DE60210864T2

DE60210864T2 - Modifiziertes fluoreszentes Protein

Info

Publication number: DE60210864T2
Application number: DE60210864T
Authority: DE
Inventors: Atsushi Wako-shi Miyawaki; Takeharu Wako-shi Nagai
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2022-06-08
Also published as: US7595375B2; EP1264888A2; EP1264888A3; JP2002369690A; US7981658B2; US20030017538A1; EP1264888B1; US20100184116A1; DE60210864D1; JP3829252B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues fluoreszierendes Protein, das verbesserte Eigenschaften aufweist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein fluoreszierendes Protein, das erhalten wird durch Ersetzen der 46. Aminosäure im grün fluoreszierenden Protein, im gelb fluoreszierenden Protein oder Mutanten derselben durch einen Leucin-Rest, wobei das Protein die Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins von Aequorea victoria, des daraus abgeleiteten gelb fluoreszierenden Proteins oder deren Mutanten mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition von einer bis zwanzig Aminosäuren aufweist, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend dem natürlich vorkommenden Protein wie folgt definiert sind: F46 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, F64 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, M153 ist durch einen Threonin-Rest ersetzt, V163 ist durch einen Alanin-Rest ersetzt, und S175 ist durch einen Glycin-Rest ersetzt, sowie die Verwendung derselben.
Technischer Hintergrund
Mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) der Qualle Aequorea victoria ergaben sich unzählige Anwendungen für biologische Systeme (Tsien, R.Y. (1998), Ann. Rev. Biochem. 67, 509–544). Während der letzten Jahre wurden durch zufallsbestimmte und halbrationale Mutagenese GFP-Varianten mit neuen Farben, verbesserten Faltungseigenschaften, größerer Helligkeit und veränderter pH-Empfindlichkeit erzeugt. Durch genetische Manipulationen wurden Hunderte von Proteinen erfolgreich zu GFPs verschmolzen, so dass ihre Expression und ihre Bewegung verfolgt werden konnten. Wird GFP oder ein GFP-Fusionsprotein heterolog mit einer bestimmten Stärke exprimiert, so ist die Intensität der Fluoreszenz abhängig von:

(1) der maximalen Helligkeit des GFP-Fluorophors, die limitiert ist durch das Produkt aus Extinktionskoeffizient (ε) und Fluoreszenz-Quantenausbeute (Φ);
(2) der Reifungseffizienz neu synthetisierter GFP-Polypeptide;
(3) dem Ausmaß der Löschung des GFP-Fluorophors durch Umweltfaktoren.

Das gelb fluoreszierende Protein (YFP) ist eine der meistverwendeten GFP-Varianten und hat die längstwellige Emission aller Aequorea-GFP-Varianten. Die meisten YFP-Varianten weisen ein ε und Φ innerhalb von 60.000 bis 100.000 M^–1 cm^–1 bzw. 0,6 bis 0,8 auf (Tsien, R.Y. (1998), Ann. Rev. Biochem. 67, 509–544). Diese Werte sind fast vergleichbar mit denen allgemein bekannter heller Fluorophore wie etwa Fluorescein und Rhodamin. Daher scheint die Verbesserung der maximalen Helligkeit von YFP ihre Grenzen erreicht zu haben.
Neu synthetisierte GFP-Polypeptide müssen in der richtigen Weise reifen, ehe sie Fluoreszenz emittieren. Die Reifung erfolgt in zwei Schritten: zunächst Faltung des Proteins zu einer nahezu nativen Konformation, anschließend Cyclisierung eines internen Tripeptids, gefolgt von Oxidation. Einige der Primärmutationen, welche die Reifung von GFP verbessern, wurden identifiziert (Tsien, R.Y. (1998), Ann. Rev. Biochem. 67, 509–544). Zum Beispiel sind F64L/M153T/V163A/S175G allgemein bekannte Mutationen, die in zahlreiche verbesserte GFP-Varianten eingeführt wurden. M153T und S175G befinden sich an der Oberfläche der Betatonne, und man weiß, dass sie die Faltungseffizienz und die Stabilität verbessern, indem sie die Hydrophobie der Oberfläche verringern und die Löslichkeit des Proteins erhöhen. Allerdings ist bei keiner Mutation klar zu erkennen, dass sie die abschließende Oxidationsreaktion bei 37°C erleichtert, obwohl solche Mutationen überaus wünschenswert sind, da der Oxidationsschritt der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im gesamten Prozess der GFP-Reifung ist. Auch wenn es einige Verbesserungen bei der Faltungseffizienz gegeben hat, ist die langsame Reifung noch immer eines der größten Probleme bei der Anwendung von GFP-Varianten zum Sichtbarmachen und ist noch problematischer, wenn diese bei 37°C exprimiert und/oder auf bestimmte Organellen gerichtet werden. Es ist daher in diesem Stadium entscheidend und notwendig, GFP-Varianten zu erhalten, die bessere Reifungseffizienz aufweisen.
Unter den Aequorea-GFP-Varianten sind die YFPs relativ säureempfindlich und werden in charakteristischer Weise durch Halogenid-Ionen gelöscht, darunter Chlorid (Cl^–) (Jayaraman, S. et al. (2000), J. Biol. Chem. 275, 6047–6050; Wachter, R.M. et al. (2000), J. Mol. Biol. 301, 157–171). Protonen (H⁺) und Cl^– beeinflussen synergistisch den Ladungszustand des Chromophors von YFP und unterdrücken so die Fluoreszenz. In den intrazellulären Organellen sind die Konzentrationen dieser Ionen unterschiedlich; man findet eine deutliche Anreicherung von H⁺ in den sekretorischen Organellen. Zudem ändern sich auf Reize ihre Konzentrationen in dynamischer Weise (Kuner, T. et al (2000), Neuron 27, 447–459). Zum Beispiel wird durch Glutamat und elektrische Stimulierung der Hippocampusneuronen der intrazelluläre pH um etwa 0,4 gesenkt, und die Rezeptorvermittelten Cl^–-Ströme finden in olfaktorischen und GABAergen Neuronen statt. Um YFP unter solchen Umständen in voller Stärke und stabil fluoreszieren zu lassen, sind Mutationen erwünscht, die die Empfindlichkeit sowohl gegenüber H⁺ als auch Cl^– verringern.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von GFP- oder YFP-Mutanten mit ausgezeichneter Reifungswirksamkeit. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von GFP- oder YFP-Mutanten mit verringerter Empfindlichkeit sowohl gegenüber H⁺ als auch Cl^–.
Zur Lösung der obigen Aufgabe führten die hier tätigen Erfinder eingehende Forschungen durch und konstruierten eine neue Mutante von YFP. Die hier täti gen Erfinder zeigten den Nutzen der neuen Variante auf, indem sie sie auf sekretorische Vesikel von PC12-Zellen richteten, um Exozytose-Ereignisse wirksam zu verfolgen, und sie als Akzeptor für den sofortigen Nachweis verlässlicher FRET-Signale (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) verwendeten. Die fluoreszierenden Proteine der vorliegenden Erfindung haben verbesserte Geschwindigkeit und Ausbeute bei der Reifung und Widerstandsfähigkeit sowohl gegenüber H⁺ als auch Cl^–, haben daher breitere Anwendbarkeit und ermöglichen Fluoreszenz-Markierungen, die bislang unmöglich waren.
Gemäß vorliegender Erfindung wird somit ein fluoreszierendes Protein bereitgestellt, das die Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins, des gelb fluoreszierenden Proteins oder Mutanten derselben aufweist, wobei der Phenylalanin-Rest Nr. 46 durch einen Leucin-Rest ersetzt ist, wobei das Protein die Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins von Aequorea victoria, des daraus abgeleiteten gelb fluoreszierenden Proteins oder deren Mutanten mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition von einer bis zwanzig Aminosäuren aufweist, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend dem natürlich vorkommenden Protein wie folgt definiert sind: F46 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, F64 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, M153 ist durch einen Threonin-Rest ersetzt, V163 ist durch einen Alanin-Rest ersetzt, und S175 ist durch einen Glycin-Rest ersetzt.
Zu den Beispielen für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung gehört das fluoreszierende Protein mit der Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins von Aequorea victoria oder des davon abgeleiteten gelb fluoreszierenden Proteins mit einer der folgenden Sequenzen:

(a) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder
(b) eine Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition einer bis mehrerer Aminosäure(n) in der mit SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend dem natürlich vorkommenden Protein wie folgt definiert sind: F46 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, F64 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, M153 ist durch einen Threonin-Rest ersetzt, V163 ist durch einen Alanin-Rest ersetzt, und S175 ist durch einen Glycin-Rest ersetzt; und wobei das fluoreszierende Protein eine Fluoreszenz-Charakteristik aufweist, die gleichwertig oder besser ist als die des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, wobei der Begriff "Fluoreszenz-Charakteristik, die gleichwertig oder besser ist" hierin so verwendet wird, dass er die Bedeutung hat, dass das Protein eine äquivalente oder höhere Fluoreszenz-Intensität, eine äquivalente Wellenlänge, eine äquivalente oder höhere Reifungsgeschwindigkeit und Reifungseffizienz und eine äquivalente oder geringere Empfindlichkeit gegenüber H⁺ und Cl^– aufweist.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine DNA bereitgestellt, die für das wie vorstehend erwähnte fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor bereitgestellt, der die wie vorstehend erwähnte DNA der vorliegenden Erfindung aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Transformante bereitgestellt, die die DNA oder den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung wie vorstehend erwähnt aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein fusioniertes fluoreszierendes Protein bereitgestellt, das aus dem wie vorstehend erwähnten fluoreszierenden Protein der vorliegenden Erfindung und einem weiteren Protein zusammengesetzt ist.
Vorzugsweise ist dieses weitere Protein ein Protein, das sich innerhalb einer Zelle befindet, z.B. ein Protein, das spezifisch für intrazelluläre Organellen ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro-Verfahren zum Analysieren des Orts oder der dynamischen Lage eines Proteins in einer Zelle bereitgestellt, wobei das wie vorstehend erwähnte fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung in der Zelle exprimiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro-Verfahren zur Analyse einer physiologisch wirksamen Substanz bereitgestellt, wobei das FRET-Verfahren (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) durchgeführt wird unter Verwendung des wie vorstehend erwähnten fluoreszierenden Proteins als Akzeptorprotein oder Donorprotein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Analyse des Orts intrazellulärer Komponenten und/oder zur Analyse einer physiologisch wirksamen aktiven Substanz bereitgestellt, umfassend das fluoreszierende Protein, die DNA, den rekombinanten Vektor, die Transformante oder das fusionierte Protein der vorliegenden Erfindung wie vorstehend erwähnt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt vergleichende Charakterisierungen der Fluoreszenzeigenschaften von YFP-Varianten. (A) zeigt Fluoreszenzemissionsspektren von ratiometrischen Pericams (rPericams), die in E. coli bei 37°C produziert wurden. (B) zeigt Fluoreszenzemissionsspektren der YFP-Varianten EYFP, EYFP-F46L, SEYFP, SEYFP-F46L (Venus), die in E. coli bei 37°C produziert wurden. (C) und (D) zeigen den zeitlichen Verlauf der Wiederherstellung der Fluoreszenz der vier YFP-Varianten aus ihrem denaturierten (C) und denaturierten/reduzierten (D) Zustand. Die pH-Empfindlichkeit (E) und Chlorid-Empfindlichkeit (F) der Fluoreszenz von EYFP (aufrechtes Dreieck), EYFP-F46L (Karo), SEYFP (umgedrehtes Dreieck) und SEYFP-F46L (= Venus) (Kreis) sind gezeigt.
2 zeigt Fluoreszenz-Mikroaufnahmen von PC12-Zellen, die NPY-Venus (A und B) und NPY-EGFP (C-F) exprimieren. Mikroskopische Aufnahme mit kleiner Vergrößerung zeigen, dass alle diejenigen fluoreszierenden Zellen, die NPY-Venus exprimieren, eine helle Fluoreszenz in Neuriten erzeugen (A), während die Fluoreszenz von NPY-EGFP im Zytosol oder in der perinukleären Region in einigen Zellen (C, angedeutet durch die Pfeile) nachgewiesen wurde. Es sind mikroskopische Aufnahmen hoher Vergrößerung von Zellen mit korrekt gerichtetem NPY-Venus (B) und NPY-EGFP (D) und mit fehlerhaft gerichtetem NPY-EGFP (E und F) gezeigt. Bei typischen Zellen, die korrektes Targeting von NPY-Fusionsproteinen aufweisen, wurden die grünen Fluoreszenzsignale (G und J) und die roten Immunfluoreszenzsignale (H und K) von NPY-Venus bzw. NPY-EGFP nachgewiesen. Ihre Verhältnisbilder von grün zu rot sind in Falschfarben für NPY-Venus (I) und NPY-EGFP (L) gezeigt. Maßstabsbalken: 10 μm.
3 zeigt die Beobachtung von Exozytose-Ereignissen. (A) zeigt die Intensitäten der Fluoreszenz von NPY-Venus oder NPY-EGFP, die aus kultivierten PC-12 Zellen (ausgefüllte Balken) und Medium (offene Balken) mit oder ohne Depolarisationsstimulierung (K⁺ hoch) gewonnen wurden. (B) zeigt die Ca²⁺-Abhängigkeit der durch Depolarisationsstimulierung induzierten NPY-Venus-Sekretion. (C) zeigt den zeitlichen Verlauf der Anreicherung von NPY-Venus im Medium mit und ohne Depolarisationsstimulierung. (D-F) zeigen die Sekretion eines einzelnen dichtkernigen Granulums (angedeutet durch den Pfeil in D), sichtbar gemacht mit NPY-Venus. Die Bilder wurden alle 100 ms nacheinander aufgenommen. Maßstabsbalken: 10 μm.
4 zeigt das Verhalten von YC3.12, das gelbe Cameleon, das Venus enthält. (A) zeigt die Fluoreszenzemissionsspektren von Bakterienproben, die bei 37°C YC3.12 und YC3.1 produzieren. (B) und (C) zeigen die Entwicklung der Fluoreszenz von Venus (B) und EYFP-V68L/Q69K (C), den Akzeptoren von YC3.12 bzw. YC3.1. Diese Bilder wurden 5 Stunden nach Zugabe der Transfektionsreagenzien mit einem Anregungsfilter 490DFDF10 und einem Emissionsfilter 535DF25 aufgenommen. Maßstabsbalken: 10 μm. (D) und (E) zeigen die fünfstündige Messung der Zytosol-Konzentration an freiem Ca²⁺ in HeLa-Zellen, die YC3.12 (D) und YC3.1 (E) exprimieren. Die Emissionsverhältnisse von 535 zu 480 nm wurden alle 5 Sekunden genommen. Die Ordinate auf der rechten Seite gibt R_max (Pfeil) und R_min (Pfeilspitze) an.
Art der Durchführung der Erfindung
Die Ausführungsformen und Methoden zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind nachstehend ausführlich beschrieben.
(1) Fluoreszierendes Protein der vorliegenden Erfindung
Das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der Phenylalanin-Rest Nr. 46 in der Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins, des gelb fluoreszierenden Proteins oder Mutanten derselben durch einen Leucin-Rest ersetzt ist, wobei das Protein die Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins von Aequorea victoria, des daraus abgeleiteten gelb fluoreszierenden Proteins oder deren Mutanten mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition von einer bis zwanzig Aminosäuren aufweist, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend dem natürlich vorkommenden Protein wie folgt definiert sind: F46 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, F64 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, M153 ist durch einen Threonin-Rest ersetzt, V163 ist durch einen Alanin-Rest ersetzt, und S175 ist durch einen Glycin-Rest ersetzt.
Der hierin verwendete Begriff "grün fluoreszierendes Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP) oder Mutanten derselben" ist so aufzufassen, dass alle bekannten grün fluoreszierenden Proteine und gelb fluoreszierenden Proteine sowie alle Mutanten derselben eingeschlossen sind. So wurde zum Beispiel das Gen des grün fluoreszierenden Proteins isoliert und auch seine Sequenz wurde bestimmt (Prasher, D.C. et al. (1992), "Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein", Gene 111, 229–233). Es gibt auch zahlreiche Berichte über die Aminosäuresequenzen anderer fluoreszierender Proteine oder deren Mutanten, zum Beispiel wie beschrieben bei Roger Y. Tsin, Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509–44; und in der darin zitierten Literatur.
Das grün fluoreszierende Protein (GFP), das gelb fluoreszierende Protein (YFP) oder die Mutanten derselben schließen jene ein, die aus Quallen wie etwa Aequorea victoria stammen.
Beispiele für GFP, YFP und Mutanten derselben sind nachstehend erwähnt. Die Angabe F99S zeigt, dass F am 99. Aminosäurerest durch S ersetzt ist. Weitere Aminosäure-Substitutionen sind mit Hilfe des gleichen Benennungsverfahrens gezeigt.
Wildtyp-GFP;
GFP mit den Aminosäure-Mutationen F99S, M153T und V163A;
GFP mit der Aminosäure-Mutation S65T;
GFP mit den Aminosäure-Mutationen F64L und S65T;
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65T, S72A, N149K, M153T und I167T;
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S202F und T203I;
GFP mit den Aminosäure-Mutationen T203I, S72A und Y145F;
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65G, S72A und T203F (YFP);
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65G, S72A und T203H (YFP);
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65G, V68L, S72A und T203Y (EYFP-V68L);
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65G, V68L, Q69K, S72A und T203Y (EYFP-V68L, Q69K);
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65G, S72A und T203Y (EYFP); und
GFP mit den Aminosäure-Mutationen S65G, S72A, K79R und T203Y (YFP).
Ein Beispiel für die Aminosäuresequenzen des verbesserten grün fluoreszierenden Proteins, bei dem es sich um eine Mutante des grün fluoreszierenden Proteins handelt, ist in SEQ ID NO: 2 des Sequenzprotokolls der vorliegenden Beschreibung gezeigt, und ein Beispiel für die Aminosäuresequenzen des verbesserten gelb fluoreszierenden Proteins, bei dem es sich um eine Mutante des gelb fluoreszierenden Proteins handelt, ist in SEQ ID NO: 3 des Sequenzprotokolls der vorliegenden Beschreibung gezeigt.
Da Val zwischen die erste Aminosäure und die zweite Aminosäure in den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO. 2 und 3 inseriert ist, entspricht der Phenylalanin-Rest (Phe) Nr. 46 im natürlich vorkommenden fluoreszierenden Protein dem Rest 47 in SEQ ID NO. 2 und 3.
Zu den Beispielen für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung zählen Proteine mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO. 2 oder 3, in denen der Phenylalanin-Rest (Phe) durch einen Leucin-Rest ersetzt ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist neben der Ersetzung des Phenylalanin-Rests 46 durch einen Leucin-Rest in der Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins, des gelb fluoreszierenden Proteins oder Mutanten derselben der Phenylalanin-Rest 64 durch einen Leucin-Rest ersetzt, der Methionin-Rest 153 ist durch einen Threonin-Rest ersetzt, der Valin-Rest 163 ist durch einen Alanin-Rest ersetzt, und der Serin-Rest 175 ist durch einen Glycin-Rest ersetzt.
Wie vorstehend beschrieben, entsprechen die Aminosäurereste 64, 153, 163 bzw. 175 den Aminosäureresten 65, 154, 164 und 176 in SEQ ID NO. 2 und 3.
Zu den Beispielen für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung zählt das fluoreszierende Protein mit der Aminosäuresequenz des grün fluores zierenden Proteins von Aequorea victoria oder des davon abgeleiteten gelb fluoreszierenden Proteins mit einer der folgenden Sequenzen:

(a) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder
(b) eine Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition einer bis mehrerer Aminosäure(n) in der mit SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend dem natürlich vorkommenden Protein wie folgt definiert sind: F46 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, F64 ist durch einen Leucin-Rest ersetzt, M153 ist durch einen Threonin-Rest ersetzt, V163 ist durch einen Alanin-Rest ersetzt, und S175 ist durch einen Glycin-Rest ersetzt; und wobei das fluoreszierende Protein eine Fluoreszenz-Charakteristik aufweist, die gleichwertig oder besser ist als die des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, wobei der Ausdruck "Fluoreszenz-Charakteristik, die gleichwertig oder besser ist" hierin so verwendet wird, dass er die Bedeutung hat, dass das Protein eine äquivalente oder höhere Fluoreszenz-Intensität, eine äquivalente Wellenlänge, eine äquivalente oder höhere Reifungsgeschwindigkeit und Reifungseffizienz und eine äquivalente oder geringere Empfindlichkeit gegenüber H⁺ und Cl^– aufweist.

Bei dem in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Ausdruck "Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition einer bis mehrerer Aminosäuren" unterliegt der Bereich "einer bis mehrerer" keinen speziellen Einschränkungen, ist aber zum Beispiel 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10, mehrbevorzugt 1 bis 7, besonders bevorzugt 1 bis 5, und ganz besonders bevorzugt 1 bis 3.
Der Ausdruck "Fluoreszenz-Charakteristik, die gleichwertig oder besser ist" wird hierin verwendet, um zu verstehen zu geben, dass das Protein eine äquivalente oder höhere Fluoreszenz-Intensität, eine äquivalente Wellenlänge, eine äquivalente oder höhere Reifungsgeschwindigkeit und Reifungseffizienz und eine äquivalente oder geringere Empfindlichkeit gegenüber H⁺ und Cl^– aufweist.
Das Verfahren zum Erhalten des fluoreszierenden Proteins der vorliegenden Erfindung unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Es kann irgendein chemisch synthetisiertes Protein oder ein rekombinantes Protein verwendet werden, das mit Hilfe einer Genrekombinationstechnik hergestellt wird.
Wird ein rekombinantes Protein hergestellt, so muss die DNA erhalten werden, die für das Protein codiert. Durch Nutzen der Informationen der in SEQ ID NO. 1 bis 3 gezeigten Aminosäuresequenzen und der in SEQ ID NO. 4 und 5 gezeigten Nucleotidsequenzen (die Beispiele für die Nucleotidsequenzen sind, die für die Aminosäuresequenzen SEQ ID. NO. 2 und 3 codieren) des Sequenzprotokolls hierin, können geeignete Primer entworfen werden, und durch Verwendung derselben zur Durchführung einer PCR unter Verwendung eines cDNA-Klons der wie vorstehend beschriebenen verschiedenen bekannten fluoreszierenden Proteine als Matrize, kann eine DNA hergestellt werden, die für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Wurde ein Teilfragment der für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung codierenden DNA mit Hilfe der oben genannten PCR erhalten, so kann eine für das gewünschte fluoreszierende Protein codierende DNA durch Ligieren dieser DNA-Fragmente in der richtigen Reihenfolge mit Hilfe einer Genrekombinationstechnik erhalten werden. Ein fluoreszierendes Protein der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Einführen dieser DNA in ein geeignetes Expressionssystem. Die Expression in diesem Expressionssystem soll weiter unten in der vorliegenden Beschreibung beschrieben werden.
(2) DNA der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung macht ein Gen verfügbar, das für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Beispiele für DNAs, die für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung codieren, umfassen irgendeine der folgenden DNAs.

(a) eine DNA, die für die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert;
(b) eine DNA, die für eine Aminosäuresequenz codiert, die eine Deletion, Substitution und/oder Addition einer bis mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz und eine Fluoreszenz-Charakteristik aufweist, die gleichwertig oder besser ist als die des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1.

Die DNA der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel mit Hilfe des Phosphoramidit-Verfahrens oder dergleichen synthetisiert werden und kann mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt werden. Das Verfahren zur Herstellung der DNA der vorliegenden Beschreibung oder von Fragmenten derselben ist wie vorstehend beschrieben.
Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zum Einführen einer gewünschten Mutation in eine bestimmte Nucleotidsequenz bekannt. Zum Beispiel kann eine DNA mit einer Mutation konstruiert werden durch Anwendung einer bekannten Technik wie etwa ortspezifische Mutagenese, PCR unter Verwendung eines entarteten Oligonucleotids, Einwirkenlassen eines mutagenen Mittels oder von Strahlung oder dergleichen auf eine Zelle, die eine Nucleinsäure enthält. Diese bekannten Techniken sind zum Beispiel beschrieben in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; und Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1–38, John Wiley & Sons (1987–1997).
(3) Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann nach Insertion in einen geeigneten Vektor verwendet werden. Die Art des bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Vektors unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Zum Beispiel kann der Vektor ein solcher Vektor sein, der sich autonom repliziert (zum Beispiel ein Plasmid), oder ein Vektor, der bei der Einführung in die Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und zusammen mit dem Chromosom repliziert wird.
Vorzugsweise ist der bei der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor ein Expressionsvektor. In einem Expressionsvektor sind die für die Transkription notwendigen Elemente (zum Beispiel ein Promotor und dergleichen) wirksam mit der DNA der vorliegenden Erfindung verknüpft. Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die Transkriptionsaktivität in einer Wirtszelle zeigt, und der Promotor kann in geeigneter Weise gemäß der Art des Wirts ausgewählt werden.
Beispiele für Promotoren, die in Bakterienzellen wirksam sind, umfassen den Promotor des Gens der maltogenen Amylase aus Bacillus stearothermophilus, des α-Amylase-Gens aus Bazillus licheniformis, des BAN-Amylase-Gens aus Bazillus amyloliquefaciens, des Gens der alkalischen Protease aus Bazillus subtilis oder des Xylosidase-Gens aus Bazillus pumilus, den P_R oder P_L-Promotor des Lambda-Phagen, einen lac-, trp-, oder tac-Promotor aus Escherichia coli und dergleichen.
Beispiele für Promotoren, die in Säugerzellen wirksam sind, umfassen den SV40-Promotor, MT-1-Promotor (Metallothionein-Gen), den starken späten Promotor von Adenovirus 2 und dergleichen. Beispiele für Promotoren, die in Insektenzellen wirksam sind, umfassen Polyhedrin-Promotor, P10-Promotor, Basic Protein Promotor von Autographa californica Nuclear Polyhedrosis, Promotor des immediate-early-Gen 1 von Baculovirus, Promotor des 39K delayed-early-Gens von Baculovirus und dergleichen. Zu den Beispielen für Promotoren, die in Hefe-Wirtszellen wirksam sind, zählt ein aus den Hefe-Glycolysesystem-Genen stammender Promotor, der Promotor des Alkoholdehydrogenase-Gens, TPI1-Promotor, ADH2-4c-Promotor und dergleichen.
Beispiele für Promotoren, die in mykotischen Zellen wirksam sind, umfassen den ADH3-Promotor, tpiA-Promotor und dergleichen.
Zudem kann die DNA der vorliegenden Erfindung, falls nötig, wirksam mit einem geeigneten Terminator verknüpft sein, etwa einem Terminator des menschlichen Wachstumshormons oder TPI1-Terminator oder ADH3-Terminator für einen Pilzwirt. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch ein Element wie etwa ein Polyadenylierungssignal aufweisen (zum Beispiel eines, das von SV40 oder der Adenovirus 5E1b-Region abgeleitet ist), eine Transkriptionsenhancer-Sequenz (zum Beispiel SV40-Enhancer) oder eine Translationsenhancer-Sequenz (zum Beispiel eine, die für Adenovirus VA-RNA codiert).
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch mit einer DNA-Sequenz versehen werden, die es ermöglicht, dass der Vektor in der Wirtszelle repliziert wird, und ein Beispiel dafür ist ein SV40-Replikationsstartpunkt (wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist).
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch einen selektierbaren Marker enthalten. Zu den Beispielen für selektierbare Marker zählen Gene, deren Komplement in der Wirtszelle nicht vorhanden ist, etwa Dihydrofolatreductase (DHFR) oder das Schizosaccharomyces pombe TPI-Gen, oder Gene für Resistenz gegen Arzneimittel wie Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Neomycin und Hygromycin.
Verfahren zum Verbinden der DNA der vorliegenden Erfindung, des Promotors und, je nach Belieben, eines Terminators und/oder einer Sekretionssignalsequenz und Inserieren dieser in einen geeigneten Vektor sind dem Fachmann bekannt.
(4) Transformante der vorliegenden Erfindung
Eine Transformante lässt sich herstellen durch Einführen der DNA oder des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung in einen geeigneten Wirt.
Eine Wirtszelle, in die die DNA oder der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung eingeführt wird, kann irgendeine Zelle sein, die das DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung exprimieren kann, und Beispiele umfassen Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryontische Zellen.
Zu den Beispielen für Bakterienzellen gehören Gram-positive Bakterien wie Bacillus und Streptomyces und Gram-negative Bakterien wie etwa Escherichia coli. Die Transformation dieser Bakterien kann mit Hilfe der Protoplast-Methode oder einer bekannten Methode unter Verwendung kompetenter Zellen durchgeführt werden.
Zu den Beispielen für Säugerzellen gehören HEK293-Zellen, HeLa-Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, CHL-Zellen und CHO-Zellen. Verfahren zur Transformation einer Säugerzelle und zum Exprimieren der in die Zelle eingebrachten DNA-Sequenz sind bekannt. Zum Beispiel können Verfahren wie Elektroporation, die Phosphat-Calcium-Methode oder Lipofektion angewandt werden.
Beispiele für Hefezellen umfassen die zu Saccharomyces oder Schizosaccharomyces gehörenden Zellen, und zu den Beispielen für diese zählen Saccharomyces cerevisae und Saccharomyces kluyveri. Beispiele für Methoden zum Einführen eines rekombinanten Vektors in einen Hefewirt umfassen die Elektroporation, die Sphäroplast-Methode und das Lithiumacetat-Verfahren.
Andere Beispiele für Pilzzellen sind Fadenbakterien, zum Beispiel Aspergillus, Neurospora und Fusarium sowie die zu Trichoderma gehörenden Zellen. Wird ein Fadenbakterium als Wirtszelle verwendet, so kann die Transformation durchgeführt durch Integrieren des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom und Erhalten einer rekombinanten Wirtszelle. Die Integration des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden, etwa homologe Rekombination oder heterologe Rekombination.
Wird eine Insektenzelle als Wirt verwendet, so kann ein Protein exprimiert werden durch Cotransfektion eines rekombinanten Gentransduktionsvektors und eines Baculovirus in die Insektenzelle, um ein rekombinantes Virus im Insektenzellkulturüberstand zu erhalten, und anschließende Infektion des rekombinanten Virus in die Insektenzelle (beispielsweise wie beschrieben in Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual; und Current Protocols in Molecular Biology, Bio/Technology, 6, 47 (1988); und dergleichen).
Als Baculovirus kann zum Beispiel Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus, welches ein Virus ist, das Insekten der Mamestra-Familie infiziert, und dergleichen verwendet werden.
Als Insektenzellen können zum Beispiel Sf9 und Sf21, welche Eizellen von Spodoptera frugiperda [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, (1992)] sind, und Hi Five, welches Eizellen von Trichoplusia ni (Invitrogen) sind, oder dergleichen verwendet werden.
Zu den Beispielen für Verfahren zum Cotransfizieren eines rekombinanten Gentransduktionsvektors und des vorstehend beschriebenen Baculovirus in eine Insektenzelle zur Erzeugung eines rekombinanten Virus gehören die Phosphat-Calcium-Methode oder die Lipofektion.
Die vorstehend beschriebene Transformante wird in einem geeigneten Nährkulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des eingebrachten DNA-Konstrukts ermöglichen. Zur Isolierung und Reinigung des fluoreszierenden Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung aus der Kultur der Transformante kann ein herkömmliches Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Proteins eingesetzt werden.
Für den Fall zum Beispiel, dass ein Protein der vorliegenden Erfindung in solubilisierter Form innerhalb der Zellen exprimiert wurde, werden die Zellen nach be endetem Kultivieren durch Zentrifugieren gewonnen und in einem wasserbasierten Puffer suspendiert, und anschließend wird durch Aufbrechen der Zellen mit Hilfe eines Ultraschall-Homogenisators oder dergleichen ein zellfreier Extrakt erhalten. Aus dem Überstand, der durch Zentrifugieren des zellfreien Extrakts erhalten wird, kann unter Anwendung eines herkömmlichen Verfahrens zur Isolierung und Reinigung eines Proteins eine gereinigte Probe erhalten werden. Beispiele für herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines Proteins umfassen die Anwendung von Techniken, entweder alleine oder in Kombination, wie z.B. Lösungsmittelextraktion, Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, Entsalzen, Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Harzes wie etwa Diethylaminoethyl(DEAE)-Sepharose, Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Harzes wie etwa S-Sepharose (Pharmacia), hydrophobe Chromatographie unter Verwendung eines Harzes wie etwa Butyl-Sepharose oder Phenyl-Sepharose, Gelfiltration unter Verwendung eines Molekularsiebs, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung, elektrophoretische Verfahren wie z.B. isoelektrische Fokussierung und dergleichen.
(5) Fluoreszierendes Fusionsprotein, umfassend das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung, und dessen Verwendung
Ein fluoreszierendes Fusionsprotein lässt sich konstruieren durch Verschmelzen des fluoreszierenden Proteins der vorliegenden Erfindung mit einem anderen Protein. Die Art dieses mit dem fluoreszierenden Protein der vorliegenden Erfindung zu verschmelzenden "anderen Proteins" unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Ein Beispiel dafür ist ein Protein, das sich innerhalb der Zelle befindet, insbesondere ein Protein, das für intrazelluläre Organellen spezifisch ist.
Das Verfahren zur Herstellung des fluoreszierenden Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Es kann ir gendein chemisch synthetisiertes Protein oder ein rekombinantes Protein verwendet werden, das mit Hilfe einer Genrekombinationstechnik hergestellt wird.
Wird ein rekombinantes Protein hergestellt, so muss die DNA erhalten werden, die für das Protein codiert. Durch Nutzen der Informationen der in SEQ ID NO. 1 bis 3 gezeigten Aminosäuresequenzen und der in SEQ ID NO. 4 und 5 gezeigten Nucleotidsequenzen des Sequenzprotokolls hierin, können geeignete Primer entworfen werden, und durch Verwendung derselben zur Durchführung einer PCR unter Verwendung eines cDNA-Klons der wie vorstehend beschriebenen verschiedenen bekannten fluoreszierenden Proteine als Matrize, können DNA-Fragmente hergestellt werden, die zum Aufbau der DNA erforderlich sind, die für das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung codiert. In der gleichen Weise kann auch ein DNA-Fragment erhalten werden, das für ein zu verschmelzendes Protein codiert.
Die für das gewünschte fluoreszierende Fusionsprotein codierende DNA kann dann durch Ligieren dieser DNA-Fragmente in der richtigen Reihenfolge mit Hilfe einer Genrekombinationstechnik erhalten werden. Ein fluoreszierendes Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Einführen dieser DNA in ein geeignetes Expressionssystem.
Durch Exprimieren des durch Verschmelzen des fluoreszierenden Proteins der vorliegenden Erfindung mit einem wie vorstehend erwähnten anderen Protein (als "Protein X" bezeichnet) erhaltenen fluoreszierenden Fusionsproteins in Zellen und Verfolgen der emittierten Fluoreszenz kann der Ort und die dynamische Lage des Proteins X in der Zelle analysiert werden. Durch Beobachten einer Zelle, die mit DNA transformiert oder transfiziert wurde, welche für das fluoreszierende Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codiert, mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops kann der Ort und die dynamische Lage von Protein X in der Zelle sichtbar gemacht und analysiert werden.
Durch Verwendung eines Proteins als Protein X, das für intrazelluläre Organellen spezifisch ist, kann beispielsweise die Verteilung und Bewegung von Kern, Mitochondrien, endoplasmischem Retikulum, sekretorischen Vesikeln, Peroxisomen und dergleichen beobachtet werden.
Da Axonen und dendritische Axonen von Nervenzellen sehr komplizierte Änderungen der Bewegungsrichtung bei sich entwickelnden Individuen aufweisen, können zudem dynamische Analysen durch Fluoreszenzmarkierung solcher Stellen durchgeführt werden.
Die Art des Mikroskops kann je nach Verwendungszweck in geeigneter Weise ausgewählt werden. Sind häufige Beobachtungen zur Verfolgung des zeitlichen Verlaufs der Veränderungen erforderlich, so wird ein herkömmliches Auflichtfluoreszenzmikroskop bevorzugt. Soll die Auflösung erhöht werden, wie in dem Fall, wenn der genaue intrazelluläre Ort verfolgt werden soll, so wird ein konfokales Laser-Mikroskop bevorzugt. Im Hinblick auf die Aufrechterhaltung des physiologischen Zustands der Zelle und zur Verhinderung von Verunreinigungen ist ein umgekehrtes Mikroskop als Mikroskopsystem bevorzugt. Bei Verwendung eines aufrecht stehenden Mikroskops kann eine Immersionslinse verwendet werden, wenn eine starke Linse benutzt wird.
Das Filter kann je nach Fluoreszenz-Wellenlänge des fluoreszierenden Proteins in geeigneter Weise ausgewählt werden. Zur Beobachtung von GFP ist die Verwendung eines Filters mit Anregungslicht von etwa 470 bis 490 nm und Fluoreszenzlicht von etwa 500 bis 520 nm bevorzugt. Für die Beobachtung von YFP ist die Verwendung eines Filters mit Anregungslicht von etwa 480 bis 500 nm und Fluoreszenzlicht von etwa 510 bis 550 nm bevorzugt.
Wird eine Beobachtung des zeitlichen Verlaufs an lebenden Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops durchgeführt, so sollten die Zellen zudem innerhalb einer kurzen Zeitspanne photographiert werden, und daher wird eine hochempfindliche Kamera mit gekühltem CCD-Element verwendet. Durch Verwendung einer Kamera mit gekühltem CCD-Element kann das thermische Rauschen durch Kühlen des CCD-Elements verringert werden, und es können Bilder einer schwachen Fluoreszenz mit kurzer Belichtung klar photographiert werden.
(6) FRET-Verfahren (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) mit dem fluoreszierenden Protein der vorliegenden Erfindung
Das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung kann für Analysen unter Anwendung des FRET-Verfahrens (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) verwendet werden.
Ist beispielsweise das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung eine Mutante des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), so wird das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung als Akzeptormolekül verwendet und das cyan fluoreszierende Protein (CFP) wird als Donormolekül verwendet, um so einen FRET (Fluoreszenzresonanzenergietransfer) zwischen diesen herbeizuführen und die Wechselwirkung zwischen den Proteinen sichtbar zu machen. Zum Beispiel kann eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen, hervorgerufen durch eine Erhöhung der Ca²⁺-Konzentration (zum Beispiel Bindung eines Calciumbindenden Proteins wie etwa Calmodulin und dessen Targetpeptid wie z.B. M13), durch einen FRET von CFP auf YFP sichtbar gemacht werden.
Zu den Beispielen für Calcium-bindende Proteine gehören Calmodulin, Troponin C, Calcineurin B, Myosin-Leichtkette, Recoverin, S-Modulin, Visinin, VILIP, Neurocalcin, Hippocalcin, Frequenin, Caltractin, die große Untereinheit von Calpain, S100-Proteine, Parvalbumin, Calbindin D_9K, Calbindin D_28K und Calretinin.
Die Aminosäuresequenz eines Targetpeptids eines Calcium-bindenden Proteins kann von einem Fachmann in geeigneter Weise ausgewählt werden. Ist zum Beispiel das Calcium-bindende Protein Calmodulin, so kann die Aminosäuresequenz einer Calmodulin-bindenden Domäne, von der bekannt ist, dass sie in verschiedenen Proteinen und Peptiden vorhanden ist, die als Target-Substanzen für Calmodulin bekannt sind, an der N-terminalen Seite eines fluoreszierenden Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Gegenwärtig sind mehr als 1200 Arten von Aminosäuresequenzen der Calmodulin-bindenden Domäne bekannt, und diese können in einer Datenbank zur Calmodulin-bindenden Domäne gesucht werden (http://calcium.oci.utoronto.a/ctdb).
Wie vorstehend erwähnt, kann das fluoreszierende Protein der vorliegenden Erfindung zur Messung der intrazellulären Calcium-Ionenkonzentration oder zum Verfolgen der Calcium-Ionenverteilung verwendet werden.
(7) Kit der vorliegenden Erfindung
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Kit zum Analysieren des Orts intrazellulärer Komponenten und/oder zum Analysieren einer physiologisch wirksamen Substanz bereitgestellt, umfassend wenigstens eines derjenigen, die ausgewählt sind aus dem fluoreszierenden Protein, dem fluoreszierenden Fusionsprotein, der DNA, dem rekombinanten Vektor oder der Transformante wie hierin erwähnt. Das Kit der vorliegenden Erfindung kann mit Hilfe bekannter Materialien und Techniken hergestellt werden, die üblicherweise in der Fachwelt verwendet werde.
Das Reagens, etwa das fluoreszierende Protein und die DNA, kann in einer Form hergestellt werden, die zur Konservierung durch Lösen in einem geeigneten Lösungsmittel geeignet ist. Zu den Beispielen für geeignete Lösungsmittel gehören Wasser, Ethanol, verschiedene Pufferlösungen und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert, jedoch wird die vorliegende Erfindung durch diese Beispiele nicht eingeschränkt.
Beispiel
(1) Experimentelle Verfahren
Zufallsbestimmte Mutagenese bei Pericam
Mit Hilfe des fehlerauslösenden PCR-Verfahrens wurden zufällige Mutationen in das Gen für das zirkulär permutierte YFP eingeführt (H148D/V163A/S175G/Y203F) (Nagai, T. et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3197–3202). Die PCR-Produkte wurden mit PstI und KpnI verdaut und in pRSET_B (Invitrogen) subkloniert, das Gene für M13 und Calmodulin an der BamHI/PstI-Stelle bzw. der KpnI/EcoRI-Stelle trug. Die Fluoreszenz der bei 37°C auf einer Platte gezogenen Bakterienkolonie wurde mit dem von uns hergestellten Fluoreszenz-Bildanalysensystems analysiert (Sawano, A. et al. (2000), Nucleic Acids Research 28, e78).
Gen-Konstruktion
Die Oligonucleotid-gerichteten Mutagenesen wurden unter Anwendung der neuen Vorschrift durchgeführt, über die wir bereits für die Mutationen F46L und F64L/M153T/V163A/S175G berichtet hatten (Sawano, A. et al. (2000). Nucleic Acids Research 28, e78). Unter Verwendung der cDNA von EYFP in pRSET_B (pRSET_B/EYFP) als Ausgangsmaterial wurden pRSET_B/SEYFP, pRSET_B/EYFP-F46L und pRSET_B/SEYFP-F46L (= pRSET_B/Venus) erzeugt. Das EGFP-Gen in pEGFP-N1-NPY (freundlicherweise von Dr. W. Almers zur Verfügung gestellt) wurde durch das Venus-Gen ersetzt, um pVenus-N1-NPY zu ergeben, welches für das chimäre NPY-Venus-Protein codiert. EYFP-V68L/Q69K im Gen für das gelbe Cameleon 3.1 (YC3.1) wurde durch Venus ersetzt, um das YC3.12-Gen zu erzeugen, das anschließend für die bakterielle und Säuger-Expression in pRSET_B bzw. pCS2 subkloniert wurde.
Messung der Fluoreszenz von Proteinen in E. coli
Bakterien-Proben [JM109 (DE3)] wurden bei 37°C in 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB gezogen, geerntet und in PBS auf eine End-OD₆₀₀ von 0,5 resuspendiert. Die Fluoreszenzspektren wurden aufgenommen durch Anregung bei 485 nm für Varianten von ratiometrischem Pericam und YFP-Varianten und bei 435 nm für Cameleon-Varianten.
Proteinexpression, in vitro-Spektroskopie sowie pH- und Chlorid-Titrationen
Die Proteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und spektroskopisch charakterisiert wie früher beschrieben (Miyawaki, A. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135–2140). Die Quantenausbeute der YFP-Mutanten wurde durch Vergleich mit der von Fluorescein (0,91) bestimmt. Zur Berechnung der molaren Extinktionskoeffizienten wurden die Protein-Konzentrationen mit einem Bradford-Kit (BioRad) und mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die pH-Titrationen wurden durchgeführt wie beschrieben (Nagai T. et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3197–3202), außer dass alle Puffer 35 mM Cl^– enthielten und die Ionenstärke mit Kalium-D-gluconat auf 150 mM eingestellt wurde. Die Chlorid-Titration erfolgte bei pH 7,0. Die Proteine wurden in 10 mM MOPS (pH 7,0) gelöst, das Cl^– spezifisch im Bereich von 0 bis 400 mM enthielt, und die Ionenstärke wurde mit Kalium-D-gluconat auf 400 mM eingestellt.
Umfaltung und Rückoxidation der YFP-Varianten in vitro
Die Experimente zur Wiederherstellung der Fluoreszenz wurden durchgeführt wie beschrieben (Reid, B.G. et al. (1997), Biochemistry 36, 6786–6791). Denaturierte YFPs wurden hergestellt durch fünfminütiges Inkubieren der Proteine in einem Denaturierungspuffer (8 M Harnstoff und 1 mM DTT) bei 95°C. Zur Herstellung der denaturierten/reduzierten YFPs wurde 5 mM Dithionit zum Denaturierungspuffer gegeben. Die Wiederherstellung der Fluoreszenz wurde eingelei tet nach 100-facher Verdünnung in einem Renaturierungspuffer (35 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM DTT) bei 37°C. Die Emission bei 530 nm wurde durch Anregung bei 515 nm verfolgt.
Expression von NPY-Fusionsproteinen in PC12 Zellen
PC12-Zellen (RIKEN Cell Bank) wurden in Wachstumsmedium (DMEM, 10% fetales Kälberserum, 10% Pferdeserum, 100 E/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) bei 37°C in 5% CO₂ gehalten. Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen auf Deckgläser aufgebracht. Für die Aufnahmen wurden die Deckgläser mit Polyethylenimin beschichtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Lipofect Amine 2000 (Gibco BRL) mit pVenus-N1-NPY oder pEGFP-N1-NPY transfiziert. Dann wurden die Zellen zur Differenzierung belassen, und durch Beigabe von Nervenwachstumsfaktor (100 ng/ml menschliche rekombinante NGF-β-Kette, Calbiochem) zum Medium wurde Neurit-Entwicklung ermöglicht.
Immunhistochemie
Die transfizierten PC12-Zellen wurden 15 min lang mit 4% Paraformaldehyd in PBS(-) fixiert. Die Immunfärbung auf Venus und EGFP wurde durchgeführt unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen GFP (MBL, Japan) und Alexa568-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG, verdünnt in 0,1 % Triton X-100 enthaltendem PBS. Die angefärbten Zellen wurden unter Verwendung von 470DF35 (Anregung) und HQ525/50 (Emission) auf die grüne Fluoreszenz von Venus und EGFP sowie 550DF30 (Anregung) und 590DF35 (Emission) auf die rote Fluoreszenz von Alexa568 hin beobachtet.
Verfolgen der Sekretion von NPY-Fusionsproteinen
Die transfizierten PC12-Zellen wurden in physiologischer Salzlösung (145 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,2 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 5,6 mM Glucose, 15 mM HEPES, pH 7,4) bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Depolarisationsstimulierung wurde eingeleitet durch Ersetzen mit vorgewärmter Hoch-K⁺-Lösung (95 mM NaCl, 56 mM KCl, 2,2 mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂, 5,6 mM Glucose, 15 mM HEPES, pH 7,4). Die Fluoreszenzintensitäten der extrazellulären Lösung und der Zell-Lysate wurden zu vorgegebenen Zeitpunkten gemessen.
Aufnahmen einzelner dichtkerniger Granula von PC12-Zellen
Ein umgekehrtes Mikroskop (IX-70, Olympus) wurde für die Anregung mit evaneszenten Wellen modifiziert wie beschrieben (Steyer, J.A. et al. (2001), Nature Reviews Mol. Cell Biol. 2, 268–275). Das Mikroskop war ausgestattet mit einer lichtstarken Linse (UplanApo 60X NA1.45, Olympus), einem dichroitischen Spiegel (505DRLP, Omega) und einer Lichtquelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) (U-DP, Olympus). Ein Laser (Argon, Omnichrome) und die Lichtquelle wurden mit einer Einmodenfaser verbunden, um das 488 nm-Laserlicht in das Mikroskop zu führen. Das Laserlicht wird in die Ausgangspupille der Objektivlinse projiziert. Die Bilder wurden unter Verwendung einer Kamera mit gekühltem 12 Bit-CCD-Element (MikroMax 1300Y/HS, Roper Scientific), gesteuert von der Software MetaMorph/MetaFluor 4.0 (Universal Imaging), durch ein Emissionsfilter (HQ525/50, Omega) erfasst. Die Geschwindigkeit der Bilderfassung war entweder 30 Teilbilder/s (2 × 2 Binning) oder 10 Teilbilder/s (1 × 1 Binning).
Ca²⁺-Abbildung in HeLa-Zellen mit gelben Cameleons
HeLa-Zellen wurden unter Verwendung von Superfect (Qiagen) mit pCS2-YC3.1 oder pCS2-YC3.12 transfiziert und abgebildet wie beschrieben (Miyawaki, A. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135–2140).
(2) Ergebnisse und Diskussion
F46L: eine neuartige Mutation, die die Reifung von bei 37°C erzeugten YFPs verbessert
Bei der zufallsbestimmten Mutagenese mit Pericams (zirkulär permutierte GFPs, gentechnisch so hergestellt, dass sie Ca²⁺ registrieren) (Nagai, T. et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3197–3202) fanden wir etliche Mutationen, die die Reifung verbessern, ohne die Ca²⁺-Empfindlichkeit zu beeinflussen. Von besonderem Interesse war die Mutation von Phe-46 zu Leu, die die Bildung des Chromophors bei 37°C stark verbesserte. Bei den drei Pericam-Typen wurde gefunden, dass inverses Pericam und ratiometrisches Pericam, die dieses F46L tragen, weitaus wirksamere Reifung bei 37°C aufweisen, wobei ihre hohe Ca²⁺-Empfindlichkeit beibehalten wird. 1A zeigt die bemerkenswerte Wirkung von F46L auf die Fluoreszenzentwicklung von ratiometrischem Pericam, das in E. coli bei 37°C produziert wurde, während zwei andere Mutationen, V163A und S175G, bei denen erkannt wurde, dass sie die Faltungseffizienz erhöhen, keine Wirkung hatten. Die Ca²⁺-Empfindlichkeit von Flash-Pericam verschlechterte sich mit dieser Mutation. Daher wurde Flash-Pericam ohne F46L-Mutation hergestellt und wird besser bei 28–30°C erzeugt.
Da Pericams aus einer YFP-Variante (EYFP-V68LQ69K) gentechnisch hergestellt werden (Miyawaki, A. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135–2140), um Ca²⁺-Empfindlichkeit zu haben, waren wir neugierig, ob F46L die Reifungseffizienz auch bei YFP erhöhen könnte. Die Wirkung von F46L wurde bei der mit Vorliebe verwendeten YFP-Variante EYFP (S65G/S72A/T203Y) untersucht. In der Kristallstruktur einer YFP-Variante (S65G/S72A/V68L/T203Y) (Wachter, R.M. et al. (1999), Structure 6, 1267–1277) liegt der Benzolring von Phe-46 neben dem Imidazolinon, einem Teil des Chromophors. Es scheint, dass F46L Einfluss auf die Chromophor-Bildung von YFP hat. Die Wirkung der bekannten Faltungsmutation F64L/M153T/V163A/T203Y auf EYFP wurde neben der von F46L ebenfalls untersucht, da in keinem Bericht der Versuch unternommen wurde, diese Mutationen in YFP-Varianten einzuführen, obwohl bereits unterstellt wurde, dass sie die Faltungseffizienz in anderen GFP-Varianten erhöhen könnten. Durch Anwenden einer Vorschrift für eine Mutagenese an mehreren Stellen (Sawano, A. et al (2000), Nucleic Acids Research 28, e78) wurden die vier üblichen Faltungsmutationen alle auf einmal in EYFP eingeführt, um SEYFP (Super-EYFP; EYFP-F64L/M153T/V163A/S175G) zu erzeugen. Dann wurden EYFP-F46L und SEYFP-F46L durch Einführen von F46L in EYFP bzw. in SEYFP erhalten. Zunächst wurden diese vier YFP-Varianten in E. coli bei Raumtemperatur erzeugt, so dass sie zur Reinigung voll reiften. Die gereinigten YFP-Varianten zeigten exakt die gleichen Anregungs- und Emissionsspektren und nahezu gleiche ε und Φ im Bereich von 78.700 bis 101.000 M^–1 cm^–1 bzw. 0,56 bis 0,61 (Tabelle 1).
Als nächsten kultivierten wir E. coli-Klone, die die vier YFPs bei 37°C produzieren, und verglichen die Fluoreszenzintensitäten der Zellsuspensionen (1B). Durch F46L wird die Reifung von YFP bei 37°C in hohem Maße erleichtert. Zwar zeigt 1B die relativen Fluoreszenzintensitäten zu einem Zeitpunkt in einer logarithmischen Phase, doch führt F46L zu einer etwa 20-fachen Erhöhung der Fluoreszenz des Zellpellets nach 12-stündiger Inkubation.
Venus: Die beste Reifungsversion von YFP bei 37°C
Die Faltungseffizienz wurde bei 37°C bewertet, indem die Annahme von Fluoreszenz nach Renaturierung von Harnstoff-denaturiertem Protein mit einem reifen Chromophor verfolgt wurde (Reid, B.G. et al. (1997), Biochemistry 36, 6786–6791). Wenn sich das Protein zurückfaltet, wird der gereifte Chromophor im Innern der Betatonne von GFP begraben, so dass die Fluoreszenz wiederhergestellt wird (1C). Die Ausbeute an wiederhergestellter Fluoreszenz war bei EYFP weniger als 30%, wie beurteilt anhand der Intensität der Fluoreszenz vor der Denaturierung, was darauf hindeutet, dass sich ziemlich viel unlösliche Aggregate durch den Denaturierungsvorgang gebildet haben. Wie bereits früher berichtet (Reid, B.G. et al. (1997) Biochemistry 36, 6786–6791), erfolgte die Renaturierung aller YFP-Varianten durch zwei verschiedene kinetische Phasen. Die Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung für die Anfangsphase war unter den YFP-Varianten unterschiedlich (Tabelle 1). Sowohl SEYFP als auch SEYFP-F46L, die die Mutationen F64L/M153T/V163A/S175G enthalten, ergaben sehr schnelle Wiederherstellung mit Geschwindigkeitskonstanten (K_Falts) von 6,6010^–2 s^–1 bzw. 5,6210^–2 s^–1. Auch wenn F46L alleine die Geschwindigkeit und Ausbeute der Wiederherstellung von EYFP und SEYFP erhöhte, war ihre Wirkung weniger stark als die der üblichen Faltungsmutationen. Es wurde der Schluss gezogen, dass die Mutationen F64L/M153T/V163A/S175G deutlich wirksamer beim Erleichtern der Faltung von YFP bei 37°C waren.
Dann wurden die Chromophore der Harnstoff-denaturierten YFPs mit 5 mM Dithionit reduziert (Reid, B.G. et al. (1997), Biochemistry 36, 6786–6791). Renaturierung und Reoxidation wurden bei 37°C durch Verdünnen in Puffer eingeleitet, der weder Harnstoff noch Dithionit enthielt. Da die Oxidation der langsamste Schritt ist, sollte die beobachtete Gesamtgeschwindigkeit der Wiederherstellung der Fluoreszenz die Geschwindigkeit der Oxidation des cyclisierten Chromophors darstellen. Die Geschwindigkeitskonstanten der Anfangsphasen (K_Oxs) wurden verglichen (1D). Während SEYFP und SEYFP-F46L ähnliche K_Falts ergaben, waren Geschwindigkeit und Ausbeute der Renaturierung aus denaturiertem/reduziertem Protein bei 37°C durch F46L deutlich verbessert (1D; K_Ox-Werte in Tabelle 1: 2,3610^–3 s^–1 gegenüber 8,0410^–3 s^–1). Interessanterweise war diese Verbesserung nicht klar zu beobachten, wenn die Experimente bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Auch zeigte EYFP-F46L bei 37°C schnellere Reoxidation als SEYFP (1D).
Unlängst wurde über ein neues YFP namens Citrine berichtet, bei dem die Mutation Q69M einige vorteilhafte Eigenschaften bewirkt, woraus die verbesserte Reifungsgeschwindigkeit herrührt.
Daher wurde die Reifungseffizienz von Citrine mit Hilfe des Renaturierungs- und Reoxidationsassays bewertet. Zwar faltet sich Citrine schnell und mit der gleichen Geschwindigkeit wie Venus (K_Falt-Werte in Tabelle 1: 6,3910^–2 s^–1), doch wurde die Oxidationsgeschwindigkeit nicht verbessert (K_Oxs-Werte in Tabelle 1: 2,4210^–3 s^–1).
Die Geschwindigkeit der Annahme von Fluoreszenz von YFP, das aus Einschlusskörpern renaturiert wurde, könnte Informationen zur Kinetik einer de novo-Reifung liefern, einschließlich des Schritts der Cyclisierung eines inneren Tripeptids (Reid, B.G. et al. (1997), Biochemistry 36, 6786–6791). Allerdings wurden SEYFP und SEYFP-F46L aus den unlöslichen Pellets nach der Zell-Lyse kaum isoliert. Obwohl die Wirkung von F46L auf die Cyclisierung nicht untersucht wurde, zeigen die obigen Ergebnisse, dass F46L den Oxidationsschritt beschleunigt und zu einer Verbesserung der Fluoreszenz-Entwicklung von YFP bei 37°C führt. Vermutlich fördert die Seitenkette von Leu-46 nicht nur den Sauerstoff-Zugang, sondern auch die Faltung des sich neu bildenden Proteins zu einem entscheidenden, aber nicht identifizierten Konformationszustand, der für die Oxidationsreaktion günstig ist. Dieses Argument steht in Einklang mit der Tatsache, dass F46L alleine die Umfaltung des Harnstoff-denaturierten Proteins er leichtert (1C). Diesbezüglich sollte in Betracht gezogen werden, dass Faltung und Chromophor-Bildung im Zusammenwirken erfolgen.
SEYFP-F46L faltet sich und bildet den Chromophor bei 37°C sehr effizient und ergibt das hellste gelbliche Licht. Diese neue Variante wird hierin als "Venus" bezeichnet.
Geringere Empfindlichkeit von Venus gegenüber Protonen und Chlorid-Ionen
Protonierung und Cl^–-Bindung des Chomophors von YFP erfolgen definitiv im Zusammenwirken (Wachter, R.M., et al. (2000), J. Mol. Biol. 301, 157–171). So wurde die Empfindlichkeit der 4 YFP-Varianten gegenüber H⁺ und Cl^– untersucht. Für die pH-Titration wurden Puffer verwendet, die 35 mM [Cl^–] (Konzentration von Cl^–) enthielten. Die pH-Titrationskurven sind in 1E gezeigt. Der pKa von EYFP war 6,9, was darauf hindeutet, dass die quantitative Messung seiner Fluoreszenz in lebenden Zellen von Artefakten in Zusammenhang mit dem pH beeinträchtigt werden könnte. Durch Hinzufügen der Mutation F46L ändert sich die pH-Empfindlichkeit von EYFP nicht. Andererseits ergaben SEYFP und Venus Titrationskurven mit einem pKa von 6,0. Es wurde daher der Schluss gezogen, dass einige Mutationen von F64L/M153T/V163A/S175G die pH-Empfindlichkeit von YFP verringern.
1F zeigt die Abhängigkeit der Fluoreszenz der YFPs mit steigender [Cl^–] bei pH 7,0. EYFP und EYFP-F46L waren gegenüber Cl^– empfindlich, mit Kd-Werten von 110 mM bzw. 145 mM. Dagegen waren SEYFP und Venus weniger empfindlich gegenüber diesem Anion. Innerhalb des Bereichs einer physiologischen [Cl^–] (unter 150 mM) bei pH 7,0 wurde ihre Fluoreszenz nicht beeinträchtigt. Somit war die Einführung der Mutationen F64L/M153T/V163A/S175G wirksam zur Beseitigung der Cl^–-Empfindlichkeit. Von diesen Mutationen scheint V163A kritisch zu sein, da die Seitenkette von Val163 erwiesenermaßen an der Auskleidung des Anion-bindenden Hohlraums einer Variante von YFP beteiligt ist (Wachter, R.M. et al. (2000), J. Mol. Biol. 301, 157–171).
Durch Absenkung des pH wird die Extinktion von YFP bei 511 nm geringer. Auch Cl^– verringerte die Extinktion von YFP ohne Φ zu beeinflussen; es gibt keinen Beleg für eine Kollisionslöschung der YFP-Fluoreszenz durch Cl^– (Wachter, R.M. et al. (2000), J. Mol. Biol. 301, 157–171). YFP wurde häufig als Akzeptor für FRET in Kombination mit CFP als Donor verwendet (Tsien, R.Y. et al. (1998), Science 280, 1954–1955). Da die Extinktion eines Akzeptors einer der kritischen Faktoren ist, die die FRET-Effizienz bestimmen, sollten pH- und Cl^–-Empfindlichkeit von YFP minimiert werden, um zuverlässige FRET-Signale zu erhalten (Miyawaki, A. und Tsien, R.Y. (2000), Methods Enzymol. 327, 472–500). Ganz abgesehen von der Reifungseffizienz, sollte Venus als FRET-Akzeptor geeigneter sein als EYFP.
Insgesamt ist Venus heller als EYFP, das üblichste YFP, und zwar durch die von zwei Arten von Mutationen ausgeübte Wirkung: i) verbesserte Reifung des Chromophors bei 37°C durch die Mutation F46L, und ii) verbesserte Faltung bei 37°C und geringere Löschung durch H⁺ und Cl^– durch einen Satz Mutationen F64L/M153T/V163A/S175G.
Fluoreszenzmarkierung sekretorischer dichtkerniger Granula in PC12-Zellen mit Venus
Sekretorische Organellen haben eine saure Umgebung und meist eine dichtkernige Proteinmatrix. So ist die Fluoreszenzmarkierung von Organellen mit GFP relativ schwierig. Zwar wurden GFP-Mutanten mit verbesserten optischen und Reifungseigenschaften, etwa EGFP (Enhanced GFP, Clontech) erfolgreich auf dichtkernige sekretorische Granula von PC12-Zellen (Lang, T. et al. (1997), Neuron 18, 857–863) und große dichtkernige sekretorische Vesikel von INS-1-β-Zellen gerichtet (Tsuboi, T. et al. (2000), Curr. Biol. 10, 1307–1310), doch wurde eine unzureichende örtliche Übereinstimmung der Fluoreszenz des GFP mit einigen spezifischen Markern für die Organellen festgestellt, was auf fehlerhaftes Targeting des rekombinanten fluoreszierenden Proteins und ausbleibende Fluoreszenz des Proteins in den Organellen hinweist.
In diesem Beispiel konstruierten wir ein Säuger-Expressionsplasmid, das für ein an das C-terminale Ende von Neuropeptid Y (NPY) fusioniertes Venus codiert, um NPY-Venus zu ergeben. Die Leistung des chimären Proteins wurde im Hinblick auf die folgenden beiden Punkte im Vergleich zu der von NPY-EGFP untersucht: Der erste Punkt ist, wie spezifisch das NPY-Fusionsprotein auf sekretorische dichtkernige Granula gerichtet ist; der zweite Punkt ist, wie effizient das korrekt gerichtete NPY-Fusionsprotein fluoresziert.
Den transfizierten PC12-Zellen wurde die Differenzierung und die Ausbreitung von Neuriten durch Behandlung mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) ermöglicht. 2A zeigt eine mikroskopische Weitwinkel-Fluoreszenzaufnahme von 6 Zellen, die NPY-Venus exprimieren. Eine typische Aufnahme mit starker Vergrößerung ist in 2B gezeigt. Es wurde beobachtet, dass sich helle und punkförmige Fluoreszenz von NYP-Venus in den Neuriten konzentriert, die reich waren an dichtkernigen Granula, was auf ein korrektes Targeting von NPY-Venus hindeutet. Man beachte, dass nahezu alle fluoreszierenden, NPY-Venus exprimierenden Zellen auf dem Deckglas ähnliche Fluoreszenzmuster zeigten. Im Gegensatz dazu zeigten die NPY-EGFP exprimierenden PC12-Zellen drei unterschiedliche Muster. Etwa 60% der fluoreszierenden Zellen hatten helle Neuriten (2C, mittlere Zelle), und das punkförmige Fluoreszenzmuster wurde durch eine mikroskopische Aufnahme starker Vergrößerung bestätigt (2D). Die übrigen 40% der Zellen zeigten verwaschene Fluoreszenz über das gesamte Zytosol, mit hellen netzartigen Flecken (2C, angedeutet durch Pfeile; 2E), oder röhrenförmige Objekte (2F), was auf ein falsches Targeting von NPY-EGFP hinweist. Möglicherweise wurde die korrekte Verarbeitung des Neu ropeptids durch eine von der Regel abweichende Faltung des EGFP beeinträchtigt.
Zwar ergab das korrekt gerichtete NPY-EGFP eine nachweisbare Fluoreszenz, doch war die Intensität etwa 10-mal geringer als die von NPY-Venus; die Belichtungszeit für die Aufnahme der Bilder war 100 ms für 2B und 1,5 s für 2D. Die Helligkeit der NPY-Venus enthaltenden Granula war entweder auf die verbesserte Reifungsausbeute von Venus oder die Häufigkeit von NYP-Venus in den Granula zurückzuführen. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Menge der rekombinanten Proteine mit korrektem Targeting auf die dichtkernigen Granula immunhistochemisch quantifiziert. Die mit pVenus-N1-NPY und pEGFP-N1-NPY transfizierten PC12-Zellen wurden fixiert und einer Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper und einem Alexa562-konjugiertem sekundären Antikörper zugeführt. Die grünen Fluoreszenzsignale von Venus und EGFP wurden durch einen üblichen Filtersatz für die GFP-Beobachtung aufgefangen (2G bzw. 2J), und die rote Fluoreszenz von Alexa562 wurde durch einen weiteren Filtersatz detektiert (2H und 2K). Die Bilder in den 2G und 2J oder in den 2H und 2K wurden unter den gleichen optischen Bedingungen aufgenommen und sind mit den gleichen Graustufen wiedergegeben. Trotz ähnlicher Mengen an rekombinanten Proteinen (2H und 2K) war die Fluoreszenz von Venus klar sichtbar (2G), während die von EGFP kaum nachzuweisen war (2J). Die Fluoreszenz-Intensitäten pro Molekül rekombinantes Protein sind in Falschfarbenbildern gezeigt (2I und 2L), die durch Division der grünen Fluoreszenzsignale durch die Immunfluoreszenzsignale erhalten wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Venus in dichtkernigen Granula effizienter zur Fluoreszenz reifen kann als EGFP.
Effizientes Verfolgen und dynamisches Sichtbarmachen der Sekretion von NPY-Venus
NPY-Venus ermöglichte zwei Experimente zum Verständnis der Exozytose von dichtkernigen Granula von PC12-Zellen. Zum einen wurde die durch Depolarisation induzierte Sekretion von NPY-Venus durch Messen der Zunahme der Fluoreszenz des Mediums sowie des Verlusts der zellulären Fluoreszenz verfolgt (3A), da NPY-Venus eine spezifische und starke Markierung der dichtkernigen Granula einer großen Population kultivierter PC12-Zellen ergab. Ein solcher Populationsassay war bei Verwendung von Proinsulin-GFP kaum möglich, wie bereits früher berichtet (Angleson, J.K. et al. (1997), Trends Neurosci. 20, 281–187). Im Gegensatz zu herkömmlichen biochemischen oder elektrophysiologischen Ansätzen (Angleson, J.K. et al. (1997), Trends Neurosci. 20, 281–187) ermöglicht die Messung der Fluoreszenz von sezerniertem NPY-Venus im Medium eine einfache, schnelle und effiziente Verfolgung der Exozytose von PC12-Zellen. Dreißig Minuten nach der Depolarisierung erreichte die Menge des sezernierten NPY-Venus etwa 40% der Gesamtmenge, und diese Sekretion wurde verhindert, wenn sowohl extra- als auch intrazelluläres Ca²⁺ mit EGTA und BAPTA-AM cheliert wurde (3B). Auch der zeitliche Verlauf der Sekretion war leicht zu erhalten, wobei sich zeigte, dass 50% der Sekretion innerhalb der ersten 5 Minuten erfolgten (3C).
Zum anderen wurde die Dynamik von kleinen einzelnen fluoreszierenden dichtkernigen Granula in NGF-behandelten PC12-Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung unter Anwendung der Mikroskopie mit evaneszenten Wellen beobachtet. Eine ähnliche Fluoreszenzbildgebung mit einem Feld evaneszenter Wellen wurde mit einer GFP-Mutante (GFPmut2) durchgeführt, die an menschliches Chromogranin B fusioniert war (Lang, T. et al. (1997), Neuron 18, 857–863). Allerdings wurden große Granula (~0,5 μm Durchmesser) bei 0,5 Hz in PC12-Zellen beobachtet, die niemals differenzierten. Bei diesem Beispiel dagegen wurden die Granula differenzieren lassen, so dass sie zu dichtkernigen Granula mit geringerer Größe wurden (0,2 μm Durchmesser). Aufgrund der hellen Markierung mit NPY-Venus konnten wir solch kleine Granula mit einer herkömmlichen Kamera mit gekühltem CCD-Element bei 10 Hz ohne Binning oder bei Video-Geschwindigkeit (30 Hz) mit Binning 2 sehen. Die 3D–F sind aufeinanderfolgende Bilder, die ein einzelnes, durch Depolarisierung induziertes Exozytose-Ereignis zeigen. Nach dem Andocken an die Plasmamembran ergoss sich die in einem dichtkernigen Granulum befindliche Fluoreszenz von NPY-Venus (angedeutet durch einen Pfeil in 3D) in das Medium (3E) und verschwand anschließend (3F).
Unmittelbarer Nachweis von FRET-Signalen zwischen CFP und Venus
Für FRET unter Verwendung von GFPs ist es bevorzugt, dass ein Akzeptor-GFP effizienter reift als ein Donor-GFP. Ansonsten würde ein Überschuss an Donormolekülen zu einer Verdünnung der FRET-Signale durch Emission aus den Donoren führen, die nicht am FRET teilnehmen. Das gelbe Cameleon (YC) ist ein Ca²⁺-Indikatorprotein, bestehend aus einem CFP, Calmodulin, einem Glycylglycin-Linker, der Calmodulin-bindenden Domäne der Myosin-Leichtkettenkinase (M13) und YFP (Miyawaki, A. et al. (1997), Nature 388, 882–887). Zwar ist die Stöchiometrie von Donoren und Akzeptoren auf genetischer Ebene 1:1, doch reift EYFP-V68L/Q69K, der Akzeptor von YC3.1, bei 37°C oder in bestimmten Organellen schlecht (Miyawaki, A. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135–2140). Um das Signal von YC in allen Situationen effizient zu erhalten, haben wir durch Ersetzen von EYFP-V68L/Q69K durch Venus in YC3.1 das YC3.12 geschaffen. Bakterien-Proben, die YC3.12 und YC3.1 produzieren, wurden bei 37°C gezogen, und ihre Emissionsspektren mit Anregung bei 435 nm wurden verglichen (4A). Das Emissionsspektrum des hergestellten YC3.12 war gleich dem des gelben Cameleon, das voll reift, was darauf hinweist, dass das YC3.12-Protein in der Lage ist, als Ca²⁺-Indikator zu fungieren. Dagegen hatte YC3.1 kein reifes EYFP-V68L/Q69K bei 37°C. Die effiziente Reifung von Venus in YC3.12 wurde auch in HeLa-Zellen verifiziert und mit der von EYFP- V68L/Q69K in YC3.1 verglichen (4B und 4C). Fünf Stunden nach Einleitung der Gentransfektion fluoreszierte Venus stark. Wir interessierten uns dann dafür, wie bald das Ca²⁺-Signal von YC3.12 nachgewiesen werden konnte. Nach nur 2,5-stündigem Inkubieren der HeLa-Zellen mit cDNA und Superfect-Reagens (Qiagen) konnten wir ein durch Histamin ausgelöstes vorübergehendes Ca²⁺-Signal mit einem großen dynamischen Bereich beobachten (4D), was mit dem normalen Verhalten des gelben Cameleon gut übereinstimmt (Miyawaki, A. et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135–2140). Dagegen gab YC3.1 unter den gleichen Bedingungen nur schwache Signale (4E). Die Verwendung von YC3.12 befreit uns vom Zeitdruck und ermöglicht schnellen Nachweis von Ca²⁺-Signalen beispielsweise aus frischen neuronalen Zellen in frischen Schnitten von Maus- oder Rattenhirn nach ballistischem teilchenvermittelten Gentransfer.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß vorliegender Erfindung werden neuartige GFP- oder YFP-Mutanten mit ausgezeichneter Reifungseffizienz und geringerer Empfindlichkeit sowohl gegenüber H⁺ als auch Cl^– bereitgestellt. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz des Grünfluoreszierenden Proteins (green fluorescent protein) aus Aequorea victoria, des daraus abgeleiteten Gelb-fluoreszierenden Proteins (yellow fluorescent protein) oder deren Mutanten, die eine Deletion, Substitution und/oder Addition von einer bis zwanzig Aminosäuren aufweisen, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend des natürlich vorkommenden Proteins wie folgt definiert werden: F46 ist mit einem Leucinrest ersetzt, F64 ist mit einem Leucinrest ersetzt, M153 ist mit einem Threoninrest ersetzt, V163 ist mit einem Alaninrest ersetzt, und S175 ist mit einem Glycinrest ersetzt.
Ein fluoreszierendes Protein mit der Aminosäuresequenz des Grünfluoreszierenden Proteins (green fluorescent protein) aus Aequorea victoria, des davon abgeleiteten Gelb-fluoreszierenden Proteins (yellow fluorescent protein), mit einer der folgenden Sequenzen: (a) eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:1 gezeigt, oder (b) eine Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution und/oder Addition von einer bis mehrerer Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, wobei die folgenden Aminosäurepositionen entsprechend des natürlich vorkommenden Proteins wie folgt definiert werden: F46 ist mit einem Leucinrest ersetzt, F64 ist mit einem Leucinrest ersetzt, M153 ist mit einem Threoninrest ersetzt, V163 ist mit einem Alaninrest ersetzt, und S175 ist mit einem Glycinrest ersetzt; und wobei das fluoreszierende Protein eine Fluoreszenz-Charakteristik aufweist, die äquivalent ist zu oder höher ist als die des Proteins mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, wobei die Bezeichnung "Fluoreszenz-Charakteristik, die äquivalent ist zu oder höher ist als" hier so verwendet wird, dass sie die Bedeutung hat, dass das Protein eine äquivalente oder höhere Fluoreszenz-Intensität, eine äquivalente Wellenlänge, eine äquivalente oder höhere Reifungsgeschwindigkeit und Reifungseffizienz, und eine äquivalente oder geringere Sensitivität gegenüber H⁺ and Cl^– aufweist.
Eine DNA, die das fluoreszierende Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert.
Ein rekombinanter Vektor enthaltend die DNA gemäß Anspruch 3.
Eine Transformante enthaltend die DNA gemäß Anspruch 3 oder enthaltend den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 4.
Ein fusioniertes fluoreszierendes Protein welches aus dem fluoreszierenden Protein gemäß irgend einem der Ansprüche 1 oder 2 und einem anderen Protein zusammengesetzt ist.
Das fusionierte fluoreszierende Protein gemäß Anspruch 6, wobei das besagte andere Protein ein Protein ist, das innerhalb der Zelle lokalisiert ist.
Das fusionierte fluoreszierende Protein gemäß Anspruch 6, wobei das besagte andere Protein ein Protein ist, das spezifisch aus intrazellulären Organellen stammt.
Ein in-vitro Verfahren zur Analyse der örtlichen Zuordnung oder der dynamischen Situation eines Proteins in einer Zelle, wobei das fusionierte fluoreszierende Protein gemäß Anspruch 6 in der Zelle exprimiert wird.
Ein in-vitro Verfahren zur Analyse einer physiologisch aktiven Substanz, wobei die FRET-Methode (fluorescence resonance energy transfer) durchgeführt wird unter Verwendung des fluoreszierenden Proteins gemäß Anspruch 1 als Akzeptorprotein oder als Donorprotein.
Ein Kit zur Analyse der örtlichen Zuordnung von intrazellulären Komponenten und/oder zur Analyse einer physiologisch aktiven Substanz, umfassend das fluoreszierende Protein gemäß irgend einem der Ansprüche 1 oder 2, die DNA gemäß Anspruch 3, den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 4, den Transformanten gemäß Anspruch 5 oder das fusionierte Protein gemäß Anspruch 6.