DE60217202T2

DE60217202T2 - Polyhydroxyalkanoat-Polyester die Vinylphenylgruppen in der Seitenkette enthalten und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE60217202T2
Application number: DE60217202T
Authority: DE
Inventors: Tomohiro Suzuki; Etsuko Sugawa; Tetsuya Yano; Tsuyoshi Nomoto; c/o Canon Kabushiki Kaisha Takeshi Imamura; c/o Canon Kabushiki Kaisha Tsutomu Honma; c/o Canon Kabushiki Kaisha Takashi Kenmoku
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2008-03-13
Also published as: US20030059907A1; EP1236752A3; DE60217202T8; US6803444B2; KR20020070643A; EP1236752B1; DE60217202D1; JP3720779B2; KR100484719B1; JP2002327048A; EP1236752A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Polyester vom Typ eines Polyhydroxyalkanoats (PHA), der eine neue Einheit aufweist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung unter Verwendung eines Mikroorganismus. Insbesondere betrifft sie einen PHA-Polyester, der eine 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit umfaßt, und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen PHA unter Verwendung eines Mikroorganismus, der dieses PHA unter Verwendung von ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure als Ausgangsmaterial produzieren kann.
Einschlägiger Stand der Technik
Es ist bisher bekannt, daß eine große Anzahl von Mikroorganismen Poly-3-hydroxybutyrat (PHB) oder andere PHA produzieren und diese im Inneren der Zelle speichern ("Biodegradable Plastics Handbook", herausgebeben von Biodegradable Plastics Society, veröffentlicht von N.T.S. Co., Ltd., S. 178–197 (1995)). Diese mikrobiellen Polymere, wie PHA, können genau wie herkömmliche Kunststoffe für die Herstellung einer Vielzahl von Produkten durch Schmelzverfahren verwendet werden. Außerdem sind mikrobielle Polymere, wie PHA, biologisch abbaubar, was den Vorteil bietet, daß sie von Mikroorganismen in der Natur vollständig zersetzt werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen synthetischen Polymerverbindungen verbleiben folglich entsorgte mikrobielle PHA nicht so wie sie sind in der Umwelt oder würden nicht zu einer Verschmutzung führen. Mikrobielles PHA hat ferner im allgemeinen eine gute Biokompatibilität, und und es läßt sich dessen Verwendung bei einem weichen medizinischen Teil erwarten.
Es ist auch bekannt, daß die Zusammensetzung und der Aufbau von mikrobiellen PHA in Abhängigkeit vom für die Produktion verwendeten Mikroorganismus, der Zusammensetzung des Kulturmediums, den Züchtungsbedingungen und dergleichen verschieden sind. Bisher wurden Untersuchungen zur Regelung der Zusammensetzung und Struktur von mikrobiellem PHA hauptsächlich vorgenommen, um die physikalischen Eigenschaften des PHA zu verbessern.
Als Teil der Untersuchungen zur Regelung der Zusammensetzung und Struktur von mikrobiellem PHA sind kürzlich verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden, um Mikroorganismen dazu zu bringen, PHA mit einem aromatischen Ring an der Einheit zu produzieren.
Es gibt Berichte, daß Pseudomonas oleovorans ein PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure-Einheiten aufweist, wenn 5-Phenylvaleriansäure als Substrat verwendet wird (Makrocool. Chem., 191, 1957–1965 (1990) und Macromolecules, 24, 5256–5260 (1991).
In Macromolecules, 29, 1762–1766 (1996) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 5-(p-Tolyl)valeriansäure als Substrat ein PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(p-tolyl)valeriansäure-Einheiten aufweist.
In Macromolecules, 32, 2889–2895 (1999) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 5-(2,4-Dinitrophenyl)valeriansäure als Substrat ein PHA produziert, das 3-Hydroxy-5-(2,4-dinitrophenyl)valeriansäure-Einheiten und 3-Hydroxy-5-(p-nitrophenyl)valeriansäure-Einheiten enthält.
In Macromol. Chem. Phys., 195, 1665–1672 (1994) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 11-Phenoxyundecansäure als Substrat ein PHA-Copolymer produziert, das 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure-Einheiten und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure-Einheiten enthält.
Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 2989175 offenbart ein Homopolymer, das aus 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat-Einheiten (3H5(MFP)P-Einheiten) oder 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat-Einheiten (3H5(DFP)P-Einheiten) besteht; ein Copolymer, das 3H5(MFP)P-Einheiten und/oder 3H5(DFP)P-Einheiten enthält; Pseudomonas putida, der die Fähigkeit aufweist, diese Polymere zu produzieren; und ein Verfahren zu deren Herstellung unter Verwendung der Spezies Pseudomonas. Es wird auch offenbart, daß der Mikroorganismus Polymere produzieren kann, die mit 1 oder 2 Fluoratomen substituierte Phenoxygruppen am Ende ihrer Seitenketten aufweisen, indem langkettige Fettsäuren mit einer solchen substituierten Phenoxygruppe assimilieren, und als Vorteil dieser Erfindung wird angegeben, daß ein solches Polymer einen hohen Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit aufweist, und ferner mit Stereoregularität und Wasserabweisungsvermögen ausgestattet ist.
Neben den mit Fluor substituierten PHA, die in der Einheit Fluoratome am aromatischen Ring aufweisen, wurden auch PHA untersucht, die in der Einheit Cyano- und/oder Nitrosubstituenten am aromatischen Ring aufweisen.
Can. J. Microbiol., 41, 32–43 (1995) und Polymer International, 39, 205–213 (1996) berichten, daß ein PHA, das 3-Hydroxy-6-(p-cyanophenoxy)hexansäure oder 3-Hydroxy-6-(p-nitrophenoxy)hexansäure als Monomereinheit enthält, durch Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 oder Pseudomonas putida KT 2442 erhalten wird, wenn als Substrate Octansäure und 6-(p-Cyanophenoxy)hexansäure oder 6-(p-Nitrophenoxy)hexansäure verwendet werden.
Ein PHA, das eine solche Einheit mit einem substituierten aromatischen Ring enthält, ist ein multifunktionelles PHA, da es aufgrund der Substituenten der aromatischen Ringe Funktionen und aufgrund der aromatischen Ringe Eigenschaften, wie einen hohen Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit, aufweist.
Andererseits wurden intensiv Untersuchungen durchgeführt, um ein multifunktionelles PHA zu erhalten, indem durch chemische Umwandlung unter Ausnutzung der Vinylgruppen erwünschte funktionelle Gruppen in die Seitenketten des PHA-Polymers mit einer Vinylgruppe in der Einheit eingeführt wurden.
Polymer, 41, 1703–1709 (2000) berichtet, daß durch Pseudomonas ein Polyester mit einer Vinylgruppe an den Seitenketten erhalten wurde und die Vinylgruppen dann oxidiert wurden, so daß ein Polyester mit einer Hydroxylgruppe an den Seitenketten erzeugt wurde.
Macromolecules, 31, 1480–1486 (1998) berichtet, daß durch Pseudomonas oleovorans ein Polyester mit Vinylgruppen an den Seitenketten erhalten wurde und die Vinylgruppen dann expoxidiert wurden, wodurch ein Polyester mit einer Epoxygruppe an den Seitenketten erzeugt wurde.
Polymer, 40, 3787–3793 (1999) berichtet von der Analyse der Vernetzungsreaktion und von Produkten, wenn ein Polymer, das eine Epoxygruppe an den Seitenketten aufweist und nach einem ähnlichen Verfahren erzeugt worden war, mit Hexamethylendiamin erhitzt wurde.
Polymer, 35, 2090–2097 (1994) berichtet ferner, daß die physikalischen Eigenschaften von Polyester durch eine Vernetzungsreaktion innerhalb des Polyestermoleküls verbessert wurden, wobei Vinylgruppen an den Seitenketten des Polyesters ausgenutzt wurden.
Wie aus den vorstehend aufgeführten Untersuchungen ersichtlich ist, ist die Vinylgruppe, die einen ungesättigten Kohlenwasserstoffrest darstellt, bei einer Additionsreaktion usw. sehr reaktiv, so daß die Vinylgruppe dazu verwendet werden kann, verschiedene funktionelle Gruppen einzuführen und eine chemische Umwandlung vorzunehmen. Eine Vinylgruppe kann ferner einen Haltepunkt oder eine Vernetzungsstelle bei der Vernetzungsreaktion des Polymers darstellen. Angesichts der Verwendung des PHA als funktionelles Material ist es folglich sehr vorteilhaft, wenn in der Einheit, die das PHA bildet, eine Vinylgruppe vorliegt.
Alle bekannten Polyesterpolymere mit Vinylgruppen haben eine Struktur, die sich auszeichnet durch endständiger Vinylgruppen an Alkylseitenketten, die direkt mit der Grundgerüststruktur des Polyesters verbunden sind. Polyester mit Alkylseitenketten haben jedoch im allgemeinen nicht einen so hohen Umwandlungspunkt zweiter Ordnung und Schmelzpunkt, und deren Wärmeeigenschaften sind bei der Schmelzverarbeitung nicht immer von Vorteil, und es gibt nicht viele Materialien, die als Folie oder verarbeitete Gegenstände hervorragende Eigenschaften aufweisen. Andererseits weist ein Polyester mit einem aromatischen Ring in der Seitenkette, wie er bereits beschrieben worden ist, im allgemeinen einen hohen Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit auf.
Folglich ist es erwünscht, einen Polyester zu verwenden, der aromatische Ringe zusammen mit Vinylgruppen an den Seitenketten aufweist, um neue funktionelle Polymere mit hervorragenden Verarbeitungseigenschaften zu entwickeln. Bisher gibt es keinen Bericht, der darauf hinweist, daß ein aromatischer Ring und eine funktionelle Gruppe, wie die Vinylgruppe, in eine Seitenkette eines Polyesters eingeführt worden sind.
Die vorliegende Erfindung soll das vorstehend beschriebene Problem lösen, und ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Polyesters mit einem aromatischen Ring und einer Vinylgruppe an der Seitenkette, insbesondere eines PHA-Polyesters mit biologischer Abbaubarkeit und eines Verfahrens zu dessen Herstellung. Insbesondere sorgt die vorliegende Erfindung für einen PHA-Polyester, der einen aromatischen Ring mit einem Vinylsubstituenten am Ring an der Seitenkette aufweist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung unter Verwendung eines Mikroorganismus.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier genannten Erfinder haben sich auf die Untersuchung konzentriert, um das vorstehend beschriebene Ziel zu erreichen, und gelangten zur vorliegenden Erfindung, wie diese nachfolgend beschrieben ist.
Nach einem Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Polyester vom Polyhydroxyalkanoat-Typ bereitgestellt, umfassend ein Einheits-Prozent (unit %) oder mehr einer 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit der chemischen Formel (1):
worin n für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 7 ausgewählte ganze Zahlen steht.
Wenn es die Umstände erfordern, kann der Polyester in der vorliegenden Erfindung zusätzlich zur vorstehend genannten 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (2) enthalten:
(m ist eine oder mehrere ganze Zahlen, die willkürlich aus dem in der Formel angegebenen Bereich ausgewählt sind).
Zu einem Beispiel eines solchen Polyesters gehört ein Polyester, der im Molekül ein Einheits-% oder mehr von 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (3) enthält:
Nach einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen PHA-Polyesters angegeben, das die folgenden Schritte aufweist:

(1) Bereitstellen einer ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure der chemischen Formel (4) als Ausgangsmaterial,
worin p für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 7 ausgewählte ganze Zahlen steht; und
(2) Herstellen eines Polyesters, der ein Einheits-% oder mehr einer 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit der chemischen Formel (1) umfaßt, unter Verwendung eines Mikroorganismus, der aus der ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure den Polyester produzieren kann,
worin n für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 7 ausgewählte ganze Zahlen steht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum des in Beispiel 1 erhaltenen PHA-Polymers.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen Polyester, der 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (1) enthält (hier nachstehend als erfindungsgemäßer PHA-Polyester bezeichnet), und einen neuen PHA-Polyester mit einem mit einer Vinylgruppe substituierten aromatischen Ring in der Seitenkette bereit:
(n ist eine oder mehrere ganze Zahlen, die willkürlich aus dem in der Formel angegebenen Bereich ausgewählt sind).
Der erfindungsgemäße PHA-Polyester kann unter Verwendung eines Mikroorganismus produziert werden, wie es später ausführlicher beschrieben ist.
Diese 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit hat eine Vinylgruppe in der p-Position einer aromatischen Phenylgruppe. Vinylgruppen sind bei Additionsreaktionen usw. sehr reaktiv und werden der Einführung verschiedener funktioneller Gruppen und der chemischen Umwandlung unterzogen. Das erfindungsgemäße PHA-Polymer hat folglich nicht nur Verarbeitungseigenschaften, wie einen hohen Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit, die auf dem Vorhandensein der Phenylgruppen beruhen, sondern bietet auch die Möglichkeit, daß eine neue Funktion bereitgestellt werden kann, indem verschiedene funktionelle Gruppen eingeführt werden oder eine chemische Umwandlung unter Verwendung der Vinylgruppen vorgenommen wird.
Der erfindungsgemäße PHA-Polyester kann ferner andere Einheiten, gewöhnlich einige 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten, enthalten. Die Einheit der chemischen Formel (1) ist in Hinblick auf den hohen Schmelzpunkt und die gute Verarbeitbarkeit, die vom Anteil der Phenylgruppe abhängen, mit mindestens 1 Einheits-% oder mehr, gewöhnlich als Hauptkomponente, das heißt mit mindestens 50 Einheits-% oder mehr, stärker bevorzugt 70 Einheits-% oder mehr enthalten.
Wenn alle anderen Einheiten im erfindungsgemäßen PHA-Polyester 3-Hydroxyalkansäure der chemischen Formel (2) sind, ist die Einheit der chemischen Formel (1) insbesondere vorzugsweise mit 70% oder mehr enthalten.
(m ist eine oder mehrere ganze Zahlen, die willkürlich aus dem in der Formel angegebenen Bereich ausgewählt sind.)
Wenn das erfindungsgemäße PHA jedoch zusätzlich zur Einheit der chemischen Formel (1) Einheiten mit einer Phenylgruppe in der Seitenkette enthält, beträgt die Summe ähnlicher Einheiten vorzugsweise 70% oder mehr. In Abhängigkeit von der Verwendung des erfindungsgemäßen PHA oder dem Verwendungszweck kann ein solch hoher Gehalt der Einheit der chemischen Formel (1) nicht immer erforderlich sein. Wenn der Gehalt der mit der chemischen Formel (1) angegebenen Einheit jedoch weniger als 1 Einheits-% beträgt, zeigen sich die auf das Vorhandensein dieser Einheit im Polymer zurückzuführenden Eigenschaften insgesamt nicht.
Die als anderer Bestandteil enthaltene 3-Hydroxyalkansäure-Einheit ist vorzugsweise eine 3-Hydroxyalkansäure-Einheit der vorstehenden chemischen Formel (2), bei der die Seitenkette eine lineare Alkylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist. Da 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten dieses Typs keine sehr gute Reaktivität wie die Vinylgruppe aufweisen, würden sie nicht zu einer unnötigen Reaktion führen, womit eine selektive Reaktion der Vinylgruppe möglich ist, wenn verschiedene funktionelle Gruppen eingeführt werden oder eine chemische Umwandlung erfolgt. Das erfindungsgemäße PHA wird übrigens dem Schmelzformen unterzogen und zu verschiedenen Endprodukten verarbeitet. Wenn das Molekulargewicht übermäßig hoch ist, übersteigt der Schmelzpunkt des Polyesters den Schmelzbereich, da die Wirkung der Vinylgruppe, den Schmelzpunkt zu erhöhen, äußerst stark ist. Angesichts dessen liegt das Zahlenmittel des Molekulargewichts des erfindungsgemäßen PHA vorzugsweise im Bereich von 3.000 bis 200.000.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des PHA-Polyesters ausführlich beschrieben.
Der erfindungsgemäße PHA-Polyester kann von einem Mikroorganismus als biologisch abbaubarer PHA-Polyester erzeugt werden. Insbesondere wird eine ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure der folgenden chemischen Formel (4):
(p ist Null oder eine ganze Zahl nicht kleiner als 8) von einem PHA produzierenden Mikroorganismus in die entsprechende 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit der chemischen Formel (1) überführt. Dann produziert der Mikroorganismus den die umgewandelten Einheiten enthaltenden PHA-Polyester und speichert ihn.
Wenn zum Beispiel 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure der folgenden chemischen Formel (5) als Ausgangsmaterial verwendet wird,
wird ein PHA-Polyester produziert und gespeichert, der eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit der chemischen Formel (3) enthält:
Wenn eine 8-(4-Vinylphenyl)octansäure der chemischen Formel (6) als Ausgangsmaterial verwendet wird,
wird ein PHA-Polyester produziert und gespeichert, der eine 3-Hydroxy-8-(4-vinylphenyl)octansäure-Einheit der chemischen Formel (7)
und eine 3-Hydroxy-6-(4-vinylphenyl)hexansäure-Einheit der chemischen Formel (8) enthält
Wenn ferner 10-(4-Vinylphenyl)decansäure der folgenden chemischen Formel (9) als Ausgangsmaterial verwendet wird,
wird ein PHA-Polyester erzielt und gespeichert, der eine 3-Hydroxy-10-(4-vinylphenyl)decansäure-Einheit der chemischen Formel (10)
eine 3-Hydroxy-8-(4-vinylphenyl)octansäure-Einheit der chemischen Formel (7)
und eine 3-Hydroxy-6-(4-vinylphenyl)hexansäure-Einheit der chemischen Formel (8) enthält:
Wenn 11-(4-vinylphenyl)undecansäure der chemischen Formel (11) als Ausgangsmaterial verwendet wird,
wird ein PHA-Polyester erzielt und gespeichert, der eine 3-Hydroxy-9-(4-vinylphenyl)nonansäure-Einheit der chemischen Formel (12)
eine 3-Hydroxy-7-(4-vinylphenyl)heptansäure-Einheit der chemischen Formel (13)
und eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit der chemischen Formel (3) enthält:
Der erzeugte PHA-Polyester weist an der Seitenkette der 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit im allgemeinen hydrophobe Atomgruppen, wie eine 4-Vinylphenylgruppe, auf, so daß der PHA-Polyester eine schlechte Wasserlöslichkeit aufweist und in den mikrobiellen Zellen gespeichert wird. Der Polyester wird folglich leicht aus dem Kulturmedium abgetrennt, wenn der Mikroorganismus gezüchtet und die Zellen aufgefangen werden, die den PHA-Polyester speichern. Wenn die aufgefangenen Zellen gewaschen und getrocknet werden, kann der gewünschte PHA-Polyester gewonnen werden. Für die Gewinnung des PHA-Polyesters aus den gezüchteten mikrobiellen Zellen kann irgendein übliches Verfahren angewendet werden. Die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Dichlormethan und Aceton, ist zum Beispiel besonders bequem, es können jedoch Dioxan, Tetrahydrofuran und Acetonitril verwendet werden. Wenn die Bedingungen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln nicht bevorzugen, kann das PHA aus den Zellen gewonnen werden, die unter Anwendung eines der folgenden Verfahren aufgebrochen worden sind, wobei die anderen Zellkomponenten entfernt werden. Zu diesen Verfahren gehören: eine Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, eine Behandlung mit einem Enzym, wie Lysozym, eine chemische Behandlung, wie mit Hypochlorit, Ammoniak und EDTA, das Aufbrechen mittels Ultraschall, das Aufbrechen mit einem Homogenisierapparat, das Aufbrechen mittels Druck, das Aufbrechen durch ein Kugelschlagverfahren, das Mahlen, das Zerstoßen und das Gefrieren und Auftauen.
Der für die Produktion des erfindungsgemäßen PHA-Polyesters verwendete Mikroorganismus kann irgendwelche Mikroorganismen sein, die PHA produzieren können, insbesondere ein Mikroorganismus, der einen PHA-Polyester produzieren kann, der 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheiten der chemischen Formel (1) enthält, wenn er in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure (chemische Formel (4)) enthält. Ein Beispiel eines solchen Mikroorganismus ist die Gattung Pseudomonas. Insbesondere ist es bevorzugt, solche Stämme, wie jene zu verwenden, die PHA produzieren können, jedoch keine Enzymaktivitäten aufweisen, um den Vinylsubstituenten an der Phenylgruppe zu oxidieren oder zu epoxydieren. Stärker bevorzugte Stämme sind zum Beispiel Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375, Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374, Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376 und Pseudomonas putida P91, FERM BP-7373.
Diese vier Mikroorganismen sind beim International Patent Organism Depositary (IPOD) vom Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) (früher Agency of Industrial Science and Technology des ehemaligen Ministry of International Trade and Industry) hinterlegt und in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-288256 beschrieben.
Die Komponenten des erfindungsgemäßen PHA-Polyesters, die 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit der chemischen Formel (1) und die 3-Hydroxyalkansäure-Einheit der chemischen Formel (2), weisen zudem beide an ihrer 3-Position asymmetrische Kohlenstoffatome auf. Folglich existieren Stereoisomere des PHA, deren absolute Konfiguration aufgrund dieser asymmetrischen Zentren unterschiedlich ist. Angesichts der biologischen Abbaubarkeit sind PHA besonders bevorzugt, bei denen die Einheiten alle ein R-Stereoisomer sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die entsprechende Alkansäure von einem Mikroorganismus in 3-Hydroxyalkansäure überführt, so daß der durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren erhaltene PHA-Polyester die Besonderheit aufweist, daß alle Einheiten R-Stereoisomere sind.
Beim erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren, bei dem der PHA produzierende Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das ein Substrat enthält, werden die Züchtungsbedingungen vorzugsweise wie folgt ausgewählt.
Die Konzentration eines Substrats für die Herstellung des gewünschten erfindungsgemäßen PHA-Polyesters, das heißt ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure der chemischen Formel (4), in einem Kulturmedium liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 1% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt im Bereich von 0,02 bis 0,2 (Gew./Vol.). Wenn der PHA-Polyester ferner zusätzlich zu den 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheiten eine andere Art von 3-Hydroxyalkansäure-Einheiten enthalten soll, wird die entsprechende 3-Hydroxyalkansäure als Substrat in das Kulturmedium gegeben.
Das Kulturmedium kann Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Polypepton und Fleischextrakt, enthalten, um das mikrobielle Wachstum zu beschleunigen. Das heißt, Peptide in Form von Hefeextrakt, Polypepton oder Fleischextrakt, können als Energiequelle und Kohlenstoffquelle zugesetzt werden.
Nach einer anderen Ausführungsform können dem Kulturmedium Kohlehydrate als Energie- und Kohlenstoffquelle zugesetzt werden, die durch das Wachstum des Mikroorganismus verbraucht werden. Es können zum Beispiel Aldosen, wie Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose; Alditol, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol; Aldonsäuren, wie Gluconsäure; Uronsäuren, wie Glucuronsäure, Galacturonsäure usw.; Disaccharide, wie Maltose, Saccharose und Lactose, und dergleichen verwendet werden.
Die vorstehend angegebenen Saccharide können auch durch organische Säuren, insbesondere Carbonsäuren ersetzt werden, wie jene, die am TCC-Zyklus beteiligt sind, oder jene, die durch wenige biochemische Schritte vom TCC-Zyklus stammen. Es können zum Beispiel Hydroxycarbonsäuren oder Oxocarbonsäuren, wie Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Ketoglutarsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Milchsäure und andere oder deren wasserlösliche Salze verwendet werden. Nach einer anderen Ausführungsform können Aminosäuren, zum Beispiel Aminosäuren, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, oder deren Salze verwendet werden. Wenn dem Kulturmedium organische Säuren oder deren Salze zugesetzt werden, ist es bevorzugt, ein oder mehrere aus Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Ketoglutarsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Milchsäure und Salzen davon auszuwählen. Wenn dem Kulturmedium Aminosäuren oder deren Salze zugesetzt werden, ist es bevorzugt, eine oder mehrere aus Asparaginsäure, Glutaminsäure und deren Salzen auszuwählen. In diesem Fall ist es möglich, diese insgesamt oder ein Teil davon in Form eines wasserlöslichen Salzes zuzusetzen, um sie falls erforderlich gleichmäßig im Kulturmedium zu lösen, ohne daß der pH-Wert beeinflußt wird.
Irgendwelche der vorstehend genannten Peptide, Kohlehydrate, organischen Säuren und deren Salze, Aminosäuren und deren Salze können allein oder in Kombination als Nährstoffe in das Kulturmedium gegeben werden, um das Wachstum des Mikroorganismus zu verbessern. In diesem Fall liegt die in das Kulturmedium zu gebende Menge gewöhnlich im Bereich von 0,1 bis 5% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 2% (Gew./Vol.). Wenn ein Salz einer organischen Säure verwendet wird, ist die Zugabemenge die der entsprechenden organischen Säure. Wenn zwei oder mehr Arten zusammen verwendet werden, ist es erwünscht, wenn die Gesamtmenge im vorstehend angegebenen Bereich liegt.
In der vorliegenden Erfindung können irgendwelche anorganischen Kulturmedien, die Phosphat und eine Stickstoffquelle, wie ein Ammoniumsalz oder Nitrat, enthalten, als grundlegendes Salzmedium verwendet werden. Die Produktivität für das PHA kann ferner verbessert werden, wenn die Konzentration der im Medium enthaltenen Stickstoffquelle geregelt wird.
Es kann irgendeine Züchtungstemperatur angewendet werden, sofern sich der zu verwendende Stamm bei dieser Temperatur gut vermehren kann, es ist jedoch geeignet, eine Züchtungstemperatur im Bereich von 15 bis 30°C auszuwählen. Es kann irgendeine Art eines Züchtungsverfahrens, flüssig oder fest, verwendet werden, sofern sie die Substrate oder Nährstoffe aufnehmen kann, der zu verwendende Mikroorganismus darin oder darauf wachsen kann und sie in einer Form vorliegt, die für die Produktion des PHA geeignet ist. Ferner kann sie eine Batch-Kultur, eine Fed-batch-Kultur, eine halbkontinuierlich Kultur oder eine kontinuierliche Kultur sein. Zu geeigneten Batch-Flüssigkulturverfahren gehören die Züchtung in einem Schüttelkolben, um durch Schütteln Sauerstoff zuzuführen, oder eine Züchtung in einem Fermentor, wobei Sauerstoff durch ein Belüftungs/Bewegungs-System zugeführt wird.
Als Verfahren zur mikrobiellen Produktion von PHA gibt es zusätzlich zur vorstehend beschriebenen Kultur mit einem Schritt, bei dem ein Mikroorganismus in einem Medium aus anorganischen Salzen gezüchtet wird, das das Substrat in einer vorbestimmten Menge, Phosphat und eine Stickstoffquelle, wie ein Ammoniumsalz oder Nitrat, enthält, auch ein Züchtungsverfahren mit zwei Schritten. Bei dieser Züchtung mit zwei Schritten wird der Mikroorganismus zuerst im vorstehend angegebenen Kulturmedium für die Züchtung in einem Schritt vollständig gezüchtet und dann in ein zweites Kulturmedium übertragen und darin gezüchtet, in dem die Stickstoffquelle, wie Ammoniumchlorid, eingeschränkt ist, das Substrat jedoch in einer für die Produktion und Speicherung des PHA vorbestimmten Konzentration enthalten ist. Durch dieses Züchtungsverfahren in zwei Schritten kann die Produktivität für das PHA verbessert werden.
Die Zusammensetzung des Mediums M9, ein Kulturmedium aus anorganischen Salzen, das in den folgenden Beispielen verwendet wird, ist nachfolgend aufgeführt. Dies stellt ein Beispiel von grundlegenden Medien aus anorganischen Salzen dar, die im erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren verwendet werden können. Zusammensetzung des Mediums M9 (g/l)

Na₂HPO₄: 6,3

KH₂PO₄: 3,0

NH₄Cl: 1,0

NaCl: 0,5; pH = 7,0.
Um ein gutes Wachstum und eine hohe Produktivität für das PHA zu erreichen, ist es ferner erforderlich, dem anorganischen Kulturmedium, wie dem Medium M9, eine Stammlösung von Spurenelementen mit der folgenden Zusammensetzung bis zu etwa 0,3% (V./V.) zuzusetzen. Die Zugabe einer solchen Lösung von geringfügigen Bestandteilen dient der Zuführung von Spurenmetallelementen, die beim Wachstum eines Mikroorganismus verwendet werden. Zusammensetzung einer Lösung von geringfügigen Bestandteilen (g/l)

Nitrilotiressigsäure: 1,5

MgSO₄: 3,0

MnSO₄: 0,5

NaCl: 1,0

FeSO₄: 0,1

CaCl₂: 0,1

CoCl₂: 0,1

ZnSO₄: 0,1

CuSO₄: 0,1

AlK(SO₄)₂: 0,1

H₃BO₃: 0,1

Na₂MoO₄: 0,1

NiCl₂: 0,1.
[Beispiele]
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen konkreter beschrieben. Diese Beispiele stellen die beste Art und Weise dieser Erfindung dar, die vorliegende Erfindung sollte jedoch nicht darauf begrenzt sein.
Beispiel 1
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Polypepton als Peptidquelle (Nährstoff) enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet.
Eine Kolonie des Stamms YN2, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Polypepton und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 24 Stunden bei 40°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit kaltem Methanol gewonnen. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 139 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 22 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 3.700 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 8.900.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). In der Figur ist das ¹H-NMR-Spektrum gezeigt. Die Zuordnung der Wasserstoffatome, die die entsprechenden Resonanzsignale in dem in der Figur dargestellten ¹H-NMR-Spektrum ergeben, sind in Tabelle 1 aufgeführt (¹H-NMR).
[Tabelle 1]
Ergebnis der ¹H-NMR-Zuordnung

ppm	Integrierter Wert	Aufteilung	Zuordnung
1,82~1,86	2H	m	c
2,40~2,64	4H	m	a, d
5,14~5,28	2H	m	b, h1
5,62~5,67	1H	d	h2
6,58~6,66	1H	t	g
7,03~7,05	2H	d	e
7,24~7,26	2H	d	f

Als Ergebnis der Zuordnung des ¹H-NMR wurde bei jedem in der Figur angegebenen Signal bestätigt, daß es von einer 3-Hydroxy-5-(4- vinylphenyl)valeriansäure-Einheit stammt. Es wurde auch aufgezeigt, daß das erhaltene PHA eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit mit einem Gehalt von mindestens 73 Einheits-% oder mehr enthält. Von der 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit verschiedene Einheiten enthielten keine aromatischen Ringe (Benzolringe), und es wird angenommen, daß sie eine 3-Hydroxyalkansäure-Einheit der chemischen Formel (2) sind.
Beispiel 2
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit zwei Schritten gezüchtet.
Eine Kolonie des Stamms YN2, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Glucose und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure enthielt, und 48 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen.
Die gewonnenen Zellen wurden dann in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Glucose und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure, jedoch kein NH₄Cl enthielt und 48 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 24 Stunden bei 40°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit kaltem Methanol gewonnen. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 203 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 17 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie (GPC) gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 8.100 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 17.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde ein Spektrum beobachtet, das den ¹H-NMR-Signalen in Beispiel 1 entspricht, und es wurde bestätigt, daß das PHA eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit enthielt; und anhand der Intensität des Spektrums mit 97 Einheits-% oder mehr.
Beispiel 3
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Natriumpyruvat als organische Säure enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA in einer Kultur mit zwei Schritten gezüchtet.
Die Zellkultur und die Produktion von PHA erfolgten in der gleichen Weise wie in Beispiel 2, außer daß Glucose durch Natriumpyruvat ersetzt wurde, das eine α-Oxocarbonsäure im Glycolyse- oder Gluconeogeneseweg ist. Die getrockneten Zellen wurden gewogen, und das Polymer wurde nach dem gleichen Verfahren und unter den gleichen Bedingungen gewonnen. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 145 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers (gewonnene Menge) lag bei 29 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie (GPC) gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 7.300 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 16.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde ein Spektrum beobachtet, das dem ¹H-NMR-Signal im vorstehend beschriebenen Beispiel 1 entspricht, und es wurde bestätigt, daß es ein PHA zeigt, das eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit enthält. Laut Intensität des Spektrums betrug der Gehalt der 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit mindestens 99 Einheits-% oder mehr.
Beispiel 4
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Polypepton als Peptidquelle enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde sowohl mit Aceton als auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms YN2, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Polypepton und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure enthielt, und 72 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 155 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 20 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 9.900 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 39.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde ein Spektrum beobachtet, das dem ¹H-NMR-Signal im vorstehend beschriebenen Beispiel 1 entspricht, und es wurde bestätigt, daß es ein PHA zeigt, das eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit enthält. Laut Intensität des Spektrums betrug der Gehalt der 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit mindestens 99 Einheits-% oder mehr.
Beispiel 5
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Hefeextrakt enthielt, wurde der Stamm P161 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde mit Aceton sowie auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms P161, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Hefeextrakt und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure enthielt, und 72 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 135 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 16 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 8.900 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 32.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde ein Spektrum beobachtet, das dem ¹H-NMR-Signal im vorstehend beschriebenen Beispiel 1 entspricht, und es wurde bestätigt, daß es ein PHA zeigt, das eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit enthält. Laut Intensität des Spektrums betrug der Gehalt der 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit mindestens 99 Einheits-% oder mehr.
Beispiel 6
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Hefeextrakt enthielt, wurde der Stamm H45 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde mit Aceton sowie auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms H45, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Hefeextrakt und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure enthielt, und 72 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 135 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 16 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 8.900 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 32.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde ein Spektrum beobachtet, das dem ¹H-NMR-Signal im vorstehend beschriebenen Beispiel 1 entspricht, und es wurde bestätigt, daß es ein PHA zeigt, das eine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit enthält. Laut Intensität des Spektrums betrug der Gehalt der 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit mindestens 99 Einheits-% oder mehr.
Beispiel 7
Unter Verwendung des Mediums M9, das 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure und Hefeextrakt enthielt, wurde der Stamm P91 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde mit Aceton sowie auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms P91, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Hefeextrakt und 0,05% 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure enthielt, und 96 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 105 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 11 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 9.200 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 31.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde ein Spektrum beobachtet, das dem ¹H-NMR-Signal im vorstehend beschriebenen Beispiel 1 entspricht, und es wurde bestätigt, daß es ein PHA zeigt, daseine 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit als Hauptbestandteil-Einheit enthält. Laut Intensität des Spektrums betrug der Gehalt der 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit mindestens 99 Einheits-% oder mehr.
Beispiel 8
Unter Verwendung des Mediums M9, das 8-(4-Vinylphenyl)octansäure und Polypepton enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde mit Aceton sowie auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms YN2, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Polypepton und 0,05% 8-(4-Vinylphenyl)octansäure enthielt, und 96 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 170 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 26 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 12.200 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 38.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde deutlich, daß das Polymer ein PHA war, das 3-Hydroxy-8-(4-vinylphenyl)octansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (7) und 3-Hydroxy-6-(4-vinylphenyl)hexansäure-Einheiten der chemischen Formel (8) im Verhältnis von 30 : 70 enthielt.
Beispiel 9
Unter Verwendung des Mediums M9, das 10-(4-Vinylphenyl)decansäure und Polypepton enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde mit Aceton sowie auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms YN2, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Polypepton und 0,05% 10-(4-Vinylphenyl)decansäure enthielt, und 96 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 160 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 23 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 10.000 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 36.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde deutlich, daß das Polymer ein PHA war, das 3-Hydroxy-10-(4-vinylphenyl)decansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (10) und 3-Hydroxy-8-(4-vinylphenyl)octansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (7) und 3-Hydroxy-6-(4-vinylphenyl)hexansäure-Einheiten der chemischen Formel (8) im Verhältnis von 20 : 30 : 50 enthielt.
Beispiel 10
Unter Verwendung des Mediums M9, das 11-(4-Vinylphenyl)undecansäure und Polypepton enthielt, wurde der Stamm YN2 für die Produktion von PHA durch eine Kultur mit einem Schritt gezüchtet. Das PHA wurde mit Aceton sowie auch Chloroform herausgelöst.
Eine Kolonie des Stamms YN2, die auf einer Agarplatte gewachsen war, wurde in einen 500 ml Schüttelkolben geimpft, der 200 ml Kulturmedium M9 enthielt, das 0,5% Polypepton und 0,05% 11-(4-Vinylphenyl)undecansäure enthielt, und 120 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die gewachsenen Zellen durch Zentrifugentrennung gewonnen und mit Methanol gewaschen und gefriergetrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde gewogen.
Den getrockneten Zellen wurde Chloroform zugesetzt, um das Polymer für 72 Stunden bei 25°C herauszulösen. Der Chloroformextrakt wurde filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Chloroformschicht, in der das Polymer gelöst war, wurde mit einem Verdampfer eingeengt. Danach wurde der Rückstand mit Aceton gelöst, und das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt. Der Acetonextrakt wurde mit einem Verdampfer eingeengt und mit kaltem Methanol gefällt. Der gewonnene Niederschlag wurde dann bei reduziertem Druck getrocknet, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der trockenen Zellen betrug 170 mg, und das Gewicht des erhaltenen (gewonnenen) Polymers lag bei 26 mg.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gel-Permeationschromatographie gemessen (HLC-8220 GPC; Toso Co., Ltd., Säule: TSK-GEL Super HM-H; Toso Co., Ltd., Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrolstandards). Als Ergebnis hatte das erhaltene Polymer ein Zahlenmittel des Molekulargewichts Mn = 11.000 und ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw = 37.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; Resonanzfrequenz: 400 MHz, gemessenes Nuclid: ¹H, verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃, Bezug: in einer Kapillare verschlossenes TMS/CDCl₃, Meßtemperatur: Raumtemperatur). Als Ergebnis wurde deutlich, daß das Polymer ein PHA war, das 3-Hydroxy-9-(4-vinylphenyl)nonansäure-Einheiten der folgenden chemischen Formel (12) und 3-Hydroxy-7-(4-vinylphenyl)heptansäure-Einheiten der chemischen Formel (13) und 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheiten der chemischen Formel (3) im Verhältnis von 10 : 20 : 70 enthielt.

Claims

Polyester vom Polyhydroxyalkanoat-Typ, umfassend ein Einheits-% (one unit %) oder mehr einer 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit der chemischen Formel (1):
worin n für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 7 ausgewählte ganze Zahlen steht.
Polyester nach Anspruch 1, wobei der Polyester ferner eine 3-Hydroxyalkansäure-Einheit der chemischen Formel (2) umfaßt:
worin m für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 8 ausgewählte Einheiten steht.
Polyester nach Anspruch 1, wobei der Polyester im Molekül ein Einheits-% oder mehr einer 3-Hydroxy-5-(4-vinylphenyl)valeriansäure-Einheit der chemischen Formel (3) enthält:
Polyester nach Anspruch 1, wobei der Polyester ein Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von 3.000 bis 200.000 hat.
Verfahren zur Herstellung eines Polyesters, umfassend die Schritte: (1) Bereitstellen einer ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure der chemischen Formel (4) als Ausgangsmaterial,
worin p für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 7 ausgewählte ganze Zahlen steht; und (2) Herstellen eines Polyesters, der ein Einheits-% oder mehr einer 3-Hydroxy-ω-(4-vinylphenyl)alkansäure-Einheit der chemischen Formel (1) umfaßt, unter Verwendung eines Mikroorganismus, der aus ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure den Polyester produzieren kann,
worin n für eine oder mehrere willkürlich aus 0 bis 7 ausgewählte ganze Zahlen steht.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Schritt (2) den Schritt (3) umfaßt, bei dem der Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das die ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure als 5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure der chemischen Formel (5) vorliegt:
und der Polyester im Molekül ein Einheits-% oder mehr der 3-Hydroxy-5-(4-Vinylphenyl)valeriansäure-Einheit der chemischen Formel (3) enthält:
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Kulturmedium zusätzlich zur ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure eine Peptidquelle enthält.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Peptidquelle Polypepton ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Kulturmedium zusätzlich zur ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure Hefeextrakt enthält.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Kulturmedium zusätzlich zur ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure eine organische Säure oder deren Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die organische Säure oder deren Salz ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Ketoglutarsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Milchsäure und einem Salz davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Kulturmedium zusätzlich zur ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure eine Aminosäure oder deren Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Aminosäure oder deren Salz ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und einem Salz davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Kulturmedium zusätzlich zur ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure ein Kohlehydrat enthält.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Kohlehydrat ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Glycerinaldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Glycerol, Erythritol, Xylitol, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Maltose, Saccharose und Lactose besteht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Kulturmedium zusätzlich zur ω-(4-Vinylphenyl)alkansäure eine geradkettige Alkansäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder deren Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Schritt (2) ferner den Schritt (4) umfaßt, bei dem der vom Mikroorganismus produzierte Polyester aus dem Mikroorganismus gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Pseudomonas gehört.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375; Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374; Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376; und Pseudomonas putida P91, FERM BP-7373.