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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen zum Verabreichen
bzw. Transport von biologisch aktiven Wirkstoffen zu einem Ziel.
Diese Verbindungen eignen sich gut zum Bilden von nicht-kovalenten Mischungen
mit Wirkstoffen für
orale, intrakolische, pulmonale oder andere Wege der Verabreichung
an Tiere. Verfahren zur Herstellung und Verabreichung von solchen
Zusammensetzungen werden ebenfalls offenbart.
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Herkömmliche
Mittel zum Verabreichen von Wirkstoffen sind häufig durch biologische, chemische
und physikalische Schranken stark eingeschränkt. Typischerweise werden
diese Schranken durch die Umgebung, durch welche die Verabreichung
erfolgt, die Umgebung des Ziels für die Verabreichung und/oder
das Ziel selbst auferlegt. Biologisch und chemisch aktive Wirkstoffe
sind für
solche Schranken besonders anfällig.
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Bei
der Verabreichung von biologisch aktiven und chemisch aktiven pharmakologischen
und therapeutischen Mitteln an Tiere werden Schranken vom Körper auferlegt.
Beispiele für
physikalische Schranken sind die Haut, Lipiddoppelschichten und
verschiedene Organmembranen, welche für bestimmte Wirkstoffe relativ undurchlässig sind,
aber vor dem Erreichen eines Ziels, wie etwa des Kreislaufsystems, überquert
werden müssen.
Zu chemischen Schranken gehören
pH-Schwankungen im Gastrointestinaltrakt (GI-Trakt) und abbauende
Enzyme, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
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Diese
Schranken sind von besonderer Bedeutung bei der Planung von oralen
Verabreichungssystemen. Die orale Verabreichung von vielen biologisch
oder chemisch aktiven Wirkstoffen wäre der Weg der Wahl zur Verabreichung
an Tiere, wenn es nicht biologische, chemische und physikalische
Schranken gäbe.
Zu den zahlreichen Wirkstoffen, welche sich typischerweise nicht
für eine
orale Verabreichung eignen, gehören
biologisch oder chemisch aktive Peptide, wie Calcitonin und Insulin;
Polysaccharide und insbesondere Mucopolysaccharide, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Heparin; Heparinoide; Antibiotika; und andere organische Substanzen.
Diese Wirkstoffe werden im Gastrointestinaltrakt durch Säurehydrolyse,
Enzyme und dergleichen rasch unwirksam gemacht oder zerstört. Außerdem kann
die Größe und Struktur
von makromolekularen Arzneimitteln eine Absorption verhindern.
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Frühere Verfahren
zum oralen Verabreichen von empfindlichen pharmakologischen Wirkstoffen
beruhten auf der gleichzeitigen Verabreichung (Co-Verabreichung)
von Adjuvanzien (z. B. Resorcinole und nicht-ionischen oberflächenaktiven
Stoffen wie Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylenether)
zum künstlichen
Erhöhen
der Permeabilität
der Darmwände
sowie der gleichzeitigen Verabreichung von Enzyminhibitoren (z.
B. Pankreas-Trypsin-Inhibitoren,
Diisopropylfluorphosphat (DFF) und Trasylol) zum Hemmen des enzymatischen
Abbaus. Liposome sind ebenfalls als Arzneimittelverabreichungssysteme
für Insulin
und Heparin beschrieben worden. Eine verbreitete Verwendung solcher
Arzneimitttelverabreichungssysteme ist jedoch ausgeschlossen, weil:
(1) die Systeme toxische Mengen von Adjuvanzien oder Inhibitoren
erfordern; (2) geeignetes Ladegut mit niedrigem Molekulargewicht,
d. h. Wirkstoffe, nicht zur Verfügung
stehen; (3) die Systeme eine geringe Stabilität und eine unzureichende Lagerbeständigkeit
aufweisen; (4) die Systeme schwierig herzustellen sind; (5) die
Systeme nicht in der Lage sind, den Wirkstoff (das Ladegut) zu schützen; (6)
die Systeme den Wirkstoff nachteilig verändern; oder (7) die Systeme
nicht in der Lage sind, die Absorption des Wirkstoffes zuzulassen
oder zu fördern.
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In
letzter Zeit wurden Proteinoid-Mikrokügelchen zum Verabreichen von
Pharmazeutika verwendet. Siehe z. B.
US
5,401,516 ,
US 5,443,841 und
US RE 35,862 . Außerdem wurden
bestimmte modifizierte Aminosäuren
zum Verabreichen von Pharmazeutika verwendet. Siehe z. B.
US 5,629,020 ;
US 5,643,957 ;
US 5,766,633 ;
US 5,776,888 ; und
US 5,866,536 .
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WO 96/30036 offenbart Verbindungen
und Zusammensetzungen zum Verabreichen von Wirkstoffen, wie etwa
die folgende Verbindung:
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WO 98/34632 offenbart Verbindungen
und Zusammensetzungen zum Verabreichen von Wirkstoffen, wie etwa
die folgende Verbindung:
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Die
der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist es, ein
einfaches, kostengünstiges
Verabreichungssystem bereitzustellen, welches leicht hergestellt
wird und welches einen breiten Bereich von Wirkstoffen auf verschiedenen
Wegen verabreichen kann.
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch eine Verbindung der Formel
oder
ein Salz davon.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist die Erfindung auf eine Zusammensetzung gerichtet, die wenigstens
einen biologisch aktiven Wirkstoff und wenigstens eines von der
Verbindung 1 oder einem Salz davon umfasst. Verfahren zur Herstellung
und Verabreichung von solchen Zusammensetzungen werden ebenfalls
bereitgestellt.
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Ebenfalls
bereitgestellt werden Dosierungseinheitsformen, welche die Zusammensetzungen
umfassen. Die Dosierungseinheitsform kann in Form eines Feststoffs
(wie etwa eine Tablette, eine Kapsel oder ein Partikel wie etwa
ein Pulver oder eine Portionspackung) oder einer Flüssigkeit
vorliegen.
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Verfahren
zum Verabreichen eines biologisch aktiven Wirkstoffs an ein Tier,
welches diesen Wirkstoff benötigt,
insbesondere auf den oralen, intrakolischen oder pulmonalen Wegen,
mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren
zur Behandlung unter Verwendung solcher Zusammensetzungen werden
ebenfalls bereitgestellt. Ein Verfahren zum Behandeln einer Erkrankung
bei einem Tier, welches das Verabreichen einer Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung an das Tier, welches diese benötigt, umfasst,
wird bereitgestellt.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Verbindungen
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Die
Verbindungen können
in Form der Carbonsäure
und/oder ihrer Salze vorliegen. Zu den Salzen gehören organische
und anorganische Salze, z. B. Salze von Alkalimetallen, wie Natrium,
Kalium und Lithium; Salze von Erdalkalimetallen, wie Magnesium,
Calcium oder Barium; Ammoniumsalze; basische Aminosäuren, wie
Lysin oder Arginin; und organische Amine, wie Dimethylamin oder
Pyridin, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise sind die
Salze Natriumsalze. Die Salze können
ein- oder mehrwertige Salze sein, wie etwa Mononatriumsalze und
Dinatriumsalze. Die Salze können
auch Solvate sein, einschließlich
Ethanolsolvate.
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Außerdem können Polyaminosäuren und
Peptide, die eine oder mehrere von diesen Verbindungen umfassen,
verwendet werden.
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Eine
Aminosäure
ist eine beliebige Carbonsäure
mit wenigstens einer freien Amingruppe und schließt in der
Natur vorkommende und synthetische Aminosäuren ein. Polyaminosäuren sind
entweder Peptide (welche zwei oder mehr durch eine Peptidbindung
verbundene Aminosäuren
sind) oder sind zwei oder mehr Aminosäuren, die durch eine Bindung
verbunden sind, welche durch andere Gruppen gebildet wird, welche
z. B. durch eine Ester- oder eine Anhydridbindung verbunden sein
können.
Die Länge
der Peptide kann von Dipeptiden mit zwei Aminosäuren bis zu Polypeptiden mit
mehreren hundert Aminosäuren
variieren. Eine oder mehrere der Aminosäuren oder Peptideinheiten können acyliert
oder sulfoniert sein.
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Die
in dieser Anmeldung beschriebenen Verbindungen können von Aminosäuren abgeleitet
sein und können
durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, auf der Grundlage
der vorliegenden Beschreibung und der in
WO 96/30036 ,
WO 97/36480 ,
US 5,643,957 und
US 5,650,386 beschriebenen Verfahren
leicht aus Aminosäuren
hergestellt werden. Zum Beispiel können die Verbindungen hergestellt
werden durch Umsetzen der einzelnen Aminosäure mit dem passenden Acylierungsmittel
oder aminmodifizierenden Mittel, welches mit einer in der Aminosäure vorhandenen
freien Aminoeinheit unter Bildung von Amiden reagiert. Schutzgruppen können verwendet
werden, um unerwünschte
Nebenreaktionen zu vermeiden, wie dem Fachmann bekannt ist. Im Hinblick
auf Schutzgruppen wird auf T. W. Greene, Protecting Groups in Organic
Synthesis, Wiley, New York (1981) verwiesen, wobei dessen Offenbarung
hiermit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen ist.
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Salze
der Verbindung der vorliegenden Erfindung können durch im Stand der Technik
bekannte Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können Natriumsalze
durch Auflösen
der Verbindung in Ethanol und Zugeben von wässrigem Natriumhydroxid hergestellt
werden.
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Die
Verbindung kann durch Umkristallisation oder durch Fraktionierung
an einem oder mehreren festen chromatografischen Trägern, allein
oder in Tandemanordnung verbunden, gereinigt werden. Zu geeigneten Lösungsmittelsystemen
für die
Umkristallisation gehören
Acetonitril, Methanol und Tetrahydrofuran, sie sind aber nicht darauf
beschränkt.
Die Fraktionierung kann an einem geeigneten chromatografischen Träger, wie Aluminiumoxid,
unter Verwendung von Methanol/n-Propanol-Gemischen als die mobile
Phase; durch Umkehrphasenchromatografie unter Verwendung von Trifluoressigsäure/Acetonitril-Gemischen
als die mobile Phase; und durch Ionenaustauschchromatografie unter
Verwendung von Wasser oder einem geeigneten Puffer als die mobile
Phase durchgeführt
werden. Wenn eine Anionenaustauschchromatografie durchgeführt wird,
wird vorzugsweise ein 0–500
mM Natriumchloridgradient eingesetzt.
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Gemäß einer
Ausführungsform
wird die Verbindung in ihrer wasserfreien Form eingesetzt.
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Wirkstoffe
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Wirkstoffe,
die sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, sind
biologisch aktive Wirkstoffe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf
Pestizide, pharmakologische Wirkstoffe und therapeutische Wirkstoffe.
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Zu
biologisch aktiven Wirkstoffen, die sich zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung eignen, gehören
z. B. Proteine; Polypeptide; Peptide; Hormone; Polysaccharide und
insbesondere Mischungen von Mucopolysacchariden; Kohlenhydrate;
Lipide; andere organische Verbindungen; und insbesondere Verbindungen,
welche von selbst nicht durch die gastrointestinale Schleimhaut
hindurchgehen (oder von denen nur ein Bruchteil der verabreichten
Dosis hindurchgeht) und/oder für
eine chemische Spaltung durch Säuren
und Enzyme im Gastrointestinaltrakt anfällig sind; oder eine beliebige
Kombination davon, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
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Zu
weiteren Beispielen gehören
die Folgenden, einschließlich
synthetischer, natürlicher
oder rekombinanter Quellen davon: Wachstumshormone, die menschliche
Wachstumshormone (hGH), rekombinante menschliche Wachstumshormone
(rhGH), Rinderwachstumshormone und Schweinewachstumshormone bzw. schweineartige
Wachstumshormone einschließen;
Wachstumshormon freisetzende Hormone; Interferone, einschließlich α, β und γ Interleukin-1; Interleukin-2;
Insulin, das Schweineinsulin bzw. schweineartiges Insulin, Rinderinsulin,
menschliches Insulin und menschliches rekombinantes Insulin einschließt, das
gegebenen falls Gegenionen, einschließlich Natrium, Zink, Calcium
und Ammonium aufweist; insulinartiger Wachstumsfaktor, einschließlich IGF-1;
Heparin, das unfraktioniertes Heparin, Heparinoide, Dermatane, Chondroitine,
Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, Heparin mit sehr niedrigem
Molekulargewicht und Heparin mit ultraniedrigem Molekulargewicht
einschließt;
Calcitonin, das Lachs-Calcitonin, Aal-Calcitonin, Schweine-Calcitonin
und menschliches Calcitonin einschließt; Erythropoietin; atrialer
natriuretischer Faktor; Antigene, monoklonale Antikörper; Somatostatin;
Protease-Inhibitoren; Adrenocorticotropin, Gonadotropinfreisetzendes
Hormon; Oxytocin; luteinisierendes Hormon-freisetzendes Hormon;
Follikelstimulierendes Hormon; Glucocerebrosidase; Thrombopoietin;
Filgrastim; Prostaglandine; Cyclosporin; Vasopressin; Cromolyn-Natrium
(Natrium- oder Dinatrium-Chromoglycinsäure); Vancomycin; Desferrioxamin
(DFO); Parathyroidhormon (PTH), einschließlich seiner Fragmente; antimikrobielle
Substanzen, einschließlich
Antimykotika; Vitamine, Analoga, Fragmente, Mimetika oder Polyethylenglycol(PEG)-modifizierte
Derivate dieser Verbindungen; oder eine beliebige Kombination davon,
sie sind aber nicht darauf beschränkt. Weitere geeignete Formen
von Insulin, welche synthetische Formen von Insulin einschließen, aber
nicht darauf beschränkt
sind, sind in den
US-Patenten
Nr. 4,421,685 ,
5,474,978 und
5,534,488 beschrieben, von
denen jedes hiermit durch Bezugnahme in Gänze in diese Anmeldung aufgenommen
ist.
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Verabreichungssysteme
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein Verabreichungsmittel
und einen oder mehrere Wirkstoffe. In einer Ausführungsform können eine
oder mehrere der Verabreichungsmittelverbindungen oder Salze von
diesen Verbindungen oder Polyaminosäuren oder Peptide, von denen
diese Verbindungen oder Salze eine oder mehrere ihrer Einheiten
bilden, als ein Verabreichungsmittel durch Vermischen mit dem Wirkstoff
vor der Verabreichung verwendet werden.
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Die
Verabreichungszusammensetzungen können in Form einer Flüssigkeit
vorliegen. Der Dosierträger kann
Wasser (z. B. für
Lachs-Calcitonin, Parathyroidhormon und Erythropoietin), 25 %iges
wässriges
Propylenglycol (z. B. für
Heparin) und Phosphatpuffer (z. B. für rhGH) sein. Zu weiteren Dosierträgern gehören Polyethylenglycole,
Sorbitol, Maltitol und Sucrose. Dosierungslösungen können durch Vermischen einer
Lösung der
Verabreichungsmittelverbindung mit einer Lösung des Wirkstoffs unmittelbar
vor der Verabreichung hergestellt werden. Alternativ kann eine Lösung des
Verabreichungsmittels (oder Wirkstoffs) mit der festen Form des Wirkstoffs
(oder Verabreichungsmittels) vermischt werden. Die Verabreichungsmittelverbindung
und der Wirkstoff können
auch als trockene Pulver vermischt werden. Die Verabreichungsmittelverbindung
und der Wirkstoff können
auch während
des Herstellungsverfahrens zusammengemischt werden.
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Die
Dosierungslösungen
können
optional Zusätze
wie Phosphatpuffersalze, Citronensäure, Glycole oder andere Dispergiermittel
enthalten. Stabilisierende Zusätze
können
in die Lösung
aufgenommen werden, vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich
zwischen ungefähr
0,1 und 20% (Gew./Vol.).
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Die
Verabreichungszusammensetzungen können alternativ in Form eines
Feststoffs, wie etwa einer Tablette, einer Kapsel oder eines Partikels,
wie etwa eines Pulvers oder einer Portionspackung vorliegen. Feste
Dosierungsformen können
durch Vermischen der festen Form der Verbindung mit der festen Form
des Wirkstoffs hergestellt werden. Alternativ kann ein Feststoff
aus einer Lösung
der Verbindung und des Wirkstoffs durch im Stand der Technik bekannte
Verfahren, wie etwa Gefriertrocknen, Fällung, Kristallisation und
Feststoffdispergierung, erhalten werden.
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Die
Verabreichungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch
einen oder mehrere Enzyminhibitoren einschließen. Zu solchen Enzyminhibitoren
gehören
Verbindungen, wie Actinonin oder Epiactinonin und Derivate davon,
sie sind aber nicht darauf beschränkt. Zu anderen Enzyminhibitoren
gehören Aprotinin
(Trasylol) und der Bowman-Birk-Inhibitor,
sie sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
Menge an Wirkstoff, die in einer Verabreichungszusammensetzung der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine Menge, die zum Erreichen
des Zwecks des bestimmten Wirkstoffs für die Zielindikation wirksam
ist. Die Menge des Wirkstoffs in den Zusammensetzungen ist typischerweise
eine pharmakologisch, biologisch oder therapeutisch wirksame Menge.
Die Menge kann jedoch weniger als diese Menge sein, wenn die Zusammensetzung
in einer Dosierungseinheitsform verwendet wird, da die Dosierungseinheitsform
eine Mehrzahl von Verbindung/Wirkstoff-Zusammensetzungen enthalten
kann oder eine abgeteilte pharmakologisch, biologisch oder therapeutisch
wirksame Menge enthalten kann. Die gesamte wirksame Menge kann dann
in kumulativen Einheiten verabreicht werden, welche insgesamt eine
wirksame Menge des Wirkstoffs enthalten.
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Die
Gesamtmenge des Wirkstoffs, die verwendet werden soll, kann durch
dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. Da jedoch die Zusammensetzungen
Wirkstoffe effizienter verabreichen können als Zusammensetzungen
des Standes der Technik, können
niedrigere Mengen an biologisch aktiven Wirkstoffen als die in Dosierungseinheitsformen
oder Verabreichungssystemen des Standes der Technik verwendeten dem
Subjekt verabreicht werden, wobei dennoch die gleichen Blutspiegel
und/oder therapeutischen Wirkungen erzielt werden.
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Die
gegenwärtig
offenbarten Verbindungen verabreichen biologisch aktive Wirkstoffe,
insbesondere in oralen, intranasalen, sublingualen, intraduodenalen,
subkutanen, bukkalen, intrakolischen, rektalen, vaginalen, mukosalen,
pulmonalen, transdermalen, intradermalen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären und okularen
Systemen, und überschreiten
auch die Blut-Hirn-Schranke.
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Dosierungseinheitsformen
können
auch ein beliebiges oder eine Kombination von Hilfsstoffen, Streckmitteln,
Zerfallhilfsmitteln, Gleitmitteln, Weichmachern, Farbmitteln, Aromastoffen,
Geschmackmaskierungsmitteln, Zuckern, Süßungsmitteln, Salzen und Dosierträgern enthalten,
einschließlich,
aber nicht beschränkt auf
Wasser, 1,2-Propandiol, Ethanol, Olivenöl oder eine beliebige Kombination
davon.
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Die
Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind
zum Verabreichen von biologisch aktiven Wirkstoffen an beliebige
Tiere brauchbar, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Vögel
wie Hühner;
Säuger,
wie Nagetiere, Kühe,
Schweine, Hunde, Katzen, Primaten und insbesondere Menschen; und Insekten.
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Das
System ist besonders vorteilhaft zum Verabreichen von biologisch
aktiven Wirkstoffen, welche andernfalls durch Bedingungen, die angetroffen
werden, bevor der Wirkstoff seine Zielzone (d. h. den Bereich, in dem
der Wirkstoff der Verabreichungszusammensetzung freigesetzt werden
soll) erreicht, und im Körper
des Tieres, an das sie verabreicht werden, zerstört oder weniger wirksam gemacht
würden.
Insbesondere sind die Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung beim oralen Verabreichen von Wirkstoffen, insbesondere
solchen, die gewöhnlich
nicht oral verabreichbar sind, oder solchen, für die eine verbesserte Verabreichung
erwünscht
ist, brauchbar.
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Die
Zusammensetzungen, welche die Verbindungen und Wirkstoffe umfassen,
sind brauchbar bei der Verabreichung von Wirkstoffen an ausgewählte biologische
Systeme und mit einer erhöhten
oder verbesserten Bioverfügbarkeit
des Wirkstoffs im Vergleich zur Verabreichung des Wirkstoffs ohne
das Verabreichungsmittel. Die Verabreichung kann durch Verabreichen
von mehr Wirkstoff über
einen Zeitraum oder durch Verabreichen von Wirkstoff in einem bestimmten
Zeitraum (z. B. zum Bewirken einer schnelleren oder verzögerten Verabreichung)
oder über
einen Zeitraum (z. B. bei einer anhaltenden Verabreichung) verbessert
werden.
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Nach
der Verabreichung wird der in der Zusammensetzung oder Dosierungseinheitsform
vorhandene Wirkstoff in den Kreislauf aufgenommen. Die Bioverfügbarkeit
des Wirkstoffs kann leicht durch Messen einer bekannten pharmakologischen
Aktivität
in Blut, z. B. einer Erhöhung
der Blutgerinnungszeit, die durch Heparin verursacht wird, oder
einer Abnahme der zirkulierenden Calciumspiegel, die durch Calcitonin
verursacht wird, bestimmt werden. Alternativ können die zirkulierenden Spiegel
des Wirkstoffs selbst direkt gemessen werden.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung ohne Einschränkung. Alle
Teile sind Gewichtsteile, sofern nichts anderes angegeben ist.
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Beispiel 1 – Herstellung einer Verbindung
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1a. Herstellung von Verbindung 1
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4-Chlorsalicylsäure (10,0
g, 0,0579 mol) wurde zu einem 250 ml-Einhalsrundkolben zugegeben,
der ungefähr
50 ml Methylenchlorid enthielt. Das Rühren wurde begonnen und für den Rest
der Reaktion fortgesetzt. Das Kupplungsreagens 1,1-Carbonyldiimidazol
(9,39 g, 0,0579 mol) wurde als ein Feststoff in Portionen zu dem
Kolben zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 20 Minuten
bei Raumtemperatur gerührt, nachdem
das gesamte Kupplungsreagens zugegeben worden war, und dann wurde
Ethyl-4-aminobutyrat-hydrochlorid (9,7 g, 0,0579 mol) unter Rühren zu
dem Kolben zugegeben. Triethylamin (10,49 ml, 0,0752 mol) wurde
tropfenweise aus einem Zugabetrichter zugegeben. Der Zugabetrichter
wurde mit Methylenchlorid gespült.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht rühren gelassen.
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Das
Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter gegossen und mit
2N HCl gewaschen und es bildete sich eine Emulsion. Die Emulsion
wurde zwei Tage lang stehen gelas sen. Dann wurde die Emulsion in einer
Glasfilternutsche durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde in einen
Scheidetrichter zurückgegeben,
um die Schichten zu trennen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat
getrocknet, welches dann abfiltriert wurde, und das Filtrat wurde
durch Rotationsverdampfung konzentriert. Das resultierende feste
Material wurde mit 2N NaOH hydrolysiert, unter Kühlung über Nacht aufbewahrt und anschließend wurde
das Hydrolysieren wieder aufgenommen. Die Lösung wurde mit 2N HCl angesäuert und
die Feststoffe, welche sich bildeten, wurden isoliert, unter Vakuum
getrocknet und zweimal umkristallisiert, wobei Methanol/Wasser verwendet
wurde. Über
Nacht fielen Feststoffe aus und wurden isoliert und getrocknet.
Die Feststoffe wurden in 2N NaOH gelöst und der pH der Probe wurde
mit 2N HCl auf pH 5 gebracht. Die Feststoffe wurden gesammelt und
die HPLC zeigte einen einzigen Peak. Diese Feststoffe wurden dann
in Methanol/Wasser umkristallisiert, isoliert und dann unter Vakuum
getrocknet, wobei 4,96 g (33,0 %) 4-(4-Chlor-2-hydroxybenzoyl)aminobuttersäure erhalten wurde.
(C11H12ClNO4; Molekulargewicht 257,67). Schmelzpunkt:
131–133°C. Verbrennungsanalyse:
% C: 51,27 (berechnet), 51,27 (gefunden); % H: 4,69 (berechnet),
4,55 (gefunden); % N: 5,44 (berechnet), 5,30 (gefunden). H-NMR-Analyse:
(d6-DMSO): δ 13,0, s, 1H (COOH); δ 12,1, s,
1H (OH); δ 8,9,
t, 1H (NH); δ 7,86,
d, 1H (H ortho zu Amid); δ 6,98,
d, 1H (H ortho zu Phenol OH); δ 6,96,
d, 1H, (H meta zu Amid); δ 3,33,
m, 2H (CH2 benachbart zu NH); δ 2,28, t,
2H (CH2 benachbart zu COOH); δ 1,80, m,
2H (aliphatisches CH2 beta zu NH und CH2 beta zu COOH).
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1b. Weitere Herstellung von Verbindung
1
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4-Chlorsalicylsäure (25,0
g, 0,1448 mol) wurde zu einem 250 ml-Einhalsrundkolben zugegeben,
der ungefähr
75–100
ml Methylenchlorid enthielt. Das Rühren wurde begonnen und für den Rest
der Reaktionen fortgesetzt. Das Kupplungsreagens 1,1-Carbonyldiimidazol
(23,5 g, 0,1448 mol) wurde als ein Feststoff in Portionen zu dem
Kolben zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 20 Minuten
bei Raumtemperatur gerührt,
nachdem das gesamte Kupplungsreagens zugegeben worden war, und dann
wurde Ethyl-4-aminobutyrathydrochlorid (24,3 g, 0,1448 mol) zu dem
Kolben unter Rühren
zugegeben. Triethylamin (26,0 ml, 0,18824 mol) wurde tropfenweise
aus einem Zugabetrichter zugegeben. Der Zugabetrichter wurde mit
Methylenchlorid gespült.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht rühren gelassen.
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Das
Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter gegossen und mit
2N HCl gewaschen und es bildete sich eine Emulsion. Die Emulsion
wurde in einer Glasfilternutsche durch Celite filtriert. Das Filtrat
wurde in einen Scheidetrichter zurückgegeben, um die Schichten
zu trennen. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen,
dann über
Natriumsulfat getrocknet, welches anschließend abfiltriert wurde, und
das Filtrat wurde durch Rotationsverdampfung konzentriert. Das resultierende
feste Material wurde über Nacht
mit 2N NaOH hydrolysiert. Die Lösung
wurde mit 2N HCl angesäuert
und die braunen Feststoffe, welche sich bildeten, wurden unter Verwendung
von Methanol/Wasser umkristallisiert, wobei unlösliches schwarzes Material
heiß abfiltriert
wurde. Es fielen weiße
Feststoffe aus und wurden isoliert und getrocknet, wobei 11,68 g
(37,0%) 4-(4-Chlor-2-hydroxybenzoyl)aminobuttersäure erhalten
wurde. (C11H12ClNO4; Molekulargewicht 257,67). Schmelzpunkt:
129–133°C. Verbrennungsanalyse:
% C: 51,27 (berechnet), 51,26 (gefunden); % H: 4,69 (berechnet),
4,75 (gefunden); % N: 5,44 (berechnet), 5,32 (gefunden). H-NMR-Analyse:
(d6-DMSO): δ 13,0, s, 1H (COOH); δ 12,1, s,
1H (OH); δ 8,9,
t, 1H (NH); δ 7,86,
d, 1H (H ortho zu Amid); δ 6,98,
d, 1H (H ortho zu Phenol OH);δ 6,96,
d, 1H, (H meta zu Amid); δ 3,33,
m, 2H (CH2 benachbart zu NH); δ 2,28, t,
2H (CH2 benachbart zu COOH); δ 1,80, m,
2H (aliphatisches CH2 beta zu NH und CH2 beta zu COOH).
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1c. Weitere Herstellung von Verbindung
1
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(4-[(4-Chlor-2-hydroxybenzoyl)amino]butansäure)
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Ein
22 l-Fünfhalsrundkolben
wurde mit einem Rührwerk,
einer 1 l-Dean-Stark-Falle mit Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige und einem Heizmantel ausgestattet.
Die folgende Reaktion wurde unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff
durchgeführt.
Das Reagens n-Butanol (5000 ml) und 4-Chlorsalicylsäure (2000
g, 11,59 mol) wurden in den Reaktionskolben eingefüllt. Die
Dean-Stark-Falle wurde mit n-Butanol (1000 ml) gefüllt. Konzentrierte
Schwefelsäure
(50 g) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 120 Stunden
zum Rückfluss
erhitzt. Ungefähr
206 ml Wasser wurden während
dieser Zeit in der Falle gesammelt. Der Heizmantel wurde entfernt
und das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen.
Die Dean-Stark-Falle wurde abgelassen und entfernt. Es wurde entionisiertes
Wasser (1000 ml) eingefüllt.
Das zweiphasige Gemisch wurde 10 Minuten gerührt. Das Rühren wurde beendet und die Phasen
sich trennen gelassen. Die untere wässrige Phase wurde abgehebert
und verworfen. Eine 10 gew.-%ige wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat
(1000 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das Gemisch wurde
10 Minuten gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit pH-Papier getestet, um sicherzustellen,
dass der pH der Lösung
höher als 7
war. Wasser (500 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das
Rühren
wurde beendet und die Phasen sich trennen gelassen. Die untere wässrige Schicht
wurde abgehebert und verworfen. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer
weiteren 500 ml-Portion von entionisiertem Wasser gewaschen. Der
Reaktor wurde für
eine atmosphärische
Destillation in einen austarierten 5 l-Auffangbehälter eingerichtet.
Das Gemisch wurde destilliert, bis die Blasentemperatur auf 140–150°C anstieg.
Die Destillation wurde von atmosphärischer Destillation auf Vakuumdestillation
umgestellt. Der Druck in der Destillationsapparatur wurde langsam
auf 100 mmHg abgesenkt. Die Blasentemperatur fiel und das verbleibende n-Butanol und n-Butylether
(ein Nebenprodukt der Reaktion) destillierten ab. Das Erwärmen wurden
beendet und das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen.
Das Vakuum wurde mit trockenem Stickstoff aufgehoben. Der rohe Butylester
wurde in einen 5 l-Destillationskolben einer Vakuumdestillationsapparatur überführt. Der
rohe Butylester wurde bei einem Druck zwischen 0,2 und 0,5 mmHg
destilliert. Der bei einer Kopftemperatur von < 40°C
gesammelte Vorlauf wurde verworfen. Die Butyl-4-chlor-2-hydroxybenzoat-Fraktion
wurde bei einer Kopftemperatur zwischen 104 und 112°C gesammelt.
Diese Fraktion hatte ein Gewicht von 2559 g. Die Ausbeute betrug
96%.
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Ein
22 l-Fünfhalsrundkolben
wurde mit einem Rührwerk,
einem Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige und einem Heizmantel ausgestattet.
Der Reaktor wurde mit Stickstoff gespült. Butyl-4-chlor-2-hydroxybenzoat
(2559 g, 11,2 mol) und das Reagens Methanol (10000 ml) wurden in
den Reaktionskolben eingefüllt
und der Inhalt wurde gerührt,
bis eine Lösung
erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde durch einen Büchnertrichter
filtriert und zu dem Reaktor zurückgeführt. Die
Rührgeschwindigkeit
wurde erhöht
und gasförmiges
Ammoniak wurde schnell in dem Kopfraum des Reaktors zugegeben. Die
Ammoniakgaszugabe wurde fortgesetzt, bis die Temperatur des Reaktors
45°C erreichte.
Die Zugabe des Ammoniaks wurde unterbrochen und die Rührgeschwindigkeit
herabgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur
abkühlen
gelassen. Die Zugabe von Ammoniakgas, wie vorstehend beschrieben,
wurde wiederholt, bis die Reaktion vollständig abgelaufen war, was durch
Flüssigchromatografie
angezeigt wurde. Es wurden sieben Ammoniakzufuhren im Laufe von
fünf Tagen
benötigt,
um die Reaktion vollständig
ablaufen zu lassen. Ungefähr
die Hälfte
des Lösungsmittels
wurde durch atmosphärische
Destillation entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur
gekühlt
und 5 l entionisiertes Wasser wurde zugegeben. Konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (ungefähr 500 ml)
wurde langsam zu dem Reaktor zugegeben, bis der pH des Reaktionsgemisches
zwischen 4 und 5 lag. Der resultierende Niederschlag wurde durch
Vakuumfiltration durch eine große
Glasfilternutsche gesammelt. Der Filterkuchen des Produkts wurde
mit 2000 ml entionisiertem Wasser gewaschen und 32 Stunden bei 50°C getrocknet,
wobei 1797 g 4-Chlor-2-hydroxybenzamid
erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 94%.
-
Ein
22 l-Fünfhalsrundkolben
wurde mit einem Rührwerk,
einem Rückflusskühler, einem
Zugabetrichter, einer Thermoelementtemperaturanzeige und einem Heizmantel
ausgestattet. Der Reaktor wurde mit Stickstoff gespült. Acetonitril
(4700 ml) und 4-Chlor-2-hydroxybenzamid (1782 g, 10,4 mol) wurden
in den Reaktionskolben eingefüllt
und das Rühren
wurde begonnen. Pyridin (1133 ml, 14,0 mol) wurde in den Reaktor
eingefüllt.
Die resultierende Reaktionsaufschlämmung wurde mit einem Eisbad
auf weniger als 10°C
gekühlt. Ethylchlorformiat
(1091 ml, 1237 g, 11,4 mol) wurde in den Zugabetrichter gegeben
und langsam zu dem gerührten
Reaktionsgemisch zugegeben, so dass die Temperatur des Reaktionsgemisches
während
der Zugabe 15°C
nicht überstieg.
Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde 30 Minuten zwischen
10 und 15°C
gehalten, nachdem die Ethylchlorformiatzugabe beendet war. Das Eisbad
wurde entfernt und das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur
erwärmt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann langsam zum Rückfluss erhitzt und 18 Stunden
bei dieser Temperatur gehalten. Eine Flüssigchromatografie des Reaktionsgemisches zeigte,
dass die Reaktion nur zu 80% vollständig war. Ungefähr die Hälfte des
Lösungsmittels
wurde durch atmosphärische
Destillation entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Eisbad
zunächst
auf Umgebungstemperatur und anschließend auf < 10°C
gekühlt.
Zusätzliches
Pyridin (215 ml, 2,65 mol) wurde zu dem Reaktionsgemisch zugegeben.
Ethylchlorformiat (235 g, 2,17 mol) wurde langsam über einen
Zugabetrichter zu dem kalten Reaktionsgemisch zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde 30 Minuten lang zwischen 10 und 15°C gehalten, nachdem die Ethylchlorformiatzugabe
beendet war. Das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch
wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde
dann langsam zum Rückfluss
erhitzt und 18 Stunden lang auf dieser Temperatur gehalten, wonach
eine Flüssigchromatografie
anzeigte, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch
wurde mit einem Eisbad zunächst
auf Umgebungstemperatur und anschließend < 10°C
gekühlt.
Wasser (1600 ml) wurde über
einen Zugabetrichter langsam zugegeben und die resultierende Aufschlämmung 90
Minuten bei < 10°C gehalten.
Das feste Produkt wurde durch Vakuumfiltration durch eine große Glasfilternutsche
gesammelt. Der Filterkuchen des Produkts wurde mit entionisiertem
Wasser gewaschen und bei 50°C
18 Stunden lang vakuumgetrocknet, wobei 1914 g 7-Chlor-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dion
als ein gelbbrauner Feststoff erhalten wurden. Die Ausbeute betrug
83%.
-
Ein
22 l-Fünfhalsrundkolben
wurde mit einem Rührwerk,
einem Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige und einem Heizmantel ausgestattet.
Die folgende Reaktion wurde unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff
durchgeführt.
7-Chlor-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dion (1904 g, 9,64 mol), Ethyl-4-brombutyrat
(1313 ml, 9,18 mol) und N,N-Dimethylacetamid
(4700 ml) wurden unter einer Stickstoffspülung eingefüllt. Das Reaktionsgemisch wurde
auf 70°C
erwärmt.
Natriumcarbonat (1119 g, 10,55 mol) wurde in fünf gleichen Portionen über einen
Zeitraum von ungefähr
40 Minuten zu der klaren Lösung
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 70°C gehalten.
Das Reaktionsgemisch wurde auf 55°C
gekühlt. Die
anorganischen Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration durch eine
Glasfilternutsche entfernt. Der Reaktionskolben wurden mit 2B-Ethanol
(2000 ml) gespült
und diese Spülflüssigkeit
wurde zum Waschen des Filterkuchens verwendet. Der Reaktionskolben
wurde mit entionisiertem Wasser gereinigt. Das Filtrat wurde in den
reinen Reaktionskolben zurückgegeben.
Das Filtrat wurde in einem Eisbad gekühlt. Entionisiertes Wasser (9400
ml) wurde langsam mit einem Zugabetrichter zugegeben. Das gekühlte Gemisch
wurde über
Nacht rühren
gelassen. Die resultierenden Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration
durch eine Glasfilternutsche zurückgewonnen.
Der Produktkuchen wurde mit entionisiertem Wasser gewaschen. Das
Ethyl-3-(4-butanoat)-7-chlor-2H-1,3-benzoxazin-2,4-(3H)-dion hatte ein Gewicht
von 2476,0 g. Die Ausbeute betrug 82,2%.
-
Ein
12 l-Edelstahlreaktor wurde mit einem Rührwerk, einem Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige, einem Zugabetrichter und einem Heizmantel
ausgestattet. Die folgende Reaktion wurde unter einer Atmosphäre aus trockenem
Stickstoff durchgeführt.
Wasser (3 l) und Ethyl-3-(4-butanoat)-7-chlor-2H-1,3-benzoxazin-2,4-(3H)-dion
(1118 g, 3,58 mol) wurden in den Reaktor eingefüllt und das Rühren wurde
begonnen. Eine Lösung
von Natriumhydroxid (574 g, 14,34 mol) in Wasser (2 l) wurde langsam
zu der Reaktionsaufschlämmung
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden auf 70°C erwärmt und
anschließend
langsam auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde durch einen Büchnertrichter
filtriert.
-
Ein
22 l-Fünfhalsrundkolben
wurde mit einem Rührwerk,
einem Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige und einem Zugabetrichter ausgestattet.
Entionisiertes Wasser (1880 ml) und konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (1197
g, 12,04 mol) wurden in den Reak tor eingefüllt. Das Hydrolysat von oben wurde
langsam über
einen Zugabetrichter zu der Säurelösung zugegeben.
Der pH der resultierenden Aufschlämmung wurde durch Zugeben von
weiterer Chlorwasserstoffsäure
(160 ml, 1,61 mol) auf 3 eingestellt. Die Produktfeststoffe wurden
durch Filtration durch eine Glasfilternutsche gesammelt und 24 Stunden
in einem Vakuumofen bei 50°C
getrocknet, wobei 1109,3 g 4-[(4-Chlor-2-hydroxy-benzoyl)amino]butansäure als
ein gebrochen weißer
Feststoff erhalten wurde. Die Ausbeute war quantitativ.
-
Beispiel 1d: Herstellung von wasserfreiem
Natrium-4-((4-chlor-2-hydroxybenzoyl)amino]butanoat
-
Ein
22 l-Fünfhalsrundkolben
wurde mit einem Rührwerk,
einem Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige und einem Heizmantel ausgestattet.
Die folgende Reaktion wurde unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff
durchgeführt.
Das Reagens Aceton (13000 ml) und 4-[(4-Chlor-2-hydroxy-benzoyl)amino]butansäure (500,0
g, 1,94 mol) wurden in den Reaktor eingefüllt und das Rühren wurde
begonnen. Die Reaktionsaufschlämmung
wurde auf 50°C
erwärmt,
bis eine trübe
braune Lösung
erhalten wurde. Die warme Lösung
wurde durch einen warmen Druckfilter, der mit Whatman #1-Papier
versehen war, in einen reinen 22 l-Reaktor gepumpt. Das klare gelbe
Filtrat wurde unter Rühren
auf 50°C
erwärmt.
Eine Natriumhydroxidlösung
(50 %ig wässrig;
155 g, 1,94 mol) wurde in den Reaktor eingefüllt, wobei ein kräftiges Rühren aufrechterhalten
wurde. Nachdem die Zugabe der Base beendet war, wurde der Reaktor
2,5 Stunden zum Rückfluss (60°C) erhitzt
und anschließend
langsam auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen. Das Produkt
wurde durch Vakuumfiltration durch eine Glasfilternutsche isoliert
und 24 Stunden in einem Vakuumofen bei 50°C getrocknet, wobei 527,3 g
Natrium-4-[(4-chlor-2-hydroxybenzoyl)amino]butanoat
als ein gebrochen weißer
Feststoff erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 97,2%.
-
Beispiel 1e: Herstellung eines Kanalhydrats
von Natrium-4-[(4-chlor-2-hydroxybenzoyl)-amino]butanoat-monohydrat
-
Ein
22 l-Kolben wurde mit einem Rührwerk
ausgestattet. Entionisiertes Wasser (2000 ml) und 4-[(4-Chlor-2-hydroxybenzoyl)amino]-butansäure (380,0
g, 1,47 mol) wurden zugegeben und das Rühren wurde begonnen. Eine Lösung von
Natriumhydroxid (59,0 g, 1,48 mol) in Wasser (500 ml) wurde zu dem
Reaktor zugegeben. Wasser (1500 ml) wurde zu dem Reaktor zugegeben
und die resultierende Aufschlämmung
wurde erwärmt,
bis eine vollständige
Lösung
erhalten war. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und
dann unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Die resultierenden
Feststoffe wurden von dem Kolben abgekratzt und bei 50°C im Vakuum
getrocknet, wobei 401,2 g eines Kanalhydrats von Natrium-4-[(4-chlor-2-hydroxybenzoyl)-amino]-butanoat
als ein gebrochen weißer
Feststoff erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 96,9%.
-
Beispiel 1f: Herstellung von Natrium-4-[(4-chlor-2-hydroxybenzoyl)-amino]butanoat über das
Isopropanolsolvat
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Ein
1 Liter-Vierhalsrundkolben wurde mit einem Rührwerk, einem Rückflusskühler, einer
Thermoelementtemperaturanzeige und einem Heizmantel ausgestattet.
Die folgende Reaktion wurde unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff
durchgeführt.
Isopropanol (400 ml) und 4-[(4-Chlor-2-hydroxy-benzoyl)amino]butansäure (25,0
g, 0,09 mol) wurden in den Reaktor eingefüllt und das Rühren wurde
begonnen. Die Reaktionsaufschlämmung
wurde auf 50°C
erwärmt,
bis eine trübe
braune Lösung
erhalten wurde. Die warme Lösung
wurde durch einen warmen Druckfilter, der mit Whatman #1-Papier
versehen war, in einen reinen 1 l-Reaktor filtriert. Das klare gelbe
Filtrat wurde unter Rühren
auf 62°C
erwärmt.
Eine Natriumhydroxidlösung
(50% wässrig,
7,2 g, 0,09 mol) wurde in den Reaktor eingefüllt, wobei ein kräftiges Rühren beibehalten
wurde. Nachdem die Zugabe der Base beendet war, wurde der Reaktor
zum Rückfluss
(72 °C)
erwärmt
und anschließend langsam
auf Umgebungstemperatur abkühlen
gelassen. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltration durch eine Glasfilternutsche
isoliert und 24 Stunden bei 50°C
im Vakuum getrocknet, wobei 23,16 g Natrium-4-[(4-chlor-2-hydroxybenzoyl)amino]butanoat
als ein gebrochen weißer
Feststoff erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 92%.
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Beispiel 1 g: Kapselherstellung
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Kapseln
zur Verabreichung an Primaten, welche das Mononatriumsalz von Verbindung
1 (wie in Beispiel 1 d hergestellt) und Insulin enthielten, wurden
wie folgt hergestellt. Das Mononatriumsalz von Verbindung 1 und
von Proinsulin abgeleitete Zink-Humaninsulinkristalle QA307X (Herkunft
von rekombinanter DNA) (erhältlich
von Eli-Lilly & Co.
in Indianapolis, IN) wurden zunächst
durch ein 35 mesh Tyler-Standardsieb gesiebt und die erforderliche
Menge wurde abgewogen. Das gesiebte Mononatriumsalz von Verbindung
1 und Insulin wurden unter Verwendung eines geometrischen Siebverfahrens
in einem Glasmörser
ge eigneter Größe vermischt.
Die Materialien in dem Mörser
wurden mit einem Glaspistill gut vermischt. Ein Spatel wurde verwendet, um
die Seiten des Mörsers
abzukratzen. Die resultierende Formulierung wurde in ein Kunststoffwägeschiffchen
zur Kapselfüllung überführt. Die
Formulierung wurde von Hand in Torpac-Hartgelatinekapseln der Größe #0 (erhältlich von
Torpac, Inc. in Fairfield, NJ) abgepackt. Das Füllgewicht jeder Kapsel hing
von dem Gewicht des einzelnen Tieres ab. Die Kapseldosen der Verbindung
1 betrugen 100 mg/kg, 75 mg/kg und 50 mg/kg (als Mononatriumsalz).
Die Kapseldosen von Insulin betrugen 0,25 bis 0,5 mg pro kg.
-
Beispiel 2 – Insulin – Orale Verabreichung
-
A. Studien an Ratten
-
Zusammensetzungen
zur oralen Dosierung (PO) der Verabreichungsmittelverbindung (hergestellt
wie in Beispiel 1a oder 1b wie nachstehend angegeben) und von Zinkrekombinantem
Humaninsulin (erhältlich
von Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA (Katalog # 407694))
wurden in entionisiertem Wasser hergestellt. Typischerweise wurden
500 mg der Verabreichungsmittelverbindung zu 1,5 ml Wasser zugegeben.
Die freie Säure
der Verabreichungsmittelverbindung wurde durch Rühren der resultierenden Lösung und
Zugeben von einem Äquivalent
Natriumhydroxid in das Natriumsalz umgewandelt. Die Lösung wurde
verwirbelt, anschließend
erwärmt
(ungefähr
37°C) und
beschallt. Der pH wurde mit NaOH oder HCl auf ungefähr 7 bis
8,5 eingestellt. Zusätzliches
NaOH wurde zugegeben, falls dies nötig war, um eine einheitliche
Löslichkeit
zu erzielen, und der pH wurde wieder eingestellt (zum Beispiel wurde
für Verbindung
1a insgesamt 258,5 ml 10N NaOH zu 501 mg der Verbindung in 1,5 ml
Wasser zugegeben, End-pH 7,73). Anschließend wurde Wasser zugegeben,
um das Gesamtvolumen auf ungefähr
2,4 ml zu bringen, und es wurde verwirbelt. Ungefähr 1,25 mg
Insulin aus einer Insulinstammlösung
(15 mg/ml, hergestellt aus 0,5409 g Insulin und 18 ml entionisiertem Wasser,
eingestellt mit HCl und NaOH auf pH 8,15 und zum Erhalten einer
klaren Lösung
unter Verwendung von 40 ml konzentriertem HCl, 25 ml 10N NaOH und
50 ml 1N NaOH) wurde zu der Lösung
zugegeben und durch Umwenden vermischt. Die am Ende erhaltene Dosis
der Verabreichungsmittelverbindung, Insulindosis und Dosisvolumenmengen
sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.
-
Die
Dosierungs- und Probenahmevorschriften waren wie folgt. Männliche
Sprague-Dawley-Ratten,
die ungefähr
200–250
g wogen, wurden 24 Stunden fasten gelassen und es wurde ihnen Ketamin
(44 mg/kg) und Chlorpromazin (1,5 mg/kg) 15 Minuten vor der Dosierung
und erneut je nach Bedarf zum Aufrechterhalten der Anästhesie
verabreicht. Einer Dosierungsgruppe von fünf Tieren wurde eine der Dosierungslösungen verabreicht.
Für eine
orale Dosierung wurde ein 11 cm Rusch 8 French-Katheter an eine
1 ml-Spritze mit einer Pipettenspitze angeschlossen. Die Spritze
wurde mit Dosierungslösung
gefüllt,
indem die Lösung
durch den Katheter gezogen wurde, welcher anschließend trocken
gewischt wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingeführt, wobei
1 cm Schlauch nach den Schneidezähnen
belassen wurde. Die Lösung
wurde durch Drücken
des Spritzenkolbens verabreicht.
-
Blutproben
wurden der Reihe nach aus der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zum Zeitpunkt = 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten nach der Verabreichung.
Seruminsulinspiegel wurden mit einem Insulin-ELISA Testkit (Kit
# DSL-10-1600 von Diagnostic Systems Laborstories, Inc., Webster,
TX) bestimmt, wobei die Standardvorschrift abgewandelt wurde, um
die Empfindlichkeit und den linearen Bereich der Eichkurve für die Volumina
und Konzentrationen der in der vorliegenden Vorschrift verwendeten
Proben zu optimieren. Serumhumaninsulinkonzentrationen (μE/ml) wurden
für jeden
Zeitpunkt für
jedes der fünf
Tiere in jeder Dosierungsgruppe gemessen. Die fünf Werte für jeden Zeitpunkt wurden gemittelt
und die Ergebnisse als Seruminsulinkonzentration gegen die Zeit
aufgetragen. Das Maximum (Peak) und die Fläche unter der Kurve (AUC) sind nachstehend
in Tabelle 1 angegeben.
-
Frühere Experimente
zeigten keine messbaren Spiegel von Humaninsulin im Anschluss an
eine orale Dosierung mit Humaninsulin allein. Tabelle 1. Insulin – Orale Verabreichung
Verbindung | Volumendosis
(ml/kg) | Dosis
der Verbindung (mg/kg) | Insulindosis (mg/kg) | Mittlerer
Spitzenwert von Humaninsulin im Serum
(μE/ml ± SE) | AUC |
1a | 1,0 | 200 | 0,5 | 1457 ± 268 | 58935 |
1b | 1,0 | 200 | 0,5 | 183 ± 89 | 8674 |
1b | 1,0 | 200 | 0,5 | 136 ± 52 | 5533 |
1b | 1,0 | 200 | 0,5 | 205 ± 61 | 7996 |
1b | 1,0 | 200 | 0,5 | 139 ± 43 | 5271 |
-
B. Studien an Affen
-
Alle
Tierversuchsvorschriften hielten sich an die "Prinzipien der Pflege von Labortieren" und waren vom Institutional
Animal Care and Use Committee (IACUC) anerkannt.
-
Die
Dosierungsvorschrift zur Verabreichung der Kapseln an jedes Tier
war wie folgt. Grundlinienplasmaproben wurden von den Tieren vor
der Dosierung erhalten. Gruppen von vier Cynomolgus-Affen, zwei männlichen
und zwei weiblichen, die 2–3
kg wogen, wurden 4 Stunden vor der Dosierung und bis zu 2 Stunden nach
der Dosierung fasten gelassen. Die Tiere wurden mit einer intramuskulären Injektion
von 10 mg/kg Ketamin-hydrochlorid unmittelbar vor dem Dosieren anästhesiert.
Jedem Tier wurden variierende Dosen von Verbindung 1 (25–100 mg/kg)
in Kombination mit variierenden Dosen von Insulin 0,25–0,5 mg/kg
Insulin als 1 Kapsel verabreicht. Wasser stand während des gesamten Dosierungszeitraums
zur Verfügung
und 400 ml Saft wurde dem Tier über
Nacht vor dem Dosieren und während
des Dosierungszeitraums zur Verfügung
gestellt. Das Tier wurde in einer Schlingenfixierung fixiert. Eine
Kapsel wurde in einen Tablettengeber gegeben, bei dem es sich ein
Kunststoffwerkzeug mit einem Stempel und einer gespaltenen Gummispitze
zur Aufnahme einer Kapsel handelt. Der Tablettengeber wurde in die
Speiseröhre
des Tieres eingeführt.
Der Stempel des Tablettengebers wurde gedrückt, um die Kapsel aus der
Gummispitze in die Speiseröhre
zu schieben. Der Tablettengeber wurde dann zurückgezogen. Der Mund des Tieres
wurde geschlossen gehalten und ungefähr 5 ml Umkehrosmosewasser
wurden in den Mund von der Seite verabreicht, um einen Schluckreflex
auszulösen. Die
Kehle des Tieres wurde außerdem
gerieben, um den Schluckreflex auszulösen.
-
Mit
Citrat versetzte Blutproben (jeweils 1 ml) wurden durch Venenpunktur
aus einer geeigneten Vene zu den Zeitpunkten 1 Stunde vor der Dosierung
und 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten und 1, 1,5, 2, 3, 4 und 6 Stunden
nach der Dosierung gesammelt. Jede erhaltene Plasmaprobe wurde in
zwei Portionen unterteilt. Eine Portion wurde bei –80°C eingefroren
und für
einen Insulintest an einen anderen Ort transportiert. Die andere Portion
wurde in dem Blutglucosetest verwendet. Vier Affen erhielten auch
Insulin subkutan (0,02 mg/kg). Blutproben wurden wie vorstehend
beschrieben gesammelt und analysiert.
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Insulintests.
Seruminsulinspiegel wurden unter Verwendung des Insulin-ELISA-Testkit
(DSL, Webster, TX) gemessen.
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Glucosetests.
Blutglucosemessungen wurden unter Verwendung des ONETOUCH® Glucose
Monitoring System von Live Scan Inc., Newtown, PA durchgeführt.
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Die
Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 1A gezeigt. Table 1A. Insulin – Orale Verabreichung an Affen
Verbindung | Dosis
der Verbindung (mg/kg) | Insulindosis (mg/kg) | Mittlerer
Spitzenwert von Humaninsulin im Serum
(μE/ml ± SE) | Mittlerer
Spitzenwert der Blutglucoseverringerung
(μE/ml ± SE) |
1d | 100 | 0,5 | 91,4 ± 45 | –52,3 ± 5,3 |
1d | 50 | 0,5 | 124,1 ± 51,95 | –61 ± 12,7 |
1d | 25 | 0,5 | 87,14 ± 53,85 | –28,75 ± 21,59 |
1d | 25 | 0,25 | 36,35 ± 32,3 | –19 ± 10,21 |
-
Beispiel 3 – Cromolyn – Orale Verabreichung
-
Dosierungslösungen,
die eine Verabreichungsmittelverbindung (hergestellt wie in Beispiel
1b) und Cromolyn-Dinatriumsalz (Cromolyn) (Sigma, Milwaukee, Wisconsin)
enthielten, wurden in entionisiertem Wasser hergestellt. Die freie
Säure der
Verabreichungsmittelverbindung wurde mit einem Äquivalent Natriumhydroxid in
das Natriumsalz umgewandelt. Dieses Gemisch wurde verwirbelt und
in ein Beschallungsgerät
gegeben (ungefähr
37°C). Der
pH wurde mit wässrigem
NaOH auf ungefähr
7–7,5
eingestellt. Zusätzliches
NaOH wurde zugegeben, falls dies nötig war, um eine einheitliche
Löslichkeit
zu erzielen, und der pH wurde wieder eingestellt. Das Gemisch wurde
verwirbelt, um eine einheitliche Lösung zu erzeugen, wobei auch
eine Beschallung und Wärme
eingesetzt wurde, falls dies nötig
war. Die Lösung
der Verabreichungsmittelverbindung wurde mit Cromolyn aus einer
Stammlösung
vermischt (175 mg Cromolyn/ml in entionisiertem Wasser, pH mit NaOH
oder HCl auf ungefähr
7,0 eingestellt, falls dies erforderlich war, Stammlösung gefroren
in Folie eingewickelt aufbewahrt, dann aufgetaut und vor der Verwendung
auf ungefähr
30°C erwärmt). Das
Gemisch wurde verwirbelt, um eine einheitliche Lösung zu erzeugen, wobei auch
eine Beschallung und Wärme
eingesetzt wurden, falls dies nötig
war. Der pH wurde mit wässrigem
NaOH auf ungefähr
7-7,5 eingestellt. Die Lösung
wurde anschließend
mit Wasser auf das gewünschte
Volumen (üblicherweise
2,0 ml) und die gewünschte
Konzentration verdünnt
und in Folie eingewickelt vor der Verwendung aufbewahrt. Die endgültigen Dosen
der Verabreichungsmittelverbindung und von Cromolyn und die Dosisvolumina
sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenahmevorschriften waren wie folgt.
Männliche
Sprague-Dawley-Ratten, die zwischen 200 und 250 g wogen, wurden
24 Stunden fasten gelas sen und mit Ketamin (44 mg/kg) und Chlorpromazin
(1,5 mg/kg) 15 Minuten vor der Dosierung und erneut je nach Bedarf
zum Aufrechterhalten der Anästhesie
anästhesiert.
Einer Dosierungsgruppe von fünf
Tieren wurde eine der Dosierungslösungen verabreicht. Ein 11
cm Rusch 8 French-Katheter wurde an eine 1 ml-Spritze mit einer
Pipettenspitze angeschlossen. Die Spritze wurde mit der Dosierungslösung gefüllt, indem
die Lösung
durch den Katheter gezogen wurde, welcher anschließend trocken
gewischt wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingeführt, wobei
1 cm des Schlauches nach den Schneidezähnen belassen wurde. Die Lösung wurde
durch Drücken
des Spritzenkolbens verabreicht.
-
Blutproben
wurden über
die Schwanzarterie gesammelt, typischerweise 0,25, 0,5, 1,0 und
1,5 Stunden nach der Dosierung. Serumcromolynkonzentrationen wurden
durch HPLC gemessen. Proben wurden wie folgt hergestellt: 100 μl Serum wurde
mit 100 μl
3N HCl und 300 μl
Ethylacetat in einem Eppendorfröhrchen vereinigt.
Das Röhrchen
wurde 10 Minuten verwirbelt und dann 10 Minuten bei 10000 U/min
zentrifugiert. 200 μl
Ethylacetatschicht wurden in ein Eppendorfröhrchen, das 67 μl 0,1 M Phosphatpuffer
enthielt, überführt. Das Röhrchen wurde
10 Minuten verwirbelt und anschließend 10 Minuten bei 10000 U/min
zentrifugiert. Die Phosphatpufferschicht wurde dann in eine HPLC-Phiole überführt und
in die HPLC injiziert (Säule
= Keystone Exsil Amino 150 × 2
mm Innendurchmesser, 5 μm,
100 Å (Keystone
Scientific Products, Inc.); mobile Phase = 35% Puffer (68 mM KH2PO4, eingestellt
auf pH 3,0 mit 85% H3PO4)/65%
Acetonitril; Injektionsvolumen = 10 μl; Fließgeschwindigkeit = 0,30 ml/Minute;
Cromolyn-Retentionszeit = 5,5 Minuten; Extinktion detektiert bei
240 nm). Vorangegangene Studien zeigten Grundlinienwerte von ungefähr null.
-
Die
Ergebnisse von den Tieren in jeder Gruppe wurden für jeden
Zeitpunkt gemittelt und der höchste dieser
Mittelwerte (d. h. der mittlere Spitzenwert der Serumcromolynkonzentration)
ist nachstehend in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2. Cromolyn – Orale Verabreichung
Verbindung | Volumendosis (ml/kg) | Dosis
der Verbindung (mg/kg) | Cromolyndosis (mg/kg) | Mittlerer
Spitzenwert von Serumcromolyn ± SD(SE) |
1b | 1 | 200 | 25 | 0,70 ± 0,36
(0,16) |
-
Beispiel 4: Rekombinantes menschliches
Wachstumshormon (rhGH) – Orale
Verabreichung
-
Dosierungslösungen für eine orale
Verabreichung mittels Sonde (PO) der Verabreichungsmittelverbindung
(hergestellt wie in Beispiel 1a oder 1b, wie in nachstehender Tabelle
3 angegeben) und von rhGH wurden in Phosphatpuffer hergestellt.
Die freie Säure
der Verabreichungsmittelverbindung wurde mit einem Äquivalent Natriumhydroxid
in das Natriumsalz umgewandelt. Typischerweise wurde eine Lösung der
Verbindung in Phosphatpuffer hergestellt und gerührt, wobei ein Äquivalent
Natriumhydroxid (1,0 N) zugegeben wurde, wenn das Natriumsalz hergestellt
wurde. Zusätzliches
NaOH wurde zugegeben, falls dies nötig war, um eine einheitliche
Löslichkeit
zu erreichen, und der pH wurde wieder eingestellt. Die am Ende erhaltenen
Dosierungslösungen
wurden hergestellt durch Vermischen der Lösung der Verbindung mit einer
rhGH-Stammlösung
(15 mg rhGH/ml, hergestellt durch Vermischen in Pulverform von 15
mg rhGH, 75 mg D-Mannitol, 15 mg Glycin und 3,39 mg Dinatriumphosphat,
und anschließend
Verdünnen
mit 2% Glycerin) und Verdünnen
zu dem gewünschten
Volumen (üblicherweise
3,0 ml). Die Dosen der Verbindung und von rhGH und die Dosisvolumina sind
nachstehend in Tabelle 3 aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenahmevorschriften waren wie folgt.
Männliche
Sprague-Dawley-Raten, die zwischen 200 und 250 g wogen, wurden 24
Stunden fasten gelassen und es wurde ihnen 15 Minuten vor der Dosierung
und erneut nach Bedarf zum Aufrechterhalten der Anästhesie
Ketamin (44 mg/kg) und Chlorpromazin (1,5 mg/kg) verabreicht. Einer
Dosierungsgruppe von fünf
Tieren wurde eine der Dosierungslösungen verabreicht. Ein 11
cm Rusch 8 French-Katheter wurde an eine 1 ml-Spritze mit einer
Pipettenspitze angeschlossen. Die Spritze wurde mit der Dosierungslösung gefüllt, indem
die Lösung
durch den Katheter gezogen wurde, welcher anschließend trocken
gewischt wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingebracht,
wobei 1 cm Schlauch nach den Schneidezähnen belassen wurde. Die Lösung wurde
durch Drücken
des Spritzenkolbens verabreicht.
-
Blutproben
wurden der Reihe nach aus der Schwanzarterie gesammelt, typischerweise
zum Zeitpunkt = 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der Verabreichung.
Serum-rHGH-Konzentrationen wurden durch einen rHGH-Immunoassaytestkit
(Kit # K1F4015 von Genzyme Corporation Inc., Cambridge, MA) quantitativ
bestimmt. Vorangegangene Studien zeigten Grundlinienwerte von ungefähr null.
-
Die
Ergebnisse für
die Tiere in jeder Gruppe wurden für jeden Zeitpunkt gemittelt.
Der Maximalwert von diesen Mittelwerten (d. h. der mittlere Spitzenwert
der Serum-rhGH-Konzentration)
ist nachstehend in Tabelle 3 angegeben. (In den Fällen, in
denen keine Standardabweichung (SD) oder Standardfehler (SE) nachstehend
angegeben ist, wurden die fünf
Proben von jedem Zeitraum vor dem Testen zusammengegeben). Tabelle 3. rhGH – Orale Verabreichung
Verbindung | Volumendosis (ml/kg) | Dosis
der Verbindung (mg/kg) | rhGH-Dosis (mg/kg) | Mittlerer
Spitzenwert von Serum
[rhGH] ± SD
(SE) (ng/ml) |
1a | 1 | 200 | 3 | 99,35 |
1a | 1 | 200 | 3 | 42,62 |
1b | 1 | 200 | 3 | 84,01 ± 73,57
(32,90) |
1b | 1 | 200 | 3 | 50,44 ± 34,13
(15,26) |
-
Beispiel 5 – Interferon – Orale
Verabreichung
-
Dosierungslösungen der
Verabreichungsmittelverbindung (hergestellt wie in Beispiel 1b)
und von menschlichem Interferon (IFN) wurden in entionisiertem Wasser
hergestellt. Die freie Säure
der Verabreichungsmittelverbindung wurde mit einem Äquivalent
Natriumhydroxid in das Natriumsalz umgewandelt. Typischerweise wurde
eine Lösung
der Verabreichungsmittelverbindung in Wasser hergestellt und gerührt, wobei ein Äquivalent
Natriumhydroxid (1,0 N) zugegeben wurde, wenn das Natriumsalz hergestellt
wurde. Dieses Gemisch wurde verwirbelt und in ein Beschallungsgerät gegeben
(ungefähr
37°C). Der
pH wurde mit wässrigem
NaOH auf ungefähr
7,0 bis 8,5 eingestellt. Das Gemisch wurde verwirbelt, um eine einheitliche
Suspension oder Lösung
zu erzeugen, wobei auch Beschallung und Wärme eingesetzt wurden, falls
dies nötig
war. Zusätzliches
NaOH wurde zugegeben, falls dies nötig war, um eine einheitliche
Löslichkeit
zu erzielen, und der pH wurde wieder eingestellt. Die Lösung der
Verabreichungsmittelverbindung wurde mit einer IFN-Stammlösung (ungefähr 22,0
bis 27,5 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) vermischt und auf das
gewünschte
Volumen (üblicherweise
3,0 ml) verdünnt.
Die am Ende erhaltenen Dosen der Verabreichungsmittelverbindung
und des IFN und die Dosisvolumina sind nachstehend in Tabelle 4
aufgeführt.
-
Die
typischen Dosierungs- und Probenahmevorschriften waren wie folgt.
Männliche
Sprague-Dawley-Ratten, die zwischen 200 und 250 g wogen, wurden
24 Stunden fasten gelassen und es wurde ihnen Ketamin (44 mg/kg)
und Chlorpromazin (1,5 mg/kg) 15 Minuten vor der Dosierung und erneut
nach Bedarf zum Aufrechterhalten der Anästhesie verabreicht.
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Einer
Dosierungsgruppe von fünf
Tieren wurde eine der Dosierungslösungen verabreicht.
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Ein
11 cm Rusch 8 French-Katheter wurde an eine 1 ml-Spritze mit einer
Pipettenspitze angeschlossen. Die Spritze wurde mit Dosierungslösung gefüllt, indem
die Lösung
durch den Katheter gezogen wurde, welcher anschließend trocken
gewischt wurde. Der Katheter wurde in die Speiseröhre eingeführt, wobei
1 cm des Schlauchs nach den Schneidezähnen belassen wurde. Die Lösung wurde
durch Drücken
des Spritzenkolbens verabreicht.
-
Blutproben
wurden der Reihe nach der Schwanzarterie entnommen, typischerweise
zum Zeitpunkt = 0, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten nach der Verabreichung.
Serum-IFN-Konzentrationen wurden unter Verwendung des Cytoscreen
Immunoassay Kit für
menschliches IFN-alpha (Katalog # KHC4012 von Biosource International,
Camarillo, CA) quantitativ bestimmt. Vorangegangene Studien zeigten
Grundlinienwerte von ungefähr
null. Die Ergebnisse von den Tieren in jeder Gruppe wurden für jeden
Zeitpunkt gemittelt. Das Maximum dieser Mittelwerte (d. h. der mittlere
Spitzenwert der Serum-IFN-Konzentration) ist nachstehend in Tabelle
4 wiedergegeben. Tabelle 4. Interferon – Orale Verabreichung
Verbindung | Volumendosis (ml/kg) | Dosis
der Verbindung (mg/kg) | IFN-Dosis
(mg/kg) | Mittlerer
Spitzenwert von Serum [IFN] (ng/ml) ± SD (SE) |
1b | 1,0 | 200 | 1,0 | 17,80 ± 13,52
(6,05) |
-
Die
vorstehend erwähnten
Patente, Patentanmeldungen, Testverfahren und Veröffentlichungen
sind hiermit durch Bezugnahme in Gänze in diese Anmeldung aufgenommen.