DE60129593T2

DE60129593T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur extraktion einer nukleinsäure

Info

Publication number: DE60129593T2
Application number: DE60129593T
Authority: DE
Inventors: Lucy Tung-Yi Fremont LAI; Michael Shiu-Yan Fremont HO
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: WO2002044400A3; AU2002220175A1; WO2002044400A2; EP1346037A2; JP4297687B2; US6503716B1; JP2004534515A; EP1346037B1; ATE368106T1; DE60129593D1; CA2430138A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zum schnellen und wirksamen Aufreinigen von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe.
HINTERGRUND
Viele der Techniken der modernen molekularen Biologie und molekularen Medizin beginnen mit der Isolierung einer Nukleinsäure aus einer biologischen Quelle. Typischerweise wird die Nukleinsäure aus einer Zelle oder einem Virus extrahiert und sodann mit einem oder mehreren Enzymen modifiziert oder manipuliert. Um verwendbar zu sein, muss der Extraktionsprozess mindestens drei Kriterien erfüllen. Zuerst muss er die Nukleinsäure für eine Manipulation durch den Anwender dadurch verfügbar machen, dass sie von der Zelle oder dem Virus, die/das sie enthält, entfernt wird. Zweitens muss er Inhibitoren von Enzymen entfernen, die ansonsten die Manipulation stören würden. Drittens muss er Nukleasen entfernen, die ansonsten die Nukleinsäure zerstören würden. Jedes dieser Kriterien ist besonders schwierig zufrieden zu stellen, wenn die Quelle der Nukleinsäure keine relativ reine Kultur von Zellen oder Viren ist, sondern stattdessen andere Verunreinigungen enthält. Diese Probleme sind besonders groß, wenn die Quelle der Nukleinsäure selbst eine kleine Komponente des Ausgangsmaterials ist. Dies ist z.B. der Fall, wenn eine Nukleinsäure aus einem Nahrungsmittelpathogen, das Teil einer Nahrungsmittelprobe ist, extrahiert wird.
Die meisten Verfahren einer DNA-Extraktion umfassen mindestens zwei Schritte. Im ersten Schritt wird die Zelle oder das Virus durch eine chemische Behandlung, Kochen, einen enzymatischen Verdau der Zellwand oder mechanische Kräfte lysiert. Eine Lyse setzt die DNA aus der Zelle oder dem Virus frei und macht sie für eine Manipulation verfügbar. Eine Zentrifugation oder Filtration trennt Zell- oder virale Trümmer von einer Rohfraktion ab, die die DNA und Verunreinigungen wie Inhibitoren von Enzymen und Nukleasen umfasst. In dem zweiten Schritt wird die DNA durch Entfernen der Inhibitoren, Nukleasen und anderen nicht gewünschten Proteinen aus der Rohfraktion aufgereinigt. Traditionell wurde dies durch Extrahieren der Rohfraktion mit Phenol und Präzipitieren der DNA mit Ethanol oder Isopropanol erreicht. Die Phenolextraktion entfernt Proteinverunreinigungen. Leider ist Phenol eine hochgradig toxische und korrosive Chemikalie, was erfordert, dass der Anwender Schutzkleidung, Handschuhe und eine Sicherheitsbrille trägt und einen Abzug verwendet. Bevor das Phenol zum Extrahieren von DNA verwendet werden kann, muss es auf einen pH-Wert von über 7,8 äquilibriert werden. Das Äquilibrierungsverfahren ist zeitaufwändig und gefährlich, da es erfordert, das Phenol auf 68°C zu erhitzen. Der Phenolextraktionsschritt erfolgt wirksamer dadurch, dass das äquilibrierte Phenol mit Chloroform und Isoamylalkohol in einem Verhältnis von 25:24:1 vereinigt wird. Jedoch ist das Gemisch bei 4°C nicht länger als einen Monat stabil und Chloroform ist hochgradig toxisch und steht im Verdacht, ein Karzinogen zu sein. Die Alkoholpräzipitation ist erforderlich, um Verunreinigungen zu entfernen, einschließlich Spuren von Phenol und Chloroform. Da eine einzige Phenolextraktion oder Ethanolpräzipitation typischerweise nicht vollständig wirksam beim Entfernen von Verunreinigungen von der DNA ist, müssen sie mehrmals wiederholt werden, um DNA von annehmbarer Reinheit zu erhalten. Jedoch wird mit jeder Extraktion und Präzipitation ein Teil der DNA verloren, was zu geringeren Ausbeuten führt. Jeder Präzipitationsschritt erfordert auch einen Trocknungsschritt, um alle Spuren an Alkohol von der DNA zu entfernen. Der Alkohol kann bei Umgebungstemperatur und Druck, was zeitaufwändig ist, oder bei erhöhter Temperatur und vermindertem Druck in einer beheizten, vakuumdichten Zentrifuge verdampft werden, was nicht zu langsam ist, aber eine teure und komplizierte Ausrüstung und eine signifikante Menge an Arbeitszeit erfordert.
Kürzlicher wurden Alternativen zu dem traditionellen Verfahren einer DNA-Isolierung entwickelt, die kein Phenol oder Chloroform verwenden. Diese alternativen Verfahren beinhalten typischerweise eine Entfernung von Inhibitoren, Nukleasen und anderen Proteinen durch Binden der DNA an ein Festsubstrat wie eine Säule, ein Harz, einen Filter oder eine Aufschlemmung. Die DNA wird ein- oder mehrere Male zur Entfernung von Verunreinigungen gewaschen, sodann von dem Substrat eluiert. Während diese Alternativen einige Vorteile gegenüber den herkömmlichen Verfahren bieten, sind die benötigten Bindungssubstrate teuer und können nicht wieder verwendet werden. Außerdem erfordern diese Verfahren, dass der Anwender eine signifikante Menge an Zeit und Energie investiert. Auch kann Substrat-gebundene DNA für eine Zerstörung durch Scheren empfänglich sein.
Die Isolierung von RNA stellt noch größere Schwierigkeiten bereit. Spurenmengen von RNase, die während einer Isolierung vorhanden ist, kann schnell die gesamte RNA in einer Probe zerstören. Der Anwender muss sowohl die RNase, die ursprünglich in der Probe vorhanden ist, inaktivieren als auch verhindern, dass RNase von äußeren Quellen in die Probe eingebracht wird. Dies ist eine schwierige Aufgabe, da RNasen ubiquitäre, reichlich vorhandene und widerstandsfähige Enzyme sind. Die meisten Verfahren zum Isolieren von RNA sind kompliziert und beinhalten viele zeitaufwändige Schritte, wobei jeder Schritt eine Möglichkeit zur Kontamination der Probe mit einer RNase darstellt, die die gewünschte RNA zerstören wird.
Die Nachteile der vorstehend beschriebenen Nukleinsäureextraktionsverfahren werden stark multipliziert, wenn das Ausgangsmaterial keine relativ reine laborgewachsene Kultur ist, sondern stattdessen eine unverarbeitete Probe ist. Beispiele für unverarbeitete Proben, die bestehende Verfahren einer Nukleinsäureisolierung vereitelt haben, beinhalten Nahrungsmittelproben, klinische Proben, forensische Proben, Landwirtschaftsproben und Umweltproben. Um die Sache schlimmer zu machen, ist die Zelle oder das Virus, die/das die Quelle der Nukleinsäure ist, oft eine winzige Fraktion der Gesamtmasse der Probe. Die Nukleinsäure muss von sowohl den Zell- oder viralen Trümmern als auch von dem anderen Material in der Probe und von jeglichen Nukleasen oder Inhibitoren von Enzymen, die sie enthält, abgetrennt werden. Das Problem ist besonders akut, wenn die Nukleinsäure RNA ist, da RNAs äußerst empfindlich gegenüber RNase-katalysierter Hydrolyse sind, oder DNA ist, die unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion ("PCR") oder einer anderen Amplifikationstechnik amplifiziert werden soll. PCR benötigt lediglich winzige Mengen an Substrat-DNA, aber das Polymeraseenzym, das zum Amplifizieren der DNA verwendet wird, ist gegenüber sogar Spurenmengen von Inhibitoren empfindlich.
Demzufolge besteht ein Bedarf für schnelle und wirksame Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren aus biologischen Proben. Die Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen, dass Gesamtnukleinsäure aus nahezu jeglicher biologischer Quelle isoliert wird. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders unter Bedingungen verwendbar, bei denen vorherige Verfahren nicht wirksam oder unpraktisch sind: die biologische Probe enthält große Mengen an kontaminierendem Material, die Quelle der Nukleinsäure ist eine kleine Fraktion der gesamten biologischen Probe, die Isolierung erfolgt in großem Maßstab oder automatisiert, oder Elektrizität oder Laborausrüstung ist nicht verfügbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt wird erfindungsgemäß ein einfaches, schnelles und wirksames Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren aus Proben, typischerweise aus biologischen Proben, bereitgestellt. Gemäß dem Verfahren wird eine biologische Probe mit einem Nukleinsäureextraktionsreagenz für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur in Kontakt gebracht, die ausreichen, um Zellen in der biologischen Probe zu lysieren. Nach Lyse werden die Nukleinsäuren von den Zelltrümmern typischerweise durch Zentrifugieren der Probe zum Pelletieren der Zelltrümmer und Wiedergewinnen des Überstands, der die Nukleinsäuren umfasst, wieder gewonnen.
Nukleinsäureextraktionsreagenzien, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, sind typischerweise wässrige Zusammensetzungen, die etwa 0,1% (w/w) bis etwa 18% (w/w) Natriummetasilicat und etwa 0,05% (w/w) bis etwa 80% (w/w) und vorzugsweise etwa 0,5% (w/w) bis etwa 40% (w/w) eines substituierten Ethers umfassen. Das Gewichtsverhältnis des Metasilicats zu substituiertem Ether liegt typischerweise in dem Bereich von etwa 1:0,5 bis etwa 1:2. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Gewichtsverhältnis von Natriummetasilicat zu substituiertem Ether etwa 1:1,3. Typische substituierte Ether beinhalten in nicht begrenzender Weise Alkoxyalkylalkohole, Aryloxyalkylalkohole und Alkyloxyarylalkohole, die 2 bis 12, typischer 3 oder 4 bis 8 Kohlenstoffatome umfassen. Bevorzugte substituierte Ether sind unverzweigte primäre Alkoxyalkanole gemäß der Formel CH₃(CH₂)_m-O-(CH₂)_nCH₂OH, worin m und n jeweils unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 6 sind. Beispiele für bevorzugte alkylierte Alkylalkohole beinhalten 2-Butoxyethanol und 2-Methoxyethanol. Zusätzliche substituierte Ether beinhalten 2-Phenoxyethanol, Diethylenglykolmonobutylether, Diethylenglykolmonoethylether, Diethylenglykolmonopentylether, Diethylenglykoldiethylether, Diethylenglykoldibutylether, Ethylenglykolmonomethylether, Ethylenglykolmonoethylether, Ethylenglykolmonobutylether, Ethylenglykoldimethylether und Ethylenglykoldiethylether.
Die Nukleinsäureextraktionsreagenzien sind typischerweise basisch, vorzugsweise weisen sie einen pH-Wert in dem Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 10 auf und können zusätzliche optionale Komponenten enthalten, die in nicht begrenzender Weise einschließen: organische Säuren wie Zitronensäure oder Essigsäure, typischerweise bei einer Konzentration in dem Bereich von etwa 0,01 M bis etwa 0,04 M, Puffermittel wie Tris-HCl, HEPES, MOPS, PIPES, MES, typischerweise bei einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 100 mM, Chelatierungsmittel wie EDTA oder EGTA, typischerweise bei einer Konzentration in dem Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM, Harze wie vernetzte Polystyrolkügelchen (z.B. CHELEX^TM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), vernetzte Agarosekügelchen mit Tris(2-aminoethyl)amin, Iminodiessigsäure, Duolite C-467, Duolite GT73, typischerweise bei einer Konzentration von 15% oder weniger (w/w), Konservierungsmittel wie NaN₃, typischerweise bei einer Konzentration in dem Bereich von etwa 0,01% bis etwa 0,4% (w/v), Tenside wie SDS, Triton X-100 oder TWEEN, typischerweise bei einer Konzentration in dem Bereich von etwa 0,1% bis etwa 1,0% (w/v), und einen Stabilisator wie Polyethylenglykol, typischerweise bei einer Konzentration in dem Bereich von etwa 0,03% (w/w) bis etwa 1% (w/w). Die vorgesehene Verwendung der extrahierten Nukleinsäure kann die Konzentration eines jeden der in dem Extraktionsreagenz verwendeten Bestandteile beeinflussen. Zum Beispiel sollte, wenn die extrahierte Nukleinsäure in einer PCR-Reaktion verwendet wird, das Extraktionsreagenz derart formuliert sein, dass die Konzentration von Bestandteilen in der PCR-Reaktion nicht die Taq-Polymerase inhibiert oder anderweitig verhindert, dass die Amplifikationsreaktion abläuft. Für Faktoren, die den Erfolg von PCR-Reaktionen beeinflussen, vergleiche Innis (Hrsg.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, insbesondere Kapitel 1.
Die Arten von biologischen Quellen, aus denen eine Nukleinsäure unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert werden kann, sind nahezu unbegrenzt. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure aus einem Mikroorganismus wie einem Bakterium (z.B. ein Eubakterium oder ein Archaebakterium), Virus, Retrovirus oder Eukaryoten (z.B. Hefe oder anderen Pilz) isoliert werden. Der Mikroorganismus kann ein pathogener Mikroorganismus sein. Die Nukleinsäure kann auch aus einer Pflanzen- oder Tierzelle (z.B. einer menschlichen Zelle) isoliert werden. Die Zelle oder das Virus, aus der/dem die Nukleinsäure isoliert wird, kann Teil eines nahezu jeglichen Typs von Probe sein. Zum Beispiel kann die Zelle oder das Virus ein Teil einer Nahrungsmittel-, klinischen, forensischen, Landwirtschafts- oder Umweltprobe sein. Diese Proben können z.B. eine Körperflüssigkeit (z.B. Blut, Samenflüssigkeit, Speichel), ein Gewebe oder eine andere Probe, die von einem Testsubjekt entnommen wurde (z.B. eine Biopsie), Schmutz, Wasser oder ein jeglicher anderer Feststoff oder eine jegliche andere Flüssigkeit sein, von der bekannt ist oder die in Verdacht steht, dass sie eine Zelle oder ein Virus enthält.
In einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß Nukleinsäureextraktionsreagenzien bereitgestellt, die spezifisch für eine Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren formuliert sind. Erfindungsgemäße Nukleinsäureextraktionsreagenzien sind typischerweise wässrige Zusammensetzungen, die mehr als 0,8% (w/w) bis weniger als 5% (w/w) Natriummetasilicat und mehr als 0,4% (w/w) bis weniger als 5% (w/w) eines substituierten Ethers umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung etwa 0,85% (w/w) bis etwa 4% (w/w) Natriummetasilicat. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung etwa 0,90% (w/w) bis etwa 3% (w/w) Natriummetasilicat. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung etwa 1% (w/w) bis etwa 2% (w/w) Natriummetasilicat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung etwa 1,1% (w/w) bis 4% (w/w) eines substituierten Ethers. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung etwa 1,2% (w/w) bis 3% (w/w) eines substituierten Ethers. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung etwa 1,25% (w/w) bis 2,5% (w/w) eines substituierten Ethers.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 0,16:1 bis etwa 5:1. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 0,5:1 bis etwa 4:1. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 0,7:1 bis etwa 3:1. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 0,8:1 bis etwa 2:1. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 0,9:1 bis etwa 1:1,75. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 1:1 bis etwa 1:1,5. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 1:1,2 bis etwa 1:1,4. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Konzentration von Natriummetasilicat zu der Konzentration des substituierten Ethers etwa 1:1,3.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Zusammensetzung einen pH-Wert in dem Bereich von etwa 7 oder mehr auf. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform weist die Zusammensetzung einen pH-Wert in dem Bereich von etwa 7 bis etwa 10,5 auf. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform weist die Zusammensetzung einen pH-Wert in dem Bereich von etwa 8 bis etwa 9,5 auf.
Typische substituierte und bevorzugte substituierte Ether sind diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden. Die Nukleinsäureextraktionsreagenzien können auch die vorstehend beschriebenen zusätzlichen optionalen Komponenten enthalten.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Kit bereitgestellt, der ein zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbares Nukleinsäureextraktionsreagenz umfasst. Der Kit kann gegebenenfalls zusätzliche Reagenzien, Puffer und Vorrichtungen zum Wachsen der Proben, aus der die Nukleinsäuren extrahiert werden, und/oder zum Durchführen anschließender Analysen der isolierten Nukleinsäuren wie Sequenzieren oder PCR beinhalten. Zum Beispiel kann der Kit ein Gefäß zum Wachsen einer Probe oder zum Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren, einen Sequenzier- oder PCR-Primer, eine Polymerase (z.B. eine Taq-Polymerase) oder andere Enzyme, ein Nukleotidtriphosphat oder ein Gemisch von Nukleotidtriphosphaten, einen Mikroorganismus oder ein Medium zum Kultivieren eines Mikroorganismus beinhalten.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäureextraktionsreagenzien und Verfahren stellen signifikante Vorteile gegenüber gegenwärtig erhältlichen Isolierungstechniken bereit. Sehr wichtig ist, dass Nukleinsäuren, die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und/oder Verfahren isoliert wurden, im Wesentlichen rein sind und direkt in einer Vielzahl von Tests und/oder Analysen ohne weitere Manipulation oder Aufreinigung verwendet werden können. Zum Beispiel können die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und/oder Verfahren isolierten Nukleinsäuren, z.B. durch PCR, amplifiziert oder ohne weitere Aufreinigung sequenziert werden. Die Fähigkeit zum wirksamen Isolieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe in einem einzigen Schritt in hoher Reinheit, insbesondere in einer Reinheit, die für anschließende enzymatische Manipulationen wie PCR-Amplifikation hoch genug ist, ist beispiellos im Stand der Technik.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse von PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung einer Matrizen-DNA, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen hergestellt wurde, wie durch den Schwellenwertzyklus (oberes Feld) und Fluoreszenzintensität (unteres Feld) gemessen.
2 zeigt die Ergebnisse von PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von genomischer DNA aus E. coli, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen hergestellt wurde, wie durch den Schwellenwertzyklus gemessen.
3 zeigt die Ergebnisse von PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von genomischer DNA aus Salmonella enteritidis, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen hergestellt wurde, wie durch den Schwellenwertzyklus gemessen.
4 zeigt die Ergebnisse von PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von genomischer DNA aus Listeria monocytogenesi, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen hergestellt wurde, wie durch den Schwellenwertzyklus gemessen.
5 zeigt elektrophoretische Auftrennungen auf mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegelen von DNA, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Listeria innocua extrahiert wurde.
6 zeigt normalisierte Ergebnisse (oberes Feld) und Farbstoffansichtsergebnisse (unteres Feld) einer allelischen Diskriminierung von DNA, die aus menschlichem Blut unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen extrahiert wurde.
7 zeigt elektrophoretische Auftrennungen auf mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegelen von DNA, die aus Katzenblut unter Verwendung der erfindungs gemäßen Verfahren und Zusammensetzungen extrahiert und durch PCR amplifiziert wurde.
8 zeigt die Wirkungen der Inkubationstemperatur auf die Extraktionswirksamkeit unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen, wie durch den Schwellenwertzyklus von PCR-Reaktionen gemessen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die erfindungsgemäßen Verfahren, Zusammensetzungen und Kits sind zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus Zellen und Viren verwendbar. Sie sind äußerst vielseitig und können für eine Verwendung in einer großen Anzahl und breiten Vielzahl von Anwendungen angepasst werden, von denen manche in Sambrook et al. (Hrsg.), 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York und Ausubel et al. (Hrsg.), 2000, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, beschrieben sind. Wie es genauer nachstehend beschrieben werden wird, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, Verfahren und Kits verwendet werden, um nahezu jegliche Art an Nukleinsäure (z.B. jegliche Art von DNA oder RNA) aus nahezu jeglicher Art von Zelle (z.B. prokaryotisch oder eukaryotisch) oder aus jeglicher Art von Virus (z.B. ein DNA- oder RNA-Virus) in einer Probe, die sich von nahezu jeglicher Quelle (z.B. einer Zellkultur, einer klinischen Probe, einer Landwirtschaftsprobe, einer Umweltprobe, einer forensischen Probe oder einer Nahrungsmittelprobe) unter sogar primitiven Bedingungen (z.B. ohne Elektrizität) zu isolieren. Die extrahierte Nukleinsäure kann ohne weitere Aufreinigung oder ohne weiteres Waschen für nahezu einen jeglichen bekannten Zweck, zu dem ein Nukleinsäureextrakt eingespannt werden kann (z.B. eine Amplifikationsreaktion, Sequenzierungsreaktion, Markierungsreaktion, Anlagerungsreaktion, Restriktionsverdau, Ligation, reverse Transkriptasereaktion, Hybridisierung, Southern Blot oder Northern Blot), verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, Verfahren und Kits eignen sich besonders gut zum Herstellen von Nukleinsäureextrakten für eine Verwendung in Amplifikationstechniken (z.B. PCR, LCR, MASBA, SDA und bDNA) und für eine Verwendung in einem jeglichen Prozess mit hohem Durchsatz oder automatisiertem Prozess. Die Erfindung kann auch angepasst werden, um eine vorher extrahierte Nukleinsäure aufzureinigen oder zu waschen. Ferner sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, Verfahren und Kits nicht teuer, einfach und schnell herzustellen oder zu verwenden im Vergleich zu anderen Nukleinsäureextraktionsreagenzien, Verfahren und Kits, die bekannt sind. Im Ge gensatz zu anderen Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren können die erfindungsgemäßen Verfahren ohne eine Wärmequelle, eine Zentrifuge oder einen Vakuumexsikkator durchgeführt werden. Folglich sind die erfindungsgemäßen Verfahren ideal für eine Verwendung an Orten, wo Elektrizität nicht verfügbar ist. Die Nukleinsäureextraktionsreagenzien sind auch sicher für die Umwelt.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Probe, die eine Nukleinsäure von Interesse enthält oder im Verdacht steht, diese zu enthalten, mit einem Nukleinsäureextraktionsreagenz bei einer Temperatur und für eine Zeitspanne in Kontakt gebracht, die ausreichen, um Zellen in der Probe zu lysieren, was die Nukleinsäuren in das Extraktionsreagenz freisetzt. Die freigesetzten Nukleinsäuren können sodann von den Zelltrümmern und anderen Verunreinigungen typischerweise durch Zentrifugieren der Probe zum Pelletieren der Zelltrümmer und Verunreinigungen und Abtrennen des Überstands von dem Pellet isoliert werden. Die isolierten Nukleinsäuren können sodann in weiteren Manipulationen und Tests wie z.B. PCR-Amplifikationsreaktionen ohne weitere Aufreinigung verwendet werden.
Nukleinsäureextraktionsreagenzien, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, sind Lösungen, die Natriummetasilicat und einen substituierten Ether umfassen. Die Reagenzien sind typischerweise neutral bis basisch mit einem pH-Wert in dem Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 10 und umfassen im Allgemeinen etwa 0,1 bis etwa 18% (w/v) Natriummetasilicat und etwa 0,05 bis etwa 80% (v/v) substituierten Ether.
Die Identität des substituierten Ethers ist für einen Erfolg nicht kritisch. Typische substituierte Ether, die verwendet werden können, beinhalten beispielsweise und in nicht begrenzender Weise Alkoxyalkylalkohole, Aryloxyalkylalkohole und Alkyloxyarylalkohole, die insgesamt 2 bis 12 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt 3 oder 4 bis 8 Kohlenstoffatome umfassen. Die Alkylgruppen können geradkettig, verzweigt oder zyklisch sein und können gesättigt oder ungesättigt sein. Die Arylgruppen sind typischerweise Phenyl- oder Naphthylgruppen. Bevorzugte substituierte Ether sind geradkettige primäre Alkoxyalkanole gemäß der Formel CH₃(CH₂)_m-O-(CH₂)_nCH₂OH, worin m und n unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 6 sind. Beispiele für bevorzugte alkylierte Alkylalkohole beinhalten 2-Butoxyethanol und 2-Methoxyethanol. Zusätzliche substituierte Ether beinhalten 2-Phenoxyethanol, Diethylenglykolmonobutylether, Diethylenglykolmonoethylether, Diethylenglykolmonopentylether, Diethylenglykoldiethylether, Diethylenglykoldibutylether, Ethylenglykolmono methylether, Ethylenglykolmonoethylether, Ethylenglykolmonobutylether, Ethylenglykoldimethylether und Ethylenglykoldiethylether.
Wie vom Fachmann anerkannt werden wird, kann das Nukleinsäureextraktionsreagenz Gemische von zwei oder mehreren substituierten Ethern umfassen. Zum Beispiel kann das Reagenz ein Gemisch eines primären Alkoxyalkanols gemäß der vorstehenden Formel und eines Aryloxyalkylalkohols umfassen. Wenn Gemische von substituierten Ethern verwendet werden, betreffen die verschiedenen Mengen und Verhältnisse, die hierin beschrieben sind, die Gesamtmenge an substituiertem Ether.
Das Nukleinsäureextraktionsreagenz kann auch zusätzliche optionale Bestandteile umfassen, einschließlich beispielsweise in nicht begrenzender Weise Puffermittel, Chelatierungsmittel, Konservierungsmittel etc. Ein jegliches Puffermittel, das zum Beibehalten des pH-Werts des Reagenzes in dem Bereich von pH 7 bis pH 10 geeignet ist, kann verwendet werden, einschließlich beispielsweise Tris-HCl-, HEPES-, MOPS-, PIPES-, MES-, Phosphatpuffer, etc. Der pH-Wert des Reagenzes kann mit einer Säure oder Base, z.B. HCl oder NaOH, eingestellt werden. Alternativ dazu kann der pH-Wert mit einer schwachen Säure oder Base, z.B. mit einer schwachen organischen Säure wie Zitronensäure oder Essigsäure, eingestellt werden. Obwohl nicht kritisch für einen Erfolg, beträgt die Konzentration des Puffermittels typischerweise 1 mM bis 100 mM, mehr bevorzugt 10 mM bis 50 mM.
Wie es nachstehend genauer beschrieben werden wird, ist es oft bevorzugt, das Nukleinsäureextraktionsreagenz während einer Herstellung anzusäuern. Folglich kann das Nukleinsäureextraktionsreagenz ferner eine Säure beinhalten. Bevorzugte Säuren sind schwache organische Säuren wie Zitronensäure oder Essigsäure. Wenn verwendet, beträgt die Endkonzentration der organischen Säure typischerweise 0,001 M bis 0,5 M, typischer 0,01 M bis 0,25 M und am meisten bevorzugt 0,05 M bis 0,2 M.
Chelatierungsmittel, die gegebenenfalls verwendet werden können, beinhalten in nicht begrenzender Weise EDTA oder EGTA, typischerweise in dem Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 100 mM, mehr bevorzugt in dem Bereich von etwa 0,5 mM bis etwa 50 mM und am meisten bevorzugt in dem Bereich von etwa 1 mM bis etwa 10 mM. Chelatierungsharze können auch verwendet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise vernetzter Polystyrolkügelchen (z.B. CHELEX^TM), vernetzter Agarosekügelchen mit Tris(2-aminoethyl)amin, Iminodiessigsäure, Duolite C-467, Duolite GT73, typischerweise bei einer Konzentration in dem Bereich von etwa 0,01% (w/v) bis etwa 1% (w/v), mehr bevorzugt etwa 0,025% (w/v) bis etwa 0,5% (w/v), am meisten bevorzugt 0,05% (w/v) bis etwa 0,2% (w/v).
Konservierungsmittel, z.B. Natriumazid, können auch verwendet werden. Wenn verwendet, werden Konservierungsmittel typischerweise bei sehr niedrigen Konzentrationen in den Bereich von etwa 0,1% bis 0,4% verwendet.
Stabilisatoren, z.B. Polyethylenglykol, können auch verwendet werden. Wenn verwendet, werden Stabilisatoren typischerweise bei Konzentrationen in dem Bereich von 0,04% (w/w) bis etwa 1% (w/w) verwendet.
Andere optionale Bestandteile, die in den Nukleinsäureextraktionsreagenzien verwendet werden können, werden dem Fachmann ersichtlich sein. Zum Beispiel können die Reagenzien auch Bestandteile umfassen, die bei der weiteren Manipulation der extrahierten Nukleinsäuren nützlich sind. Zum Beispiel können die Reagenzien einen oder mehrere aus Taq-Polymerase-Puffer, Taq-Polymerase, Nukleotidtriphosphaten und Primern bei Konzentrationen umfassen, die eine PCR-Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure vereinfachen.
Eine Vielzahl von Zusammensetzungen mit Natriummetasilicat und einem substituierten Ether, die erfolgreich als Nukleinsäureextraktionsreagenzien (nach Einstellung des pH-Werts, wie benötigt) unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind z.B. in den US-PSen 5,965,512 , 5,906,215 , 5,888,308 , 5,849,681 , 5,786,319 , 5,770,548 , 5,637,152 , 5,534,181 , 5,444,094 , 5,340,682 , 5,227,276 , 5,096,610 , 5,202,049 , 5,158,710 , 4,921,629 , 4,844,745 , 4,421,680 , 3,879,216 , der japanischen Patentanmeldung JP 58009793 , den europäischen Patentanmeldungen 0 379 093 A1 , 0 405 986 A2 und der PCT-Patentanmeldung 97/09412 beschrieben.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung umfasst das Nukleinsäureextraktionsreagenz etwa 1% bis etwa 2% (w/w) Natriummetasilicat und etwa 1,25% bis 2,5% (w/w) eines substituierten Ethers wie 2-Butoxyethanol, 2-Methoxyethanol, 2-Phenoxyethanol, Diethylenmonoethylether, Diethylenglykolbutylether und Diethylenglykoldibutylether, und weist einen pH-Wert von pH 8,3 bis pH 8,9 auf. Vorzugsweise beträgt das Gewicht-zu-Gewicht-Verhältnis des Natriummetasilicats zu Alk oxyalkylalkohol 1:1,1 bis 1:1,5, mehr bevorzugt 1:1,3. Die bevorzugte Zusammensetzung beinhaltet auch Zitronensäure oder Essigsäure in dem Bereich von etwa 0,05 M bis etwa 0,2 M. Die bevorzugte Zusammensetzung kann auch einen jeglichen der vorstehend aufgeführten optionalen Bestandteile in den vorstehend angegebenen Mengen beinhalten.
Die Nukleinsäureextraktionsreagenzien können gemäß herkömmlicher Techniken wie den Techniken, die in den vorstehend aufgeführten Patenten und Referenzen beschrieben sind, hergestellt werden. In einer zweckmäßigen Ausführungsform wird das Nukleinsäureextraktionsreagenz dadurch hergestellt, dass zuerst das Natriummetasilicat in Wasser aufgelöst wird und diese Lösung mit dem substituierten Ether verdünnt wird. Die wässrige Lösung von Natriummetasilicat und substituiertem Ether wird sodann weiter mit einer wässrigen Lösung einer schwachen organischen Säure verdünnt. Schließlich wird die sich ergebende Lösung mit einem Puffer verdünnt, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen.
Es wurde festgestellt, dass manchmal Flocken in dem Nukleinsäureextraktionsreagenz entweder während einer Herstellung oder nachfolgenden Lagerung suspendiert werden. Einmal gebildet, können die Flocken durch leichtes Schütteln und/oder Anwendung von Wärme wieder aufgelöst werden. Jedoch müssen die Flocken nicht wieder aufgelöst werden. Das Vorhandensein der Flocken beeinträchtigt die Fähigkeit des Reagenzes zum Extrahieren von Nukleinsäuren nicht nachteilig, wenn es in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. Folglich kann, wenn sich Flocken bilden, das Reagenz in den Verfahren so wie es ist oder gemäß der Präferenz des Anwenders geklärt verwendet werden. Details zum Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen erfindungsgemäßen Nukleinsäureextraktionsreagenzien sind in den Beispielen bereitgestellt.
Die Temperatur, bei der das Nukleinsäureextraktionsreagenz mit der Probe in Kontakt gebracht wird, ist für einen Erfolg nicht kritisch. Zum Beispiel kann das In-Kontakt-Bringen bei Umgebungstemperatur, bei Temperaturen über Umgebungstemperatur und bei Temperaturen unter Umgebungstemperatur erfolgen. Jedoch wird, da angenommen wird, dass die Temperatur des Gemisches die Geschwindigkeit einer Zelllyse beeinflusst (nachstehend genauer beschrieben), die Wahl der Temperatur die Zeitspanne beeinflussen, während der die Probe mit dem Reagenz in Kontakt stehen muss. Im Allgemeinen wird die Geschwindigkeit einer Zelllyse mit sich erhöhenden Temperaturen steigen. Folglich können Proben, die bei einer höhe ren Temperatur in Kontakt gebracht werden, in einer geringeren Zeitspanne mit den gleichen Ergebnissen in Kontakt gebracht werden. Jedoch wird der Fachmann anerkennen, dass Nukleinsäuren nicht unbegrenzt bei hohen Temperaturen stabil sind. Folglich sollte die verwendete Temperatur nicht so hoch sein, dass die zu extrahierenden Nukleinsäuren denaturiert oder anderweitig abgebaut werden. Typischerweise ergeben Temperaturen im Bereich von Umgebungstemperatur (etwa 25°C) bis etwa 120°C, typischer von etwa 55°C bis etwa 100°C gute Ergebnisse, obwohl, wie vorstehend angegeben, das Verfahren bei Temperaturen unter Umgebungstemperatur funktioniert. Das Gemisch kann während dem Kontaktierungsschritt unter Verwendung eines jeglichen Verfahrens oder einer jeglichen Vorrichtung, das/die bekannt ist, z.B. eines erhitzten Wasserbads, Wärmeblocks oder Thermocyclers, erhitzt werden. Der Anwender kann auch die Lysegeschwindigkeit durch Abkühlen des Gemisches, z.B. durch Inkubieren des Gemisches in einem Eisbad oder in einer Kühleinheit, vermindern.
Zusätzlich zur Temperatur beinhalten andere Faktoren, die die Zeitspanne beeinflussen, während der die Probe mit dem Nukleinsäureextraktionsreagenz in Kontakt gebracht wird, z.B. die Menge von zu extrahierender gewünschter Nukleinsäure, die Anzahl oder Konzentration von Zellen oder Viren in der Ausgangsprobe, die Art von Zelle oder Virus, die oder das lysiert werden soll, und die anschließende Verwendung, der die Nukleinsäure unterzogen werden wird. Der Fachmann wird auch anerkennen, dass die Zeitspanne des Kontaktierungsschritts über die für eine Lyse minimale ausgedehnt werden kann, und dass der limitierende Faktor die Geschwindigkeit des Abbaus der Nukleinsäure in dem Lysat sein wird. Zum Beispiel kann das Lysat bei Umgebungstemperatur für mindestens mehrere Tage ohne Abbau der Nukleinsäuren stehen gelassen werden. Durch Abkühlen des Gemisches auf 4°C kann der Kontaktierungsschritt auf neun Monate oder langer ausgedehnt werden. Das Gemisch kann sogar für einen noch längeren Lagerungszeitraum eingefroren werden.
Für die meisten Proben wurde festgestellt, dass eine Kontaktzeitspanne von etwa 10 Minuten zufriedenstellende Ergebnisse für Temperaturen zwischen 25°C und 100°C ergibt.
Sobald die Zellen mittels des Kontaktierungsschritts lysiert worden sind, können die freigesetzten Nukleinsäuren von den Zelltrümmern und anderem partikulärem Material unter Verwendung von Standardverfahren wieder gewonnen werden.
Zweckmäßigerweise kann das Lysat in eine wässrige Phase, die die freigesetzten Nukleinsäuren umfasst, und eine feste Phase getrennt werden. Die Auftrennung kann durch Schwerkraft, entweder dadurch, dass dem Lysat ermöglicht wird, sich im Wesentlichen ungestört abzusetzen, oder durch Zentrifugation erfolgen.
Alternativ dazu können Zelltrümmer und andere Trümmer durch Filtration entfernt werden. Da Nukleinsäuren oft nicht spezifisch an bestimmte Materialien wie Glas, etc. anhaften, sollte ein Filtermaterial ausgewählt werden, das nicht signifikant Nukleinsäuren nicht spezifisch bindet.
Ein signifikanter Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die isolierten Nukleinsäuren direkt in weiteren Tests und Experimenten ohne eine weitere Aufreinigung verwendet werden können. Zum Beispiel kann, wie in Beispiel 2 gezeigt, der wieder gewonnene Überstand direkt auf einem Agarosegel für eine direkte Analyse der isolierten Nukleinsäuren laufen gelassen werden. Wie in den Beispielen 2 bis 13 gezeigt, wurde DNA aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben, einschließlich Nahrungsmittel und Blut, die/das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert wurden/wurde, direkt in PCR-Amplifikationsexperimenten verwendet. Gemäß diesen Beispielen wurde die Überstandsfraktion direkt als eine Quelle einer Matrizen-DNA für die PCR-Reaktion verwendet. Die Überstandsfraktion konnte auch als eine Quelle einer Matrizen-DNA oder -RNA für andere Anwendungen wie Sequenzieren, Markierungsreaktionen oder Erzeugen von cDNA verwendet werden.
Im weitesten Sinne extrahiert das erfindungsgemäße Verfahren alle Nukleinsäuren aus allen Quellen innerhalb der Probe. Falls der Anwender es wünscht, eine spezifische Nukleinsäure von den anderen abzutrennen, können ein oder mehrere zusätzliche Schritte angefügt werden. Zum Beispiel können die isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel laufen gelassen werden, um die Nukleinsäuren nach Größe oder Topologie aufzutrennen. RNA oder DNA können durch In-Kontakt-Bringen der isolierten Nukleinsäuren mit RNase bzw. DNase entfernt werden. Alternativ dazu kann das Nukleinsäureextraktionsreagenz eine RNase oder DNase wie gewünscht, beinhalten, mit der Maßgabe, dass der Kontaktierungsschritt bei einer Temperatur erfolgt, die die Aktivität des Enzyms nicht denaturiert oder anderweitig nachteilig beeinflusst. Ein Hybridisierungsschritt kann hinzugefügt werden, um Nukleinsäuren gemäß ihrer Sequenzen aufzutrennen. Alle diese verschiedenen zusätzlichen Schritte sind herkömmlich und werden dem Fachmann ersichtlich sein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um nahezu einen jeglichen Typ von Nukleinsäure ungeachtet ihrer Länge oder Sequenz aus einer Zelle, einem Virus oder einer anderen Quelle zu isolieren. Der Anwender muss nicht die Sequenz der zu extrahierenden Nukleinsäure kennen. Die Nukleinsäure kann nicht traditionelle Nukleotide, chemisch modifizierte Nukleotide, künstliche Nukleotide oder Nukleotidsubstitute umfassen. Die Nukleinsäure kann auch eine Nichtnukleinsäurekomponente umfassen. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure kovalent modifiziert (z.B. mit Biotin) oder anderweitig markiert (z.B. mit einem radioaktiven Isotop oder einem fluoreszierenden Marker) sein.
Die Nukleinsäure kann z.B. eine DNA oder eine RNA sein. Das DNA-Molekül kann z.B. genomische DNA sein. Genomische DNA kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren aus einer jeglichen Quelle isoliert werden. Sie kann ein vollständiges Chromosom oder ein jeglicher Teil eines Chromosoms sein. Sie kann eine Mutante oder der Wildtyp sein. Sie kann DNA von einer anderen Quelle (z.B. einem Gen von einem anderen Organismus) umfassen, die in die genomische DNA durch eine jegliche bekannte Technik eingebracht worden ist. Sie kann eine kodierende Sequenz oder eine nicht kodierende Sequenz umfassen. Die kodierende Sequenz kann z.B. für eine mRNA, eine tRNA oder eine rRNA kodieren. Die kodierende Sequenz kann von einem Wildtyp oder einer Mutante abstammen, die volle Länge aufweisen, oder trunkiert sein. Die nicht kodierende Sequenz kann z.B. ein Centromer, ein Telomer, ein intergenischer Bereich, ein Intron, ein Transposon oder eine Mikrosatellitensequenz sein.
Das DNA-Molekül kann auch ein Plasmid-DNA-Molekül sein. Die Plasmid-DNA kann von einer jeglichen Quelle oder einem jeglichen Organismus abstammen. Der Begriff "Plasmid-DNA" betrifft alle DNA-Moleküle innerhalb einer Zelle, die nicht Teil des normalen zellulären Komplements von Chromosomen sind. Folglich beinhaltet der Begriff "Plasmid" künstliche Chromosomen, extrachromosomale DNA und DNA von Organellen. Das Plasmid kann in ein Chromosom einer Wirtszelle integriert sein oder als ein zirkuläres oder lineares extrachromosomales Element beibehalten werden. Es kann ein natürlich vorkommendes Plasmid oder ein gentechnisch hergestelltes Plasmid sein. Ein gentechnisch hergestelltes Plasmid kann sich von einer jeglichen Quelle, z.B. von der chromosomalen DNA eines Organismus wie eines Menschen, Hefe, Bakteriums oder Virus, ableiten. Es kann bei einer hohen oder niedrigen Kopienanzahl in der Wirtszelle beibehalten werden. Es kann alle der Elemente, die für seine eigene, autonome Propagierung in der Wirtszelle benötigt werden, enthalten oder es kann auf einen oder mehrere Faktoren, die vom Wirt kodiert werden, angewiesen sein. Es kann ein Plasmid, das für Gentherapie verwendbar ist, sein. Das Plasmid kann ein oder mehrere Gene umfassen, die für eine mRNA, tRNA oder rRNA kodieren.
Die Nukleinsäure kann auch eine cDNA sein. Eine cDNA ist ein DNA-Molekül, das durch reverse Transkription einer RNA-Matrize oder durch Replikation einer cDNA hergestellt wird.
Die Nukleinsäure kann auch eine RNA sein. Die RNA kann von einer jeglichen natürlichen oder künstlichen Quelle abstammen. Beispiele für RNA-Moleküle, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren, Reagenzien und Kits extrahiert werden können, beinhalten mRNA, tRNA und rRNA.
Die Quelle der Nukleinsäure kann eine jegliche Zelle oder ein jeglicher Virus oder eine jegliche andere Zusammensetzung, Behausung oder Struktur, die eine Nukleinsäure umfasst, sein. Die Nukleinsäure kann von einer jeglichen Art von Zelle, einschließlich sowohl prokaryotischer als auch eukaryotischer Zellen, extrahiert werden. Eine jegliche Art von prokaryotischer Zelle kann verwendet werden, einschließlich Eubakterien und Archaebakterien und grampositiver und gramnegativer Bakterien. Der Prokaryot kann ein pathogenes Bakterium sein. Eine jegliche Art von eukaryotischer Zelle kann verwendet werden, einschließlich z.B. eines eukaryotischen Mikroorganismus oder einer Zelle von einem multizellulären Organismus. Die eukaryotische Zelle kann z.B. ein pathogener eukaryotischer Mikroorganismus, eine Blutzelle oder eine Gewebszelle sein.
Alternativ dazu kann die Nukleinsäure aus einer jeglichen Art von Virus extrahiert werden. Das Virus kann ein RNA- oder ein DNA-Genom aufweisen. Es kann prokaryotische oder eukaryotische Zellen infizieren. Es kann ein virulentes, attenuiertes oder nicht infektiöses Virus sein. Es kann natürlich auftretend, künstlich modifiziert oder künstlich hergestellt worden sein. Das Virus kann z.B. ein humanes Immundefizienz-Virus ("HIV") oder ein sich davon ableitendes Virus sein. Das Virus kann z.B. ein Teil einer viralen Kultur, die von der Wirtszelle des Virus im Wesentli chen frei ist, sein oder es kann direkt von einer infizierten Zelle oder einer Gewebeprobe isoliert werden.
Die Quelle der Nukleinsäure kann ein Teil einer größeren Probe sein. Zum Beispiel kann die Probe eine Nahrungsmittelprobe, eine klinische Probe, eine forensische Probe, eine Landwirtschaftsprobe oder eine Umweltprobe sein. Wie hierin verwendet, betrifft eine "Nahrungsmittelprobe" eine Probe, die ein Nahrungsmittel umfasst, eine "klinische Probe" betrifft eine Probe, die zum Diagnostizieren, Behandeln, Überwachen oder Heilen einer Erkrankung oder Störung in dem Patienten oder zum Bestimmen des Genotyps des Patienten verwendet wird, eine "forensische Probe" betrifft eine Probe, die zum Untersuchen eines Verbrechens oder eines Unfalls verwendet wird, eine "Landwirtschaftsprobe" ist eine Probe, die von einer Pflanze oder einem Tier entnommen wird, die/das zu einem landwirtschaftlichen Zweck gezüchtet oder aufgezogen wird, und eine "Umweltprobe" betrifft eine Probe, die entnommen wird, um die Umweltqualität der Quelle der Probe zu untersuchen. Typischerweise wird die Probe keine reine Kultur der Quelle der Nukleinsäure sein, sondern wird auch andere Substanzen enthalten. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind wirksam, die Nukleinsäure von diesen anderen Substanzen abzutrennen.
Die Probe kann zusätzlich zu der Quelle der Nukleinsäure nahezu eine jegliche Flüssigkeit oder einen jeglichen Feststoff enthalten. Der Feststoff kann wasserlöslich oder wasserunlöslich sein. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um das Vorhandensein eines Nahrungsmittelpathogens in einer Nahrungsmittelprobe nachzuweisen. Dies kann dadurch erfolgen, dass genomische DNA aus der Nahrungsmittelprobe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert wird und die DNA unter Verwendung von für das Pathogen spezifischen Primern amplifiziert wird.
Alternativ dazu kann die Probe eine jegliche Substanz enthalten, die sich von einem tierischen Testsubjekt ableitet, z.B. Blut, Cerebralspinalflüssigkeit, Haar, Fell, Speichel, Sputum, Samen, Urin, Stuhl, Schleim, Haut, ein benigner oder maligner Tumor oder eine benigne oder maligne Vergrößerung, ein biopsiertes Gewebe oder eine jegliche andere Art von Gewebeprobe, die beim Diagnostizieren einer Erkrankung oder eines Zustandes verwendet wird. Das Testsubjekt kann eine jegliche Art von Tier, z.B. ein Mensch, sein. Alternativ dazu kann die Probe eine jegliche Substanz enthalten, die sich von einer Pflanze ableitet, z.B. ein Blatt, Stamm, Stängel, Pollen, Wurzel, Zweig, Blüte, Samen, Blumenzwiebel, Spore oder ein anderes Pflanzenmaterial.
Die aus der Probe extrahierte Nukleinsäure kann diejenige des Testsubjekts sein. Sie kann z.B. verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Testsubjekt eine Erkrankung oder einen medizinischen Zustand aufweist, oder um den Genotyp des Testsubjekts zu bestimmen, oder zu bestimmen, ob ein bestimmtes Gen in dem Gewebe des Testsubjekts in der Probe exprimiert wird. Alternativ dazu kann die extrahierte Nukleinsäure diejenige eines Pathogens oder eines anderen Organismus in der Probe sein. Das Pathogen oder der Organismus kann z.B. ein Bakterium, ein Virus (z.B. HIV), ein Wurm, ein Insekt oder ein Pilz sein. Die Nukleinsäure kann sodann unter Verwendung von für das Pathogen oder den anderen Organismus spezifischen Primern amplifiziert werden, um das Vorhandensein des Pathogens oder anderen Organismus in der Probe nachzuweisen. Folglich sind die erfindungsgemäßen Verfahren in einer großen Vielzahl von medizinischen, klinischen, forensischen und Landwirtschaftsanwendungen verwendbar.
Alternativ dazu kann die Probe z.B. Erdboden, Schmutz, Deponiematerial, Abfall oder Müll, Pflanzen oder Tiermaterial, Wasser (einschließlich z.B. Frischwasser, Salzwasser oder Abwasser), oder eine Probe, die von einer Struktur (z.B. einem Gebäude) oder einer Vorrichtung (z.B. eine Klimaanlage) gesammelt wird, umfassen. Die extrahierte Nukleinsäure kann für das Vorhandensein eines Mikroorganismus in der Probe diagnostisch sein. Der Mikroorganismus kann pathogen oder anderweitig schädlich für andere Spezies, z.B. Menschen, sein. Das Vorhandensein des Mikroorganismus in der Probe kann zum Diagnostizieren, Untersuchen, Überwachen oder Beseitigen eines Umweltschadens für die Quelle der Probe (z.B. einen Mangel oder Unausgeglichenheit von Nährstoffen oder das Vorhandensein eines Toxins) verwendet werden.
Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren hinsichtlich eines Isolierens einer Nukleinsäure aus einer biologischen oder anderen Probe, umfassend eine Zelle oder einen Virus, veranschaulicht wurde, wird der Fachmann anerkennen, dass die Verfahren und Reagenzien zum Isolieren und/oder Aufreinigen von Nukleinsäuren aus nahezu einer jeglichen Quelle verwendet werden können. Zum Beispiel können die Verfahren und Reagenzien zum Isolieren von Nukleinsäuren aus in vitro-Reaktionen wie in vitro-Transkriptions- oder reverse Transkriptionsreaktionen verwendet wer den. Typischerweise wird das Verhältnis von Extraktionsreagenz zu in vitro-Syntheseprodukt etwa 1:9 betragen.
Erfindungsgemäß werden auch Kits bereitgestellt, die z.B. zum Analysieren von Proben hinsichtlich einer Nukleinsäure von Interesse verwendbar sind. Die erfindungsgemäßen Kits umfassen ein Nukleinsäureextraktionsreagenz und eine oder mehrere andere zusätzliche Komponenten, die für die gewünschte Analyse oder die gewünschte Anordnung verwendbar sind. Zum Beispiel kann der Kit zusätzlich ein oder mehrere Reagenzien beinhalten, die zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von Interesse verwendbar sind, einschließlich in nicht begrenzender Weise eines oder mehrerer Amplifikationsprimer, eines oder mehrerer Desoxynukleotidtriphosphate (z.B. ein Gemisch von dATP, dGTP, dCTP und/oder dUTP oder dTTP), eines oder mehrerer polymerisierender Enzyme (z.B. Taq-DNA-Polymerase), etc.
Alternativ dazu kann der Kit ein oder mehrere zusätzliche Reagenzien beinhalten, die zum Sequenzieren einer Nukleinsäure von Interesse verwendbar sind, z.B. einen oder mehrere Sequenzierungsprimer (markiert oder nicht markiert), ein oder mehrere Desoxynukleotidtriphosphate (z.B. ein Gemisch von dATP, dGTP, dCTP und dUTP oder dTTP), einen oder mehrere markierte oder nicht markierte Terminatoren (z.B. ddATP, ddGTP, ddCTP und ddUTP oder ddTTP) oder ein oder mehrere polymerisierende Enzyme (z.B. DNA-Polymerase).
In einer noch weiteren Ausführungsform kann der Kit ein oder mehrere Reagenzien beinhalten, die zum Markieren einer isolierten Nukleinsäure verwendbar sind, z.B. ein oder mehrere markierte oder nicht markierte Desoxynukleotidtriphosphate (z.B. ein Gemisch von dATP, dGTP, dCTP und dUTP oder dTTP), ein oder mehrere polymerisierende Enzyme (z.B. DNA-Polymerase) oder ein oder mehrere markierte oder nicht markierte Primer.
In einer noch weiteren Ausführungsform kann der Kit ein oder mehrere Reagenzien beinhalten, die zum Herstellen oder Verwenden einer DNA-Mikroanordnung oder eines "Gen-Chips" verwendbar sind.
Alle der innerhalb des Hauptteils der vorliegenden Beschreibung zitierten Referenzen sind hierdurch durch Bezug in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
BEISPIEL 1
Herstellung von Zusammensetzungen zum Extrahieren einer Nukleinsäure
Dieses Beispiel zeigt, dass eine große Vielzahl von Reagenzien verwendet werden kann, um die erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführen.

Das allgemeine Verfahren zum Herstellen von erfindungsgemäßen Nukleinsäureextraktionsreagenzien war wie folgt. Natriummetasilicat wurde in einem ersten Volumen von Wasser aufgelöst, sodann mit einem substituierten Ether (2-Butoxyethanol, wenn nicht anders angegeben) gemischt. Eine schwache Zitronensäurelösung und/oder eine Tris-Lösung wurden gegebenenfalls zugegeben, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen, und das sich ergebende Gemisch wurde gegebenenfalls weiter mit einem zweiten Volumen an Wasser verdünnt. Andere Bestandteile, einschließlich CHELEX-100^TM, Natriumazid, und Polyethylenglykol, wurden sodann gegebenenfalls zugegeben. Die Menge jedes Bestandteils in jeder Formel ist in der nachstehenden Tabelle angegeben.

	LL-1	LL-2	LL-3	LL-4
SMS(9 H₂O)	0.4	4	4	4
H₂O (mL)	15.1	151	182	182
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.2 ml	2 ml	1.43 g	1.33 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)
H₂O (ml)
2BE (ml)	0.5	5	5	5
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	2	20	20.4	20.4
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	0.178	1.78	2.04	2.04
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.5	8.5	8.2	8.3

	LL-5	LL-6	LL-7	LL-8
SMS(9H₂O) (g)	4	4	4	4
H₂O (mL)	182	182	182.2	182.2
Zitronensäure (gepulvert in g;	1.22 g	1.13 g	1.027 g	1 g
Lös. (1:4 w/v) in mL)
Eisessig (ml)
H₂O (ml)
2BE (mL)	5	5	5	5
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)	20.4	20.4	20.4	20.4
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	2.04	2.04	2.04	2.04
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.4	8.5	8.7	8.6

	LL-9	LL-10	LL-11	LL-12
SMS(9 H₂O) (g)	4	4	4	4
H₂O (ml)	182.3	182.4	187.9	183.6
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.919 g	0.812 g	1 g	1.027 g
Lös. (1:4 w/v) in mL
Eisessig (ml)
H₂O (mL)
2BE (mL)	5	5	5	5
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)	20.4	20.4	15	19
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	2.04	2.04	2.04	2.04
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.7	8.9	8.8	8.7

	LL-13	LL-14	LL-15	LL-16
SMS(9H₂O) (g)	3.802	4.3	4	4
H₂O (mL)	185	190	183.6	183.6
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.9 g	2 g
Lös. (1:4 w/v) in mL)
Eisessig (ml)			0.75	0.65
H₂O (mL)
2BE (ml)	5	5.4	5	5
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)	19	1	19	19
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	2.04	2	2.04	2.04
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.7	8.5	8.8	9

	LL-17	LL-18	LL-19	LL-20
SMS(9 H₂O) (g)	4	4	3.8	3.8
H₂O (mL)	183.6	183	100	100
Zitronensäure (gepulvert in g;			0.9 g	0.9 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)	0.85	1.1
H₂O (ml)			84.3	85.25
2BE (ml)	5	5	5.7	4.75
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)	19	19	19	19
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	2.04	2.04	2.04	2.04
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.6	8.9	8.6	8.6

	LL-21	LL-22	LL-23	LL-24
SMS(9 H₂O) (g)	3.8	3.8	1.27	1.27
H₂O (ml)	100	100	33.33	33.33
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.9 g	0.9 g	0.30 g	0.30 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)
H₂O (ml)	86.2	88.1	28.33	28.33
2BE (ml)	3.8	1.9	1.58	1.58
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	19	19	6.33	6.33
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	2.04	2.04	0.68	0.68
PEG (g)			0.07	0.21
Endgültiger pH-Wert	8.6	8.6

	LL-25	LL-26	LL-27	LL-28
SMS(9 H₂O) (g)	1.27	3.5	3.5	3.5
H₂O (mL)	33.33	100	100	100
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.309	0.9 g	0.829 g	0.7 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)
H₂O (ml)	28.33	85.75	89.4	89.4
2BE (ml)	1.58	4.75	4.75	4.75
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	6.33	19	17	20
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	0.68	2.04	2.04	2.04
PEG (g)	0.70
Endgültiger pH-Wert	8.4	8.7	8.6

	LL-29	LL-30	LL-31	LL-32
SMS(9 H₂O) (g)	2.1	2.1	3.5	2.1
H₂O (mL)	100	100	100	100
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.5 g	0.5 g	0.83 g	0.5 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)
H₂O (mL)	89.4	95.4	88	97.5
2BE (ml)	4.75	4.75	4.75	2.64
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	17	10	19	10
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)	2.04	2.04	2.04
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.1	8.6	8.5	8.6

	LL-33	LL-34	LL-35	LL-36
SMS(9 H₂O) (g)	2.1	2.1	2.7	2.1
H₂O (mL)	100	100	100	100
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.5 g	0.5 g	0.61 g	0.5 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)
H₂O (ml)	94	92.4	91.8	92.9
2BE (ml)	2.64	4.75	3.66	3.7
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	13.5	13.5	15.66	13.5
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid (ml)
PEG (g)
Endgültiger pH-Wert	8.3	8.3	8.5	8.4

	LL-37	LL-38	LL-39(ausgegelt)	LL.40(ausgegelt)
SMS(9 H₂O) (g)	2.1	2.1	2.1	2.1
H₂O (mL)	100	100	100	100
Zitronensäure (gepulvert in g;	0.5 g	0.5 g	0.5 g	0.5 g
Lös. (1:4 w/v) in ml)
Eisessig (ml)
H₂O (mL)	91.3	92.4	94	94
2BE (ml)	4.2	2.64	2.64	2.64
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	14.6	13.5	13.5	13.5
Chelex-100 (g)
5% (w/v) Natriumazid mL
PEG (g)			0.21	2.1
Endgültiger pH-Wert	8.3	8.3

	LL-50	LL-51	LL-52	LL-53	LL-54
SMS (g)	4.2	4.2	4.2	4.2	4.2
H₂O (mL)	200	200	200	200	200
Zitronensäure (g)	1	1	1	1	1

H₂O (mL)	188	188	188	188	188
Substituierter Ether	5.28	5.28	5.28 (2BE)	5.28	5.28
(ml)	(2-Methoxyethanol)	(2-Phenoxyethanol)		(Diethylenglykolbutylether)	(Diethylenglykoldibutylether)
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)	27	27	27	27	27
	8.5	8.5	8.5	8.5	8.5

	16-1	16-2	19	21
SMS (9H₂O, wenn nicht	0.4	0.8	0.4	0.8
anders angegeben) (g)			(SMS-5H₂O)
H₂O (mL)	9.1	17.7	9.1	17.7
2BE (mL)	0.5	1	0.5	1
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.2	0.5	0.2	0.5
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	0.5	0.5	0.5	0.75
H₂O (mL)	1.7	1.7	1.7	1.45
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)		0.25		0.25
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)

Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	0.2	0.25	0.25
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)			0.035
5% (w/v) Natriumazid (mL)
PEG (g)

	22	23	24(keine Amp.)	25 (keine Amp.)
SMS (9H₂O, wenn nicht	0.8	1.6	1.6	1.6
anders angegeben) (g)
H₂O (mL)	17.7	15.4	15.4	15.4
2BE (mL)	1	2	2	2
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.5	0.75	0.75	0.75
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	1	0.5	1	0.75
H₂O (mL)	1.2	1.7	12	1.45
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)	0.25	0.25	025	0.25
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.25	0.5	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)
PEG (g)

	26 (keine Amp.)	31	34	35
SMS (9H₂O, wenn nicht	1.6	0.4	0.4	0.4
anders angegeben) (g)
H₂O (ml)	15.4	9.1	9.1	9.1
2BE (ml)	2	0.5	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.75	0.2	0.1	0.3
Eisessig (ml)

CHELEX-100^TM (g)	0.75	0.5	0.5	0.5
H₂O (mL)	1.45	1.7	1.7	1.7
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)	0.25
1M Tris-HCL (pH 8.0) (ml)
0.5M EDTA (ml)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	0.5	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v)(mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)
PEG (g)

	36	37	38	43
SMS (9H₂O, wenn nicht	0.4	0.098	0.098	0.4
anders angegeben) (g)
H₂O (ml)	9.1	2.23	3.93	9.1
2BE (mL)	0.5	0.123	0.123	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (ml)	0.15	0.049	0.049	0.2
Eisessig (ml)

CHELEX-100^TM (g)	0.5	0.5	0.5	0.5
H₂O (ml)	1.7	1.7		1.7
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (ml)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5			2.5
hend hergestellt (ml)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	0.5	0.5	0.2
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (ml)
PEG (g)

	44	45	46	47
SMS (9H₂O, wenn nicht	0.4	0.4	0.4	0.4
anders angegeben) (g)
H₂O (ml)	9.1	9.1	9.1	9.1
2BE (ml)	0.5	0.5	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (ml)	02	0.2	0.15	0.15
Eisessig (ml)

CHELEX-100^TM (g)	0.5	0.5	0.5	0.5
H₂O (mL)	1.7	1.7	1.7	1.7
1M Tris-HCL (pH 7.0) (ml)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (ml)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	0.8	0.2	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (ml)
5% (w/v) Natriumazid (ml)
PEG (g)

	48	49	50	51
SMS (9H₂O, wenn nicht	0.4	0.8	0.8	0.8
anders angegeben) (g)
H₂O (mL)	9.1	18.2	18.2	18.2
2BE (mL)	0.5	1	1	1
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.15	0.4	0.4	0.4
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	0.5	0.5	0.5	0.5
H₂O (mL)	1.7	1.7	1.7	1.7
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.8	0.3	0.4	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)
PEG (g)

	52	53	54	55
SMS (9H₂O, wenn nicht	0.8	8	1.6	1.6
anders angegeben) (g)
H₂O (ml)	18.2	182	36.4	36.4
2BE (mL)	1	10	2	2
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.4	4	0.8	0.8
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	0.5	25		0.26
H₂O (mL)	1.7	85	2.2	1.94
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.25	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	125	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	25	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)	0.05	2.5	0.05	0.05
PEG (g)

	56	57	58	59
SMS (9H₂O, wenn nicht	1.6	1.6	1.6	1.6
anders angegeben) (g)
H₂O (ml)	36.4	36.4	36.4	36.4
2BE (mL)	2	2	2	2
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.8	0.8	0.8	0.8
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	0.39	0.5	0.66	0.79
H₂O (mL)	1.81	1.7	1.54	1.41
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	0.5	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)	0.05	0.05	0.05	0.05
PEG (g)

	60	61	62	63
SMS (9H₂O, wenn nicht	8	8	8	8
anders angegeben) (g)
H₂O(mL)	182	182	182	182
2BE (mL)	10	10	10	10
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	4	4	4	4
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)		0.25	0.79	1.31
H₂O (mL)	11	10.74	10.21	9.69
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.025	0.025	0.025	0.025
SMS/26E/Säurelös., wie vorste	12.5	12.5	12.5	12.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	2.5	2.5	2.5	2.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)	0.25	0.25	0.25	0.25
PEG (g)

	64	65	66	67
SMS (9H₂O, wenn nicht	8	8	8	8
anders angegeben) (g)
H₂O (mL)	182	182	182	182
2BE (mL)	10	10	10	10
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	4	4	4	4
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	1.84	2.36	2.6	3.28
H₂O (mL)	9.16	8.64	8.4	7.72
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.025	0.025	0.025	0.025
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	12.5	12.5	12.5	12.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	2.5	2.5	2.5	2.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)	0.25	0.25	0.25	0.25
PEG (g)

	71	72	73(keine Amp.)	74
SMS (9H₂O, wenn nicht	1.6	1.6	1.6	1.6
anders angegeben) (g)
H₂O (mL)	36.4	36.4	38.4	38.4
2BE (mL)	2	2
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)	0.8	0.8	0.8	0.8
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	0.26	0.26		0.26
H₂O (mL)	1.94	1.94	1.94	1.94
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.005	0.005	0.005	0.005
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	2.5	2.5	2.5	2.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.5	0.5	0.5	0.5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)	0.05	0.05	0.05	0.05
PEG (g)	0.025	0.04	0.025	0.025

	75	76	77	78
SMS (9H₂O, wenn nicht	1.6	1.6	1.6	4
anders angegeben) (g)
H₂O (mL)	36.4	36.4	36.4	170.4
2BE (mL)	2	2	2	5
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)				1.21
Eisessig (mL)

CHELEX-100^TM (g)	1.25	2.5	1.25	10.4
H₂O (mL)	11.25	10	11.25	11
1M Tris-HCL (pH 7.0) (mL)
1M Tris-HCL (pH 8.0) (mL)
0.5M EDTA (mL)	0.025	0.025	0.025	0.204
SMS/2BE/Säurelös., wie vorste	12.5	12.5	12.5
hend hergestellt (mL)
Tris-HCL (7.0)(mL)	0.25	0.25	0.175	20.408
Zitronensäurelös. (1:4 w/v) (mL)
5% (w/v) Natriumazid (mL)	0.25	0.25	0.25	2.041
PEG (g)

	27	28	29	30
SMS (g)	0.4	0.4	0.4	0.4
H₂O (mL)	16.24	16.24	16.24	16.24
2BE (mL)	0.5	0.5	0.5	0.5
Zitronensäure (g)	0.05	0.1	0.15	0.2
0.5 M EDTA (mL)	0.0204	0.0204	0.0204	0.0204
CHELEX-100^TM (g)	2.04	2.04	2.04	2.04
1M Tris-HCl (7.0) (mL)	2.04	2.04	2.04	2.04

SMS: Natriummetasilicat (Nonahydrat, wenn nicht anders angegeben), Sigma Chemical, St. Louis MO
H₂O: 18 Megaohm-Wasser, Sigma Chemical, St. Louis MO
2BE: 2-Butoxyethanol, Sigma Chemical, St. Louis MO
Zitronensäure: J.T. Baker, Phillipsburg NJ
Essigsäure: Sigma Chemical, St. Louis MO
CHELEX-100^TM: Bio-Rad Laboratories, Hercules CA
Tris-HCl: Sigma Chemical, St. Louis MO
EDTA: Sigma Chemical, St. Louis MO
Natriumazid: Sigma Chemical, St. Louis MO
PEG: Polyethylenglykol, Sigma Chemical, St. Louis MO

Jedes in der Tabelle aufgelistete Reagenz (mit der Ausnahme derjenigen, die mit "ausgegelt" markiert sind, die einen gelartigen Rückstand während oder nach einer Herstellung erzeugten) wurde auf seine Fähigkeit getestet, bakterielle DNA im Wesentlichen frei von PCR-Inhibitoren aus einer Eierprobe zu extrahieren, die mit dem E. coli-Stamm O157:H7 angeimpft worden war, wie im Wesentlichen in Beispiel 2 beschrieben. Jedes getestete Reagenz ergab ein positives Ergebnis in dem Amplifi kationstest für bakterielle DNA mit der Ausnahme von denjenigen, die mit "keine Amp." markiert sind.
BEISPIEL 2

Extraktion und Amplifikation von bakterieller DNA aus Nahrungsmittelproben Dieses Beispiel zeigt die Vielseitigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen beim Extrahieren von bakterieller DNA aus Nahrungsmittelproben.

Hersteller	Nahrungsmittel	Hersteller	Nahrungsmittel
GERBER	Babycerealiengemisch	SAFEWAY	Krautsalat
–	Frische Regen	SAFEWAY	Kartoffelsalat
	bogenforelle
SAFEWAY	Frischer Schrimp	GOOSE POINT	Austern
OSCAR MAYER	Freies Rind	–	Frischer Kopfsalat
	("beef frank")
KELLOGG'S	Cornflakes	–	Frische Alfalfa
			triebe
SCHILLING	Italienisches	ODWALLA	Orangensaft
	Saisongemisch
ODWALLA	Apfelsaft	LUCERNE	Vollmilch
NESTLE	Heißes Kakaogemisch	PACE	Dicke und grobe
CARNATION	(reich an Schokolade)		Salsa (mid)
KRAFT	Amerikanischer Käse	HEINZ	Mayonnaise
SAFEWAY	Rinderhackfleisch	HAAGEN-DAZ	Schokoladeneis
			creme mit Schoko
			stückchen
–	Imitationskrabben	FOSTER FARM	Hühnchenhackfleisch
	fleisch
LUCERNE	Kaffee und	–	Frische Erdbeeren
	Sahnejoghurt
NESTLE CARNATION	Nichtmolkerei	NESTLE	Plätzchen mit
	kaffeecreamer		Schokoladenstück
			chen
LUCERNE	Ei	NESTLE	Goodstart-Babyre
		CARNATION	zeptkonzentrat
NEW YORK STYLE	Italienische Wurst	COLUMBUS	Italienische
SAUSAGE CO.	(Schweinehackfleisch)		Trockensalami
LAND O' LAKES	Butter	CAMPBELL	Hühnernudelsuppe
			(aus der Dose)

Jede Nahrungsmittelprobe wurde im Wesentlichen wie in dem Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual, 1998, ADAC International, Gaithersburg, MD, beschrieben getestet. In getrennten Experimenten wurden 5 ml Milch, Babyrezept, Apfelsaft, Orangensaft oder Nichtmolkereicreamer zu 45 ml an modifizierter EC-Brühe in einen Anreicherungsbeutel gegeben. Für jedes der anderen Nahrungsmittel wurden in getrennten Experimenten 10 g zu 90 ml an modifizierter EC-Brühe in einem Anreicherungsbeutel gegeben. Jede Nahrungsmittelanreicherung wurde dadurch homogenisiert, dass der Beutel in einen STOMACHER-400^TM-Labormischer (Seward, London, England) gegeben und eine Minute gemischt, sodann bei 37°C 20 Stunden inkubiert wurde. Drei 0,9 ml-Aliquots jedes Homogenats wurden sodann bei einer Konzentration von etwa 1,1 × 10⁴ cfu/ml mit einer geeignet verdünnten Übernachtkultur des E. coli-Stamms O157:H7 in 2 ml-Mikrozentrifugationsröhrchen angeimpft. Die Röhrchen wurden 2 Minuten bei 16000 g zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde von jedem Röhrchen entfernt und ohne Aufwirbeln des Pellets verworfen. 200 μl Reagenz 53 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) wurden zu jedem Pellet gegeben, sodann in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten inkubiert. Die Röhrchen wurden sodann 5 Minuten bei 16000 g zentrifugiert. 70 μl der Überstandsfraktion von jedem Röhrchen wurden in ein sauberes Röhrchen pipettiert. Der TAQMAN^TM-E. coli-O157:H7-Pathogen-Nachweiskit (Applied Biosystems, Foster City, CA) wurde gemäß den Herstellerangaben verwendet, um zu bestimmen, ob bakterielle DNA in den Nahrungsmittelproben unter Verwendung eines PCR-Protokolls nachgewiesen werden konnte. Ein Thermocycling erfolgte und die sich ergebende Amplifikation wurde unter Verwendung eines ABI PRISM 7700^TM-Sequenzdetektors (Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den Herstellerangaben untersucht. Kurz gesagt wurde die Amplifikation von bakteriellen DNA-Sequenzen unter Verwendung einer ersten fluoreszierenden Sonde gemessen. Jede Amplifikationsreaktion beinhaltete auch eine interne Positivkontrolle, die eine Kontroll-DNA-Sequenz, Primer und eine zweite fluoreszierende Sonde umfasste. Die Sonden fluoreszieren bei unterschiedlichen Wellenlängen und so kann die Fluoreszenz jeder Sonde unabhängig von der anderen gemessen werden. Der Erfolg oder das Ausbleiben jeder Reaktion wurde durch die nachfolgenden Änderungen in der Menge an Fluoreszenz für jede Sonde bestimmt. Ein positives Ergebnis, was anzeigt, dass bakterielle DNA amplifiziert und in der Probe nachgewiesen wurde, wurde als eine Reaktion definiert, wobei die Fluoreszenz beider Sonden signifikant über dem Hintergrund anstieg (wie durch die Software, die von dem Hersteller des Sequenzdetektors mitgeliefert wurde, bestimmt). Ein negatives Ergebnis war dasjenige, wobei die Fluoreszenz der Bakteriensequenzsonde nicht signifikant erhöht war, aber die Fluoreszenz der inneren Kontrollsequenzsonde erhöht war. Das zeigte an, dass der extrahierten Nahrungsmittelprobe bakterielle DNA fehlte (dieses Ergebnis wurde durch eine Negativkontrollreaktion imitiert, die die Positivkontrollmatrizen-DNA aber keine bakterielle Matrizen-DNA enthielt). Ein "keine Amplifikation"-Ergebnis war dasjenige, wobei keine Sonde eine signifikant erhöhte Fluoreszenz zeigte. Folglich enthielt die extrahierte Nahrungsmittelprobe entweder einen PCR-Inhibitor oder eine Substanz, die mit der Messung der Sondenfluoreszenz interferierte (dieses Ergebnis wurde durch eine Negativkontrollreaktion imitiert, der Taq-Polymerase fehlte).
Durch Befolgen des vorstehenden Protokolls wurden positive Ergebnisse für jede getestete Probe erhalten, mit der Ausnahme des italienischen Saisongemisches, des Kakaogemisches und der Schokoladeneiscreme. Alle drei Proben des italienischen Saisongemisches und zwei der drei Proben der Schokoladeneiscreme ergaben negative Ergebnisse. Die verbleibende Probe der Schokoladeneiscreme und alle drei Proben des Kakaogemisches ergaben "keine Amplifikation"-Ergebnisse. Es wurde bemerkt, dass diese drei Proben eine deutliche Färbung aufwiesen, die mit der Messung von Fluoreszenz in den Proben interferiert haben kann. Folglich ist es möglich, dass durch Zugabe eines geeigneten Filtrationsschritts zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren positive Ergebnisse aus diesen Nahrungsmitteln auch erhalten werden könnten, obwohl dies nicht getestet wurde.
BEISPIEL 3
Extraktion und Amplifikation von bakterieller DNA unter Verwendung einer Vielzahl von Extraktionsreagenzien
Dieses Beispiel zeigt, dass eine Vielzahl von unterschiedlichen Extraktionsreagenzien in den erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich einer Vielzahl von Nahrungsmittelproben funktionieren.
Getrennte Proben wurden unter Verwendung von entweder Apfelsaft, Ei, Rinderhackfleisch oder Milch hergestellt. Um jede Probe herzustellen, wurden 25 g des geeigneten Nahrungsmittels mit 225 ml Anreicherungsmedium (z.B. modifizierter EC-Brühe) in einem Filterbeutel gemischt. Jeder Beutel wurde sodann 16 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. 0,9 ml an Anreicherungsmedium wurden von jedem Beutel entfernt und mit 0,1 ml einer Verdünnung einer Übernachtkultur von E. coli- O157:H7 derart gemischt, dass die Endkonzentration an Bakterien in der Amplifikationsreaktion, die nachstehend beschrieben ist, 350 cfu/Reaktion betrug. Die 1 ml des Anreicherungsmediums nach Animpfung wurden drei Minuten in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde entfernt und verworfen. Jedes Pellet wurde in 200 μl LL-32, LL-33, LL-34 oder LL-35 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) oder in PREPMAN^TM-Probenpräparationsreagenz (Applied Biosystems, Foster City, CA), das gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, wieder suspendiert und in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten inkubiert. Jedem Röhrchen wurde ermöglicht, auf Umgebungstemperatur 2 Minuten abzukühlen, sodann wurde es bei maximaler Geschwindigkeit 3 Minuten in einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren. 5 μl jeder Überstandsfraktion wurden zu 45 μl des PCR-Gemisches von TAQMAN^TM E. coli-O157:H7-PCR-Nachweissystem (Applied Biosystems, Foster City, CA) gegeben und auf einem Sequenznachweissystem Modell ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) untersucht, wie im Wesentlichen in Beispiel 2 beschrieben. Wie in 1 gezeigt, ergaben alle vier Reagenzien positive und nahezu identische Ergebnisse für alle vier getesteten Nahrungsmittelproben. In dem oberen Feld ist der Schwellenwertzyklus für jede Nahrungsmittelprobe angegeben, die mit dem jeweiligen getesteten Reagenz extrahiert wurde. Der Schwellenwertzyklus ist als der PCR-Amplifikationszyklus definiert, bei dem der Sequenzdetektor eine Amplifikation der bakteriellen Zielsequenz nachweist. Folglich gilt, dass je niedriger der Schwellenzyklus ist, desto empfindlicher ist der Nachweis. Für jede Kombination an Nahrungsmittelprobe und getesteten Extraktionsreagenz betrug der Schwellenwertzyklus etwa 28 bis 32. Das untere Feld zeigt die Menge an Fluoreszenz an, die durch den Detektor bei der Vervollständigung von 40 Runden einer Amplifikation gemessen wurde. Dieser Wert reichte von etwa 1,7 bis etwa 1,9.
BEISPIEL 4
Extraktion und Amplifikation von DNA von einer Vielzahl von bakteriellen Quellen
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden können, um DNA aus einer großen Vielzahl von pathogenen Bakterien in Nahrungsmittelproben zu extrahieren und nachzuweisen.
Übernachtnahrungsmittelanreicherungen unter Verwendung von Ei und Milch wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. In getrennten Experimenten wurden 0,9 ml-Aliquots jeder Anreicherung mit 0,1 ml einer seriellen Verdünnung einer Übernachtkultur von entweder E. coli, Salmonella enteritidis oder Listeria monocytogenes angeimpft. Jede angeimpfte Probe wurde drei Minuten in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und die Überstandsfraktion verworfen. Jedes Zellpellet wurde in 200 μl an Reagenz LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) wieder suspendiert, 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert und wie vorstehend zentrifugiert. Bakterielle DNA wurde auch aus seriellen Verdünnungen von homogenen Übernachtzellkulturen extrahiert und amplifiziert.
5 μl jeder DNA-Extraktion aus E. coli, S. enteritidis und L. monocytogenes wurden unter Verwendung des TAQMAN^TM-STX1-Nachweistests (Applied Biosystems, Foster City, CA), TAQMAN^TM Salmonella Gold-Nachweistests (Applied Biosystems, Foster City, CA) bzw. TAQMAN^TM Listeria monocytogenes-Nachweistests (Applied Biosystems, Foster City, CA) und eines Sequenzdetektors Modell ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA), alle gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert und nachgewiesen.
Die 2, 3 und 4 zeigen den Schwellenwertzyklus zum Nachweis von DNA von E. coli, S. enteritidis bzw. L. monocytogenes aus angeimpften Nahrungsmittelproben und aus seriellen Verdünnungen von Übernachtzellkulturen. Die Konzentration von Bakterien ist als die Anzahl von Kolonie-formenden Einheiten ("cfu") pro Amplifikationsreaktion ausgedrückt.
BEISPIEL 5
Extraktion und Visualisierung von bakterieller DNA und RNA
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, um große Mengen an DNA und RNA aus einer bakteriellen Quelle zu isolieren, und dass die Nukleinsäuren in diesen Extrakten bei Umgebungstemperatur für über eine Woche stabil sind.
1 ml einer tryptischen Sojabohnenbrühe wurde mit Listeria innocua-Zellen angeimpft und bei 37°C über Nacht mit Schütteln inkubiert. Die Standardplattenzäh lung nach zwei Tagen betrug 9,5 × 10⁸ cfu/ml. 400 μl der Kultur wurden bei 16000 g 3 Minuten zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde entfernt und verworfen. Das Zellpellet wurde in 200 μl LL-12 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) durch wiederholtes Pipettieren erneut suspendiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Umgebungstemperatur wurden Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 16000 g für 3 Minuten entfernt. 1, 5 und 10 μl-Aliquots der Überstandsfraktion wurden zusammen mit Größenmackern auf einem 1%igen FMC SEAKEM^TM-Agarosegel laufen gelassen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt. 5A. Spur 1: Hind III-Verdau von lambda-DNA (nicht erhitzt); Spur 2: 1 kB-DNA-Leiter; Spur 3: 1 μl L. innocua-Extrakt; Spur 4: 5 μl L. innocua-Extrakt; Spur 5: 10 μl L. innocua-Extrakt. Eine signifikante Menge an chromosomaler DNA und rRNA von L. innocua war in jeder Spur sichtbar, die ein Aliquot des Überstands aus der Zelllyse erhielt.
Um die Stabilität der extrahierten DNA und RNA zu bestimmen, wurde der verbleibende Anteil der Überstandsfraktion bei Umgebungstemperatur 10 Tage stehen gelassen. 1, 5 und 10 μl-Aliquots wurden wieder auf einem Gel laufen gelassen und wie vorstehend beschrieben angefärbt. 5B (selbe Spurzuordnung wie vorstehend). Obwohl ein gewisser Abbau sichtbar war, wie durch das verschmierte Auftreten einiger der Banden belegt, blieb die DNA und RNA größtenteils im Takt.
BEISPIEL 6
Nachweis von genetisch modifizierten Organismen in sojahaltigen Nahrungsmittelproben
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Identifizieren des Vorhandenseins von genetisch modifizierten Organismen ("GMO") in einer Nahrungsmittelprobe verwendet werden können.
Alle der sojahaltigen Nahrungsmittelproben, die nachstehend aufgeführt sind, wurden bei Supermärkten bezogen. Keine war als GMO-haltig markiert. 100 mg jeder Nahrungsmittelprobe wurden in 200 μl Reagenz LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) in einem Mikrozentrifugationsröhrchen suspendiert und in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten inkubiert. 1 ml 1 M TE (pH-Wert von 7,0) wurde zu jeder Suspension gegeben, die sodann bei 16000 g drei Minuten zentrifugiert wurde. DNA wurde auch aus einem Satz von käuflich erhältlichen Standards mit 0,1%, 0,5% und 2,0% GMO-Soja extrahiert. 5 μl jedes Überstands wurden entfernt und zu 20 μl PCR-Gemisch gegeben. Das PCR-Gemisch beinhaltete Primer, die zu einer DNA-Sequenz komplementär sind, die in GMO-Soja, aber nicht in nicht-modifiziertem Soja gefunden wird. Eine Amplifikation und ein Nachweis der extrahierten DNAs wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung eines Sequenzdetektors Modell ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) erreicht, der den Schwellenwertzyklus ("Ct") für jede Probe maß. Der Schwellenwertzyklus ist die Zeit während einer Amplifikation, die durch die Anzahl von durchgeführten Amplifikationszyklen gemessen wird, bei denen der Sequenzdetektor zum ersten Mal eine Zunahme über den Hintergrund des diagnostischen Fluoreszenzsignals nachweist. Der Prozentsatz von GMO, die in jeder Probe enthalten sind, wurde durch Vergleich ihres Ct-Werts zu dem Ct-Wert der GMO-Standards abgeschätzt.

Die nachstehende Tabelle führt sojahaltige Nahrungsmittelprodukte, die in diesem Beispiel getestet wurden, und deren abgeschätzten GMD-Gehalt auf.

Nahrungsmittel	% GMO	Nahrungsmittel	% GMO
Babyrezept	>5%	Proteinriegel #1	>5%
Misosuppengemisch	>5%	Proteinriegel #2	0,2%
Proteindrink	>5%	Proteinriegel #3	>5%
Sojamilch	>5%	Proteinriegel #4	>5%
		Künstliche Speck	>5%
		stücke

BEISPIEL 7
Extraktion und PCR von bakterieller DNA aus Käse
Dieses Beispiel zeigt weiter, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Extrahieren und Amplifizieren von DNA aus einer Vielzahl von Nahrungsmittelproben verwendet werden können.
In getrennten Experimenten wurden angereicherte Kulturen dadurch hergestellt, dass 10 g amerikanischer Käse, Boursinkäse, Cheddarkäse, Creme de Brie, Schweizer Käse, Ei, Rinderhackfleisch, Milch oder Salatgemisch mit 90 ml modifizierter EC-Brühe in einem Anreicherungsbeutel gemischt und eine Minute in einem STOMACHER-400^TM-Labormischer (Seward, London, England) homogenisiert wurden, wie in dem vorstehenden Beispiel 2 beschrieben. Die Homogenate wurden sodann bei 37°C 23 Stunden inkubiert. 0,9 ml-Aliquots jeder Probe wurden sodann bis zu einer Endkonzentration von 1,3 × 10⁵ cfu/ml mit einer geeignet verdünnten Übernachtkultur von E. coli-O157:H7 in einem Mikrozentrifugationsröhrchen mit Schraubverschluss angeimpft und drei Minuten in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde entfernt und verworfen. Jedes Pellet wurde in 200 μl Reagenz 60, 63 oder 66 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) wieder suspendiert und in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten inkubiert. Jedem Röhrchen wurde ermöglicht, auf Umgebungstemperatur 2 Minuten abzukühlen, sodann wurde es bei maximaler Geschwindigkeit 3 Minuten in einem Mikrozentrifugationsröhrchen zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren. 5 μl jeder Überstandsfraktion wurden zu 45 μl des PCR-Gemisches von TAQMAN^TM E. coli STX PCR-Test (Applied Biosystems, Foster City, CA) gegeben und amplifiziert und auf einem Sequenznachweissystem Modell ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) getestet, wie im Wesentlichen in Experiment 2 beschrieben.
Die meisten Nahrungsmittelproben ergaben positive Ergebnisse mit allen drei getesteten Reagenzien. Die einzige Ausnahme war Cheddarkäse, der positive Ergebnisse mit Reagenzien 60 und 66 aber nicht mit Reagenz 63 ergab.
BEISPIEL 8
Extraktion und Amplifikation von DNA aus menschlichem Blut
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus menschlichem Blut verwendet werden können und dass die extrahierten Nukleinsäuren bei Umgebungstemperatur für mindestens mehrere Tage stabil sind.
In getrennten Ergebnissen wurden 4 mm Ausstanzungen eines Stückes von FTA-Papier (Whatman BioScience, Newton, MA) angefärbt mit menschlichem Blut in ein Mikrozentrifugationsröhrchen mit 200 μl von entweder Reagenz LL-29 oder Reagenz LL-30 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) gegeben. Jedes Röhrchen wurde 10 Minuten bei entweder 100, 65, 55°C oder Umgebungstemperatur inkubiert, sodann kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. 1 μl jeder Reaktion wurde sofort als die Quelle einer Matrizen-DNA für eine Amplifikationsreaktion unter Verwendung des TAQMAN^TM-β-Actin-Nachweiskits (Applied Biosystems, Foster City, CA) und eines Sequenznachweissystems Modell ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie in dem vorstehenden Beispiel 2 beschrieben verwendet.
Positive Ergebnisse wurden für alle getesteten Proben erhalten, wie in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Es wurde auch bemerkt, dass der Schwellenwertzyklus für jede Probe im Allgemeinen mit der zunehmenden Inkubationstemperatur abnahm, was anzeigt, dass die Extraktionseffizienz proportional zur Inkubationstemperatur über den getesteten Bereich ist.

Zum Bestimmen, ob die extrahierten Nukleinsäuren Verunreinigungen enthalten, die zu einem Abbau über die Zeit führen würden, wurde jeder Extraktion ermöglicht, bei Umgebungstemperatur für eine Zeitspanne von 3 Tagen zu verbleiben, sodann wurde sie als die Quelle einer Matrizen-DNA in Amplifikationsreaktionen, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, was anzeigt, dass kein signifikanter Abbau der Matrizen-DNA auftrat, da sie zuerst extrahiert wurden. Amplifikation sofort nach Extraktion

	Inkubations			Inkubations
Reagenz	temperatur	Ct	Reagenz	temperatur	Ct
LL-29	RT	34.2	LL-30	RT	36.4
LL-29	55°C	33.5	LL-30	55°C	33.6
LL-29	65°C	31.1	LL-30	65°C	31.3
LL-29	100°C	30.1	LL-30	100°C	29.1

Amplifikation nach drei Tagen

	Inkubations			Inkubations
Reagenz	temperatur	Ct	Reagenz	temperatur	Ct
LL-29	RT	31.0	LL-30	RT	31.9
LL-29	55°C	31.2	LL-30	55°C	31.1
LL-29	65°C	29.2	LL-30	65°C	30.5
LL-29	100°C	26.9	LL-30	100°C	27.1

RT = Raumtemperatur (Umgebungstemperatur)

BEISPIEL 9
Allelunterscheidung von aus menschlichem Blut extrahierter DNA
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus kleinen Mengen von menschlichem Gewebe verwendet werden können.
Für jede getestete Blutprobe wurden 25 μl Reagenz LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) zu 1,5 μl gerinnselfreiem Vollblut in einem 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben. Jedes Röhrchen wurde verschlossen und ein kleines Loch wurde in den Deckel mit einer Spritzennadel der Größe 24 Gauge gestochen. Die Röhrchen wurden 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert, sodann wurde ihnen ermöglicht, für etwa 1,5 bis 2 Minuten abzukühlen. Die abgekühlten Proben wurden sodann bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge zentrifugiert. 1 μl des sich ergebenden Überstands wurde in einem Standard-TAQMAN^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA)-PCR-Allelunterscheidungstest verwendet, der unter Verwendung der Richtlinien optimiert wurde, die sich in der Verwenderanleitung des Sequenzdetektors Modell ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) befanden. Ein Thermozyklisieren erfolgte unter Verwendung eines GENEAMP^TM-PCR-Systems 9700. Nach der PCR wurde die 96-Well-Reaktionsplatte in den ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) überführt.
Wie in dem oberen Feld von 6 gezeigt, zeigen die Allelgruppen ein dichtes Clusterverhalten in der normalisierten Ansicht. Dies ist auch in der Farbstoffansicht zu sehen (6, unteres Feld). Ein leichtes Ausbreiten in der Allelgruppe 1 wurde auch beobachtet und als normal befunden. Insgesamt ergab der Test sehr verlässliche Ergebnisse.
BEISPIEL 10
Extraktion und Amplifikation von DNA aus menschlichem Haar
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus menschlichem Haar verwendet werden können.
0,2 M NaOH wurde zu menschlichem Haar in ein Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben und 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert. Für die ersten zwei Proben wurden 10 μl der NaOH-Präparation zu 40 μl Reagenz LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) gegeben, sodann zusätzliche 10 Minuten in dem siedenden Wasserbad inkubiert. 1 μl wurde sodann als die Quelle einer Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion verwendet. Für die zweiten zwei Proben wurden 10 μl der NaOH-Präparation auf ein FTA-Papier (Whatman BioScience, Newton, MA) gepunktet. 4 mm-Ausstanzungen wurden hergestellt und zu einem Mikrozentrifugationsröhrchen mit 100 μl LL-33 gegeben. Diese Röhrchen wurden sodann in dem siedenden Wasserbad 10 Minuten inkubiert. 1 μl wurde sodann als die Quelle einer Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion verwendet. Die PCR-Reaktionsprodukte aus allen vier Reaktionen wurden sodann auf einem Agarosegel laufen gelassen wie im Wesentlichen vorstehend beschrieben.
Die ersten zwei Reaktionen erzeugten beide ein hochgradig amplifiziertes Produkt, was das reichliche Vorhandensein von Matrizen-DNA und das Fehlen von PCR-hemmenden Substanzen anzeigt. Die zweiten zwei Proben zeigten eine schwächere und variablere Amplifikation.
BEISPIEL 11
Extraktion und Amplifikation von DNA aus Katzenblut
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus Tiergewebe verwendet werden können.
Blut, das von einer Hauskatze entnommen wurde, wurde auf FTA-Papier (Whatman BioScience, Newton, MA) gepunktet. 4 mm-Ausstanzungen des mit Blut angefärbten Papiers wurden in 1 ml-Röhrchen mit 100 μl Reagenz LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) gegeben und in ein siedendes Wasserbad 10 Minuten eingetaucht. 1 μl wurde für eine PCR in einem Reaktionsvolumen von 50 μl verwendet. Ein Teil einer jeglichen PCR-Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen, wie im Wesentlichen in Beispiel 5 beschrieben. Wie in 7, Spalten 1, 2 und 3, Spuren 2–13 und Spalten 4, 5 und 6, Spuren 2–19 von 9 gezeigt, erzeugten in nahezu allen 90 Blutproben eine Bande, die der amplifizierten Ziel-DNA-Sequenz entsprach (Spur 1 jeder Spalte ist ein Molekulargewichtsmarker). Es wird aus diesen Ergebnissen abgeschätzt, dass die Menge an amplifizierter Nukleinsäure in jeder Probe ausreichend sein würde, um als Matrizen-DNA in einer nachfolgenden DNA-Sequenzierungsreaktion zu dienen.
BEISPIEL 12
Extraktion und Amplifikation von DNA aus einem Schweineschwanz
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus einer Landwirtschaftsprobe verwendet werden können.
Zellen von Schwänzen, die von Ferkeln post partum entfernt worden waren, wurden auf FTA-Papier (Whatman BioScience, Newton, MA) geschmiert. Nukleinsäuren wurden aus 4 mm-Ausstanzungen extrahiert, wie im Wesentlichen in dem vorstehenden Beispiel 11 beschrieben. Primer wurden derart ausgewählt, dass sie spezifisch ein Gen amplifizieren, das in Schweinen mit der Wurfgröße assoziiert ist. Jede Amplifikationsreaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen und angefärbt, wie im Wesentlichen in dem vorstehenden Beispiel 5 beschrieben. Etwa 60 der ge testeten 90 Proben ergaben nachweisbare Amplifikationsprodukte. Die anderen 30 ergaben entweder keine Bande oder eine "Primerdimer"-Bande, die etwas kleiner als die gewünschte Ampliconbande war. Die Erfolgsquote wurde auf 90 von 90 erhöht, wenn das TAQMAN^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) PCR-System verwendet wurde, wie im Wesentlichen in Beispiel 2 beschrieben.
BEISPIEL 13
Extraktion und Amplifikation von DNA aus einem Kochsalzmundwasser
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus kleinen Mengen an menschlichem Gewebe verwendet werden können.
In getrennten Experimenten spülten drei menschliche Probanden ihre Münder mit einem Salzmundwasser. 1 ml jedes Mundwassers, das nach Spülung wieder gewonnen wurde, wurde eine Minute zentrifugiert. Jedes Pellet wurde in 200 μl LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) wieder suspendiert und 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert. Für jede extrahierte DNA-Probe wurde eine Reihe von 50 μl-PCR-Reaktionen mit 1, 3, 5, 7 und 10 μl der extrahierten Probe als der Quelle einer Matrizen-DNA aufgestellt. Primer wurden ausgewählt, um eine Amplifikation des AluPV92-Lokus zu ermöglichen, der Allelgrößen von 550 und 850 bp aufweist. Jede PCR-Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen und angefärbt, wie im Wesentlichen in dem vorstehenden Beispiel 5 beschrieben. Banden der erwarteten Größen wurden für jede PCR-Reaktion beobachtet, was anzeigt, dass PCR-amplifizierbare DNA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen sogar aus Spurenmengen von menschlichem Gewebe isoliert werden kann.
BEISPIEL 14
Extraktion und Amplifikation von DNA aus kultivierten Bakterien
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zum Isolieren von Nukleinsäuren aus einem großen Bereich von prokaryotischen Organismen verwendet werden können.

Jede der nachstehenden 21 Spezies von Bakterien wurden als Kolonien auf Agarplatten mit einem geeigneten Wachstumsmedium wachsen gelassen:

MCC#	Familie	Gattung	Art	Unterart
600	Lactobacillaceae	Lactobacillus	casei
812	Corynebacteriace	Corynebacterium	variabile
958	Nocardiodaceae	Nocardia	asteroides
1852	Xanthomonadace	Stenotrophomonas	maltophilia
2106	Bacillaceae	Bacillus	coagulans
2107	Staphylococcacea	Staphylococcus	epidermidis
2204	Nocardioidaceae	Rhodococcus	equi
2263	Streptococcaceae	Streptococcus	agalactiae
2633	Pseudomonadac	Pseudomonas	aeruginosa
3322	Moraxellaceae	Acinetobacter	calcoaceticus
3385	Propionibacteriac	Propioinibacterium	acnes
3386	Clostridiaceae	Clostridium	difficile
3420	Fusobacteriaceae	Fusobacterium	necrophorum	necrophorum
3485	Enterobacteriace	Escherichia	coli
3555	B. Cereus	Bacillus	cereus
3591	Staphylococcacea	Staphylococcus	aureus	aureus
3598	Burkholderiaceae	Burkholderia	cepacia
3725	Comamonadace	Delftia	acidovorans
4538	Streptomycetacea	Streptomyces	rimosus	rimosus
4557	Gordaniaceae	Gordonia	sputi
4597	Legionellaceae	Legionella	anisa

In getrennten Experimenten wurde ein Viertel bis die Hälfte einer Öse von Zellen von einer einzelnen Kolonie jedes Bakteriums in 200 μl LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) in ein Mikrozentrifugationsröhrchen suspendiert. Die Suspension wurde 10 Sekunden oder, bis die gesamte Zellmasse suspendiert war, unter Verwendung eines VORTEX^TM-Labormischers gemischt. Jede Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad 10 Minuten inkubiert, sodann bei 16000 g 2 Minuten zentrifugiert.
Eine PCR-Optimierung erfolgte auf alle Stämme unter Verwendung des PCR-Moduls des MICROSEQ^TM 500 16S rDNA-bakteriellen Sequenzierkits (Applied Biosystems, Foster City, CA). Für jede Extraktion erfolgten PCR-Reaktionen unter Verwendung von 2 μl, 1 μl, 0,1 μl und 0,02 μl der Extraktionsüberstandsfraktion (die 0,1 μl- und 0,02 μl-Volumina wurden unter Verwendung serieller Verdünnungen jeder Extraktionsüberstandsfraktion erhalten). Positive Ergebnisse, wie unter Verwendung eines Agarosegels bestimmt, das wie im Wesentlichen vorstehend beschrieben wurde, wurden für jeden Stamm eines Bakteriums für alle vier Mengen der getesteten Überstandsfraktion erhalten. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung von 1 μl der Überstandsfraktion erhalten.
Eine PCR-Optimierung wurde sodann auf alle Stämme unter Verwendung des PCR-Moduls des MICROSEQ^TM-Vollgens 16S rDNA-bakteriellen Sequenzierungskits (Applied Biosystems, Foster City, CA), wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass lediglich 2 μl- und 1 μl-Volumina der Extraktionsüberstandsfraktion verwendet wurden. Jede Amplifikation war erfolgreich, mit der Ausnahme von Stamm 4557, der mit keinem Volumen an Extraktionsüberstandsfraktion erfolgreich amplifiziert wurde (obwohl schwache Banden auf dem Gel sichtbar waren). Für die verbleibenden Stämme ergab 1 μl der Extraktionsüberstandsfraktion bessere Ergebnisse als 2 μl.
BEISPIEL 15
Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Extraktionseffizienz
Dieses Beispiel zeigt, dass ein großer Bereich von Inkubationstemperaturen zum Durchführen der Erfindung verwendet werden kann.
In getrennten Experimenten wurden Ei- und Rinderhackfleischanreicherungen wie in dem vorstehenden Beispiel 3 beschrieben hergestellt. 0,9 ml-Aliquots jeder Anreicherung wurden mit 0,1 ml einer geeignet verdünnten Übernachtkultur von E. coli versetzt, um eine Konzentration an Bakterien in den beschriebenen Amplifikationsreaktionen zu ergeben, die unterhalb von 335 cfu/Reaktion lag. Jede 1 ml angeimpfte Anreicherungskultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und die Überstandsfraktion wurde verworfen. Die Zellpellets wurden in 200 μl Reagenz LL-33 (in dem vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) wieder suspendiert. Jedes wieder suspendierte Zellpellet wurde bei 21, 37, 60, 70, 80, 90 oder 100°C inkubiert.
Nach Zentrifugation wurden die Lysate unter Verwendung des TAQMAN^TM E. coli O157:H7-Nachweistestkits (Applied Biosciences, Foster City, CA) und des ABI PRISM 7700^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA) analysiert, wie im Wesentlichen in Beispiel 3 beschrieben.
Wie in 8 gezeigt, war jede Amplifikation erfolgreich (d.h. jede Amplifikation wies einen Schwellenwertzyklus von weniger als 40 auf). Jedoch wurde bemerkt, dass die niedrigeren getesteten Temperaturen (21 und 37°C) eine Extraktionseffizienz aufwiesen, die niedriger als diejenige war, die unter Verwendung der höheren Inkubationstemperaturen erreicht wurde.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure für eine anschließende Manipulation, umfassend ein In-Kontakt-Bringen einer Probe, die in Verdacht steht, die Nukleinsäure zu enthalten, mit einem wässrigen Nukleinsäureextraktionsreagenz, wobei das Nukleinsäureextraktionsreagenz etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 18 Gew.-% Natriummetasilicat und etwa 0,05 Gew.-% bis 80 Gew.-% eines wasserlöslichen substituierten Ethers mit insgesamt 2 bis 12 Kohlenstoffatomen umfasst und einen pH-Wert in dem Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 10 aufweist.
Verfahren zum Isolieren an Nukleinsäure aus einer Probe, umfassend die Schritte: In-Kontakt-Bringen einer Probe, die in Verdacht steht, eine Nukleinsäure zu beinhalten, mit einem wässrigen Nukleinsäureextraktionsmittel, und Wiederherstellen der Nukleinsäure, wobei das Nukleinsäureextraktionsreagenz etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 18 Gew.-% Natriummetasilicat und etwa 0,05 Gew.-% bis 80 Gew.-% eines wasserlöslichen substituierten Ethers mit insgesamt 2 bis 12 Kohlenstoffatomen aufweist und einen pH-Wert in dem Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 10 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Probe eine Zelle oder ein Virus umfasst und die Probe mit dem wässrigen Nukleinsäureextraktionsreagenz für eine Zeitspanne in Kontakt gebracht wird, die ausreicht, um die Zelle oder das Virus zu lysieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der wasserlösliche substituierte Ether ein Alkoxyalkylalkohol, ein Aryloxyalkohol oder ein Alkoxyarylalkohol ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der wasserlösliche substituierte Ether die Formel CH₃(CH₂)_m-O-(CH₂)_nCH₂-OH aufweist, worin m und n unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 6 sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der substituierte Ether ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus 2-Butoxyethanol, 2-Methoxyethanol, 2-Phenoxyethanol, Diethylenglykolmonoethylether, Diethylenglykolmonobutylether, Diethylenglykoldibutylether, 2-Butoxyethanol, Diethylenglykol-Monopentylether, Diethylenglykol-Diethylether, Ethylenglykol-Monomethylether, Ethylenglykol-Monoethylether, Ethylenglykol-Monobutylether, Ethylenglykol-Dimethylether und Ethylenglykol-Diethylether.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Verhältnis von Natriummetasilicat zu Substituierten etwa 1:1,1 bis etwa 1:1,5 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Verhältnis 1:1,3 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der pH-Wert des Extraktionsmittels etwa pH 8 bis pH 9 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Kontaktierungsschritt bei einer Temperatur von etwa 25°C bis etwa 120°C erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Kontaktierungsschritt für eine Zeitspanne von etwa 5 Minuten bis etwa 30 Minuten erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe eine Nahrungsmittelprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe eine klinische Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe eine forensische Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe eine Landwirtschaftsprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe eine Umweltprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe ein Mikroorganismus ist, der in Kultur wachsen gelassen wurde.
Wässriges Nukleinextraktionsreagenz, umfassend: mehr als 0,8 Gew.-% bis weniger als 5 Gew.-% an Natriummetasilicat; mehr als 1 Gew.-% bis weniger als 5 Gew.-% eines wasserlöslichen substituierten Ethers und das einen pH-Wert im Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 10 aufweist, wobei der Ether ausgewählt wird, aus der Gruppe, bestehend aus einem Alkoxyalkylalkohol, einem Aryloxyalkylalkohol und einem Alkoxyarylalkohol mit insgesamt 2 bis 12 Kohlenstoffatomen.
Nukleinsäureextraktionsreagenz nach Anspruch 18, wobei der Ether ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus 2-Butoxyethanol, 2-Methoxyethanol, 2-Phenoxyethanol, Diethylglykolmonoethylether, Diethylenglykolmonobutylether, Diethylenglykoldibutylether, 2-Butoxyethanol, Diethylenglykol-Monopentylether, Ethylenglykol-Diethylether, Ethylenglykol-Monomethylether, Ethylenglykol-Monoethylether, Ethylenglykol-Monobutylether, Ethylenglykol-Dimethylether und Ethylenglykol-Diethylether.
Nukleinsäureextraktionsreagenz nach Anspruch 18, das ferner Zitronensäure umfasst.
Nukleinsäureextraktionsmittel nach Anspruch 18, das ferner einen Puffer umfasst.
Nukleinsäureextraktionsreagens nach Anspruch 18, das ferner einen Chelator umfasst.
Nukleinsäureextraktionsreagens nach Anspruch 18, das ferner ein Konservierungsmittel umfasst.
Nukleinsäureextraktionsmittel nach Anspruch 18, das ferner einen Stabilisator umfasst.
Nukleinsäureextraktionsreagens nach Anspruch 18, wobei das Verhältnis des Gewichtprozentsatzes an Natriummetasilicat zu dem Gewichtsprozentsatz an Ether etwa 1:1,3 beträgt.
Kit, der ein Nukleinsäureextraktionsreagenz und einen PCR-Primer umfasst, wobei das Nukleinsäureextraktionsreagenz etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 18 Gew.-% Natriummetasilicat und etwa 0,05 Gew.-% bis 80 Gew.-% eines wasserlöslichen substituierten Ethers mit insgesamt 2 bis 12 Kohlenstoffatomen umfasst und einen pH-Wert in dem Bereich von etwa pH 7 bis etwa pH 10 aufweist.