenigen, die für die individuellen
Antikörper
(+10%) anhand der Titrationen gefunden wurden.
-
Falls äquivalente
Anheftungsniveaus der Antikörper
bei deren individuellen optimalen Anheftungsniveaus erforderlich
sind, werden die Antikörper
vorgemischt und gemeinsam dem Kolloid zugegeben (nach der Zugabe
von Glutaraldehyd). Die Verarbeitung folgt dem Verfahren, das oben
für die
Einzelkonjugationen beschrieben wurde. Falls die Antikörper in
einem bestimmten Verhältnis
vorliegen sollen, wird zunächst
jedem der primäre
Antikörper
zugegeben, und die zweiten Antikörper
werden in Intervallen später
zugegeben. Der Zeitverlauf der Bindungsniveaus an das Kolloid wurde
für einige
Kombinationen von Antikörpern
bestimmt, und die Niveaus der zweiten und nachfolgenden Antikörper nehmen
in einem regelmäßigen Muster
mit dem Zeitintervall zwischen der Zugabe des ersten Antikörpers und
den nachfolgenden Zugaben ab. Nach dem ersten Intervall vom 30 bis
40 Minuten wird ein konstantes Niveau des zweiten Antikörpers gebunden
bei ungefähr 10%
des Niveaus des primären
Reaktant gefunden. In manchen Fallen findet sich, daß ein Intervall
von 5 Minuten zwischen Test-Antikörper und Verfahrenskontroll-Antikörper in
den erforderlichen Konzentrationsverhältnissen optimal ist.
-
Bei
einem Beispiel ist der primäre
Antikörper
eine Maus-Anti-α-Amylase,
konjugiert bei pH 8,3, und der sekundäre Antikörper (Kontrolle) ist Ziege-Immunglobulin-G.
Bei einem anderen Beispiel können
zwei primäre Antikörper (zum
Beispiel Anti-Human-IgG1 und Anti-Human-IgG2) gleichzeitig zugegeben
werden, und ein Kontroll-Antikörper
wird anschließend
nach einem geeigneten Intervall zugegeben.
-
Herstellung von Membran mit
Einfang-Analyt
-
Die
Einfang-Analyten in der Form von Liganden, wie zum Beispiel Antigenen
oder Antikörpern
(zum TB, HIV-1), werden auf eine Proteineinfangmembranmatrix (zum
Beispiel eine Nitrozellulosemembran) aufgedruckt in einer angemessen
bemessenen Anordnung unter Anwendung piezoelektrisch-chemischer
Aufdrucktechnologie. Ein geeignetes chemisches Aufdrucksystem für die Verwendung
bei der vorliegenden Erfindung umfaßt die Anwendung einer piezoelektrischen
Tintenstrahldrucktechnologie mit Drop-on-Demand-Funktion für die Mikroverteilung
von Fluiden bei der DNA-Diagnostik oder das Syntheseverfahren nach
Combion Inc., welches „CHEM-JET" genannt wird. Um
die Fluidverteilung für
die DNA-Diagnostik mit Drop-on-Demand-Funktion zu erkunden, wurde als ein
Teil des Genosensor Technology Development-Projekts (GTD), welches
vom Institute of Standards and Technology (USA) gefördert wurde,
ein acht-Fluid-Drucker
entwickelt. Die Forschung konzentriert sich bis heute auf das Aufdrucken
von Oligonukleotid-Mikro-Spots auf feste Träger. Bei der CHEM-JET-Technik,
die am California Institute of Technology entwickelt wurde, werden
kleine Volumina von Reagenz tragender Flüssigkeit auf spezifische Stellen
oder an spezifische Adressen auf einem festen Substrat gespritzt,
gerade wie ein Tintenstrahldrucker Tinte auf eine Seite aufspritzt.
Durch wiederholte Rückkehr
zu jeder Adresse mit einem oder anderen eines kleinen Satzes an
Aufbaueinheiten, in diesem Fall für das Verfahren modifizierte
Nukleotide, können
riesige zwei-dimensionale Bibliotheken von kurzen DNA-Ketten (Oligonukleotide)
zusammengestellt werden. Eine solche Vorrichtung, einschließlich eines
Bildgebungsmittels, wird beschrieben in der parallel anhängigen internationalen
Patentanmeldung Nr.
PCT/AU98/00265 des
Anmelders, deren vollständiger
Inhalt durch Querverweis darauf hierin eingeschlossen ist. Bei der
beschriebenen Ausführungsform
wird Antigen auf eine Reaktionsmembran in Tröpfchen von 100 pl oder einem
Vielfachen davon (zum Beispiel 10 nl) aufgedruckt, wobei jedes Aliquot
einen Abstand von 1 mm aufweist. Diese Volumina und Abstände können jedoch
erhöht/abgesenkt
werden, je nachdem, welcher Antigentiter und welche Array-Größe gewählt wird.
Beispielswiese ist es möglich,
Tröpfchen
mit Volumina von lediglich 1-10 pl zu verteilen.
-
Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
können
Antigene oder Antikörper
in eine Matrix aus Punkten oder Linien oder in der Form von Buchstaben
aufgedruckt werden, so daß eine
quantitative Mehrfach-Analyten-Analyse einer einzelnen Probe möglich ist.
-
Nachdem
das verteilte Antigen getrocknet ist, werden nichtspezifische Protein-bindende
Stellen auf der (Nitrozellulose-)Membran unter Verwendung von 0,5%
(V/V) Casein in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) – 0,05% (nN) Natriumazid +
0,1% (V/V) Tween-20 (PBSA-Waschpuffer)
blockiert. Es besteht allerdings auch die Option, die Membran im
Anschluß an
das Aufdrucken des Antigens (oder des Antikörpers) oder anderer Liganden
unblockiert zu lassen.
-
Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
kann die Spritzpumpentechnologie, die für die intravenöse Verabreichung
von Flüssigkeiten
an Patienten verwendet wird, angepaßt werden, um einzelne oder mehrere
Reihen auf Nitrozellulosemembranen abzulegen.
-
Verwendung von Immunkonjugaten im Durchflußformat.
-
Die
optische Dichte der Immunkonjugatsuspension wird üblicherweise
bei einer Wellenlange von 520 nm gemessen. Dieser Wert gibt ein
relatives Maß für die Konzentration
des Kolloids. Auch aus der Kenntnis der Bedingungen der Konjugation
ist das Niveau an das Kolloid gebundenem Antikörper bei einer optischer Dichte
= 1 bekannt, und dies kann angewendet werden, um das optimale Volumen
zu bestimmen, das in dem Durchflußtest zu verwenden ist (Antikörperkonzentration
pro ml an Kolloid × Volumen
an Konjugat × optische Dichte
des Konjugats).
-
Das
Immunkonjugat wird zu der Probe, die in der Filteranordnung vorinkubiert
wird, vor dem Kontakt mit der aktiven Membran in dem Gehäuse zugegeben.
Dies ermöglicht
das maximale Anheftungsniveau des Analyten in der Probe, um an den
aktiven, mit dem Kolloid konjugierten Antikörper zu binden. Der Komplex Konjugat:Analyt
wird dann durch den immobilisierten Tests-Antikörper auf der Membran eingefangen,
wenn das Gemisch durch die aktive Membran, die zu der gleichen Zeit
dem Probenfluid ausgesetzt ist, hindurchfiltriert, da das Verfahrenskontroll-Antigen an den sekundären Antikörper, der
mit dem Konjugat verknüpft
ist, bindet.
-
Bei
Mehrfach-Analyten-Proben würden
die mehreren Antikörper
auf dem Konjugat (erfaßbares
Element) auf dem gleichen Niveau an die Proben-Analyten binden,
da sich die Antikörper
auf ihren optimalen Bindungsniveaus auf dem Kolloidpartikel befinden
würden.
-
Beschreibung der Figuren
-
Von
den Zeichnungen zeigt 1 eine Untersuchungsvorrichtung 10 mit
Durchfluß,
welche die oben beschriebene Nitrocellulosemembran verwendet. Die
Vorrichtung hat die Form einer Kassette 12 und eines passenden,
entfernbaren Filterrahmens 14. In der Kassette befindet
sich die Membran (in typischer Weise Nitrocellulose) 16,
auf welcher Einfanganalyten in der Form von Liganden in der oben
beschriebenen Weise aufgedruckt sind und die oben auf einer Absorbensmatrix 18 angeordnet
ist. Die Absorbensmatrix weist vorzugsweise Mehrfachschichten eines
Absorbensgewebes oder einer Absorbensunterlage, wie z. B. Fließpapier,
auf, bei der speziellen Ausführungsform
vierundzwanzig Schichten (Doppellage), von denen man gefunden hat, daß sie eine
ideale Porosität
besitzen, welche den schnellsten Durchfluß verschiedener Lösungen erlaubt.
Dieser schnelle Durchfluß ist
wichtig, denn er führt
zu niedrigeren Hintergrundwerten bei höherer Spezifität und höherer Signalauflösung.
-
Wie
in 1 gezeigt ist, ist oben auf der Kassette in ihrer
oberen Fläche
eine Öffnung
gebildet sowie ein abgehängter,
im allgemeinen kegelstumpfförmiger
Raum, dessen Seiten bis zu der Membran 15 herunterreichen,
um eine Kammer zu bilden, mit schrägen Seiten und einer Basis,
welche von der Membran 16 gebildet ist.
-
Der
Filtereinheitsrahmen 14 ist im Abstand über der oberen Fläche der
Kassette 12 angeordnet. Er bildet auch einen abgehängten konischen
Raum in der Form einer Kammer 21, die auch als „Vorinkubationskammer" bezeichnet ist mit
schrägen
Seiten und einer Basis 22, die aus einer 5 μm-Whatman
grade 1-Membran oder einem 0,22 μm
hydrophilen Durapore-Membranfilter (Millipore, North Ryde, Australien)
gebildet ist. Es können
jedoch auch andere Arten von Filter/Membran und Porengröße je nach
der Anwendung zweckmäßig sein.
Die Funktion der Membran ist es, eine Probe, die untersucht werden
soll, lange genug in dem Raum oder in der Vorinkubationskammer 21 zurückzuhalten,
damit eine „Vorinkubationsstufe" stattfinden kann.
Wenn die Membran 22 abgesenkt wird, um mit der Membran 1 in
Berührung
zu kommen, zieht die Kapillaranziehung die Probe durch die Membranen 22 und 16 aus
der Kammer und in das Gewebe 18 hinein.
-
Zur
einfacheren Nutzung sind zwei Stifte 24 vorgesehen, die
während
der Vorinkubationsstufe den Filterrahmen 14 in einem geeigneten
Abstand über
der Kassette 12 halten, die es aber dem Filterrahmen erlauben,
nach unten gestoßen
zu werden, so daß die
Membranen 22 und 16 für die zweite Stufe des Vorgangs, der
in 2 gezeigt ist, in Berührung kommen. Der Rahmen 14 ist
auch wegnehmbar, so daß die
Membran 16 betrachtet werden kann, um die Ergebnisse der
Untersuchung zu bestimmen.
-
Die 3 bis 5d veranschaulichen
eine handelsübliche
Ausführungsform
einer Untersuchungsvorrichtung entsprechend den Aspekten der 1 und 2.
-
In
diesen Figuren tragen die Komponenten, die den in den 1 und 2 gezeigten
Komponenten äquivalent
sind, dieselben Bezugszahlen. Die Kassette 12 weist einen
oberen Formling 12a und einen unteren Formling 12b auf.
Die poröse
Membran 22 wird von der Basis eines kegelstumpfförmigen Pressfilterpapiers 22a gebildet,
welches von einer Filterrückhalteeinrichtung 23 gehalten
wird. Der Filtereinheitsrahmen 14 bildet zwei Vertiefungen 14a,
auf denen ein Bedienungsmann seine Daumen drücken kann, wenn er den Filterrahmen
niederdrückt,
um die Membranen 22 und 16 in Berührung zu
bringen.
-
Die 5a bis 5d veranschaulichen
die Betriebsstufen der Vorrichtung. 5a veranschaulicht den
Filterrahmen separat von der Kassette 12. 5b veranschaulicht
die Vorinkubation, die so angeordnet ist, daß sich die Basis der Kammer/des
Raumes 21 im Abstand von der Membran befindet. Die 5c und 5d veranschaulichen
die Vorrichtung, nachdem die Filtereinheit niedergedrückt worden
ist, um die Membranen 22 und 16 in Berührung zu
bringen und es der Probe zu erlauben, durch das Fließpapier 18 hindurchzufließen.
-
Wenn
die Membran 22 durch eine hydrophobe Membran ersetzt wird,
ist es möglich,
die Vorrichtung mit einem Vorinkubationsschritt allein in derjenigen
Position zu betreiben, die in den 3 und 4 gezeigt ist,
wobei die Membranen 22 und 16 immer in Berührung miteinander
sind. Die hydrophobe Membran 22 verhindert den Fluß der Probe
in der Inkubationskammer 21 zu der Reaktionsmembran 16.
Nachdem eine ausreichende Zeit vergangen ist, so daß sich der
Erfassungsanalyt in der Kammer 21 an das Reagenz anlagert, wird
ein geeignetes Benetzungsmittel der Probe in der Kammer zugegeben,
welches es der Probe ermöglicht, durch
die Reaktionsmembran 16 und in eine Absorbensmatrix 20 hinein
durch die hydrophobe Membran zu fließen.
-
Beispiel 1
-
Anwendung der Vorfilterkammer
-
Eine
Whatman-Membran (Papier) oder Reemay-Filter (Polyester, 1 cm2) werden in die Kammer 21 in dem
Filterrahmen eingeführt,
um einen konischen Rückhaltebehälter (Vorfiltereinheit)
zu bilden.
-
Die
Probe wird in die Vorfilterkammer aus Kunststoff (50-100 ul) pipettiert
zusammen mit einem Erfassungsanalyten in der Form eines Erfassungsantikörpers (50-100
ul), der sich an kolloidales Gold angelagert hat (Teilchengröße 20-50
nm). In der Vorinkubationskammer wird die Probe 30 Sekunden
lang nach mäßigem Pipettieren,
um ein gutes Vermischen sicherzustellen, mit dem Goldkonjugat (O.D.4)
vorinkubiert. Nach 30 Sekunden wird die Kammer in den Raum 20 der
Testkassette 12 gedrückt.
Nach der Berührung
mit der Membran 16, welche die Erfassungszone enthält, wird
die Lösung
durch die Absorbensschicht 18 darunter hindurchgefiltert.
Das Vorfilter 14 wird weggeworfen, nachdem die Lösung hindurchgefiltert
war, und zwei Tropfen der PBSA-Waschpuffer-Flüssigkeit werden dann der Reaktionsmembran
zugegeben, um überschüssiges Goldkonjugat
abzuwaschen und die Untersuchungsergebnisse auf der Membran 16 zu
verdeutlichen.
-
Die
Verwendung der Vorinkubation der Probe mit dem Erfassungsanalyten
erhöht
die Empfindlichkeit um nahezu das 10-fache. Ferner können jegliche
Feststoffe in der Vorinkubationskammer zurückgehalten werden, die alle
entfernt werden können,
um ein klares Signal zur Verfügung
zu stellen. Die Verwendung der Vorinkubationskammer mit den Doppelrollen,
einen Vorinkubationsschritt und einen Vorfilterschritt zu gestatten, erlaubt
auch die Mehrfachanalyterfassung auf der Reaktionsmembran durch
Vorinkubieren mit einer Mehrfachanalytsonde, z. B. kolloidales Gold,
welches an unterschiedliche Erfassungsanalyten angelagert ist. Zusätzlich können Störanalyten
oder Substanzen, die falsche positive oder negative Werte in der
Untersuchung verursachen könnten,
in dem Vorinkubationsschritt entfernt oder herausabsorbiert werden,
z. B. menschliche Antikörper
zu Mausantigenen können
durch Anti-HAMA-Antikörper
herausabsorbiert werden.
-
Obwohl
das oben beschriebene Beispiel sich auf die Antigene bezieht, welche
auf Krankheit bezogen sind, könnte
die Immununtersuchungsvorrichtung z. B. wie eine Allergietesteinrichtung
verwendet werden, als eine Versuchseinrichtung für Drogenmißbrauch oder für das Analysieren
von nichtmenschlichen Derivatproben, z. B. Bovin, Porcin, Veterinärtests und
Versuche in der Landwirtschaft, wie z. B. Auswertung der Getreidequalität usw.
-
Das
Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sind besonders
geeignet für
die Verwendung mit Tupfern, die in einfacher Weise in die Kammer 21 gebracht
und in einer Flüssigkeit
herumgewirbelt werden können,
welche einen Erfassungsantikörper
enthält
(50-100 ul), der an kolloidales Gold angelagert ist, und zwar 30
Sekunden lang, bevor die Vorfiltereinheit niedergedrückt wird,
um die Membranen 22 und 16 in Berührung miteinander
zu bringen.
-
Eine
beliebige Kombination von Liganden und Analyten kann bei dem System
der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Die Wahl von Liganden
könnte
darauf zugeschnitten sein, vorherrschende Krankheiten in einem besonderen
Land oder einer Bevölkerung
zu erfassen. Z. B. könnten
Analyten aus der folgenden Kombination von Krankheiten unter Verwendung
dieser Anordnung für
die Diagnose verwendet werden.
- 1. TB und HIV
- 2. Hepatitis B und C, HIV
- 3. Chagas-Krankheit, HIV, TB, Syphilis und Hepatitis B und C
- 4. Malaria, Dengue-Fieber, TB, Chagas-Krankheit.
-
Alternativ
könnten
Antigene, welche unterschiedliche Arten von Weizen oder anderen
landwirtschaftlichen Produkten darstellen, auf die Reaktionsmembran
gedruckt werden, wobei die Erfassung von Mehrfachstämmen mit
einem einzigen Test ermöglicht
würde.
-
Beispiel 2
-
Die
Untersuchungsvorrichtung kann auch für die Erfassung von Analyten
in Körperfluiden
außer
Blut benutzt werden, wie z. B. Plasma, Seren, Urin, Speichel und
Sputum. In diesem System kann die Probe in der Vorinkubationskammer 21 durch
die Verwendung einer hydrophoben Membran zurückgehalten werden, z. B. Reemay
oder Hollingsworth and Vose 7303 anstelle der Whatman-Klasse 1-Membran
oder eines 0,22 μm
hydrophilen Durapore-Membran-Filters, der oben beschrieben ist.
Die Probe wird mit dem Erfassungsanalyt die erforderliche Vorinkubationszeit
lang gemischt. Um eine wirksame Durchfluß-Kapillartätigkeit zu der Absorbensschicht 18 zu
erhalten, wenn die Vorinkubationskammer 21 auf die Kassette 12 abgesenkt
wird, kann eines der zwei folgenden Verfahren durchgeführt werden:
- 1. Die Membran 16, welche den Einfanganalyten
enthält,
wird mit mindestens einem Tropfen Waschpufferlösung benetzt, die 0,01 M Phosphat,
0,15 M NaCl, 0,0% Azid, 0,5% Tween 20 oder ein beliebiges
Benetzungsmittel enthält,
welches ein Detergens enthält.
- 2. Die Membran 16, welche den Einfanganalyten enthält, wird
mit einer hygroskopischen Lösung
blockiert, wie z. B. Saccharose, Trehalose, Fructose oder alternativ
Glycerin. Dies verändert
die Eigenschaften der Membran 16 von einer nichthygroskopischen
zu einer hygroskopischen Membran, wodurch die Möglichkeit vorgesehen ist, daß die Probe
nach dem Kontakt der Membran an der Basis der Vorinkubationskammer 21 mit
der Membran 16 durch die Absorbensschicht 18 fließt.
-
Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)
-
Vergleich einer fehlenden Vorinkubation
und einer einminütigen
Vorinkubation einer Probe, die mit Alpha-Amylase bei der oben beschriebenen
Ausführungsform
gespiket ist.
-
Verfahren
-
Eine
6%-ige Lösung
von Rinderserumalbumin wurde mit 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1 ng/ml,
10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml und 1.000 ng/ml gespiket
und gemäß dem folgenden
Verfahren auf die obige Ausführungsform
angewendet:
-
Keine Vorinkubation
-
- I. Die Vorinkubationskammer wurde so niedergedrückt, daß die Basis
der Kammer mit dem ersten Teil, welches den Einfangantikörper gegen
Alpha-Amylase enthält,
in Berührung
kommt.
- II. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde
zu der Vorinkubationskammer dazugegeben, und man ließ es durch
das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
- III. Einhundert Mikroliter von gespiketer Alpha-Amylase-Probe
wurde der Kammer zugegeben, und man ließ sie durch das Absorbensmaterial
unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
- IV. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde
der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial
unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
- V. Sechzig Mikroliter von Anti-Alpha-Amylase-Antikörper, mit
kolloidalem Gold (Partikelgröße 20 bis
50 nm) verknüpft,
wurde der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch
das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
- VI. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde
der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial
unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
- VII. Die Vorinkubationskammer wurde entfernt und das Ergebnis
auf der Reaktionsmembran mit einem dichten Messer abgetastet. Die
Signalstärke
wurde in Pixel-Intensität gemessen.
-
Eine Minute Vorinkubation
-
- I. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde
der ersten Membran zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial
darunter hindurchfiltrieren.
- II. Die Vorinkubationskammer wurde über der ersten Membran so abgehängt, daß es einen
Raum gab zwischen der Kammer und der Membran.
- III. 100 μl
von gespiketer Alpha-Amylase-Probe und 60 Mikroliter von Anti-Alpha-Amylase-Antikörper, verknüpft mit
kolloidalem Gold (Partikelgröße 20-50
nm) wurden in der Vorinkubationskammer eine Minute lang inkubiert.
- IV. Die Kammer wurde abgesenkt, bis sie mit der ersten Membran
in Kontakt kam, und man ließ das
Gemisch der Probe und des Antikörper-Gold-Konjugates
durch das Absorbensmaterial hindurchfiltrieren.
- V. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde
der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial
hindurchfiltrieren.
- VI. Die Vorinkubationskammer wurde entfernt, und das Ergebnis
auf der Reaktionsmembran wurde mit einem Dichtemesser abgetastet.
Die Signalstärke
wurde in Pixel-Intensität
gemessen.
-
Jeder
Datenpunkt auf der Kurve ist das Mittel zweier Experimente unter
Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung. Die Ergebnisse zeigen,
daß die
Vorinkubation der Probe mit dem Erfassungsanalyten eine minimale
Erfassungsgrenze hat, die in Pixeldichte von etwa 500 pg/ml der
Alpha-Amylase gebildet ist. Dies wird verglichen mit einer minimalen
Erfassungsgrenze ohne die Vorinkubation von etwa 50 ng/ml und zeigt
die Vorinkubationszunahmen der Empfindlichkeit um rund das 10-fache
an.
-
Beispiel 4 (Vergleichsbeispiele)
-
Demonstration erhöhter Empfindlichkeit bei erhöhter Vorinkubation
der Probe mit dem Erfassungsanalyt.
-
Amylase-Proben,
die in 0,5% Salzlösung
bis 400 ng/mL gelöst
sind, wurden mit Immungoldkonjugat gegen Amylase behandelt und auf
die Durchflußausführung in
unterschiedlichen Protokollen aliquotiert, wie unten gezeigt ist.
- A. Die Probe wurde der Ausführungsform zugegeben (ohne
einen vorhandenen Filter), und man ließ sie vor der Zugabe des Konjugats
hindurchfiltrieren, gefolgt von einem Konjugat-Aliquot, unmittelbar
nachdem die Probe durch die Membran hindurchgegangen ist.
- B. Die Probe wurde in richtigen Verhältnissen mit Goldkonjugat vermischt
und unmittelbar auf die Durchflußausführung aliquotiert.
- C. Die Probe wurde mit dem Protokoll B gemischt, aber der Durchfließausführungsform
nach einer Zeit von 60 Sekunden zugegeben.
-
Die
in Pixel-Intensität
dargestellten Ergebnisse sind in den Tabellen unten gezeigt (für zwei Experimente):
Protokoll | Probenspitze | Kontrollspitze | Probenbereich | Kontrollbereich | S/PC-Verhältnis |
A | 82 | 286 | 657 | 2120 | 317 |
B | 288 | 758 | 2062 | 5509 | 383 |
C | 823 | 949 | 5843 | 6765 | 884 |
Protokoll | Probenspitze | Kontrollspitze | Probenbereich | Kontrollbereich | S/PC-Verhältnis |
A | 89 | 516 | 588 | 3890 | 588 |
B | 482 | 830 | 3736 | 6345 | 602 |
C | 708 | 829 | 4506 | 5822 | 792 |
-
Eindeutig
gibt es eine bemerkenswerte Zunahme des Probensignals, wenn der
Analyt mit der Konjugatsonde vorinkubiert ist im Unterschied zu
einer folgenden Erfassung auf der Durchflußausführung. Die Differenz der Erfassungsniveaus
(für die
400 ng/ml-Probe) glich einer 7,5-fachen
bis 10-fachen Zunahme in erfassbarer Amylase in der Durchflußausführungsform,
wenn die Probe getrennt von dem Erfassungseinfangantikörper vorinkubiert
ist.
-
Der
Fachmann weiß,
daß zahlreiche
Veränderungen
und/oder Modifikationen an der Erfindung vorgenommen werden können, wie
sie in den speziellen Ausführungsformen
gezeigt ist.
-
Die
vorliegenden Ausführungsformen
werden deshalb in jeder Beziehung als illustrativ und nicht als beschränkend betrachtet.