DE60209634T2

DE60209634T2 - Substrat auf gelatinebasis zur herstellung von protein-biochips

Info

Publication number: DE60209634T2
Application number: DE2002609634
Authority: DE
Inventors: c/o Eastman Kodak Company Tiecheng Alex Rochester Qiao; c/o Eastman Kodak Company Krishnan Rochester Chari; c/o Eastman Kodak Company Thomas Lorne Rochester Penner; c/o Eastman Kodak Company Zhihao Rochester Yang
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Carestream Health Inc
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2022-11-19
Also published as: DE60209634D1; EP1316800B1; US20030138649A1; EP1316800A1; JP2003240781A; US6797393B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Protein-Mikroreihen, ganz allgemein insbesondere ein Verfahren, das ein Substrat auf Gelatinebasis verwendet, wobei die Gelatineoberfläche modifiziert ist, um die spezifische Bindung von biologischen Molekülen zu verbessern.
Die Vervollständigung des menschlichen Genom-Projektes hat das rasche Wachstum eines neuen interdisziplinären Gebietes der Proteomics beflügelt, das umfasst:
Die Identifizierung und Charakterisierung von vollständigen Sätzen von Proteinen, kodiert durch das Genom, die Synthese von Proteinen, nach-translationale Modifizierungen, wie auch detaillierte Kartografierungen von Protein-Wechselwirkungen bei zellularem Regulations-Niveau.
Obgleich die 2-dimensionale Gel-Elektrophorese in Kombination mit der Massen-Spektrometrie immer noch die dominierende Technologie beim 0Proteinstudium ist, hat die erfolgreiche Implantation und Anwendung der DNA-Mikroarray-Technologie auf die Gen-Profilierung und Gen-Entdeckung Wissenschaftler dazu veranlasst, eine Protein-Mikroreihen-Technologie zu entwickeln und eine Proteinanalyse auf Mikrochip-Basis auf dem Gebiet der Proteomics anzuwenden. Beispielsweise wird in der WO 00/04382 und in der WO 00/04389 ein Verfahren zur Herstellung von Protein-Mikroreihen (protein microarrays) beschrieben. Ein Schlüsselelement der Offenbarung ist ein Substrat, bestehend aus einem festen Träger, beschichtet mit einer Monoschicht aus einem dünnen organischen Film, auf dem ein Protein oder ein ein Protein einfangendes Mittel immobilisiert werden kann. Dünne Filme und Verfahren zur Herstellung derselben werden in der WO 98/08086 beschrieben. In der US-A-6 887 701 B2 wird eine Mikroreihe erzeugt durch Bündelung zahlreicher Hohlfasern, die mit einem Gelierungsmittel gefüllt sind und Molekülen von Interesse und Unterteilung der gebündelten Fasern in Scheiben (disks).
Eine Nitrocellulosemembran wurde weit verbreitet verwendet als ein Protein-Blottingsubstrat im Rahmen der Western-Blotting- und Enzym-gebundenen Immunosorbent-Analyse (ELISA). Im Falle der WO 01/40312 und der WO 01/40803 werden Antikörper auf eine Nitrocellulosemembran aufgetüpfelt unter Verwendung eines gerasterten Roboter-Gerätes. Es wurde gezeigt, dass derartige aufgetüpfelte Antikörper-Mikroreihen auf einem Nitrocellulose-Membransubstrat geeignet sind für die Analyse von Proteinmischungen in einer großen parallelen Weise. In der WO 98/29736 beschreiben L.G. Mendoza u.A. eine Antikörper-Mikroreihe mit Antikörpern, die auf einem N-Hydroxysuccinimidylester modifizierten Glassubstrat immobilisiert sind. In der US-A-5 981 734 und in der WO 95/04594 wird eine Hydrogelsubstrat-Technologie auf Polyacrylamidbasis für die Herstellung von DNA-Mikroreihen beschrieben. In jüngerer Zeit wurde in Anal. Biochem. (2000) 278, 123–131 gezeigt, dass die gleiche Hydrogel-Technologie geeignet ist als Substrat für die Immobilisierung von Proteinen bei der Herstellung von Protein-Mikroreihen.
In den oben zitierten Beispielen ist das gemeinsame Merkmal im Falle dieser unterschiedlichen Versuche das Erfordernis eines festen Trägers, der eine covalente oder nicht-covalente Bindung eines Proteins oder eines ein Protein einfangenden Mittels auf der Oberfläche des Trägers ermöglicht. Im Falle der DNA-Mikroreihen-Technologie ist eine Vielzahl von Oberflächen für die Abscheidung von vor-synthetisierten Oligos und PCR hergestellte cDNA-Sonden hergestellt worden. Ungleich der DNA jedoch neigen Proteine dazu, sich an die Oberflächen in einer nicht spezifischen Weise zu binden, wobei sie ihre biologische Aktivität einbüßen. Dies bedeutet, dass die Attribute für ein Protein-Mikroreihen-Substrat verschieden sind von jenen für ein DNA-Mikroreihen-Substrat derart, dass das Protein-Mikroreihen-Substrat nicht nur eine Oberflächen-Funktionalität liefern muss, die dazu befähigt ist, mit Protein einfangenden Mittel zu reagieren, sondern auch einer nicht-spezifischen Proteinbindung in Bereichen widerstehen muss, in denen keine Protein-einfangenden Mittel abgeschieden sind.
Es wurde gezeigt, dass Rinder-Serumalbumin (BSA) ein geeignetes Reagenz beim Blockieren von Proteinen von einer nicht-spezifischen Oberflächenbindung ist. Polyethylenglykol und Phospholipide wurden ebenfalls dazu verwendet, um Oberflächen zu passivieren und eine Oberflächen-Resistenz gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung zu erzeugen. Sämtliche dieser Methoden leiden jedoch an Nachteilen, entweder deshalb, weil die Oberflächenpräparation langwierig ist oder weil die Methode der Oberflächen-Modifizierung komplex und schwierig ist, weshalb die Methode keine ideale Lösung für eine industrielle Herstellung im großen Maßstab ist.
Infolgedessen besteht immer noch ein Bedürfnis zur Herstellung von kostengünstigen und leicht herzustellenden Materialien, die als Matrix auf einem festen Träger für die Bindung von Protein einfangenden Mitteln dienen. Die Praxis benötigt ein Substrat mit einer chemischen Funktionalität für die Immobilisierung von Protein einfangenden Mitteln, wobei ein solches Substrat keine Proteine an Bereiche auf der Gelatineoberfläche binden muss, die ohne immobilisierte Protein einfangende Mittel sind.
Die vorliegende Erfindung strebt danach, einige der Probleme zu lösen, die oben diskutiert wurden durch Bereitstellung von:
einem Substrat auf Gelatinebasis zur Herstellung von Protein-Reihen, wobei das Substrat umfasst: Gelatine, die praktisch resistent gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung ist sowie eine trifunktionelle Verbindung A-L-B, die an eine Oberfläche der Gelatine gebunden ist; worin A eine funktionelle, mit der Gelatine reagierende Gruppe ist; L eine verbindende Gruppe ist, die mit A und mit B reagiert und B eine funktionelle Gruppe ist, die mit einem ein Protein einfangenden Mittel reagiert, worin die funktionelle Gruppe ist Aldehyd, Epoxy, Hydrazid, Vinylsulfon, Succinimidylester, Carbodiimid, Maleimid, Dithio, Iodoacetyl, Isocyanat, Isothiocyanat, Aziridin, Carboxy, Amino, Chloromethyl, eine Affinitäts-Markierung, Streptavidin, Biotin, Glutathion-S-Transferase, Glutathion, eine Histidin-Markierung oder eine löslich machende Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Hydroxaminsäure-, Sulfonamid-, Hydroxygruppe oder entsprechenden Salzen hiervon, worin A die gleiche oder eine unterschiedliche Bedeutung von B haben kann.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Substrates auf Gelatinebasis für die Herstellung von Proteinreihen mit den Stufen der Bereitstellung eines Trägers; der Beschichtung des Trägers mit einer Zusammensetzung, die Gelatine enthält, die praktisch resistent gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung ist; und der Befestigung einer trifunktionellen Gruppe A-L-B an einer Oberfläche der Gelatine; worin A eine funktionelle, mit der Gelatine reagierende Gruppe ist; L eine verbindende Gruppe ist, die mit A und mit B reagiert; und worin B eine funktionelle Gruppe ist, die mit einem ein Protein einfangenden Mittel rea giert, worin die funktionelle Gruppe ist Aldehyd, Epoxy, Hydrazid, Vinylsulfon, Succinimidylester, Carbodiimid, Maleimid, Dithio, Iodoacetyl, Isocyanat, Isothiocyanat, Aziridin, Carboxy, Amino, Chloromethyl, eine Affinitäts-Markierung, Streptavidin, Biotin, Glutathion-S-Transferase, Glutathion, eine Histidin-Markierung oder eine löslich machende Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Hydroxaminsäure-, Sulfonamid- oder einer Hydroxygruppe oder entsprechenden Salzen hiervon, wobei A gleich B oder von B verschieden sein kann.
Die Erfindung ist besonders geeignet zur Herstellung von Protein-Mikroreihen. Die Erfindung stellt ein Gelatinesubstrat bereit, mit mindestens einer Oberfläche, an die bestimmte Funktionalitäten gebunden sind. Infolgedessen ist die Gelatineoberfläche, behandelt oder modifiziert, praktisch resistent gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung. Ferner reagieren die Funktionalitäten spezifisch mit Protein einfangenden Mitteln, mit denen sie in Kontakt gelangen. Infolgedessen ermöglicht das Substrat der Erfindung einen hohen Grad an spezifischer Bindung zwischen der modifizierten Gelatineoberfläche und Protein einfangenden Mitteln.
Gelatinesubstrate, die gemäß dieser Erfindung modifiziert wurden, erfordern eine sehr niedrige Konzentration an einer biologischen Probe bei der Herstellung von Protein-Mikroreihen im Vergleich mit unmodifizierten Gelatine-Substraten. Ferner können die Gelatine-Substrate der Erfindung leicht zu niedrigen Kosten hergestellt werden. Die Eignung des beanspruchten Substrates für eine Proteinbindung wird unten in den Beispielen veranschaulicht unter Anwendung verschiedener chemischer Modifizierungsmethoden und Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assays (ELISA).
Ganz allgemein kann eine Protein-Mikroreihe (protein microarray) dadurch hergestellt werden, dass zunächst ein fester Träger modifiziert wird, nämlich der Protein-Mikroreihenträger, worauf sich die Abscheidung von verschiedenen Protein einfangenden Mitteln auf dem modifizierten Substrat an vordefinierten Stellen anschließt. Träger der Wahl für die Protein-Mikroreihen-Anwendungen können organischer, anorganischer oder biologischer Natur sein. Zu einigen, in üblicher Weise verwendeten Trägermaterialien gehören Glas, plastische Materialien, Metalle und Halbleiter. Der Träger kann transparent oder opaque sein, flexibel oder starr. In einigen Fällen kann der Träger eine poröse Membran sein, zum Beispiel aus Nitrocellulose und Polyvinylidendifluorid und die Protein einfangenden Mittel werden auf der Membran durch physikalische Adsorption abgeschieden. Um jedoch die Robustheit zu verbessern und die Reproduzierbarkeit, ist es wünschenswerter, die Protein einfangenden Mittel auf dem Substrat durch eine chemische, co-valente Bindung zu immobilisieren.
Um Proteine einfangende Mittel auf einem festen Träger zu immobilisieren, muss der Träger durch bestimmte chemische, funktionelle Mittel modifiziert werden. Im Allgemeinen ist das chemisch funktionelle Mittel ein bi-funktionelles Molekül, das dargestellt werden kann durch A-L-B, worin A und B chemische Funktionalitäten sind, die dazu in der Lage sind, mit Gelatine und mit Protein einfangenden Mittelmolekülen zu reagieren oder auf diese einzuwirken, sodass diese auf dem Substrat immobilisiert werden, wobei sie gleich oder verschieden sein können und L stellt eine verbindende Gruppe dar. Vorzugsweise ist L ein Diradikal von einer solchen Menge, dass der kürzeste Bindungsweg zwischen den Enden, die A und B miteinander verbinden nicht größer als 10 Atome ist.
Es gibt zwei Klassen von bi-funktionellen Mitteln: 1) homofunktionelle Mittel, wenn A = B ist; und 2) heterofunktionelle Mittel, wenn A ≠ B ist. Zu einigen, üblicher Weise verwendeten Funktionalitäten A und B gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Aldehyd, Epoxy, Hydrazid, Vinylsulfon, Succinimidylester, Carbodiimid, Maleimid, Dithio, Iodoacetyl, Isocyanat, Isothiocyanat, Aziridin. Die verbindende Gruppe L umfasst jede geeignete Kombination von relativ nicht-labilen, co-valent gebundenen, chemischen Einheiten, die ausreichen, um die zwei Funktionalitäten A und B miteinander zu verbinden. Diese chemischen Einheiten können bestehen aus, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, einer einzelnen Bindung, einem Kohlenstoffatom, einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom, einer Carbonylgruppe
einer Carboxylestergruppe
einer Carboxylamidgruppe
einer Sulfonylgruppe
einer Sulfonamidgruppe
einer Ethylenoxygruppe, einer Polyethylenoxygruppe, einer Aminogruppe
worin die Substituenten X, Y und Z jeweils unabhängig voneinander stehen für ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1–10 Kohlenstoffatomen und einer linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Decyl, Benzyl, Methoxymethyl, Hydroxyethyl, Isobutyl und n-Butyl); einer substituierten oder unsubstituierten Arylgruppe mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen (wie Phenyl, Naphthyl, Anthryl, Tolyl, Xylyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Chlorophenyl, 4-Carbomethoxyphenyl und 4-Cyanophenyl); und einer substituierten oder unsubstituierten Cycloalkylgruppe mit 5 bis 14 Kohlenstoffatomen, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cyclooctyl); einer substituierten oder unsubstituierten, gesättigten oder ungesättigten, heterozyklischen Gruppe (wie Pyridyl, Pyrimidyl, Morpholino und Furanyl); einer Cyanogruppe. Einige löslich machende Gruppen können ebenfalls in A-L-B eingeführt werden und zu Beispielen von diesen löslich machenden Gruppen gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Hydroxaminsäure-, Sulfonamid- und Hydroxygruppen (und ihre entsprechenden Salze). A und B können ferner in Form von leicht reaktiven Funktionalitäten bezüglich Quervernetzern vorliegen, in welchem Falle zu Beispielen gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Carboxy, Amino und Chloromethyl usw.. A und B können Affinitäts-Kennzeichen sein (affinity tags), die dazu befähigt sind, nicht-co-valent mit Proteine einfangenden Mitteln zu reagieren, die dazu bestimmt sind, auf dem Substrat immobilisiert zu werden. Beispielsweise gehören zu einigen, in üblicher Weise verwendeten Kennzeichnungs- oder Tag-Systemen, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Streptavidin und Biotin, Histidin-Tags und Nickelmetallionen, Glutathion-S-Transferase und Glutathion. Ein Fachmann sollte dazu in der Lage sein, ein Protein einfangendes Fusionsmittel aufzufinden unter Verwendung der Rekombinations-DNA-Technologie und ein Element einer Kennzeichen-Erkennungs-Einheit kann in ein Protein einfangendes Mittel auf diese Weise eingeführt werden.
Ist ein Protein-Mikroreihensubstrat modifiziert worden, werden Protein einfangende Mittel auf dem Substrat angeordnet, um einen Protein-Mikroreihengehalt zu erzeugen. Proteine einfangende Mittel sind Moleküle, die mit Proteinen in hoher Affinität und hoher Spezifizität reagieren können. In typischer Weise ist es wünschenswert, dass eine Affinitäts-Bindungskonstante zwischen einem ein Protein einfangenden Mittel und einem Target-Protein von größer als 106 M–1 vorliegt. Es gibt verschiedene Klassen von Molekülen, die als Protein einfangende Mittel auf einer Protein-Mikroreihe (protein microarray) verwendet werden können. Antikörper sind eine Klasse von natürlich vorkommenden Proteinmolekülen, die dazu befähigt sind, Targets mit hoher Affinität und Spezifizität zu binden. Die Eigenschaften und Protokolle der Verwendung von Antikörpern können ermittelt werden in der Literaturstelle "Using Antibodies; A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, von Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor, NY 1999). Antigene können ebenfalls als Pro teine einfangende Mittel verwendet werden, wenn Antikörper beabsichtigte Targets für die Ermittlung sind. Proteingerüste, wie ganze Protein/Enzyme oder ihre Fragmente können ebenfalls als Protein einfangende Mittel verwendet werden. Zu Beispielen gehören Phosphotasen, Kinasen, Proteasen, Oxidasen, Hydrolyasen, Cytokine oder synthetische Peptide. Nukleinsäureliganden können als Protein einfangende Mittelmoleküle verwendet werden nach einer in vitro Auswahl und Anreicherung für ihre Bindungsaffinität und Spezifizität gegenüber bestimmten Targets. Das Prinzip für derartige Auswahlverfahren findet sich in Science, Band 249, 505–510, 1990 und in Nature, Band 346, 818–822, 1990. Die US-A-5 110 833 beschreibt eine alternative Klasse von synthetischen Molekülen, die eine Antikörper-Bindungsaffinität und Spezifizität nachahmen und sie lassen sich leicht herstellen nach dem sogenannten Molecular Imprinting Polymer (MIP). Diese Technologie wurde beschrieben in Chem. Rev. Band 100, 2495–2504, 2000.
In der Praxis wird eine Protein-Mikroreihe in Kontakt mit einer biologischen Flüssigkeitsprobe gebracht und Proteine in der Probe werden adsorbiert von sowohl Bereichen, die aufgetüpfelt wurden mit spezifischen Proteine einfangenden Mitteln und von Bereichen ohne Proteine einfangenden Mitteln. Da die Protein-Mikroreihe zur Messung von spezifischen Reaktionen zwischen Proteine einfangenden Mitteln auf dem Chip mit bestimmten Proteinen oder anderen Molekülen in der biologischen Flüssigkeitsprobe verwendet wird, führt die nicht-spezifische Bindung von Probenproteinen an nicht-aufgetüpfelten Bereichen zu einem hohen Hintergrundgeräusch oder Störpegel. Das Merkmal nicht-spezifische Bindung bezieht sich auf die Tendenz von Proteinmolekülen an der festen Oberfläche in einer nicht-selektiven Weise anzuhaften. Dieser hohe Störpegel, der sich aus der nicht-spezifischen Bindung ergibt, stört Reporter-Signale, die von dem aufgetüpfelten Bereich ermittelt werden sollen, wenn nicht die nicht-spezifische Bindung in einer geeigneten Weise blockiert wird. In typischer Weise wird die Protein-Mikroreihe in eine Lösung eingetaucht, die ein Blockierungsmittel enthält, um die nicht-spezifischen Bindungsstellen zu blockieren, bevor diese in Kontakt mit der beabsichtigten Analyt-Lösung gelangen. Eine üblicher Weise angewandte Methode zur Blockierung einer nicht-spezifischen Proteinblockierung besteht darin, die Oberfläche des Substrates mit einem großen Überschuss an Rinder-Serumalbumin zu behandeln. Der nicht-betüpfelte Oberflächenbereich kann ebenfalls chemisch modifiziert werden mit Polyethylenglykol (PEG), Phospholipid oder Polylysin, um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern.
Gelatine ist in der fotografischen Industrie als Bindemittel für verschiedene chemische Komponenten verwendet worden und das Verfahren zur Herstellung einer hoch-qualitativen Gelatine ist in der Industrie gut eingeführt. Da Gelatine aus biologischen Materialien hergestellt wird, ist sie biologisch verträglich mit Protein einfangenden Mittel auf der Protein-Mikroreihe. Die mit Gelatine beschichtete Oberfläche liefert eine biologisch gutartige Oberfläche für die Immobilisierung von Protein einfangenden Mitteln auf der Protein-Mikroreihe. Wie im Falle dieser Erfindung gezeigt wird, führt Gelatine zu einer Oberfläche, die den Störpegel wesentlich reduziert, der eine Folge einer nicht-spezifischen Bindung ist. Normalerweise wird Gelatine auf ein Substrat aufgetragen und eine Gelierung erfolgt durch einen Prozess, durch den Gelatinelösungen oder Suspensionen von Gelatine und anderen Materialien ein kontinuierliches, dreidimensionales Netzwerk bilden, das keinen stabilen Zustand aufweist. Dies kann auftreten in Polymeren durch Polymerisation in Gegenwart von polyfunktionellen Monomeren durch eine co-valente Quervernetzung eines gelösten Polymeren, das reaktive Seitenketten aufweist und durch sekundäre Bindung, beispielsweise Wasserstoffbindung, zwischen Polymermolekülen in Lösung. Polymere, wie Gelatine, zeigen eine thermische Gelierung, die vom letzteren Typ ist. Der Prozess der Gelierung oder des Absitzens ist gekennzeichnet durch eine diskontinuierliche Erhöhung der Viskosität. (vgl. P.I. Rose, "The Theory of the Photographic Process", 4. Auflage, T.H. James Herausgeber, Seiten 51 bis 67).
Das Gelatinesubstrat, das in dieser Erfindung beschrieben wird, kann entweder aufgetragen werden, wie es auf jedem festen Träger vorliegt oder mit einem Härtungsmittel oder einer Kombination vom mehreren Härtungsmitteln, die in die Gelatine eingemischt sind. Der Grad an Härtungsmittel sollte bei 0 bis 20 Gew.-% liegen und vorzugsweise bei 0,5 bis 8 Gew.-% der gesamten aufgetragenen Gelatine.
Es gibt zwei Typen von Gelatine: mit Säure vorbehandelte Gelatine und mit Alkali vorbehandelte Gelatine. Die bevorzugte Gelatine ist die alkalisch vorbehandelte Gelatine aus Rinderknochenmark, doch kann die Gelatine auch von anderen Quellen stammen. Zu Beispielen gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Schweinegelatine, Fischgelatine. Das bi-funktionelle Mittel A-L-B kann entweder während oder nach dem Auftragen der Gelatine auf einen festen Träger eingeführt werden.
Beschichtungsmethoden werden ausführlich beschrieben von Edward Cohen und Edgar B. Gutoff in Kapitel 1 von "Modern Coating And Drying Techology", (Interfacial Engineering Series, v.1) (1992), VCH Publishers Inc., New York, NY. Im Allgemeinen enthält eine flüssige Beschichtungszusammensetzung ein Bindemittel, ein Lösungsmittel zur Lösung oder zur Suspendierung der Komponenten und gegebenenfalls Additive, wie oberflächenaktive Mittel, Dispergiermittel, Plastifizierungsmittel, Biocide, Quervernetzungsmittel für die Zähigkeit und Unlöslichkeit und leitfähige Materialien zur Minimierung der statischen Aufladung. Sämtliche Komponenten werden vermischt und gelöst oder dispergiert und die Beschichtungsflüssigkeit wird einem Applikator zugeführt, wo sie auf ein Substrat aufgebracht wird unter Anwendung verschiedener Beschichtungstechniken. Dann wird der Beschichtung Wärme zugeführt, um das Lösungsmittel zu verdampfen und um den erwünschten Film zu produzieren oder die Beschichtung wird verfestigt durch Einwirkung von ultravioletter Strahlung oder durch Einwirkung eines Elektronenstrahls.
Die am meisten geeignete Beschichtungsmethode – einschließlich der Beschichtungsgeschwindigkeit – hängt von der Qualität und gewünschten Funktionalität ab und den verwendeten Materialien, zum Beispiel dem Substrat, dem Lösungsmittel, dem Gewicht und der Viskosität der Beschichtung, usw.. Für ein einschichtiges Format können zu geeigneten Beschichtungsmethoden gehören die Tauchbeschichtung, die Stabbeschichtung, die Beschichtungsmesser-Beschichtung, die Blade-Beschichtung, die Luftmesserbeschichtung, die Gravure-Beschichtung, die Vorwärts-Walzen- und Umkehr-Walzen-Beschichtung und die Schlitz- und Extrusionsbeschichtung.
Die Beschichtungsgeschwindigkeit kann ebenfalls ein wesentliches Merkmal bei der Auswahl der Beschichtungsmethode sein. Obgleich die meisten Methoden bei niedrigen Geschwindigkeiten angewandt werden können und sämtliche Methoden begrenzte, obere Geschwindigkeiten aufweisen, arbeiten einige Methoden besser bei hohen Geschwindigkeiten.
Die Vorhangbeschichtung erfordert eine Minimum-Strömungsgeschwindigkeit, um die Integrität des Vorhanges aufrecht zu erhalten. Infolgedessen ist dieses Verfahren beschränkt auf höhere Geschwindigkeiten, wenn eine dünne Beschichtung erhalten werden soll. Bei der Gleitflächen-Beschichtung von mehreren Schichten, ist es wahrscheinlicher, dass Grenzflächen-Instabilitäten auf dem Gleittrichter auftreten, wenn die Schichten sehr dünn sind. Höhere Geschwindigkeiten mit ihren höheren Strömungsgeschwindigkeiten und dickeren Schichten auf dem Gleittrichter tendieren zur Vermeidung dieser Instabilitäten. Verwiesen wird auf Seite 12, "Modern Coating And Drying Technology", supra.
Die Gelatine liegt in einer abgeschiedenen Menge von 0,2 bis 100 g/m², vorzugsweise 10 bis 50 g/m² vor.
Jede allgemein bekannte Beschichtungsmethode, wie eine Wulstbeschichtung oder Vorhangbeschichtung kann zur Herstellung des Gelatinesubstrates angewandt werden. Die Gelatine kann mit jedem anderen Beschichtungshilfsmittel aufgetragen werden, wie oberflächenaktiven Mitteln und Dickungsmitteln, um die physikalischen Eigenschaften einzustellen. Die im Rahmen der Erfindung verwendete Gelatine kann chemisch modifiziert werden entweder vor, während oder nach dem Beschichtungsprozess, um weitere chemische Funktionalitäten herbeizuführen, die reagieren können oder sich umsetzen können mit biologisch aktiven Molekülen oder Zusammensetzungen, die an dieses Substrat gebunden werden sollen.
Die Erfindung lässt sich besser veranschaulichen durch Bezugnahme auf die folgenden speziellen Ausführungsbeispiele.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer Gelatineschmelze und das Verfahren des Auftragens der Schmelze auf einen reflektierenden Träger.
Formulierung 1-1:
Diese wurde hergestellt durch Zugabe von 3,0 g von Gelatine des Typs IV in 9,1 g Wasser, 0,032 g des Beschichtungshilfsmittels Nonylphenoxypolyglyzerin in 0,3 g Wasser, 0,06 g des Beschichtungshilfsmittels Natrium-Octylphenolpoly(ethenoxy)sulfonat in 0,8 g Wasser, 0,15 g Ethen, 1,1'-(Methylenbis(sulfonyl))bis in 8,25 g Wasser zu 98,3 g destilliertem Wasser.
Formulierung 1-2:
Diese wurde hergestellt durch Zugabe von 3,0 g Gelatine vom Typ IV in 9,1 g Wasser, 0,032 g des Beschichtungshilfsmittels Nonylphenoxypolyglyzerin in 0,3 g Wasser, 0,06 g des Beschichtungshilfsmittels Natrium-Octylphenolpoly(ethenoxy)sulfonat in 0,8 g Wasser, 0,30 g Ethen, 1,1'-(Methylenbis(sulfonyl))bis in 16,5 g Wasser zu 89,9 g destilliertem Wasser.
Formulierung 1-3:
Diese wurde hergestellt durch Zugabe von 3,0 g Gelatine vom Typ IV in 9,1 g Wasser, 0,032 g des Beschichtungshilfsmittels Nonylphenoxypolyglyzerin in 0,3 g Wasser, 0,06 g des Beschichtungshilfsmittels Natrium-Octylphenolpoly(ethenoxy)sulfonat in 0,8 g Wasser, 0,45 g Ethen, 1,1'-(Methylenbis(sulfonyl))bis in 24,75 g Wasser zu 81,5 g destilliertem Wasser.
Formulierung 1-4:
Diese wurde hergestellt durch Zugabe von 3,0 g Gelatine vom Typ IV in 9,1 g Wasser, 0,032 g des Beschichtungshilfsmittels Nonylphenoxypolyglyzerin in 0,3 g Wasser, 0,06 g des Beschichtungshilfsmittels Natrium-Octylphenolpoly(ethenoxy)sulfonat in 0,8 g Wasser, 0,60 g Ethen, 1,1'-(Methylenbis(sulfonyl))bis in 32,9 g Wasser zu 73,2 g destilliertem Wasser.
Formulierung 1-5:
Diese wurde hergestellt durch Zugabe von 3,0 g Gelatine vom Typ IV in 9,1 g Wasser, 0,032 g des Beschichtungshilfsmittels Nonylphenoxypolyglyzerin in 0,3 g Wasser, 0,06 g des Beschichtungshilfsmittels Natrium-Octylphenolpoly(ethenoxy)sulfonat in 0,8 g Wasser, 0,75 g Ethen, 1,1'-(Methylenbis(sulfonyl))bis in 41,15 g Wasser zu 64,8 g destilliertem Wasser.
Die Formulierungen 1-1 bis 1-5 wurden auf ein reflektierendes, fotografisches Papiersubstrat unter Verwendung einer Beschichtungsvorrichtung aufgetragen. Die Formulierungen wurden durch eine Beschichtungsschlitzdüse bei einer Temperatur von 45 °C auf ein 12,7 cm breites Band aufgebracht, das sich mit einer Geschwindigkeit von 3,7 m/Min. bewegte. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde eingestellt zur Erzeugung einer Gelatinebeschichtungsstärke von 86,1 g/m². Die Beschichtungen wurden abgeschreckt in einem 2,4 m langen Abschreckabschnitt, der bei einer Temperatur von 4 °C gehalten wurde sowie einer relativen Feuchtigkeit von 56,6 % RH, worauf die Beschichtungen in zwei Trocknungsabschnitten getrocknet wurden, die eine Länge von 9,8 m bzw. 11,6 m hatten. Der erste Trocknungs abschnitt wurde bei einer Temperatur von 21 °C und einer relativen Feuchtigkeit von 33,2 % RH gehalten und der zweite Abschnitt wurde bei einer Temperatur von 37,8 °C und einer relativen Feuchtigkeit von 18,6 % RH gehalten.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren der Untersuchung einer Gelatinebeschichtung unter Anwendung einer modifizierten Enzym-gebundenen Immunosorbent-Analyse (ELISA).
Das Verfahren zur Durchführung des modifizierten ELISA-Analyseverfahrens war, wie folgt.

1. Ziegen-Antimäuse-Antikörper IgG von Sigma wurde in PBS (Phosphatsalzpuffer, pH-Wert 7,4) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Eine Reihe von verdünntem Ziegen-Antimäuse-Antikörper IgG wurde manuell auf eine Nitrocellulosemembran und beschichtete Gelatinesubstrate aufgeträufelt. Die beträufelten Substrate wurden in einer feuchten Kammer eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
2. Die Substrate wurden vier Mal in PBS-Puffer mit 1 % Triton X100^® jeweils 5 Minuten lang gewaschen, wobei sie geschüttelt wurden.
3. Die gewaschenen Substrate wurden in PBS-Puffer mit 1 % Glyzin 15 Minuten lang unter konstantem Schütteln gewaschen.
4. Die Substrate wurden vier Mal in PBS-Puffer mit 1 % Triton^® X100 unter Schütteln gewaschen.
5. Mäuse-IgG von Sigma wurde in PBS-Puffer mit 0,1 % Tween^® 20 zu 1 μg/ml verdünnt, um die gesamte Oberfläche der Substrate zu bedecken und die Substrate wurden bei Raumtemperatur 1 Stunden lang inkubiert.
6. Die Substrate wurden vier Mal mit PBS-Puffer mit 1 % Triton X100^® jeweils 5 Minuten lang unter konstantem Schütteln gewaschen.
7. Die Substrate wurden in Ziegen-Antimäuse-IgG-Meerrettich-Peroxidase-Konjugatlösung (verdünnt in PBS mit 1 % Glyzin auf einen geeigneten Titer) bei Raumtemperatur 1 Stunde lang unter Schütteln inkubiert unter Bedeckung der gesamten Oberfläche der Substrate.
8. Die Substrate wurden vier Mal mit PBS-Puffer mit 1 % Triton X100^® jeweils 5 Minuten lang unter konstantem Schütteln gewaschen und zwei Mal mit Wasser gespült.
9. Die Farbe wurden entwickelt in einer Meerrettich-Peroxidase-Substratlösung, die enthielt 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) von der Firma Sigma unter Beachtung der Anleitung des Herstellers.

Die Substrate mit den auf ihren Oberflächen entwickelten Farben wurden an der Luft getrocknet und die Reflexionsdichten des betüpfelten Bereiches und des nicht-betüpfelten Bereiches wurden mittels eines Perkin-Elmer PDS-Mikrodensitometers mit einer Status 'A' Filtration gemessen. Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Die Hintergrunddichten wurden verursacht durch eine nicht-spezifische Proteinbindung auf der Oberfläche des Substrates. Die Ergebnisse zeigen, dass alle fünf erfindungsgemäßen Beispiele zu viel geringeren Hintergrunddichten führten als die Vergleichsprobe auf einer Nitrocellulosemembran.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Modifizierung von aufgetragener Gelatine unter Verwendung von homobifunktionellen Quervernetzern zur Verbesserung ihrer Oberflächen-Protein-Bindungskapazität.

3-1: Gelatine wurde gemäß Beispiel 1 aufgetragen und die Beschichtung wurde in einen 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, enthaltend 1,25 % Glutaraldehyd eingetaucht. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und die Beschichtung wurde mit Wasser gespült. Die erhaltene Schiff'sche Base wurde reduziert unter Verwendung einer 10 mg/ml Natriumborohydridlösung. Die Beschichtung wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Ziegen-Antimäuse-Antikörper wurde auf das derart behandelte Substrat aufgetröpfelt und dieses wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht.
3-2: Gelatine wurde, wie Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen und die Beschichtung wurde in 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, enthaltend 10 mM Bis(sulfosuccinimidyl)suberart eingetaucht. Die Reaktion wurde 1 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und die Beschichtung wurde mit destilliertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Ziegen-Antimäuse-Antikörper wurde auf das derart behandelte Substrat aufgetröpfelt und dieses wurde untersucht, wie in Beispiel 2 beschrieben.
3-3: Gelatine wurde, wie Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen und die Beschichtung wurde in 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, enthaltend 10 mM Cyanurchlorid eingetaucht. Die Reaktion wurde 1 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und die Beschichtung wurde mit destilliertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet. Ziegen-Antimäuse-Antikörper wurde auf das derart behandelte Substrat aufgetröpfelt und dieses wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht.

Die Oberflächen-Protein-Bindungskapazität wurde gemäß dem ELISA-Protokoll, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Modifizierung von aufgetragener Gelatine unter Verwendung von heterobifunktionellen Quervernetzern zur Verbesserung der Oberflächen-Protein-Bindungskapazität.

4-1: Gelatine wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen und die Beschichtung wurde eingetaucht in 0,01 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, enthaltend 10 mM N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimidester. Die Reaktion wurde 1 Stunden lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und die Beschichtung wurde mit destilliertem Wasser gespült und an der Luft getrocknet.

Ziegen-Antimäuse-Antikörper wurde in 0,05 M DTT reduziert und bei Raumtemperatur 10 Minuten stehen gelassen. Unmittelbar vor der Verwendung wurde die reduzierte Antikörperlösung vier Mal mit Ethylacetat extrahiert, um DTT von der Probe zu entfernen.
Ziegen-Antimäuse-Antikörper wurde auf die derart behandelte Substratoberfläche aufgetröpfelt und untersucht, im Wesentlichen, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass Cystein anstelle von Glyzin in den Stufen 2 und 7 verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2

* Kein Spot-Signal konnte bei diesen Mengen an Ziegen-Antimäuse-IgG ermittelt werden. Die Behandlung der Gelatineoberflächen mit homobifunktionellen und heterobifunktionellen Quervernetzern verbesserte die Protein-Oberflächen-Bindungskapazität und ermöglichte eine geringere Abscheidung von zu ermittelnden Antikörpermolekülen (Signale waren bereits erkennbar bei 10 Nanogramm Proteinen, die auf die modifizierten Oberflächen aufgetüpfelt wurden).

Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die nicht-spezifische Bindung an Protein von einer beschichteten Gelatineoberfläche.
Ein Siliziumwafer oder Glas wurde behandelt mit 10 Gew.-% NaOH-Lösung in Ethanol 10 Minuten lang, worauf 30 Minuten lang bei 580 °C gealtert wurde. Eine wässrige 1 Gew.-% Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APS, von der Firma Gelest Inc.) wurde hergestellt und unter Verwendung von Essigsäure auf einen pH-Wert von 3,5 gebracht. Nach Einbringen des behandelten Wafers oder Glases in die APS-Lösung wurde der pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 5,5 eingestellt. Die Reaktion wurde 1 Stunden lang ablaufen gelassen, worauf die Oberfläche gründlich mit Wasser gespült wurde und in Stickstoff getrocknet wurde. Die APS-Schicht, die auf die Oberfläche des Glases oder der Waferscheibe aufgepfropft worden war, wurde gemessen durch Ellipsometrie (GAERTNER^® L116B) und es wurde gefunden, dass die Schicht eine Dicke von 8 Å hatte. Die Gelatine- und Polyethylenimin-(PEI) Oberflächen wurden weiter verändert, in dem die APS-Oberfläche mit einer 10 mM Cyanchloridlösung (von Aldrich^®) in Acetonitrillösung 1 Stunde lang behandelt wurde und worauf die Slides über Nacht in 0,1 Gew.-% Lösungen von Gelatine und PEI (von Aldrich^®, MW ~ 2000) eingetaucht wurden. Es wurde gefunden, dass die Oberflächen eine gebundene Schicht von Gelatine und PEI aufwiesen mit Dicken von 47 Å bzw. 30 Å.
Die nicht-spezifische Protein-Bindung an die drei funktionellen Amingruppen enthaltenden Oberflächen wurde getestet durch Einweichen der mit APS, Gelatine und PEI beschichteten Slides in eine 100 μg/ml Rinder-Serumalbumin (BSA von der Firma Sigma^®) Lösung in einer Phosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 7, 60 Minuten lang und 2 Minuten langes Spülen mit Wasser. Die Mengen an BSA, das nicht-spezifisch an die Oberflächen adsorbiert worden war, wurde durch Ellipsometrie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt:
Tabelle 3: BSA nicht-spezifische Bindung an Amin enthaltende Oberfläche von Gelatine, APS und PEI Tabelle 3
Die Ergebnisse zeigen, dass die Gelatineoberfläche eine beträchtlich geringere, nichtspezifische Bindungskapazität hatte als die anderen eine funktionelle Amingruppe enthaltenden Materialien. Zu bemerken ist zum Beispiel, dass die aufgetragene Gelatineoberfläche beträchtlich weniger BSA absorbierte als die mit Amin beschichteten Oberflächen.

Claims

Substrat auf Gelatinebasis zur Herstellung von Protein-Reihen, das umfasst: Gelatine, die praktisch resistent gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung ist sowie eine trifunktionelle Verbindung A-L-B, die an einer Oberfläche der Gelatine befestigt ist; worin A eine funktionelle, mit der Gelatine reagierende Gruppe ist; L eine verbindende Gruppe ist, die mit A und mit B reagiert, und B eine funktionelle Gruppe ist, die mit einem ein Protein einfangenden Mittel reagiert, worin die funktionelle Gruppe ist Aldehyd, Epoxy, Hydrazid, Vinylsulfon, Succinimidylester, Carbodiimid, Maleimid, Dithio, Iodoacetyl, Isocyanat, Isothiocyanat, Aziridin, Carboxy, Amino, Chloromethyl, eine Affinitäts-Markierung, Streptavidin, Biotin, Glutathion-S-transferase, Glutathion, eine Histidin-Markierung oder eine löslich machende Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Hydroxaminsäure-, Sulfonamid-, Hydroxygruppe oder entsprechenden Salzen hiervon, worin A die gleiche oder eine unterschiedliche Bedeutung von B haben kann.
Substrat auf Gelatinebasis nach Anspruch 1, worin L ein Diradikal einer solchen Länge ist, dass die kürzeste Bindungsbahn zwischen den Enden, die A und B verbindet, nicht größer als 10 Atome ist.
Verfahren zur Herstellung eines Substrates auf Gelatinebasis zur Herstellung von Proteinreihen mit den Stufen: -- Bereitstellung eines Trägers; -- Beschichtung des Trägers mit einer Zusammensetzung, die Gelatine enthält, die praktisch resistent gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung ist; -- Befestigung einer trifunktionellen Gruppe A-L-B an einer Oberfläche der Gelatine; worin A eine funktionelle, mit der Gelatine reagierende Gruppe ist; L eine verbindende Gruppe ist, die mit A und mit B reagiert; und worin B eine funktionelle Gruppe ist, die mit einem ein Protein einfangenden Mittel reagiert, worin die funktionelle Gruppe ist Aldehyd, Epoxy, Hydrazid, Vinylsulfon, Succinimidylester, Carbodiimid, Maleimid, Dithio, Iodoacetyl, Isocyanat, Isothiocyanat, Aziridin, Carboxy, Amino, Chloromethyl, eine Affinitäts-Markierung, Streptavidin, Biotin, Glutathion-S-transferase, Glutathion, eine Histidin-Markierung oder eine löslich machende Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Hydroxaminsäure-, Sulfonamid- oder Hydroxygruppe oder entsprechenden Salzen hiervon, wobei A gleich B oder von B verschieden sein kann.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die trifunktionelle Verbindung A-L-B während des Auftrages der Gelatine auf das Substrat befestigt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die trifunktionelle Verbindung A-L-B nach dem Auftrag der Gelatine auf das Substrat befestigt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das ein Protein einfangende Mittel ein Antikörper, ein Proteingerüst, ein Peptid, ein Nukleinsäureligand oder ein Polymer für einen molekularen Abdruck ist.
Verfahren zur Herstellung eines Substrates mit einem ein Protein einfangenden Mittel, das auf einer Oberfläche befestigt ist, mit den Stufen: -- Bereitstellung eines Substrates mit Gelatine, die gegenüber einer nicht-spezifischen Bindung praktisch resistent ist; -- Befestigung einer trifunktionellen Verbindung A-L-B auf einer Oberfläche der Gelatine; worin A eine funktionelle, mit der Gelatine reagierende Gruppe ist; L eine verbindende Gruppe ist, die mit A und mit B reagiert; und B eine funktionelle Gruppe ist, die mit einem ein Protein einfangenden Mittel reagiert, worin die funktionelle Gruppe ist Aldehyd, Epoxy, Hydrazid, Vinylsulfon, Succinimidylester, Carbodiimid, Maleimid, Dithio, Iodoacetyl, Isocyanat, Isothiocyanat, Aziridin, Carboxy, Amino, Chloromethyl, eine Affinitäts-Markierung, Streptavidin, Biotin, Glutathion-S-transferase, Glutathion, eine Histidin-Markierung oder eine löslich machende Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Phosphonsäure-, Hydroxaminsäure-, Sulfonamid- oder Hydroxygruppe oder entsprechenden Salzen hiervon, wobei A gleich B oder von B verschieden sein kann; und -- das Inkontaktbringen der Oberfläche der Gelatine mit einem Protein.