DE60132343T2

DE60132343T2 - Fgf-2 zur behandlung von erkrankungen der peripheralen arterien

Info

Publication number: DE60132343T2
Application number: DE60132343T
Authority: DE
Inventors: Martha Jo San Francisco WHITEHOUSE
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2021-06-23
Also published as: WO2001098346A3; US20070135348A1; JP2004501164A; US7541337B2; EP1324766A2; AU2001268680A1; CA2414020A1; DE60132343D1; ATE383168T1; US7186407B2; US20020115603A1; WO2001098346A2; EP1324766B1; US20040209817A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die rekombinanten Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (rFGF-2) enthalten, zur Behandlung einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die koronare Herzkrankheit (coronary artery disease, CAD) und die periphere arterielle Verschlusskrankheit (peripheral artery disease, PAD) sind Zustände, die durch einen unzureichenden Blutfluss gekennzeichnet sind und üblicherweise sekundär zu einer Arteriosklerose auftreten. Symptome einer Ischämie (Angina pectoris bei CAD oder Claudicatio intermittens bei PAD) werden durch Stress verursacht und durch Ausruhen gelindert. Bei der CAD können die Symptome aufgrund von Myokardinfarkt, Arrhythmie und progressiver Herzinsuffizienz lebensbedrohlich werden. Bei der PAD sind die Symptome außer bei Auftreten der kritischen Extremitätenischämie (critical limb ischemia) mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit lebensbedrohlich, wobei jedoch das Risiko von ungünstigen kardiovaskulären Vorfällen und Tod erhöht ist.
Die Erkennung und Handhabung von Risikofaktoren ist bei der medizinischen Bewältigung der CAD und PAD wichtig. Die pharmakologische Handhabung von Risikofaktoren kann anti-hypertensive Mittel, lipidverringernde Mittel und hypoglykämische Mittel umfassen; oftmals wird das Aufgeben des Rauchens, eine Diät sowie Bewegung angewiesen, wobei diese Anweisungen unterschiedlich befolgt werden. Die pharmakologische Handhabung, die auf eine Abschwächung der Symptome der kritischen Extremitätenischämie gerichtet ist, umfasst oftmals Vasodilatatoren, eine anti-anginöse Therapie und eine gegen Blutplättchen ge richtete Therapie. Die mechanische Revaskularisierung durch perkutane Angioplastie (mit oder ohne Stent) und eine direkte chirurgische Rekonstruktion verbessern den Blutfluß und schwächen die Symptome ab. Eine Restenose nach Angioplastie und das Fortschreiten der Erkrankung können jedoch die Dauer des Nutzens einschränken.
Die PAD betrifft ungefähr 11 Millionen Patienten in den Vereinigten Staaten. Bei ungefähr einem Drittel dieser Patienten tritt eine Claudicatio intermittens auf (Unwohlsein, Schmerz, Müdigkeit oder Schweregefühl in den Beinmuskeln, durchgehend verursacht durch die gleiche Menge an muskulärer Aktivität und durch Ausruhen gelindert). Die Claudicatio ähnelt der Angina und stellt einen ischämischen Muskelschmerz dar, der in der Hüfte, im Gesäß, im Oberschenkel oder in der Wade lokalisiert sein kann. Er tritt in vorhersagbarer Weise durch die gleiche Menge an physischem Stress auf. Die Arteriosklerose ist systemisch, wobei jedoch eine untere Extremität öfter betroffen ist als die anderen. Patienten können eine kritische Extremitätenischämie mit Ruheschmerz, nicht-heilenden Geschwüren und/oder Gangränen entwickeln. Ein Ruheschmerz tritt auf, wenn die Blutzufuhr unzureichend ist, um den grundlegenden Nährstoffbedarf im Ruhezustand zu erfüllen, und er ist üblicherweise in den Zehen oder im Fuß der betroffenen Extremität lokalisiert.
Es wird erwartet, dass die Verbreitung der CAD und PAD in Ländern mit alternden Populationen steigt, da das Altern ein primärer Risikofaktor für die Arteriosklerose ist. Weniger invasive, auf Katheter basierende Behandlungsverfahren und stärker kosteneffiziente Programme und Behandlungsmethoden sind notwendig, um diesen Bedingungen zu begegnen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors-2 (FGF-2) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit in einem Patienten, wobei eine therapeutisch wirksame Mengen von FGF-2 an den Patienten zu verabreichen ist, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 in zwei Dosen zu unterteilen ist, und wobei eine einzelne Dosis innerhalb eines Zeitraums von 1 Stunde in jedes Bein des Patienten zu verabreichen ist, wie in den Ansprüchen beschrieben wird. Es werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors, wie beispielsweise FGF-2, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Solche Zusammensetzungen stellen bei erfindungsgemäßer Verabreichung eine effektive Behandlung für PAD-Patienten dar, einschließlich derjenigen, die an Claudicatio intermittens leiden, welche mit dieser Krankheit assoziiert ist. Solche Zusammensetzungen können darüber hinaus an PAD-Patienten verabreicht werden, um ein Fortschreiten einer kritischen Extremitätenischämie zu einer Amputation zu verhindern.
Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge FGF-2 umfassen, können als intraarterielle Infusion (IA), intravenöse Infusion (IV), intramuskuläre Injektion (IM) oder subkutane Injektion (SC) verabreicht werden. Die Verabreichung einer einzelnen Dosis FGF-2 ist bei der Behandlung von PAD wirksam. Therapeutische Vorteile können mit mehreren Dosen erhalten werden, ohne die Sicherheit zu beeinträchtigen. Die Verabreichung von FGF-2 verbessert die maximale Belastungszeit beim Gehen (peak walking time) in Patienten mit PAD für mindestens 90 Tage nach der Verabreichung von FGF-2. Der FGF-2 kann verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die an einer kritischen Extremitätenischämie leiden, einschließlich derjenigen mit Ruheschmerz mit oder ohne nicht-heilende Geschwüre. Darüber hinaus kann FGF-2 verwendet werden, um PAD-Patienten zu behandeln, die an einer kritischen Extremitätenischämie leiden. Die FGF-2 enthaltenden Zusammensetzungen können als Ergänzung bei einem vaskulären chirurgischen Eingriff mit mechanischem Bypass und bei perkutanen transluminalen Eingriffen mit Ballonkathetern mit oder ohne Stents verabreicht werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1), die für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert; dieser FGF-2 ist bovinen Ursprungs. Die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) ist ebenfalls dargestellt.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) von bovinem FGF-2 mit 146 Aminosäureresten, die von der in 1 gezeigten DNA-Sequenz kodiert wird.
3 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3), die für die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) von FGF-2 menschlichen Ursprungs mit 146 Aminosäureresten kodiert.
4 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5), die für die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) von FGF-2 bovinen Ursprungs mit 155 Aminosäureresten kodiert.
5 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7), die für die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 8) von FGF-2 menschlichen Ursprungs mit 155 Aminosäureresten kodiert.
6 zeigt die relative Veränderung der maximalen Belastungszeit beim Gehen (peak walking time; PWT) am Tag 90 bei Verabreichung von rFGF-2 in Patienten in einer klinischen Phase II-Studie. In dieser Studie wurden drei Patientengruppen untersucht: einer Gruppe wurde ein Placebo an den Tagen 1 und 30 verabreicht; einer Gruppe wurde eine einzelne Dosis rFGF-2 (30 μg/kg) am Tag 1 und ein Placebo am Tag 30 verabreicht; und einer Gruppe wurde eine Dosis rFGF-2 (30 μg/kg) sowohl am Tag 1 als auch am Tag 30 verabreicht. Der mittlere Fehler und der Standardfehler sind für die in jeder dieser Gruppen gemessene PWT angegeben. Die ANOVA-Analyse schloss Patienten mit fehlenden Daten und revaskularisierte Patienten aus. Die Untersuchung der ANOVA nach Rängen umfaßte Patienten mit fehlenden Daten und revaskularisierte Patienten, wobei diesen der tiefste Rang zugewiesen wurde. Der paarweise erfolgende Vergleich zeigte einen p-Wert von 0,026 zwischen der Einzeldosis und den Placebogruppen und einen p-Wert von 0,45 zwischen der Doppeldosis und den Placebogruppe. Die Figur stellt die Analyse der primären Wirksamkeit der klinischen Studie dar, welche die Verwendung von log-transformierten Daten vorschrieb. Dies wird als eine geeignete statistische Behandlung von Daten angesehen, wenn die Ergebnisse Schiefe (skewness) und Kurtosis (kertosis) aufweisen, wie sie oftmals bei Untersuchungen am Laufband beobachtet werden.
7 zeigt die absolute Veränderung der PWT an den Tagen 90 und 180 für die Patientengruppen, die Placebo, eine einzelne Dosis rFGF-2 oder eine doppelte Dosis rFGF-2 erhalten. Für jeden Patienten wird die PWT an der Basislinie von der PWT am Tag 90 subtrahiert, und die Differenzen werden für jede Gruppe summiert und es wird ein Mittelwert bestimmt; diese Daten werden durch eine Varianzanalyse (ANOVA) analysiert.
8 zeigt die prozentuale absolute Veränderung der PWT in den drei Patientengruppen an den Tagen 90 und 180. Die prozentuale Veränderung der PWT, die über die zwei rFGF-2-Gruppen gemittelt wurde, ist ebenfalls gezeigt (als "jeder FGF" bezeichnet).
9 zeigt den gemessenen Knöchel-Arm-Index (ankle brachial index, ABI) für die drei Patientengruppen der klinischen Phase II-Studie. Es sind eine Messung der Basislinie, eine Messung am Tag 90 und die entsprechende Veränderung zwischen der Basislinie und der Messung am Tag 90 gezeigt. Die gemittelte Veränderung des ABI ist ebenfalls für die drei Patientengruppen gezeigt. Der ABI ist in An Office Based Approach to the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Disease (2000) Society of Vascular Medicine and Biology (Medical Communications Media, Inc., Wrightstown, PA) beschrieben. Probanden mit einem ABI > 1,2 an der Basislinie werden für die Analyse ausgeschlossen.
10 zeigt die Ergebnisse bezüglich der Schwere der Claudicatio gemäß WIQ für die drei Patientengruppen in der klinischen Phase II-Studie an den Tagen 90 und 180. Die Werte stellen den prozentualen Anteil von Patienten in jeder Gruppe dar, bei denen eine Verbesserung, keine Veränderung oder eine Verschlechterung dieses Zustands festgestellt wird.
11 zeigt die Scores für die Schwere in Bezug auf Strecke, Geschwindigkeit und Stufensteigen für jede Gruppe an der Basislinie, am Tag 90 und am Tag 180. Die Figur zeigt, dass die Ergebnisse für die Einzeldosisgruppe laut WIQ besser waren als die Ergebnisse für die Placebogruppe in Bezug auf Strecke, Geschwindigkeit und Stufensteigen. Die Figur wird mit einer Skalierung gezeigt, bei der höhere Punktwerte besser sind.
12 zeigt die Scores für den allgemeinen Gesundheitszustand vom Gesundheitsfragebogen 36 (short form 36, SF-36). Eine Veränderung von einem Punkt ist mit einer erhöhten Le bensdauer von 2 Jahren verbunden. Die Scores für die Veränderung in der Figur verweisen am Tag 90 auf eine Verbesserung bei der Einzeldosis-Gruppe im Vergleich zur Placebogruppe von mehr als 2 Punkten.
13 faßt die Ergebnisse der Studie zusammen.
14 zeigt den gemessenen ABI (Knöchel-Arm-Index) für die drei Patientengruppen der klinischen Phase II-Studie, wobei Probanden mit einem ABI > 1,2 zu einem beliebigen Zeitpunkt (d. h. Basislinie, Tag 90 und/oder Tag 180) von der Analyse ausgeschlossen werden. Es sind eine Messung der Basislinie, eine Messung am Tag 90 und die entsprechende Veränderung zwischen der Basislinie und der Messung am Tag 90 dargestellt. Die gemittelte Veränderung des ABI ist ebenfalls für die drei Patientengruppen gezeigt.
15 zeigt eine hypothetische Auftragung der maximalen Belastungszeit beim Gehen am Tag 90 (PWT90) gegen die maximale Belastungszeit beim Gehen an der Basislinie (PWTB), wobei der Score für die absolute Veränderung als korrekte Analysenvariable angenommen wird. Annahmen: (PWT90 – PWTB) = d, dann ist PWT90 = 1,0·PWTB + dPWT90, das Streudiagramm ist linear, Steigung = 1,0 und Schnittpunkt ist d (unbeschränkt).
16 zeigt eine hypothetische Auftragung der PWT90 gegen die PWTB, wobei der Score für die relative Veränderung als korrekte Analysenvariable angenommen wird. Annahmen: PWR90/PWTB) = ld, dann ist PWT90 = ld·PWTB + 0,0 (über den gesamten Bereich von PWTB), das Streudiagramm ist linear, die Steigung ist ld (unbeschränkt) und der Schnittpunkt ist 0,0.
17 zeigt ein Streudiagramm von PWT90 gegen PWTB sowie eine unbeschränkte Spline-Regressionskurve für die Placebo gruppe (Δ), die Einzeldosisgruppe (☐) und die Doppeldosisgruppe (o).
18 zeigt das gleiche Streudiagramm aus 16 sowie Kurven, die das in Tabelle 15 beschriebene Regressionsmodell 2 darstellen, wie es auf die Placebogruppe (Δ), die Einzeldosisgruppe (☐) und die Doppeldosisgruppe (o) angewendet wurde. P = Placebo; S = Einzeldosis; D = Doppeldosis.
19 zeigt das Streudiagramm von PWT180 versus PWTB sowie eine unbeschränkte Spline-Regressionskurve für die Placebogruppe (Δ), die Einzeldosisgruppe (☐) und die Doppeldosis (o).
20 zeigt die Wirkung einer einzelnen Verabreichung durch intraarterielle Infusion (IA) oder intramuskuläre Injektion (IM) und durch 14tägige kontinuierliche intraarterielle Infusion auf den Gesamtblutfluss im Hinterbein in einem bilateralen PAD-Modell der Ratte. Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) diente als Vehikelkontrolle.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine potentiell neue Alternative zur Behandlung der Claudicatio intermittens aufgrund von peripherer arterieller Verschlußkrankheit (peripheral artery disease; PAD) ist die Verwendung von angiogenen Wachstumsfaktoren, welche die Bildung von neuen Blutgefäßen aus vorbestehenden Blutgefäßen (Angiogenese) fördern und darüber hinaus die Endothelzellfunktion wiederherstellen. Bei der Angiogenese verlassen Endothelzellen ihren Ruhezustand und beginnen damit, die unterliegende Basalmembran abzubauen, gefolgt von Proliferation und Migration und letztlich der Bildung einer hohlen Röhre (Gerwins et al. (2000) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 34(3): 185–194). Fibrobla sten-Wachstumsfaktoren binden an Zelloberflächenrezeptoren, bei denen es sich um Liganden-stimulierbare Tyrosin-Kinasen handelt. Die Bindung dieser Wachstumsfaktoren an ihre Rezeptoren führt zur Aktivierung der intrinsischen Tyrosin-Kinase und zur Signaltransduktion an stromabwärts gelegene Signalkaskaden (Gerwins et al. (2000) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 34(3): 185–194). Die Angiogenese in ischämischen Geweben kann durch die transmurale Zuführung von angiogenen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise VEGF, FGF und PDGF unter Verwendung eines intravaskulären Infusionskatheters gefördert werden. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,941,868 .
Es werden Zusammensetzungen und Mittel zur Behandlung der PAD in einem Patienten beschrieben. Die Zusammensetzungen und Mittel sind bei der Behandlung und Verhinderung der Claudicatio und der kritischen Extremitätenischämie aufgrund von PAD nützlich. Der Begriff "kritische Extremitätenischämie" wird für alle Patienten mit chronisch-ischämischem Ruheschmerz, Geschwüren oder Gangränen verwendet, die auf einer objektiv nachgewiesenen arteriellen Verschlusskrankheit beruhen. Der Begriff "kritische Extremitätenischämie" impliziert eine Chronizität und ist von einer akuten Ischämie einer Extremität zu unterscheiden. Mit "akuter Extremitätenischämie" ist jede plötzliche Verringerung oder Verschlechterung der Perfusion einer Extremität gemeint, die eine Bedrohung der Lebensfähigkeit der Extremität verursacht. Siehe J. Vasc. Surg. 31: S135, S168, die vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Die Erfindung verwendet FGF-2. Es ist verständlich, dass alle angiogenen Wachstumsfaktoren, die vorliegend beschrieben werden, rekombinante Moleküle sein können. Es ist ferner verständlich, dass Zusammensetzungen einen oder mehrere Fibroblasten-Wachstumsfaktoren als angiogene Mittel umfassen können, sowie auch biologisch aktive Varianten derselben. Varianten einer FGF-Sequenz, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) angingen aktive Fragmente, Analoga und Derivate. Mit "Fragment" ist ein Polypeptid gemeint, dass lediglich aus einem Teil einer intakten FGF-Sequenz und FGF-Struktur besteht, und bei dem es sich um eine C-terminale Deletion, eine N-terminale Deletion und um beides handeln kann. Mit "Analoga" sind entweder Analoga des angiogenen Mittels FGF oder von Fragmenten desselben gemeint, die eine native FGF-Sequenz und FGF-Struktur mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -Insertionen oder -Deletionen umfassen. Peptide mit einem oder mit mehreren Peptoiden (Peptidmimetika) und Muteine oder mutierte Formen des angiogenen Mittels sind ebenfalls vom Begriff Analog umfasst. Mit "Derivate" ist eine beliebige geeignete Modifikation des angiogenen Mittels, des Fragments des angiogenen Mittels oder ihrer jeweiligen Analoga gemeint, wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung oder eine andere Addition von fremden Gruppen, solange die angiogene Aktivität beibehalten wird. Verfahren zur Herstellung von Fragmenten, Analoga und Derivaten sind im Stand der Technik verfügbar. Siehe US-Patent Nrn. 4,738,921 ; 5,158,875 und 5,077,276 ; Internationale Veröffentlichungen WO 85/00831 , WO 92/04363 , WO 87/01038 und WO 89/05822 ; und Europäische Patente EP 135094 , EP 123228 und EP 128733 .
Solche Varianten sollten die angiogenen Aktivitäten beibehalten und somit "angingen aktiv" sein. Die Varianten können hinsichtlich ihrer angiogenen Aktivität unter Verwendung von Standard-Bioassays gemessen werden. Repräsentative Assays umfassen bekannte Radiorezeptor-Assays unter Verwendung von plazentaren Membranen (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,324,639 ; Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 973–976; und Marshall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 283–292). Zusätzliche Assays umfassen die mitogene Aktivität, wie sie in einem in vitro-Assay für die endotheliale Zellproliferation bestimmt wird. Diese Aktivität wird vorzugsweise in einem Assay bestimmt, der auf humanen Endothelzellen aus Nabelschnur (human umbilical vein endothelial cells, HUVE) basiert, wie beispielsweise in einer beliebigen der nachfolgenden Publikationen beschrieben wird: Gospodarowicz et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57: 7311–7315; Ferrara und Henzel (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851–858; Conn et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1323–1327; Soker et al. (1998) Cell 92: 735–745; Waltenberger et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 26988–26995; Siemmeister et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 249–255; Fiebich et al. (1993) Eur. J. Biochem. 211: 19–26; Cohen et al. (1993) Growth Factors 7: 131–138. Eine weitere biologische Aktivität ist die Beteiligung bei der Angiogenese und/oder dem vaskulären Remodeling, welche beispielsweise mit dem Corneal-Pocket-Angiogenesis-Assay, wie er Connolly et al. (1989) J. Clin. Invest. 84: 1470–1478 und Lobb et al. (1985) Biochemistry 24: 4969–4973 beschrieben ist; mit dem Endothelzell-Röhrenbildungs-Assay, der z. B. in Pepper et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 824–831; Goto et al. (1993) Lab. Invest. 69: 508–517; oder in Koolwijk et al. (1996) Cell Biol. 132: 1177–1188 beschrieben ist; mit dem Hühner-Chorioallantoismembran(CAM)-Angiogenese-Assay der beispielsweise in Pluet et al. (1989) EMBO. J. 8: 3801–3806 beschrieben ist; dem Endothelzell-Mitogenese-Assay, der in Bohlen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5364–5368; Presta et al. (1986) Mol Gen. Biol. 6: 4060–4066; Klagsbrun und Shing (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 805–809; Gospodarowicz et al. (1985) J. Cell. Physiol. 122: 323–332 beschrieben ist; oder mit dem Endothelialzell-Migrationsassay, der in Moscatelli et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2091–2095; und in Presta et al. (1986) Mol. and Cell. Biol. 6: 4060–4066 beschrieben ist, nachgewiesen werden kann. Es ist verständlich, dass einer oder mehrere dieser Assays verwendet werden können. Vorzugsweise hat die Variante mindestens dieselbe Aktivität wie das native Molekül.
Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2), einschließlich rekombinant hergestellter Formen (rFGF-2) ist ein wirkungsvolles Mitogen und ein angiogenes Mittel, das bei der Behandlung der koronaren Herzkrankheit (Angina) und der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (Claudicatio) Anwendung findet. Obwohl FGF-2 normalerweise in zahlreichen Körpergeweben hergestellt wird und er an der Reaktion des Körpers auf bestimmte ischämische Bedingungen beteiligt ist, ist der Vorrat von FGF-2 im Körper selbst möglicherweise nicht ausreichend, um die Komplikationen der Arteriosklerose und der arteriellen Insuffizienz (Ischämie) zu umgehen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verwendungen können verwendet werden, um PAD-Patienten zu behandeln, selbst diejenigen, die an einem weiten Spektrum von verwandten klinischen Beschwerden leiden, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) koronare Herzkrankheit (coronary artery disease, CAD), Myokardinfarkte, Schlaganfall, Diabetes, Dyslipidämien, Hypertonie, sowie Patienten, die eine chirurgische oder eine Katheter-gestützte Revaskularisierung durchlaufen hatten. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, insbesondere FGF-2, können verwendet werden, um PAD-Patienten zu behandeln, die an Claudicatio leiden, einschließlich derjenigen, die eine kritische Extremitätenischämie aufweisen. Die kritische Extremitätenischämie (critical limb ischemia) kann sich bei ausbleibender Behandlung zu einer akuten Ischämie der Extremität entwickeln und letztlich eine Amputation der Extremität nach sich ziehen. Somit können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um eine akute Ischämie der Extremität zu verhindern.
Die FGF-2-enthaltenen Zusammensetzungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind intraarteriell (IA), intravenös (IV), intramuskulär (IM), subkutan (SC), transmural usw. an einen Patienten zu verabreichen, der dies benötigt. Mit "transmuraler" Verabreichung ist eine lokali sierte Zuführung der Zusammensetzung in das Blutgefäß oder in die Körperlumenwand, einschließlich neointimale, intimale, mediale, adventiale und perivaskuläre Räume gemeint, insbesondere solche neben der Zielstelle. Mit "Zielstelle" ist das Gebiet gemeint, das die Blutzufuhr in die Extremitäten (z. B. in die Beine) umgibt oder unmittelbar umgibt.
Eine intraarterielle Verabreichung (IA) umfasst die Verabreichung der FGF-enthaltenen Zusammensetzung in mindestens einer Arterie. Bei einer IA-Infusion wird die Infusion üblicherweise auf mehrere Arterien der Beine unterteilt, z. B. in die linke und rechte Arteria femoralis communis, wobei sie jedoch manchmal in eine einzelne Arterie verabreicht wird. Die Infusion kann für etwa 1 Minute, 1 bis 5 Minuten, 10 bis 20 Minuten oder 20 bis 30 Minuten in jede Arterie beider Beine verabreicht werden. Die Infusion kann von Zeit zu Zeit wiederholt werden, um den vorhergesagten Nutzen zu erreichen oder diesen zu erhalten. Der Zeitpunkt für die Wiederholung der Verabreichung basiert auf der Reaktion des Patienten, die durch Symptome und hämodynamische Messungen gemessen wird. Eine therapeutische wirksame Dosis oder Menge an FGF-2, die als Infusion zu verabreichen ist, wird in zwei Dosen unterteilt, und eine einzelne Dosis wird in jedes Bein des Patienten, der sich der Behandlung unterzieht, verabreicht. Auf diese Weise wird die gesamte Dosis so verabreicht, dass das angiogene Mittel in beide Beinen des Patienten gegeben wird.
Gemäß einer Ausführungsform wird somit eine therapeutisch wirksame Dosis oder Menge von FGF-2, wie sie an anderer Stelle dieser Beschreibung definiert ist, durch IA-Infusion unter Verwendung eines bilateralen Verabreichungsverfahrens verabreicht, so dass der Vorgang mit einem einzelnen Einstich beendet werden kann. Auf diese Weise wird eine Hälfte der therapeutisch wirksamen Menge oder Gesamtdosis rFGF-2 durch Infusion in die Arteria femoralis communis des ersten Beins verab reicht, und anschließend wird der Katheter über die Verzweigung der Aorta zur kontralaterale Beckenarterie und zur Arteria femoralis communis geführt, und der Rest der Gesamtdosis wird durch Infusion in die Arteria femoralis des zweiten Beins verabreicht. Die Geschwindigkeit der Infusion (eine in jedes Bein) beträgt etwa 1 ml/min über einen Zeitraum von 10 Minuten mit kurzen Unterbrechungen zwischen der ersten und der zweiten Infusion. Somit beginnt die zweite Infusion üblicherweise innerhalb von etwa 1 Stunde nach der ersten Infusion, sie kann jedoch auch bis zu 2, 3 oder 4 Stunden nach der ersten Infusion beginnen. Vorzugsweise beginnt die zweite Infusion innerhalb von 30 Minuten, stärker bevorzugt innerhalb von 20 Minuten, noch stärker bevorzugt innerhalb von 10 Minuten, und noch stärker bevorzugt innerhalb von 5 Minuten nach Abschluß der ersten Infusion. Jede Infusion kann weniger als 10 Minuten benötigen, wie beispielsweise 3, 4 oder 5 Minuten, solange der FGF nicht als Bolus verabreicht wird. Es ist dem Fachmann verständlich, dass die therapeutisch wirksame Dosis oder Menge von FGF, wie beispielsweise rFGF-2, auf die zwei Beinen des Patienten verteilt werden kann, sodass ungleiche Teile der Gesamtdosis in jedes Bein verabreicht werden, beispielsweise ein Drittel in ein Bein und zwei Drittel in das andere Bein. Der Vorteil der bilateralen Verabreichungsmethode besteht darin, dass zwei Infusionen (eine in jedes Bein) mit einem einzelnen Einstich in den Probanden durchgeführt werden können. In dieser Ausführungsform erfolgt die Ansicht des Einstichs vorzugsweise in der Leistengegend. Ein Verfahren unter Verwendung des Arms kann angewendet werden, sofern dies vom behandelnden Arzt als vorteilhaft angesehen wird. Bei diesem Vorgehen kann der Katheter stärker distal geführt werden, wie beispielsweise in den Bereich unmittelbar über dem Knie, solange die Behinderung des Blutflusses distal zum Infusionspunkt verbleibt.
Alternativ dazu kann die therapeutisch wirksame Menge von rFGF-2 durch direkten IA-Einstich in jede Arteria femoralis communis zugeführt werden. Auf diese Weise wird eine Hälfte der Dosis von FGF-2 in jede Arteria femoralis communis verabreicht, während die andere Hälfte der Dosis von FGF-2 in die andere Arteria femoralis communis verabreicht wird. Der direkte IA-Einstich kann vorteilhaft sein, da er die Katheter-Prozedur vermeidet, die bei der bilateralen Zuführung erforderlich ist; wenn die therapeutisch wirksame Dosis zu unterteilen und in beide Beine zu verabreichen ist, sind jedoch zwei Einstiche erforderlich. Wie bei der bilateralen Verabreichung wird jede Infusion bei einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml/min über einen Zeitraum von etwa 10 Minuten verabreicht, mit kurzen Unterbrechungen zwischen der ersten und zweiten Infusion. Somit beginnt die zweite Infusion im Allgemeinen innerhalb von etwa 1 Stunde nach der ersten Infusion, sie kann jedoch bis zu 2, 3 oder 4 Stunden nach der ersten Infusion beginnen. Vorzugsweise beginnt die zweite Infusion innerhalb von etwa 30 Minuten, stärker bevorzugt innerhalb von etwa 20 Minuten, noch stärker bevorzugt innerhalb von etwa 10 Minuten, und noch stärker bevorzugt innerhalb von etwa 5 Minuten nach Abschluß der ersten Infusion. Jede Infusion kann weniger als etwa 10 Minuten benötigen, wie beispielsweise 3, 4 oder 5 Minuten, solange der FGF-2 nicht als Bolus verabreicht wird. Es wird wiederum verständlich sein, dass die therapeutisch wirksame Dosis oder Menge von FGF-2, wie beispielsweise rFGF-2, auf beide Beine des Patienten verteilt werden kann, so dass ungleiche Teile der Gesamtdosis in jedes Bein verabreicht werden.
Die Zuführung von FGF-2-enthaltenen Zusammensetzungen kann gemäß der vorliegenden Erfindung durch eine Vielzahl von bekannten Verabreichungssystemen für intravaskuläre Wirkstoffe erfolgen. Solche Verabreichungssysteme umfassen Zuführungssysteme für intravaskuläre Katheter. Es sind eine Vielzahl von Kathetersystemen im Stand der Technik bekannt, die für die direkte transmurale Infusion von angiogenen Wachstumsfaktoren in Blutgefäße nützlich sind. Für die Durchführung der Erfindung kann jede einer Vielzahl von diagnostischen oder therapeutischen Katheterarten verwendet werden. Wenn der FGF-2 im Zusammenhang mit einer Angioplastie verabreicht wird, können Ballonkatheter verwendet werden. Ballonkatheter mit expandierbaren distalen Enden, die in der Lage sind, mit der inneren Wand eines Blutgefäßes in Kontakt zu treten und einen angiogenen Wachstumsfaktor durch Infusion direkt in diese zu verabreichen, sind in der Patentliteratur hinreichend beschrieben. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,318,531 ; 5,304,121 ; 5,295,962 ; 5,286,254 ; 5,254,089 ; 5,213,576 ; 5,197,946 ; 5,087,244 ; 5,049,132 ; 5,021,044 ; 4,994,033 und 4,824,436 . Katheter mit beabstandeten oder helikalen Ballons für die Expansion innerhalb des Lumens eines Blutgefäßes und zur Verabreichung eines therapeutischen Mittels an die resultierende isolierte Behandlungsstelle sind in den US-Patent Nrn. 5,279,546 ; 5,226,888 ; 5,181,911 ; 4,824,436 und 4,636,195 beschrieben. Katheter ohne Ballon zur Wirkstoff-Verabreichung sind in den US-Patent Nrn. 5,180,366 ; 5,112,305 und 5,021,044 und in der PCT-Veröffentlichung WO 92/11890 beschrieben. Katheter, die einen Zugang zum distalen Gefäß ermöglichen, sowie Stents können ebenfalls verwendet werden. Ultraschall-unterstützte Katheter zur Wirkstoff-Verabreichung (Phonophorese-Vorrichtungen) werden in den US-Patent Nrn. 5,362,309 ; 5,318,014 und 5,315,998 beschrieben. Andere Katheter zur Wirkstoff-Verabreichung mittels Iontophorese und Phonophorese sind in den US-Patenten Nrn. 5,304,120 ; 5,282,785 und 5,267,985 beschrieben. Manschettenkatheter mit Lumen zur Wirkstoff-Verabreichung, die zur Verwendung in Kombination mit herkömmlicher Angioplastie-Ballonkathetern gedacht sind, werden in den US-Patent Nrn. 5,364,356 und 5,336,178 beschrieben.
Es können direkte intramuskuläre (IM) Injektionen verwendet werden, um die erfindungsgemäßen angiogenen Mittel zu verabreichen. Die Mittel für die Injektion können das FGF-2-Protein oder angingen aktive Fragmente des Proteins sowie das Gen oder Plasmid, welches für das angingen aktive FGF-2-Protein oder das Fragment kodiert, umfassen. Injektionen sind an die betroffene Extremität (die betroffenen Extremitäten) in den Oberschenkel oder in die Wade zu verabreichen, in die Umgebung von bestehenden Gefäßen, in die Nähe von Kollateralflussgefäßen oder von leitenden Gefäße, wie beispielsweise Arterien oder Pulsadern (arterials). Die therapeutisch wirksame Dosis des angiogenen Mittels ist als einzelne Injektion zu verabreichen, oder sie kann unterteilt und in mehreren Injektionen verabreicht werden. Vorzugsweise wird die therapeutisch wirksame Menge oder Dosis als 1 bis etwa 20 Injektionen verabreicht, 1 bis 15 Injektionen, vorzugsweise 1 bis etwa 10 Injektionen. Es kann eine einzelne Dosis des angiogenen Mittels intramuskulär verabreicht werden, und dies kann (sofern erforderlich) basierend auf den Symptomen und/oder den hämodynamischen Messungen wiederholt werden. Eine lokale Verabreichung, wie beispielsweise mittels IM-Injektion, kann den zusätzlichen Vorteil einer Verabreichung von geringeren Dosen des angiogenen Mittels erreichen. Siehe das vorliegende Beispiel 4 sowie die ebenfalls anhängige Anmeldung mit dem Titel „Dose of an Angiogenic Factor and Method of Administering to Improve Myocardial Blond Flow", US 2003/171294 . Der Vorteil einer IM-Injektion (von IM-Injektionen) besteht darin, dass sie weniger wahrscheinlich zu einer Hypotonie führt (führen) und mit höherer Wahrscheinlichkeit eine längere Halbwertszeit im Bereich der Ischämie aufweist (aufweisen), weniger invasiv ist (sind) und daher häufiger wiederholt werden kann (können) als die IA-Infusion. Eine IA-Infusion oder eine IM-Injektion (IM-Injektionen) können durch IM-Injektion(en) alle 1–2 Monate aufgefrischt werden (boosted), wenn dies durch die klinischen Symptome angezeigt wird.
Rekombinanter FGF-2 setzt Stickoxid frei, einen wirkungsvollen Vasodilatator, und eine energische Handhabung der Flüs sigkeit vor (proaktiv) und während der Infusion ist für die Sicherheit des Patienten entscheidend. Die Verabreichung von IV-Flüssigkeiten (z. B. 500 bis 1000 ml normale Salzlösung) zur Etablierung eines Wedge-Drucks von 12 mm Hg vor der Infusion sowie die Verabreichung von Boli aus IV-Flüssigkeiten (z. B. 200 ml normale Salzlösung) zur Verringerung des systolischen Blutdrucks (z. B. < 90 mm Hg), der mit einer Infusion im Zusammenhang steht, optimierten die Sicherheit der Verabreichung von rFGF-2 durch IC- oder IV-Infusion an humane Patienten.
Da ein plötzlicher rFGF-2-Bolus mit einer schweren Hypotonie in Tieren assoziiert ist, ist die Infusionsgeschwindigkeit für die Sicherheit des Patienten entscheidend. Die Verabreichung von 0,5 bis 2 ml/min, üblicherweise 1 ml/min optimierte die Sicherheit der Verabreichung von rFGF-2 durch IC- oder IV-Infusion in humane Patienten.
Zusammensetzungen, die den Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF-2 umfassen, können an einen Patienten mit peripherer arterieller Verschlußkrankheit verabreicht werden, einschließlich an diejenigen mit Claudicatio in Verbindung mit vaskulärer oder mechanischer Bypass-Chirurgie oder Angioplastie. Der FGF-2 kann mit oder ohne Stent während des chirurgischen Eingriffs verabreicht werden. Der FGF-2 kann daher als Ergänzung zu einem vaskulären chirurgischen Eingriff, der einen mechanischen Bypass und eine Angioplastie umfasst, verabreicht werden.
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Zusammensetzungen stellen eine sichere und therapeutisch wirksame Menge des Fibroblasten-Wachstumsfaktors bereit, um den Blutfluss zu verbessern. Mit "sichere und therapeutisch wirksame Menge" ist eine Menge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors, wie beispielsweise FGF-2, oder einer angingen aktiven Variante oder eines Fragments davon gemeint, die bei erfindungsgemäßer Verabrei chung frei von wesentlichen Komplikationen ist, die nicht medizinisch beherrschbar sind und die zu einer objektiven Verbesserung in Patienten mit Symptomen von PAD führt. Es sollte verstanden werden, dass sich die therapeutisch wirksame Menge in Abhängigkeit von Alter, Gewicht, Schwere der Symptome, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem physischen Zustand, usw. von Patient zu Patient unterscheiden kann. Andere Faktoren umfassen die Verabreichungsart und die jeweilige Menge von FGF, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist. Üblicherweise ist eine therapeutisch wirksame Menge eines angiogenen Mittels der Erfindung, wie beispielsweise FGF-2, etwa 0,1 μg/kg bis etwa 100 μg/kg, vorzugsweise etwa 0,20 μg/kg bis etwa 75 μg/kg, stärker bevorzugt etwa 0,4 μg/kg bis etwa 50 μg/kg, noch stärker bevorzugt etwa 0,50 μg/kg bis etwa 35 μg/kg, noch stärker bevorzugt jedoch etwa 1,0 μg/kg bis etwa 30 μg/kg, basierend auf dem tatsächlichen Körpergewicht. Wenn das angiogene Mittel FGF-2 ist, beträgt eine therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 somit etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg, 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg, etwa 1 μg/kg bis 3 μg/kg, etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg, etwa 5 μg/kg bis etwa 7 μg/kg, etwa 7 μg/kg bis etwa 8 μg/kg, etwa 8 μg/kg bis etwa 9 μg/kg, etwa 9 μg/kg bis etwa 9,9 μg/kg, wie beispielsweise etwa 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 oder 9,9 μg/kg, bis zu etwa 10 μg/kg, etwa 10 μg/kg bis etwa 15 μg/kg, etwa 15 μg/kg bis etwa 20 μg/kg, etwa 20 μg/kg bis etwa 30 μg/kg, etwa 30 μg/kg bis etwa 40 μg/kg, etwa 40 μg/kg bis etwa 60 μg/kg, etwa 60 μg/kg bis etwa 80 μg/kg des rFGF-2, abhängig von der Art und Weise der Verabreichung.
Wie angegeben sind die im Rahmen der Erfindung verwendeten Zusammensetzungen nützlich bei der Behandlung oder Vermeidung der PAD und Symptomen, die mit der PAD assoziiert sind, einschließlich Claudicatio und kritische Extremitätenischämie. Somit umfassen die erwünschten therapeutischen Reaktionen eine gesteigerte Bewegungsfähigkeit, einen verbesserten Knöchel- Arm-Index, eine Verringerung im Körperschmerz und eine Verringerung der Claudicatio. In Fällen von PAD-Patienten mit kritischer Extremitätenischämie umfassen die erwünschten therapeutischen Reaktionen ein Verschwinden des dauerhaften Ruheschmerzes, der nicht durch Analgetika kontrollierbar ist, eine Ausheilung von Geschwüren und eine Vermeidung von Gangrän und Amputation.
Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit einer Verabreichung von FGF-2 zur Behandlung der PAD sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Siehe beispielsweise die Verfahren zur Überprüfung des gesteigerten Blutflusses in betroffene Extremitäten, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Doppler-Ultraschall, Plethysmographie (Macdonald (1994) J. Vas. Tech. 18: 241–248) und Magnet-Resonanzspektroskopie, Knöchel-Arm-Druckindex oder Index des systolischen Drucks in den Zehen im Ruhezustand und nach einer Bewegungsphase und erhöhte kollaterale Gefäßdichte unter Verwendung der Angiographie. Klinische Indikatoren der Wirksamkeit umfassen Gesamtzeit des Gehens auf einem Laufband (d. h. peak walking time, PWT) und Zeit bis zum Einsetzen von Claudicatio; und Patientenfragebögen in Bezug auf die Lebensqualität.
Die FGF-2-enthaltenen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für einen Zeitraum zu verabreichen, der ausreicht, um die erwünschte physiologische Wirkung, d. h. die Angiogenese und/oder die Wiederherstellung der Endothelzellfunktion und die Förderung der kollateralen Blutgefäße zu erreichen. Die Zusammensetzungen können als Einzelbolus oder in Form von mehreren Injektionen verabreicht werden. Üblicherweise wird der angiogene Faktor als Infusion über einen bestimmten Zeitraum zugeführt werden. Es ist verständlich, dass beliebige Mittel zur Verabreichung umfasst sind, einschließlich Formulierungen mit anhaltender Freisetzung, Plasmide oder Gene sowie andere Arten der Verabreichung. Die Gesamtdauer der Verabreichung kann in Abhängigkeit von der Zuführungsgeschwindigkeit und der Wirkstoffkonzentration in der zugeführten Zusammensetzung variieren. Beispielsweise kann die Verabreichungszeit bei intraarterieller Verabreichung von 1 Sekunde bis zu etwa. 24 Stunden variieren, üblicherweise von 1 Minute bis zu etwa 6 Stunden, insbesondere von etwa 5 Minuten bis zu etwa 30 Minuten. Die Verabreichung einer einzelnen intraarteriellen Dosis ist bei der Behandlung der PAD wirksam.
Bei einer Verabreichung gemäß der vorliegenden Erfindung sorgen die FGF-2-enthaltenen Zusammensetzungen beim Patienten für eine sichere und therapeutisch wirksame Behandlung der PAD, die mindestens 1 Monat, 2 Monate, üblicherweise 3 Monate, 4 Monate, 5 Monate, 6 Monate und in einigen Fällen mehr als 6 Monate anhält, bevor eine weitere Behandlung notwendig ist. Das angiogene Mittel FGF-2 kann einmal oder zweimal pro Tag etwa jede Woche, vorzugsweise jeden Monat, oder stärker bevorzugt alle 2 Monate, noch stärker bevorzugt alle 3 Monate, noch stärker bevorzugt alle 4 Monate und sogar noch stärker bevorzugt alle 6 Monate verabreicht werden.
Wie angegeben sind die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und die verwandten Moleküle in der Lage, die Endothelzellfunktion wieder herzustellen und die Proliferation von Endothelzellen und/oder glatten Muskelzellen zu fördern. Die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine Familie von mindestens 23 strukturell verwandten Polypeptiden (als FGF-1 bis FGF-23 bezeichnet), die durch einen hohen Grad an Affinität für Proteoglycane, wie beispielsweise Heparin, gekennzeichnet sind. Die verschiedenen FGF-Moleküle variieren hinsichtlich ihrer Größe von 15 bis mindestens 32,5 kDa und weisen ein breites Spektrum von biologischen Aktivitäten in normalen und malignen Zuständen auf, einschließlich Adhäsion und Differenzierung von Nervenzellen (Schubert et al. (1987) J. Cell. Biol. 104: 635–643); Wundheilung ( US-Patent Nr. 5,439,818 (Fiddes)); als Mi togene für zahlreiche mesodermale und ektodermale Zelltypen, als trophische Faktoren, als die Differenzierung induzierende oder inhibierende Faktoren (Clements et al. (1993) Oncogene 8: 1311–1316); sowie als ein angiogener Faktor (Harada (1994) J. Clin. Invest. 94: 623–630). Somit ist die FGF-Familie eine Familie von pluripotenten Wachstumsfaktoren, die in unterschiedlichen Ausmaßen Fibroblasten, glatte Muskelzellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Myozyten und neuronale Zellen stimulieren. FGF-ähnliche Polypeptide werden ebenfalls zur Verwendung in Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen. Mit "FGF-ähnlich" sind Polypeptide gemeint, die den FGF-Rezeptor-1 binden, insbesondere den Rezeptor 1-C, die an Heparin-ähnliche Moleküle binden und eine angiogene Aktivität aufweisen. Mit Heparin-ähnlichem Molekül sind Heparin, Proteoglycane und andere polyanionische Verbindungen gemeint, die an FGF binden, FGF dimerisieren und eine Rezeptoraktivierung ermöglichen. Von besonderem Interesse bei der Ausführung der Erfindung ist der FGF, welcher als FGF-2 bezeichnet wird, sowie Varianten und Fragmente davon, welche im Stand der Technik bekannt sind. Siehe beispielsweise Patent Nrn. 5,989,866 ; 5,925,528 ; 5,874,254 ; 5,852,177 ; 5,817,485 ; 5,714,458 ; 5,656,458 ; 5,604,293 ; 5,576,288 ; 5,514,566 , 5,482,929 ; 5,464,943 und 5,439,818 .
Der zu verabreichende FGF-2 kann von einer beliebigen Tierspezies stammen, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Vogel, Hund, Rind, Schwein, Pferd und Mensch. Im Allgemeinen stammt der FGF-2 von einer Säugetier-Spezies, vorzugsweise vom Rind oder vom Menschen. Der FGF-2 kann wie nachfolgend ausgeführt in nativer, in rekombinant hergestellter oder in chemisch synthetisierter Form vorliegen. FGF-2 kann in der Form mit 146 Aminosäuren, in der Form mit 153–155 Aminosäuren oder als Mischung davon vorliegen, abhängig vom Verfahren der rekombinanten Herstellung. Siehe US-Patent Nr. 5,143,829 . Ferner können angiogene aktive Muteine des FGF-2-Moleküls verwendet werden. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,859,208 und 5,852,177 .
Biologisch aktive Varianten von FGF-2 sind ebenfalls von den erfindungsgemäßen Verwendungen umfasst. Wie bereits zuvor ausgeführt, umfassen solche Varianten Fragmente, Analoga und Derivate. Solche Varianten sollten die angiogenen Aktivitäten beibehalten und somit "angingen aktiv" sein, wie es unter Verwendung der oben aufgeführten Standard-Bioassays gemessen wird.
Varianten des nativen FGF-2, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden, werden im Allgemeinen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 bis 95% oder mehr, und am stärksten bevorzugt etwa 98% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz des FGF-2-Referenzmoleküls aufweisen. Mit "Sequenzidentität" ist gemeint, dass dieselben Aminosäurereste in der Variante und in dem FGF-2-Referenzmolekül gefunden werden, wenn ein bestimmtes, zusammenhängendes Segment der Aminosäuresequenz der Variante der Aminosäuresequenz des FGF-2-Referenzmoleküls, welches als Basis für den Vergleich dient, gegenübergestellt und mit diesem verglichen wird. Wenn beispielsweise das FGF-2-Referenzmolekül humaner FGF-2 ist, wird eine angingen aktive Variante davon im Allgemein mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt etwa 90% bis 95% oder mehr, und noch stärker bevorzugt etwa 98% oder mehr Sequenzidentität zu der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz vollständiger Länge aufweisen (SEQ ID NO: 3). Darüber hinaus können andere FGF-Rezeptor-bindende Peptide verwendet werden, wie es beispielsweise in WO 98/21237 oder in US 6548634 beschrieben wird.
Ein Polypeptid, das eine biologisch aktive Variante eines Referenzpolypeptidmoleküls von Interesse ist, kann sich von diesem Referenzmolekül durch lediglich 1–15 Aminosäuren, lediglich 1–10, wie beispielsweise durch 6–10, lediglich 5, lediglich 4, 3, 2 oder sogar durch 1 Aminosäure unterscheiden. Die prozentuale Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen wird durch Bestimmung der Anzahl von Positionen, an denen der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen vorkommt, berechnet, wodurch die Anzahl von übereinstimmenden Positionen erhalten wird, Dividieren der Anzahl von übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl von Positionen in dem Segment, das dem Vergleich mit dem Referenzmolekül unterzogen wird, und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, wodurch die prozentuale Sequenzidentität erhalten wird.
Für die Zwecke eines optimalen Alignments der zwei Sequenzen kann das zusammenhängende Segment der Aminosäuresequenz des Varianten-Polypeptids zusätzliche Aminosäurereste oder deletierte Aminosäurereste in Bezug auf die Aminosäuresequenz des Referenzpolypeptidmoleküls aufweisen. Das zusammenhängende Segment, das zum Vergleich mit der Referenzaminosäuresequenz verwendet wird, wird mindestens zwanzig (20) zusammenhängende Aminosäurereste umfassen, und es kann 30, 40, 50, 100 oder mehr Reste umfassen. Korrekturen zur Steigerung der Sequenzidentität, die mit dem Einbringen von Lücken in die Aminosäuresequenz der Variante verbunden sind, können durch Zuweisung von Strafwerten für Lücken (gap penalties) durchgeführt werden. Verfahren des Sequenzalignments sind im Stand der Technik sowohl für Aminosäuresequenzen als auch für Nukleotidsequenzen, die für Aminosäuresequenzen kodieren, hinreichend bekannt.
Die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei beliebigen. Sequenzen kann somit unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4: 11–17. Ein solcher Algorithmus wird in dem ALIGN-Programm (Version 2.0) verwendet, der Teil des GCC-Sequenzaligmnent-Software-Pakets ist. Eine PAM120-Gewichtungstabelle (weight residue table), ein Strafwert für Lückenlängen von 12 (gap length penalty) und ein Lückenstrafwert von 4 (gap penalty) können mit dem ALIGN-Programm verwendet werden, wenn Aminosäuresequenzen verglichen werden. Ein weiteres bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus zur Verwendung beim Vergleich zweier Sequenzen ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, der in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877 modifiziert wurde. Ein solcher Algorithmus ist in die Programme NBLAST und XBLAST von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 eingebaut. BLAST-Nukleotid-Suchen können mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12 durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu einer Nukleotidsequenz sind, welche für das Polypeptid von Interesse kodiert. BLAST-Protein-Suchen können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu dem Polypeptid von Interesse sind. Um Alignments mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped-BLAST verwendet werden, wie es von Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 beschrieben ist. Alternativ dazu kann PSI-Blast verwendet werden, um wiederholte Suchen durchzuführen, die entfernte Verwandtschaftsverhältnisse zwischen Molekülen nachweisen. Siehe Altschul et al. (1997) oben. Bei Verwendung der Programme BLAST, Gapped-BLAST und PSI-Blast können die voreingestellten Parameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe www.ncbi.nlm.nih.gov. Siehe ferner das ALIGN-Programm (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.) und die Programme in dem Wisconsin Sequenzanalyse-Paket, Version 8 (erhältlich von Genetics Compu ter Group, Madison, Wisconsin), beispielsweise das GAP-Programm, bei dem die voreingestellten Parameter des Programms verwendet werden.
Bei Betrachtung der prozentualen Aminosäuresequenzidentität können einige Aminosäurerestpositionen aufgrund von konservativen Aminosäuresubstitutionen unterschiedlich sein, was die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinflusst. In diesen Fällen kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepaßt werden, um der Ähnlichkeit in Bezug auf die konservativ substituierten Aminosäuren Rechnung zu tragen. Solche Anpassungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Siehe beispielsweise Myers und Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11–17.
Der Stand der Technik stellt wesentliche Anleitungen in Bezug auf die Herstellung und Verwendung von FGF-2-Polypeptidvarianten bereit. Bei der Herstellung von Polypeptidvarianten kann der Fachmann problemlos bestimmen, welche Modifikationen an der nativen Nukleotid- oder Aminosäuresequenz zu einer Variante führen, die zur Verwendung als therapeutisch aktiver Bestandteil einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren, welche sich auf die Behandlung von Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit richten, geeignet ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird FGF-2 in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert. Auf diese Weise kann ein pharmazeutisch akzeptabler Träger in Kombination mit dem angiogenen Mittel FGF-2 und mit anderen Bestandteilen in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Mit "pharmazeutisch akzeptablen Träger" ist ein Träger oder ein Verdünnungsmittel gemeint, das gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, um die Lagerung, die Verabreichung und/oder die erwünschte Wirkung der therapeutischen Bestandteile ermög licht. Ein Träger kann darüber hinaus beliebige unerwünschte Nebenwirkungen des angiogenen Mittels, d. h. des FGF-2 oder der Variante davon, verringern. Ein geeigneter Träger sollte stabil sein, d. h. er sollte nicht in der Lage sein, mit anderen Bestandteilen der Formulierung zu reagieren. Er sollte bei den Dosierungen und Konzentrationen, die für die Therapie verwendet werden, keine signifikante lokale oder systemische Nebenwirkung in den Empfängern erzeugen. Solche Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Geeignete Träger für die Erfindung sind diejenigen, die gewöhnlich große stabile Makromoleküle, wie beispielsweise Albumin, Gelatine, Kollagen, Polysaccharid, Monosaccharide, Polyvinylpyrrolidon, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, polymere Aminosäuren, nicht-flüchtige Öle (fixed oils), Ethyloleat, Liposomen, Glucose, Sucrose, Lactose, Mannose, Dextrose, Dextran, Cellulose, Mannitol, Sorbitol, Polyethylenglykol (PEG), Heparinalginate und Ähnliches umfassen. Träger mit langsamer Freisetzung, wie beispielsweise Hyaluronsäure, sind ebenfalls geeignet. Stabilisierende Mittel, wie beispielsweise Trehalose, Thioglycerol und Dithiothreitol (DTT) können ebenfalls zugesetzt werden. Siehe beispielsweise die ebenfalls anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 60/229,238 und dem Titel "Stabilized FGF Formulations Containing Reducing Agents", die vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. FGF-Formulierungen, die wie vorliegend beschrieben DTT umfassen, werden vorliegend als "stabilisierte FGF-DTT-Formulierungen definiert und umfassen stabilisierte FGF-2-DTT-Formatierungen". Andere akzeptable Bestandteile der Zusammensetzung umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Puffer, welche die Isotonizität erhöhen, wie beispielsweise Wasser, Salzlösung, Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren und ihre Salze. Des Weiteren können die angiogenen Mittel der Erfindung unter Verwendung eines Pflasters mit langsamer Freisetzung verabreicht werden. Solche Formulierungen können DMSO umfassen.
Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen können Puffer umfassen, die zu verringertem lokalen Schmerz und verringerter Reizung führen, welche aus der Injektion resultieren. Solche Puffer umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Puffer mit wenig Phosphat und Succinatpuffer. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können darüber hinaus eine solubilisierende Verbindung umfassen, die in der Lage ist, die Löslichkeit eines angiogenen Mittels oder einer Variante zu erhöhen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollte die pharmazeutische Zusammensetzung, die das angiogene Mittel FGF-2 oder eine angingen aktive Varianten davon umfasst, als Einheitsdosis formuliert werden, und sie sollte in injizierbarer oder mittels Infusion verabreichbarer Form formuliert werden, wie beispielsweise als Lösung, Suspension oder Emulsion. Sie kann darüber hinaus in Form eines lyophilisierten Puders vorliegen, der vor der Verabreichung in eine Lösung, eine Suspension oder eine Emulsion umgewandelt werden kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann durch Membranfiltration sterilisiert werden, wodurch auch Aggregate entfernt werden, und sie kann in Einheitsdosis- oder in Multi-Dosisbehältern, wie beispielsweise in versiegelten Fläschchen oder Ampullen, gelagert werden.
Das Verfahren zur Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist im Stand der Technik allgemein bekannt. Eine ausführliche Diskussion der Formulierung und Auswahl von pharmazeutisch akzeptablen Trägern, stabilisierenden Mitteln und Isomolyten kann in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Auflage; Mack Pub. Co.: Eaton, Pennsylvania 1990) gefunden werden, das vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen können darüber hinaus in Form von Zusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung formuliert werden, um das Vorhandensein des pharmazeutisch aktiven Mittels in dem behandelten Patienten zu verlängern, üblicherweise für mehr als 1 Tag. Zahlreiche Verfahren zur Herstellung einer Formulierung mit anhaltender Freisetzung sind im Stand der Technik bekannt und in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Auflage; Mack Pub. Co.: Eaton, Pennsylvania, 1990) offenbart. Im Allgemeinen kann das Mittel in semipermeablen Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren eingeschlossen werden. Diese Matrizes können als Filme oder Mikrokapseln ausgeformt sein. Beispiele für solche Matrizes umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Polyester, Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22: 547–556), Polylactide ( US-Patent Nr. 3,773,919 und EP 58,481 ), Polyactatpolyglykolat (PLGA), Hydrogele (siehe beispielsweise, Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167–277; Langer (1982) Chem. Tech. 12: 98–105), nicht degradierbares Ethylen-Vinylacetat, degradierbare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie beispielsweise das Lupron DepotTm, und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ). Geeignete Mikrokapseln können ferner Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln und Polymethylmethacylat-Mikrokapseln umfassen, die durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt wurden. Mikropartikel, wie beispielsweise Heparinalginatkügelchen, können ebenfalls verwendet werden. Darüber hinaus können auch Mikroemulsionen oder kolloidale Wirkstoff-Verabereichungssysteme, wie beispielsweise Liposomen und Albuminmikrosphären verwendet werden. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Auflage; Mack Pub. Co.: Eaton, Pennsylvania, 1990).
Insbesondere können ein Säugetier-Fibroblasten-Wachstumsfaktor bovinen Ursprungs, der FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), der auch als basischer FGF (bFGF) bekannt ist, und humaner FGF-2 aus 3 (SEQ ID NO: 4) oder ein angingen akti ves Fragment oder Mutein davon bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nukleotidsequenz, die für bovinen FGF-2 kodiert, ist in 1 gezeigt (SEQ ID NO: 1). Die Nukleotidsequenz, die für humanen FGF-2 kodiert, ist in 3 gezeigt (SEQ ID NO: 3). Siehe ferner US-Patent Nr. 5,604,293 . Die Dosis von FGF-2, von der angenommen wird, dass sie zu einem klinischen Nutzen bei einem Patienten führt, dessen Bewegungsfähigkeit durch eine Claudicatio, die mit einer PAD verbunden ist, beschränkt ist, reicht von etwa 0,1 μg/kg bis etwa 100 μg/kg FGF-2, vorzugsweise von etwa 0,20 μg/kg bis etwa 75 μg/kg, stärker bevorzugt von etwa 0,4 μg/kg bis etwa 50 μg/kg, noch stärker bevorzugt von etwa 0,50 μg/kg bis etwa 35 μg/kg, noch stärker bevorzugt von etwa 1,0 μg/kg bis etwa 30 μg/kg und am wahrscheinlichsten von 0,3 bis 3,5 mg als Standard-Dosis. Somit ist die therapeutisch wirksame Dosis von FGF-2, wie beispielsweise von rekombinantem FGF-2 (rFGF-2), in einer Ausführungsform etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg, etwa 1 μg/kg bis 3 μg/kg, etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg, etwa 5 μg/kg bis etwa 7 μg/kg, etwa 7 μg/kg bis etwa 8 μg/kg, etwa 8 μg/kg bis etwa 9 μg/kg, etwa 9 μg/kg bis etwa 9,9 μg/kg, wie beispielsweise etwa 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 oder 9,9 μg/kg bis etwa 10 μg/kg, etwa 10 μg/kg bis etwa 15 μg/kg, etwa 15 μg/kg bis etwa 20 μg/kg, etwa 20 μg/kg bis etwa 30 μg/kg, etwa 30 μg/kg bis etwa 40 μg/kg, etwa 40 μg/kg bis etwa 60 μg/kg, etwa 60 μg/kg bis etwa 80 μg/kg FGF-2, abhängig von der Art und Weise der Verabreichung.
Es ist praktisch, die Dosis des angiogenen Mittels in absoluteren Werten zu definieren, die nicht vom Gewicht des zu behandelnden Patienten abhängen. In dieser Ausführungsform wird die Dosis als eine "Standard"-Dosis bezeichnet. Bei dieser Definition reicht die zu verabreichende Standard-Dosis gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung von etwa 4,0 μg bis etwa 7,2 mg, wie beispielsweise etwa 4,0 μg bis etwa 0,3 mg, vor zugsweise von etwa 0,3 mg bis etwa 1,0 mg, stärker bevorzugt von etwa 1,0 mg bis etwa 2,0 mg, noch stärker bevorzugt von 2,0 mg bis etwa 2,5 mg, von etwa 2,5 mg bis etwa 3,5 mg, von etwa 3,5 mg bis etwa 4,5 mg, von etwa 4,5 mg bis etwa 5,5 mg, von etwa 5,5 mg bis etwa 6,5 mg, bis zu etwa 7,2 mg. In dieser Ausführungsform ist die Standard-Dosis eine ausreichende Menge von FGF-2, um die Dosierung in irgendeinem Patienten aus der Mehrzahl der humanen PAD-Patienten zu bewerkstelligen, vom kleinsten Patienten (z. B. 40 kg) bei der geringsten Dosierung (etwa 0,1 μg/kg) bis zu den größeren Patienten (z. B. 150 kg) bei höheren Dosierungen (etwa 48 μg/kg für diese Ausführungsform). Wenn beispielsweise ein Patient 70 kg wiegt, reicht die Standard-Dosis von etwa 0,2 mg bis etwa 3,0 mg, von etwa 0,5 mg bis etwa 2,5 mg, vorzugsweise etwa 2,1 mg, abhängig von der Art und Weise der Verabreichung.
Wenn geringere Dosen von FGF-2 vorgeschlagen werden, wie beispielsweise zwischen 0,1 μg/kg bis etwa 10 μg/kg, reicht die gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verabreichende Standard-Dosierung von etwa 7,0 μg bis etwa 0,7 mg, von etwa 8 μg bis etwa 0,6 mg, von etwa 9 μg bis etwa 0,5 mg, von etwa 0,1 mg bis etwa 0,4 mg, und ist vorzugsweise etwa 0,21 mg für einen Patienten mit 70 kg. Somit reicht die Standard-Dosierung in diesen Ausführungsformen für einen Patienten mit 70 kg von etwa 7,0 μg bis etwa 0,7 mg, einschließlich 8 μg, 9 μg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,65 mg, bis zu etwa 0,7 mg.
Da FGF-2 ein Glycosaminoglycan(z. B. Heparin-)bindendes Protein ist, und die Gegenwart eines Glycosaminoglycans (auch als "Proteoglycan" oder als "Mucopolysaccharid" bekannt) die Aktivität und Fläche unter der Kurve (area under the curve, AUC) optimiert, können die erfindungsgemäßen Dosierungen von FGF-2 innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach einer intravenösen (IV) Verabreichung eines Glycosaminoglycans, wie beispielswei se Heparin, verabreicht werden. Zahlreiche fraktionierte und unfraktionierte Heparine, Proteoglycane und sulfonierte Mucopolysaccharide, wie beispielsweise Chondroitinsulfat, können bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Heparine mit geringem Molekulargewicht (< 10000d) und unfraktionierte (d. h. mit hohem Molekulargewicht) Heparine (> 10000d) können bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Moleküle können zusammen mit dem rFGF-2 oder innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach Verabreichung des rFGF-2 verabreicht werden. Heparin ist mit 20 bis 80 Einheiten/kg und vorzugsweise mit 40 Einheiten/kg geeignet dosiert.
In einer Ausführungsform enthält die Einheitsdosis eine ausreichende Menge von FGF-2, die von etwa 0,1 μg/kg bis etwa 80 μg/kg reicht. Noch üblicher ist es, dass die systemische Einheitsdosis 0,3 mg bis 3,5 mg des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) oder des FGF-2 von 3 (SEQ ID NO: 4) umfasst oder ein angiogenes aktives Fragment oder Mutein davon. Es können Dosierungen für die lokale Verabreichung verwendet werden, die etwa 0,01 μg bis etwa 500 μg und bis zu etwa 3 mg umfassen. Bei lokaler Verabreichung mit IM-Injektionen kann die Dosis der intraarteriell verabreichten Dosis entsprechen, oder ein zehntel oder ein hundertstel davon betragen. Die Einheitsdosis wird üblicherweise in Form einer Lösung bereitgestellt oder sie wird aus der lyophilisierten Form rekonstituiert, und sie enthält die oben genannte Menge von FGF-2 sowie eine wirksame Menge eines oder mehrerer pharmazeutisch akzeptabler Puffer, Stabilisierungsmittel und/oder anderer Hilfsstoffe, die vorliegend an anderer Stelle beschrieben werden.
Der rekombinante FGF-2 mit der Aminosäuresequenz von 2 (SEQ ID NO: 2) wird hergestellt, wie es in dem US-Patent Nr. 5,155,214 mit dem Titel "Basic Fibroblast Growth Factor", das am 13. Oktober 1992 erteilt wurde, beschrieben ist. Wie in dem '214-Patent offenbart ist, wird eine DNA nach 1 (SEQ ID NO: 1), welche für einen bFGF (nachfolgend "FGF-2" genannt) nach 2 (SEQ ID NO: 2) kodiert, in einen Klonierungsvektor eingebracht, wie beispielsweise in pBR322, pMB9, Col E 1, pCRI, RP4 oder λ-Phage, und der Klonierungsvektor wird dazu verwendet, entweder eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle zu transformieren, wobei die transformierte Zelle den FGF-2 exprimiert. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Hefezelle, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae. Der resultierende FGF-2 vollständiger Länge, der exprimiert wird, weist gemäß 2 (SEQ ID NO: 2) 146 Aminosäuren auf. Obwohl der FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) vier Cysteine aufweist, d. h. an den Aminosäurepositionen 25, 69, 87 und 92, gibt es keine internen Disulfidbrücken ['214 in Spalte 6, Zeilen 59–61]. Wenn jedoch eine Quervernetzung unter oxidativen Bedingungen stattgefunden hat, wäre es wahrscheinlich, dass diese zwischen den Resten in den Positionen 25 und 69 auftritt.
Der Säugetier-FGF-2 mit 146 Resten nach 2 (SEQ ID NO: 2), der bovinen Ursprungs ist, sowie auch der entsprechende humane FGF-2 mit 146 Resten nach 3 (SEQ ID NO: 4) wird in vivo zunächst als Polypeptid mit 155 Aminosäuren synthetisiert (Abraham et al. (1986) EMBO J. 5(10): 2523–2528; 4 (SEQ ID NO: 6) ist bovinen Ursprungs; 5 (SEQ ID NO: 8) ist humanen Ursprungs). Bei Vergleich mit den FGF-2-Molekülen vollständiger Länge mit 155 Resten fehlen den FGF-2-Molekülen mit 146 Resten die ersten Aminosäurereste, Met-Ala-Ala-Gly-Ser-Ile-Thr-Thr-Leu (SEQ ID NO: 9) am N-Terminus des entsprechenden bovinen und humanen FGF-2-Moleküls vollständiger Länge (4 (SEQ ID NO: 6) bzw. 5 (SEQ ID NO: 8)). Der FGF-2 humanen oder bovinen Ursprungs mit 155 Resten und biologisch aktive Varianten davon können ebenfalls in den Zusammensetzung und Verfahren der vorliegenden Erfindung in der für das bovine und für das humane FGF-2-Molekül mit 146 Resten beschriebenen Weise verwendet werden. Es ist wiederum verständlich, dass die Form mit 155 Resten mit 153–155 Resten oder Mischungen davon vorliegen kann, abhängig vom Verfahren der Herstellung des rekombinanten Proteins. Der Säugetier-FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) unterscheidet sich von humanem FGF-2 von 3 (SEQ ID NO: 4) in zwei Positionen. Die Aminosäurereste in den Positionen 112 und 128 des Säugetier-FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) sind Ser bzw. Pro, wohingegen in humanem FGF-2 (3; SEQ ID NO: 4) diese Reste Thr bzw. Ser sind. Für die Formen mit 155 Resten treten diese Unterschiede an den Positionen 121 und 137 von 4 (SEQ ID NO: 6; FGF-2 bovinen Ursprungs) und 5 (SEQ ID NO: 8; FGF-2 humanen Ursprungs) auf.
Der rekombinante FGF-2, der im Rahmen der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird, wurde auf eine pharmazeutische Qualität gereinigt (90% oder höhere Reinheit nach Gewicht des Gesamtproteins, vorzugsweise 92% oder höhere Reinheit, stärker bevorzugt 95% oder höhere Reinheit, vorzugsweise im Wesentlichen rein, d. h. etwa 98% Reinheit nach Gewicht des Gesamtproteins), wobei die Methoden verwendet wurden, die ausführlich in US-Patent Nr. 4,956,455 mit dem Titel "Bovine Fibroblast Growth Factor" beschrieben sind, das am 11. September 1990 erteilt wurde, und das vorliegend durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist. Die ersten beiden Schritte, die bei der Aufreinigung des rekombinanten FGF-2 angewendet wurden, der in einer Einheitsdosis einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, sind herkömmliche Ionen-Austauschschritte und HPLC-Aufreinigungsschritte, die zuvor beschrieben wurden. Der dritte Schritt, den das '455-Patent als "Schlüssel-Aufreinigungsschritt" bezeichnet ['455 in Spalte 7, Zeilen 5–6] ist eine Heparin-Sepharose^®-Affinitätschromatographie, bei der die starke Heparin-bindende Affinität des FGF-2 ausgenutzt wird, um eine Aufreinigung um einen Faktor von mehreren tausend zu er reichen, wenn bei ungefähr 1,4 M und 1,95 M NaCl eluiert wird ['455 in Spalte 9, Zeilen 20–25]. Die Polypeptid-Homogenität kann durch Reverse Phase-Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC) bestätigt werden. Ein Pufferaustausch wurde durch eine SEPHADEX^® G-25 (M)-Gelfiltrationschromatographie erreicht.
Neben dem FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) mit 146 Resten kann das therapeutisch aktive Mittel in der erfindungsgemäßen Einheitsdosis auch ein "angingen aktives Fragment" des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) umfassen. Mit dem Begriff "angingen aktives Fragment des FGF-2 nach 2 (SEQ ID NO: 2)" ist ein Fragment von FGF-2 gemeint, das etwa 80% der 146 Reste von 2 (SEQ ID NO: 2) aufweist und die angiogene Wirkung des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) beibehält. Diese Definition von "angingen aktives Fragment" betrifft auch den humanen FGF-2 von 3 (SEQ ID NO: 4). Ein "angiogen aktives Fragment" des FGF-2 von 4 (SEQ ID NO: 6) oder von 5 (SEQ ID NO: 8) ist ein Fragment von FGF-2, das etwa 80% der 155 Reste von 4 (SEQ ID NO: 6) bzw. von 5 (SEQ ID NO: 8) aufweist.
Um angingen aktiv zu sein, sollte das FGF-2-Fragment zwei Zellbindungsstellen und mindestens eine der zwei Heparinbindungsstellen aufweisen. Die zwei putativen Zellbindungsstellen des analogen humanen FGF-2 mit 146 Resten (hFGF-2; SEQ ID NO: 4) treten etwa an den Positionen 36–39 und 77–81 davon auf. Siehe Yoshida et al. (1987) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 84: 7305–7309 in 3. Die zwei putativen Heparinbindungsstellen von hFGF-2 treten etwa an den Positionen 18–22 und 107–111 davon auf. Siehe Yoshida (1987) in 3. Im Hinblick auf die wesentliche Ähnlichkeit zwischen den Aminosäuresequenzen für humanen FGF-2 (hFGF-2) und bovinen FGF-2 (bFGF-2) wird erwartet, dass die Zellbindungsstellen für bFGF-2 (2 (SEQ ID NO: 2)) ebenfalls etwa an den Positionen 36–39 und 77–81 davon vorkommen, und dass die Heparinbin dungsstellen etwa an den Positionen 18–22 und 107–111 davon vorkommen. Die zusätzlichen 9 Reste der Form mit 155 Resten beeinflussen die relativen Positionen dieser Bindungsstellen in Bezug auf die in 2 (SEQ ID NO: 2; FGF-2 bovinen Ursprungs) oder in 3 (SEQ ID NO: 4; FGF-2 humanen Ursprungs) gezeigten Reste 1–146 nicht. Somit kommen bei der Form des humanen FGF-2 mit 155 Resten (5; SEQ ID NO: 8) zwei putative Zellbindungsstellen etwa an den Positionen 45–48 und 86–90 davon vor, und die zwei putativen Heparinbindungsstellen kommen etwa an den Positionen 27–31 und 116–120 davon vor. Im Hinblick auf die wesentlichen Ähnlichkeit zwischen dem bovinen Protein mit 155 Resten und dem humanen Protein mit 155 Resten wird wiederum erwartet, dass die zwei putativen Zellbindungsstellen etwa an den Positionen 45–48 und 86–90 vorkommen, und dass die zwei putativen Heparinbindungsstellen etwa an den Positionen 27–31 und 116–120 des bovinen FGF-2 mit 155 Resten (4; SEQ ID NO: 6) vorkommen. Im Einklang mit dem oben Gesagten ist es im Stand der Technik hinreichend bekannt, dass N-terminale Trunkierungen des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) seine angiogene Aktivität in Kühen nicht beseitigen. Der Stand der Technik offenbart insbesondere einige natürlich vorkommende und biologisch aktive Fragmente des FGF-2, die N-terminale Trunkierungen in Bezug auf den FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) aufweisen. Ein aktiver und trunkierter bFGF-2 mit den Resten 12–146 von 2 (SEQ ID NO: 2) wurde in boviner Leber gefunden, und ein weiterer aktiver und trunkierter bFGF-2 mit den Resten 16–146 von 2 (SEQ ID NO: 2) wurde in der bovinen Niere, in der Nebenniere und in den Hoden gefunden. (Siehe US-Patent Nr. 5,155,214 in Spalte 6, Zeilen 41–46, in dem auf Ueno et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Comm. 138: 580–588 verwiesen wird). Weitere Fragmente des bFGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von denen bekannt ist, dass sie FGF-Aktivität aufweisen, sind FGF-2(24–120)-OH und FGF-2(30–110)-N1712 [ US-Patent Nr. 5,155,214 in Spalte 6, Zeilen 48–52]. Diese zuletzt genannten Fragmente enthalten sowohl die Zell bindungsteile von FGF-2 (2 (SEQ ID NO: 2)) als auch eines der Heparin-bindenden Segmente (Reste 107–111). Demgemäß umfassen die angingen aktiven Fragmente von Säugetier-FGF üblicherweise diejenigen terminal trunkierten Fragmente eines FGF-2, die mindestens Reste aufweisen, welche den Resten 30–110 des FGF-2 in 2 (SEQ ID NO: 2) entsprechen; noch üblicher mindestens Reste, die den Resten 18–146 von FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) entsprechen.
Es ist verständlich, dass basierend auf den nativen FGF-Sequenzen andere synthetische Peptide verwendet werden können, solange diese Peptide an FGF-Rezeptoren binden. Zusätzliche, hybride FGF-Moleküle können konstruiert werden, einschließlich Peptide aus verschiedenen nativen Sequenzen sowie Kombinationen von nativen und synthetischen Sequenzen. Die Hybrid-Moleküle werden wiederum die Fähigkeit beibehalten, an FGF-Rezeptoren zu binden.
Die Einheitsdosis der vorliegenden Erfindung umfasst ferner ein "angingen aktives Mutein" des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4), von 4 (SEQ ID NO: 6) oder von 5 (SEQ ID NO: 8). Mit dem Begriff "angingen aktives Mutein" ist eine mutierte Form des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4), von 4 (SEQ ID NO: 6) oder von 5 (SEQ ID NO: 8) gemeint, die strukturell mindestens 80%, vorzugsweise 90%, der 146 Reste der in 2 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Sequenz von FGF-2, der 146 Reste der in 3 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Sequenz von humanem FGF-2, der 155 Reste der in 4 (SEQ ID NO: 6) gezeigten Sequenz von FGF-2 oder der 155 Reste der in 5 (SEQ ID NO: 8) gezeigten Sequenz von FGF-2 in ihren jeweiligen Positionen beibehält, und die funktionell die angiogene Aktivität der jeweils unmutierten Form von FGF-2 erhält. Vorzugsweise sind die Mutationen "konservative Substitutionen" unter Verwendung von L-Aminosäuren, wobei eine Aminosäure durch eine andere biologisch ähnliche Aminosäure ersetzt wird. Beispiele für konservative Substitutionen umfassen die Substitutionen eines hydrophoben Rests, wie beispielsweise Ile, Val, Leu, Pro oder Gly gegen einen anderen, oder die Substitution eines polaren Restes gegen einen anderen, wie beispielsweise zwischen Arg und Lys, zwischen Glu und Asp oder zwischen Gin und Asn usw. Im Allgemeinen werden die geladenen Aminosäuren als gegeneinander austauschbar angesehen. Um jedoch die Substitution konservativer zu gestalten, berücksichtigt man sowohl die Größe als auch die Art der Ladung (sofern vorhanden) der Seitenkette. Geeignete Substitutionen umfassen die Substitutionen von Serin gegen ein oder gegen beide Cysteine an den Positionen 87 und 92, die nicht an einer Disulfidbildung beteiligt sind. Andere geeignete Substitutionen umfassen eine beliebige Substitution, bei der mindestens ein bestehendes Cystein gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, sodass das Mutein eine größere Stabilität unter sauren Bedingungen aufweist, siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,852,177 , das vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Eine solche Substitution ist der Austausch der Cysteinreste gegen neutrale Aminosäuren, wie beispielsweise: Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, Phenylalanin, Histidin, Tryptophan, Serin, Threonin und Methionin ( US-Patent Nr. 5,852,177 ). Vorzugsweise werden die Substitutionen am N-Terminus von FGF-2 eingebracht, der nicht mit der angiogenen Aktivität im Zusammenhang steht. Wie jedoch oben erwähnt sind konservative Substitutionen für die Einbringung im Bereich des gesamten Moleküls geeignet.
Der Fachmann ist unter Verwendung von hinreichend bekannten Methoden in der Lage, ein oder mehrere Punktmutationen in die DNA von 1 (SEQ ID NO: 1), von 3 (SEQ ID NO: 3), von 4 (SEQ ID NO: 5) oder von 5 (SEQ ID NO: 7) einzubringen, um die Expression eines FGF-2-Polypeptidemuteins (oder eines Fragments eines Muteins) mit angiogener Aktivität zu erzielen, um diese in der Einheitsdosis, in den Zusammen setzungen und in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Um ein angingen aktives Mutein von FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4), von 4 (SEQ ID NO: 6) oder von 5 (SEQ ID NO: 8) herzustellen, verwendet man Standardmethoden zur zielgerichteten Mutagenese, die im Stand der Technik bekannt sind und/oder in Gilman et al. (1979) Gene 8: 81 oder in Roberts et al. (1987) Nature 328: 73 1 beschrieben sind, wobei eine oder mehrere Punktmutationen in die cDNA von 1 (SEQ ID NO: 1), von 3 (SEQ ID NO: 3), von 4 (SEQ ID NO: 5) oder von 5 (SEQ ID NO: 7) eingebracht werden, welche den FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4), von 4 (SEQ ID NO: 6) oder von 5 (SEQ ID NO: 8) kodieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen eine angingen aktive Dosis von Säugetier-FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4), von 4 (SEQ ID NO: 6), von 5 (SEQ ID NO: 8) oder ein angingen aktives Fragment oder Mutein davon, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Üblicherweise ist die sichere und angingen wirksame Dosis der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Form und einer Größe, die für die Verabreichung an einen humanen Patienten geeignet ist, und sie umfasst: (i) 1,0 μg/kg bis 30,0 μg/kg eines FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) oder eines angingen aktiven Fragments oder Muteins davon, (ii) und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. In anderen Ausführungsformen umfasst die sichere und angingen wirksame Dosis etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg, etwa 1 μg/kg bis etwa 3 μg/kg, etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg, etwa 5 μg/kg bis etwa 7 μg/kg, etwa 7 μg/kg bis etwa 8 μg/kg, etwa 8 μg/kg bis etwa 9 μg/kg, etwa 9 μg/kg bis etwa 9,9 μg/kg, wie beispielsweise etwa 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 oder 9,9 μg/kg, bis zu etwa 10 μg/kg, etwa 10 μg/kg bis etwa 15 μg/kg, etwa 15 μg/kg bis etwa 20 μg/kg, etwa 20 μg/kg bis etwa 30 μg/kg, etwa 30 μg/kg bis etwa 40 μg/kg, etwa 40 μg/kg bis etwa 60 μg/kg, etwa 60 μg/kg bis etwa 80 μg/kg des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4), von 4 (SEQ ID NO: 6), von 5 (SEQ ID NO: 8) oder eines angingen aktiven Fragments oder Muteins davon, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung umfasst 0,1 mg/ml bis 10 mg/ml FGF-2, noch üblicher 0,3 mg/ml bis 0,5 mg/ml, insbesondere rekombinanter FGF-2 (rFGF-2) mit der in 2 (SEQ ID NO: 2) oder mit der in 3 (SEQ ID NO: 4) gezeigten Sequenz oder ein angingen aktives Fragment oder Mutein davon, 10 mM Thioglycerol, 135 mM NaCl, 10 mM Natriumcitrat und 1 mM EDTA, pH 5,0. Ein geeignetes Verdünnungsmittel oder Spülungsmittel für die oben beschriebene Zusammensetzung ist ein beliebiger der oben beschriebenen Träger. Üblicherweise ist das Verdünnungsmittel die Trägerlösung selbst, die 10 mM Thioglycerol, 135 mM NaCl, 10 mM Natriumcitrat und 1 mM EDTA, pH 5,0 umfasst. Der rFGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) oder ein angingen aktives Fragment oder Mutein davon ist über längere Zeiträume in flüssiger Form instabil. Um die Stabilität und die Lagerfähigkeit zu maximieren, sollte die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von rFGF-2 oder eines angingen aktiven Fragments oder Muteins davon in einem pharmazeutisch akzeptablen wässrigen Träger umfasst, gefroren bei –60°C gelagert werden. Aufgetaut ist die Lösung für 1 Monat unter Kühlschrankbedingungen stabil. Eine typische Einheitsdosis würde etwa 5 bis 10 ml der oben beschriebenen Zusammensetzung mit 1,5–8 mg FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) oder von 3 (SEQ ID NO: 4) umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine Einheitsdosis des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), von 3 (SEQ ID NO: 4) oder ein angingen aktives Fragment oder Mutein davon in lyophilisierter (gefriergetrockneter) Form. In dieser Form könnte die Einheitsdosis FGF-2 bei Raumtemperatur für wesentlich länger als 6 Monate ohne Verlust von therapeutischer Wirksamkeit gelagert werden. Die Lyophilisation wird erreicht, indem man eine Vielzahl von Fläschchen, die jeweils eine Einheitsdosis des erfindungsgemäßen FGF-2 enthalten, zügig unter verringertem Druck einfriert. Lyophilisationsgeräte, die die oben beschriebene Lyophilisation durchführen, sind kommerziell verfügbar und problemlos durch den Fachmann einsetzbar. Vor Verabreichung an den Patienten wird das lyophilisierte Produkt in einer bekannten Konzentration rekonstitutiert, vorzugsweise erfolgt dies in dem jeweiligen Fläschchen mit einem geeigneten sterilen wässrigen Verdünnungsmittel, üblicherweise 0,9% (oder weniger) sterile Salzlösung, oder ein kompatibler steriler Puffer, oder sogar steriles, deionisiertes Wasser. Siehe beispielsweise, die ebenfalls anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 60/229,238 mit dem Titel "Stabilized FGF Formulations containing Reducing Agents", die vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Abhängig vom Gewicht des Patienten in kg wird eine Einzeldosis, die von 0,2 μg/kg bis 36 μg/kg des FGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2), des FGF-2 von 3 (SEQ ID NO: 4) oder eines angingen aktiven Fragments oder Muteins davon umfasst, dem Fläschchen als rekonstituiertes Produkt zur Verabreichung an den Patienten entnommen. Beispielsweise würde man bei einem durchschnittlichen Mann von 70 kg, dem eine Dosis von 24 μg/kg verabreicht wird, dem Fläschchen ein ausreichendes Volumen des rekonstituierten Produkts entnehmen, damit dieser eine Infusion von (70 kg × 24 μg/kg) 1680 μg (d. h. 1,680 mg) erhält.
Die als Lösung vorliegende pharmazeutische Zusammensetzung ist im Allgemeinen durch Infusion der Einheitsdosis im wesentlichen kontinuierlich über einen Zeitraum von etwa 10 bis etwa 30 Minuten zu verabreichen, obwohl es verständlich sein soll te, dass die Zusammensetzung auch über einen längeren Zeitraum verabreicht werden kann. Wenn die Zusammensetzung in mehr als ein Blutgefäß zu verabreichen ist, wird üblicherweise ein Teil (z. B. eine Hälfte) der Einheitsdosis in ein erstes Gefäß verabreicht, gefolgt von der Verabreichung in ein zweites Gefäß. Bei Verwendung des oben beschriebenen Repositionierungsverfahrens können Teile der Einheitsdosis an eine Vielzahl von Gefäßen verabreicht werden, bis die gesamte Einheitsdosis verabreicht worden ist. Nach der Verabreichung wird der Katheter unter Verwendung herkömmlicher Protokolle, die im Stand der Technik bekannt sind, entfernt. Anzeichen für eine Angiogenese und für eine therapeutische Verbesserung, wie beispielsweise verringerte Claudicatio, Verbesserung des Knöchel-Arm-Index, Verbesserung der maximalen Belastungszeit beim Gehen, Verbesserung der Fähigkeit des Stufensteigens, verringerter Körperschmerz, Verbesserung oder Verhinderung einer kritischen Extremitätenischämie und verbesserte Lebensqualität des Patienten werden bereits 2 Wochen bis 1 Monat nach Verabreichung des FGF-2 beobachtet.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen und nicht beschränken.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel 1: Einheitsdosis von rFGF-2, die in einer klinischen Phase I-Studie verwendet wird
Der rekombinant hergestellte FGF-2 (rFGF-2) mit der in 2 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Sequenz wurde als Einheitsdosis und als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert. Die verschiedenen Formulierungen sind nachstehend beschrieben.
Die rFGF-2-Einheitsdosis wurde als Flüssigkeit in 3 cm³-Glasfläschchen vom Typ I mit einem laminierten grauen Butyl-Gummistopfen und roter Aufschnapp-Versiegelung bereitgestellt. Die rFGF-2-Einheitsdosis enthielt 1,2 ml 0,3 mg/ml rFGF-2 von 2 (SEQ ID NO: 2) in 10 mM Natriumcitrat, 10 mM Monothioglycerol, 1 mM Dinatriumdihydrat-EDTA (Molekulargewicht 372,2), 135 mM Natriumchlorid, pH 5,0. Somit enthielt jedes Fläschchen (und jede Einheitsdosis) in absoluten Zahlen 0,36 mg rFGF-2. Die Fläschchen, welche die Einheitsdosis in flüssiger Form enthielten, wurden bei 2°C bis 8°C gelagert.
Das Verdünnungsmittel wurde in 5 cm³-Glasfläschchen vom Typ I mit einem laminierten grauen Gummistopfen und roter Aufschnapp-Versiegelung bereitgestellt. Das rFGF-2-Verdünnungsmittel enthielt 10 mM Natriumcitrat, 10 mM Monothioglycerol, 135 mM Natriumchlorid, pH 5,0. Jedes Fläschchen enthielt 5,2 ml rFGF-2-Verdünnungslösung und wurde bei 2°C bis 8°C gelagert. Solche Mittel können auch verabreicht werden, um das Fortschreiten einer kritischen Extremitätenischämie zur Amputation zu verhindern.
Die pharmazeutische rFGF2-Zusammensetzung, die mittels Infusion verabreicht wurde, wurde durch Verdünnung der rFGF-2-Einheitsdosis mit dem rFGF-Verdünnungsmittel hergestellt. Um die EDTA-Konzentration unter der Grenze von 100 μg/ml zu halten, wurde das Gesamtinfusionsvolumen bis auf 40 ml erhöht, wenn proportional höhere absolute Mengen FGF-2 an Patienten verabreicht wurde.
Beispiel 2: Klinische PAD-Phase II-Studie
Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (peripheral artery disease, PAD), die durch einen Knöchel-Arm-Index (ABI) im Ruhezustand von weniger als 0,9 definiert ist, ist ein allgemeiner Zustand, der etwa 15% der Erwachsenen betrifft, die älter als 55 Jahre sind. Etwa 33% dieser Individuen weisen Symptome einer Claudicatio auf; bei etwa 25% wird ein Fortschreiten verzeichnet werden. Mit Verschlimmerung der Beschränkung des Blutflusses entwickelt sich das Spektrum der PAD von mild zu moderat zu schwerer Claudicatio, gefolgt durch eine die Extremität bedrohende Ischämie, die zunächst durch Ruheschmerz charakterisiert ist, anschließend durch schlechte Wundheilung und ein drohendes oder offensichtliches Gangrän.

Es wurde eine Phase II-Studie durchgeführt, um die Wirksamkeit der intraarteriellen Verabreichung von rFGF-2 auf die Bewegungsfähigkeit von Patienten mit Claudicatio intermittens aufgrund infrainguinaler PAD festzustellen. Die PAD-Phase II-Studie war eine multizentrische, randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte, behandlungsfindende Studie mit rFGF-2 zur Evaluierung der Sicherheit, der pharmakokinetischen Daten und der Wirksamkeit durch intraarterielle (IA) Infusion über 20 Minuten in PAD-Probanden mit moderater bis schwerer Claudicatio intermittens. Die Hauptauswahlkriterien für die Aufnahme eines Patienten in die Studie war ein Alter von mehr als 40 Jahren, eine durch Claudicatio verringerte Bewegung, ein Knöchel-Arm-Index (ABI) von weniger als 0,8 im Ruhezustand, offensichtlicher Zustrom im Oberschenkel, eine medizinische Stabilität für mehr als 4 Monate und eine Einverständniserklärung. Hauptauswahlkriterien für den Ausschluss eines Patienten aus der Studie waren ein Hinweis auf eine Malignität (gemäß den ACS-Richtlinien), Kreatinin von mehr als 2,0 mg/dl, Urinprotein von mehr als oder entsprechend 2+ oder mehr als 300 mg/Tag, eine proliferative Retinopathie, und/oder andere Bedingungen, welche die Sicherheit oder Einhaltung beeinflussen. 190 Patienten nahmen an der PAD-Phase II-Studie teil. Die Basiseigenschaften der Patientenpopulation sind in den Tabellen 1–3 gezeigt.

Tabelle 1: Basislinien-Eigenschaften der Patientenpopulation der klinischen PAD-Phase II-Studie. ABI (Knöchel-Arm-Druckindex); PWT (maximale Belastungszeit beim Gehen, auf einem Laufband bei 2 Meilen/Stunde mit einer alle 2 Minuten zunehmenden Steigung gemessen; COT (claudication onset time, Zeitpunkt des Beginn der Claudicatio).
	Placebo E	INZEL	DOPPEL	Jeder FGF
Anzahl der Probanden	63	66	61	127
mittleres Alter (Jahre)	67	65	68	67
männlich	73%	71%	82%	76%
weiblich	27%	29%	18%	24%
ABI im Ruhezustand (Index)	0,55	0,57	0,55	0,56
PWT an der Basislinie	5,32	5,15	5,81	5,48
COT an der Basislinie	1,97	2,03	2,20	2,13
aktuell Raucher	38%	24%	21%	23%
vormals Raucher	43%	59%	61%	60%
niemals Raucher	19%	17%	18%	17%
strukturierte Bewegung	56%	50%	49%	50%

Tabelle 2: Gleichzeitige Diagnosen der Zielpatientenpopulation in der klinischen PAD-Phase II-Studie. CAD = koronare Herzkrankheit (coronary artery disease); CHF = angeborener Herzfehler (congestive heart failure); MI = Myokardinfarkt; PTCA = perkutane transluminale koronare Angioplas tie (percutaneous transluminal coronary angioplasty); S/P CABG = Koronararterien-Bypass (coronary artery bypass graft); PTI = perkutane transluminale Intervention-Angioplastie (percutaneous transluminal intervention-angioplasty).
	Placebo	EINZEL	DOPPEL Je	der FGF
HERZ
CAD-Vorgeschichte	62%	58%	62%	60%
CHF-Vorgeschichte	8%	14%	11%	13%
Zuvor MI	29%	30%	31%	30%
CAD-Angioplastie (PTCA)	21%	27%	21%	24%
S/P CABG	41%	33%	31%	32%
zuvor PAD-Eingriff	48%	44%	56%	50%
zuvor PTI	21%	27%	21%	24%
CEREBROVASKULÄR
zuvor Schlaganfall	8%	6%	7%	6%
RISIKOFAKTOREN
Diabetes mellitus	36%	27%	38%	33%
Hyperlipidämie	75%	77%	75%	76%
Hypertonie	79%	67%	75%	71%

Tabelle 3: Inzidenz der peripheren Angioplastie und der Revaskularisierung von Extremitäten in der Zielpopulation der klinischen PAD-Phase-II Studie. Es sind Indikatoren für die Lebensqualität gezeigt, wie sie durch WIQ und SF-36 gemessen wurden.
	Placebo	EINZEL	DOPPEL	Jeder FGF
periphere Angioplastie
keine	71%	71%	71%	71%
eine	7%	14%	17%	16%
> eine	22%	14%	12%	13%
Revaskularisierung des Beins
keine	72%	68%	66%	67%
eine	16%	16%	17%	17%
> eine	12%	16%	17%	17%
WIQ-Score Strecke	14%	18%	23%	21%
WIQ-Score Geschwindigkeit	19%	21%	26%	23%
WIQ-Score Stufensteigen	32%	23%	37%	30%
SF-36 – PCSS	30,3	29,9	32,9	31,6

Ungefähr zwei Drittel der Patienten wiesen eine Vorgeschichte in Bezug auf eine koronare Herzkrankheit (CAD) auf, und geringfügig weniger als ein Drittel hatten einen Myokardinfarkt erlitten, ein Drittel war Diabetiker, ungefähr drei Viertel hatten Hypertonie und/oder eine Dislipidämie (Tabelle 2). Ungefähr 20 bis 30% dieser Zielpopulation hatten sich mehr als einer Vaskularisierungsbehandlung unterzogen (Tabelle 3). Die niedrige Basislinie bei den Scores für die der Lebensqualität (WIQ und SF-36) sind indikativ für eine Zielpopulation von PAD-Patienten mit einer moderaten bis schweren Erkrankung. Die Scores basieren auf einer Skalierung, bei der 1 oder 100% normal ist. Somit stellt eine Steigerung des Scores eine Verbesserung dar. Die Scores werden auf Basis eines Fragebogens tabellarisch zusammengefasst, indem Patienten eine Selbstbewertung durchführen.
Der rFGF-2 wurde durch intraarterielle (IA) Infusion über 20 Minuten verteilt auf zwei Beine an den Tagen 1 und 30 verabreicht. Die verabreichte Dosis betrug 30 μg/kg des rFGF-2. Die Patienten der Studie wurden in drei Gruppen unterteilt: Placebo; einzelne Dosis (rFGF-2 am Tag 1) und doppelte Dosis (rFGF-2 an den Tagen 1 und 30). Der primäre Endpunkt, der in dieser Studie verwendet wurde, war eine Veränderung der maximalen Belastungszeit beim Gehen (PWT) am Tag 90 in einem nach Gardner abgestuften Bewegungsprotokoll. Sekundäre gemessene Endpunkte umfassten: Veränderung in der PWT am Tag 180, Zeitpunkt des Beginns der Claudicatio (claudication onset time, COT; aufgeführt als die Zeit, zu der die Patienten darauf hinweisen, dass Claudicatio und/oder Schmerz einsetzt), Knöchel-Arm-Druckindex (ABI; wie unter Verwendung von Standard-Ultraschallgeräten ermittelt), und durch den Gesundheitszustand bedingte Lebensqualität (QOL), ermittelt durch Walking Impairment Questionnaire (WIQ) und Short-Form-36 (SF-36) am Tag 90 und am Tag 180.
Rekombinanter FGF-2 (rFGF-2) wurde in einer Lösung formuliert, die folgendes enthielt: 0,3 mg/ml rFGF-2, 10 mM Natriumcitrat, 0,3 mM EDTA, 10 mM Thioglycerol, 135 mM Natriumchlorid, pH 5,0. Jedes 5 ml-Fläschchen enthielt 3,7 ml klare, farblose Lösung (1,1 mg rFGF-2 pro Fläschchen). Die rFGF-2-enthaltenden Fläschchen wurden mit "rFGF-2" markiert und eingefroren angeliefert. Das Wirkstoffprodukt wurde bei Raumtemperatur aufgetaut, bevor die Dosis hergestellt wurde; ausführliche Anweisungen für Pharmazeuten wurden in den Handbüchern der Studie bereitgestellt. Aufgetautes, unverdünntes, aktives Wirkstoffprodukt konnte im gekühlten Zustand bei 2°C bis 8°C für 30 Tage gelagert werden.
Das Wirkstoffprodukt wurde mit Placebo (Verdünnungsmittel) verdünnt und vor der Verabreichung gefiltert. Der Filter war ein steriler, nicht-pyrogener Filter, der Protein mit niedrigem Molekulargewicht bindet. Die Filtration des Wirkstoffprodukts durch einen Spritzenfilter von 0,22 μm (z. B. Millipore, Millex-GV, #SLGVR25LS oder Entsprechende) würde Partikel ohne resultierenden Verlust in Bezug auf Stärke und Potenz entfernen. Aufgetautes, unverdünntes Wirkstoffprodukt wurde innerhalb von 8 Stunden verwendet.
Placebo (Verdünnungsmittel) wurde als klare, farblose Lösung bereitgestellt, die vom Wirkstoffprodukt nicht zu unterscheiden war. Es enthielt folgendes: 10 mM Natriumcitrat, 0,3 mM EDTA, 10 mM Thioglycerol, 135 mM Natriumchlorid, pH 5,0. Fläschchen, die Verdünnungsmittel enthielten, wurden mit "Placebo" markiert, in flüssiger Form angeliefert und gekühlt bei 2°C bis 8°C gelagert.
Das Ergebnis der Studie zeigte, dass rFGF-2 nach 90 Tagen ein akzeptables Sicherheitsprofil sowohl für die Einzel- als auch die Doppeldosisbehandlungsgruppe aufwies. Die Dosierungen am Tag 1 und am Tag 30 führten zu ähnlichen Daten in Bezug auf die Sicherheit wie die Einzeldosierung am Tag 1 (Daten nicht gezeigt).

Die Patientenveranlagung sowie Nebenwirkungen bei Patienten am Tag 180 der Studie sind in den Tabellen 4 bzw. 5 gezeigt.

Tabelle 4: Patientennachuntersuchung
	Placebo	EINZEL	DOPPEL
randomisiert:	63	66	61
Sicherheit: 180 Tage FU	57	63	56
PWT: 90/180 Tage	58/54	62/61	54/53
Vorzeitiger Abbruch	6	3	5
Tod	1	0	1
Nebenwirkung	1	0	0
Einvernehmliches Ausscheiden	2	1	2
Verlust an FU	2	2	2
revaskularisiert/Amputation	3	2	3

Tabelle 5: Sicherheit: Nebenwirkungen
	Placebo	EINZEL	DOPPEL	Jeder FGF
Anzahl der Probanden	63	66	61	127
beliebige Nebenwirkung	41 (65%)	43 (65%)	46 (75%)
beliebige kardiäre Nebenwirkung	8	6	7	13
Hypotonie	2	4	5	9
Proteinurie	2	6	7	13
ernsthafte Nebenwirkungen	13 (21%)	9 (14%)	14 (23%)
Todesfälle	1	0	1	1
ernsthafte kardiäre Nebenwirkungen	3	4	2	6
Revaskularisierungen/Amputationen	3	2	3	5
Gangrän	(2)	0	0	0
Malignität	1	0	0	0
retinale Erkrankungen	1	1	0	1
pleurale/perikardiale Effusion	1	0	0	0

Datenanalyse

Die primäre Analyse der Daten wurden mittels ANOVA durchgeführt. 10 Probanden mit fehlender PWT und 6 Probanden, die revaskularisiert waren, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die sekundäre Analyse wurde mittels einer ANOVA nach Rängen durchgeführt. Die 16 von der primären Analyse ausgeschlossenen Probanden erhielten den niedrigsten Rang. Dies stellt einen konservativeren Ansatz dar. Siehe beispielsweise Tabelle 6

Tabelle 6: Analyse auswertbar vs. zur Behandlung vorgesehen 1. Analyse durch ANOVA: "auswertbar" = 174/190 schließt 16 Probanden aus, die revaskularisiert waren (2 Placebo, 3 Einzel, 4 Doppel) oder deren Daten fehlten (3 Placebo, 3 Einzel, 4 Doppel) 2. Analyse durch ANOVA nach Rängen: "zur Behandlung vorgesehen" – Zuweisung des geringsten Rangs an die 16 oben genannten, ausgeschlossenen Probanden
Hypothetische Probanden
	Basislinien-PWT	PWT am Tag 90		ANOVA	Stufen
	n = 6			n = 4	n = 6
a	8:40	10:20		1:40	4
b	5:30	6:55		1:25	3
c	4:30	5:00	→	0:30	2
d	6:20	6:00		–0:20	1
e	4:00	Angioplastie am Tag 60			1
f	2:30	Eingriff am Tag 89			1

Primärer Endpunkt: Maximale Belastungszeit beim Gehen am Tag 90
Rekombinanter FGF-2 war wirksam bei der Behandlung von PAD, wie durch eine statistisch signifikante Verbesserung der PWT (p = 0,026) am Tag 90 in Patienten der Studie, die eine Einzeldosis rFGF-2 erhielten, im Vergleich zur Placebo-Kontrollgruppe (6) gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass eine Doppeldosis rFGF-2 (Tage 1 und 30) nicht besser war als eine Einzeldosis (Tag 1).
Sekundäre Wirksamkeitsvariablen
Sekundäre Wirksamkeitsvariablen umfassten PWT am Tag 180, Zeitpunkt des Beginns von Claudicatio (COT) und Knöchel-Arm-Index (ABI) an den Tagen 90 und 180, sowie WIQ und SF-36 Fragebögen zur Lebensqualität an den Tagen 90 und 180. Die Ergebnisse am Tag 180 spiegeln eine starke Zunahme bei der Placebo-Antwort wieder.
7 zeigt die absolute Veränderung in der PWT an den Tagen 90 und 180 für die Patientengruppen, die Placebo, eine Einzeldosis rFGF-2 oder eine Doppeldosis rFGF-2 erhielten. Für jeden Patienten wird die PWT an der Basislinie von der PWT am Tag 90 subtrahiert, und die Differenz wird für jede Gruppe summiert, und es wird ein Mittelwert bestimmt. Die Daten werden durch eine Varianzanalyse (ANOVA) analysiert.
8 zeigt die prozentuale absolute Veränderung in der PWT in den drei Patientengruppen am Tag 90 und am Tag 180. Die prozentuale Veränderung in der PWT, die über die beiden rFGF-2-Gruppen gemittelt wurde, ist ebenfalls gezeigt (als "jeder FGF" bezeichnet).
9 zeigt den gemessenen ABI (Knöchel-Arm-Index) für die drei Patientengruppen der klinischen Phase II-Studie. Eine Basislinien-Messung, eine Messung am Tag 90 und die entsprechende Veränderung zwischen der Basislinien-Messung und der Messung am Tag 90 sind angegeben. Die gemittelte Veränderung des ABI ist ebenfalls für die drei Patientengruppen gezeigt. Der ABI wird in „An Office Based Approach to the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Disease" (2000) Society of Vascular Medicine and Biology (Medical Communications Media, Inc., Wrightstown, PA) beschrieben.
Der Knöchel-Arm-Index ist das Verhältnis von systolischem Druck im Fuß zum systolischem Druck im Arm, das durch eine Doppler-Ultraschallvorrichtung gemessen wird. Der normale ABI beträgt 1. Ein ABI von weniger als 0,9 wird als diagnostisch für eine PAD angesehen. Der mittlere ABI der Zielpopulation, die in diese Studie aufgenommen wurde, betrug 0,56 im Index-Bein im Ruhezustand. Das Index-Bein ist das Bein mit dem geringeren ABI. 9 zeigt den mittleren ABI (obere Tafel) an der Basislinie, am Tag 90 und am Tag 180 für jede Gruppe. Die untere Tafel zeigt die mittlere Veränderung im ABI am Tag 90 und am Tag 180 für jede Gruppe. Es gibt eine gerichtete positive Veränderung in den Behandlungsgruppen im Vergleich zum Placebo. Der Unterschied erreichte eine statistische Signifikanz in der Doppeldosis-Gruppe am Tag 180 (Durchschnitt ΔABI = 0,11; p = 0,031 versus Placebo). Da der ABI ein objektives Maß für den Blutfluss darstellt, ist diese Veränderung konsistent mit einem postulierten Mechanismus von FGF, nämlich der Bildung neuer kollateraler Blutgefäße.
10 zeigt die Schwere der Claudicatio laut WIQ an den Tagen 90 und 180 für die Einzeldosis-Gruppe und die Doppeldosis-Gruppe relativ zur Placebo-Gruppe. Die Balkenwerte zeigen den prozentualen Anteil von Patienten in jeder Gruppe, bei denen eine Verbesserung, keine Veränderung oder eine Verschlech terung in jeder Gruppe verzeichnet wurde. Am Tag 90 verzeichneten mehr als 50% der Patienten in den Behandlungsgruppen eine Verbesserung, wohingegen weniger als 40% der Placebo-Patienten eine Verbesserung verzeichneten. Am Tag 180 ist dieser augenfällige Behandlungsvorteil nicht mehr vorhanden. Für weitere Informationen zum WIQ, siehe Regensteiner et al. (1990) J. Vasc. Med. Biol. 2: 142–153, das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
11 zeigt die Scores für die Schwere in Bezug auf Strecke, Geschwindigkeit und Stufensteigen für jede Gruppe an der Basislinie, am Tag 190 und am Tag 180. Obwohl die Veränderungen für die FGF-Behandlungsgruppen in Bezug auf Strecke und Geschwindigkeit gerichtet positiv sind, erreichten diese Ergebnisse keine statistische Signifikanz. Beim Stufensteigen gab es einen Trend zur Verbesserung bei der Einzeldosis-Gruppe gegenüber der Placebo-Gruppe (p = 0,11). Die Figur zeigt, dass die Ergebnisse in Bezug auf WIQ Strecke, Geschwindigkeit und Stufensteigen bei der Einzeldosis-Gruppe besser waren als die Ergebnisse bei der Placebo-Gruppe. Die Figur ist mit einer Skalierung gezeigt, bei der höhere Werte besser sind.
12 zeigt eine Zusammenfassung der physischen Scores aus der Short-Form 36 (SF-36). Der SF-36 ist ein allgemein validiertes Instrument der Lebensqualität, das aus 36 Fragen besteht. Der SF-36 hat 12 Domänen, die in zwei zusammenfassende Scores zusammengezogen werden können: physisch und mental. Eine Veränderung von einem Punkt ist mit einer gesteigerten Lebensdauer von 2 Jahren assoziiert. Die Scores für die Veränderung in der Figur verweisen auf eine Verbesserung der Einzeldosis-Gruppe gegenüber. der Placebo-Gruppe und mehr als 2 Punkten am Tag 90.
Ergebnisse der Studie sind in 13 zusammengefasst.
Untersuchung der Subgruppen
Der Analyseplan sah die Erfassung der Behandlungsreaktion in drei vorbestimmten Subgruppen der Patientenpopulation der klinischen Phase II-Studie vor: Diabetes (Typ I oder II, ja vs. nein), Rauchen (aktuell vs. nicht-aktuell, was diejenigen Individuen umfasste, die in den vergangenen Jahren geraucht hatten oder niemals geraucht hatten) und Durchschnittsalter (≤ 68 Jahre vs. > 68 Jahre). Die Ergebnisse der primären Wirksamkeitsmessung (Veränderung der PWT) sind für jede Subgruppe nachstehend aufgeführt. Die Daten in den Tabellen 7–12 spiegeln die log-transformierten Ergebnisse wieder (um konsistent mit der primären Wirksamkeitsanalyse zu sein).
Diabetes

Die Ergebnisse für die PWT an den Tagen 90 und 180 sind in den Tabellen 7 und 8 dargestellt. Es gab keine statistisch signifikante Differenz zwischen der mit Placebo und der mit FGF behandelten Gruppe. Die Veränderungen waren sowohl in Diabetiker als auch in Nicht-Diabetikern in den FGF-behandelten Gruppen am Tag 90 größer. Am Tag 180 waren die Veränderungen in Diabetikern und in ähnlicher Weise in Nicht-Diabetikern in den mit FGF behandelten Gruppen geringer. Der prozentuale Anteil von Diabetikern in der Einzeldosis-Gruppe war geringfügig kleiner (27% vs. 37% in der Placebo-Gruppe und 36% in der Doppeldosis-Gruppe.

Tabelle 7: Veränderung der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in Diabetikern
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 21	N = 17	N = 22	N = 39
relative Veränderung der PWT	12,3%	26,8%	18,8%	21,9%
P-Wert paarweise		0,44	0,70	0,53
mittlere Veränderung der PWT (min)	1,08	1,42	1,26	1,33
(+/–SD)	(1,84)	(2,74)	(3,08)	(2,90)
P-Wert gesamt = 0,74
Tag 180	N = 20	N = 17	N = 21	N = 38
relative Veränderung der PWT	18,2%	7,6%	4,6%	5,8%
P-Wert paarweise		0,64	0,52	0,52
mittlere Veränderung der PWT (min)	1,85	1,32	1,07	1,18
(+/–SD)	(2,47)	(3,27)	(2,94)	(3,05)
P-Wert gesamt = 0,81

Tabelle 8: Veränderung der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in Nicht-Diabetikern
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 37	N = 45	N = 32	N = 77
relative Veränderung der PWT	13,0%	34,9%	18,7%	28,0
P-Wert paarweise		0,061	0,65	0,14
mittlere Veränderung der PWT (min)	0,75	2,12	1,90	2,03
(+/–SD)	(2,60)	(2,88)	(3,61)	(3,18)
P-Wert gesamt = 0,14
Tag 180	N = 34	N = 44	N = 32	N = 76
relative Veränderung der PWT	19,1%	22,7%	20,0%	21,6%
P-Wert paarweise		0,80	0,96	0,84
mittlere Veränderung der PWT (min)	1,57	2,15	1,89	2,04
(+/–SD)	(2,91)	(3,97)	(2,89)	(3,54)
P-Wert gesamt = 0,96

Rauchen

Die Ergebnisse für die Veränderung der PWT an den Tagen 90 und 180 für aktuelle und nicht-aktuelle Raucher sind in den Tabellen 9 und 10 dargestellt. Bei den aktuellen Rauchern wurde kein statistisch signifikanter Unterschied am Tag 90 oder am Tag 180 gesehen. Bei den nicht-aktuellen Raucher gab es am Tag 90 einen statistisch signifikanten Unterschied insgesamt (P-Wert = 0,007) sowie zwischen der Placebo-Gruppe und der Einzeldosis-Gruppe (P-Wert = 0,002); am Tag 180 wurde kein statistisch signifikanter Unterschied beobachtet. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse verwiesen darauf, dass Rauchen eine Störvariable (confounder) für das Ergebnis ist.

Tabelle 9: Veränderung der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in aktuellen Rauchern
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 23	N = 14	N = 13	N = 25
relative Veränderung der PWT	29,3%	22,1%	31,3%	26,2%
P-Wert paarweise		0,76	0,93	0,87
mittlere Veränderung der PWT (min)	1,55	2,27	2,36	2,31
(+/–SD)	(2,67)	(4,22)	(3,91)	(4,00)
P-Wert gesamt = 0,93
Tag 180	N = 20	N = 14	N = 11	N = 25
relative Veränderung der PWT	27,2%	1,0%	43,3%	18,1%
P-Wert paarweise		0,25	0,53	0,66
mittlere Veränderung der PWT (min)	2,03	1,89	2,19	2,02
(+/–SD)	(2,45)	(4,55)	(3,24)	(3,95)
P-Wert gesamt = 0,26

Tabelle 10: Veränderung der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in nicht-aktuellen Rauchern
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 35	N = 48	N = 43	N = 91
relative Veränderung der PWT	5,5%	35,9%	15,8%	26,1%
P-Wert paarweise		0,002	0,27	0,019
mittlere Veränderung der PWT (min)	0,42	1,83	1,45	1,65
(+/–SD)	(2,02)	(2,34)	(3,27)	(2,81)
P-Wert gesamt = 0,007
Tag 180	N = 34	N = 47	N = 42	N = 89
relative Veränderung der PWT	19,8%	29,9	10,0%	20,3%
P-Wert paarweise		0,46	0,46	0,97
mittlere Veränderung der PWT (min)	1,46	1,93	1,40	1,68
(+/–SD)	(2,90)	(3,57)	(2,84)	(3,24)
P-Wert gesamt = 0,28

Alter

Die Ergebnisse für die Veränderung der PWT an den Tagen 90 und 180 bei Probanden > 68 Jahre und ≤ 68 Jahre sind in den Tabellen 11 und 12 dargestellt. Es gab eine höhere Frequenz von Probanden mit hoher PWT (≥ 8 Minuten) in der Doppeldosis-Gruppe. Für Probanden > 68 Jahre wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der Doppeldosis-Gruppe am Tag 180 be obachtet (P-Wert = 0,031). Für Probanden ≤ 68 Jahre war die Veränderung in der PWT in den mit FGF behandelten Gruppen höher, wobei jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied am Tag 90 oder am Tag 180 beobachtet wurde. Die Ergebnisse legen eine stärkere Verbesserung in Probanden ≤ 68 Jahren nahe.

Tabelle 11: Veränderung in der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in Probanden > 68 Jahre
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 27	N = 24	N = 30	N = 54
relative Veränderung in der PWT	16,0%	29,1%	8,0%	17,6%
paarweise P-Wert		0,27	0,53	0,87
mittlere Veränderung in der PWT (min)	1,00	1,58	0,81	1,15
(+/–SD)	(2,18)	(2,66)	(2,25)	(2,45)
P-Wert gesamt = 0,22
Tag 180	N = 25	N = 25	N = 29	N = 54
relative Veränderung in der PWT	28,8%	7,1%	–4,0%	1,4%
paarweise P-Wert		0,19	0,031	0,044
mittlere Veränderung in der PWT (min)	1,74	0,86	1,05	0,96
(+/–SD)	(2,73)	(2,89)	(2,75)	(2,79)
P-Wert gesamt = 0,095

Tabelle 12: Veränderung in der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in Probanden ≤ 68 Jahre
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 31	N = 38	N = 24	N = 62
relative Veränderung in der PWT	15,0%	33,1%	40,0%	35,7%
paarweise P-Wert		0,18	0,11	0,099
mittlere Veränderung in der PWT (min)	0,76	2,16	2,67	2,36
(+/–SD)	(2,51)	(2,96)	(4,25)	(3,49)
P-Wert gesamt = 0,23
Tag 180	N = 29	N = 36	N = 24	N = 60
relative Veränderung in der PWT	25,8%	31,5%	48,2%	37,9%
paarweise P-Wert		0,72	0,25	0,44
mittlere Veränderung in der PWT (min)	1,61	2,65	2,19	2,47
(+/–SD)	(2,78)	(4,17)	(3,03)	(3,73)
P-Wert gesamt = 0,50

Post-hoc-Reaktionsanalyse

Bei denjenigen Probanden der Studie, deren PWT sich am Tag 90 ≥ 2 Minuten erhöhte, gab es eine höhere Frequenz von Probanden mit niedriger PWT (≤ 4 Minuten) an der Basislinie in der Einzeldosis-Gruppe. Der stärkste Prädiktor für eine Reaktion am Tag 180 war die Reaktion am Tag 90. Die Veränderung in der PWT bei Probanden, deren PWT sich um ≥ 2 Minuten erhöhte und bei Probanden, deren PWT sich um < 2 Minuten erhöhte, sind in den Tabellen 13 bzw. 14 dargestellt. Es gab einen höheren prozentualen Anteil von reagierenden Probanden an den Tagen 90 und 180, und das Ausmaß der Veränderung war größer als in der Einzeldosis-Gruppe. Etwa 40% der Patienten, die eine Behandlung mit einer Einzeldosis erhielten, wiesen sowohl am Tag 90 als auch am Tag 180 eine Erhöhung in der PWT von mehr als 2 Minuten auf, während lediglich etwa 22% und etwa 26% der Patienten, die Placebo oder eine Doppeldosis FGF-2 erhielten, dieses Ausmaß der Reaktion zeigten. Darüber hinaus scheint der Behandlungseffekt bei dieser Analyse bis zum Tag 180 anzudauern.

Tabelle 13: Veränderung in der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in Probanden, deren PWT sich am Tag 90 um ≥ 2 Minuten erhöhte
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 14	N = 27	N = 16	N = 43
relative Veränderung in der PWT	61,1%	85,8%	68,4%	79,0%
P-Wert paarweise		0,17	0,76	0,27
mittlere Veränderung in der PWT (min)	3,67	4,28	5,37	4,68
(+/– SD)	(1,57)	(2,54)	(4,10)	(3,20)
P-Wert gesamt = 0,35
Tag 180	N = 14	N = 26	N = 16	N = 42
relative Veränderung in der PWT	55,3%	86,0%	53,2%	72,7%
P-Wert paarweise		0,17	0,90	0,37
mittlere Veränderung in der PWT (min)	3,02	4,28	4,16	4,24
(+/–SD)	(2,39)	(3,85)	(3,31)	(3,61)
P-Wert gesamt = 0,24

Tabelle 14: Veränderung in der PWT am Tag 90 und am Tag 180 in Probanden, deren PWT sich am Tag 90 sich um < 2 Minuten erhöhte
	Placebo	Einzel	Doppel	Jeder FGF
Tag 90	N = 44	N = 35	N = 38	N = 73
relative Veränderung in der PWT	3,8%	4,4%	3,9%	4,1%
P-Wert paarweise		0,93	0,99	0,95
mittlere Veränderung in der PWT (min)	–0,02	0,12	0,07	0,09
(+/–SD)	(1,78)	(1,33)	(1,04)	(1,18)
P-Wert gesamt = 1,00
Tag 180	N = 40	N = 35	N = 37	N = 72
relative Veränderung in der PWT	14,5%	–5,8%	2,5%	–1,4%
P-Wert paarweise		0,79	0,31	0,11
mittlere Veränderung in PWT (min)	1,20	0,16	0,44	0,31
(+/–SD)	(2,71)	(2,62)	(1,84)	(2,24)
P-Wert gesamt = 0,21

Post-hoc-Analyse des Knöchel-Arm-Index
Der anfängliche Analyseplan sah vor, dass Probanden mit einem Knöchel-Arm-Index (ABI) > 1,2 an der Basislinie (entspricht einer nicht-komprimierbaren Arterie) von der Analyse ausgeschlossen werden (siehe 9). In einer post-hoc-Analyse der Daten wurden Probanden mit einem ABI > 1,2 zu irgendeiner Zeit (d. h. Basislinie, Tag 90 und/oder Tag 180) von der Analyse ausgeschlossen. Wie in 14 zu sehen ist, verweist die post-hoc-Analyse darauf, dass am Tag 90 sowohl die Einzeldosis- als auch die Doppeldosis-Gruppe eine statistisch signifikante Verbesserung im ABI im Vergleich zur Placebo-Gruppe aufwies. Diese Signifikanz war am Tag 180 nicht ersichtlich, obwohl der Trend sowohl für die Einzeldosis-Gruppe als auch für die Doppeldosis-Gruppe bestehen blieb.
Zusammenfassung der Wirksamkeit
Analyse der primären Wirksamkeit
Der Gesamt-P-Wert für die Analyse der primären Wirksamkeit (Veränderung in der PWT am Tag 90) war 0,075 (ANOVA). Der Gesamt-P-Wert für die Analyse der sekundären Wirksamkeit durch eine ANOVA nach Rängen war statistisch signifikant (P-Wert = 0,034). Die Einzeldosis-Gruppe zeigte eine Erhöhung von 33,5% in der PWT am Tag 90 gegenüber einer Erhöhung von 20,3% in der Doppeldosis-Gruppe und einer Erhöhung von 13,8% in der Placebo-Gruppe. Der paarweise erfolgende Vergleich von Einzeldosis vs. Placebo war statistisch signifikant (P-Wert = 0,026). Diese Behandlungswirkung wurde am Tag 180 bei Verwendung der log-transformierten Daten nicht beibehalten.
Variablen für die sekundäre Wirksamkeit
Die Variablen für die sekundäre Wirksamkeit zeigten keinen Unterschied in der PWT am Tag 180, keinen Unterschied im COT an den Tagen 90 und 180, einen günstigen Trend im ABI in den FGF-behandelten Gruppen mit einer statistisch signifikanten Veränderung in der Doppeldosis-Gruppe am Tag 180, und keinen Unterschied bei der Plethysmographie der Wade. Die Interpretation der Veränderungen im WIQ wurde durch Ungleichheiten an der Basislinie gestört. Es gab am Tag 90 einen Trend zur Verbesserung im PCSS des SF-36 in der Einzeldosis-Gruppe im Vergleich zum Placebo; dieser Trend wurde durch einen statistisch signifikanten Unterschied im Score für den Körperschmerz verursacht.
In den zuvor festgelegten Subgruppen war die Auswirkung des Rauchens am interessantesten. Der Gesamt-P-Wert für die Veränderung in der PWT am Tag 90 betrug 0,007 für nicht-aktuelle Raucher, wohingegen dieser 0,93 für aktuelle Raucher betrug. Die Veränderungen in der PWT bei der Placebo-Gruppe betrug 5,5% für nicht-aktuelle Raucher und 29,3% für aktuelle Raucher. Die Modellierung der Regression verwies darauf, das Rauchen eine störende Variable ist (siehe nachstehende post-hoc-Regressionsanalyse). Die übermäßige Repräsentierung von aktuellen Rauchern in der Placebo-Gruppe (38% gegenüber 24% in der Einzeldosis-Gruppe und 21% in der Doppeldosis-Gruppe) machte es schwieriger, den Unterschied in allen bewertbaren Probanden nachzuweisen.
Die Veränderungen in der PWT bei Nicht-Diabetikern entsprachen den Veränderungen, die in allen bewertbaren Probanden an den Tagen 90 und 180 beobachtet wurden. Die Veränderungen in der PWT bei Diabetikern entsprachen den Veränderungen, die in allen bewertbaren Probanden am Tag 90, jedoch nicht am Tag 180 beobachtet wurden. Die Modellierung der Regression verwies nicht darauf, dass Diabetes eine Covariante ist. Veränderungen in der PWT bei Probanden über dem Durchschnittsalter (> 68 Jahre) waren an den Tagen 90 und 180 geringer als die in Probanden unterhalb des Durchschnittsalters. Die Modellierung der Regression verwies nicht darauf, dass Alter eine Covariante ist.
Die post-hoc-Analyse der reagierenden Probanden zeigte einen höheren prozentualen Anteil von reagierenden Probanden in der Einzeldosis-Gruppe und ein stärkeres Ausmaß der Wirkung in der Einzeldosis-Gruppe. Darüber hinaus verwies sie darauf, dass die Behandlungswirkung am Tag 180 andauert. Der stärkste Prädiktor für eine Reaktion am Tag 180 ist die Reaktion am Tag 90.
Post-hoc-Regressionsanalyse der maximalen Belastungszeit beim Gehen (peak walking time)
Es wurden Regressionsmodelle verwendet, um die Kriterien zu bewerten, die der Verwendung eines Scores für die absolute Veränderung, eines Scores für die relative Veränderung und für die PWT an den Tagen 90 (PWT90) als Analysevariablen zugrunde liegen. Die Modelle werden nachfolgend diskutiert. Diese post-hoc-Analyse zeigt, dass die Scores sowohl für die absolute als auch für die relative Veränderung Nachteile aufweisen und nicht den höchsten Nutzen für die Feststellung der FGF-Behandlungswirkung in der klinischen Phase II-Studie bereitstellen. Die Verwendung der PWT90 als Analysenvariable und das Anpassen der PWT der Basislinie scheinen eine bessere Basis und einen größeren Wert für die Feststellung der Behandlungswirkung von FGF bereitzustellen.
Hintergrund – Annahmen bei der Analyse:

I. Es wird angenommen, dass der Score für die absolute Veränderung die korrekte Variable ist, die bei der Analyse verwendet werden soll. Für jeden Probanden ist der Score für die absolute Veränderung am Tag 90 hinsichtlich der PWT = (PWT Tag 90 – PWT Basislinie) oder = (PWT90 – PWTB). Es wird angenommen, dass (PWT90 – PWTB) = d ist, wobei dann PWT90 = 1,0·PWTB + d, (über den gesamten Bereich von PWTB) ist, und dass das Streudiagramm von PWT90 versus PWTB wie folgt sein würde:
1. Linear,
2. Steigung = 1,0, und
3. Schnittpunkt wäre d (unbeschränkt). 15 zeigt eine hypothetische Auftragung der PWT90 gegen PWTB, wenn angenommen wird, dass der Score für die absolute Veränderung die korrekte Variable ist.
II. Es wird angenommen, dass der Score für die relative Veränderung die korrekte Variable ist, die für die Analyse verwendet werden soll. Für jeden Probanden ist der Score für die relative Veränderung am Tag 90 hinsichtlich der PWT = (PWT90/PWTB). Es wird angenommen, dass (PWT90/PWTB) = ld ist, wobei dann PWT90 = ld·PWTB + 0,0 (über den gesamten Bereich von PWTB) ist, und dass das Streudiagramm von PWT90 versus PWTB wie folgt sein würde:
1. Linear,
2. Steigung würde ld sein (unbeschränkt), und
3. Schnittpunkt würde 0,0 sein. 16 zeigt eine hypothetisch Auftragung der PWT90 gegen PWTB, wenn angenommen wird, dass der Score für die relative Veränderung korrekt ist.

Der ursprüngliche Analyseplan verwendete den Score für die absolute Veränderung als Analysenvariable, weil es keine anfängliche überzeugende Beratung von PIs/Beratern dahingehend gab, die relative Punktzahl zu verwenden, und weil der Score für die absolute Veränderung bei der Analyse einer. verwandten Studie verwendet wurde, die auf die Behandlung der koronaren Herzkrankheit (CAD) gerichtet war. Es gab ein Interesse an ei ner Möglichkeit für eine kombinierte Indikation von FGF bei CAD und PAD, die durch konsistente Verwendung derselben Analysenvariable erreicht würde. Der Analyseplan wurde jedoch geändert, sodass der Log10 des Scores für die relative Veränderung (Log10(PWT90/PWTB) = (Log10PWT90 – Log10PWTB) verwendet wurde, da eine verblindete, vorläufige Bewertung der Schiefe (skewness) und der Kurtosis (kurtosis) darauf verwies, dass die Daten vom Tag 90 nicht symmetrisch zu sein schienen. Der Score für die absolute Veränderung in der PWT am Tag 180 schien (bei einer post-hoc-Analyse) annähernd symmetrisch zu sein, d. h. der Score für die absolute Veränderung schien bessere distributionale Eigenschaften aufzuweisen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der post-hoc-Regressionsanalyse unter Verwendung der in den Tabellen 15 und 16 beschriebenen Modelle sind in den 17–19 gezeigt. 17 zeigt ein Streudiagramm von PWT90 vs. PWTB sowie eine unbeschränkte Spline-Regressionskurve für jede Behandlungsgruppe. 17 legt nahe, dass die ersten zwei Kriterien für eine Verwendung des Scores für die absolute Veränderung (Linearität und Steigung = 1) nicht vollständig erfüllt sind, und dass die Kriterien für eine Verwendung des Scores für die relative Veränderung (Linearität und Schnittpunkt = 0,0) ebenfalls nicht erfüllt sind. Somit scheint die Verwendung des Scores für die absolute Veränderung oder des Scores für die relative Veränderung als Analysenvariable nicht vollständig mit den beobachteten Daten konsistent zu sein.
18 zeigt dasselbe Streudiagramm sowie Kurven, die das nachstehend beschriebene Regressionsmodell Nr. 2 darstellen. Die Regressionsmodelle stellen ein flexibleres Verfahren zur Erfassung der Veränderung in der PWT am Tag 90 und zur Anpassung der Basislinien-PWT dar. Die kurvige Form des Streudia gramms legt nahe, dass ein Regressionsmodell, das Kurven produziert, die Daten der Studien besser wiedergibt und besser zu diesen passt. Um eine kurvige Form zu erreichen, würden die Regressionsmodelle PWT90 als Analysenvariable haben sowie Prädiktor-Variablen, die PWTB und (PWTB)² einschließen. Andere Basislinien-Variablen, wie beispielsweise Status hinsichtlich des Rauchens, können ebenfalls in das Regressionsmodell eingebracht werden, sofern sie wichtige Störfaktoren sind.
Tabelle 15 zeigt drei Regressionsmodelle mit PWT90 als Analysenvariable, die an PWTB angepasst ist. Alle Modelle werden an das Zentrum (Ort) angepasst. Modell 1 für PWT90 umfasst lediglich die Prädiktor-Variable PWTB, ist jedoch flexibler als bei Verwendung des Scores für die absolute Veränderung, weil Modell 1 eine beliebige Steigerung aufweisen kann (d. h. Modell 1 erfordert keine Steigung von 1,0). Modell 1 passt daher besser zu den Daten als die Scores für die absolute oder relative Veränderung.
Modell 2 für PWT90 umfasst sowohl PWTB als auch (PWTB)² als Prädiktor-Variablen und sorgt für die kurvige Form des Streudiagramms (siehe 18). Modell 2 scheint besser zu den Daten der Studie zu passen als Modell 1, wie durch Folgendes beobachtet werden kann:

1) ein p-Wert = 0,027 für die Aufnahme von PWTB² in das Modell, und
2) einen erhöhten R² = 0,52 im Vergleich zu Modell 1, was eine statistisch signifikante Verbesserung hinsichtlich R² (p = 0,025) darstellt.

Modell 3 für PWT90 umfasst den Status des Rauchens (an der Basislinie), PWTB und (PWTB)² und passt sich auf den aktuellen Status des Rauchens ein.

Tabelle 15: Regressionsmodelle für die PWT90. Alle Regressionsmodelle werden an das Zentrum (Ort) angepasst.
	1	2	3
Variablen im Modell	Behandlung Einzel	Behandlung Einzel	Behandlung Einzel
	Behandlung Doppel	Behandlung Doppel	Behandlung Doppel
	PWTB	PWTB	PWTB
	(gerade Linien)	PWTB2	PWTB2
		(Kurven)	Raucher
			(Kurven)
Variable Coeffizienten	Einzel: 69,8	Einzel: 71,5	Einzel: 79,3
	Doppel: 56,7	Doppel: 61,8	Doppel: 71,5
	PWTB: 0,986	PWTB: 1,917	PWTB: 1,93
		PWTB²: –0,0012	PWTB2: –0,0012
			Raucher: –23,8
p-Wert für jede Variable	Einzel: 0,032	Einzel: 0,027	Einzel: 0,015
	Doppel: 0,096	Doppel: 0,067	Doppel: 0,037
	PWTB: < 0,0001	PWTB: < 0,0001	PWTB: < 0,0001
		PWTB²: 0,026	PWTB2: 0,022
			Raucher: 0,14
Behandlungswirkung (Sekunden)
S – Placebo	69,8	71,5	79,3
D – Placebo	56,7	61,8	71,5
Modell R²	0,50	0,52	0,53
Geschätzter Placebowert für PWT90, wenn PWTB gleich ist:			Nicht-Raucher	Raucher
100 sek.	139 sek.	75	33	57
300 sek.	336 sek.	363	323	347
600 sek.	632 sek.	615	578	602

Die drei Regressionsmodelle mit PWT90 verweisen auf Folgendes:

• Die Einzeldosis-Gruppe wies eine statistisch signifikante Verbesserung in der PWT am Tag 90 auf, mit paarweisen p-Werten von 0,032, 0,027 und 0,015 (für die Modelle 1, 2 bzw. 3).
• Die Einzeldosis-Gruppe hatte eine durchschnittliche Erhöhung in der PWT gegenüber der Placebo-Gruppe von 69,8, 71,7 und 79,3 Sekunden.
• Die Doppeldosis-Gruppe hatte einen Trend oder eine statistisch signifikante Verbesserung in der PWT am Tag 90 mit paarweisen p-Werten von 0,096, 0,0678 und 0,037.
• Die Doppeldosis-Gruppe hatte eine durchschnittliche Erhöhung in der PWT gegenüber der Placebo-Gruppe von 56,7, 61,8 und 71,5 Sekunden; und somit ist die Doppeldosis-Gruppe der Einzeldosis-Gruppe hinsichtlich der erhöhten PWT ähnlicher als der Placebo-Gruppe.
• Die Regressionsmodelle erklären 50 oder mehr der Variation in der PWT am Tag 90.

19 zeigt ein Streudiagramm von PWT180 vs. PWTB sowie eine unbeschränkte Spline-Regressionskurve für jede Behandlungsgruppe. Die Form der Daten unterstützt ebenfalls keine Steigung von 1 oder einen Schnittpunkt von 0,0. Die Form der PWT-Daten am Tag 180 ist lediglich leicht gewölbt.

Tabelle 16 zeigt die drei Regressionsmodelle für PWT180 als Analysenvariable und an PWTB angepasst, und andere Eigenschaften des Probanden an der Basislinie. Alle drei Modelle verweisen auf ähnliche Ergebnisse, wobei die Einzeldosis-Gruppe einen 22- bis 26-sekündigen Vorteil gegenüber der Placebo-Gruppe hat, und die Doppeldosis-Gruppe sich offenbar nicht von der Placebo-Gruppe unterscheidet.

Tabelle 16: Regressionsmodell für die PWT180. Alle Regressionsmodelle werden an das Zentrum (Ort) angepasst.
	1	2	3
Variablen in Modell	Behandlung Einzel	Behandlung Einzel	Behandlung Einzel
	Behandlung Doppel	Behandlung Doppel	Behandlung Doppel
	PWTB	PWTB	PWTB
	(gerade Linien)	PWTB2	PWTB2
		(Kurven)	Raucher
			(Kurven)
Variable Coeffizienten	Einzel: 22,3	Einzel: 22,7	Einzel: 25,9
	Doppel: –7,4	Doppel: –5,8	Doppel: –1,7
	PWTB: 1,2	PWTB: 1,4	PWTB: 1,4
		PWTB²: –0,003	PWTB2: –0,0003
			Raucher: –11,4
p-Wert für jede Variable	Einzel: 0,514	Einzel: 0,506	Einzel: 0,454
	Doppel: 0,836	Doppel: 0,872	Doppel: 0,964
	PWTB: < 0,0001	PWTB: < 0,0031	PWTB: < 0,0029
		PWTB²: 0,630	PWTB2: 0,608
			Raucher: 0,508
Behandlungswirkung (Sekunden)
S – Placebo	22,3	22,7	25,9
D – Placebo	–7,4	–5,8	–1,7
Modell R²	0,57	0,57	0,57
Geschätzter Placebowert für PWT90 wenn PWTB gleich ist:			Nicht-Raucher	Raucher
100 sek.	157	141	123	134
300 sek.	393	395	381	392
600 sek.	745	731	723	734

Zusammenfassend zeigte die post-hoc-Regressionsanalyse unter Verwendung des PWT am Tag 90 als die Ergebnis-Variable und bei Anpassen an die PWT der Basislinie eine Zunahme von etwa 70 Sekunden (1,16 Minuten) gegenüber Placebo in der Einzeldosis-Gruppe und von etwa 57 Sekunden (0,95 Minuten) in der Doppeldosis-Gruppe (p = 0,32 bzw. 0,096). Wenn man es der Beziehung erlaubte, nicht-linear zu sein (d. h. kurvig), nahm die Behandlungswirksamkeit auf etwa 72 Sekunden (1,19 Minuten) in der Einzeldosis-Gruppe und auf etwa 62 Sekunden (1,03 Minuten) in der Doppeldosis-Gruppe zu (p = 0,027 bzw. 0,067). Die Anpassung an den Status hinsichtlich des Rauchens erhöhte die Behandlungswirksamkeit darüber hinaus auf etwa 79 Sekunden (1,32 Minuten) in der Einzeldosis-Gruppe und auf etwa 72 Sekunden (1,19 Minuten) in der Doppeldosis-Gruppe (p = 0,015 bzw. 0,035).
Folgerungen aus der klinischen Phase II-Studie
Diese Studie definierte eine wirksame Dosis, eine Verabreichungsart und ein Behandlungsprotokoll für die Behandlung von PAD mit rFGF-2. Eine Einzeldosis von 30 μg/kg rFGF-2, die intraarteriell verabreicht wurde, verbesserte die PWT von PAD-Patienten. Die Verabreichung einer Doppeldosis FGF-2 war nicht besser als die Verabreichung einer Einzeldosis FGF-2. Das Ausmaß der Verbesserung in der PWT war größer als 1 Minute, wobei die Dauer des Vorteils sowohl nach 3 Monaten als auch nach 6 Monaten beobachtet wurde. Tatsächlich kam es bei etwa 40% der Patienten, die eine Einzeldosis erhielten, zu einer Erhöhung in der PWT von mehr als 2 Minuten sowohl am Tag 90 als auch am Tag 180 im Vergleich zu lediglich etwa 22% der Patienten, die Placebo enthielten und etwa 26% der Patienten, die eine Doppeldosis rFGF-2 erhielten. Diese Daten zeigen, dass diejenigen Patienten, die am Tag 90 eine Reaktion zeigten, mit höherer Wahrscheinlichkeit am Tag 180 eine Reaktion zeigen.
Somit ist eine wiederholte Dosierung mit FGF-2 durchführbar (sofern dies notwendig ist), ohne die Sicherheit des Patienten zu beeinträchtigen. Die vorteilhafte Wirkung auf die PWT, die sowohl am Tag 90 als auch am Tag 180 mit einer Einzeldosis rFGF-2 beobachtet wurde, in Verbindung mit der Sicherheit von mehreren Dosierungen bietet ein Verfahren zur Bereitstellung eines verlängerten therapeutischen Nutzens für PAD-Patienten. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass eine therapeutisch wirksame Dosis am Tag 1 an einen Patienten verabreicht wird, und nachfolgende therapeutisch wirksame Dosen verabreicht werden, sobald sie klinisch erforderlich sind, d. h. wenn Symptome wiederkehren.
Beispiel 3: Klinische PAD-Phase III-Studie

Es wird eine multizentrische (bis zu 50 Orte) doppelblinde, Placebo-kontrollierte, Dosis-Optimierungsstudie durchgeführt. Das primäre Ziel dieser Studie ist die Bewertung der Sicherheit und der Wirksamkeit einer intraarteriellen (IA) Infusion von 3,0 μg/kg oder 30,0 μg/kg rFGF-2 versus Placebo in Probanden mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit (PAD) mit moderater bis schwerer Claudicatio. Die Studie umfasst 450 Probanden (150 pro Arm) mit moderater bis schwerer Claudicatio, die eine Bewegung einschränkte. Aufnahme- und Ausschlusskriterien sind in Tabelle 17 gezeigt. Die Größe der Probe kann auf Basis der DSMB-Bewertung der Variabilität der maximalen Belastungszeit beim Gehen (peak walking time) bei 90 Tagen angepasst werden, nachdem 225 Probanden aufgenommen worden sind. Tabelle 17: Übersicht über die klinische Phase III-Studie

Aufnahmekriterien

• männlich oder weiblich ≥ 40 Jahre alt • Vorgeschichte mit moderater bis schwerer Claudicatio, die eine Bewegung einschränkt für > 6 Monate • ABI > 0,3 und < 0,8 im Index-Bein im Ruhezustand oder > 20% Verringerung nach Bewegung • peripheres Angiogramm (Kontrast oder MRA) innerhalb von 4 Monaten, das einen > 70% Verschluss eines oder mehrerer infrainguinaler Gefäße bestätigt, offensichtlicher bilateraler Zufluss im Oberschenkel, und Fehlen eines hämodynamisch signifikanten suprainguinalen Verschlusses • zur Bewegung in der Lage > 1 Minute jedoch < 12 Minuten in zwei Laufbandbewegungstests nach Gardner. Die Bewegungszeit muss an der Basislinie durch eine Claudicatio beschränkt werden. Es werden Paralleltests durchgeführt werden, die > 24 Stunden jedoch nicht > 2 Wochen auseinander liegen. Die Differenz zwischen den Bewegungszeiten an der Basislinie muss < 20% von deren Mittelwert sein. • medizinisch stabil für 3 Monate mit Laborparametern innerhalb klinisch akzeptabler Bereiche für die erforderlichen Prozeduren • Serumkreatinin ≤ 2,2 mg/dl und Urinprotein/Kreatin-Verhältnis < 0,3. • gewillt und dazu in der Lage, eine schriftliche Einverständniserklärung abzugeben

Ausschlusskriterien

Periphere Herzkrankheit • Vorgeschichte mit Schmerz im Ruhezustand, nicht-heilendem Geschwür oder Gangrän innerhalb von 3 Monaten • Hinweis auf hämodynamisch signifikante aorto-iliakale Verschlusskrankheit • periphere Revaskularisierung (PTI oder chirurgischer Eingriff) innerhalb von 3 Monaten Malignität • Vorgeschichte einer Malignität innerhalb der vergangenen 5 Jahre (Ausnahmen: heilend behandeltes Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Haut in Bereichen, die der Sonne ausgesetzt waren oder Cervix-Karzinom) • Hinweis oder Verdacht auf Malignität nach Screening gemäß ACS-Richtlinien Zustände der Augen • proliferative Retinopathie oder moderate oder schwere nicht-proliferative Retinopathie • Makulopathie mit choroidaler Neovaskularisierung oder makuläres Ödem • intraokulärer chirurgischer Eingriff innerhalb von 3 Monaten. Kardiovaskuläre Zustände • Myokardinfarkt, CABG, PTCA innerhalb von 3 Monaten • transiente, ischämische Attacke oder Schlaganfall innerhalb von 3 Monaten Allgemeinmedizinische Zustände • Schwangerschaft, stillende Mütter • Teilnahme an klinischen Studien mit anderen investigativen Mitteln, intraarteriellen Vorrichtungen oder Verfahren, bei denen die Nachfolgebesuche noch nicht vollständig abgeschlossen sind • Vorgeschichte einer Organtransplantation • beliebiger kombinierter Zustand, der den Probanden für die Teilnahme nach Auffassung des Forschers ungeeignet macht, z. B. gleichzeitige medizinische Erkrankung, die die Lebenserwartung auf < 12 Monate begrenzt, Psychose, schwere mentale Retardation, Unfähigkeit mit dem Personal der Studie zu kommunizieren, Alkohol- oder Drogenmissbrauch • Diagnose von primärer pulmonaler Hypertension, restriktive oder obstruktive Kardiomyopathie, aktive Vaskulitis • vorherige Teilnahme an einer beliebigen therapeutischen Angiogenese-Studie mit einem beliebigen zu erforschenden Mittel, ausgenommen, dass der Proband Placebo erhalten hat

Der Wirkstoff der Studie, rFGF-2 mit der in 2 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Sequenz, ist mit 0,3 oder 3,5 mg/ml in einem lyophilisierten Puder enthalten, der mit normaler Salzlösung rekonstituiert wird; er wird in 10 mM Natriumcitrat, 1 mM EDTA, 10 mM Dithiotreitol (DTT), 4% Glycin, 1% Glucose bei pH 6,0 formuliert. Die Behandlung besteht aus einer Infusion von 20 ml bei 1 ml/min Placebo, 3,0 μg/kg oder 30,0 μg/kg rFGF-2 zu gleichen Teilen verteilt auf beide Beine, über die Arteria femoralis communis. Die Zuweisung der Behandlungen ist randomisiert 1:1:1 Placebo:3,0 μg/kg rFGF-2:30 μg/kg rFGF-2. An der Basislinie und am Ende der Infusion wird Blut für die Analyse der Plasmakonzentration von FGF-2 entnommen. Jeder Proband wird in einem Hospital nach der Verabreichung des Wirkstoffs der Studie für 6 Stunden beobachtet und als ambulanter Patient zu festgelegten Intervallen für 180 Tage überwacht.
Die Patienten werden hinsichtlich akuter Sicherheitsvariablen überwacht, die eine mit einer IA-Infusion assoziierte systolische Hypertonie, einen beliebigen Hinweis auf allergische Reaktionen, Häufigkeit und Schwere von Nebenwirkungen, Veränderungen in Laborparametern (insbesondere Urinprotein), einen Hinweis auf retinale Toxizität und einen Hinweis auf Serokonversion (Antikörperbildung) umfassen. Das DSMB wird die SAEs und die abnormalen Laboruntersuchungen während der Aufnahme überwachen.
Die primäre Wirksamkeitsvariable ist die Veränderung der maximalen Belastungszeit beim Gehen (PWT) von der Basislinie am Tag 90, wie durch die nach Gardner abgestufte Bewegungstestzeit gemessen wird, angepasst an die Basislinien-PWT, an den Status hinsichtlich des Rauchens und an das Zentrum. Die sekundäre Wirksamkeit wird basierend auf den nachfolgenden Parametern festgelegt:

• Veränderung der PWT von der Basislinie an den Tagen 45, 135 und 180, angepasst an die Basislinien-PWT, an den Status hinsichtlich des Rauchens und an das Zentrums;
• Veränderung des Zeitpunkt des Beginns der Claudicatio (COT) von der Basislinie an den Tagen 45, 90, 135 und 180;
• Veränderung des Knöchel-Arm-Index-Drucks (ABI) von. der Basislinie an den Tagen 45, 90, 135 und 180;
• Veränderung der Scores für Claudicatio, Strecke, Geschwindigkeit und Stufensteigen von der Basislinie nach WIQ an den Tagen 45, 90, 135 und 180;
• Veränderung des zusammenfassenden Scores des physischen Teils (physical component summary score, PCSS) des SF-36 von der Basislinie an den Tagen 45, 90, 135 und 180; und
• Prozentualer Anteil von reagierenden Probanden an den Tagen 90 und 180.

Potentielle nebengeordnete Untersuchungen umfassen Plethysmographie, Muskelbiopsie und MR-Spektroskopie. Das allgemeine Protokoll und die Informationsuntersuchungen bei Nachfolgeuntersuchungen sind in der Tabelle 18 aufgeführt. Tabelle 18: Allgemeine Abfolge von Ereignissen.

	Screening	Dosierung			Primärer Endpunkt		Abbruch
	TAG	TAG	TAG	TAG	TAG	TAG	TAG
Untersuchungen	–45 bis –1	1	15	45	90	135	180
vollständige Vorgeschichte und physische Untersuchung gemäß ACS-Richtl.	X
begrenzte Vorgeschichte und physische Untersuchung		X		X	X	X	X
telefon. Nachunter.			X
12-Kanal-EKG	X	X			X		X
Röntgen des Thorax	X
PSA (nur Männer); Serum Schwangersch. (nur Frauen); Screening nach HIV, Hepatitis und Drogenmissbrauch, sofern angebracht	X
Labor-Untersuchung (CBC, Blutplättchen, Chemie¹, Urin²)	X	X	X	X	X	X	X
FGF-2 Antikörper		X	X	X	X	X	X
nach Gardner abgestufter Bewegungstest auf PWT und COT; ABIs	X, X			X	X	X	X
ophthalmologische Untersuchung; Fundusphotographie nur wenn Hinweis auf Retinopathie	X						X
Lebensqualität: WIQ, SF-36	X			X	X	X	X
begrenztes Angiogramm		X
Verabreichung des Wirkstoffs der Studie		X
Blutprobe für FGF-2 und Infusionslösungsprobe		X
Begleitende Medikationen	X	X	X	X	X	X	X
Nebenwirkungen (adverse events, AEs)		X	X	X	X	X	X

¹Vollständiges Blutbild (CBC, complete blond count, nicht differentiell), Blutplättchen, Elektrolyte, BUN, Kreatinin, Cholesterol, Leberenzyme, Glucose, Cotinin
²Urin in Bezug auf spezifische Schwere, qualitatives Protein, Protein/Kreatinin-Verhältnis.

Statistische Analyse
Die Daten werden mit der Absicht analysiert, die Analyse unter Verwendung einer ANOVA nach Rängen zu behandeln, wobei der letzte Wert nach der Basislinie für die fehlenden Daten übertragen wird, oder Probanden ohne Bewertung der post-Basislinien-PWT der niedrigste Rang zugewiesen wird, und wobei eine Anpassung an den Basislinien-PWT, den Status hinsichtlich des Rauschens und an das Zentrum erfolgt.
Beispiel 4: Einfluss der FGF-2-Dosierungsprotokolle auf den kollateralen Blutfluss in Ratten mit peripherer arterieller Insuffizienz
Es wurde eine Untersuchung vorgenommen, um die Wirksamkeit der drei Verabreichungswege von FGF-2 (intraarteriell [Positivkontrolle], intramuskulär und eine Verabreichung, die bei Menschen verwendet wird) miteinander zu vergleichen, um den kollateralen Blutfluss in Ratten mit experimenteller peripherer arterieller Insuffizienz zu erhöhen.
Vorherige Untersuchungen an Tiermodellen haben gezeigt, dass bFGF bei der Verbesserung des kollateralen Blutflusses in die distalen Wadenmuskeln nach bilateraler Okklusion der fernoralen Arterien wirksam ist (Yang et al. (1996) Circ. Res. 79: 62–69; Yang und Feng (2000) Am. J. Physiol. 278: H85–H93). Der verbesserte Blutfluss von etwa 50 ml/min/100 g auf 70– 80 ml/min/100 g wurde durch eine signifikante Verringerung der vaskulären Resistenz der kollateralen Gefäße im oberen Oberschenkel möglich. Die Zunahme im kollateralen Blutfluss zu den Wadenmuskeln korreliert gut mit dem angiographischen Score, die von Röntgenbildern der Arterienverzweigung im Oberschenkel erhalten wurde. Die Kollateralgefäße im oberen Oberschenkel sind die Hauptorte für eine Resistenz im Blutkreislauf nach Verschluss der femoralen Arterien (Yang et al. (1996) Circ. Res. 79: 62–69). Es ist nicht wahrscheinlich, dass eine de novo-Synthese von neuen Kapillaren (Angiogenese) große leitende Gefäße entwickeln würde und für diese vaskuläre Reaktion verantwortlich ist. Vielmehr machen das Ausmaß der Resistenzveränderung und die kurze Zeit für die vaskuläre Entwicklung (16 Tage) es wahrscheinlich, dass die Vergrößerung von bestehenden Gefäßen die primäre Veränderung war, die zu dem höheren Blutfluss beigetragen hat. Diese Zunahme des kollateralen Blutflusses durch bFGF wird auch in älteren Ratten beobachtet (Yang und Feng (2000) Am. J. Physiol. 278: H85–H93) und durch physische Aktivität verstärkt (Yang et al. (1998) Am. J. Physiol. 274: H2053–H2061).
Eine Vielzahl von Verabreichungsarten und Protokollen hat sich in Tiermodellen bei der bFGF-Verabreichung als wirksam bei der Steigerung des kollateralen Blutflusses erwiesen. Diese umfassen eine systemische Verabreichung nahe der Arterie und eine subkutane Verabreichung mittels Bolus, kurzfristige und verhältnismäßig langfristige Verabreichungsprotokolle, die durch Injektionen oder zeitlich festgelegte Infusionen mit osmotischen Pumpen erzielt werden (Yang und Feng (2000) Am. J. Physiol. 278: H85–H93). Während diese Protokolle nützlich waren, um die Wirksamkeit von bFGF zu zeigen, sind einige dieser Protokolle nicht für die Handhabung von Patienten bei der therapeutischen Angiogenese geeignet. Darüber gilt der Wert der wiederholten Verabreichung von bFGF in zeitlichen Intervallen in Patienten als wahrscheinlich, ist jedoch mit zahlreichen der Verfahren, die in vorhergehenden experimentellen Studien verwendet wurden, nicht durchführbar. Beispielsweise wäre es extrem wertvoll, die Wirksamkeit von intramuskulären Injektionen von bFGF zu ermitteln. Es ist jedoch gegenwärtig unklar, ob direkte intramuskuläre Injektionen von bFGF eine gezielte oder allgemeine Verbesserung des kollateralen Blutflusses bewirken. Daher war Ziel der gegenwärtigen Pilotstudie, die Wirksamkeit von FGF-2-Verabreichungen mittels intramuskulärer Injektionen sowie ein klinisch relevantes Protokoll, das bei der therapeutischen Angiogenese eingesetzt wird, zu bewerten.
Aufbau des Experiments:

Tiere mit peripherer arterieller Insuffizienz wurden in vier Gruppen eingeteilt: Gruppe 1: intraarterielle, 14 Tage andauernde Infusion,

FGF-2 (5 μg/kg/Tag)

N = 6

Gruppe 2: Vehikelgruppe bestehend aus

Gruppe 2a	14 Tage intraarterielle, kontinuierliche Infusion des Vehikels	N = 2
Gruppe 2b	einzelne intraarterielle Injektion von Vehikel	N = 2
Gruppe 2c	intramuskulär, Einzelbolus des Vehikels	N = 4

Gruppe 3: einzelne, intraarterielle Injektion

Gruppe 3a	Dosis 1 (1,5 μg/kg gesamt)	N = 6
Gruppe 3b	Dosis 2 (15 μg/kg gesamt)	N = 6
Gruppe 3c	Dosis 3 (30 μg/kg gesamt)	N = 6

Gruppe 4: intramuskuläre Injektion

Gruppe 4a	Dosis 1 (0,15 μg/kg gesamt)	N = 6
Gruppe 4b	Dosis 2 (1,5 mg/kg gesamt)	N = 6
Gruppe 4c	Dosis 3 (15 μg/kg gesamt)	N = 6

Aufgrund der verschiedenen Verabreichungsarten wurde diese Studie nicht in einer vollständig verblindeten Weise durchgeführt. Tiere innerhalb einer Verabreichungsart erhielten jedoch die Behandlungen der Dosen (d. h. Vehikel, Infusion, Dosis 1, Dosis 2 oder Dosis 3) in einer zufällig zugewiesenen verblindeten Weise.
Allgemeines Protokoll:
Adulte Sprague-Dawley-Ratten (ungefähr 325 g) wurden durch Gehen auf einem Laufband für 5 bis 10 Minuten zweimal täglich für 5 Tage konditioniert. Um das Experiment zu beginnen, wurde bei den Tieren eine bilaterale Okklusion der femoralen Arterien durchgeführt (siehe Methoden). Am selben Tag begannen die Tiere eine zweiwöchige Behandlung gemäß der oben beschriebenen Behandlungsgruppen. Am Tag 16 des Experiments wurde kollateral-abhängiges Blut bestimmt, während die Ratten auf einem motorbetriebenen Laufband rannten. Nach Vervollständigung des Datensatzes wurden die Ergebnisse nach Behandlungsgruppe vereinigt, und die Ergebnisse wurden statistisch durch ANOVA analysiert. Es wurde erwartet, dass mit Vehikel behandelte Tiere aus jeder der Verabreichungsgruppen in eine Referenzkontrollgruppe gruppiert werden können. Die Daten wurden jedoch untersucht, um zu bestimmen, ob die intramuskuläre Injektionsbehandlung eine systemische Reaktion hervorgerufen hat, beispielsweise verursacht durch eine inflammatorische Reaktion im Muskel.
Modell der peripheren arteriellen Insuffizienz:
Eine bilaterale Ligation der Femoralarterie wird durchgeführt, um eine periphere arterielle Insuffizienz zu etablieren, ohne den Blutfluss im ruhenden Muskel zu beeinflussen. Die hohe Blutflussreserve eines Muskels wird beträchtlich verringert, wobei der restliche Blutfluss im Muskel ausreichend ist, um die Bedürfnisse des Blutflusses im Ruhezustand zu unterstützen; vergleiche z. B. (Yang et al. (1990) J. Appl. Physiol. 69: 1353–1359; Yang und Terjung (1993) J. Appl. Physiol. 75(1): 452–457; Mackie und Terjung (1983) Am. J. Physiol. 245: H265–H275). Es gibt somit weder "Ruheschmerz" noch Komplikationen, die zu pathologischen Veränderungen führen, Gewebenekrose oder Gangrän, die bei stärker proximalen, vaskulären Blockierungen beobachtet werden (Chleboun und Martin (1994) Aust. N. Z. J. Surg. 64: 202–207). Es ist verständlich, dass diese chirurgisch behandelten Tiere nicht das breite Spektrum der peripheren arteriellen Insuffizienz darstellen, welches unter klinischen Bedingungen vorgefunden wird. Vielmehr ist dieses Modell kennzeichnend für eine Verschlusskrankheit von großen Gefäßen, die sich oftmals mit Symptomen einer Claudicatio intermittens präsentiert.
Verfahren:
Tierpflege. Adulte Sprague-Dawley-Ratten (ungefähr 325 g), die von Taconic Farms, Germantown, New York erhalten wurden, wurden in einem hinsichtlich der Temperatur kontrollierten Raum (20 ± 1°C) in einem 12 Stunden/12 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus gehalten. Den Tieren wurde Purina-Rattennahrung und Leitungswasser ad libitum gegeben. Vorherige Studien haben gezeigt, dass eine vollständige Datengruppe mit ungefähr 12 Tieren pro Gruppe erforderlich ist, um die Wirkungen der Behandlung definitiv zu bewerten (Yang et al. (1990) J. Appl. Physiol 69: 1353–1359). Somit war die vorliegende Arbeit eine Pi lotstudie, um eine allgemeine Reaktion im Hinblick auf zukünftige Überlegungen zu der Hälfte der Studie zu bewerten. Da ungefähr 90% der Ratten, die vom Lieferanten erhalten wurden, freiwillige liefen (und per Zufall auf die Behandlungsgruppen zu verteilen waren), und einige Abnutzung bei der Durchführung der Experimente auftrat, wurde erwartet, dass n = 5–6 pro experimenteller Gruppe erhalten würde.
FGF-2-Zufuhr: Die Zuführung von FGF-2 wurde zum Zeitpunkt der Ligation der Femoralarterie begonnen/erreicht durch: a) eine 14tägige, kontinuierliche, intraarterielle Infusion; b) eine einzelne intramuskuläre Injektion; oder c) eine einzelne intraarterielle Injektion, wie es nachstehend beschrieben wird.
Bei der Kontrollgruppe erhielt eine Gruppe von Ratten eine 14tägige Infusion mit einer Verweilpumpe/Verweilkatheter (Rate = 0,5 μl/h). Der Katheter wurde so platziert, dass die Infusion oberhalb des Ligationspunktes in die Femoralarterie eines Hinterlaufs verabreicht wurde. Sechs der Ratten erhielten FGF-2 in einer Dosis von 5 μg/kg/Tag für 14 Tage (insgesamt 70 μg/kg); die anderen beiden erhielten lediglich Vehikel (PBS). Um Toträume sowie das Füllen der Pumpe, das Füllen der Leitungen usw. zu erlauben, wurde ein Endvolumen von 0,435 ml Pumpenlösung für jede Ratte basierend auf dem Anfangsgewicht der Ratte von ungefähr 325 g berechnet. Es wurde für jede Ratte ein separates Aliquot der Pumpenlösung hergestellt. Unmittelbar vor der Verwendung wurden jedem Aliquot 43,5 μl Natriumcitrat und 7 μl Glycerol zugefügt, sodass das Volumen der FGF-2-Lösung oder von PBS in jeder der vorbereiteten Röhrchen 0,435 – 0,0435 – 0,007 = 0,385 ml betrug. Für die FGF-Aliquots betrug die Konzentration von FGF-2 somit 152,5 μg/ml.
Eine zweite Gruppe von Ratten erhielt Vehikel oder FGF-2 mittels einer einzelnen intraarteriellen Injektion. Diese In jektion wurde über eine Zeitspanne von 10 Minuten oberhalb des Ligationspunktes in die Femoralarterie eines Hinterlaufs verabreicht. Das zu injizierende Volumen betrug 0,35 ml. Sechs Ratten erhielten 1,5 μg/kg FGF-2 Gesamtdosis; sechs erhielten 15 mg/kg FGF-2; sechs erhielten 30 mg/kg FGF-2; und zwei erhielten lediglich Vehikel.
Eine dritte Gruppe von Ratten erhielt eine einzelne intramuskuläre Injektion. Diese Injektion wurde auf zwei Stellen im medialen oberen Oberschenkelmuskel eines Hinterlaufs verteilt, in der Region der Kollateralbildung. Das zu injizierende Volumen betrug 100 μl pro Stelle, bei einem Gesamtvolumen von 0,2 ml. Sechs Ratten erhielten 0,15 μg/kg FGF-2 Gesamtdosis; sechs erhielten 1,5 μg/kg FGF-2; sechs erhielten 15 μg/kg FGF-2; und vier erhielten lediglich Vehikel.
Chirurgische Ligation. Unter Etheranästhesie wurde jede Femoralarterie unmittelbar distal zu dem inguinalen Ligament isoliert. Eine Ligatur wurde fest um das Oberschenkelgefäß platziert, um eine totale Blockierung des Blutflusses zu erreichen. Topisches Antibiotikumpulver (Neo-Predef, Upjohn) wurde vor Verschließung mit Hautclips auf die Wunde platziert. Der chirurgische Eingriff war kurz, wurde mit einer 100%igen Erfolgsrate erzielt, und die Tiere erholten sich schnell. Eine visuelle Begutachtung, die routinemäßig durchgeführt wurde (Yang und Terjung (1993) J. Appl, Physiol. 75(1): 452–451; Yang et al. (1995a) Circ. Res. 76: 448–456; Yang et al (1995b) Am J. Physiol. 268: H1174–H1180), verifizierte bei der Autopsie den Erfolg der Chirurgie.
Blutflussbestimmung beim Laufen auf einem Laufband in vivo. Der Blutfluss im Muskel wurde in einer verblindeten Weise bestimmt, wobei radiomarkierte Mikrosphären während des Laufens auf einem Laufband verwendet wurden, wie es ausführlich in (Yang und Terjung (1993) J. Appl. Physiol. 75(1): 452–457; Mackie und Terjung (1983) Am. J. Physiol. 245: H265–B275; Mathien und Terjung (1986) Am. J. Physiol. 245: H1050–H1059; Mathien und Terjung (1990) Am J. Physiol. 258: H759–H765; Yang et al. (1990) J. Appl. Physiol 69: 1353–1359; Yang et al. (1995) Circ. Res. 76: 448–456; Yang et al. (1995) Am J. Physiol. 268: H1174–H1180; Yang et al. (1996) Circ. Res. 79: 62–69) beschrieben wurde. Mikrosphären (15 μm Durchmesser), die mit ⁸⁵Sr oder ¹⁴¹Ce (~ 10 mCi/g) markiert waren, wurden kommerziell in einer Suspension von 10% Dextran erhalten (NEN, Boston), das 0,05% Tween 80 enthielt. Eine gut gemischte Suspension von Mikrosphären wurde vorsichtig durch Infusion in den Aortabogen verabreicht, gefolgt von einem Spülen mit Salzlösung, über einen Zeitraum von 15 bis 20 Sekunden. Direkte Vergleiche der Injektionsstellen (linker Ventrikel vs. Aortabogen) ergaben denselben Blutfluss zu den Nieren und zum Hinterlaufmuskel. Ungefähr 360000 Mikrosphären wurden per Infusion verabreicht, um eine geeignete Mikrosphärenverteilung zu etablieren, und um eine statistische Sicherheit in Bezug auf die Daten zu gewährleisten (Mackie und Terjung (1983) Am. J. Physiol. 245: H265–H275; Mathien und Terjung (1986) Am. J. Physiol. 245: H1050–H1059; Mathien und Terjung (1990) Am J. Physiol. 258: H759–H765). Üblicherweise gab es mehr als 400 Mikrosphären pro einzelner Muskelprobe während der Bewegung. Die Entnahme einer Referenzblutprobe bei 500 μl/min (Pumpe von Sage Instruments, Modell 355) aus der Schwanzarterie wurde 10 Sekunden vor der Infusion der Mikrosphären begonnen und für ungefähr 100 Sekunden fortgeführt. Es wurde herausgefunden, dass die Referenzblutproben, die aus der rechten Karotisarterie, aus der Femoralarterie und aus der Schwanzarterie entnommen wurden, sich einander im Rahmen von 5 bis 10% entsprechen (Mackie und Terjung (1983) Am. J. Physiol. 245: H265–H275; unveröffentl. Beobachtung).
Zwei Blutflussbestimmungen wurden in jedem Tier durchgeführt, bei einer moderaten und bei einer höheren Geschwindigkeit des Laufbands, um die maximale vaskuläre Leitfähigkeit des Muskels zu ermitteln, sodass die stromaufwärts gelegene, kollaterale Resistenz im oberen Oberschenkel geschwindigkeitsbestimmend für den Blutfluss stromabwärts zu den Oberschenkelmuskeln ist. Dies wird erreicht, da die Muskelkontraktion (Bewegung) der stärkste Stimulus für die Vasodilatation ist. Nach der Bewegung wurden die Ratten durch eine Überdosis Pentobarbital getötet, und die Gewebeproben wurden wie unten beschrieben erhalten und im Hinblick auf die Referenzblutprobe (LKB Universal Gamma Counter) mit einem 1%igen Auszählfehler ausgezählt. Es wurden bilaterale Teile der Niere (mittleres Drittel) entnommen, um die Eignung der Mikrosphärenmischung zu verifizieren. Geeignete Korrekturen wurden hinsichtlich des Hintergrunds und des Isotopen-Überschusses durchgeführt. Der Blutfluss (ml/min/100 g) wurde wie folgt berechnet: FLUSS = (CPMT × FLUSSRBS × 100)/(CPMRBS × WtT)wobei T das Gewebe ist und RBS die Referenzblutprobe.
Herzrate und arterieller Druck wurden kontinuierlich während der Bewegung überwacht.
Chirurgische Verfahren zur Bestimmung des Blutflusses. Die chirurgische Vorbereitung auf die Bestimmung des Blutflusses in vivo war eine Modifikation des von Laughlin et al. (1982) J. Appl. Physiol 52: 1629–1635 beschriebenen Verfahrens. Die Tiere wurden mit Ketamin/ACE-Promazin (100 mg/0,5 mg pro kg) anästhesiert, und es wurde ein Katheter in den Aortabogen der rechten Karotisarterie für die spätere Infusion von Mikrosphären eingebracht. Ein Katheter (PE 50 spitz zulaufend) wurde darüber hinaus für die Entnahme von Blutproben in die Schwanzarterie eingebracht. Beide Katheter wurden mit einer Salzlö sung gefüllt, die Heparin (100 IU/ml) enthielt; sie wurden unter der Haut belassen und auf der Rückseite des Nackens nach außen geführt. Jede Einschnittstelle wurde genäht und mit 1% Xylocain-Salbe (Astra Pharm.) bedeckt. Nach den Erfahrungen, die von anderen Gruppen gemacht wurden (Gleeson und Baldwin (1981) J. Appl. Physiol. 50: 1205–1211), waren die Ratten 3 bis 4 Stunden nach Einbringen der Katheter munter, bewegungsfreudig und zeigten eine normale Belastungstoleranz.
Muskelsektionen. Alle Gewebe des Hinterlaufs distal von der Hüftpfanne werden präpariert, gewogen und hinsichtlich ihrer Radioaktivität ausgezählt. Die Muskeln (Greene (1963) Anatomy of the Rat, New York Hafner Pub. Co.) umfassen: M. biceps femoris, M. semitendinosus, M. semimembranosus, M. caudofemoralis, die Adduktorengruppe, die Gluteusgruppe, M. tensor fasciae latae, die Quadricepsgruppe, M. soleus, M. plantaris, M. gastrocnemius, M. tibialis anterior, M. extensor digitorum longus, die tiefen lateralen Muskeln und Muskeln des hinteren Bereichs des Beins. Tibia, Fibula, Femur und Fuß wurden ebenfalls gewogen und ausgezählt. Darüber hinaus werden Teile erhalten, die primär aus schnellen (fast-twitch) roten Fasern (tiefer lateraler M. quadriceps und tiefer lateraler M. gastrocnemius), aus schnellen (fast-twitch) weißen Fasern (oberflächlicher M. quadriceps und oberflächlicher, medialer M. gastrocnemius), und aus langsamen (slow-twitch) roten Fasern (M. soleus) bestehen. Eine ausführliche biochemische, physiologische und morphologische Charakterisierung dieser Muskelfasersektionen ist bekannt (siehe Saltin und Gollaick (1983) In: Handbook of Physiology – Skeletal Muscle, Am. Physiol. Soc., Seiten 555–631). Der Blutfluss zum Zwerchfell wird ebenfalls bestimmt werden, um die Reaktion eines aktiven Muskels, der nicht von der Ligation betroffen ist, zu verfolgen.
Statistische Verfahren. Die statistische Bewertung, die wiederholte Messungen Varianzanalyse, einen Vergleich von Mittelwerten nach Turkey und einen t-Test umfasste, wurde in geeigneter Weise durchgeführt (Steel und Torrie (1960) Principles & Procedures of Statistics, McGraw-Rill, New York).
Ergebnisse:
Die intramuskuläre Verabreichung von rFGF-2 erhöht den Blutfluss in Dosis-abhängiger Weise (20). Bei intraarterieller Verabreichung war die Dosis von 15 μg/kg rFGF-2 genauso wirksam wie die Dosis von 30 μg/kg. Eine kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum von 14 Tagen stellte keine signifikant unterschiedliche Wirkung relativ zur Verabreichungsart mittels einzelner IA-Infusion oder einzelner IM-Infusion dar.
Diese Daten zeigen die Wirksamkeit einer einzelnen IM-Injektion und einer einzelnen IA-Infusion von rFGF-2 bei der Erhöhung des Blutflusses in die Region des Hinterlaufs in einem PAD-Tiermodell.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer peripheren arteriellen Verschlußkrankheit (peripheral artery disease) in einem Patienten, wobei eine therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 an den Patienten zu verabreichen ist, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 in zwei Dosen zu unterteilen ist, und wobei eine einzelne Dosis innerhalb eines Zeitraums von einer Stunde in jedes Bein des Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der FGF-2 durch intraarterielle Infusion (IA) in mindestens eine Arterie jedes Beins des Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der FGF-2 in die Arteria femoralis communis jedes Beins des Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der FGF-2 durch bilaterale Zuführung unter Verwendung eines Katheters zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der FGF-2 durch direkte IA-Infusion in die Arteria femoralis communis jedes Beins des Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der FGF-2 durch eine oder mehrere intramuskuläre (IM) Injektionen zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die periphere arterielle Verschlußkrankheit durch Claudicatio angezeigt wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Patient eine kritische Extremitätenischämie (critical limb ischemia) aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der FGF-2 ein rekombinantes Molekül ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der FGF-2 die in 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 4), 4 (SEQ ID NO: 6), 5 (SEQ ID NO: 8) gezeigte Sequenz oder ein angingen aktives Fragment oder Mutein davon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Mutein ein FGF-2-Molekül umfaßt, bei dem mindestens ein einzelner Cystein-Rest gegen eine neutrale Aminosäure ausgetauscht ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die neutrale Aminosäure Serin oder Threonin ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der FGF-2 gleichzeitig mit einem weiteren Molekül zu verabreichen ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heparin und einem anderem Proteoglycan.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Heparin ein Molekül mit geringem Molekulargewicht ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Heparin unfraktioniertes Heparin ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der FGF-2 innerhalb von etwa 5 Minuten bis etwa 60 Minuten nach der Verabreichung von Heparin oder der Verabreichung des anderen Proteoglycans an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der FGF-2 innerhalb von etwa 20 Minuten bis etwa 30 Minuten nach der Verabreichung von Heparin oder der Verabreichung des anderen Proteoglycans an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der FGF-2 zu verabreichen ist, ohne daß ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Heparin und einem anderen Proteoglycan verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 einmal innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 einmal pro Woche an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 einmal im Monat, einmal alle zwei Monate, einmal alle drei Monate, einmal alle vier Monate, einmal alle fünf Monate oder einmal alle sechs Monate an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 als Ergänzung zur Gefäßchirurgie, zur mechanischen Bypass-Chirurgie, zur Anigoplastie oder zu einem Angiogramm zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 1 μg/kg bis etwa 3 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 5 μg/kg bis etwa 7 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 7 μg/kg bis etwa 9 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 9 μg/kg bis etwa 10 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 10 μg/kg bis etwa 15 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 15 μg/kg bis etwa 20 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 20 μg/kg bis etwa 25 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 25 μg/kg bis etwa 30 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 30 μg/kg bis etwa 40 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 40 μg/kg bis etwa 50 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 4 μg bis etwa 0,3 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 0,3 mg bis etwa 3,5 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 1,0 mg bis etwa 2,0 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 2,0 mg bis etwa 3,5 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der FGF-2 durch intraarterielle (IA) oder intravenöse (IV) Infusion an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der FGF-2 durch eine oder mehrere intramuskuläre (IM) Injektionen an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der FGF-2 durch subkutane (SC) Injektion an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verabreichung von FGF-2 eine Verbesserung in der maximalen Belastungszeit beim Gehen (peak walking time; PWT) in dem Patienten relativ zur PWT ohne Verabreichung von FGF-2 bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verabreichung von FGF-2 eine Verbesserung des Knöchel-Arm-Index (anklebrachial index; ABI) in dem Patienten relativ zum ABI ohne Verabreichung von FGF-2 bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verabreichung von FGF-2 zu einer Verringerung des Körperschmerzes führt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verabreichung von FGF-2 die Fähigkeit verbessert, Stufen zu steigen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verabreichung von FGF-2 das die Schwere der Claudicatio verringert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die therapeutisch wirksame Menge etwa 0,1 μg/kg bis etwa 9,9 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine stabilisierte FGF-2-DTT-Formulierung ist.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei der FGF-2 gleichzeitig mit einem weiteren Molekül zu verabreichen ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heparin und einem anderen Proteoglycan.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 1 μg/kg bis etwa 3 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 5 μg/kg bis etwa 7 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 7 μg/kg bis etwa 8 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 8 μg/kg bis etwa 9 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 9 μg/kg bis etwa 9,9 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 7,0 μg bis etwa 0,7 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 57, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 9,0 μg bis etwa 0,5 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 58, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 0,1 mg bis etwa 0,4 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 59, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 oder des angingen aktiven Fragments oder Muteins davon etwa 0,1 mg bis etwa 0,2 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei der FGF-2 durch intraarterielle (IA) oder intravenöse (IV) Infusion an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei der FGF-2 durch eine oder mehrere intramuskuläre (IM) Injektionen an den Patienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verabreichung von FGF-2 die maximale Belastungszeit beim Gehen (peak walking time; PWT) in einem Patienten mit Claudicatio intermittens verbessert.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 1 μg/kg bis etwa 3 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 5 μg/kg bis etwa 9 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 9 μg/kg bis etwa 10 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 10 μg/kg bis etwa 20 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 63, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 20 μg/kg bis etwa 30 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verabreichung von FGF-2 den Knöchel-Arm-Index (ankle brachial index; ABI) in einem Patienten mit Claudicatio intermittens verbessert.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 0,1 μg/kg bis etwa 1 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 1 μg/kg bis etwa 3 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 3 μg/kg bis etwa 5 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 5 μg/kg bis etwa 9 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 9 μg/kg bis etwa 10 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 10 μg/kg bis etwa 20 μg/kg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 71, wobei die therapeutisch wirksame Menge von FGF-2 etwa 20 μg/kg bis etwa 30 μg/kg beträgt.