DE602004008241T2

DE602004008241T2 - Verfahren zum anfärben von sperma

Info

Publication number: DE602004008241T2
Application number: DE602004008241T
Authority: DE
Inventors: Muhammad Chesterfield ANZAR; Cindy L. St. Louis LUDWIG; Jeffrey A. Chesterfield GRAHAM; Jeannet A. University City GLAENZER
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Inguran LLC
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2024-03-30
Also published as: AU2004226343A1; AU2004226343B2; CN1795004A; CA2519989A1; EP1608382A1; NZ542688A; ATE369867T1; BRPI0408852A; EP1608382B1; JP2006525019A; WO2004087177A1; ZA200507823B; US20050003472A1; DE602004008241D1; MXPA05010478A; PL1608382T3; CN100379429C; US7335507B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Färbeverfahren, um eine Spermatrennung zum Zwecke der Erzeugung eines hinsichtlich des Geschlechts angereicherten Samens zu ermöglichen.
Die Befruchtung von Tieren durch künstliche Insemination (AI) und Embryotransplantation nach einer in-vitro-Fertilisation ist eine etablierte Technik. In der Tierproduktionsindustrie beinhaltet die Möglichkeit, das Reproduktionsergebnis dahingehend zu beeinflussen, dass die Nachkommen eine oder mehrere erwünschte Eigenschaft(en) aufweisen, naheliegende Vorteile. Beispielsweise wäre es in der Milchindustrie ökonomisch vorteilhaft, eine Vorauswahl der Nachkommen zugunsten des weiblichen Geschlechts zu treffen, um die Produktion von Milchkühen sicherzustellen. Die Trennung von Sperma in angereicherte Populationen von X- und Y-Chromosom-tragende Zellen, bekannt als gesexter Samen oder hinsichtlich des Geschlechts angereichertes Sperma, ist eine Methode, um eine Vorauswahl der Nachkommen zu erreichen.
Johnson et al. ( US-Patent Nr. 5,135,759 ) beschreiben die Trennung von intakten X- und Y-Chromosom-tragenden Spermapopulationen nach dem DNA-Gehalt unter Verwendung eines Durchflusscytometers/Zellsortiergeräts in angereicherte Populationen von X- und Y-Chromosom-tragende Spermien. Wie beschrieben, wird das Sperma mit einem DNA-selektiven Farbstoff bei einer Temperatur von 30°C bis 39°C für einen Zeitraum von 1 Stunde (39°C) bis 1,5 Stunden (30°C) kombiniert. Anschließend wird ein Durchflusscytometer verwendet, um den Anteil des Fluoreszenzlichts zu messen, welcher abgestrahlt wird, wenn die Spermien einen Laserstrahl passieren. Da die ein X-Chromosom tragenden Spermien ungefähr 3% bis 5% mehr DNA enthalten als die ein Y-Chromosom tragenden Spermien, abhängig von der Spezies, ergeben die ein X-Chromosom tragenden Spermien eine höhere Fluoreszenzlichtintensität als die ein Y-Chromosom tragenden Spermien. Tröpfchen, die eine einzelne Samenzelle mit einer bestimmten Fluoreszenzintensität enthalten, erhalten eine Ladung und werden elektrostatisch in Auffangbehälter abgelenkt. Die gesammelte, hinsichtlich des Geschlechts angereicherte Spermapopulation wird dann für die Mikroinjektion oder künstliche Insemination verwendet.
Seidel et al. ( WO 02/43574 ) beschreiben ebenfalls die Trennung von Sperma in hinsichtlich des Geschlechts angereicherte Populationen von X- und Y-Chromosom-tragende Zellen mittels Durchflusscytometrie. Seidel et al. beschreiben die Färbung der Zellen bei einer Temperatur zwischen 30°C und 40°C.
Didion et al. ( WO 02/41906 ) beschreiben die Färbung von Spermazellen bei Temperaturen von etwa 17°C bis 30°C. Gemäß Didion et al. wurden durch diese Färbetemperaturen gewisse Effekte vermieden, welche aus einer Färbung bei höheren Temperaturen resultieren können, wie eine verminderte Spermalebensfähigkeit und eine geringere Effizienz. Weiterhin wurde davon ausgegangen, dass die Färbung bei einer niedrigeren Temperatur vorteilhafte Effekte auf die Spermaorientierung während der Sortierung vorsieht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung beinhalten die Bereitstellung eines relativ schnellen und effizienten Verfahrens zum Färben von Spermazellen und die Bereitstellung eines solchen Prozesses, bei welchem geringere Zeiträume für die Farbstoffaufnahme erforderlich sind, wodurch die Zeit verringert wird, die zwischen dem Zeitpunkt der Samensammlung und der Erzeugung von hinsichtlich des Geschlechts angereicherten Populationen von X- und Y-Chromosom-tragenden Spermazellen verstreicht.
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zum Färben von Spermazellen. Das Verfahren umfasst das Bilden einer Färbemischung, enthaltend intakte lebensfähige Spermazellen und einen DNA-selektiven Fluoreszenzfarbstoff, und das Aussetzen der Färbemischung einer Temperatur von mindestens etwa 40°C, ohne wesentliche Beeinflussung der Lebensfähigkeit der gefärbten Zellen.
Andere Aspekte der Erfindung werden nachstehend teilweise ersichtlich und zum Teil hervorgehoben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–1D veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 1 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit verschiedenen Konzentrationen von Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 41°C gefärbt wurde.
Die 2A–2D veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 2 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit verschiedenen Konzentrationen von Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 41°C gefärbt wurde.
Die 3A–3D veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 3 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit verschiedenen Konzentrationen von Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 43°C gefärbt wurde.
Die 4A und 4B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 4 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit verschiedenen Konzentrationen von Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 43°C gefärbt wurde.
Die 5A und 5B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 5 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit verschiedenen Konzentrationen von Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 45°C gefärbt wurde.
Die 6A und 6B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 6 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit verschiedenen Konzentrationen von Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 47°C gefärbt wurde.
Die 7A und 7B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 7 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 60 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C und 43°C gefärbt wurde.
Die 8A und 8B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 8 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 60 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 39°C und 45°C gefärbt wurde.
Die 9A–9C veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 9 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wurde, welcher ungefärbt war oder mit 80 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C, 43°C und 45°C gefärbt wurde.
Die 10A–10C veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 10 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 100 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C, 43°C und 45°C gefärbt wurde.
Die 11 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 11 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 100 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 47°C gefärbt wurde.
Die 12 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 12 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 100 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 49°C gefärbt wurde.
Die 13A und 13B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 13 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 125 μM Hoechst 33342-Farbstoff oder mit 150 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 43°C gefärbt wurde.
Die 14A und 14B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 14 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 200 μM Hoechst 33342-Farbstoff oder mit 250 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 43°C gefärbt wurde.
Die 15A und 15B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 15 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 125 μM Hoechst 33342-Farbstoff oder mit 150 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 45°C gefärbt wurde.
Die 16A–16C veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 16 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 200 μM Hoechst 33342, mit 250 μM Hoechst 33342 oder mit 350 μM Hoechst 33342 gefärbt wurde.
Die 17A–17C veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 17 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 300 μM Hoechst 33342, mit 350 μM Hoechst 33342 oder mit 400 μM Hoechst 33342 gefärbt wurde.
Die 18A–18C veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 18 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale Motilität und die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher ungefärbt war oder mit 0,6 μM SYBR-14, mit 6,0 μM SYBR-14 oder mit 60 μM SYBR-14 gefärbt wurde.
Die 19A–19B veranschaulichen graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 19 durchgeführten Studie, wobei die Fluoreszenzintensität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit 100 μM Bisbenzimid-BODIPY-Konjugat (BBC) oder mit 6 μM SYBR-14 gefärbt wurde.
Die 20 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 20 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit 400 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in entweder einem TCA-Puffer oder einem TCA-Puffer, enthaltend 10 mM Pyruvat, gefärbt wurde.
Die 21 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 21 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit 400 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in entweder einem TCA-Puffer oder einem TCA-Puffer, enthaltend 10 μM Vitamin K, gefärbt wurde.
Die 22 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 22 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit 400 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in entweder einem TCA-Puffer oder einem TCA-Puffer, enthaltend 100 μM Vitamin K, gefärbt wurde.
Die 23 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 23 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Sperma für Samen gemessen wird, welcher mit 400 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in entweder einem TCA-Puffer oder einem TCA-Puffer, enthaltend 1 mM Liponsäure, gefärbt wurde.
Die 24 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 24 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Spermazellen für Samen gemessen wird, welcher mit 300 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in TCA, enthaltend 10 mM Pyruvat, gefärbt und dann 1:3 mit entweder TCA, enthaltend 10 mM Pyruvat, oder einem Inhibitor auf Carbonat-Basis bei pH 6,2 verdünnt wurde.
Die 25 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 24 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Spermazellen für Samen gemessen wird, welcher mit 300 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in (1) TCA, enthaltend 10 mM Pyruvat, gefärbt und dann mit demselben Puffer 1:3 verdünnt wurde, oder in (2) einem Puffer auf Carbonat-Basis bei pH 7,3 gefärbt und dann 1:3 mit einen Inhibitor auf Carbonat-Basis bei pH 6,2 verdünnt wurde.
Die 26 veranschaulicht graphisch die Ergebnisse der in Beispiel 24 durchgeführten Studie, wobei die prozentuale progressive Motilität von Spermazellen für Samen gemessen wird, welcher mit 300 μM Hoechst 33342-Farbstoff bei 41°C in TCA, enthaltend 10 mM Pyruvat, oder einem Inhibitor auf Carbonat-Basis bei pH 6,2 gefärbt wurde.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Überraschend ist festgestellt worden, dass Spermazellen für die Verwendung in Durchflusscytometrie-Verfahren mit einem Farbstoff bei erhöhten Temperaturen, d.h. bei Temperaturen oberhalb von 40°C, in einer kürzeren Zeit, als sie für das Färben der Zellen bei niedrigeren Temperaturen erforderlich ist, ohne wesentliche Beeinflussung der Lebensfähigkeit der Spermazellen, gefärbt werden können. In einer Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 41°C ausgesetzt. In einer anderen Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 42°C ausgesetzt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 43°C ausgesetzt. In einer noch anderen Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 44°C ausgesetzt. In einer noch weiteren Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 45°C ausgesetzt. Im Allgemeinen jedoch kann das Aussetzen der Spermazellen einer Temperatur von im Wesentlichen mehr als 45°C für einen wesentlichen Zeitraum die Lebensfähigkeit der Zellen nachteilig beeinflussen. Daher werden in einer Ausführungsform die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 41°C, aber nicht mehr als 50°C, ausgesetzt. In einer anderen Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 41°C, aber nicht mehr als 48°C, ausgesetzt. In einer weiteren Ausführungsform werden die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 41°C, aber nicht mehr als 47°C, ausgesetzt. Zum Beispiel werden in einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 42°C, aber nicht mehr als 47°C, ausgesetzt. Bei einem weiteren Beispiel werden in einer anderen gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform die Spermazellen dem Farbstoff bei einer Temperatur von mindestens 43°C, aber nicht mehr als 45°C, ausgesetzt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann angewendet werden, um intakte, lebensfähige Spermazellen eines Rindes, Schweines, Pferdes oder anderen Säugetieres, welche einer frisch erhaltenen Samenprobe oder einer aufgetauten kryokonservierten Samenprobe entstammen, zu färben. Verschiedene Methoden für das Sammeln von lebensfähigem Sperma sind bekannt und schließen zum Beispiel die Methode einer künstlichen Vagina oder die Methode einer behandschuhten Hand ein. Eine typische Rinder-Samenprobe enthält etwa 0,5 bis etwa 5 Milliarden Spermazellen pro Milliliter, abhängig von der Spezies und dem einzelnen Tier innerhalb der Spezies.
Im Allgemeinen werden Spermazellen gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung durch das Bilden einer Färbemischung gefärbt, welche Spermazellen und einen DNA-selektiven Farbstoff umfasst. Spermazellen sind gegenüber wesentlichen Änderungen in Bezug auf den osmotischen Druck und den pH-Wert ziemlich empfindlich. Um die Auswirkung auf die Lebensfähigkeit des Spermas zu vermindern, wird daher im Allgemeinen bevorzugt, dass die Färbemischung unter Beachtung dieser Überlegungen gebildet wird. Im Einklang mit diesen Überlegungen kann die Färbemischung vielfältige Weise gebildet werden.
In einer Ausführungsform wird der unverdünnte Samen mit dem DNA-selektiven Farbstoff kombiniert. So kann zum Beispiel ein Farbstoff in Form eines reinen Feststoffes, einschließlich eines rieselfähigen Pulvers, oder einer flüssigen Zusammensetzung mit dem unverdünnten Samen kombiniert werden. Alternativ kann eine ungepufferte Flüssigkeit, in welcher der Farbstoff gelöst oder dispergiert ist, mit dem unverdünnten Samen kombiniert werden. Bei jedem dieser Ansätze wird jedoch im Allgemeinen bevorzugt, dass die Bildung der Färbemischung nicht zur Folge hat, dass das Sperma einer wesentlichen Änderung in Bezug auf den osmotischen Druck oder den pH-Wert im Verhältnis zu dem unverdünnten Samen, welche ausreichend ist, um dessen Lebensfähigkeit wesentlich nachteilig zu beeinflussen, ausgesetzt wird.
In einer anderen Ausführungsform wird der unverdünnte Samen mit einer gepufferten Flüssigkeit kombiniert, in welcher der Farbstoff gelöst oder dispergiert ist, um die Färbemischung zu bilden. Vorteilhafterweise begünstigt der Puffer die Vermeidung irgendeiner wesentlichen Änderung in Bezug auf den osmotischen Druck oder den pH-Wert im Verhältnis zu dem unverdünnten Samen, welche ausreichend ist, um dessen Lebensfähigkeit als Folge der Bildung der Mischung wesentlich nachteilig zu beeinflussen.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Spermaquelle mit einem Puffer kombiniert, um eine Spermasuspension zu bilden, und die Spermasuspension wird danach mit dem Farbstoff kombiniert, um die Färbemischung zu bilden. Das Suspendieren der Spermazellen in einer gepufferten Flüssigkeit vor dem Kontakt mit dem Farbstoff kann die Spermazellen vorteilhafterweise vor einer wesentlichen Änderung in Bezug auf den pH-Wert und den osmotischen Druck schützen, welche ansonsten aus der Zugabe des Farbstoffes resultieren würde. In dieser Ausführungsform kann die Spermaquelle ein unverdünnter Samen sein. Alternativ kann die Spermaquelle ein Sperma enthaltendes Samenderivat sein, welches durch Zentrifugation oder die Verwendung eines anderen Mittels zur Trennung von Samen in Fraktionen erhalten wird.
In einer anderen Ausführungsform wird der DNA-selektive Farbstoff mit einem Puffer kombiniert, oder ist als Bestandteil einer Pufferrezeptur eingeschlossen, wodurch eine gepufferte Farbstofflösung gebildet wird. So kann zum Beispiel ein Farbstoff in Form eines reinen Feststoffes, einschließlich eines rieselfähigen Pulvers, oder eine flüssige Zusammensetzung mit dem Puffer oder irgendwelchen Bestandteilen der Pufferrezeptur vor der Kombination davon kombiniert werden, um eine gepufferte Farbstofflösung zu bilden, welche dann mit einem unverdünnten Samen oder einer Spermasuspension kombiniert werden kann.

Eine Vielzahl von biologischen Puffer kann einzeln oder in Kombination miteinander verwendet werden, um die Spermazellen vor wesentlichen Änderungen in Bezug auf den pH-Wert und den osmotischen Druck zu schützen. Typischerweise liegen diese Puffer in einer Konzentration von etwa 0,001 M bis etwa 1,0 M und einem pH zwischen etwa 4,5 bis etwa 8,5 vor. Gebräuchliche biologische Puffer schließen zum Beispiel Phosphate, Diphosphate, Citrate, Acetate und Lactate ein. Solche Puffer können auch eine Nährstoffquelle, wie zum Beispiel einen Zucker, und/oder ein Antibiotikum, wie Streptomycin, enthalten. Bevorzugte Puffer schließen TCA, TEST, Natriumcitrat, TL und HEPES ein. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Samenprobe mit einer oder mehreren der in Tabelle I beschriebenen Pufferlösungen verdünnt. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform die Samenprobe mit einer TCA#1-Pufferlösung verdünnt, welche die in Tabelle I beschriebene Zusammensetzung hat. In einer anderen Ausführungsform wird die Samenprobe mit einer TCA#2-Pufferlösung verdünnt, welche die in Tabelle I beschriebene Zusammensetzung hat. In einer weiteren Ausführungsform wird die Samenprobe mit einer TEST-Pufferlösung verdünnt, welche die in Tabelle I beschriebene Zusammensetzung hat. In einer noch anderen Ausführungsform wird die Samenprobe mit einer Natriumcitrat-Pufferlösung verdünnt, welche die in Tabelle I beschriebene Zusammensetzung hat. In einer noch weiteren Ausführungsform wird die Samenprobe mit einer TL- Pufferlösung verdünnt, welche die in Tabelle I beschriebene Zusammensetzung hat. In einer anderen Ausführungsform wird die Samenprobe mit einer HEPES-Pufferlösung verdünnt, welche die in Tabelle I beschriebene Zusammensetzung hat. In einer weiteren Ausführungsform können die Spermazellen mit einer Pufferlösung, umfassend 0,204 g NaHCO₃, 0,433 g KHCO₃ und 0,473 g C₆H₈O₇·H₂O pro 25 ml gereinigtem Wasser (0,097 mol/l NaHCO₃, 0,173 mol/l KHCO₃ und 0,090 mol/l C₆H₈O₇·H₂O in Wasser), verdünnt werden, um eine Spermasuspension zu bilden. Tabelle I

PUFFERREZEPTUREN
Komponenten	TCA#1	TCA#2	TEST	Na-Citrat	HEPES	TL
Natriumchlorid (NaCl)					7,6 g	5,84 g
Kaliumchlorid (KCl)					0,3 g	0,23 g
Natriumbicarbonat (NaHCO₃)						2,1 g
Monobasisches Natriumphosphat (NaH₂PO₄·H₂O)						0,04 g
(+)-2-Hydroxypropionsäure (Na-Lactat)						3,68 ml
Magnesiumchlorid (MgCl₂)					0,1 g	0,08 g
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES)					2,38 g	2,38 g
Tris(hydroxymethyl)aminoethan (TRIS-Base)	30,3 g	32,02 g	10,28 g
Citronensäure-Monohydrat	15,75 g	18,68 g
Na-Citrat-Dihydrat				29 g
2-(2-Hydroxy-1,1-bis[hydroxymethyl]ethyl)aminoethansulfonsäure (TES)			43,25 g
Fructose	12,5 g	2,67 g		10 g	2,52 g
D-Glucose			2 g
Streptamycin			0,25 g
Penicillin-G			0,15 g
Wasser	1 Liter	1 Liter	1 Liter	1 Liter	1 Liter	1 Liter
Ziel-pH	7,35	7,35	7,35	7,35	7,35	7,35
Ziel-Osmolalität (Milliosmol/kg H₂O)	~314	~300	~302	~316	~298	~296

Die verwendete Menge an Puffer hängt im Allgemeinen von verschiedenen Überlegungen, z.B. dem jeweiligen Puffer und der gewünschten Spermienkonzentration (# Spermien/ml) in der Färbemischung, ab. Daher wird eine ausreichende Menge an Puffer verwendet, so dass die gewünschte Konzentration an Spermien/ml erreicht wird. In einer Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche eine geringere Konzentration an Spermien als in einer unverdünnten Samenprobe enthält. In einer anderen Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 1 × 10⁶ Spermien/ml bis etwa 5 × 10⁹ Spermien/ml enthält. In einer weiteren Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche weniger als etwa 200 × 10⁶ Spermien/ml enthält. In einer noch anderen Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 1 × 10⁶ Spermien/ml bis etwa 200 × 10⁶ Spermien/ml enthält. In einer noch weiteren Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 20 × 10⁶ Spermien/ml bis etwa 200 × 10⁶ Spermien/ml enthält. In einer anderen Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 30 × 10⁶ Spermien/ml bis etwa 175 × 10⁶ Spermien/ml enthält. In einer noch anderen Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 50 × 10⁶ Spermien/ml bis etwa 150 × 10⁶ Spermien/ml enthält. In einer noch weiteren Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 100 × 10⁶ Spermien/ml bis etwa 150 × 10⁶ Spermien/ml enthält. In einer noch anderen Ausführungsform wird Puffer zugegeben, um eine Spermasuspension zu erhalten, welche etwa 150 × 10⁶ Spermien/ml enthält.
Die Konzentration des Farbstoffes in der Färbemischung wird so gewählt, dass eine ausreichende Menge des Farbstoffes an die DNA bindet, um das Sortieren, von X- und Y-Chromosom-tragenden Spermien in nach Geschlecht getrennte Populationen zu ermöglichen. Weiterhin ist die Farbstoffkonzentration vorzugsweise ausreichend, um eine quantitative Färbung der Spermazellen innerhalb eines angemessenen kurzen Zeitraums vorzusehen, ohne die Zelllebensfähigkeit wesentlich zu beeinflussen. Faktoren, welche die gewünschte Konzentration für eine bestimmte Anwendung beeinflussen, schließen die Art des Farbstoffes, die Konzentration der Spermien in der Färbemischung, den pH-Wert der Färbemischung, die für die Aufnahme des Farbstoffes durch die Spermazellen erlaubte Zeitdauer und die Temperatur während dieses Aufnahmezeitraums ein. Im Allgemeinen jedoch liegt die Konzentration des Farbstoffes in der Färbemischung typischerweise innerhalb eines beliebigen Bereichs von Konzentrationen, im Allgemeinen zwischen etwa 0,1 μM und etwa 1000 μM. Zum Beispiel kann die Konzentration des Farbstoffes innerhalb eines "relativ niedrigen" Konzentrationsbereichs, d.h. einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 250 μM, gehalten werden; in dieser Ausführungsform beträgt die Konzentration vorzugsweise etwa 100 μM bis etwa 200 μM, mehr bevorzugt etwa 100 μM, noch mehr bevorzugt etwa 200 μM und sogar noch mehr bevorzugt etwa 150 μM. Alternativ kann die Konzentration des Farbstoffes innerhalb eines "dazwischenliegenden" Konzentrationsbereichs, d.h. einer Konzentration von etwa 250 μM bis etwa 700 μM, gehalten werden; in dieser Ausführungsform beträgt die Konzentration vorzugsweise etwa 300 μM bis etwa 700 μM, mehr bevorzugt etwa 300 μM, noch mehr bevorzugt etwa 400 μM und sogar noch mehr bevorzugt etwa 600 μM. Daneben kann die Konzentration des Farbstoffes innerhalb eines "relativ hohen" Konzentrationsbereichs, d.h. einer Konzentration von etwa 700 μM bis etwa 1000 μM, gehalten werden; in dieser Ausführungsform beträgt die Konzentration vorzugsweise etwa 800 μM bis etwa 1000 μM, mehr bevorzugt etwa 800 μM, noch mehr bevorzugt etwa 900 μM und sogar noch mehr bevorzugt etwa 1000 μM. Entsprechend beträgt in einer Ausführungsform die Farbstoffkonzentration etwa 100 μM bis etwa 200 μM. In einer anderen Ausführungsform beträgt die Farbstoffkonzentration etwa 10 μM bis etwa 100 μM. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die Farbstoffkonzentration etwa 20 μM bis etwa 80 μM. In einer noch anderen Ausführungsform beträgt die Farbstoffkonzentration in der Färbemischung etwa 20 μM bis etwa 60 μM. Des Weiteren ist berichtet worden, dass die optimale Farbstoffkonzentration für die meisten Spezies etwa 40 μg pro 150 × 10⁶ Spermien beträgt, was ungefähr 70 μM entspricht. Vgl. zum Beispiel L.A. Johnson und Glenn Welch, Theriogenology (1999).
Der pH-Wert der Färbemischung wird vorzugsweise in dem Bereich von etwa 6,0 bis etwa 8,0 gehalten. Mehr bevorzugt wird der pH-Wert der Färbemischung in dem Bereich von etwa 7,1 bis etwa 7,6 gehalten. Noch mehr bevorzugt wird der pH-Wert der Färbemischung bei etwa 7,3 bis 7,4 gehalten. Noch stärker bevorzugt wird der pH-Wert der Färbemischung bei etwa 7,35 gehalten.
Bestimmte Farbstoffe sind in der Lage, in die Spermazellen einzudringen und spezifisch an die DNA zu binden, ohne dass als weiterer Eingriff die Permeabilität der Zellen erhöht wird. Bei anderen Farbstoffen kann es jedoch wünschenswert sein, das Sperma vor dem Färben zu behandeln, um die Permeationsrate zu erhöhen, ohne dass die Lebensfähigkeit oder Motilität unannehmbar vermindert wird. Jede geeignete Methode, welche den Fachleuten bekannt ist, kann angewendet werden. Solche Methoden schließen die Elektroporation, die Verwendung von die Zellpermeation erhöhenden Lösungen, z.B. milde Tenside, oder einen chemischen Schock ein. Falls es wünschenswert oder vorteilhaft ist, andere oder stringentere Techniken anzuwenden, können solche Behandlungen die Verwendung von Liposomen einschließen, oder können viele der Techniken angewendet werden, welche den Fachleuten bekannt sind, um Färbemittel, Farbstoffe, Gene oder Vektoren in lebende Zellen einzubringen. Diese Methoden schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, die Mikroinjektion, wie durch Gordon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 1990) angewendet und in der Zwischenzeit auf Kaninchen, Schafe, Rinder und Schweine ausgeweitet; den DEAE-Dextran-vermittelten Transfer; die Copräzipitation mit Calciumphosphat; und andere Techniken, welche dem Fachmann alle gut bekannt sind, ein. In noch weiteren Fällen kann es wünschenswert sein, das Sperma zu zentrifugieren, und das zentrifugierte Sperma in einem anderen Medium, welches allerdings auf demselben oder im Wesentlichen demselben Puffersystem basiert, zu resuspendieren, um bestimmte Komponenten (welche vorher zu der Spermasuspension zugesetzt worden sein können) zu entfernen, welche spätere Verfahrensschritte beinträchtigen können.
Die Aufnahme von Farbstoff durch die Spermazellen in der Färbemischung wird für einen ausreichenden Zeitraum fortdauern gelassen, um den gewünschten DNA-Färbegrad zu erhalten. Im Allgemeinen beträgt die Aufnahmedauer zwischen etwa 1 Minute und etwa 160 Minuten. In einer Ausführungsform beträgt der Aufnahmezeitraum weniger als 90 Minuten. In einer anderen Ausführungsform beträgt der Aufnahmezeitraum weniger als 60 Minuten. In einer weiteren Ausführungsform beträgt der Aufnahmezeitraum weniger als 40 Minuten. In einer anderen Ausführungsform beträgt der Aufnahmezeitraum weniger als 25 Minuten. Wie vorher angemerkt, hängt der Aufnahmezeitraum ein wenig von dem Bereich der anderen Parameter einschließlich der Aufnahmetemperatur, der Art des Farbstoffes und der Konzentration des Farbstoffes ab. In bestimmten Ausführungsformen beträgt der Aufnahmezeitraum etwa 2 bis etwa 25 Minuten. In anderen Ausführungsformen beträgt der Aufnahmezeitraum etwa 5 bis etwa 20 Minuten. In noch anderen Ausführungsformen beträgt der Aufnahmezeitraum etwa 2 bis etwa 10 Minuten. In einer anderen Ausführungsform beträgt der Aufnahmezeitraum weniger als 2 Minuten.
Die Färbemischung kann einer erhöhten Temperatur gemäß der vorliegenden Erfindung während des gesamten der Aufnahmezeitraums oder während eines Teils davon ausgesetzt werden. So kann zum Beispiel die Färbemischung bei einer Temperatur von mehr als 40°C für mindestens 1%, 5%, 10%, 20% oder auch einen größeren Prozentsatz des der Aufnahmezeitraums gehalten werden. In einer Ausführungsform wird die Temperatur der Färbemischung während des Aufnahmezeitraums erhöht. In einer anderen Ausführungsform wird die Temperatur der Färbemischung während des Aufnahmezeitraums erniedrigt. In jeder dieser Ausführungsformen wird jedoch die Rate der Temperaturänderung kontrolliert, um vorzugsweise irgendeinen wesentlichen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Spermazellen zu vermeiden.
In jedem Fall ist der Aufnahmezeitraum für die Bindung des Farbstoffes an die DNA ausreichend, so dass X- und Y-Chromosom-tragende Spermazellen basierend auf der unterschiedlichen und messbaren Fluoreszenzintensität zwischen den X- und Y-Chromosom-tragenden Spermien sortiert werden können. In einer Ausführungsform ist der Färbegrad ausreichend, um zu ermöglichen, dass die X- und Y-Chromosom-tragenden Spermien basierend auf ihrer jeweiligen Fluoreszenz unterschiedlich in X- und Y-Populationen von mindestens etwa 60% Reinheit sortiert werden können. Der Färbegrad ist vorzugsweise ausreichend, um zu ermöglichen, dass die X- und Y-Chromosom-tragenden Spermien basierend auf ihrer jeweiligen Fluoreszenz unterschiedlich in X- und Y-Chromosom-tragende Spermienpopulationen von mindestens etwa 70% Reinheit, mehr bevor zugt von mindestens etwa 80% Reinheit, noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 85% Reinheit und stärker bevorzugt von mindestens etwa 90% Reinheit sortiert werden können.
Nach der Bindung an die DNA und der Anregung mit UV-Licht oder sichtbarem Licht fluoreszieren die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung. In einer Ausführungsform ist der Farbstoff einer, welcher nach der Anregung mit Ultraviolettstrahlung fluoresziert. Solche Farbstoffe schließen zum Beispiel Bisbenzimide wie Hoechst 33342 und Hoechst 33258 ein, welche jeweils im Handel von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) erhältlich sind. Zum Beispiel weist Hoechst 33342 vorteilhafterweise eine geringe Toxizität auf, ist ausreichend zellpermeabel, ist für DNA spezifisch, hat eine Fluoreszenz, welche nach der Bindung an DNA drastisch erhöht wird, und zeigt eine lineare Beziehung zwischen der Intensität der Fluoreszenz und der in einer bestimmten Zelle oder Probe vorhandenen Menge an DNA.
In einer anderen Ausführungsform ist der Farbstoff einer, welcher nach der Anregung mit sichtbarem Licht fluoresziert. Solche Farbstoffe schließen zum Beispiel den durch sichtbares Licht anregbaren Farbstoff SYBR-14, im Handel erhältlich von Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), und das Bisbenzimid-BODIPY^®-Konjugat 6{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboryl)-3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-yl]methylen}-2H-pyrrol-5-yl)-propanoyl]amino}-N-[3-(methyl{3-[({4-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1H,3'H-2,5'-bibenzimidazol-2'-yl]phenoxy}acetyl)amino]propyl}amino)propyl]hexanamid ("BBC"), beschrieben in WO 02/41906 , ein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Farbstoff durch Konjugation an eine andere Einheit modifiziert werden. Zum Beispiel kann gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung das Bisbenzimid (Bisbenzimidazol) durch die Addition eines Fluorophors modifiziert werden, woraus eine Fluoreszenzantwort durch das Konjugat auf eine Anregung durch sichtbares Licht resultiert. Vorzugsweise ähneln diese Konjugatmoleküle dem Bisbenzimidmolekül insofern, als die Bindung an DNA ihre Fluoreszenz verstärkt, und stellen eine Verbesserung gegenüber dem Bisbenzimidmolekül insofern dar, als die Konjugate als Antwort auf sichtbares Licht fluoreszieren.
Besonders bevorzugte Fluorophore sind durch sichtbares Licht anregbare Dipyrromethenbordifluorid-Derivate. Dipyrromethenbordifluorid-Farbstoffe sind membranpermeable, fluoreszierende Verbindungen, die von Molecular Probes, Inc., unter dem BODIPYO-Warenzeichen erhältlich sind, wie zum Beispiel in US-Patent Nr. 5,338,854 und 4,774,339 , hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben. Die Herstellung eines beispielhaften Bisbenzimid-Dipyrromethenbordifluorid-Konjugats ist in WO 02/41906 beschrieben. Andere Fluorophore der im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Klasse, wie zum Beispiel Fluoroscein und dessen Derivate, können ebenfalls verwendet werden.
Den Fachleuten ist bekannt, dass solche Fluorophor-modifizierten Farbstoffe dadurch hergestellt werden können, dass die Konjugat-DNA-Färbemittel mit ande ren geeigneten Eigenschaften modifiziert oder funktionalisiert werden, so dass sie eine ausreichende Zellpermeabilität innerhalb der gewünschten pH- und Temperaturbereiche aufweisen. Zum Beispiel können chemische Modifikationen vorgenommen werden, um die Zellpermeabilität geeignet zu erhöhen, indem (1) der pKa des DNA-Farbstoffes verändert wird, (2) eine ionische, die Permeabilität erhöhende Gruppe, entweder kationisch oder anionisch, gebunden über eine geeignete Verbindungsgruppe, angehängt wird, oder (3) nichtionische, die Permeabilität erhöhende Gruppen, wie Ethylenglykol- oder Polyethylenglykolgruppen, angehängt werden.
Innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung können das Bisbenzimid und das Fluorophor mit einer sichtbaren Wellenlänge auf viele verschiedene Arten miteinander verbunden werden. WO 02/41906 veranschaulicht einen Weg, wie sie verbunden werden können; jedoch können Fachleute jederzeit viele andere Fluorophore und Verknüpfungsmethoden bevorzugen. Hilfsmittel und Beratungsdienste, um bei einer solchen Auswahl zu helfen, sind für Fachleute ohne Weiteres von kommerziellen Einrichtungen auf dem Gebiet der Herstellung und des Vertriebs der Fluorophore, wie zum Beispiel Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), verfügbar.
Vorzugsweise wird die chemische Gruppe, welche das Bisbenzimid mit dem Fluorophor mit einer sichtbaren Wellenlänge verknüpft, derart gewählt, dass keine wesentlichen negativen Effekte bezüglich Lebensfähigkeit, Permeabilität, Stabilität, Aufnahme, Zelllagerung, Durchflusscytometrie, Formulierung oder Fluoreszenzeigenschaften hervorgerufen werden. Vorzugsweise wird die chemische Funktionalität der Verbindungsgruppe so gewählt, dass Eigenschaften wie Stabilität, Permeabilität, Lebensfähigkeit, Aufnahme, Zelllagerung, Durchflusscytometrie, Formulierung oder Fluoreszenzeigenschaften verbessert werden.
Die hierin offenbarten Verfahren können entweder auf Sperma, welches kurz zuvor der jeweiligen Quelle entnommen wurde (d.h. erhalten von Rindern, Schweinen oder einer anderen Säugetierquelle innerhalb von Minuten oder Stunden vor der Färbung), oder auf Sperma, welches kryokonserviert und anschließend aufgetaut worden ist, angewendet werden. In beiden Fällen können die Ergebnisse der cytometrischen Sortierung durch die Zugabe eines Quenchmittels zu der Färbelösung, um die Fluoreszenz von toten Spermien zu verringern, verbessert werden. Verschiedene Quenchmittel sowie die Verwendung davon sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, wie im Hinblick auf Propidiumiodid (Garner et al., Bio. of Reprod. 53 (1995), 276–284) und FD&C #40 (Johnson et al., Theriogenology 52 (1999), 1323–1341) demonstriert wird. FD&C #40 ist bei diesem Verfahren besonders nützlich, da es nicht toxisch ist, wenn es in niedrigen Konzentrationen verwendet wird. Desgleichen ist die Kombination von SYBR-14 und Propidiumiodid vorteilhaft, da dies das Sichtbarmachen und die Trennung von lebenden Spermazellen von sterbenden und toten Zellen ermöglicht. Demgemäß werden in einer Ausführungsform der Erfindung die Spermazellen mit sowohl einem Farbstoff als auch einem Quenchmittel kombiniert, um eine Färbemischung zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Spermazellen mit Hoechst 33342 und FD&C #40 kombiniert. In einer noch anderen Ausführungsform werden die Spermazellen mit SYBR-14 und Propidiumiodid kombiniert. Obwohl Quenchmittel bei der Sortierung von aufgetauten, kryokonservierten Spermaproben nützlich sind, ist es selbstverständlich, dass deren Verwendung nicht ausschließlich darauf begrenzt ist, und dass sie vorteilhafterweise für Proben von Sperma, welches kurz zuvor gewonnen wurde, verwendet werden können.
Zusätzlich zu einem Puffer können andere Additive in der Färbemischung enthalten sein, um die Lebensfähigkeit oder Motilität der Spermien zu erhöhen; diese Additive können als Teil der Spermaquelle, der Farbstoffquelle oder getrennt von der Färbemischung bereitgestellt werden. Solche Additive schließen Energiequellen, Antibiotika, Zusammensetzungen, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen regulieren, Motilitätsinhibitoren und Spermaplasma ein.
Im Allgemeinen bewirken Motilitätsinhibitoren, dass die Zellen in der Färbemischung Spermazellen in den Nebenhoden eines Säugetieres, wie zum Beispiel eines Bullens, durch das Simulieren der Flüssigkeitsumgebung in den Nebenhoden oder in dem Nebenhodenkanal des Säugetieres imitieren; wobei der Inhibitor oder die Inhibitoren zum Beispiel die Stoffwechselaktivität und/oder die Motilität der Spermien inhibiert(en). Der Inhibitor kann aus einer Reihe von Zusammensetzungen, welche einen hemmenden Effekt auf die Spermamotilität haben, gewählt sein. Zum Beispiel zeigen relativ hohe Konzentrationen an Kaliumionen in der Färbemischung die Tendenz, die Spermamotilität zu hemmen. In einer Ausführungsform wird daher bevorzugt, dass die Färbemischung eine Quelle für Kaliumionen enthält und dass die Kaliumkonzentration in der Färbemischung mindestens etwa 0,05 mol/l beträgt. Mehr bevorzugt beträgt die Kaliumkonzentration mindestens etwa 0,05 mol/l bis etwa 0,5 mol/l. Noch mehr bevorzugt beträgt die Kaliumkonzentration mindestens etwa 0,1 mol/l bis etwa 0,3 mol/l. Am meisten bevorzugt beträgt die Kaliumkonzentration mindestens etwa 0,173 mol/l. Solche Färbemischungen enthalten typischerweise, aber nicht notwendigerweise, auch eine Quelle für Natriumionen. Falls Natrium vorhanden ist, ist das Molverhältnis von Kalium zu Natrium jeweils größer als 1:1. Vorzugsweise beträgt das Molverhältnis von Kalium zu Natrium mindestens etwa 1,25:1. Noch mehr bevorzugt beträgt das Molverhältnis von Kalium zu Natrium mindestens etwa 1,5:1. Noch stärker bevorzugt beträgt das Molverhältnis von Kalium zu Natrium mindestens etwa 1,75:1. Noch mehr bevorzugt beträgt das Molverhältnis von Kalium zu Natrium mindestens etwa 1,78:1. In einer besonderen Ausführungsform beträgt das Molverhältnis von Kalium zu Natrium mindestens etwa 2:1.
Die Färbemischung kann weiterhin ein(e) Kohlendioxid-Ion oder -Quelle umfassen, welches(e) in der Lage ist, die Aufnahme von Kohlenhydrat herunterzuregulieren. In dieser Ausführungsform kann die Quelle für Kohlendioxid zum Beispiel ein oder mehrere Carbonate einschließen. In einer Ausführungsform umfasst die Färbemischung NaHCO₃ und KHCO₃, wodurch eine Quelle für Kalium- und Natriumionen sowie ein Partialdruck an Kohlendioxid bereitgestellt wird. Zum Beispiel umfasst in einer Ausführungsform die Färbemischung NaHCO₃ und KHCO₃ in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise NaHCO₃, KHCO₃ und C₆H₈O₇·H₂O in Wasser; als weiteres Beispiel kann die Färbemischung unter Verwendung eines hemmend wirkenden Puffers, umfassend 0,097 mol/l NaHCO₃, 0,173 mol/l KHCO₃ und 0,090 mol/l C₆H₈O₇·H₂O in Wasser, wie bei Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil. 6 (1963), 351–359, offenbart, gebildet werden. Die Spermazellen verbleiben im Allgemeinen im Ruhezustand, solange sie dem oder den Motilitätsinhibitor(en) ausgesetzt sind.
Beispiele einer solchen Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, schließen zum Beispiel Pyruvat, Vitamin K, Liponsäure, Glutathion, Flavine, Chinone, Superoxiddismutase (SOD) und SOD-Nachahmer ein. Falls in der Färbemischung eingeschlossen, kann eine solche Zusammensetzung in einer Konzentration vorliegen, welche ausreichend ist, um eine Schutzwirkung ohne nachteilige Beeinflussung der Spermiengesundheit hervorzurufen. Beispielhafte Konzentrationsbereiche schließen etwa 10 μM bis etwa 50 mM ein, abhängig von solchen Faktoren wie der jeweiligen verwendeten Zusammensetzung oder der Konzentration der Spermien in der Färbemischung. Zum Beispiel, falls Pyruvat in der Zusammensetzung eingeschlossen ist, kann es in der Färbemischung in einer Konzentration von etwa 0,5 μM bis etwa 50 mM, vorzugsweise etwa 1 mM bis etwa 40 mM, mehr bevorzugt etwa 2,5 mM bis etwa 25 mM, noch mehr bevorzugt etwa 10 mM bis etwa 20 mM, sogar noch mehr bevorzugt etwa 15 mM und am meisten bevorzugt etwa 10 mM vorliegen. Falls Vitamin K in der Zusammensetzung eingeschlossen ist, kann es in der Färbemischung in einer Konzentration von etwa 1 μM bis etwa 100 μM, vorzugsweise etwa 10 μM bis etwa 100 μM, mehr bevorzugt etwa 50 μM bis etwa 100 μM und am meisten bevorzugt etwa 100 μM vorliegen. Falls Liponsäure in der Zusammensetzung eingeschlossen ist, kann es in der Färbemischung in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM, vorzugsweise etwa 0,5 mM bis etwa 1 mM, mehr bevorzugt etwa 0,5 mM und am meisten bevorzugt etwa 1 mM vorliegen. Die Färbemischung kann irgendeine der oben aufgeführten Ausführungsformen der Zusammensetzung oder irgendeine Kombination davon in den vorstehend angegebenen Konzentrationen einschließen. Zum Beispiel kann die Färbemischung eine Zusammensetzung, die intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, umfassend Pyruvat in einer Konzentration von etwa 10 mM und Vitamin K in einer Konzentration von etwa 100 μM, umfassen. Alternativ kann die Färbemischung eine Zusammensetzung, umfassend Pyruvat in einer Konzentration von etwa 10 mM und Liponsäure in einer Konzentration von etwa 1 mM, umfassen. Ein noch anderes Beispiel schließt eine Färbemischung ein, umfassend eine Zusammensetzung, welche Pyruvat in einer Konzentration von etwa 10 mM, Vitamin K in einer Konzentration von etwa 100 μM und Liponsäure in einer Konzentration von etwa 1 mM umfasst.
Sobald die Spermien im Einklang mit der vorliegenden Erfindung gefärbt sind, können sie für die Sortierung vorbereitet und dann gemäß irgendeinem bekannten Mittel, welches eine Trennung basierend auf der Fluoreszenz ermöglicht, sortiert werden. Gebräuchliche und gut bekannte Methoden schließen Durchflusscytometrie-Systeme ein, wie solche, welche in US-Patent Nr. 5,135,759 , 5,985,216 , 6,071,689 , 6,149,867 und 6,263,745 , sowie in WO 99/33956 und WO 01/37655 erläutert und beschrieben sind. In einer Ausführungsform können die gefärbten Zellen zum Beispiel mit Scheidenflüssigkeit kombiniert oder auf eine andere Weise für die Sortierung vorbereitet werden, während sie bei einer erhöhten Temperatur gemäß der vorliegenden Erfindung gehalten werden. In einer anderen Ausführungsform können die gefärbten Zellen zum Beispiel von der erhöhten Temperatur, bei welcher die Farbstoffaufnahme erfolgt, auf eine niedrigere Temperatur, z.B. Raumtemperatur, bei welcher die späteren Verarbeitungsschritte durchgeführt werden, heruntergekühlt werden, um in dieser Ausführungsform die Voraussetzung für den gewünschten Trennungsgrad zu schaffen. Jedoch wird im Allgemeinen bevorzugt, dass bei Temperaturen, welche niedriger als die erhöhten Temperaturen gemäß der vorliegenden Erfindung sind, keine Farbstoffaufnahme in einem wesentlichen Ausmaß erfolgt.
Beispiele
Beispiel 1

Bullensamen wurde von einem geschlechtsreifen Bullen unter Verwendung einer künstlichen Vagina gesammelt, und die Probe wurde bei 37°C in einem Behälter bei kontrollierter Temperatur in die Färbeeinrichtung transportiert. Bei der Annahme wurde der Samen bezüglich Konzentration, visuelle Motilität, pH und Membranintegrität untersucht, wobei die Motilität und die progressive Motilität mit Hilfe des Hamilton-Thorn Motilität-Analysegeräts gemäß einem Standard und gut bekannten Verfahren (Farrell et al., Theriogenology 49 (4), 871–879 (März 1998)), bestimmt wurden. Ausgehend von der Samenkonzentration wurden 8 × 5 ml-Spermasuspensionen hergestellt. Vier 5 ml-Proben von 150 × 10⁶ Spermien/ml wurden durch Suspendieren eines Aliquots des Samens in TCA-Puffer, pH 7,35, bei 41°C hergestellt. Vier weitere 5 ml-Proben von 150 × 10⁶ Spermien/ml wurden durch Suspendieren eines Aliquots des Samens in TCA-Puffer, pH 7,35, bei 39°C hergestellt. Zu den Spermasuspensionen wurden Aliquots einer 10 mM Hoechst-Lösung in Wasser zugegeben, um die in Tabelle 1 angegebenen Farbstoffkonzentrationen ("Zielkonzentration an Hoechst (μM)") zu erhalten. Die Spermasuspensionen wurden bei 41°C bzw. 39°C in einem Wasserbad aufrechterhalten. Die Spermasuspensionen wurden durch Entnahme eines Aliquots von 500 μl aus den Spermasuspension-Proben und Analyse mittels Durchflusscytometrie, um die Aufnahme des Farbstoffes zu messen (d.h. um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen) untersucht. Tabelle 1

Röhrchen #	Temperatur ₍ _°C ₎	Zielkonzentration an Hoechst (μM)	μL 10mM Hoechst 33342 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
1	39°C	20μM	10μL
2	41°C	20μM	10μL
3	39°C	30μM	15μL
4	41°C	30μM	15μL
5	39°C	57μM	28.5μL
6	41°C	57μM	28.5μL
7	39°C	85μM	42.5μL
8	41°C	85μM	42.5μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 1A–1D zusammengefasst.
Beispiel 2

Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der Farbstoffkonzentrationen von Hoechst 33342, welche zum Färben der Spermien verwendet werden, erhalten und vorbereitet. Tabelle 2 zeigt die in Beispiel 2 verwendeten Konzentrationen. Die Suspensionen wurden bei 41°C bzw. 39°C in einem Wasserbad aufrechterhalten. Probenaliquots von 500 μl wurden regelmäßig aus jeder Probe entnommen und mittels Durchflusscytometrie analysiert, um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen. Tabelle 2

Röhrchen #	Temperatur (°C)	Zielkonzentration an Hoechst ₍ _μM ₎	μL 10mM Hoechst 33342 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
1	39°C	20μM	10μL
2	41°C	20μM	10μL
3	39°C	30μM	15μL
4	41°C	30μM	15μL
5	39°C	40μM	20μL
6	41°C	40μM	20μL,
7	39°C	60μM	30μL
8	41°C	60μM	30μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 2A–2D zusammengefasst.
Beispiel 3

Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der Farbstoffkonzentrationen von Hoechst 33342, welche zum Färben der Spermien verwendet werden, und der Färbetemperaturen, erhalten, vorbereitet und gefärbt. Tabelle 3 zeigt die in Beispiel 3 verwendeten Konzentrationen und Temperaturen. Tabelle 3

Röhrchen #	Temperatur (°C)	Zielkonzentration an Hoechst (μM)	μL 10mM Hoechst 33342 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
1	39°C	60μM	30μL
2	43°C	60μM	30μL
3	39°C	40μM	20μL
4	43°C	40μM	20μL
5	39°C	30μM	15μL
6	43°C	30μM	15μL
7	39°C	20μM	10μL
8	43°C	20μM	10μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 3A–3D zusammengefasst.
Beispiel 4

Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der Farbstoffkonzentrationen von Hoechst 33342, welche zum Färben der Spermien verwendet werden, und der Färbetemperaturen, erhalten, vorbereitet, gefärbt und analysiert. Tabelle 4 zeigt die in Beispiel 4 verwendeten Konzentrationen und Temperaturen. Tabelle 4

Röhrchen 4	Temperatur (°C)	Zielkonzentration an Hoechst (μM)	μL 10mM Hoechst 33342 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
1	39°C	80μM	40μL
2	43°C	80μM	40μL
3	39°C	100μM	50μL
4	43°C	100μM	50μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 4A und 4B zusammengefasst.
Beispiel 5

Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der Farbstoffkonzentrationen von Hoechst 33342, welche zum Färben der Spermien verwendet werden, und der Färbetemperaturen, erhalten, vorbereitet, gefärbt und analysiert. Tabelle 5 zeigt die in Beispiel 5 verwendeten Konzentrationen und Temperaturen. Tabelle 5

Röhrchen #	Temperatur (°C)	Zielkonzentration an Hoechst (μM)	μL 10mM Hoechst 33342 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
5	39°C	80μM	40μL
6	45°C	80μM	40μL
7	39°C	100μM	50μL
8	45°C	100μM	50μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 5A und 5B zusammengefasst.
Beispiel 6

Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der Farbstoffkonzentrationen von Hoechst 33342, welche zum Färben der Spermien verwendet werden, und der Färbetemperaturen, erhalten, vorbereitet, gefärbt und analysiert. Tabelle 6 zeigt die in Beispiel 6 verwendeten Konzentrationen und Temperaturen. Tabelle 6

Röhrchen #	Temperatur (°C)	Zielkonzentration an Hoechst (μM)	μL 10mM Hoechst 33342 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
1	39°C	60μM	30μL
2	47°C	60μM	30μL
3	39°C	150μM	75μL
4	43°C	150μM	75μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 6A und 6B zusammengefasst.
Beispiel 7
Bullensamen wurde von einem geschlechtsreifen Bullen unter Verwendung einer künstlichen Vagina gesammelt, und die Probe wurde bei 25°C in einem Be hälter bei kontrollierter Temperatur in die Färbeeinrichtung transportiert. Bei der Annahme wurde der Samen mittels bekannter Analyseverfahren bezüglich Konzentration, visuelle Motilität, IVOS-Motilität und progressive Motilität, sowie pH und Membranintegrität untersucht. Ausgehend von der Samenkonzentration wurden 4 × 1 ml-Spermasuspensionen von 150 × 10⁶ Spermien/ml hergestellt. Zwei 1 ml-Proben von 150 × 10⁶ Spermien/ml wurden durch Suspendieren eines Aliquots des Samens bei 41°C in TCA-Puffer bei pH 7,35 hergestellt. Zwei weitere 1 ml-Proben von 150 × 10⁶ Spermien/ml wurden durch Suspendieren eines Aliquots des Samens bei 43°C in TCA-Puffer bei pH 7,35 hergestellt. Zu einer Probe einer jeden Temperatur wurden 6 μl einer 10 mM Hoechst-Lösung zugegeben, um eine Farbstoffkonzentrationen von 60 μM zu erhalten. Die Suspensionen wurden bei 41°C bzw. 43°C in einem Wasserbad aufrechterhalten. Regelmäßig wurden 50 μl-Aliquots aus den Spermasuspension-Proben entnommen und in ein konisches Röhrchen überfährt, und 200 μl TCA-Puffer mit der entsprechenden Temperatur wurden zugegeben, um eine endgültige Spermasuspension-Konzentration von 30 × 10⁶ Spermien/ml zu erhalten. Die Spermasuspension-Proben mit 30 × 10⁶ Spermien/ml wurden umgehend mittels IVOS analysiert. Die IVOS-Ergebnisse für % Motilität und % Progressive Motilität (Prog. Mot.) sind in den 7A und 7B dargestellt.
Beispiel 8
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 60 μM gefärbt und bei einer Temperatur von 39°C und 45°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 8A und 8B dargestellt.
Beispiel 9
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 80 μM gefärbt und bei einer Temperatur von 41°C, 43°C und 45°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 9A–9C dargestellt.
Beispiel 10
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 100 μM gefärbt und bei einer Temperatur von 41°C, 43°C und 45°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 10A–10C dargestellt.
Beispiel 11
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 100 μM gefärbt und bei einer Temperatur von 47°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in 11 dargestellt.
Beispiel 12
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 100 μM gefärbt und bei einer Temperatur von 49°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in 12 dargestellt.
Beispiel 13
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 125 μM und 150 μM gefärbt und jeweils in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 43°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 13A und 13B dargestellt.
Beispiel 14
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 200 μM und 250 μM gefärbt und jeweils in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 43°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 14A und 14B dargestellt.
Beispiel 15
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 125 μM und 150 μM gefärbt und jeweils in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 45°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 15A und 15B dargestellt.
Beispiel 16
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentration von 200 μM, 250 μM und 300 μM gefärbt und jeweils in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 45°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 16A–16C dargestellt.
Beispiel 17
Bullensamen wurde wie in Beispiel 7 gesammelt, analysiert, in Puffer suspendiert, mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels IVOS analysiert, mit den folgenden Ausnahmen. Die Proben wurden bei einer Konzentrationsrate von 300 μM, 350 μM und 400 μM gefärbt und jeweils in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 43°C gehalten. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in den 17A–17C dargestellt.
Beispiel 18
Bullensamen wurde von einem geschlechtsreifen Bullen unter Verwendung einer künstlichen Vagina gesammelt, und die Probe wurde bei 25°C in einem Behälter bei kontrollierter Temperatur in die Färbeeinrichtung transportiert. Bei der Annahme wurde der Samen mittels bekannter Analyseverfahren bezüglich Konzentration, visuelle Motilität, IVOS-Motilität und progressive Motilität, sowie pH und Membranintegrität untersucht. Ausgehend von der Samenkonzentration wurden 4 × 1 ml-Spermasuspensionen von 150 × 10⁶ Spermien/ml durch Suspendieren von Aliquots des Samens bei 43°C in TCA-Puffer bei pH 7,35 hergestellt. Zu drei Proben davon wurde eine SYBR-14-Farbstofflösung zugegeben, um eine Farbstoffkonzentration von 0,6 μM, 6 μM bzw. 60 μM zu erhalten. Die Suspensionen wurden bei 43°C in einem Wasserbad aufrechterhalten. Regelmäßig wurden Probenaliquots von 50 μl in ein konisches Röhrchen überführt, und 200 μl TCA-Puffer mit der entsprechenden Temperatur wurden zugegeben, um eine endgültige Spermakonzentration von 30 × 10⁶ Spermien/ml zu erhalten. Die Proben wurden unmittelbar mittels IVOS analysiert. Die IVOS-Ergebnisse für % Motilität und % Progressive Motilität (Prog. Mot.) sind in den 18A–18C dargestellt.
Beispiel 19

Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, mit Ausnahme der verwendeten Farbstoffkonzentrationen, erhalten, vorbereitet, gefärbt und analysiert. BBC in einer Konzentration von 100 μM und SYBR-14 in einer Konzentration von 6 μM wurden verwendet, um die Spermasuspensionen zu färben, und die Temperaturen wurden in einem Wasserbad bei @ 45°C gehalten. Tabelle 7 zeigt eine Zusammenfassung der in Beispiel 19 verwendeten Konzentrationen und Temperaturen. Tabelle 7

Röhrchen #	Temperatur (°c)	Zielkonzentration an SYBR-14	μL 1mM SYBR-14 zugesetzt zu 5 ml Spermasuspension
1	39°C	6μM	30μL
2	45°C	6μM	30μL
		BBC	μL 10mM BBC
3	39°C	100μM	50μL
4	45°C	100μM	50μL

Die Ergebnisse der Analyse sind in den 19A und 19B zusammengefasst.
Beispiel 20
Bullensamen wurde von einem geschlechtsreifen Bullen unter Verwendung einer künstlichen Vagina gesammelt, und die Probe wurde für den Transport bei 25°C in einem Behälter bei kontrollierter Temperatur in die Färbeeinrichtung in 2 Teilen Carbonatpuffer verdünnt. Bei der Annahme wurde der Samen bezüglich Konzentration, Motilität und progressive Motilität mit Hilfe des Hamilton-Thorn Motilität-Analysegeräts (IVOS) gemäß einem Standard und gut bekannten Verfahren (Farrell et al., Theriogenology 49 (4), 871–879 (März 1998)), untersucht. Ausgehend von der Samenkonzentration wurde eine 1 ml-Suspension von 150 × 10⁶ Spermien/ml hergestellt, indem ein Aliquot der Carbonat-Spermasuspension entnommen, die Spermasuspension bei 500 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet bei 41°C in TCA-Puffer, pH 7,3, resuspendiert wurde. Eine weitere 1 ml-Probe von 150 × 10⁶ Spermien/ml wurde durch Suspendieren eines Aliquots des Samens bei 41°C in TCA-Puffer, enthaltend 10 mM Pyruvat, bei pH 7,3 hergestellt. Zu den Spermasuspensionen wurden Aliquots einer 10 mM Hoechst-Lösung in Wasser zugegeben, um eine Farbstoffkonzentrationen von 400 μM Hoechst zu erhalten. Die Spermasuspensionen wurden für die Dauer des Färbezeitraums bei 41°C in einem Wasserbad aufrechterhalten. Die Spermasuspensionen wurden durch Entnahme eines 50 μl-Aliquots aus der gefärbten Spermasuspension, Zugabe von 200 μl desselben Puffers bei der gleichen Temperatur und Analyse mittels IVOS, um die % Progressive Motilität (% Prog. Mot.) zu messen, untersucht. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in 20 zusammengefasst.
Beispiel 21
Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 20 erhalten und vorbereitet, mit den folgenden Ausnahmen. Die Puffer, welche zum Suspendieren der Spermien für die Färbung und die IVOS-Analyse verwendet wurden, waren TCA und TCA, enthaltend 10 μM Vitamin K. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in 21 zusammengefasst.
Beispiel 22
Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 20 erhalten und vorbereitet, mit den folgenden Ausnahmen. Die Puffer, welche zum Suspendieren der Spermien für die Färbung und die IVOS-Analyse verwendet wurden, waren TCA und TCA, enthaltend 100 μM Vitamin K. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in 22 zusammengefasst.
Beispiel 23
Spermaproben wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 20 erhalten und vorbereitet, mit den folgenden Ausnahmen. Die Puffer, welche zum Suspendieren der Spermien für die Färbung und die IVOS-Analyse verwendet wurden, waren TCA und TCA, enthaltend 1 mM Liponsäure. Die Ergebnisse der IVOS-Analyse sind in 23 zusammengefasst.
Beispiel 24
Bullensamen wurde von einem geschlechtsreifen Bullen unter Verwendung einer künstlichen Vagina gesammelt und bei 25°C in einem Behälter bei kontrollierter Temperatur in die Färbeeinrichtung transportiert. Bei der Annahme wurde der Samen bezüglich Konzentration, sowie Motilität und progressive Motilität mit Hilfe des Hamilton-Thorn Motilität-Analysegeräts (IVOS) gemäß einem Standard und gut bekannten Verfahren (Farrell et al., Theriogenology 49 (4), 871–879 (März 1998)), untersucht.

Ausgehend von der Samenkonzentration wurden mehrere Röhrchen mit Suspensionen von 450 × 10⁶ Spermien/ml durch Suspendieren des Samens in entweder einem TCA-Puffer oder einem Inhibitor auf Carbonatbasis hergestellt. Die nachstehende Tabelle II veranschaulicht die verwendeten Zusammensetzungen und Färbebedingungen. Tabelle II

Probenname	Puffer	pH	Konz. (μM) Hoesht	Temperatur (°C)
10mM Pyr. TCA	10 mM Pyruvat in TCA	7.3	300μM	41°C
Carbonat 6.2	Inhibitor auf Carbonat – Basis, pH 6,2	6.2	300μM	41°C
Carbonat 7.3	Inhibitor auf Carbonat –Basis pH 7.3	7.3	300μM	41°C

,

Zu den Spermasuspensionen wurden Aliquots einer 10 mM Hoechst-Lösung in Wasser zugegeben, um eine Konzentration von 300 μM Hoechst zu erhalten. Die Spermasuspensionen wurden für 30 Minuten bei 41°C in einem Wasserbad aufrechterhalten und dann mit 10 mM Pyruvat in TCA oder einem Inhibitor auf Carbonatbasis, wie in jeder Figur spezifisch angegeben, bei pH 6,2 auf eine Konzentration von 150 × 106 Spermien/ml verdünnt, welche für eine Sortierung typisch ist. Die Spermasuspensionen wurden analysiert, indem ein 50 μl-Aliquot aus der gefärbten und verdünnten Spermasuspension zu dem in jeder Figur angegebenen Zeitraum entnommen wurde, 200 μl 10 mM Pyruvat bei 25°C in TCA bei pH 7,3 zugegeben wurden, um die Aufhebung des Ruhezustands zu initiieren, eine Äquilibrierungszeit von mindestens 5 Minuten verstreichen gelassen wurde, die Probe mittels IVOS analysiert wurde, um die prozentuale progressive Motilität zu messen. Vergleiche der mittels IVOS gemessenen prozentualen progressiven Motilitäten sind in den 24–26 gezeigt.

Claims

Verfahren zum Färben von Spermazellen, welches Verfahren das Bilden einer Färbemischung, enthaltend intakte lebensfähige Spermazellen und einen DNA-selektiven Fluoreszenzfarbstoff, und das Aussetzen der Färbemischung einer Temperatur oberhalb von 40°C, ohne wesentliche Beeinflussung der Lebensfähigkeit der gefärbten Zellen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Farbstoff ein durch UV-Licht anregbarer oder ein durch sichtbares Licht anregbarer Farbstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Farbstoff gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Bisbenzimid, SYBR-14 und einem Konjugat, einem Analogon oder einem Derivat davon.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Farbstoff gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14 und 6{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboryl)-3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-yl]methylen}-2H-pyrrol-5-yl)propanoyl]amino}-N-[3-(methyl{3-[({4-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1H,3'H-2,5'-bibenzimidazol-2'-y1]-phenoxy}acetyl)amino]propyl}amino)propyl]hexanamid.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Färbemischung der Temperatur für einen Zeitraum ausgesetzt wird, welcher ausreichend ist, um zu ermöglichen, dass der Farbstoff an die DNA bindet, so dass X- und Y-tragende Spermazellen basierend auf der Fluoreszenz unterschiedlich sortiert werden können.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Zeitraum 1 Minute bis 160 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Zeitraum weniger als 60 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Zeitraum weniger als 30 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Farbstoffkonzentration 0,1 μM bis 1000 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Farbstoffkonzentration 100 μM bis 600 μM beträgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Färbemischung einer Temperatur oberhalb von 41°C ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Färbemischung einer Temperatur zwischen 41°C und 50°C ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Färbemischung einer Temperatur zwischen 41°C und 47°C ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Färbemischung einer Temperatur zwischen 42°C und 45°C ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Färbemischung einer Temperatur von 43°C ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens einer Färbemischung das Kombinieren eines Puffers mit den Spermazellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Puffer mit den Spermazellen kombiniert wird, um eine Spermasuspension zu bilden, und die Spermasuspension mit einem DNA-selektiven Fluoreszenzfarbstoff kombiniert wird, um die Färbemischung zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens einer Färbemischung das Kombinieren eines Puffers mit einem DNA-selektiven Fluoreszenzfarbstoff, um eine gepufferte Farbstoff-Lösung zu bilden, und das Kombinieren der gepufferten Farbstoff-Lösung mit den Spermazellen, um die Färbemischung zu bilden, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin den Schritt des Kombinierens eines Quenchmittels mit der Färbemischung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Quenchmittel gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus FD&C #40 und Propidiumiodid.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Quenchmittel FD&C #40 ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Quenchmittel FD&C #40 ist und der Farbstoff Hoechst 33342 ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Quenchmittel Propidiumiodid ist und der Farbstoff SYBR-14 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Färbemischung weiterhin einen Motilitätsinhibitor enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Bildens einer Färbemischung das Kombinieren eines Motilitätsinhibitors mit den Spermazellen, um eine inhibierte Spermasuspension zu bilden, und das Kombinieren der inhibierten Spermasuspension mit einem DNA-selektiven Fluoreszenzfarbstoff, um die Färbemischung zu bilden, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Motilitätsinhibitor einen Motilitätsinhibitor auf Carbonat-Basis umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Motilitätsinhibitor auf Carbonat-Basis NaHCO₃, KHCO₃ und C₆H₈O₇·H₂O umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Motilitätsinhibitor auf Carbonat-Basis 0,097 Mol/l NaHCO₃, 0,173 Mol/l KHCO₃ und 0,090 Mol/l C₆H₈O₇·H₂O in Wasser umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Färbemischung weiterhin eine Zusammensetzung enthält, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvat, Vitamin K, Liponsäure, Glutathion, Flavinen, Chinonen, Superoxiddismutase und Superoxiddismutase-Nachahmern.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvat, Vitamin K und Liponsäure.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Pyruvat in einer Konzentration von 0,5 μM bis 50 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Pyruvat in einer Konzentration von 10 mM bis 15 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Pyruvat in einer Konzentration von etwa 10 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Vitamin K in einer Konzentration von 1 μM bis 100 μM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Vitamin K in einer Konzentration von etwa 100 μM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Liponsäure in einer Konzentration von 0,1 mM bis 1,0 mM umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Zusammensetzung, welche intrazelluläre oder extrazelluläre Oxidations/Reduktionsreaktionen reguliert, Liponsäure in einer Konzentration von etwa 1,0 mM umfasst.