DE60128900T2

DE60128900T2 - Massenmarker

Info

Publication number: DE60128900T2
Application number: DE60128900T
Authority: DE
Inventors: Gunter Schmidt; Andrew Hugin Thompson; Robert Alexander Walker Johnstone
Original assignee: Electrophoretics Ltd
Current assignee: Electrophoretics Ltd
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2021-03-15
Also published as: AU2001240834B2; CN102839213A; US20030194717A1; JP4608171B2; ES2389510T3; WO2001068664A3; JP2003529059A; PT1275004E; ATE364841T1; IL151732A0; CN1427953A; EP1806586B1; US7825069B2; CA2403114A1; EP1806586A1; EP1275004B1; GB0006141D0; NO330733B1; US7294456B2; WO2001068664A2

Description

Diese Erfindung betrifft nützliche Verbindungen zur Markierung von Analyten, insbesondere Biomolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteinen. Speziell betrifft diese Erfindung Analyseverfahren anhand von Massenspektrometrie unter Verwendung spezifischer Massenmarker.
Es sind verschiedene Methoden zur Markierung von interessierenden Molekülen in der Technik bekannt, einschließlich radioaktiver Atome, Fluoreszenzfarbstoffen, Lumineszenz-Reagenzien, Elektroneneinfangreagenzien und Licht absorbierender Farbstoffe. Jedes dieser Markierungssysteme hat Merkmale, die es für gewisse Anwendungen und nicht für andere geeignet machen. Aus Sicherheitsgründen hat das Interesse an nicht-radioaktiven Markierungssystemen zu der weit verbreiteten kommerziellen Entwicklung von Fluoreszenz-Markierungsschemata insbesondere für die genetische Analyse geführt. Fluoreszenz-Markierungsschemata ermöglichen die Markierung einer relativ kleinen Zahl von Molekülen gleichzeitig, typisch können vier und möglicherweise bis zu acht Marker gleichzeitig verwendet werden. Jedoch begrenzen die Kosten der Nachweisapparatur und die Schwierigkeiten der Analyse der resultierenden Signale die Zahl der Marker, die gleichzeitig in einem Fluoreszenznachweisschema verwendet werden können.
In jüngerer Zeit gab auf dem Gebiet der Massenspektrometrie eine Entwicklung im Hinblick auf eine Methode des Nachweises von Markern, die spaltbar an ihrem zugehörigen interessierenden Molekül angebracht sind. In vielen molekularbiologischen Anwendungen muss man in der Lage sein, die interessierenden Moleküle vor der Analyse aufzutrennen. Im Allgemeinen werden Flüssigphasen-Auftrennungen durchgeführt. Massenspektrometrie hat in den letzten Jahren eine Anzahl von Schnittstellen für Flüssigphasen-Huftrennungen entwickelt, welche die Massenspektrometrie als Nachweissystem für diese Arten von Anwendungen besonders wirksam machen. Bis vor Kurzem wurde Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie verwendet, um Analytenionen oder deren Fragmentionen direkt nachzuweisen. Jedoch kann bei vielen Anwendungen, wie z.B. der Nukleinsäure-Analyse, die Struktur des Analyten aus einer indirekten Markierung bestimmt werden. Dies ist insbesondere mit Bezug auf die Verwendung von Massenspektrometrie vorteilhaft, da komplexe Biomoleküle, wie DNA, komplexe Massenspektren aufweisen und mit relativ schlechter Empfindlichkeit nachgewiesen werden. Ein indirekter Nachweis bedeutet, dass ein zugehöriges Markermolekül verwendet werden kann, um den ursprünglichen Analyten zu identifizieren, wobei der Marker für einen empfindlichen Nachweis ausgelegt ist und ein einfaches Massenspektrum besitzt. Einfache Massenspektren ermöglichen, dass mehrere Marker verwendet werden können, um eine Mehrzahl von Analyten gleichzeitig zu analysieren.
Die WO 98/31830 beschreibt Matrizes von Nukleinsäure-Sonden, die kovalent an abspaltbare Marker geknüpft sind, welche durch Massenspektrometrie nachweisbar sind und die Sequenz der kovalent verknüpften Nukleinsäure-Sonde identifizieren. Die markierten Sonden dieser Anmeldung weisen die Struktur Nu-L-M auf, worin Nu eine Nukleinsäure ist, die kovalent mit L, einem spaltbaren Linker, verknüpft ist, welcher kovalent mit M, einem Massenmarker, verknüpft ist. Bevorzugte spaltbare Linker in dieser Anmeldung werden in der Ionenquelle des Massenspektrometers gespalten. Bevorzugte Massenmarker sind substituierte Polyarylether. Diese Anmeldung offenbart eine Vielfalt von Ionisationsmethoden und die Analyse durch Quadrupol-Massenanalysatoren, Flugzeit (TOF)-Analysatoren und Magnetsektor-Instrumenten als spezielle Verfahren zur Analyse von Massenmarkern mittels Massenspektrometrie.
Die WO 98/15652 offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäure, insbesondere DNA. Das Verfahren beinhaltet die Spaltung von Nukleinsäuren unter Bildung von Fragmenten mit zweideutigen klebrigen Enden. Diese Fragmente werden unter Verwendung von Bibliotheken von Adaptern eingefangen. Zweideutige klebrige Enden mit vier Basenpaaren sind bevorzugt, und Populationen von 256 Adaptern, die jede mögliche Vierbasen-Sequenz umfassen, werden bevorzugt verwendet. Es ist auch offenbart, dass die Adapter unter Verwendung von Massenmarkierung derart, dass abspaltbare Massenmarker an den Adaptern angebracht sind, nachgewiesen werden können.
Die WO 99/02728 offenbart Verfahren zur Charakterisierung von DNA insbesondere zum Erhalt von Sequenzinformation. Das Verfahren wird betrieben, indem eine Population von DNA-Fragmenten bereitgestellt wird, welche abspaltbar an den Massenmarkern angebracht sind. Die Fragmente werden in einem Massenspektrometer unter Freisetzung des Massenmarkers gespalten, der durch Massenspektrometrie bestimmt wird. Amin-Verknüpfungen können in diesem Verfahren verwendet werden.
Die PCT/GB94/01675 offenbart Liganden und speziell Nukleinsäuren, die abspaltbar an Massenmarker-Moleküle geknüpft sind. Bevorzugte spaltbare Linker sind photospaltbar. Diese Anmeldung offenbart Matrix-assistierte Laserdesorptionsionisation (MAIDI)-TOF-Massenspektrometrie als spezielles Verfahren zur Analyse von Massenmarkern mittels Massenspektrometrie.
Die PCT/US97/22639 offenbart freisetzbare nicht-flüchtige Massenmarker-Moleküle. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen diese Marker Polymere, typisch Biopolymere, die abspaltbar an einer reaktiven Gruppe oder einem reaktiven Liganden, d.h. einer Sonde, angebracht sind. Bevorzugte spaltbare Linker scheinen chemisch oder enzymatisch spaltbar zu sein. Diese Anmeldung offenbart MALDI-TOF-Massenspektrometrie als spezielles Verfahren zur Analyse von Massenmarkern mittels Massenspektrometrie.
Die PCT/US97/01070 , PCT/US97/01046 und PCT/US97/01304 offenbaren Liganden und speziell Nukleinsäuren, die abspaltbar an Massenmarkierungs-Moleküle geknüpft sind. Bevorzugte abspaltbare Linker scheinen chemisch oder photospaltbar zu sein. Diese Anmeldungen offenbaren eine Vielfalt von Ionisationsmethoden und eine Analyse durch Quadrupol-Massenanalysatoren, TOF-Analysatoren und Magnetsektor-Instrumente als spezielle Verfahren der Analyse von Massenmarkern mittels Massenspektrometrie.
Die WO 99/32501 offenbart eine Gruppe von acht Markern zur Charakterisierung von Nukleinsäuren. Die Marker weisen jeweils eine verschiedene Masse auf und umfassen Massenmarker derselben Masse, die abspaltbar an variable Aryl-Einheiten geknüpft sind.
Die WO 99/14362 offenbart ein Verfahren zur Analyse einer Population von Nukleinsäure-Fragmenten. Das Verfahren betrifft insbesondere die Sanger-Sequenzierung unter Verwendung einer Matrix von Massenmarkern, die abspaltbar an eine Nukleinsäure-Base geknüpft sind. Die Massenmarker sind für die einzelnen Nukleotide spezifisch, an welchen sie angebracht sind.
Die Massenspektren, die mit einem Analytenmaterial erzeugt werden, sind gegenüber Verunreinigungen sehr empfindlich. Im Wesentlichen kann jedes Material, das in das Massenspektrometer eingeführt wird und ionisieren kann, im Massenspektrum auftreten. Dies bedeutet, dass es bei vielen Analysen erforderlich ist, den Analyten vor der Einführung in das Massenspektrometer sorgfältig zu reinigen. Für die Zwecke eines Hochdurchsatz-Systems für die indirekte Analyse von Analyten anhand von Massenmarkern wäre es wünschenswert, alle unnötigen Proben-Präparationsschritte zu vermeiden. Das heißt, es wäre wünschenswert, die Marker vor einem Hintergrund von kontaminierendem Material nachzuweisen und sicher zu sein, dass der Peak, der nachgewiesen wird, in der Tat einem Marker entspricht. Der Stand der Technik offenbart keine Verfahren oder Zusammensetzungen, welche das Signal-Rausch-Verhältnis, das in auf Massenspektrometrie basierenden Nachweissystemen erzielbar ist, verbessern können oder welche die Bestätigung liefern, dass ein Massen-Peak in einem Spektrum durch die Anwesenheit eines Massenmarkers verursacht wurde.
Für die Zwecke des Nachweises von Analyten nach Flüssigkeitschromatographie oder elektrophoretischen Auftrennungen ist es wünschenswert, dass die verwendeten Marker das Auftrennungsverfahren minimal stören. Wenn eine Matrix derartiger Marker verwendet wird, ist es wünschenswert, dass die Auswirkung jedes Mitglieds der Matrix auf seinen zugehörigen Analyten die gleiche wie die aller anderen Marker ist. Dies steht in einem gewissen Ausmaß mit der Absicht der Massenmarkierung in Konflikt, welche darin besteht, Matrizes von Markern zu erzeugen, die im Massenspektrometer auf der Grundlage ihrer Masse aufgelöst werden können. Massenmarker sollten vorzugsweise durch 4 Dalton getrennt sein, um eine Störung von Isotopen-Peaks eines Markers durch diejenigen eines anderen Markers zu verhindern. Dies bedeutet, dass die Erzeugung von 250 unterschiedlichen Massenmarkern Marker erfordern würde, die über einen Bereich von 1000 Dalton und wahrscheinlich mehr verteilt wären, da es nicht trivial ist, große Matrizes von Markern zu erzeugen, die genau durch 4 Dalton voneinander getrennt sind. Dieser Massenbereich hat nahezu sicher Massenmarker zum Egebnis, die eine deutliche Auswirkung auf jedes Trennungsverfahren aufweisen, welches dem Nachweis durch Massenspektrometrie vorangeht. Dies hat auch Auswirkungen auf die Konstruktion des Instruments zur Folge, da die Kosten des Instruments zunehmen, wenn der Massenbereich zunimmt, über den ein Massenspektrometer Ionen nachweisen kann.
Es ist demgemäß ein Ziel dieser Erfindung, die Probleme zu lösen, die mit dem obigen Stand der Technik verbunden sind, und Massenmarker bereitzustellen, die vor einem kontaminierten Hintergrund nachgewiesen werden können und deren Identität als Massenmarker bestätigt werden kann. Weiter ist es ein Ziel dieser Erfindung, Matrizes von Markern bereitzustellen, die in einem komprimierten Massenbereich aufgelöst werden können, damit die Marker die Auftrennungsverfahren nicht so stark stören, und die leicht in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, welches Ionen über einen begrenzten Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen nachweist.
Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, Verfahren zur Analyse von Biomolekülen bereitzustellen, welche die Marker dieser Erfindung ausnutzen, um den Durchsatz, die Signal-Rausch-Verhältnisse und die Empfindlichkeit derartiger Assays zu maximieren, insbesondere bei der genetischen Analyse und spezieller der zweidimensionalen Gelelektrophorese, die zur Analyse von Proteinen verwendet wird.
Weiter ermöglicht die nachstehend offenbarte Konstruktion der Massenmarker, dass ein vereinfachtes Tandem-Massenspektrometer für die Zwecke des Nachweises der Massenmarker gebaut werden kann. Der erste Massenanalysator muss nur eine begrenzte Zahl von Ionen selektieren, deren Masse relativ niedrig ist. Der zweite Massenanalysator muss nur eine kleine Zahl von Fragmentierungsprodukten nachweisen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen Satz von zwei oder mehr Massenmarkern bereit, wie in Anspruch 1 definiert. Jeder Marker in dem Satz umfasst eine Massenmarkierungseinheit, die über einen spaltbaren Linker an eine Massennormierungseinheit geknüpft ist, wobei die Massenmarkierungseinheit gegen eine Fragmentierung beständig ist, wobei die aggregierte Masse jedes Markers in dem Satz dieselbe ist und die Masse der Massenmarkierungseinheit jedes Markers in dem Satz verschieden ist und wobei jeder Marker eine Massenmarkierungseinheit aufweist, deren Masse von jener aller anderen Massenmarkierungseinheiten in der Gruppe verschieden ist, so dass alle Massenmarker in dem Satz durch Massenspektrometrie voneinander unterschieden werden können.
Der Ausdruck Massenmarkierungseinheit, der im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, soll eine Einheit bezeichnen, die durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden soll, während der Ausdruck Massennormierungseinheit, der im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, eine Einheit bezeichnen soll, die nicht notwendigerweise durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden soll, die aber vorliegt, um sicherzustellen, dass ein Massenmarker eine gewünschte aggregierte Masse aufweist. Die Zahl der Marker in dem Satz ist nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass der Satz eine Mehrzahl von Markern umfasst. Jedoch wird es bevorzugt, dass der Satz zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr Marker umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Matrix (ein Array) von Massenmarkern bereit, welche zwei oder mehr Sätze von wie oben definierten Massenmarkern umfasst, wobei die aggregierte Masse jedes der Massenmarker in irgendeinem Satz von der aggregierten Masse jedes der Massenmarker in jedem anderen Satz in der Matrix verschieden ist.
Weiter wird von der Erfindung ein Analyseverfahren bereitgestellt, wobei das Verfahren den Nachweis eines Analyten durch Identifikation eines Massenmarkers oder einer Kombination von Massenmarkern, der bzw. die für den Analyten einzigartig ist, durch Massenspektrometrie umfasst, wobei der Massenmarker ein Massenmarker aus einem wie oben definierten Satz von Massenmarkern ist.
Die Erfindung wird nur durch den Bereich der beigefügten Ansprüche definiert. Jeder Satz von Markern, der nicht in den Bereich von Anspruch 1 fällt, wird hierin lediglich für Informationszwecke beschrieben.
Die Erfindung wird nun in weiterer Einzelheit lediglich mittels Beispiels mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 einen schematischen Aufbau eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers zeigt;
2 zehn Fragmente zeigt, die fünf Massennormierungseinheiten (M₀-M₄) und fünf Massenmarkierungseinheiten (X₀-X₄) zur Bildung eines Satzes von Markern gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, in denen Fluoratom-Substituenten als Masseneinstellungseinheiten verwendet werden;
3 einen Satz von fünf Markern gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, die aus den Massennormierungseinheiten und Massenmarkierungseinheiten von 2 gebildet sind;
4 einen Satz von fünf Massenmarkern gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, in dem alle Marker eine verschiedene Masse aufweisen, in dem aber alle Massenmarker des Satzes dieselbe Masse aufweisen;
5 ein Beispiel für die Markierung eines Analyten, wie eines Oligonukleotids, mit einer Kombination von Massenmarkern zeigt, der Art, dass die Massenmarkerkombination ein einzigartiges Massenspektrum aufweist, das den Analyten identifiziert;
6 eine Matrix von Sätzen von Massenmarkern zeigt, wobei jeder Satz die gleiche Massenreihen-modifizierende Gruppe (S) aufweist und von allen anderen Sätzen aufgrund der Zahl der Fluor-Substituenten an der Basis-Phenylgruppe verschieden ist;
7 eine Matrix von Sätzen von Massenmarkern zeigt, wobei jeder Satz die gleiche Massenreihen-modifizierende Gruppe (S) aufweist und von allen anderen Sätzen aufgrund von Phenylether-Einheiten in der Massenreihen-modifizierenden Gruppe verschieden ist;
8 die „Mischungsmodus"-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, welche vier der acht möglichen einzigartigen Massenspektren aller Kombinationen der drei Massenmarker P, Q und R zeigt, wenn diese in relativen Mengen von 0 oder 1 vorliegen.
9 die „Mischungsmodus"-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, die acht von 243 möglichen einzigartigen Massenspektren für alle Kombinationen der drei Massenmarker P, Q, R, S und T zeigt, wenn sie in relativen Mengen von 0, 1 oder 2 vorliegen (es gibt 81 mögliche Spektren, wenn T als interner Standard konstant bleibt);
10 zeigt, wie größere Sätze von Markern durch Vergrößerung der Massennormierungs- und Massenmarkierungseinheit gebildet werden können, um einen größeren Bereich der Substitution zu ermöglichen – dieser Satz von Markern weist neun Mitglieder auf und verwendet Fluoratom-Substituenten als Masseneinstellungseinheiten – wobei ein Satz von Markern mindestens acht Mitglieder aufweist, wie es für die Markierung einer 256 4-mere in einer Matrix von Oligonukleotiden unter Verwendung des Mischungsmodus der vorliegenden Erfindung zweckmäßig ist;
11 das Massenspektrum 1 zeigt, welches ein vollständiges Spektrum ist, welches Peaks aller Ionen A⁺, B⁺, C⁺ und D⁺ umfasst;
12 das Massenspektrum 2 zeigt, welches ein Massenspektrum von A+ allein ist und durch Selektion von A⁺-Ionen in einem ersten Quadrupol des Spektrometers (Q1) erzeugt wurde;
13 das Massenspektrum 3 zeigt, welches ein Spektrum eines ersten Ions A₁ ⁺ (desselben Masse/Ladung-Verhältnisses wie A⁺) und von Fragmentierungsprodukten von A₁ ⁺, P⁺ und Q⁺ ist;
14 das Massenspektrum 4 zeigt, welches ein Spektrum eines zweiten Ions A₂ ⁺ (desselben Masse/Ladung-Verhältnisses wie A⁺) und von Fragmentierungsprodukten von A₂ ⁺, X⁺ und Y⁺ ist;
15 das Massenspektrum 5 zeigt, welches ein Spektrum ist, das durch Selektion von A⁺-Ionen gebildet ist, wenn zwei Arten derartiger Ionen, A₁ ⁺ und A₂ ⁺, vorhanden sind;
16 das Massenspektrum 6 zeigt, welches ein Spektrum ist, das in einem Triele-Quadrupol-Spektrometer durch Selektion von A⁺-Ionen in Q1, wenn zwei Arten derartiger Ionen vorhanden sind (A₁ ⁺ und A₂ ⁺), die die Dissoziation der selektierten Ionen durch Kollision in Q2 induzieren, und durch Selektion eines bekannten Kollisionsprodukts von A₁ ⁺ (P⁺) in Q3 gebildet ist – ein derartiges Verfahren ermöglicht die Auftrennung von A₁ ⁺ und A₂ ⁺;
17 das Massenspektrum 7 zeigt, welches ein zweidimensionales Spektrum eines Satzes von fünf Massenmarkern gemäß der vorliegenden Erfindung ist, in dem eine Masse MX in Q1 selektiert wird (erste Dimension) und fünf unterschiedliche Massen X₀, X₁, X₂, X₃ und X₄ in Q3 selektiert werden (zweite Dimension);
18 das Massenspektrum 8 zeigt, welches ein zweidimensionales Spektrum eines Satzes von vier Massenmarkern gemäß der vorliegenden Erfindung ist, in dem vier unterschiedliche Massen, M₀X₀, M₁X₀, M₂X₀, und M₃X₀, in Q1 selektiert werden (erste Dimension) und eine einzige Masse M₀ in Q3 selektiert wird (zweite Dimension);
19 das Massenspektrum 9 zeigt, welches ein zweidimensionales Spektrum eines Satzes von Massenmarkern ist, der Marker umfasst, die aus allen Kombinationen von M₀-M₃ mit X₀-X₃ gebildet sind, wobei sieben unterschiedliche Massen in Q1 selektiert werden (erste Dimension) und vier unterschiedliche Massen X₀-X₃ in Q3 selektiert werden (zweite Dimension);
20 ein Schema eines typischen Spaltungsprozesses zeigt, der die Massenmarker der vorliegenden Erfindung verwendet und diese von ihren Analyten thermisch oder unter Verwendung von Elektrospray-Ionisation abspaltet;
21 ein Schema der Selektionsverfahren in der zweidimensionalen Massenspektrometrie unter Verwendung eines Satzes von fünf Massenmarkern gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
22 deuterierte Massenmarker gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
23 weitere deuterierte Massenmarker gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt; und
24 ein theoretisches Spektrum von zwei Proben eines Peptids mit der Sequenz H₂N-Gly-Leu-Ala-Ser-Glu-COOH zeigt, wobei jede Probe an einem der Marker mit den in 23 gezeigten Formeln angebracht ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Satz von wie oben definierten Massenmarkern bereit, in dem jeder Marker in dem Satz eine Massenmarkierungseinheit mit einer gemeinsamen Masse aufweist und jeder Marker in dem Satz eine einzigartige aggregierte Masse aufweist. Ein Beispiel für einen Satz von Markern dieser ersten Art ist in 4 angegeben.
In einer alternativen, bevorzugteren Ausführungsform weist jeder Marker in dem Satz eine gemeinsame aggregierte Masse auf und weist jeder Marker in dem Satz eine Massenmarkierungseinheit mit einer einzigartigen Masse auf. Ein Beispiel für einen Satz von Markern dieser zweiten Art ist in 3 angegeben.
Der Satz von Markern muss nicht auf die oben beschriebenen zwei bevorzugten Ausführungsformen beschränkt sein und kann z.B. Marker beider Arten umfassen, vorausgesetzt, dass alle Marker durch Massenspektrometrie unterscheidbar sind, wie oben umrissen.
Es wird bevorzugt, dass in einem Satz von Markern der zweiten Art jede Massenmarkierungseinheit in dem Satz eine gemeinsame Grundstruktur aufweist und jede Massennormierungseinheit in dem Satz eine gemeinsame Grundstruktur aufweist und jeder Massenmarker in dem Satz eine oder mehrere Masseneinstellungseinheiten umfasst, wobei die Masseneinstellungseinheiten an der Grundstruktur der Massenmarkierungseinheit und/oder der Grundstruktur der Massennormierungseinheit angebracht sind oder darin vorliegen. In dieser Ausführungsform umfasst jede Massenmarkierungseinheit in dem Satz eine unterschiedliche Zahl von Masseneinstellungseinheiten und weist jeder Massenmarker in dem Satz die gleiche Zahl von Masseneinstellungseinheiten auf.
In dieser ganzen Beschreibung ist mit gemeinsame Grundstruktur gemeint, dass zwei oder mehr Einheiten sich eine Struktur teilen, welche im Wesentlichen das gleiche Strukturskelett, Rückgrat oder den gleichen Kern aufweisen Dieses Skelett oder Rückgrat kann z.B. eine Vinylether-Einheit sein. Das Skelett oder Rückgrat kann Substituenten, die seitenständig zu ihm vorliegen, oder Atom- oder Isotopen-Substitutionen innerhalb desselben umfassen, ohne die gemeinsame Grundstruktur zu ändern.
Typisch umfasst ein Satz von Massenmarkern der zweiten Art, auf die oben Bezug genommen wurde, Massenmarker mit der Formel: M(A)_y-L-X(A)_z in der M die Massennormierungseinheit ist, X die Massenmarkierungseinheit ist, A eine Masseneinstellungseinheit ist, L ein spaltbarer Linker ist, y und z ganze Zahlen von 0 oder größer sind und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist. Bevorzugt ist M eine gegen Fragmentierung beständige Gruppe, ist L ein Linker, der bei einer Kollision mit einem anderen Molekül oder Atom einer Fragmentierung unterliegen kann, und ist X bevorzugt eine vorionisierte, gegen Fragmentierung beständige Gruppe. Die Summe der Massen von M und X ist bei allen Mitgliedern des Satzes dieselbe. Bevorzugt weisen M und X die gleiche Grundstruktur oder Kernstruktur auf, wobei diese Struktur durch die Masseneinstellungseinheiten modifiziert ist.
Die Masseneinstellungseinheit stellt sicher, dass die Summe der Massen M und X für alle Massenmarker in einem Satz dieselbe ist, stellt aber sicher, dass jedes X eine unterschiedliche (einzigartige) Masse aufweist.
Ein bevorzugter Satz von Massenmarkern mit der obigen Struktur ist einer, bei dem jeder der Marker in dem Satz die folgende Struktur aufweist:
worin R Wasserstoff ist oder eine unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist, L der spaltbare Linker ist und A die Masseneinstellungseinheit ist, jedes p das gleiche ist und eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, jedes y' gleich oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller y' gleich y ist, jedes z' gleich oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller z' gleich z ist. Bevorzugt steht R für H, ist L eine Amidbindung, p = 0 und ist A ein F-Atom.
In dem vorliegenden Zusammenhang ist das Substitutionsmuster an der Gruppe R überhaupt nicht beschränkt. Der Substituent oder die Substituenten können irgendeine organische Gruppe und/oder ein oder mehrere Atome aus irgendeiner der Gruppen IIIA, IVA, VA, VIA oder VIIA des Periodensystems, wie ein B-, Si-, N-, P-, O- oder S-Atom oder ein Halogenatom (z.B. F, Cl, Br oder I) umfassen.
Wenn der Substituent eine organische Gruppe umfasst, kann die organische Gruppe eine Kohlenwasserstoffgruppe umfassen. Die Kohlenwasserstoffgruppe kann eine gerade Kette, eine verzweigte Kette oder eine cyclische Gruppe umfassen. Unabhängig kann die Kohlenwasserstoffgruppe eine aliphatische oder eine aromatische Gruppe umfassen. Ebenfalls unabhängig kann die Kohlenwasserstoffgruppe eine gesättigte oder ungesättigte Gruppe umfassen.
Wenn der Kohlenwasserstoff eine ungesättigte Gruppe umfasst, kann sie eine oder mehrere Alken-Funktionalitäten und/oder eine oder mehrere Alkin-Funktionalitäten umfassen. Wenn der Kohlenwasserstoff eine gerade oder verzweigtkettige Gruppe umfasst, kann sie eine oder mehrere primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylgruppen umfassen. Wenn der Kohlenwasserstoff eine cyclische Gruppe umfasst, kann sie einen aromatischen Ring, einen aliphatischen Ring, eine heterocyclische Gruppe und/oder kondensierte Ringderivate dieser Gruppen umfassen. Die cyclische Gruppe kann so eine Benzol-, Naphthalin-, Anthracen-, Inden-, Fluoren-, Pyridin-, Chinolin-, Thiophen-, Benzothiophen-, Furan-, Benzofuran-, Pyrrol-, Indol-, Imidazol-, Thiazol- und/oder eine Oxazolgruppe sowie alle Regioisomere der obigen Gruppen umfassen.
Die Zahl der Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffgruppe ist nicht besonders beschränkt, im Allgemeinen umfasst die Kohlenwasserstoffgruppe aber 1-40 C-Atome. Die Kohlenwasserstoffgruppe kann so eine niedere Kohlenwasserstoffgruppe (1-6 C-Atome) oder eine höhere Kohlenwasserstoffgruppe (7 C- Atome oder mehr, z.B. 7-40 C-Atome) sein. Die Zahl der Atome in dem Ring der cyclischen Gruppe ist nicht besonders beschränkt, aber der Ring der cyclischen Gruppe kann 3-10 Atome, wie 3, 4, 5, 6 oder 7 Atome, umfassen.
Die Gruppen, welche die oben definierten Heteroatome umfassen, sowie irgendeine der anderen oben definierten Gruppen können ein oder mehrere Heteroatome aus irgendeiner der Gruppen IIIA, IVA, VA, VIA oder VIIA des Periodensystems, wie ein B-, Si-, N-, P-, O- oder S-Atom oder ein Halogenatom (z.B. F, Cl, Br oder I), umfassen. So kann der Substituent eine oder mehrere übliche funktionelle Gruppen in der organischen Chemie umfassen, wie Hydroxygruppen, Carbonsäuregruppen, Estergruppen, Ethergruppen, Aldehydgruppen, Ketongruppen, Amingruppen, Amidgruppen, Imingruppen, Thiolgruppen, Thioethergruppen, Sulfatgruppen, Sulfonsäuregruppen und Phosphatgruppen. Der Substituent kann auch Derivate dieser Gruppen, wie Carbonsäureanhydride und Carbonsäurehalogenide, umfassen.
Zusätzlich kann jeder Substituent eine Kombination von zwei oder mehr der oben definierten Substituenten und/oder funktionellen Gruppen umfassen.
Die Matrizes von Massenmarkern der vorliegenden Erfindung sind nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass sie eine Mehrzahl von Sätzen von Massenmarkern gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Es wird bevorzugt, dass die Matrizes zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr oder fünf oder mehr Sätze von Massenmarkern umfassen. Bevorzugt weist jeder Massenmarker in der Matrix eine der folgenden Strukturen auf: (S)_x-M(A)_y-L-X(A)_z M(A)_y-(S)_x-L-X(A)_z, worin S die Massenreihen-modifizierende Gruppe ist, M die Massennormierungseinheit ist, X die Massenmarkierungseinheit ist, A die Masseneinstellungseinheit ist, L der spaltbare Linker ist, x eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, y und z ganze Zahlen von 0 oder größer sind und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist.
Eine bevorzugte Matrix von Massenmarkern der obigen Art ist eine, in der die Massenmarker eine der folgenden Strukturen aufweisen:
worin R Wasserstoff ist oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist, jedes p das gleiche ist und eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, x eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, jedes x irgendeines beliebigen Satzes vom x jedes anderen Satzes in der Matrix verschieden ist, jedes y' gleich oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller y' gleich y ist, und jedes z' gleich oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller z' gleich z ist. Eine Matrix dieser Art ist in 7 dargestellt.
In einem alternativen bevorzugten Aspekt kann die Matrix von Massenmarkern Massenmarker mit einer der folgenden Strukturen umfassen: S(A*)_r-M(A)_y-L-X(A)_z M(A)_y-S(A*)_r-L-X(A)_z worin S eine Massenreihen-modifizierende Gruppe ist, M die Massennormierungseinheit ist, X die Massenmarkierungseinheit ist, A eine Masseneinstellungseinheit der Massenmarker- und Massennormierungseinheiten ist, A* gleich oder verschieden von A sein kann und eine Masseneinstellungseinheit der Massenreihen-modifizierenden Gruppen ist, L ein spaltbarer Linker ist, r eine ganze Zahl von 0 oder größer ist und mindestens 1 bei einem oder mehreren Sätzen von Massenmarkern in der Matrix ist, y und z ganze Zahlen von 0 oder größer sind und x + y eine ganze Zahl von 1 oder größer ist. Vorzugsweise ist M eine gegen Fragmentierung beständige Gruppe, ist L ein Linker, der für eine Fragmentierung bei einer Kollision mit einem anderen Molekül oder Atom zugänglich ist und ist X bevorzugt eine vorionisierte, gegen Fragmentierung beständige Gruppe. S ist typisch eine Gruppe der Art, dass jedes Mitglied der Matrix von Sätzen von Markern ein S umfasst, dessen Masse vorzugsweise durch 4 Dalton von jedem anderen S jedes anderen Mitglieds der Matrix getrennt ist. So hat jeder verschiedene Satz von Massenmarkern eine unterschiedliche (einzigartige) Masse.
Eine bevorzugte Matrix von Massenmarkern der obigen letztgenannten Art ist eine, in der die Massenmarker in der Matrix eine der folgenden Strukturen aufweisen:
worin R Wasserstoff ist oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist, jedes p gleich ist und eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, x eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, wobei x das gleiche für alle Massenmarker in der Matrix ist, jedes y' gleich oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller y' gleich y ist, jedes z' gleich oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller z' gleich z ist, und jedes r' gleich oder verschieden sein kann, wobei die Summe aller r' gleich r ist. Eine Matrix dieser Art ist in 6 dargestellt.
In den obigen Sätzen und Matrizes dieser Erfindung ist die gemeinsame Grundstruktur der Gruppen M, X und S nicht besonders beschränkt und kann eine cyclische und/oder eine nicht-cyclische Gruppe umfassen. Die Natur von M, X und S ist nicht speziell beschränkt. Jedoch wird es bevorzugt, dass M und/oder X und/oder S als Grund-(Kern-) Struktur eine cyclische Gruppe, wie eine Aryl-, eine Cycloalkyl- oder eine heterocyclische Gruppe, umfassen. Diese Gruppen können unsubstituiert sein, sind aber bevorzugt substituiert. M, X und/oder S können jeweils ein Oligomer oder Polymer umfassen, das aus den obigen cyclischen Monomeren ausgewählt ist, wobei die cyclischen Monomere durch eine gegen Fragmentierung beständige Bindung oder Gruppe verknüpft sind.
Arylether, wie eine Phenylethergruppe und deren Oligomere und Polymere, insbesondere substituierte Arylether, sind bevorzugte gemeinsame Grundstrukturen von M, X und S.
Die spaltbare Linkergruppe ist nicht besonders beschränkt. Jedoch wird es bevorzugt, dass L eine Gruppe umfasst, die durch Kollision spaltbar ist und/oder in einem Massenspektrometer spaltbar ist. Bevorzugt umfasst die Gruppe L eine Amid-Bindung.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt stellt diese Erfindung Sätze und Matrizes von Massenmarkern bereit, die mit Analyten-Molekülen reagieren können, wobei die Massenmarker die folgende Formel aufweisen: Re-L'-Marker oder Re-L'-S-Marker, worin Re eine reaktive Funktionalität oder Gruppe ist, welche ermöglicht, dass der Massenmarker kovalent mit einer geeigneten funktionellen Gruppe in einem Analytenmolekül, wie, aber ohne Beschränkung, einem Nukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotid, einer Aminosäure, einem Peptid oder Polypeptid, reagieren kann. L' ist ein Linker, der spaltbar sein kann oder nicht, und Marker ist ein Massenmarker aus irgendeinem der oben definierten Sätze oder Matrizes. S hat die gleiche Bedeutung, wie oben definiert. L' kann ein spaltbarer Linker sein, falls gewünscht, wie beispielsweise ein spaltbarer Linker L, wie oben definiert.
In bevorzugten Ausführungsformen der obigen Aspekte der Erfindung sind L und/oder L* innerhalb des Massenspektrometers und vorzugsweise innerhalb der Ionenquelle des Massenspektrometers spaltbar.
Linker-Gruppen
In der vorstehenden und nachstehenden Erörterung wird Bezug auf Linker-Gruppen genommen, die verwendet werden können, um interessierende Moleküle mit den Massenmarker-Verbindungen dieser Erfindung zu verbinden. Eine Vielfalt von Linkern ist in der Technik bekannt, welche zwischen die Massenmarker dieser Erfindung und ihren kovalent angebrachten Analyten eingeführt werden können. Einige dieser Linker können spaltbar sein. Oligo- oder Polyethylenglycole oder deren Derivate können als Linker verwendet werden, wie jene, die in Maskos, U. und Southern, E.M., Nukleic Acids Research 20: 1679-1684, 1992, offenbart sind. Linker auf Bernsteinsäure-Basis werden ebenfalls in großem Umfang verwendet, obwohl diese für Anwendungen, welche die Markierung von Oligonukleotiden beinhalten, weniger bevorzugt sind, da sie im Allgemeinen Basen-labil sind und somit mit den Basen-vermittelten Schutzgruppenentfernungsschritten, die in einer Anzahl von Oligonukleotid-Synthetisierern verwendet werden, inkompatibel sind.
Propargylalkohohl ist ein bifunktioneller Linker, der für eine Verknüpfung sorgt, die unter den Bedingungen der Oligonukleotid-Synthese stabil ist, und ist ein bevorzugter Linker zur Verwendung mit dieser Erfindung in Bezug auf Oligonukleotid-Anwendungen. Ähnlich ist 6-Aminohexanol ein nützliches bifunktionelles Reagenz, um geeignet funktionalisierte Moleküle zu verknüpfen, und ist ebenfalls ein bevorzugter Linker.
Eine Vielfalt von bekannten spaltbaren Linker-Gruppen kann in Verbindung mit den Verbindungen dieser Erfindung verwendet werden, wie photospaltbare Linker. Orthonitrobenzyl-Gruppen sind als photospaltbare Linker bekannt, insbesondere 2-Nitrobenzylester und 2-Nitrobenzylamine, die an der Benzylamin-Bindung gespalten werden. Bezüglich eines Übersichtsartikels über spaltbare Linker siehe Lloyd-Williams et al., Tetrahedron 49, 11065-11133, 1993, der eine Vielfalt von photospaltbaren und chemisch spaltbaren Linkern behandelt.
Die WO 00/02895 offenbart die Vinylsulfon-Verbindungen als spaltbare Linker, die ebenfalls zur Verwendung mit dieser Erfindung anwendbar sind, insbesondere in Anwendungen, welche die Markierung von Polypeptiden, Peptiden und Aminosäuren beinhalten. Der Inhalt dieser Anmeldung wird durch Bezugnahme aufgenommen.
Die WO 00/02895 offenbart die Verwendung von Silicium-Verbindungen als Linker, die durch Base in der Gasphase spaltbar sind. Diese Linker sind ebenfalls zur Verwendung mit dieser Erfindung anwendbar, insbesondere in Anwendungen, welche die Markierung von Oligonukleotiden beinhalten. Der Inhalt dieser Anmeldung wird durch Bezugnahme aufgenommen.
In der nachstehenden Erörterung wird auf reaktive Funktionalitäten, Re, Bezug genommen, welche ermöglichen, dass Verbindungen der Erfindung an andere Verbindungen geknüpft werden, unabhängig davon, ob sie Reporter-Gruppen oder Analyten-Moleküle sind. Eine Vielfalt von reaktiven Funktionalitäten kann in die Massenmarker dieser Erfindung eingeführt werden.
Die nachstehende Tabelle 1 führt einige reaktive Funktionalitäten an, die mit nukleophilen Funktionalitäten umgesetzt werden können, welche in Biomolekülen gefunden werden, um eine kovalente Verknüpfung zwischen den zwei Einheiten zu erzeugen. Bei Anwendungen, welche synthetische Oligonukleotide beinhalten, werden häufig primäre Amine oder Thiole an den Enden der Moleküle eingeführt, um eine Markierung zu ermöglichen. Jede der nachstehend aufgeführten Funktionalitäten könnte in die Verbindungen dieser Erfindung eingeführt werden, um zu ermöglichen, dass Massenmarker an ein interessierendes Molekül geknüpft werden können. Eine reaktive Funktionalität kann verwendet werden, um weitere Linker-Gruppen mit einer weiteren reaktiven Funktionalität einzuführen, wenn dies gewünscht wird. Tabelle 1 soll nicht erschöpfend sein, und die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf die Verwendung der angeführten Funktionalitäten beschränkt. Tabelle 1
Es sollte bemerkt werden, dass in Anwendungen, welche die Markierung von Oligonukleotiden mit den Massenmarkern dieser Erfindung beinhalten, eventuell einige der vorstehenden reaktiven Funktionalitäten oder ihrer resultierenden Linker-Gruppen vor der Einführung in einen Oligonukleotid-Synthetisierer geschützt werden müssen. Bevorzugt sind ungeschützte Ester, Thioether und Thioester, Amin- und Amid-Bindungen zu vermeiden, da diese in den Oligonukleotid-Synthetisierern gewöhnlich nicht stabil sind. Eine große Vielfalt von Schutzgruppen ist in der Technik bekannt, die verwendet werden kann, um Verknüpfungen vor unerwünschten Nebenreaktionen zu schützen.
In der nachstehenden Erörterung wird Bezug auf „Ladung tragende Funktionalitäten" und löslich machende Gruppen genommen. Diese Gruppen können in Massenmarker, wie in die Massenmarker der Erfindung, eingeführt werden, um die Ionisation und Löslichkeit zu fördern. Die Wahl der Marker hängt davon ab, ob ein Positiv- oder Negativion-Nachweis verwendet werden soll. Die nachstehende Tabelle führt einige Funktionalitäten an, die in Massenmarker eingeführt werden können, um entweder eine positive oder eine negative Ionisation zu fördern. Die Tabelle soll keine erschöpfende Liste sein, und die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf die Verwendung der angeführten Funktionalitäten beschränkt. Tabelle 2
Die WO 00/02893 offenbart die Verwendung von Metallion-bindenden Einheiten wie Kronenethern oder Porphyrinen für den Zweck der Verbesserung der Ionisation von Massenmarkern. Diese Einheiten sind auch zur Verwendung mit den Massenmarkern der Erfindung anwendbar.
Die Komponenten der Massenmarker dieser Erfindung sind bevorzugt gegen eine Fragmentierung beständig, so dass die Stelle der Fragmentierung der Marker durch die Einführung einer Verknüpfung gesteuert werden kann, welche leicht durch kollisionsinduzierte Dissoziation gebrochen werden kann. Arylether sind ein Beispiel für eine Klasse von gegen Fragmentierung beständigen Verbindungen, die in dieser Erfindung verwendet werden können. Diese Verbindungen sind auch chemisch inert und thermisch stabil. Die WO 99/32501 erörtert die Verwendung von Polyethern in der Massenspektrometrie in größerer Einzelheit und der Inhalt dieser Anmeldung wird durch Bezugnahme aufgenommen.
In der Vergangenheit basierte das allgemeine Verfahren zur Synthese von Arylethern auf der Ullmann-Kupplung von Arylbromiden mit Phenolen in Anwesenheit von Kupferpulver bei etwa 200 °C (repräsentative Literaturstellen: H. Stetter, G. Duve, Chemische Berichte 87 (1954) 1699). Mildere Verfahren für die Synthese von Arylethern unter Verwendung eines anderen Metallkatalysators sind entwickelt worden, aber die Reaktionstemperatur liegt immer noch zwischen 100 und 120 °C (M. Iyoda, M. Sakaitani, H. Otsuka, M. Oda, Tetrahedron Letters 26 (1985) 477). Dies ist ein bevorzugter Weg für die Produktion von Polyether-Massenmarkern. Siehe die Synthese von FT77, die in den nachstehenden Beispielen angegeben wird. Eine kürzlich veröffentlichte Methode stellt einen äußerst bevorzugten Weg für die Erzeugung von Polyether-Massenmarkern bereit, da sie unter viel milderen Bedingungen als die früheren Methoden durchgeführt wird (D.E. Evans, J.L. Katz, T.R. West, Tetrahedron Lett. 39 (1998) 2937).
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Satz von zwei oder mehr Sonden bereit, wobei jede Sonde in dem Satz verschieden ist und an einem einzigartigen Massenmarker oder eine einzigartige Kombination von Massenmarkern aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern, wie oben definiert, angebracht ist.
Weiter wird eine Matrix von Sonden bereitgestellt, die zwei oder mehr Sätze von Sonden umfasst, wobei jede Sonde in irgendeinem beliebigen Satz an einem einzigartigen Massenmarker oder einer einzigartigen Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern, wie oben definiert, angebracht ist und wobei die Sonden in irgendeinem beliebigen Satz an Massenmarkern aus demselben Satz von Massenmarkern angebracht sind und jeder Satz von Sonden an Massenmarkern aus einzigartigen Sätzen von Massenmarkern aus einer Matrix von Massenmarkern, wie oben definiert, angebracht ist.
In einer Ausführungsform ist jede Sonde bevorzugt an einer einzigartigen Kombination von Massenmarkern angebracht, wobei jede Kombination durch die Anwesenheit oder Abwesenheit jedes Massenmarkers in dem Satz von Massenmarkern und/oder die Quantität jedes Massenmarkers, der an die Sonde geknüpft ist, unterschiedlich ist. Dies wird als „Mischungsmodus" der vorliegenden Erfindung bezeichnet, da die Sonden an einer Mischung von Massenmarkern angebracht sein können.
In den obigen Aspekten ist die Natur der Sonde nicht besonders beschränkt. Jedoch umfasst jede Sonde bevorzugt ein Biomolekül. Jedes Biomolekül kann verwendet werden, aber das Biomolekül ist bevorzugt aus einer DNA, einer RNA, einem Oligonukleotid, einer Nukeinsäurebase, einem Peptid, einem Polypeptid, einem Protein und einer Aminosäure ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung Sätze und Matrizes von Massen-markierten Analyten, wie Nukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden, der Form:
Analyt-L'-Marker oder Analyt-L'-S-Marker
bereit, worin L' und S wie vorstehend definiert sind und Marker ein Massenmarker aus irgendeinem der vorstehend definierten Sätze und Matrizes ist.
In dem obigen Aspekt ist die Natur des Analyten nicht besonders beschränkt. Jedoch umfasst jeder Analyt vorzugsweise ein Biomolekül. Jedes Biomolekül kann verwendet werden, aber das Biomolekül ist bevorzugt aus einer DNA, einer RNA, einem Oligonukleotid, einer Nukeinsäurebase, einem Peptid, einem Polypeptid, einem Protein und einer Aminosäure ausgewählt.
In einer Ausführungsform ist jeder Analyt bevorzugt an einer einzigartigen Kombination von Massenmarkern angebracht, wobei jede Kombination durch die Anwesenheit oder Abwesenheit jedes Massenmarkers in dem Satz von Massenmarkern und/oder die Quantität jedes Massenmarkers, der an der Probe angebracht ist, unterschieden werden kann. Wie vorstehend erwähnt, wird dies als „Mischungsmodus" der vorliegenden Erfindung bezeichnet, da die Sonden an einer Mischung von Massenmarkern angebracht sein können.
Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Analyseverfahren bereit, wobei das Verfahren den Nachweis eines Analyten durch Identifikation eines Massenmarkers oder einer Kombination von Massenmarkern, der bzw. die einzigartig für den Analyten ist, mittels Massenspektrometrie umfasst, wobei der Massenmarker ein Massenmarker aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern ist, wie vorstehend definiert. Die Art des Verfahrens ist nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt, dass das Verfahren einen Nutzen aus der Verwendung der Massenmarker der vorliegenden Erfindung zieht, um einen Analyten zu identifizieren. Bei dem Verfahren kann es sich zum Beispiel um ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukeinsäure oder ein Verfahren der Erstellung eines Expressionprofils eines oder mehrerer Gene durch Nachweis der Mengen an Protein in einer Probe handeln. Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, da es verwendet werden kann, um leicht eine Mehrzahl von Analyten gleichzeitig zu analysieren. Jedoch weist das Verfahren auch Vorteile bei der individuellen Analyse eines einzigen Analyten auf, da unter Verwendung der vorliegenden Massenmarker Massenspektren, die reiner sind als herkömmliche Spektren, erzeugt werden, was das Verfahren genau und empfindlich macht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) In-Kontakt-Bringen eines oder mehrerer Analyten mit einem Satz von Sonden oder einer Matrix von Sonden, wobei jede Sonde in dem Satz oder der Matrix für mindestens einen Analyten spezifisch ist, wobei die Sonden wie oben definiert sind,
(b) Identifizieren eines Analyten durch Nachweis der Sonde, die für den Analyten spezifisch ist.

In dieser Ausführungsform wird es bevorzugt, dass der Massenmarker vor dem Nachweis des Massenmarkers durch Massenspektrometrie von der Sonde abgespalten wird.
Die Natur der Verfahren dieser speziellen Ausführungsform ist nicht besonders beschränkt. Jedoch wird es bevorzugt, dass das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer oder mehrerer Nukeinsäure mit einem Satz von Hybridisierungssonden umfasst. Der Satz von Hybridisierungssonden umfasst typisch einen Satz von bis zu 256 4-meren, wobei jede Sonde in dem Satz eine andere Kombination von Nukeinsäurebasen aufweist. Dieses Verfahren kann zur Identifikation der Anwesenheit von Ziel-Nukeinsäuren geeignet sein oder kann alternativ in einem schrittweisen Verfahren der Primerextensions-Sequenzierung einer oder mehrerer Nukeinsäure-Matrizen verwendet werden.
Die Massenmarker der vorliegenden Erfindung sind besonders zur Verwendung in Verfahren der zweidimensionalen Analyse geeignet, hauptsächlich aufgrund der großen Zahl von Markern, die gleichzeitig unterschieden werden können. Die Marker können so in einem Verfahren der zweidimensionalen Gelelektrophorese oder in einem Verfahren der zweidimensionalen Massenspektrometrie verwendet werden.
So stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur zweidimensionalen massenspektrometrischen Analyse bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen eines oder mehrerer Analyten, wobei jeder Analyt mit einem Massenmarker oder einer Kombination von Massenmarkern markiert ist, der bzw. die für den Analyten einzigartig ist, wobei die Massenmarker aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern, wie oben definiert, abstammen;
(b) Abspalten der Massenmarker von den Analyten,
(c) Nachweisen der Massenmarker;
(d) Dissoziieren der Massenmarker im Massenspektrometer, um die Massenmarkierungseinheiten aus den Massennormierungseinheiten freizusetzen;
(e) Nachweisen der Massenmarkierungseinheiten; und
(f) Identifizieren des Analyten auf der Grundlage des Massenspektrums der Massenmarker in der ersten Dimension und des Massenspektrums der Massenmarkierungseinheiten in der zweiten Dimension.

In diesem Verfahren werden bevorzugt im Schritt (c) Massenmarker einer gewählten Masse oder eines gewählten Bereichs an Massen für den Nachweis selektiert. Es wird auch bevorzugt, dass im Schritt (e) Massenmarkierungseinheiten mit einer spezifischen Masse oder einem spezifischen Bereich von Massen für den Nachweis selektiert werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Analyseverfahren bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer ersten Auftrennungsbehandlung bei einer Mischung von markierten Analyten auf der Basis einer ersten Eigenschaft der Analyten;
(b) Durchführen einer zweiten Auftrennungsbehandlung bei den resultierenden aufgetrennten Analyten auf der Basis einer zweiten Eigenschaft der Analyten; und
(c) Nachweisen eines Analyten durch Nachweis seines Markers,

Die Eigenschaft der Analyten ist nicht besonders beschränkt. Jedoch werden in dieser Ausführungsform im Schritt (a) und/oder (b) die Analyten bevorzugt gemäß ihrer Länge oder Masse aufgetrennt. Es wird weiter bevorzugt, dass im Schritt (a) und/oder (b) die Analyten gemäß ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden. Typisch umfassen die Analyten ein oder mehrere Proteine, Polypeptide, Peptide, eine oder mehrere Aminosäuren oder Nukeinsäuren oder ein oder mehrere Fragmente derselben. Es wird besonders bevorzugt, dass in jedem der Auftrennungsschritte Gelelektrophorese verwendet wird. In dieser Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren der zweidimensionalen Gelelektrophorese.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukeinsäure bereit, welches umfasst:

(a) Bereitstellen einer Population von Nukeinsäure-Fragmenten, wobei jedes Fragment abspaltbar daran angebracht einen Massenmarker aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern, wie vorstehend definiert, zur Identifikation eines Merkmals dieses Fragments aufweist;
(b) Auftrennen der Fragmente auf der Grundlage ihrer Länge;
(c) Spalten jedes Fragments, um seinen Massenmarker freizusetzen; und
(d) Bestimmen jedes Massenmarkers durch Massenspektroskopie, um das Merkmal jedes Fragments mit der Länge des Fragments in Beziehung zu setzen.

Typisch wird das Verfahren dieses Aspekts der Erfindung für die Charakterisierung von cDNA verwendet. Bevorzugt umfasst dieses Verfahren:

(a) Einwirkenlassen eines Spaltungsmittels, das eine vorbestimmte Sequenz erkennt und an einer Bezugsstelle bei einer bekannten Versetzung von der vorbestimmten Sequenz proximal zu einem Ende jeder cDNA oder jedes Fragments derselben schneidet, auf eine Probe, die eine Population einer oder mehreren cDNAs oder eines oder mehrerer Fragmente derselben umfasst, um eine Population von terminalen Fragmenten zu erzeugen;
(b) Ligieren eines Adapter-Oligonukleotids, das eine Erkennungsstelle für ein Proben-Spaltungsmittel umfasst, an jede Bezugsstelle,
(c) Einwirkenlassen eines Proben-Spaltungsmittels, das sich an die Erkennungsstelle bindet und an einer Probenstelle mit bekannter Versetzung von der Erkennungsstelle schneidet, auf eine Population von terminalen Fragmenten, um in jedem terminalen Fragment eine Sequenz mit klebrigem Ende mit einer vorbestimmten Länge von bis zu sechs Basen und von unbekannter Sequenz zu erzeugen;
(d) Auftrennen der Population von terminalen Fragmenten in Unterpopulationen gemäß der Sequenzlänge und
(e) Bestimmen der Sequenz jedes klebrigen Endes durch: (i) Sondieren mit einer Matrix von markierten Hybridisierungssonden, wobei die Matrix alle möglichen Basensequenzen der vorbestimmten Länge enthält; (ii) Ligieren dieser Sonden, die mit den Sequenzen mit klebrigem Ende hybridisieren, und (iii) Bestimmen, welche Sonden ligiert sind, durch Identifikation und bevorzugt Quantifizierung der Marker;

In diesem Verfahren wird die Population von terminalen Fragmenten bevorzugt durch Kapillarelektrophorese, HPLC oder Gelelektrophorese aufgetrennt.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäure bereitgestellt, wobei das Verfahren die Erzeugung von Nukleinsäure-Fragmenten einer Sanger-Leiter aus einer oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen in Anwesenheit mindestens einer markierten terminierenden Base und die Identifikation der Länge des Fragments und der terminierenden Base des Fragments umfasst, wobei der Marker für die terminierende Base spezifisch ist und ein Massenmarker aus einem Satz oder einer Matrix, wie oben definiert, ist.
In diesem Aspekt der Erfindung wird es bevorzugt, dass alle vier terminierenden Basen in derselben Reaktionszone vorliegen. Das Verfahren umfasst typisch die Erzeugung von Nukleinsäure-Fragmenten einer Sanger-Leiter aus einer Mehrzahl von Nukleinsäure-Matrizen, die in derselben Reaktionszone vorliegen, und die Identifikation der Länge des Fragments bei jedem Nukleinsäure-Fragment, der Identität der Matrize, aus der das Fragment abgeleitet ist, und der terminierenden Base des Fragments, wobei vor der Erzeugung der Fragmente ein markiertes Primer-Nukleotid oder -Oligonukleotid mit jeder Matrize hybridisiert wird, wobei der Marker an jedem Primer für die Matrize, mit der dieser Primer hybridisiert, spezifisch ist, um eine Identifikation der Matrize zu ermöglichen. Die Art von Marker, welcher die Matrize identifiziert, ist nicht besonders beschränkt. Jedoch wird es bevorzugt, dass der Marker, der die Matrize identifiziert, ein Massenmarker aus einem Satz oder einer Matrix, wie oben definiert, ist.
Ein weiterer Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäure bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Erhalt einer Ziel-Nukleinsäure-Population, die eine oder mehrere zu sequenzierende einzelsträngige DNAs umfasst, von denen jede in einer einzigartigen Menge vorliegt und einen Primer trägt, um einen doppelsträngigen Teil der Nukleinsäure für eine Ligierung daran bereitzustellen.
(b) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäure-Population mit einer Matrix von Hybridisierungssonden, wobei jede Sonde einen Marker umfasst, der abspaltbar an einer bekannten Basensequenz vorbestimmter Länge angebracht ist, wobei die Matrix alle möglichen Basensequenzen jener vorbestimmten Länge umfasst und die Basensequenzen nicht in der Lage sind, miteinander zu ligieren, wobei das In-Kontakt-Bringen in Anwesenheit von Ligase unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass die Sonde, welche die Basensequenz trägt, die komplementär zu der einzelsträngigen Nukleinsäure ist, angrenzend an den doppelsträngigen Teil ligiert wird, wodurch ein verlängerter doppelsträngiger Teil gebildet wird, der nicht in der Lage ist, an weitere Sonden zu ligieren; und
(c) Entfernen aller nicht-ligierten Sonden; gefolgt von den Schritten:
(d) Spalten der ligierten Sonden, um jeden Marker freizusetzen;
(e) Registrieren der Menge jedes Markers; und
(f) Aktivieren des verlängerten doppelsträngigen Teils, um eine Ligierung daran zu ermöglichen; wobei
(g) die Schritte (b) bis (f) in einem Zyklus ausreichend oft wiederholt werden, um die Sequenz der oder jeder einzelsträngigen Nukleinsäure durch Bestimmung der Reihenfolge der Freisetzung jedes Markers zu bestimmen,

In diesem Aspekt der Erfindung wird es bevorzugt, dass die Hybridisierungssonden einen Satz von 256 4-meren sind, wobei jede Sonde in dem Satz eine andere Kombination von Nukleinsäurebasen aufweist.
Wie bereits erwähnt, wird es in allen obigen Aspekten der vorliegenden Verfahren bevorzugt, dass zwei oder mehr Analyten gleichzeitig durch Identifikation ihrer Massenmarker oder Kombinationen von Massenmarkern durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden.
Der Mischungsmodus der vorliegenden Erfindung kann auf alle obigen Verfahren angewendet werden. In dieser Ausführungsform wird jeder Analyt durch eine einzigartige Kombination von Massenmarkern aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern identifiziert, wobei jede Kombination durch die Anwesenheit und Abwesenheit jedes Massenmarkers in dem Satz oder der Matrix und/oder die Menge jedes Massenmarkers unterschieden werden kann.
Wenn das Verfahren auf zwei oder mehr Analyten gleichzeitig angewendet wird, wird es in einigen Aspekten bevorzugt, dass die Analyten vor dem Nachweis des Massenmarkers durch Massenspektrometrie gemäß ihrer Masse aufgetrennt werden. Bevorzugt ist der Auftrennungsschritt ein chromatographischer Schritt, wie Flüssigchromatographie oder Gelelektrophorese. Die vorliegenden Marker vom Typ 2 sind in diesen Ausführungsformen besonders vorteilhaft, da die aggregierte Masse aller Marker in dem Satz dieselbe ist, wodurch bei einem chromatographi schen Auftrennungsschritt die Mobilität aller Analyten gleichermaßen durch die Marker beeinflusst wird.
Typisch umfasst in den vorliegenden Verfahren das Massenspektrometer, das verwendet wird, um den Massenmarker nachzuweisen, einen oder mehrere Massenanalysatoren, wobei die Massenanalysatoren in der Lage sind, Ionen einer bestimmten Masse oder eines bestimmten Bereichs von Massen für den Nachweis durchtreten zu lassen, und/oder in der Lage sind, zu bewirken, dass Ionen dissoziieren. Bevorzugt werden Ionen einer speziellen Masse oder eines speziellen Bereichs von Massen, die bzw. der für einen oder mehrere bekannte Massenmarker spezifisch ist, unter Verwendung des Massenanalysators selektiert, werden die selektierten Ionen dissoziiert und werden die Dissoziationsprodukte nachgewiesen, um Ionenmuster zu identifizieren, welche die selektierten Massenmarker anzeigen. In besonders bevorzugten Verfahren umfasst das Massenspektrometer drei Quadrupol-Massenanalysatoren. In dieser Ausführungsform wird im Allgemeinen ein erster Massenanalysator verwendet, um Ionen einer speziellen Masse oder eines speziellen Massenbereichs zu selektieren, ein zweiter Massenanalysator wird verwendet, um die selektierten Ionen zu dissoziieren, und ein dritter Massenanalysator wird verwendet, um die resultierenden Ionen nachzuweisen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der obigen Verfahren liefert ein Verfahren zur Analyse von massenmarkierten Analyten-Molekülen, welches die Schritte umfasst:

1. Abspalten des Massenmarkers von seinem zugehörigen interessierenden Molekül;
2. Ionisieren des abgespaltenen Massenmarkers;
3. Selektieren von Ionen eines bestimmter Masse-Ladungs-Verhältnisses, welches dem Masse-Ladungs-Verhältnis der bevorzugten Ionen von bekannten Massenmarkern entspricht, in einem Massenanalysator.
4. Induzieren einer Dissoziation dieser selektierten Ionen durch Kollision.
5. Nachweisen der Kollisionsprodukte zur Identifikation der Kollisionsprodukt-Ionen, welche die selektierten Massenmarker anzeigen.

Es wird bevorzugt, dass der Prozess des Abspaltens des Massenmarkers von seiner zugehörigen Nukleinsäure innerhalb eines Massenspektrometers stattfindet, bevorzugt innerhalb der Ionenquelle. Es wird auch bevorzugt, dass die Massenmarker vorionisiert sind. In dieser Ausführungsform müssen die Marker lediglich von einer flüssigen oder festen Phase in die Gasphase überführt werden (wenn die Massenmarker in einer flüssigen oder festen Phase vorliegen). Typisch resultiert der Schritt der Ionisierung des Massenmarkers aus der Abspaltung des Massenmarkers innerhalb der Ionenquelle des Massenspektrometers.
Bevorzugt wird der dritte Schritt der Selektion der Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis in dem ersten Massenanalysator eines seriellen Instruments durchgeführt. Die selektierten Ionen werden dann in eine getrennte Kollisionszelle kanalisiert, wo sie mit einem Gas oder einer festen Oberfläche gemäß dem obigen vierten Schritt kollidieren. Die Kollisionsprodukte werden dann in einen weiteren Massenanalysator eines seriellen Instruments kanalisiert, um die Kollisionsprodukte gemäß dem obigen fünften Schritt nachzuweisen. Typische serielle Instrumente zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Triele-Quadrupol-Massenspektrometer, Tandemsektor-Instrumente und Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer.
Es wird weiter bevorzugt, dass der obige dritte Schritt der Selektion der Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis, der vierte Schritt des Kollidierens der selektierten Ionen mit einem Gas und der fünfte Schritt des Nachweises der Kollisionsprodukte in derselben Zone des Massenspektrometers durchgeführt werden. Dies kann z.B. in Innenfallen-Massenanalysatoren und Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern bewirkt werden.
In einer bevorzugten weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Massen-markierten Analyten-Molekülen bereit, welches die Schritte umfasst:

1. Abspalten des Massenmarkers von seinem zugehörigen Analyten-Molekül.
2. Ionisieren des abgespaltenen Massenmarkers.
3. Selektieren von Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis entsprechend dem Masse-Ladungs-Verhältnis der bevorzugten Ionen von bekannten Massenmarkern in einem Massenanalysator.
4. Induzieren einer Dissoziation der selektierten Ionen durch Kollision.
5. Nachweisen von mehr als einem der Kollisionsprodukte, um Kollisionsprodukt-Ionenmuster zu identifizieren, welche die selektierten Massenmarker anzeigen, die wiederum die markierte Nukleinsäure identifizieren.

In bevorzugten Aspekten dieser Ausführungsform dieser Erfindung findet der Prozess der Abspaltung des Massenmarkers von seiner zugehörigen Nukleinsäure innerhalb eines Massenspektrometers, bevorzugt innerhalb der Ionenquelle, statt.
In gewissen bevorzugten Aspekte dieser Ausführungsform sind die Massenmarker vorionisiert und müssen lediglich aus einer flüssigen oder festen Phase in die Gasphase transferiert werden (wenn die Massenmarker in einer flüssigen oder festen Phasen vorliegen).
In weiteren bevorzugten Aspekten resultiert der Schritt der Ionisation des Massenmarkers aus der Abspaltung des Massenmarkers innerhalb der Ionenquelle des Massenspektrometers.
In gewissen Aspekten wird der dritte Schritt der Selektion der Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis in einem ersten Massenanalysator eines seriellen Instruments durchgeführt. Die selektierten Ionen werden in eine getrennte Kollisionszelle kanalisiert, wo sie gemäß dem obigen vierten Schritt mit einem Gas oder einer festen Oberfläche Schritt kollidieren. Die Kollisionsprodukte werden dann in einen weiteren Massenanalysator eines seriellen instruments kanalisiert, um die Kollisionsprodukte gemäß dem obigen fünften Schritt nachzuweisen. Typische serielle Instrumente schließen Triele-Quadrupol-Massen spektrometer, Tandemsektor-Instrumente und Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer ein.
In weiteren bevorzugten Aspekten werden der dritte Schritt der Selektion der Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis, der vierte Schritt des Kollidierens der selektierten Ionen mit einem Gas und der fünfte Schritt des Nachweises der Kollisionsprodukte in derselben Zone des Massenspektrometers durchgeführt. Dies kann z.B. in Ionenfallen-Massenanalysatoren und Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern bewirkt werden.
Tandem-Massenspektrometrie
Auf Kosten von etwas Verlust an Empfindlichkeit können große Zunahmen der Selektivität durch die Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) zum Nachweis der Massenmarker der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Für die Zwecke der Erläuterung der Erfindung wird nun die Tandem-Massenspektrometrie kurz erörtert, was hier mit Bezug auf das Triele-Quadrupol-Massenspektrometer als Beispiel geschieht. Das Triele-Quad ermöglicht die einfache Erläuterung des Prinzips von MS/MS.
Der Quadrupol-Massenanalysator ist im Wesentlichen ein Massenfilter, das in jedem Augenblick so eingestellt werden kann, dass es Ionen mit nur einem speziellen Masse-Ladungs-Verhältnis durchtreten lässt. Ein Quadrupol umfasst vier parallele stabförmige Elektroden, die einen Kanal bilden. Ein Gleichstrom-Potential, über das ein sinusförmiges Radiofrequenz-Potential gelegt wird, wird an den Stabelektroden angelegt. Ionen, die in den Kanal eintreten, der von den parallelen Stäben gebildet wird, folgen komplizierten Trajektorien und bei einem bestimmten Gleichstrom-Potential und Radiofrequenz-Potential haben nur Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis eine stabile Trajektorie, welche sie durch den Kanal führen wird. Durch Änderung des angelegten Potentials kann der Quadrupol in die Lage versetzt werden, einen vollen Bereich von Masse-Ladungs-Verhältnissen bis zu etwa 4000 zu scannen.
Ein Triele-Quad (Q)-Aufbau ist in 1 gezeigt. Drei getrennte Quadrupol-Massenanalysatoren sind in Reihe verbunden. Der erste Quadrupol wird nachstehend als Q1 bezeichnet, ähnlich werden der zweite als Q2 und der dritte als Q3 bezeichnet. Die Quadrupole Q1 und Q3 werden typisch im Scanning-Modus verwendet. Die Scan-Geschwindigkeit ist sehr hoch. Alternativ kann Q1 oder Q3 als „Tor" verwendet werden, das nur selektierte Ionen durchlässt. Quadrupol Q2 wird in einem Nicht-Scanning-Modus verwendet, in dem es als Ionen-Fokussierungsvorrichtung dient. Alle Ionen treten durch Q2, wenn dort ein Hochvakuum vorliegt. Wenn ein Gas in Q2 eingeführt wird, kollidieren eintretende Ionen mit Gas und viele der Ionen gewinnen ausreichend Energie, um zu fragmentieren. Dies ist eine „Kollisions-induzierte Dissoziation" (CID).
Man betrachte eine spezielle Verwendung des Triele-Quads. Man nehme an, dass Ionen in der Ionenquelle produziert werden (A⁺, B⁺, C⁺, D⁺, usw.). Wenn alle diese Ionen durch Q1 durchgelassen werden, wobei Q2 und Q3 im Scanning-Modus arbeiten, wird ein volles Massenspektrum erzeugt (11 – Massenspektrum 1). Das Massenspektrum 1 zeigt ein Spektrum, das die Molekülionen A⁺ bis D⁺ und dazugehörige Fragment-Ionen umfasst.
Man nehme nun an, dass Q1 so eingestellt ist, dass nur A⁺-Ionen durchtreten und Q2 bei niedrigem Druck vorliegt. Die A⁺-Ionen treten durch Q2 und Q3 und werden nachgewiesen (12 – Massenspektrum 2). Das neue Massenspektrum ist nun von den anderen Ionen (B⁺, C⁺ usw.) "gereinigt", welche von Q1 zurückgewiesen wurden. Mehrere Analyten können aus derselben Probe nachgewiesen werden, die in das Massenspektrometer eingeführt wurde, indem man Q1 so einstellt, dass es über eine begrenzte Massenreihe scannt, welche der speziellen Ionenspezies der interessierenden Analyten entspricht. Dies wird als „selektive Ionen-Kontrolle" bezeichnet.
Ein Triele-Quadrupol kann jedoch verwendet werden, um eine weitere Selektivität zu gewinnen. Es ist möglich, dass A⁺-Ionen aus mehreren Quellen stammen (z.B. könnten mehrere Ionen dasselbe Masse-Ladungs-Verhältnis von 100 aufweisen, aber verschiedene Zusammensetzungen haben, wie C₇H₁₆, C₆H₁₂O, C₅H₈O usw.).
Man nehme an, dass es zwei Zusammensetzungen von A⁺-Ionen (A₁ ⁺, A₂ ⁺), beide mit derselben nominellen Masse, gibt (13 und 14 – Massenspektren 3 und 4). Wenn A⁺-Ionen in Q1 selektiert werden und in Q2 CID durchgeführt wird, ergibt ein Scan von Q3 das in 15 gezeigte Spektrum – Massenspektrum 5. Dies ist ein „gemischtes" Spektrum.
Man nehme an, dass es bekannt ist, dass Ionen P⁺, Q⁺ (oder sogar nur P⁺) zweifelsfrei aufzeigen können, dass A₁ ⁺ vorliegt. Das heißt, es ist bekannt, dass die Fragmentierung (Reaktion) A₁ ⁺ → P⁺ + Q⁺ stattfindet. Anstelle des Scannens aller Ionen in Q3 wird dieser so eingestellt, dass er nur P⁺-Ionen nachweist. Demgemäß werden nach Verlassen der Ionenquelle Ionen A⁺, B⁺ auf nur A⁺ (A⁺ = A₁ ⁺, A₂ ⁺)-Ionen reduziert, die in Q2 eintreten.
Nach CID werden nur Fragment-Ionen P⁺ selektiert und diese sind allein für A₁ ⁺ charakteristisch. Dies wird als „Einzel- oder selektive Reaktionskontrolle" bezeichnet, welche hoch selektiv ist. In allgemeinerem Sinn wird das volle Spektrum von Ionen, die in Q1 eintreten (11 – Massenspektrum 1), in Q3 auf P⁺ reduziert (16 – Massenspektrum 6) und es ist bekannt, dass diese Ionen nur mit A₁ ⁺ in Beziehung stehen.
In einigen der nachfolgenden Diskussionen betreffen die Beispiele die Verwendung der Massenmarker dieser Erfindung zur Identifikation von Nukleotiden oder Oligonukleotiden. Es ist auch möglich, dass die Marker dieser Erfindung mit Proteinen oder Peptiden oder anderen Analyten verwendet werden können, und Oligonukleotide werden beispielhaft erwähnt. Für die Zwecke der Analyse von Oligonukleotiden wird angenommen, dass die Massenmarker kovalent über einen spaltbaren Linker an dem Oligonukleotid angebracht sind. Der Linker kann durch eine Reihe von Mechanismen, einschließlich thermischer Spaltung, chemischer Spaltung, Kegelspannungs-Spaltung oder Photospaltung, spaltbar sein. In der folgenden Erörterung des Verhaltens von Massenmarkern wird angenommen, dass die Marker während oder vor der Ionisation von ihren zugehörigen Nukleinsäuren abgespalten worden sind. Bevorzugte spaltbare Linker und deren Verwendungsverfahren sind in den GB-Patentanmeldungen GB 9815163.2 und GB 9815164.0 offenbart. Der bevorzugte Spaltungsprozess ist schematisch in 20 dargestellt.
Gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung kann das Prinzip der selektierten Ionen-Kontrolle (SIM), gekoppelt mit der selektierten Reaktionskontrolle (SRM) auf Massenmarkierungstechniken angewendet werden, was ein zweidimensionales Nachweisverfahren ergibt. Wenn A₁ ⁺ ein Ion aus einem Massenmarker und deshalb von bekannter Zusammensetzung und bekanntem Fragmentierungsmuster wäre, könnte unabhängig davon, wie viele Ionen in dem Ionisationsschritt produziert würden, der Massenmarker, ohne dass irgendeine Störung durch andere Ionen auftreten würde, durch Torsteuerung der A⁺-Ionen in dem ersten Quadrupol eines Triele-Quads und dann Nachweisen der A₁ ⁺-Fragmentierungsprodukte identifiziert werden, d.h. indem nur P⁺-Ionen in das dritte Quadrupol eines Triele-Quadrupols gelenkt würden. Es wäre nicht von Belang, welcher M/Z-Bereich überprüft wird, und es ist nicht mehr erforderlich, „saubere" Fenster im Massenspektrum zu finden.
Wie oben erwähnt, stellt ein Aspekt dieser Erfindung Massenmarker bereit, die schematisch durch die Formel M-L-X dargestellt werden können. Als Beispiel könnte A₁ ⁺ das Molekülion für den nachstehend gezeigter Marker sein:
M ist so eine Benzylgruppe, L ist eine Amidbindung und X ist eine Pyridylgruppe. Die Amidbindung, die den Benzylring mit dem Pyridylring verknüpft, ist für eine Spaltung durch Kollision besonders empfänglich. So produziert A₁ ⁺ bei einer Kollision das nachstehende Fragmention:
und dieses würde P⁺ darstellen. So bedeutet der Nachweis von P⁺, dass A₁ ⁺ vorliegt und dass einer der Marker vorliegt. Der Marker ist selektiv aus allen anderen Ionen identifiziert worden, und dies eliminiert wirksam eine „Hintergrund"-Kontamination. Dies bedeutet, dass markierte Analyten nicht erschöpfend gereinigt werden können und dass die Marker nicht außerhalb des Massenspektrometers abgespalten und von dem Analyten getrennt werden müssen. Dieses Prinzip kann verallgemeinert werden, um eine nützliche Klasse von Verbindungen zur Verwendung als Massenmarker bereitzustellen, welche alle die allgemeine Struktur M-L-X aufweisen, worin M über eine spaltbare Bindung L, wie eine Amidbindung, mit X verbunden ist, und X das Ion ist, das mittels SRM nachgewiesen wird. Demgemäß ist X analog zum oben gezeigten Spaltungsprodukt und wird als P⁺ bezeichnet.
Gemäß einem Aspekt dieser Erfindung kann die oben veranschaulichte Massenmarkerstruktur verallgemeinert werden, um einen nützlichen Satz von Massenmarkern bereitzustellen, alle mit der gleichen Masse, die aber immer durch SRM aufgelöst werden. Man lasse M₀, M₁, ..., M₄ und X₀, X₁, ..., M₄ isotope Formen der Hälften von M-L-X sein, worin L eine Amidbindung ist, die M und X verbindet. Das obige Beispiel kann wiederum verwendet werden. Wenn diese Struktur mit Fluor substituiert ist, können die in 2 gezeigten Komponenten erzeugt werden. Diese Marker-Komponenten können so kombiniert werden, dass ein Massenmarker MX (wobei die spaltbare Bindung L für einen Augenblick ignoriert wird) wie folgt gebildet wird: M₀X₄; M₁X₃; M₂X₂; M₃X₁; M₄X₀
Diese fünf Substanzen haben genau dieselbe Masse (3). Demgemäß würden, wenn ein Massenmarker in Q1 eines Triele-Quadrupols selektiert würde, nur Ionen der Masse = M_mX_n (m = 0-4, n = 4-0) selektiert. Q1 könnte so eingestellt werden, dass er nur nach MX-Ionen "schaut". Wenn CID in Q2 bewirkt wird, könnte Q3 so eingestellt werden, dass nur Ionen X₀, X₁, X₂, X₃ und X₄ durchtreten, wie in 21 gezeigt.
Deshalb würden fünf Massenmarker, alle mit der gleichen Masse, in Q1 selektiert werden, und die nachstehend gezeigten Spaltungsreaktionen können in Q3 identifiziert werden. Wenn die Masse 139 in Q3 nachgewiesen würde, muss sie von M₃X₁ abstammen, usw. M₀X₄ → X₄ ⁺ (m/z 193) M₁X₃ → X₃ ⁺ (m/z 175) M₂X₂ → X₂ ⁺ (m/z 157) M₃X₁ → X₁ ⁺ (m/z 139) M₀X₄ → X₀ ⁺ (m/z 121)
Der Selektionsprozess dieses Verfahrens kann als zweidimensionales Massenspektrum veranschaulicht werden, das in 17 gezeigt ist – Massenspektrum 7.
Bei einem alternativen Ansatz kann ein anderer Satz von Massenmarkern synthetisiert werden. In diesem Analysemodus wird SRM mit "Selektierte-Ionen-Kontrolle" (SIM) kombiniert. Im SIM-Analysemodus scannt der erste Qadrupol (Q1) selektiv über vorbestimmte Massen, wobei nur Ionen mit den vorbestimmten Massen torgesteuert werden.
Wenn man wieder M₀, M₁, M₂, M₃, M₄ und X₀ aus den 2 und 3 betrachtet, können diese Marker-Komponenten vereinigt werden, was fünf Marker mit verschiedenen Massen, M₀X₀, M₁X₀, M₂X₀, M₃X₀ und M₄X₀ ergibt. Man nehme nun an, dass Q1 eines Triele-Qadrupols so eingestellt ist, dass er diese fünf Massen selektiert, dann muss Q3 nur so eingestellt werden, dass er 1 Masse (X₀) nachweist, wie in 4.
Demgemäß identifiziert das Massenspektrometer nur 1 festgelegtes Ion (X₀). Da X₀ nur von M₀X₀, M₁X₀, M₂X₀, M₃X₀, M₄X₀ herstammen kann und es bekannt ist, wann diese in Q1 selektiert worden sind, liefert dies einen alternativen Modus der Massenmarkierung. Fünf verschiedene Analyten können nun durch eine von fünf speziellen „einzelnen Reaktionen" identifiziert werden. M₀X₀ → X₀ M₁X₀ → X₀ M₂X₀ → X₀ M₃X₀ → X₀ M₄X₀ → X₀
Dies erzeugt ein anderes zweidimensionales Massenspektrum, das in 18 gezeigt ist – Massenspektrum 8.

Die zwei obigen Ansätze können kombiniert werden. Man nehme an, dass M₀, M₁, M₂, M₃ so gewählt werden, dass sie die erste Base eines Dinukleotids repräsentieren. Die zweite Base ist durch X₀, X₁, X₂, X₃ charakterisiert, was 16 verschiedene Massenmarker ergibt, wie in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt: Tabelle 3

Dinukleotid Massenmarker	AA M₀X₃	AC M₀X₂	AG M₀X₁	AT M₀X₀
Dinukleotid Massenmarker	CC M₁X₂	CA M₁X₃	CG M₁X₁	CT M₁X₀
Dinukleotid Massenmarker	GG M₂X₁	GA M₂X₃	GC M₂X₂	GT M₂X₀
Dinukleotid Massenmarker	TT M₃X₀	TA M₃X₃	TC M₃X₂	TG M₃X₁

Jeder Massenmarker hat eine von 7 verschiedenen Massen, die in dem ersten Massenanalysator eines Tandem-Instruments selektiert werden können. Die Kollisionsprodukte, die in dem zweiten Massenanalysator identifiziert werden, identifizieren das Dimer. So ist es mit acht Massenmarker-Komponenten möglich, 16 Massenmarker zu erzeugen. Das volle zweidimensionale Massenspektrum all dieser Marker in 19 gezeigt – Massenspektrum 9. Ähnlich würden, wenn 256 Massenmarker erforderlich sind, zwei Sätze von 16 Komponenten, d.h. M₀ bis M₁₅, und X₀ bis X₁₅, ausreichend Marker erzeugen, wobei jeder Marker eine von 31 verschiedenen Massen aufweisen würde.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ist es auch möglich, Matrizes von Sätzen von Massenmarkern unter Verwendung von Massenreihen-modifizierenden Gruppen zu erzeugen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann ein Satz von Markern, wobei jeder Marker in dem Satz die gleiche Masse aufweist, aber durch SRM aufgelöst werden kann, zu einem zusätzlichen Satz von Markern erweitert werden, in dem jedes Mitglied des Satzes an eine Massenreihen-modifizierende Gruppe geknüpft wird, welche die Masse jedes Mitglieds des Satzes um eine vorbestimmte Menge verschiebt, wodurch ein zweiter Satz von Markern erzeugt wird, dessen Gesamtmasse von dem ersten Satz verschieden ist. So würden zwei verschiedene Sätze von Massenmarker-Ionen durch SIM im ersten Quadrupol eines Massenanalysators torgesteuert werden, und die Kollisionsprodukte würden dann in dem dritten Quad durch Kontrollieren der gleichen Fragmentspezies beider Sätze von Markern analysiert werden. Wie ersichtlich, können so viele verschiedene Sätze von Markern erzeugt werden, wie sie bequem in einem Massenspektrometer analysiert werden können, indem verschiedene Massenreihen-modifizierende Gruppen erzeugt werden.
Massenreihen-modifizierende Gruppen (S) sind bevorzugt gegen Fragmentierung beständige Gruppen, so dass jede Gruppe S, wenn sie an jedes Mitglied eines Satzes von Markern geknüpft wird, einen neuen Satz von Markern erzeugt, der eindeutig bezüglich jedes anderen in einer Matrix derartiger Marker aufgelöst werden kann. In diesem Zusammenhang bedeutet auflösbar, dass jeder Satz von Markern in der Matrix vorzugsweise von jedem anderen Satz durch mindestens etwa 4 Dalton getrennt ist. Dies dient dazu, sicherzustellen, dass Isotopen-Peaks aus einem Marker im Massenspektrum mit jenen eines anderen Markers nicht überlappen. In bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung sind die Gruppen S substituierte oder unsubstituierte cyclische Gruppen, wie Arylgruppen, Cycloalkylgruppen und heterocyclische Gruppen, die bevorzugt durch eine Etherbindung an Mitglieder eines Satzes von durch SRM auflösbaren Massenmarkierungsgruppen geknüpft sind. Jeder Satz in der Matrix kann die gleiche Gruppe S aufweisen, die jedoch einen verschiedenen Substitutionsgrad aufweist, um sicherzustellen, dass sich jeder Satz von allen anderen Sätzen unterscheidet. Ein Beispiel für eine Matrix derartiger Marker ist in 6 gezeigt. In dieser Matrix werden F-Atome als Substituenten (Einstellungs-Einheiten) verwendet, aber andere Substituenten, wie Methylgruppen, könnten ebenfalls verwendet werden. Es sollte klar sein, dass eine Matrix derartiger Marker sehr ähnliche Auswirkungen auf die Mobilität jeglicher zugehöriger Analyten-Moleküle aufweisen wird.
Zusätzliche Sätze von Markern könnten unter Verwendung von Methyl-substituierten Phenylgruppen und auch Phenylgruppen, die sowohl mit Methyl- als auch Fluorgruppen substituiert sind, zu einer derartigen Matrix hinzugefügt werden. Methylgruppen unterscheiden sich bezüglich der Masse von Fluorgruppen um etwas weniger als 4 Dalton, und so könnte eine signifikante Matrix von Markern erzeugt werden, deren Auswirkung auf die Mobilität von zugehörigen Analyten minimal wäre.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts dieser Erfindung sind die Gruppen S Oligomere und Polymere von cyclischen Gruppen, wie Arylgruppen, Cycloalkylgruppen und heterocyclischen Gruppen, die auch substituiert sein können. Speziell sind bevorzugte Gruppen S Polyarylether. Ein Beispiel für eine derartige Matrix ist in 7 gezeigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung können die oben beschriebenen Prinzipien weitergeführt werden, indem Analyten mit einer einzigartigen Kombination der Massenmarker der vorliegenden Erfindung markiert werden. Wie oben erwähnt, wird diese Ausführungsform als Mischungsmodus-Markierung bezeichnet. Wenn irgendein einzelner Analyt einer großen Zahl identifiziert werden muss, z.B. in der kombinatorischen Chemie, wird eine Mischung von Markern, z.B. M₀X₃, M₁X₂, M₂X₁, M₃X₀, gewählt. Die Mischung wird so an einem Analyten angebracht, dass eine bestimmte Menge jedes Markers vorliegt, zum Beispiel aM₀X₃ + bM₁X₂ + cM₂X₁ + dM₃X₀, wobei a = b = c = d = 1 (5). Wenn gleiche Teile von vier Massenmarkern (a = b = c = d = 0,25) in derselben Reaktion an einen Analyten gekuppelt werden, würde die chemische Verknüpfungsreaktion zwischen ihnen nicht unterscheiden. Wenn ein Oligonukleotid markiert wird, ist das Oligo mit mehr als einem Marker pro Nukleotid oder Oligonukleotid massenmarkiert.
Man betrachte drei Massenmarker der in der nachstehenden Tabelle 4 gezeigten Form: Tabelle 4
worin "*" ²H- oder ¹³C-Isotope an der markierten Position darstellen kann. Es sollte klar sein, dass verschiedene Substituenten verwendet werden können, wie beispielsweise Fluor- oder Methylgruppen Ein Mischungsmodus ist so, wie der in 8 gezeigte. Acht verschiedene Muster können durch eine Kombination der Anwesenheit oder Abwesenheit eines bestimmten Markers in einer Mischung, die an ein Analyten-Molekül gekuppelt wird, erzeugt werden.
Man betrachte eine andere Art von Muster, bei dem die Verhältnisse jedes von fünf Markern variiert werden, wenn sie an ihren zugehörigen Analyten gekuppelt werden, wie in der nachstehenden Tabelle 5 gezeigt: Tabelle 5

P O R S T

2 2 2 2 2

2 2 2 1 2

2 2 2 0 2

2 2 1 2 2

... ... ... ... ...

0 0 1 0 2

0 0 0 2 2

0 0 0 1 2

0 0 0 0 2
Mit vier Massenmarkern, P, Q, R und S, die in drei verschiedenen Verhältnissen, d.h. keinem, 1 oder 2, vorliegen können, gibt es effektiv drei verschiedene Einheiten für jeden Marker, was bedeutet, dass es 81 mögliche verschiedene Massenspektrumsmuster gibt, die erzeugt werden können. Es ist vorzuziehen, dass auch einer dieser Marker vorhanden ist, dessen Verhältnis zu den anderen Komponenten konstant bleibt (T), um als interner Marker zu dienen, mit dem das Massenspektrometer-Datensystem die relativen Verhältnisse von P, Q, R und S vergleichen kann. Dies bedeutet, dass mit einer Mischung von fünf Markern alle 64 Kombinationen von natürlichen Nukleotiden in einem 3-mer-Oligonukleotid identifiziert werden könnten.
In dem obigen Beispiel können P, Q, R, S und T Marker der Form sein, die in 3 gezeigt ist, demgemäß haben fünf Marker die gleiche Masse und können aus Hintergrund-Kontaminanten z.B. im ersten Quadrupol eines Triele-Quadrupols oder eines Q-TOF-Instruments torgesteuert werden. Das Fragmentierungsmuster, das als Ergebnis einer Kollision mit einem Badgas im zweiten Quadrupol eines Triele-Quadrupols gebildet wird, und der Nachweis im dritten Quadrupol sind in 9 gezeigt.
Es ist ersichtlich, dass das Prinzip ausgedehnt werden kann. In einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, unter Verwendung der obigen Strategie die 256 möglichen 4-mere zu markieren. Es ist notwendig, sieben verschiedene Marker zu erzeugen, die dann in allen der oben gezeigten möglichen Kombinationen von Verhältnissen gemischt werden können. Alternativ können, wenn die Marker die Form aufweisen, die in 6 oder 7 gezeigt ist, 4 Sätze von 81 Codierungen der Art, die im obigen Beispiel gezeigt ist, durch Verwendung von 4 verschiedenen Massenreihen-modifizierenden Gruppen erzeugt werden, um verschiedene Sätze von fünf Markern zu erzeugen, wie in 6 gezeigt. Dies erzeugt ausreichend Marker, um alle möglichen 256 4-mere zu codieren.
Das Prinzip dieses Aspekts der Erfindung kann noch weiter ausgedehnt werden. Man betrachte eine Bibliothek von DNA-4-meren, die alle 256 möglichen Kombinationen der natürlichen Nukleotide umfasst. Jedes 4-mer in der Reihe kann als eine Zahl von 1 bis 256 dargestellt werden, d.h. AAAA wäre 1 und AAAC wäre 2, bis zu TTTT, das 256 wäre.

Die Zahlen 1 bis 256 könnten in binärer Form in dargestellt werden, z.B. auf die Weise, wie Zahlen im Speicherregister eines Computers dargestellt werden könnten. In einem Zählwerk gibt es eine Reihe von Schaltern, welche die Zahlen 2⁸, 2⁷, 2⁶, 2⁵, 2⁴, 2³, 2², 2¹ und 2⁰ darstellen. Um irgendeine der Zahlen von 1 bis 256 darzustellen, werden die Schalter ein- und ausgeschaltet, so dass die Summe der binären Potenzen die ursprüngliche Dezimalzahl darstellt, wie in der nachstehenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6

	2⁸	2⁷	2⁶	2⁵	2⁴	2³	2²	2¹	2⁰
1	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Ein
2	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Ein	Aus
3	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Ein	Ein
4	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Ein	Aus	Aus
...	...	...	...	...	...	...	...	...	...
255	Aus	Ein	Ein	Ein	Ein	Ein	Ein	Ein	Ein
256	Ein	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus	Aus

Eine analoge Darstellung dieser Zahlen kann mit Massenmarker-Molekülen erzielt werden, wobei jeder Schalter in dem Zählwerk durch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Moleküls dargestellt wird. So könnte man, um ein 4-mer zu identifizieren, das 4-mer mit der Mischung von Markern markieren, welche die Zahl darstellt, die das 4-mer identifiziert, z.B. kann, wenn AACG durch die Zahl 7 dargestellt wird, dieses durch Markieren des 4-mers mit einer Mischung eines Moleküls, das 2² darstellt, mit Molekülen, die 2¹ und 2⁰ darstellen, identifiziert werden.
Praktisch gesprochen können diese Moleküle als eine Reihe von Molekülen auf der Basis eines Kern-Moleküls dargestellt werden, welches mit verschiedenen Zahlen eines speziellen Substituenten oder Isotops substituiert ist, z. B. verschiedenen Zahlen einer Masseneinstellungseinheit, wie Fluoratome oder verschiedene Deuterium-Isotope. So kann 2⁰ durch das Kernmolekül ohne Fluor-Substituenten dargestellt werden, 2¹ kann durch das Kernmolekül mit 1 Fluor-Substituent dargestellt werden, und ähnlich kann 2⁸ durch das Kernmolekül mit 8 Fluor-Subsituenten dargestellt werden. Wenn diese Moleküle durch Massenspektrometrie analysiert werden, können sie mit einer komplementären Komponente kombiniert werden, was 9 isobare Markierungen ergibt, die in einem Tandem-Instrument analysiert werden können.
So kann im Fall des 4-mers AACG dieses Oligo mit Markern 0, 1 und 2 aus den oben gezeigten Markern markiert werden. Wie ersichtlich, können alle vier möglichen 4-mere auf diese binäre Weise dargestellt werden und erfordern nur 8 Basismarker, um sie zu identifizieren, wie in 10 gezeigt.
DNA-Sequenzierung unter Verwendung von SRM
Die Analyse von Sanger-Sequenzierungsleitern kann effizient unter Verwendung von Massenmarkern der oben erörterten Form bewirkt werden. Die herkömmliche DNA-Sequenzierung gemäß dem Sanger-Verfahren verwendet eine DNA-Polymerase, um zahlreiche Didesoxy/Desoxynulcleotide an Oligonukleotid-Primer zu addieren, die mit einer einzelsträngigen DNA-Matrize auf Matrizen-spezifische Weise hybridisiert werden. Eine statistische Beendigung dieses Prozesses wird erzielt, wenn terminierende Nukleotide, d.h. Didesoxynukleotide, in das Matrizenkomplement eingebaut werden. Eine „DNA-Leiter" wird erzeugt, wenn die statistisch terminierten Stränge auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel oder in einer Kapillare aufgetrennt werden. Die Sequenzinformation wird im Allgemeinen unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese gesammelt, um die terminierten Fragmente bezüglich der Länge aufzutrennen, gefolgt vom Nachweis der „DNA-Leiter". In herkömmlichen halbautomatisierten und automatisierten DNA-Sequenzierern, wie dem ABI 377 von Perkin Elmer oder dem MegaBACE von Molecular Dynamics, werden fluoreszierende Marker F1, F2, F3, F4 verwendet, um die vier terminierenden Basen A, C, G, T entweder durch Einbau des Fluoreszenzmarkers in eines der terminierenden Nukleotide oder den in den Reaktion verwendeten Primer zu identifizieren. Diese Leiter wird dann abgelesen, indem man nach den vier Farbstoffen schaut, die durch einen Detektor, der das Gel scannt, oder eine Kapillare treten. Andere Fluoreszenznachweis-Formate sind möglich.
Sequenzierung einer einzigen Matrize
Im Massenspektrumsverfahren werden die Fluoreszenzmarker gegen Massenmarker ausgetauscht (z.B. M₀X₄; M₁X₃; M₂X₂; M₃X₁; M₄X₀, gezeigt in 3). Der Didesoxy-Terminator für Adenin wird nun mit M₁X₃ markiert. Ähnlich wird der Didesoxy-Terminator für Cytosin nun mit M₂X₂ markiert, der Terminator für Guanosin wird mit M₃X₁ markiert und der Terminator für Thymidin wird mit M₄X₀ markiert. Wenn die Banden aus der Kapillare eluieren, werden sie in-line in die Ionenquelle eines geeigneten Tandem-Massenanalysators, wie eines Triple-Quadrupols, gesprüht, wo die massenmarkierten Nukleinsäuren gemäß einem Aspekt dieser Erfindung analysiert werden. Typisch werden in der Ionenquelle die Marker von der terminierenden Base jedes Fragments in der Leiter abgespalten und treten in den ersten Massenanalysator, Q1, eines Triele-Quadrupols ein. Q1 ist so eingestellt, dass er nur Molekülionen von MX torsteuert, während Q3 so eingestellt ist, dass er nach den Markern X₀ bis X₄ schaut. Es kann wünschenswert sein, dass eine dieser Massen, z.B. X₄, als interner Standard verwendet werden soll, d.h. sie liegt immer vor, und X₀, X₁, X₂ und X₃ werden mit Bezug auf X₄ überprüft.
In einer alternativen Vorgehensweise können die vier terminierenden Nukleotide mit den vier in 4 gezeigten Markern so markiert werden, dass der Didesoxy-Terminator für Adenin nun mit M₁X₀ markiert ist. Ähnlich wird der Didesoxy-Terminator für Cytosin nun mit M₂X₀ markiert, der Terminator für Guanosin wird mit M₃X₀ markiert und der Terminator für Thymidin wird mit M₄X₀ markiert. Der Marker M₀X₀ kann als interner Standard verwendet werden, falls gewünscht. In dieser Ausführungsform wird Q1 eines Triele-Quadrupols so eingestellt, dass er die Molekülionen der Marker M₄X₀ bis M₀X₀ torsteuert, während Q3 so eingestellt ist, dass er nach den Markern X₀ schaut.
Zusätzlich zur Nukleotid-Terminator-markierten Sequenzierung kann eine Primermarkierte Sequenzierung durchgeführt werden. Einzelheiten der Primermarkierten Sequenzierung, welche die Massenmarker der vorliegenden Erfindung verwenden kann, werden in der WO 99/02728 bereitgestellt.
Multiplex-Sequenzierung von Matrizen mit Massenmarkern
Die Massenmarker dieser Erfindung ermöglichen, dass mehr als eine Matrize gleichzeitig analysiert wird, da viel mehr als vier Marker entwickelt werden können. Dies bedeutet, dass mehrere Sätze von vier Markern erzeugt werden können, um eine Analyse von mehreren Matrizen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zu ermöglichen, welches auf den Verfahren beruht, die ursprünglich von Sanger erdacht wurden. Einzelheiten mit Bezug auf die Multiplex-Sequenzierung von Nukleinsäure-Matrizen, welche die Massenmarker der vorliegenden Erfindung verwenden können, werden in der WO 99/02728 bereitgestellt.
Massenmarker der in 6 oder 7 gezeigten Form können verwendet werden, um die Analyse von mehreren DNA-Sequenzen zu multiplexen. Jeder Satz von fünf Markern, der im Massenspektrometer bezüglich jedes anderen Satzes durch ein spezifisches Massenreihen-Modifikationsmittel auflösbar ist, kann verwendet werden, um eine einzige Matrize zu identifizieren, wobei ein übriger Marker zur Verwendung als Größen/Mengen-Standard verbleibt, falls gewünscht. Jedoch sind Sätze von vier Markern für die Sequenzierung ausreichend, und Größenstandards sind nicht wesentlich. Es ist so z.B. möglich, die in 6 gezeigte Matrix von 20 Markern zu verwenden, um die Sanger-Reaktionsprodukte von fünf Matrizen gleichzeitig zu analysieren.
Erstellung von Gegenexpressionsprofilen
Es sind verschiedene Verfahren zur Analyse von Populationen von komplementärer DNA entwickelt worden, welche von polyadenylierter Boten-RNA abgeleitet ist. Eine Anzahl dieser Verfahren beruht auf dem Nachweis von Amplifikations- oder Restriktionsprodukten verschiedener Größe durch elektrophoretische Auftrennung von amplifizierten cDNA-Bibliotheken. Im Allgemeinen beruhen diese Techniken auf der Erzeugung charakteristischer Restriktionsfragmente oder Amplifikationsprodukte aus den Mitgliedern einer komplementären DNA (cDNA)-Bibliothek, die von polyadenylierter Boten-RNA abgeleitet ist.
Differential-Display (Laing und Pardee, Science 257, 967-971, 1992) ist die klassische Methode zur Erstellung von Genexpressionsprofilen auf der Basis von Elektrophorese. Entwicklungen der Konzepte dieser Technik sind vorgenommen worden, was verbesserte Nachfolger dieser Technik zum Ergebnis hatte. Die Verfahren zur Erstellung von Epressionsprofilen, die auf der „molekularen Indexierung" unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen vom Typ IIS oder Typ IP beruhen, wie Sibson ( PCT/GB93/0145 ) oder Kato ( EP 0 735 144 A1 ), sind Beispiele für eine Klasse von Nachfolgern. Insbesondere offenbart die WO 98/48047 ein molekulares Indexierungsverfahren auf der Basis von Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CEMS).
In diesem Verfahren werden cDNAs unter Verwendung von verankerten und biotinylierten Polythymidin-Primern synthetisiert, welche sicherstellen, dass alle cDNAs mit einem kurzen Poly-A-Schwanz von festgelegter Länge terminiert sind. In einem cDNA-Präparat mit "verankertem" Primer werden Poly-A-tragende nRNAs eingefangen und unter Verwendung eines Oligonukleotids mit etwa 18 Desoxythymidin-Resten und einer der drei verbleibenden Basen am 3'-Ende den Primer am Ende, um den Poly-A-Abschnitt zu verankern, geprimt. Die Biotinylierung der Primer ermöglicht, dass die cDNAs auf einem avidinierten Festphasen-Träger immobilisiert werden. Diese eingefangenen cDNAs können mit einer Restriktionsendonuklease vom gewöhnlichen Typ II gespalten werden. Dies lässt ein 3'-terminales Restriktionsfragment auf dem festen Träger zurück, während andere Fragmente weggewaschen werden. Ein Adapter wird an das resultierende bekannte klebrige Ende ligiert. Der Adapter ist so konstruiert, dass er die Bindungsstelle für eine Restriktionsendonuklease vom Typ IIs trägt. Diese Enzyme binden an ihre Ziel-Sequenz, spalten aber die darunter liegende DNA bei einer definierten Zahl von Basen entfernt von der Bindungsstelle. Bestimmte dieser Enzyme erzeugen einen gestaffelten Schnitt; fok1 erzeugt z.B. ein zweideutiges 4 bp klebriges Ende. Wenn eine Population von cDNAs mit einem derartigen Enzym behandelt wird, wird das klebrige Ende am Adapter-Terminus jeder cDNA in der Population freigelegt. Eine Familie von Adapter-Molekülen wird verwendet, um diese 4 freigelegten Basen zu sondieren. Bei einem zweideutigen 4 bp klebrigen Ende gibt es 256 mögliche Kandidaten. Um die Sonden zu identifizieren, werden sie mit Massenmarkern unter Verwendung eines spaltbaren Linkers markiert, so dass ein einzigartiger Massenmarker jeden der 256 möglichen 4 bp Adapter identifiziert. Dies hat eine Population von Fragmenten mit variierenden Längen, je nachdem, wo die Restriktionsendonuklease vom gewöhnlichen Typ II sie schneidet, mit einem der 256 möglichen massenmarkierten Adapter am 5'-Terminus der cDNA zum Ergebnis.
Die massenmarkierten 3'-Restriktionsfragmente werden dann auf der Grundlage ihrer Länge unter Verwendung von Kapillarelektrophorese aufgetrennt, gefolgt von der Analyse der Massenmarker, die an die Termini der cDNA-Fragmente ligiert sind. Die CE-Säule speist direkt in ein Elektrospray-Massenspektrometer oder äquivalentes Massenspektrometer ein. Bei der Ionisation im Massenspektrometer werden die Marker von ihren zugehörigen Restriktionsfragmenten abgespalten. Die Menge jedes Massenmarkers, die in jeder Bande vorliegt, welche einer unterschiedlichen Restriktionsfragment-Länge entspricht, und aus der Kapillarelektrophorese-Säule eluiert wird, wird bestimmt. Dieses Verfahren ergibt eine Signatur jeder cDNA, die verwendet werden kann, um eine Datenbank zu durchsuchen.
Diese Technik verwendet bevorzugt 256 Massenmarker. Die Verwendung herkömmlicher Ansätze für die Massenmarkierung hätte eine Matrix von durch etwa 4 Dalton getrennten Massenmarkierungen zum Ergebnis, die einen Massenbereich von mehr als 1000 Dalton überspannen. Es ist unwahrscheinlich, dass eine Matrix derartiger Marker erzeugt werden könnte, bei der alle Markierungen die gleiche Auswirkung auf die Mobilität der zugehörigen cDNA-Restriktionsfragmente hätten. Dies würde bedeuten, dass komplizierte Korrekturalgorithmen verwendet werden müssten, um den Unterschieden in der Mobilität Rechnung zu tragen und eine genaue Bestimmung der Fragmentlänge zu ermöglichen. Die Massenmarkierungen und zugehörigen Massenmarker dieser Erfindung sind jedoch außerordentlich geeignet für das obige Verfahren zur Erzeugung von Matrizes von Massenmarkern, deren Auswirkung auf die Mobilität der zugehörigen Analyten-Moleküle dieselbe ist, was die direkte Bestimmung der Fragmentlänge mit hoher Empfindlichkeit und ausgezeichneten Signal-Rausch-Verhältnissen ermöglicht.
Eine zweite Klasse von Elektrophoresetechniken beruht auf der Verwendung von Restriktionsendonukleasen vom gewöhnlichen Typ II, die verwendet werden, um Primer-Sequenzen in cDNA-Restriktionsfragmente einzuführen. Die PCR-Amplifikation mit markierten Primern führt zu der Erzeugung von spezifischen Restriktionsfragmenten, die verwendet werden können, um ihre zugehörige mRNA zu identifizieren. Derartige Verfahren umfassen jenes, das in der US 5,712,126 beschrieben ist, welche ein Verfahren zur Einführung von Adaptern in mit Restriktionsendonuklease verdaute cDNA-Fragmente, die eine selektive Amplifikation ermöglichen, und zur Markierung von 3'-terminalen cDNA-Fragmenten offenbart. Ähnlich offenbart die WO 99/02727 ein Verfahren zur Amplifikation von 3'-terminalen Restriktionsfragmenten unter Verwendung von Festphasen-Trägern und PCR-Primern, welche die unbekannte Sequenz sondieren, die einer bekannten Restriktionsstelle benachbart ist. Bei dieser Technik werden cDNAs unter Verwendung biotinylierter Anker-Primer hergestellt, was sicherstellt, dass alle cDNAs mit einem kurzen Poly-A-Schwanz festgelegter Länge terminiert sind und auf einem Festphasen-Substrat immobilisiert werden können. Der Poly-T-Primer kann zusätzlich eine Primersequenz an seinem 5'-Terminus tragen. Die eingefangenen cDNAs werden dann mit einer Restriktionsendonuklease vom gewöhnlichen Typ II gespalten. Ein Adapter wird an das resultierende bekannte klebrige Ende ligiert. Der Adapter ist so konstruiert, dass er eine Primersequenz trägt. Das resultierende doppelsträngige Konstrukt wird dann denaturiert. Der Strang, der nicht immobilisiert ist, kann weggewaschen werden, falls gewünscht. Eine Familie von Primern, die komplementär zu dem Adapter-Primer sind, mit einer Überlappung von 4 Basen in die unbekannte Sequenz hinein, die dem Adapter-Primer benachbart ist, wird zu der denaturierten Mischung gegeben. Bei einer 4-Basen-Überlappung gibt es 256 mögliche Primer. Um die Sonden zu identifizieren, werden sie mit Massenmarkern unter Verwendung eines spaltbaren Linkers markiert, so dass jede der 256 möglichen 4 bp-Überlappungen durch einen Marker identifiziert ist, der in einem Massenspektrometer einzigartig identifizierbar ist. Dies hat eine Population von Fragmenten mit variierenden Längen, je nachdem, wo die Restriktionsendonuklease vom gewöhnlichen Typ II sie schnitt, und mit einem von 256 möglichen massenmarkierten Primern am 5'-Terminus der cDNA zum Ergebnis. Der Zyklus von Denaturierung und Primer-Verlängerung kann so oft durchgeführt werden, wie gewünscht. Wenn nur die Adapter-Primerstellen verwendet werden, kann eine lineare Amplifikation durchgeführt werden. Dies verursacht eine kleinere Verzerrung der cDNA-Quantifizierung als eine exponentielle Amplifikation. Wenn eine exponentielle Amplifikation gewünscht wird, müssen die Poly-T-Oligos, die zum Einfangen der nRNAs verwendet werden, ebenfalls eine Primerstelle tragen. Eine exponentielle Amplifikation kann trotz des Potentials für Verzerrungen der cDNA-Häufigkeiten wünschenswert sein, wenn kleine Gewebeproben analysiert werden müssen.
Wiederum werden die massenmarkierten 3'-Restriktionsfragmente auf der Grundlage der Länge unter Verwendung von Kapillarelektrophorese der Restriktionsfragmente aufgetrennt, gefolgt von der Analyse der Massenmarker an den Termini der cDNA-Fragmente. Diese Technik wird wie jene, die in der WO 98/48047 offenbart ist, vorzugsweise mit 256 Massenmarkern durchgeführt und würde so auf die gleiche Weise von den vorteilhaften Merkmalen der Massenmarker dieser Erfindung profitieren.
Demgemäß wird in einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ein Analyseverfahren bereitgestellt, welches die Schritte umfasst:

1. Bereitstellen einer Population von massenmarkierten Nukleinsäure-Fragmenten verschiedener Längen, wobei die Massenmarker ein Merkmal der markierten Nukleinsäuren anzeigen.
2. Auftrennen der markierten Fragmente auf der Grundlage ihrer Größe.
3. Entfernen der Massenmarker von den markierten Fragmenten.
4. Nachweisen der Massenmarker in einem Massenspektrometer.

In gewissen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung bestimmt der Assay die Sequenz von Nukleinsäure oder einer Reihe von Nukleinsäuren. In Sequenzierungs-Ausführungsformen, die auf der Erzeugung von Sanger-Leitern beruhen, identifiziert der Massenmarker das terminierende Nukleotid jedes Fragments und jedes Fragment wird durch einen Satz von vier Markern identifiziert. Bei Sanger-Sequenzierungs-Ausführungsformen werden die Marker als massenmarkierte Primer oder markierte terminierende Nukleotide eingeführt.
In anderen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung wird der Assay verwendet, um die Identität und Quantität von exprimierten RNA-Molekülen zu bestimmen. In bevorzugten Ausführungsformen werden die massenmarkierten Nukleinsäuren gemäß den Verfahren erzeugt, die in der W 98/48047 oder WO 99/02727 offenbart sind. In Ausführungsformen, welche diese Verfahren verwenden, werden Massenmarker durch Ligieren der massenmarkierten Adapter bzw. durch Verlängerung der massenmarkierten Primer in die Nukleinsäure-Fragmente hinein eingeführt. Dem gewöhnlichen Fachmann sollte klar sein, dass andere Verfahren der Erstellung von Genexpressionsprofilen auf der Grundlage der Größe von Nukleinsäure-Fragmenten, wie jene, die in der PCT/GB93/0145 , EP-A-0 735 144 oder US 5,712,126 offenbart sind, zur Verwendung mit den Markern dieser Erfindung angepasst werden können.
In bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird der Schritt der Auftrennung der Analyten auf der Grundlage ihrer Größe unter Verwendung von Kapillarelektrophorese oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt, wobei man z.B. Systeme wie jene verwendet, die von Transgenomic, Inc. (San Jose, California, USA.) bereitgestellt und in der US 5,585,236 , US 5,772,889 und anderen Anmeldungen offenbart werden. Bevorzugt wird die Auftrennung online mit einem Massenspektrometer durchgeführt.
In bevorzugten Ausführungsformen findet der Schritt der Entfernung der Massenmarker von ihren zugehörigen Analyten innerhalb der Ionenquelle des Massenspektrometers statt. Linker, welche erlauben, dass ein Massenmarker leicht von seinem zugehörigen Analyten in einer Massenspektrometer-Ionenquelle abgespalten wird, sind in der PCT/GB98/00127 offenbart. Verbindungen, welche die Empfindlichkeit des Nachweises eines Massenmarkers durch Massenspektrometrie verbessern, sind in der PCT/GB98/00127 offenbart.
Es sollte dem gewöhnlichen Fachmann klar sein, dass andere Größenauswahl-Assays zur Verwendung mit den Massenmarkern dieser Erfindung angepasst werden könnten, einschließlich beispielsweise des Multiplex-Genotypisierungs-Assays, der von Grossman P.D. et al. in Nukleic Acids Research 1994 Okt. 25; 22(21):4527-34 offenbart ist. Dieser Assay würde in großem Maß von der Möglichkeit profitieren, zu höheren Ordnungen zu multiplexen und immer noch die Größe der Fragmente leicht aufzulösen.
Erstellung von Protein-Expressionsprofilen und zweidimensionale Gelektrophorese
Techniken für die Erstellung von Proteinenprofilen, d.h. die Katalogisierung der Identitäten und Quantitäten aller in einem Gewebe exprimierten Proteine, sind in Bezug auf Automatisierung oder Durchsatz nicht gut entwickelt. Das klassische Verfahren zur Erstellung eines Profils einer Population von Proteinen erfolgt durch zweidimensionale Elektrophorese (R.A. Van Bogele., E.R. Olson, "Application of two-dimensional Protein gels in biotechnology", Biotechnol. Ann. Rev., 1:69-103, 1995). In diesem Verfahren wird eine Proteinprobe, die aus einer biologischen Probe extrahiert wurde, auf einem engen Gelstreifen aufgetrennt. Die erste Auftrennung trennt gewöhnlich Proteine auf der Grundlage ihres isoelektrischen Punkts. Der gesamte Gelstreifen wird dann gegen einen Rand eines rechteckigen Gels, wie eines Polyacrylamidgels, gelegt. Die aufgetrennten Proteine in dem Streifen werden dann elektrophoretisch in dem zweiten Gel auf der Grundlage ihrer Größe aufgetrennt, z. B. durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Diese Methode ist langsam und sehr schwierig zu automatisieren. Sie ist in ihren einfachsten Ausführungsformen auch relativ unempfindlich. Wenn die Auftrennung beendet ist, müssen die Proteine sichtbar gemacht werden. Dies beinhaltet typisch das Anfärben des Gels mit einem Reagenz, das visuell oder durch Fluoreszenz nachgewiesen werden kann. Radiomarkierung und Autoradiographie werden ebenfalls verwendet. In anderen Verfahren können Fluoreszenzfarbstoffe vor der Auftrennung kovalent an Proteine in einer Probe geknüpft werden. Eine kovalente Addition eines Farbstoffs kann die Mobilität eines Proteins ändern und deshalb ist dies manchmal weniger bevorzugt, insbesondere, wenn Vergleiche mit öffentlichen Datenbanken von zweidimensionalen Gelbildern vorzunehmen sind. Nach Sichtbarmachung der Proteine in einem Gel ist es gewöhnlich notwendig, die Proteine in speziellen Flecken auf dem Gel zu identifizieren. Dies wird typisch vorgenommen, indem man die Flecken aus dem Gel herausschneidet und die Proteine aus der Gelmatrix extrahiert. Die extrahierten Proteine können dann durch eine Anzahl von Techniken identifiziert werden. Bevorzugte Techniken beinhalten den Verdau des Proteins, gefolgt von Mikrosequenzierung. Eine Anzahl von Verbesserungen ist vrogenommen worden, um die Auftrennung von Proteinen durch 2-D-Gelektrophorese zu steigern und die Empfindlichkeit des Systems zu verbessern. Ein Verfahren, um die Empfindlichkeit der 2-D-Gelektrophorese und ihre Auftrennung zu verbessern, besteht darin, das Protein in speziellen Flecken auf dem Gel durch Massenspektrometrie zu analysieren (Jungblut P., Thiede B. "Protein identification from 2-D gels by MALDI mass spectrometry", Mass Spectrom. Rev. 16, 145-162, 1997). Bei einem derartigen Verfahren handelt es sich um tryptischen Verdau im Gel, gefolgt von der Analyse der tryptischen Fragmente durch Massenspektrometrie, um einen Peptidmassen-Fingerabdruck zu erzeugen. Wenn eine Sequenzinformation erforderlich ist, kann eine Tandem-Massenspektrometrieanalyse durchgeführt werden.
Derzeit ist eine 2-D-Analyse ein relativ langsames „Chargen"-Verfahren. Es ist auch nicht sehr gut reproduzierbar und es ist teuer, ein Gel zu analysieren. Da die meisten Kosten in einer auf Gel basierenden Analyse in der Handhabung jedes Gels liegen, wäre es wünschenswert, in der Lage zu sein, eine Anzahl von Proben auf einem 2-D-Gel gleichzeitig zu multiplexen. Wenn es möglich wäre, die Proteine in verschiedenen Proben mit einer unterschiedlichen, unabhängig nachweisbaren Markierung zu markieren, könnten die Proteine in jeder Probe gleichzeitig auf demselben Gel analysiert werden. Dies wäre insbesondere bei Untersuchungen wertvoll, bei denen es wünschenswert ist, dem Verhalten der gleichen Proteine in einem speziellen Organismus zu mehreren Zeitpunkten zu folgen, z.B. durch Überwachung, wie ein Bakterium auf einen Arzneistoff über einen vorbestimmten Zeitverlauf reagiert. Ähnlich wäre der Vergleich von Biopsiematerial von mehreren Patienten mit der gleichen Krankheit mit entsprechenden Kontrollen wünschenswert, um sicherzustellen, dass das gleiche Protein aus verschiedenen Proben am gleichen Fleck auf dem Gel ankommen würde. Das Laufenlassen aller Proben auf demselben Gel würde ermöglichen, dass verschiedene Proben verglichen werden können, ohne dass man Bedenken wegen der Reproduzierbarkeit der Auftrennung auf dem Gel haben müsste. Um dies zu erreichen, ist eine Reihe von Markern erforderlich, deren Auswirkung auf die Mobilität der Proteine in verschiedenen Proben dieselbe ist, so dass ein spezielles Protein, das mit einem unterschiedlichen Marker in jeder Probe markiert ist, immer noch an der gleichen Position im Gel ankommen würde, unabhängig von seinem Marker.
In jüngerer Zeit sind Versuche unternommen worden, die Massenspektrometrie auszunutzen, um ganze Proteine zu analysieren, die durch Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese fraktioniert worden sind (Dolnik V. "Capillary zone electrophoresis of Proteins", Electrophoresis 18, 2353-2361, 1997). In-line-Systeme, welche Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie ausnutzen, sind getestet worden. Die Analyse von ganzen Proteinen durch Massenspektrometrie leidet jedoch an einer Anzahl von Schwierigkeiten. Die erste Schwierigkeit ist die Analyse der komplexen Massenspektren, die eine Folge der Mehrfachionisationszustände sind, welche durch einzelne Proteine zugänglich sind. Der zweite größere Nachteil ist, dass die Massenauflösung von Massenspektrometern derzeit für Spezies mit hohem Molekulargewicht, d.h. für Ionen, die eine größere Masse als etwa 4 kDalton aufweisen, ziemlich schlecht ist, so dass die Auflösung von Proteinen, deren Massen eng beieinander liegen, schwierig ist. Ein dritter Nachteil ist, dass die weitere Analyse von ganzen Proteinen mittels Tandem-Massenspektrometrie schwierig ist, da die Fragmentierungsmuster von ganzen Proteinen äußerst kompliziert und schwierig zu interpretieren sind.
Die PCT/GB98/00201 und PCT/GB99/03258 beschreiben Verfahren zur Charakterisierung von komplexen Mischungen von Proteinen durch Isolieren von C-termi nalen Peptiden aus den Proteinen in den Mischungen und Analysieren derselben durch Massenspektrometrie. Die beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um zu bestimmen, ob Proteine in der Probe anwesend oder abwesend sind, würden aber keine Vergleichsdaten zwischen Proben liefern. Die Verfahren beschreiben keine Techniken für die gleichzeitige Analyse von mehreren Proben, welche für den quantitativen Vergleich von Proteinexpressionsniveaus in mehreren Proben erforderlich wäre.
Die EP-A-0 594 164 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung eines C-terminalen Peptids aus einem Protein mit einer Methode, welche die Sequenzierung des C-terminalen Peptids unter Verwendung von N-terminalen Sequenzierungsreagenzien ermöglicht. In diesem Verfahren wird das interessierende Protein mit einer Endopeptidase verdaut, welche an der C-terminalen Seite von Lysinresten spaltet. Die resultierenden Peptide werden mit DITC-Polystyrol umgesetzt, das mit allen freien Aminogruppen reagiert. N-terminale Aminogruppen, die mit dem DITC-Polystyrol reagiert haben, können mit Trifluoressigsäure (TFA) abgespaltet werden, was so den N-Terminus aller Peptide freilegt. Die epsilon-Aminogruppe von Lysin wird jedoch nicht gespalten und alle nicht-terminalen Peptide werden so auf dem Träger zurückgehalten und nur C-terminale Peptide werden freigesetzt. Gemäß diesem Dokument werden die C-terminalen Peptide für eine Mikrosequenzierung gewonnen.
Nature Biotechnology 17:994-999 (1999) offenbart die Verwendung von "isotopen-codierten Affinitätsmarkierungen" für das Einfangen von Peptiden aus Proteinen, um eine Proteinexpressionsanalyse zu ermöglichen. In diesem Aufsatz beschreiben die Autoren die Verwendung eines Biotin-Linkers, der mit Thiolen reagieren kann, um Cystein enthaltende Peptide einzufangen. Eine Probe von Protein aus einer Quelle wird mit dem Biotin-Linker umgesetzt und mit einer Endopeptidase gespalten. Die biotinyliertes Cystein enthaltenden Peptide können dann auf avidininierten Perlen für eine anschließende Analyse durch Massenspektrometrie isoliert werden. Zwei Proben können quantitativ verglichen werden, indem man eine Probe mit dem Biotin-Linker markiert und die zweite Probe mit einer deuterierten Form des Biotin-Linkers markiert. Jedes Peptid in den Proben wird dann als ein Paar Peaks im Massenspektrum dargestellt, wobei die relativen Peak-Höhen die relativen Expressionsniveaus anzeigen.
Das Verfahren in dieser Veröffentlichung weist eine Anzahl von Beschränkungen auf. Von den verschiedenen Beschränkungen dieses „Isotopen-Codierungs"-Verfahrens ist die erste, dass man sich auf die Anwesenheit von Thiolen in einem Protein verlässt – viele Proteine weisen keine Thiole auf, während andere mehrere aufweisen. In einer Abwandlung dieses Verfahrens können Linker so konstruiert werden, dass sie mit anderen Seitenketten, wie Aminen, reagieren, aber da viele Proteine mehr als einen Lysinrest enthalten, werden bei dieser Vorgehensweise mehrere Peptide pro Protein isoliert. Es ist wahrscheinlich, dass dies die Komplexität der Probe für eine Analyse durch Massenspektrometrie nicht ausreichend verringern würde. Eine Probe, die zu viele Spezies enthält, leidet mit Wahrscheinlichkeit an „Ionen-Suppression", bei der gewisse Spezies bevorzugt gegenüber anderen Spezies ionisieren, welche normalerweise im Massenspektrum einer weniger komplexen Probe erscheinen würden. Allgemein kann das Einfangen von Proteinen mittels ihrer Seitenketten entweder zu viele Peptide pro Protein ergeben oder gewisse Proteine werden überhaupt nicht erfasst.
Die zweite Beschränkung dieses Ansatzes liegt in dem Verfahren, das verwendet wird, um die Expressionsniveaus von Proteinen aus verschiedenen Proben zu vergleichen. Die Markierung jeder Probe mit einer uinterschiedlichen Isotopenvariante der Affinitätsmarkierung hat einen zusätzlichen Peak im Massenspektrum jedes Peptids in der Probe zur Folge, was bedeutet, dass, wenn zwei Proben zusammen analysiert werden, es zweimal so viele Peaks im Spektrum gibt. Ähnlich ist, wenn drei Proben zusammen analysiert werden, das Spektrum dreimal komplexer als bei einer Probe allein. Es könnte möglich sein, den Vergleich von zwei oder drei Proben durch diesen Ansatz zu versuchen, aber dies kann sehr gut die Grenze sein, da jede Zunahme der Zahl von Peaks die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass zwei verschiedene Peptide überlappende Peaks im Massenspektrum aufweisen.
Eine weitere Beschränkung, die von den Autoren der obigen Veröffentlichung mitgeteilt wird, ist die Mobilitätsänderung, die durch die Markierungen verursacht wird. Die Autoren teilen mit, dass Peptide, die mit der deuterierten Biotin-Markierung markiert sind, etwas nach dem gleichen Peptid eluieren, das mit der undeuterierten Markierung markiert ist.
Im Hinblick auf das Vorstehende ist es ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Identität und relativen Mengen von Polypeptiden in einer Anzahl von Proben von komplexen Polypeptidmischungen gleichzeitig zu bestimmen. Es ist ein weiteres Ziel dieses Aspekts der Erfindung, sicherzustellen, dass alle Proteine in der Analyse dargestellt werden. Es ist auch ein Ziel dieses Aspekts der Erfindung, Massenmarker und Techniken bereitzustellen, welche erlauben, dass mehrere Proben gleichzeitig und quantitativ ohne signifikante Zunahme der Komplexität des Massenspektrums im Vergleich zum Spektrum, das aus einer einzigen Probe allein erhalten würde, analysiert werden. Es ist schließlich ein Ziel dieses Aspekts der Erfindung, Marker bereitzustellen, welche die gleiche Auswirkung auf die Mobilität des markierten Peptids aufweisen, so dass Proben des gleichen Peptids, die mit verschiedenen Markierungen markiert sind, nach einer chromatographischen Auftrennung zusammen eluiert werden.
Demgemäß stellt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Proteinprobe bereit, die mehr als ein Protein enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

1. Markieren von Peptiden, Polypeptiden und/oder Proteinen in der Probe mit mindestens einem einzeln auflösbaren Massenmarker aus den Sätzen und Matrizes dieser Erfindung, so dass jedes Peptid, Polypeptid und/oder Protein mit einem Marker oder einer Kombination von Markern markiert ist, welche(r) für das Protein einzigartig sind.
2. Analysieren der markierten Peptide, Polypeptide und/oder Proteine mittels Massenspektrometrie, bevorzugt gemäß einem Aspekt dieser Erfindung, z.B. Tandem-Massenspektrometrie, um die an den Proteinen angebrachten Marker nachzuweisen. Die markierten Proteine in der Probe können dann identifiziert und ihre relativen Expressionsniveaus bestimmt werden.

Es wird bevorzugt, dass mehrere Proben dem obigen Verfahren unterzogen werden. Es wird weiter bevorzugt, dass bei jeder einer Anzahl von Proben vor dem obigen Markierungsschritt (1) Peptide aus Polypeptiden in der Mischung unter Verwendung eines Spaltungsmittels, insbesondere eines Sequenz-spezifischen Spaltungsmittels, isoliert werden. Nach dem Markierungsschritt (1) können die Proben gepoolt werden, falls gewünscht. Gegebenenfalls können nach dem Markierungsschritt (1) und/oder Poolen der Proben die Peptide, Polypeptide und/oder Proteine in der Probe oder den Proben durch Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Flüssigkeitschromatographie oder andere vorzugsweise aufgetrennte Fraktionen erzeugende Mittel aufgetrennt werden. Diese Fraktionen können Bänder oder Flecken auf einem Gel oder flüssige Fraktionen aus einer chromatographischen Auftrennung sein. Fraktionen aus einer Auftrennung können weiter unter Verwendung einer zweiten Auftrennungstechnik aufgetrennt werden. Ähnlich können weitere Fraktionen wiederum fraktioniert werden, bis die Proteine für die anschließenden Analysenschritte ausreichend aufgetrennt sind.
Dieser Aspekt der Erfindung stellt demgemäß eine weitere Anwendung der oben beschriebenen Marker und Verfahren dieser Erfindung bereit. Ein Satz oder eine Matrix von Markern der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um den Durchsatz einer 2-D-Gelektrophorese-Analyse der Proteine in einem Organismus zu erhöhen. Jeder der Massenmarker ändert die Mobilität seines zugehörigen Proteins auf die gleiche Weise, ist aber immer noch unabhängig nachweisbar. Bei bekannten Verwendungen von Massenspektrometrie, um Proteine aus einem 2-D-Gel zu analysieren, wie die Erstellung von Peptidmassen-Fingerabdrücken, ist es erforderlich, dass die Proteine aus dem Gel extrahiert werden und gereinigt werden, um Detergenzien, wie SDS, und andere Verunreinigungen aus dem Gel zu entfernen. Die Marker dieser Erfinder ermöglichen, dass ein relativ ungereinigter Extrakt von Proteinen aus dem Gel direkt in das Massenspektrometer eingeführt werden kann, und die zugehörigen Marker können dann durch die Verfahren dieser Erfindung vor einem Hintergrund von kontaminierendem Material identifiziert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung werden mehrere Proben dem folgenden Verfahren unterzogen:

1. Isolieren von Peptiden aus Polypeptiden in der Mischung unter Verwendung von Sequenz-spezifischen Spaltungsreagenzien bei jeder einer Anzahl von Proben;
2. Markieren der isolierten Peptide in jeder Probe mit den Markern dieser Erfindung, so dass jede Probe durch einen einzigartigen Marker identifiziert wird;
3. Poolen der markierten Proben;
4. Gegebenenfalls chromatographische oder elektrophoretische Auftrennung der gepoolten und markierten Peptide;
5. Analysieren dieser markierten Proben durch Tandem-Massenspektrometrie, um die markierten Peptide in der Probe zu identifizieren und ihre relativen Expressionsniveaus zu bestimmen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung stellt ein Verfahren zur Analyse einer Reihe von Proteinproben bereit, wobei jede Probe mehr als ein Protein enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

1. Kovalentes Umsetzen der Proteine jeder der Proben mit mindestens einem getrennt auflösbaren Massenmarker aus den Sätzen und Matrizes dieser Erfindung, so dass die Proteine jeder Probe mit einem oder mehreren Massenmarkern markiert sind, die sich von den Markern unterscheiden, die mit den Proteinen jeder anderen Probe umgesetzt wurden.
2. Poolen der massenmarkierten Proben.
3. Auftrennen der gepoolten Proben durch Gelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Flüssigchromatographie oder andere geeignete Mittel, um getrennte Fraktionen zu erzeugen. Diese Fraktionen können Bänder oder Flecken auf einem Gel oder flüssige Fraktionen aus einer chromatographischen Auftrennung sein. Fraktionen aus einer Auftrennung können weiter unter Verwendung einer zweiten Auftrennungstechnik aufgetrennt werden. Ähnlich können weitere Fraktionen wiederum fraktioniert werden, bis die Proteine für die anschließenden Analyseschritte ausreichend aufgetrennt sind.
4. Analysieren der Fraktionen mittels Massenspektrometrie, bevorzugt gemäß einem Aspekt dieser Erfindung, um die an den Proteinen angebrachten Marker nachzuweisen.

Eine noch weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifikation eines Proteins in einer Probe bereit, die mehr als ein Protein enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

1. Kovalentes Umsetzen der Proteine der Probe mit mindestens einem getrennt auflösbaren Massenmarker aus den Sätzen und Matrizes dieser Erfindung.
2. Auftrennen der Proteine durch Gelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Flüssigchromatographie oder andere geeignete Mittel, um getrennte Fraktionen zu erzeugen. Diese Fraktionen können Bänder oder Flecken auf einem Gel oder flüssige Fraktionen aus einer chromatographischen Auftrennung sein. Fraktionen aus einer Auftrennung können weiter unter Verwendung einer zweiten Auftrennungstechnik aufgetrennt werden. Ähnlich können weitere Fraktionen wiederum fraktioniert werden, bis die Proteine für die anschließenden Analyseschritte ausreichend aufgetrennt sind.
3. Verdauen der Proteine in der Fraktion mit einem Sequenz-spezifischen Spaltungsreagenz.
4. Gegebenenfalls Umsetzen der Proteine in der Probe mit einem zusätzlichen Massenmarker.
5. Analysieren der verdauten Fraktionen durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie, wobei die Elutionszeit von massenmarkierten Peptiden aus dem Flüssigchromatographiesäulen-Schritt durch Nachweisen der an den Peptiden angebrachten Massenmarker bestimmt wird. Eine Massenspektrometrie-Analyse wird durchgeführt, bevorzugt gemäß einem Aspekt dieser Erfindung, um die an den Proteinen angebrachten Marker nachzuweisen.
6. Vergleichen des Elutionsprofils der markierten Peptide aus der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse von Schritt 5 mit Profilen in einer Datenbank, um zu bestimmen, ob das Protein bereits identifiziert worden ist.

Eine noch weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifikation eines Proteins aus einer Reihe von Proteinproben bereit, wobei jede Probe mehr als ein Protein enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

1. Kovalentes Umsetzen der Proteine jeder der Proben mit mindestens einem getrennt auflösbaren Massenmarker aus den Sätzen und Matrizes dieser Erfindung, so dass die Proteine jeder Probe mit einem oder mehreren Massenmarkern markiert sind, die von den Markern verschieden sind, die mit den Proteinen jeder anderen Probe umgesetzt wurden.
2. Poolen der massenmarkierten Proben.
3. Auftrennen der Proteine durch Gelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Flüssigchromatographie oder andere geeignete Mittel, um getrennte Fraktionen zu erzeugen. Diese Fraktionen können Bänder oder Flecken auf einem Gel oder flüssige Fraktionen aus einer chromatographischen Auftrennung sein. Fraktionen aus einer Auftrennung können werter unter Verwendung einer zweiten Auftrennungstechnik aufgetrennt werden. Ähnlich können weitere Fraktionen wiederum fraktioniert werden, bis die Proteine für die anschließenden Analyseschritte ausreichend aufgetrennt sind.
4. Verdauen der Proteine in der Fraktion mit einem Sequenz-spezifischen Spaltungsreagenz, um charakteristische Peptide für jedes Protein in der Probe zu erzeugen.
5. Gegebenenfalls Umsetzen der Proteine in der Probe mit einem zusätzlichen Massenmarker.
6. Analysieren der verdauten Fraktionen durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie, wobei die Elutionszeit von massenmarkierten Peptiden aus dem Flüssigchromatographiesäulen-Schritt durch Nachweis der an den Peptiden angebrachten Massenmarker bestimmt wird. Eine Massenspektrometrie-Analyse wird durchgeführt, bevorzugt gemäß einem Aspekt dieser Erfindung, um die an den Proteinen angebrachten Marker nachzuweisen.
7. Vergleichen des Elutionsprofils der markierten Peptide aus der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse von Schritt 6 mit einer Datenbank, um zu bestimmen, ob das Protein bereits identifiziert worden ist.

Schritt 1 der obigen bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung beinhaltet die kovalente Umsetzung eines Massenmarkers dieser Erfindung mit den reaktiven Seitenketten einer Population von Proteinen. Es ist in der Technik wohlbekannt, dass die reaktiven Seitenketten-Funktionalitäten selektiv umgesetzt werden können. Reaktive Seitenketten umfassen Lysin, Serin, Threonin, Tyrosin und Cystein. Cystein ist unter Bildung von Disulfid-Brücken häufig mit sich selbst vernetzt. Für die Zwecke dieser Erfindung ist es nicht wesentlich, dass diese Brücken gebrochen werden, aber Cystein-Seitenketten können hoch reaktiv sein und können leicht mit einer Vielfalt von Reagenzien umgesetzt werden. Wenn Disulfid-Brücken vorliegen, können diese durch Reduktion der Disulfid-Brücke mit Mercaptoethanol zu einem Paar Thiole gebrochen werden. Thiole können selektiv unter milden basischen Bedingungen, welche die Bildung eines Thiolat-Ions fördern, mit Jodacetat (Aldrich)verkappt werden, (Mol. Microbiol. 5:2293,1991). Eine geeignete milde Base ist Carbonat. Für die Zwecke dieser Erfindung kann ein Massenmarker dieser Erfindung, dessen reaktive Funktionalität eine Iodacetylgruppe ist, mit den Thiolen eines Analyten-Proteins umgesetzt werden. In weiteren Ausführungsformen kann die Protein-Population mit einem Massenmarker behandelt werden, dessen reaktive Funktionalität eine Isocyanat-Gruppe ist. Isocyanate reagieren nahezu ausschließlich mit der alpha-Aminogruppe am N-Terminus der Proteine und mit irgendeiner Lysin-epsilon-Aminogruppe, d.h. mit primären Aminen unter milden Bedingungen, d.h. bei Raumtemperatur in einem neutralen Lösungsmittel, was ein Harnstoff-Derivat zu ergibt. Man kann diese Reagenzien bei höheren Temperaturen auch mit allen Hydroxyl-tragenden Seitenketten, wie Serin-, Threonin- und Tyrosin-Seitenketten, in Anwesenheit eines geeigneten Katalysators, wie Pyridin oder einer Zinn-Verbindung, wie Dibutylstannyllaurat, reagieren lassen, was ein Urethan-Derivat ergibt. in einer alternativen Ausführungsform kann die Protein-Population mit einem Massenmarker behandelt werden, dessen reaktive Funktionalität eine Silylgruppe, wie Chlorsilan, ist. Diese Verbindungen reagieren leicht mit den meisten reaktiven funktionellen Gruppen. Amin-Derivate sind unter wässrigen Bedingungen nicht stabil und können so zu dem freien Amin zurückhydrolysiert werden, wenn dies gewünscht wird. Sulfonylchloride können ebenfalls als reaktive Gruppe an einem Massenmarker verwendet werden, um selektiv den Massenmarker mit freien Aminen, wie Lysin, umzusetzen. Carbonsäure-Seitenketten könnten ebenfalls mit den Markern dieser Erfindung umgesetzt werden, obwohl es gewöhnlich erforderlich ist, diese Seitenketten zu aktivieren, um sicherzustellen, dass sie reagieren. Acetanhydrid wird üblicherweise für diesen Zweck verwendet. Dieses bildet gemischte Anhydride an freien Carbonsäuren, die dann mit einer nukleophilen Funktionalität, wie einem Amin, umgesetzt werden können.
Die obigen speziellen Ausführungsformen sollen lediglich als Beispiele dienen, welche bevorzugte Verfahren der selektiven Umsetzung von Seitenketten-Funktionalitäten mit Massenmarkern erläutern. Eine große Vielfalt von reaktiven Gruppen ist in der Technik bekannt und viele von diesen können verwendet werden, um die ersten Schritte dieser Aspekte dieser Erfindung durchzuführen. Es kann auch wünschenswert sein, mehr als eine Art Seitenkette der Proteine in einer Probe mit verschiedenen Massenmarkern umzusetzen. Wenn mehrere Proben gleichzeitig zu analysieren sind, können zwei oder mehr Marker verwendet werden, um jede Probe zu markieren. Dies ermöglicht, dass mehr Information von jedem Protein abgeleitet wird, um zu seiner Identifikation beizutragen.
In Schritt 3 und 4 der letztgenannten zwei Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung werden die C-terminal modifizierten Proteine dann mit einem Sequenzspezifischen Spaltungsmittel behandelt. In einigen Ausführungsformen können Sequenz-spezifische Endoproteinasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin und andere Enzyme, verwendet werden. Spaltungsmittel können alternativ chemische Reagenzien sein. Diese sind bevorzugt flüchtig, um eine leichte Entfernung von unumgesetztem Reagenz zu ermöglichen. Geeignet chemische Spaltungsreagenzien umfassen Bromcyan, welches an Methionin-Resten spaltet, und BNPS-Skatol, welches Tryptophan-Reste spaltet (D.L. Crimmins et al., Anal. Biochem. 187:27-38, 1990).
In den obigen bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung wird der Schritt der Fraktionierung der Proteine bevorzugt anhand einer Durchführung von zweidimensionaler Gelelektrophorese unter Verwendung von isoelektrischer Fokussierung in der ersten Dimension und von SDS-PAGE in der zweiten Dimension bewirkt. Das Gel wird dann sichtbar gemacht, um zu identifizieren, wohin die Proteine auf dem Gel gewandert sind. Die Flecken können dann aus dem Gel ausgeschnitten werden und die Proteine werden dann aus dem ausgeschnittenen Gelfleck extrahiert. Diese extrahierten Proteine können direkt durch Elektrospray-Massenspektrometrie oder irgendein anderes Ionisationsverfahren analysiert werden. Alternativ kann eine weitere Fraktionierung in-line mit dem Massenspektrometer durchgeführt werden, wie HPLC-Massenspektrometrie.
In Schritt 3 und 4 der letztgenannten zwei bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung werden die verdauten Proteine gegebenenfalls mit einem zusätzlichen Massenmarker dieser Erfindung umgesetzt. Dies ist von größerer Bedeutung für die letztgenannte bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, bei der mehrere Proben gleichzeitig analysiert werden. Die meisten enzymatischen Verdaue und einige der chemischen Spaltungsverfahren lassen freie Amine an den resultierenden Peptiden der verdauten fraktionierten Proteine zurück, die mit einem Massenmarker umgesetzt werden könne. Dies bedeutet, dass der gleiche Massenmarker an allen Peptiden erscheint und selektiv nachgewiesen werden kann, um die Empfindlichkeit dieser Analyse zu maximieren.
In Schritt 6 und Schritt 7 der letztgenannten zwei bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung wird das Elutionsprofil der Peptide, die durch den Verdau der fraktionierten Proteine erzeugt wurden, verwendet, um eine vorgebildete Datenbank zu durchsuchen, um zu bestimmen, ob die Proteine bereits identifiziert worden sind. Die Peptide, die aus der Flüssigchromatographie-Säule in ein Massenspektrometer eluiert werden, können weiter durch Tandem-Massenspektrometrie analysiert werden, um die Sequenz-Information zu bestimmen, die verwendet werden kann, um Proteine zu identifizieren.
Peptidsequenz-Daten können verwendet werden, um eine Proteinsequenz-Datenbank zu durchsuchen, oder können in Nukleinsäure-Sequenzdaten übersetzt werden, um Nukleinsäuresequenz-Datenbanken zu durchsuchen.
Isolierung von posttranslationa/modifizierten Peptiden
Kohlenhydrate liegen häufig als Posttranslations-Modifikation von Proteinen vor. Diese Kohlenhydrate weisen häufig Carbonylgruppen auf. Carbonylgruppen können markiert werden, was ermöglicht, dass Proteine, die derartige Modifikationen tragen, nachgewiesen oder isoliert werden. Biocytinhydrazid (Pierce & Warriner Ltd, Chester, UK) reagiert mit Carbonylgruppen in einer Anzahl von Kohlenhydrat-Spezies (E.A. Bayer et al., Anal. Biochem. 170, 271-281, "Biocytin hydrazide – a selective label for sialic acids, galactose, and other sugars in glycoconjugates using avidin biotin technology", 1988). Proteine in einer komplexen Mischung, die Kohlenhydrat-Modifikationen tragen, können so biotinyliert werden. Die Proteinmischung kann dann mit einer Endoprotease, wie Trypsin, behandelt werden, um Peptide aus den Proteinen zu erzeugen. Biotinylierte, daher Kohlenhydrat-modifizierte Peptide können dann unter Verwendung eines festen avidinierten Trägers isoliert werden. Eine Reihe von Proben kann auf diese Weise behandelt werden und die erhaltenen Peptide können mit den Massenmarkern dieser Erfindung umgesetzt werden, so dass Peptide aus jeder Probe einen Massenmarker oder eine Kombination von Massenmarkern tragen, die mit dem Peptid oder den Peptiden aus dieser Probe in Beziehung gesetzt werden können. Bevorzugt tragen Peptide aus jeder Probe einen verschiedenen Massenmarker. Diese massenmarkierten Kohlenhydrattragenden Peptide können dann durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert werden.
Eine Anzahl von Forschungsgruppen hat über die Produktion von Antikörpern berichtet, die an Phosphotyrosin-Reste in einer großen Vielfalt von Proteinen binden (siehe z.B. A.R. Frackelton et al., Methods Enzymoff. 201, 79-92, "Generation of monoclonal antibodies against phosphotyrosine and their use for affinity purification of phosphotyrosine-containing Proteins", 1991, und andere Aufsätze in dieser Ausgabe von Methods Enzymol.). Dies bedeutet, dass ein signifikanter Prozentsatz von Proteinen, die posttranslational durch Tyrosinphosphorylierung modifiziert worden sind, durch Affinitätschromatographie unter Verwendung dieser Antikörper als Affinitätssäulen-Liganden isoliert werden kann.
Diese Phosphotyrosin bindenden Antikörper können im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet werden, um Peptide zu isolieren, die Phosphotyrosin-Reste enthalten. So können Proteine in einer komplexen Mischung mit einer Sequenzspezifischen Endopeptidase behandelt werden, um freie Peptide zu erzeugen. Diese können dann durch eine Anti-Phosphotyrosin-Antikörper-Säule geleitet werden, welche die Peptide zurückhält, die eine Phosphotyrosin-Gruppe enthalten. Eine Reihe von Proben kann auf diese Weise behandelt werden und die erhaltenen Peptide können mit den Massenmarkern dieser Erfindung umgesetzt werden, so dass Peptide aus jeder Probe einen Massenmarker oder eine Kombination von Massenmarkern tragen, welche mit dem Peptid oder den Peptiden aus der Probe in Beziehung gesetzt werden können. Bevorzugt tragen Peptide aus jeder Probe einen verschiedenen Massenmarker. Diese massenmarkierten Phosphotyrosin tragenden Peptide können dann durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert werden.
Isolierung von terminalen Peptiden aus Proteinen
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erstellung von Proteinexpressionsprofilen gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, nur ein Peptid aus jedem Protein in der Probe zu isolieren. Vorausgesetzt, dass das isolierte Peptid-Fragment von ausreichender Länge ist, ist das Fragment für sein Ausgangsprotein spezifisch. Im ersten Schritt dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung werden Peptide aus jedem Protein in jeder einer Anzahl von Proben mit komplexen Proteinmischungen isoliert. In einigen Ausführungsformen dieses Aspekts wird es bevorzugt, dass terminale Peptide isoliert werden. Die Isolierung von terminalen Peptiden stellt sicher, dass mindestens ein und nur ein Peptid pro Protein isoliert wird. Verfahren zur Isolierung von Peptiden aus den Termini von Polypeptiden werden in der PCT/GB98/00201 und PCT/GB99/03258 erörtert.
So stellt dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erstellung von Proteinprofilen bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Behandeln einer Probe, die eine Population einer Mehrzahl von Polypeptiden umfasst, mit einem Spaltungsmittel, das bekanntermaßen einen spezifischen Aminosäurerest oder eine spezifische Aminosäuresequenz in Polypeptid-Ketten erkennt und an einer Spaltungsstelle spaltet, wodurch die Population unter Erzeugung von Peptid-Fragmenten gespalten wird.
(b) Isolieren einer Population von Peptid-Fragmenten, die als Bezugsterminus den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids tragen, aus dem sie fragmentiert wurden, wobei jedes Polypeptid-Fragment am anderen Ende die Spaltungsstelle proximal zum Bezugsterminus trägt.
(c) Markieren jedes Bezugsterminus der Polypeptide mit einem Massenmarker oder einer Kombination von Massenmarkern aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern der vorliegenden Erfindung vor oder nach Isolierung der Peptid-Fragmente, wobei jeder Bezugsterminus zu seinem Marker oder seiner Kombination von Markern in Beziehung gesetzt werden kann; und
(d) Bestimmen einer Signatursequenz eines oder mehrerer der isolierten Fragmente mittels Massenspektrometrie, wobei die Signatursequenz die Sequenz einer vorbestimmten Anzahl von Aminosäureresten ist, die sich von der Spaltungsstelle aus erstrecken;

Ein alternatives bevorzugtes Verfahren, das für diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, verwendet ein zweites Spaltungsmittel, um weitere Fragmente zu erzeugen, welche selbst identifiziert und verwendet werden können, um ihr Ausgangspolypeptid oder -protein zu charakterisieren. Dieses Verfahren umfasst:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die ein oder mehrer Polypeptide umfasst, mit einem ersten Spaltungsmittel, um Polypeptid-Fragmente zu erzeugen.
(b) Isolieren eines oder mehrerer Polypeptid-Fragmente, wobei jedes Fragment den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids umfasst, aus dem es fragmentiert wurde;
(c) Markieren jedes Terminus der Polypeptide mit einem Massenmarker oder einer Kombination von Massenmarkern aus einem Satz oder einer Matrix von Massenmarkern der vorliegenden Erfindung vor oder nach dem Isolieren der Polypeptid-Fragmente, wobei jeder Terminus mit seinem Marker oder seiner Kombination von Markern in Beziehung gesetzt werden kann, und
(d) identifizieren der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie;
(e) Wiederholen der Schritte (a)-(d) mit der Probe unter Verwendung eines zweiten Spaltungsmittels, welches an einer anderen Stelle als das erste Spaltungsmittel spaltet; und
(f) Charakterisieren des einen oder der mehreren Polypeptide in der Probe aus den in den Schritten (d) und (e) identifizierten Fragmenten.

In beiden obigen Verfahren kann der Schritt der Markierung der Bezugstermini vor oder nach Isolieren der Fragmente stattfinden und kann stattfinden, bevor die Fragmente aus ihren Ausgangspolypeptiden und/oder Polypeptiden abgespalten werden, falls gewünscht.
Was die Isolierung von Peptid-Fragmenten betrifft, können in bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung terminale Peptide aus einer komplexen Mischung von Proteinen unter Verwendung eines Verfahrens isoliert werden, welches die Schritt umfasst:

1. Vollständiges Verdauen der komplexen Proteinmischung mit einem Lys-C-spezifischen Spaltungsenzym, d.h. einem Reagenz, das an der Peptidbindung in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem Lysinrest an der C-terminalen Seite dieses Restes schneidet.
2. In-Kontakt-Bringen der resultierenden Peptide mit einem aktivierten festen Träger, der mit freien Aminogruppen reagiert.
3. Gegebenenfalls Umsetzen der eingefangenen Peptide mit einem bifunktionellen Reagenz, das mindestens eine mit Amin reagierende Funktionalität aufweist.
4. In-Kontakt-Bringen der eingefangenen Peptide mit einem Reagenz, das an der alpha-Aminogruppe jedes Peptids auf dem Träger spaltet. Alle Peptide, die nicht C-terminal sind, weisen einen Lysinrest auf, der sie kovalent mit dem festen Träger verknüpft. So werden freie C-terminale Peptide selektiv freigesetzt.
5. Gegebenenfalls In-Kontakt-Bringen der freigesetzten Peptide mit einem zweiten festen Träger, der mit der zweiten reaktiven Funktionalität des bifunktionellen Reagenz reagiert, das im Schritt 3 verwendet wurde, um jegliche Peptide einzufangen, die nicht richtig mit dem ersten Träger reagiert haben.
6. Gewinnen der Peptide, die frei in Lösung verbleiben.

In bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens werden die Proteine in der komplexen Mischung denaturiert, reduziert und mit einem Reagenz behandelt, um Thiole in den Proteinen zu verkappen. Typische Protokolle beinhalten die Denaturierung der Proteine in einem Puffer bei pH 8,5 mit einer hohen Konzentration an Guanidinhydrochlorid (6-8 M) als Denaturierungsreagenz in Anwesenheit eines Überschusses von Mercaptoethanol oder Dithiothreit als Reduktionsmittel und einem Überschuss eines Verkappungsmittels, wie Vinylpyridin.
In Schritt 1 dieses Verfahrens wird die komplexe Proteinmischung vollständig mit einem Lys-C-spezifischen Spaltungsenzym verdaut, bei dem es sich z.B. um Endopeptidase Lys-C aus Lysobacter enzymogenes (Boehringer Mannheim) handeln kann.
In Schritt 2 dieses Verfahrens werden die resultierenden Peptide mit einem festen Träger in Kontakt gebracht, der mit Aminen reagiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Festphasen-Träger mit einer Isothiocyanat-Verbindung derivatisiert. In einer Ausführungsform wird die Peptid-Population mit Isothiocyanato-Glas (DITC-Glas) (Sigma, Aldrich, Dorset, England) in Anwesenheit einer Base umgesetzt. Dieser fängt alle Peptide durch jegliche freien Aminogruppen ein.
Schritt 3 ist fakultativ, aber bevorzugt. Es kann schwierig sein, zu garantieren, dass alle nicht-C-terminalen Peptide vollständig mit dem ersten festen Träger sowohl an der Lysin-Seitenketten-Aminogruppen als auch der N-terminalen alpha-Aminogruppe reagieren. Peptide, die nur an der Lysin-Seitenketten-Aminogruppe reagieren, bleiben in den anschließenden Schritten am Träger angebracht. Peptide, die nur mit ihrer alpha-Aminogruppe reagieren, werden zusammen mit C-terminalem Peptid vom Träger abgespalten. Dieser Schritt ermöglicht, dass nicht-C-terminale Peptide von C-terminalen Peptiden unterschieden werden. In diesem fakultativen Schritt kann es sich bei dem bifunktionellen Reagenz um N-Succinimidyl[4-vinylsulfonyl]benzoat (SVSB von Pierce & Warriner Ltd., Chester, UK) handeln. Diese Verbindung umfasst einen mit Amin reagierenden N-Hydroxysuccinimidester, der an eine mit Thiol reagierende Vinylsulfon-Einheit geknüpft ist. Die Verbindung reagiert über die Esterfunktionalität sehr leicht mit Aminen ohne Reaktion des Vinylsulfons und kann in einem späteren Stadium getrennt mit Thiolen umgesetzt werden. Demgemäß wird das SVSB unter leicht basischen Bedingungen mit jeglichen freien Aminen auf dem Träger umgesetzt. In Anwesenheit eines großen Überschusses der SVSB-Verbindung und im Hinblick darauf, dass die Peptide auf dem Träger immobilisiert sind, reagiert das SVSB mit den Peptiden nur durch die Succinimid-Funktionalität, wobei die Vinylsulfon-Einheit für eine weitere Reaktion frei gelassen wird. In alternativen Ausführungsformen können jegliche unumgesetzten Amine mit Biotin umgesetzt werden, das an eine mit Amin reagierende Funktionalität gekuppelt ist, wie N- Hydroxysuccinimid (NHS)-Biotin (Sigma-Aldrich Ltd., Dorset, England). Dies ermöglicht, dass unvollständig umgesetzte Peptide später auf avidinierten Perlen oder auf einem avidinierten Harz in einer Affinitäts-Einfangsäule eingefangen werden.
In Schritt 4 dieses Verfahrens werden die eingefangenen Peptide mit einem Reagenz in Kontakt gebracht, das an den alpha-Aminogruppen jedes Peptids auf dem Träger schneidet. In Ausführungsformen, in denen DITC-Glas als der mit Amin reagierende Träger verwendet wird, werden die Peptide mit einer geeigneten flüchtigen Säure (wie Trifluoressigsäure (TFA), behandelt, welche die N-terminale Aminosäure jedes Peptids auf dem Träger schneidet. Alle Peptide, die nicht C-terminal sind, weisen einen Lysinrest auf, der sie kovalent mit dem festen Träger verknüpft. So werden freie C-terminale Peptide selektiv freigesetzt.
Der fakultative Schritt 5 ist insbesondere bevorzugt, wenn der fakultative Schritt 3 durchgeführt wird. Die nicht-terminalen Peptide, die nicht vollständig mit dem mit Amin reagierenden Träger reagieren, werden durch diesen Schritt entfernt. Wenn SVSB verwendet wird, um nicht-terminale Peptide zu markieren, die nur durch ihre alpha-Aminogruppen reagiert haben, haben diese eine reaktive Funktionalität zur Verfügung, welche ermöglicht, dass sie mit einem festen Träger umgesetzt werden, der mit einem geeigneten Nukleophil, bevorzugt einem Thiol, derivatisiert ist. Wenn DITC-Glas in Schritt 4 verwendet wird, was bevorzugt ist, können die Peptide unter Verwendung von TFA aus dem Träger freigesetzt werden. Die freigesetzten Peptide können als Trifluoracetat-Salze durch Abdampfen des TFA gewonnen werden. Die Peptide können dann in einem Puffer mit einem pH von etwa 7 oder nur in einem geeigneten neutralen Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder einer Mischung von Wasser und Aceton resuspendiert werden. Die Peptide werden dann zu dem mit Thiol derivatisierten Träger gegeben. Bei pH 7 sollte die verbleibende Vinyl-Funktionalität an dem mit SVSB behandelten Peptiden nahezu ausschließlich mit dem Thiol-Träger anstelle mit den freien Aminen reagieren, die durch Spaltung der Peptide aus dem DITC-Glasträger freigelegt worden sind. Mit Thiol derivatisierte Tentagele sind von Rapp Polymere GmbH (Tübingen, Deutschland) erhältlich oder ein mit Thiol derivatisierter Träger kann durch Inkubieren eines Kieselgels mit 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan hergestellt werden.
In Schritt 6 dieses Verfahrens werden die freigesetzten Peptide gewonnen. Wenn die fakultativen Schritte 3 und 5 verwendet werden, können die Peptide in einer Vielfalt von Lösungsmitteln oder Puffern vorliegen. Diese werden in bevorzugten Ausführungsformen so gewählt, das sie flüchtig sind. Wenn die Peptide direkt aus dem ersten Träger gewonnen werden, der in bevorzugten Ausführungsformen DITC-Glas ist, ist es wahrscheinlich, dass die Peptide in TFA vorliegen, die flüchtig ist. Die Peptide werden bevorzugt aus diesen flüchtigen Lösungsmitteln oder Puffern durch Verdampfen des Lösungsmittels oder Puffers gewonnen. Die Peptide, die durch dieses Verfahren isoliert werden, weisen eine freie alpha-Aminogruppe auf, die für eine Umsetzung mit den Markern dieser Erfindung verfügbar ist.
Markierung von isolierten Peptiden
Jeder der Massenmarker der vorliegenden Erfindung kann in den in diesem Aspekt der Erfindung beschriebenen Ausführungsformen für die Erstellung von Proteinexpressionsprofilen verwendet werden. Die in den 22 und 23 veranschaulichten Massenmarker sind zur Verwendung mit dieser Erfindung besonders bevorzugt, insbesondere in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung. Diese Verbindungen weisen eine reaktive Vinylsulfongruppe auf, welche ermöglicht, dass diese Verbindungen Additionsreaktionen mit freien Aminen und Thiolen eingehen. Wenn nur ein Marker pro Peptid gewünscht wird, können die Proteine in den komplexen Mischungen vor der Spaltung mit der Sequenzspezifischen Endopeptidase mit Verkappungsmitteln behandelt werden. Phenyl-, Ethyl- und Methylvinylsulfon reagieren mit freien Aminen und Thiolen, wobei sie diese verkappen, während sie immer noch die Spaltung der verkappten Proteine durch Trypsin erlauben. Die epsilon-Aminreste von Lysin reagieren mit zwei Vinylsulfon-Einheiten, wenn die Vinylsulfon-Einheiten nicht sterisch gehindert sind, insbesondere Ethyl- und Methylvinylsulfon.
Nach Anbringen der Marker weisen diese markierten Peptide eine Masse auf, die um die Masse des Markers verschoben ist. Die Masse des Peptids kann ausreichend sein, um das Quellenprotein zu identifizieren. In diesem Fall muss nur der Marker nachgewiesen werden, was durch selektierte Reaktionskontrolle mit einem Triele-Quadrupol erzielt werden kann, was nachstehend in mehr Einzelheiten erörtert wird. Kurz gesagt wird der erste Quadrupol des Triple-Quadrupols so eingestellt, dass er Ionen durchlässt, deren Masse-Ladungs-Verhältnis jenem des interessierenden Peptids unter Berücksichtigung der Masse des Markers enspricht. Die selektierten Ionen werden dann im zweiten Quadrupol einer Kollisions-induzierten Dissoziierung (CID) unterzogen. Unter der Art von Bedingungen, die bei der Analyse von Peptiden verwendet werden, fragmentieren die Ionen meistens an den Amidbindungen im Molekül. Die Marker in den 22 und 23 weisen eine Amidbindung auf, welche den terminalen vorionisierten Teil des Markers bei der Spaltung freisetzt. Obwohl die Marker alle die gleiche Masse aufweisen, ist der terminale Teil wegen Unterschieden bei den Substituenten auf beiden Seiten der Amidbindung verschieden. So können die Marker voneinander unterschieden werden. Die Anwesenheit des Marker-Fragments, das mit einem Ion einer spezifischen Masse assoziiert ist, sollte bestätigen, dass das Ion ein Peptid war, und die relativen Peak-Höhen der Marker aus verschiedenen Proben liefern eine Information über die relativen Mengen der Peptide in ihren Proben. Wenn die Masse nicht ausreicht, um ein Peptid zu identifizieren, entweder da eine Anzahl von terminalen Peptiden in der Probe dieselbe terminale Masse aufweist oder da das Peptid nicht bekannt ist, kann die Sequenzinformation durch Analyse des vollständigen CID-Spektrums bestimmt werden. 24 zeigt ein theoretisches Spektrum zweier Proben eines Peptids mit der Sequenz H₂N-Gly-Leu-Ala-Ser-Glu-COOH, wobei jede Probe an einem der Marker mit den in 23 gezeigten Formeln angebracht ist. Das Spektrum ist idealisiert, da es nur die Fragmente der b-Serie zeigt und nicht andere Fragmentierungen oder irgendwelche Rausch-Peaks zeigt, jedoch erläutert es, dass das Spektrum klar in einen Bereich höherer Massen, der den Peptid-Fragmentierungs-Peaks entspricht, und einen Bereich niedrigerer Masse eingeteilt ist, der den Massenmarker-Peaks entspricht. Falls gewünscht, können die Peptid-Fragmentierungs-Peaks verwendet werden, um die Peptide zu identifizieren, während die Massenmarker-Peaks Information über die relativen Mengen der Peptide ergeben.
Auftrennung von markierten Peptiden durch Chromatographie oder Elektrophorese
Bevorzugt werden in diesem Aspekt der Erfindung in dem Schritt vor der massenspektroskopischen Analyse die markierten terminalen Peptide vor der Analyse durch Massenspektrometrie einer chromatographischen Auftrennung unterzogen.
Diese ist bevorzugt Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC), die direkt mit einem Massenspektrometer für eine in-line-Analyse der Peptide gekoppelt werden kann, wenn diese aus der Chromatographiesäule eluiert werden. Eine Vielfalt von Auftrennungstechniken kann mittels HPLC durchgeführt werden, aber Umkehrphasenchromatographie ist ein beliebtes Verfahren für die Auftrennung von Peptiden vor der Massenspektroskopie. Kapillarzonenelektrophorese ist ein weiteres Auftrennungsverfahren, das für eine automatische Analyse von eluierten Proben direkt an ein Massenspektrometer gekoppelt werden kann. Diese und andere Fraktionierungstechniken können angewendet werden, um die Komplexität einer Peptidmischung vor der Analyse durch Massenspektrometrie zu verringern.
Proteinquantifizierung und -identifikation durch Tandem-Massenspektrometrie
Im Verfahren dieses Aspektes der Erfindung werden markierte isolierte Peptide durch Tandem-Massenspektrometrie analysiert.
Wie bereits erörtert, ermöglichen Tandem-Massenspektrometer, dass Ionen mit einem vorbestimmten Masse-Ladungs-Verhältnis selektiert und fragmentiert werden, z.B. durch Kollisions-induzierte Dissoziation (CID). Die Fragmente können dann nachgewiesen werden, wobei sie eine Strukturinformation über das selektierte Ion liefern. Wenn Peptide durch CID in einem Tandem-Massenspektrometer analysiert werden, werden charakteristische Spaltungsmuster beobachten, welche ermöglichen, dass die Sequenz des Peptids bestimmt wird. Natürliche Peptide fragmentieren typisch statistisch an den Amidbindungen des Peptid-Rückgrats, was Reihen von Ionen ergibt, die für das Peptid charakteristisch sind. CID-Fragment-Reihen werden gewöhnlich als a_n, b_n, c_n usw. bei der Spaltung an der n-ten Peptidbindung bezeichnet, wobei die Ladung des Ions auf dem N-terminalen Fragment des Ions beibehalten wird. Ähnlich werden Fragmentreihen mit x_n, y_n, z_n usw. bezeichnet, wenn die Ladung auf dem C-terminalen Fragment des Ions verbleibt. Diese Schreibweise ist in dem folgenden Schema 1 dargestellt.
Schema 1
Trypsin und Thrombin sind bevorzugte Spaltungsmittel für die Tandem-Massenspektrometrie, da sie Peptide mit basischen Gruppen an beiden Enden des Moleküls erzeugen, d.h. die alpha-Aminogruppe am N-Terminus und die Lysin- oder Arginin-Seitenketten am C-Terminus. Dies begünstigt die Bildung von doppelt geladenen Ionen, in denen die geladenen Zentren an entgegengesetzten Enden des Moleküls vorliegen. Diese doppelt geladenen Ionen erzeugen sowohl C-terminale als auch N-terminale Ionenreihen nach CID. Dies unterstützt die Bestimmung der Sequenz des Peptids. Allgemein gesprochen werden nur eine oder zwei der möglichen Ionenreihen in den CID-Spektren eines gegebenen Peptids beobachtet. Bei Niedrigenergie-Kollisionen, die für Instrumente auf Quadrupol-Basis typisch sind, herrschen die b-Serien von N-terminalen Fragmenten oder die y-Serein von C-terminalen Fragmenten vor. Wenn doppelt geladene Ionen analysiert werden, werden oft beide Serien nachgewiesen. Im Allgemeinen domieren die Ionen der y-Serie über die b-Serie.
Wenn die isolierten Peptide, die im Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, C-terminale Peptide sind, die unter Verwendung von DITC-Glas isoliert wurden, wie oben erörtert, weisen die Peptide nach der Isolierung ein freies Amin an ihren N-Termini auf, was die Markierung mit den Markern dieser Erfindung erleichtert. Wie oben erwähnt, können diese Marker alle die gleiche Masse haben, so dass äquivalente Peptide in jeder Probe, die analysiert wird, um die gleiche Größe bezüglich der Masse verschoben werden. CID dieser Peptide erzeugt Fragmente aus den Markern. Die Intensitäten der Marker-Fragmente ermöglichen, dass die relativen Mengen von äquivalenten Peptiden in jeder Probe bestimmt werden. Eine kovalente Verknüpfung der Massenmarker dieser Erfindung mit den N-Termini der isolierten Peptide verschiebt die Massen der b-Serie der Fragmentionen um die Masse des Markers, solange die Ladung auf dem Marker verbleibt. Da die Masse des Markers bei jeder analysierte Probe dieselbe ist, gibt es nur eine Ionenreihe, die für alle Ionen erzeugt wird, solange eine Kollisionsinduzierte Spaltung der markierten Peptide im Peptid-Rückgrat stattfindet. Dies bedeutet, dass es möglich ist, die markierten Peptide durch ihre Fragment-Ionen zu identifizieren, und für jedes gegebene Peptid gibt es nur eine Fragmentreihe des Peptids, unabhängig von der Zahl der Proben, die gleichzeitig analysiert werden. Die Fragmentierung innerhalb der Marker selbst erzeugt Peaks, die für jede Probe charakteristisch sind. Diese Peaks treten in einem relativ niedrigen Massenbereich auf (siehe 24). Bei einem Triele-Quadrupol-Instrument ist es vorzuziehen, eine selektierte Reaktionskontrolle zu verwenden, um den empfindlichsten Nachweis dieser Peaks zu erzielen. Die relativen Intensitäten dieser Peaks zeigen die relativen Mengen des Quellenproteins, aus dem das Peptid stammt, in den Originalproben an. Bei natürlichen Peptiden tendiert die b-Serie von Fragment-Ionen dazu, eine niedrigere Intensität aufzuweisen als die y-Serie. Mit einem geeigneten Basis-Massenmarker oder einem „vorionisierten" Massenmarker, der z.B. ein quartäres Ammoniumzentrum umfasst, kann die Intensität der b-Serie der Ionenfragmente verstärkt werden. Leider gibt es, wenn C-terminale Peptide verwendet werden, keine Garantie, dass die C-terminale Aminosäure basisch ist, so dass Fragment-Ionen der y-Serie schwach sein können. Die Bestimmung der Strukturinformation unter Verwendung der y-Serie würde erfordern, dass der C-Terminus dieser Peptide eine basische Gruppe oder eine „vorionisierte" Gruppe trägt.
Die Analyse von Proteinen durch Tandem-Massenspektrometrie, insbesondere von Proteinmischungen, wird durch das „Rauschen" der erhaltenen Spektren kompliziert. Proteine, die aus biologischen Proben isoliert wurden, sind gewöhnlich mit Pufferreagenzien, Denaturierungsmitteln und Detergenzien kontaminiert, die alle Peaks in das Massenspektrum einführen. Als Ergebnis gibt es häufig mehr Kontaminations-Peaks in dem Spektrum als Peptid-Peaks und die Identifikation von Peaks, welche Peptiden entsprechen, kann ein größeres Problem darstellen, insbesondere bei kleinen Proben von Proteinen, die schwierig zu isolieren sind. Als Ergebnis werden verschiedene Verfahren verwendet, um zu bestimmen, welche Peaks Peptiden entsprechen, bevor eine detaillierte CID-Analyse durchgeführt wird. Instrumente auf Triele-Quadrupol-Basis erlauben ein „Vorstufenion-Scannen" (siehe Wilm M. et al., Anal. Chem. 68 (3) 527-33, "Parent ion scans of unseparated Peptide mixtures" (1996)). Der Triele-Quadrupol wird in einem „Einzel-Reaktionskontrolle"-Modus betrieben, in dem der erste Quadrupol über den vollen Massenbereich scannt und jedes torgesteuerte Ion im zweiten Quadrupol CID unterzogen wird. Der dritte Quadrupol wird so eingestellt, dass er nur ein spezifisches Fragment-Ion nachweist, welches gewöhnlich ein charakteristisches Fragment-Ion aus einem Peptid ist, wie Ammoniumionen. Ein alternatives Verfahren, das bei Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometern verwendet wird, scannt doppelt geladenen Ionen durch Identifikation von Ionen, die, wenn sie einem CID-Prozess unterzogen werden, Tochterionen mit höheren Masse-Ladungs-Verhältnissen produzieren als die Ausgangsionen. Ein weiteres Verfahren der Identifikation von doppelt geladenen Ionen besteht darin, nach Sätzen von Peaks im Spektrum mit geeigneten Intensitätsverhältnissen, die nur 0,5 Dalton getrennt sind, Ausschau zu halten, welche anzeigen würden, dass die Ionen die gleichen sind, wobei sie sich nur durch den Anteil von ¹³C unterscheiden, der im Molekül vorliegt.
Durch Markierung von Peptiden mit den Massenmarkern dieser Erfindung kann eine neue Form von Vorstufenionen-Scannen ins Auge gefasst werden, bei dem Peptid-Peaks durch die Anwesenheit von Fragmenten identifiziert werden, welche den Massenmarkern dieser Erfindung entsprechen, nachdem die markierten Peptide CID unterzogen worden sind. Insbesondere können die Peptide, die aus jeder Probe isoliert wurden, durch die Verfahren dieser Erfindung mit mehr als einem Massenmarker markiert werden. Eine äquimolare Mischung eines „Vorstufenionen-Scanning"-Markers, der in allen Proben verwendet wird, und ein Proben-spezifischer Marker können verwendet werden, um die Peptide in jeder Probe zu markieren. Auf diese Weise haben Änderungen der Menge der Peptide in verschiedenen Proben keine nachteilige Auswirkung auf die Identifikation von Peptid-Peaks in einem Vorstufenionen-Scan.
Nachdem ein Peptidion identifiziert und selektiert worden ist, wird es bevorzugt CID unterzogen. Die CID-Spektren sind häufig ziemlich komplex und die Bestimmung, welche Peaks im CID-Spektrum sinnvollen Peptidfragment-Reihen entsprechen, ist ein weiteres Problem bei der Bestimmung der Sequenz eines Peptids durch Massenspektrometrie. Shevchenko et al., Rapid Commun. Mass. Spec. 11, 1015-1024 (1997) beschreiben ein weiteres Verfahren, das die Behandlung von Proteinen zur Analyse mit Trypsin in 1:1160/180-Wasser beinhaltet. Die Hydrolysereaktion hat zwei Peptidpopulationen zur Folge, eine erste, deren terminales Carboxyl ¹⁶O enthält, und eine zweite, deren terminales Carboxyl ¹⁸O enthält, Demgemäß sollte für jedes Carboxyl in der Probe ein Doppel-Peak mit gleicher Intensität für jedes Peptid vorliegen, wobei der Doppel-Peak zwei Dalton beabstandet ist. Dies wird etwas durch intrinsische Peptid-Isotopenpeaks kompliziert, ermöglicht aber ein automatisiertes Scannen des CID-Spektrums bezüglich Dubletts. Die Massenunterschiede zwischen Dubletts können bestimmt werden, um die Aminosäure durch die zwei verschiedenen Fragmente zu identifizieren. Dieses Verfahren kann bei Verfahren dieser Erfindung anwendbar sein, wenn N-terminale Peptide isoliert werden.

Claims

Satz von zwei oder mehr Massenmarkern, bei dem jeder Marker in dem Satz eine Massenmarkierungseinheit umfasst, die über einen spaltbaren Linker an einer Massennormierungseinheit angebracht ist, wobei jede Massennormierungseinheit sicherstellt, dass ein Massenmarker eine gewünschte aggregierte Masse aufweist, und wobei jede Massenmarkierungseinheit eine Masse aufweist, die von allen anderen Massenmarkierungseinheiten verschieden ist, und jeder Marker in dem Satz eine gemeinsame aggregierte Masse aufweist; und wobei alle Massenmarker in dem Satz mittels Massenspektrometrie voneinander unterscheidbar sind.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 1, bei dem jede Massenmarkierungseinheit in dem Satz eine gemeinsame Grundstruktur aufweist und jede Massennormierungseinheit in dem Satz eine gemeinsame Grundstruktur aufweist, die die gleiche oder eine andere sein kann als die gemeinsame Grundstruktur der Massenmarkierungseinheiten, und wobei jeder Massenmarker in dem Satz ein oder mehrere Masseneinstellungseinheiten umfasst, wobei die Masseneinstellungseinheiten so an der Grundstruktur der Massenmarkierungseinheit und/oder der Grundstruktur der Massennormierungseinheit angebracht sind oder darin angeordnet sind, dass jede Massenmarkierungseinheit in dem Satz eine verschiedene Zahl von Masseneinstellungseinheiten aufweist und jeder Massenmarker in dem Satz die gleiche Zahl von Masseneinstellungseinheiten aufweist.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 2, wobei jeder Massenmarker in dem Satz die folgende Struktur aufweist: M(A)_y-L-X(A)_z worin M eine Massennormierungseinheit ist, X eine Massenmarkierungseinheit ist, A eine Masseneinstellungseinheit ist, L ein spaltbarer Linker ist, y und z ganze Zahlen von 0 oder größer sind und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, bei dem die Masseneinstellungseinheit ausgewählt ist aus: (a) einem isotopischen Substituenten, der innerhalb der Grundstruktur der Massenmarkierungseinheit und/oder innerhalb der Grundstruktur der Massennormierungseinheit angeordnet ist, und (b) Substituentenatomen oder -gruppen, die an der Grundstruktur der Massenmarkierungseinheit angebracht sind und/oder an der Grundstruktur der Massennormierungseinheit angebracht sind.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 4, bei dem die Masseneinstellungseinheit ausgewählt ist aus einem Halogenatom-Substituenten, einer Methylgruppe und isotopischen ²H- oder ¹³C-Substituenten.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 5, bei dem die Masseneinstellungseinheit ein Fluoratom-Substituent ist.
Satz von Massenmarkern nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem der spaltbare Linker, der die Massenmarkierungseinheit mit der Massennormierungseinheit verknüpft, ein durch Kollision spaltbarer Linker ist.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 7, bei dem der spaltbare Linker eine Amid-Bindung umfasst.
Satz von Massenmarkern nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem die Massenmarkierungseinheit und/oder die Massennormierungseinheit eine gegen Fragmentierung beständige Gruppe umfasst.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 9, bei dem die Massennormierungseinheit eine Phenylgruppe umfasst.
Satz von Massenmarkern nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem die Massenmarkierungseinheit eine vorionisierte Gruppe umfasst.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 11, bei dem die Massenmarkierungseinheit eine N-Methylpyridyl-Gruppe oder eine Gruppe umfasst, die aus den folgenden Gruppen ausgewählt ist: -NH₂, -NR₂, -NR₃ ⁺, -SR₃ ⁺ -SO₃ ^–, -PO₄ ^–, -PO₃ ^–, -CO₂ ^–,
worin R Wasserstoff ist oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist.
Satz von Massenmarkern nach irgendeinem der Ansprüche 3-12, bei dem jeder der Marker in dem Satz die folgende Struktur aufweist:
worin R Wasserstoff ist oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist; L ein spaltbarer Linker ist; A eine Masseneinstellungseinheit ist; jedes p das gleiche ist und eine ganze Zahl von 0 oder größer ist; jedes y' das gleiche oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller y' für irgendeinen Marker gleich y ist; jedes z' das gleiche oder verschieden sein kann und einen ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller z' für irgendeinen Marker gleich z ist; und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist.
Satz von Massenmarkern nach Anspruch 13, bei dem R für H steht, L eine Amid-Bindung ist, p = 0 und A ein F-Atom ist.
Array von Massenmarkern, umfassend zwei oder mehr Sätze von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, wobei die aggregierte Masse jedes der Massenmarker von irgendeinem Satz in dem Array verschieden von der aggregierten Masse jedes der Massenmarker von jedem anderen Satz in dem Array ist.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 15, bei dem jeder Massenmarker in mindestens einem Satz eine Massenreihen-modifizierende Gruppe mit einer gemeinsamen Masse umfasst, wobei die Massenreihen-modifizierende Gruppe in jedem der Massenmarker jedes Satzes eine andere Masse als die Massenreihen-modifizierenden Gruppen in jedem der Massenmarker jedes anderen Satzes in dem Array aufweist.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 16, bei dem die Massenreihen-modifizierenden Gruppen so an den Massenmarkern angebracht sind, dass bei der Spaltung des spaltbaren Linkers der Massenmarker die Massenreihen-modifizierenden Gruppen von den Massenmarkierungseinheiten entfernt werden.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, bei dem die Massenreihen-modifizierenden Gruppen jedes Satzes in dem Array eine gemeinsame Grundstruktur aufweisen und jeder Massenmarker jedes Satzes in dem Array die gleiche Zahl von Massenreihen-modifizierenden Gruppen wie die anderen Massenmarker des Satzes und eine andere Zahl von Massenreihen-modifizierenden Gruppen als die Massenmarker jedes anderen Satzes in dem Array aufweist.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 18, wobei jeder Massenmarker in dem Array eine der folgenden Strukturen aufweist: (S)_x-M(A)_y-L-X(A)_z M(A)_y-(S)_x-L-X(A)_z worin S eine Massenreihen-modifizierende Gruppe ist; M eine Massennormierungseinheit ist; X eine Massenmarkierungseinheit ist; A eine Masseneinstellungseinheit ist; L ein spaltbarer Linker ist; x eine ganze Zahl von 0 oder größer ist; y und z ganze Zahlen von 0 oder größer sind; und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist.
Array von Massenmarkern nach irgendeinem der Ansprüche 16-19, bei dem die Massenreihen-modifizierenden Gruppen eine Arylether-Gruppe umfassen.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, wobei jeder Massenmarker in dem Array eine der folgenden Strukturen aufweist:
worin R Wasserstoff ist oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist; A wie in Anspruch 19 definiert ist; jedes p das gleiche ist und eine ganze Zahl von 0 oder größer ist; x eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, wobei x für jeden Massenmarker in jedem Satz von Arrays das gleiche ist und das x jedes Satzes von dem x jedes anderen Satzes in dem Array verschieden ist; und y das gleiche oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller y' bei jedem Marker gleich y ist und jedes z' das gleiche oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller z' bei jedem Marker gleich z ist; und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, bei dem die Massenreihen-modifizierenden Gruppen jedes Satzes in dem Array eine gemeinsame Grundstruktur aufweisen, wobei die Massenreihen-modifizierende Gruppe der Massenmarker mindestens eines Satzes eine oder mehrere Masseneinstellungseinheiten umfasst, wobei die Masseneinstellungseinheiten an der Grundstruktur der Massenreihen-modifizierende Gruppe angebracht oder innerhalb dieser angeordnet sind.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 22, bei dem jeder Massenmarker jedes Satzes in dem Array die gleiche Zahl von Massenreihen-modifizierenden Gruppen aufweist, wobei die Massenreihen-modifizierende Gruppe in jedem Massenmarker jedes Satzes die gleiche Zahl von Masseneinstellungseinheiten wie die Massenreihen-modifizierenden Gruppen in jedem anderen Marker dieses Satzes aufweist und wobei die Massenreihen-modifizierenden Gruppen in den Massenmarkern jedes Satzes eine andere Zahl von Masseneinstellungseinheiten als die Massenreihen-modifizierenden Gruppen in den Markern jedes anderen Satzes in dem Array aufweisen.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 23, bei dem jeder der Sätze in dem Array Massenmarker mit einer der folgenden Strukturen umfasst: S(A*)_r-M(A)_y-L-X(A)_z M(A)_y-S(A*)_r-L-X(A)_z worin S eine Massenreihen-modifizierende Gruppe ist; M eine Massennormierungseinheit ist; X eine Massenmarkierungseinheit ist; A eine Masseneinstellungseinheit der Massenmarkierungseinheiten und Massennormierungseinheiten ist; A* das gleiche wie oder verschieden von A sein kann und eine Masseneinstellungseinheit der Massenreihen-modifizierenden Gruppen ist; L ein spaltbarer Linker ist; r eine ganze Zahl von 0 oder größer ist und bei einem oder mehreren Sätzen von Massenmarkern in dem Array mindestens 1 ist; y und z ganze Zahlen von 0 oder größer sind; und y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist.
Array von Massenmarkern nach Anspruch 24, bei dem jeder der Sätze in dem Array Massenmarker mit einer der folgenden Strukturen umfasst:

worin R Wasserstoff ist oder eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische, cyclische oder heterocyclische Gruppe ist; A und A* wie in Anspruch 24 definiert sind; jedes p das gleiche ist und eine ganze Zahl von 0 oder größer ist; x eine ganze Zahl von 0 oder größer ist, wobei x bei allen Massenmarkern in dem Array gleich ist; jedes y das gleiche oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller y' jedes Markers gleich y ist; und jedes z' das gleiche oder verschieden sein kann und eine ganze Zahl von 0-4 ist, wobei die Summe aller z' jedes Markers gleich z ist; y + z eine ganze Zahl von 1 oder größer ist; jedes r' das gleiche oder verschieden sein kann, wobei die Summe aller r' jedes Markers gleich r ist; und r eine ganze Zahl von 0 oder größer ist und bei einem oder mehreren Sätzen von Massenmarkern in dem Array mindestens 1 ist.
Array von Massenmarkern nach irgendeinem der Ansprüche 15-25, bei dem sich die Massenmarker irgendeines Satzes bezüglich der Masse von den Massenmarkern jedes anderen Satzes in dem Array um 4 Dalton oder mehr unterscheiden.
Satz von zwei oder mehr Sonden, in dem jede Sonde in dem Satz verschieden ist und an einen einzigartigen Massenmarker oder eine einzigartige Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, geknüpft ist.
Array von Sonden, umfassend zwei oder mehr Sätze von Sonden, wie in Anspruch 27 definiert, in dem jede Sonde in jedem Satz an einem einzigartigen Massenmarker oder einer einzigartigen Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, angebracht ist und wobei die Sonden in jedem Satz an Massenmarkern aus dem gleichen Satz von Massenmarkern angebracht sind und jeder Satz von Sonden an Massenmarkern aus einzigartigen Sätzen von Massenmarkern aus einem Array von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 15-26 definiert, angebracht ist.
Satz oder Array von Sonden nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, in dem jede Sonde an einer einzigartigen Kombination von Massenmarkern angebracht ist, wobei jede Kombination sich durch die Anwesenheit oder Abwesenheit jedes Massenmarkers in dem Satz von Massenmarkern und/oder die Menge jedes Massenmarkers, die an der Sonde angebracht ist, unterscheidet.
Satz oder Array von Sonden nach irgendeinem der Ansprüche 27-29, in dem jede Sonde ein Biomolekül umfasst.
Satz oder Array von Sonden nach Anspruch 30, in dem das Biomolekül aus einer DNA, einer RNA, einem Oligonukleotid, einer Nukleinsäurebase, einem Protein und/oder einer Aminosäure ausgewählt ist.
Analyseverfahren, wobei das Verfahren den Nachweis von zwei oder mehr Analyten durch gleichzeitige Identifikation ihrer Massenmarker oder Kombinationen von Massenmarkern mittels Massenspektrometrie umfasst, wobei die Massenmarker Massenmarker aus einem Satz von Massenmarkern sind, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem jeder Analyt durch eine einzigartige Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern identifiziert wird, wobei sich jede Kombination durch die Anwesenheit oder Abwesenheit jedes Massenmarkers in dem Satz und/oder die Menge jedes Massenmarkers unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 32 oder Anspruch 33 zur Identifikation von zwei oder mehr Analyten, bei dem die Analyten vor dem Nachweis des Massenmarkers durch Massenspektrometrie gemäß ihrer Masse aufgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 34, bei dem die Auftrennung mittels eines chromatographischen oder elektrophoretischen Verfahrens durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 32-35, bei dem das zum Nachweis des Massenmarkers verwendete Massenspektrometer einen oder mehrere Massenanalysatoren umfasst, wobei die Massenanalysatoren in der Lage sind, Ionen einer speziellen Masse oder eines speziellen Bereichs von Massen zum Nachweis durchtreten zu lassen und/oder in der Lage sind zu bewirken, dass Ionen dissoziieren.
Verfahren nach Anspruch 36, bei dem Ionen einer speziellen Masse oder eines speziellen Bereichs von Massen, die bzw. der für einen oder mehrere bekannte Massenmarker spezifisch ist, unter Verwendung des Massenanalysators selektiert werden, die selektierten Ionen dissoziiert werden und die Dissoziationsprodukte nachgewiesen werden, um Ionenmuster zu identifizieren, welche die selektierten Massenmarker anzeigen.
Verfahren nach Anspruch 36 oder Anspruch 37, bei dem das Massenspektrometer drei Quadrupol-Massenanalysatoren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 37 oder Anspruch 38, bei dem ein erster Massenanalysator verwendet wird, um Ionen mit einer speziellen Masse oder einem speziellen Massenbereich zu selektieren, ein zweiter Massenanalysator verwendet wird, um die selektierten Ionen zu dissoziieren, und ein dritter Massenanalysator verwendet wird, um die resultierenden Ionen nachzuweisen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 32-39, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen von zwei oder mehr Analyten mit einem Satz von Sonden oder einem Array von Sonden, wobei die Sonden wie in irgendeinem der Ansprüche 27-31 definiert sind, (b) Identifikation eines Analyten durch Nachweisen einer Sonde, die mit dem Analyten in Beziehung gebracht werden kann.
Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der Massenmarker vor dem Nachweis des Massenmarkers durch Massenspektrometrie von der Sonde abgespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 40 oder Anspruch 41, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine oder mehrere Nukleinsäuren mit einem Satz von Hybridisierungssonden in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 42, bei dem der Satz von Hybridisierungssonden einen Satz von bis zu 256 4-meren umfasst, wobei jede Sonde in dem Satz eine andere Kombination von Nukleinsäurebasen aufweist.
Verfahren zur zweidimensionalen Massenspektrometrie-Analyse, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von zwei oder mehr Analyten, wobei jeder Analyt mit einem Massenmarker oder einer Kombination von Massenmarkern markiert ist, wobei die Massenmarker aus einem Satz von Massenmarkern sind, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert; (b) Abspalten der Massenmarker von den Analyten; (c) Nachweis der Massenmarker; (d) Dissoziieren der Massenmarker in dem Massenspektrometer, um die Massenmarkierungseinheiten aus den Massennormierungseinheiten freizusetzen; (e) Nachweisen der Massenmarkierungseinheiten; und (f) Identifizieren der Analyten auf der Grundlage des Massenspektrums der Massenmarker und des Massenspektrums der Massenmarkierungseinheiten.
Verfahren nach Anspruch 44, bei dem im Schritt (c) Massenmarker einer gewählten Masse oder eines gewählten Bereichs von Massen zur Detektion selektiert werden und/oder in Schritt (e) Massenmarkierungseinheiten mit einer spezifischen Masse oder einem spezifischen Bereich von Massen zur Detektion selektiert werden.
Analyseverfahren nach Anspruch 32, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen einer ersten Auftrennungsbehandlung bei der Mischung von markierten Analyten auf der Grundlage einer ersten Eigenschaft der Analyten; (b) Durchführen einer zweiten Auftrennungsbehandlung der resultierenden aufgetrennten Analyten auf der Grundlage einer zweiten Eigenschaft der Analyten; und (c) Nachweisen eines Analyten durch Nachweisen seines Markers mittels Massenspektrometrie; wobei die Analyten mit einem Massenmarker aus einem Satz von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 46, bei dem im Schritt (a) und/oder Schritt (b) die Analyten gemäß ihrer Länge oder Masse aufgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 46 oder 47, bei dem im Schritt (a) und/oder Schritt (b) die Analyten gemäß ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 46-48, bei dem die Analyten ein Protein, ein Polypeptid, ein Peptid, eine Aminosäure oder eine Nukleinsäure oder Fragmente derselben umfassen.
Verfahren zur zweidimensionalen Gelelektrophorese nach irgendeinem der Ansprüche 46-49.
Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäure nach Anspruch 32, welches umfasst: (a) Bereitstellung einer Population von Nukleinsäure-Fragmenten, wobei jedes Fragment spaltbar daran angebracht einen Massenmarker aus einem Satz von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, zur Identifikation eines Merkmals dieses Fragments aufweist; (b) Auftrennen der Fragmente auf der Grundlage ihrer Länge; (c) Spalten jedes Fragments, um seinen Massenmarker freizusetzen; und (d) Bestimmen jedes Massenmarkers durch Massenspektroskopie, um das Merkmal jedes Fragments mit der Länge des Fragments in Beziehung zu bringen.
Verfahren nach Anspruch 51 zur Charakterisierung von cDNA, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einwirkenlassen eines Spaltungsmittels, das eine vorbestimmte Sequenz erkennt und an einer Bezugsstelle bei einer bekannten Versetzung von der vorbestimmten Sequenz proximal zu einem Ende jeder cDNA oder eines Fragments derselben schneidet, auf eine Probe, die eine Population von einer oder mehreren cDNAs oder Fragmenten derselben umfasst, um eine Population von terminalen Fragmenten zu erzeugen; (b) Ligieren eines Adapter-Oligonukleotids, das eine Erkennungsstelle für ein Auswahl-Spaltungsmittel umfasst, an jede Bezugsstelle; (c) Einwirkenlassen eines Auswahl-Spaltungsmittels, das sich an die Erkennungsstelle bindet und eine Auswahl-Stelle mit bekannter Versetzung von der Erkennungsstelle schneidet, auf die Population von terminalen Fragmenten, um in jedem terminalen Fragment eine Sequenz mit klebrigen Enden mit einer vorbestimmten Länge von bis zu 6 Basen und von unbekannter Sequenz zu erzeugen; (d) Auftrennen der Population von terminalen Fragmenten in Unterpopulationen gemäß der Sequenzlänge; und (e) Bestimmen jeder Sequenz mit klebrigen Enden durch: (i) Sondieren mit einem Array von markierten Hybridisierungssonden, wobei der Array alle möglichen Rasensequenzen der vorbestimmten Länge enthält; (ii) Ligieren dieser Sonden, die mit den Sequenzen mit klebrigen Enden hybridisieren; und (iii) Bestimmen, welche Sonden ligiert sind, durch Identifikation und vorzugsweise Quantifizierung der Marker; wobei die Marker Massenmarker aus einem Satz, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, sind.
Verfahren nach Anspruch 52, bei dem die Population von terminalen Fragmenten durch Kapillarelektrophorese, HPLC oder Gelelektrophorese aufgetrennt wird.
Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäure nach Anspruch 32, wobei das Verfahren das Erzeugen von Sauger-Leiter-Nukleinsäure-Fragmenten aus einer oder mehreren Nukleinsäure-Matrizen in Anwesenheit mindestens einer markierten terminierenden Base und das Identifizieren der Länge des Fragments und der terminierenden Base des Fragments umfasst, wobei der Marker mit der terminierenden Base in Beziehung gebracht werden kann und ein Massenmarker aus einem Satz ist, wie in irgendeinen der Ansprüche 1-14 definiert.
Verfahren nach Anspruch 54, bei dem alle vier terminierenden Basen in derselben Reaktionszone vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 54 oder Anspruch 55, wobei das Verfahren die Erzeugung von Sanger-Leiter-Nukleinsäure-Fragmenten aus einer Mehrzahl von Nukleinsäure-Matrizen, die in derselben Reaktionszone vorliegen, und bei jedem erzeugten Nukleinsäure-Fragment die Identifikation der Länge des Fragments, der Identität der Matrize, aus der das Fragment abstammt, und der terminierenden Base des Fragments umfasst, wobei vor der Erzeugung der Fragmente ein markiertes Primer-Nukleotid oder -Oligonukleotid mit jeder Matrize hybridisiert wird, wobei der Marker an jedem Primer für die Matrize spezifisch ist, mit der der Primer hybridisiert, um eine Identifikation der Matrize zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 56, bei dem der Marker, der die Matrize identifiziert, ein Massenmarker aus einem Satz ist, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert.
Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäure nach Anspruch 32, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Ziel-Nukleinsäure-Population, die eine oder mehrere zu sequenzierende einzelsträngige DNAs umfasst, von denen jede in einer einzigartigen Menge vorliegt und einen Primer trägt, um einen doppelsträngigen Abschnitt der Nukleinsäure für eine Ligierung daran bereitzustellen; (b) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäure-Population mit einem Array von Hybridisierungssonden, wobei jede Sonde einen Marker umfasst, der spaltbar an einer bekannten Basensequenz vorbestimmter Länge angebracht ist, wobei der Array alle möglichen Rasensequenzen dieser vorbestimmten Länge umfasst und die Rasensequenzen nicht miteinander ligieren können, wobei das In-Kontakt-Bringen in Anwesenheit von Ligase unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass die Sonde, welche die Basensequenz trägt, die komplementär zu der einzelsträngigen Nukleinsäure ist, welche an den doppelsträngigen Abschnitt angrenzt, an den doppelsträngigen Abschnitt jeder Nukleinsäure ligiert wird, um einen verlängerten doppelsträngigen Abschnitt zu bilden, der zur Ligierung an weitere Sonden nicht in der Lage ist; und (c) Entfernen aller nicht ligierten Sonden; gefolgt von den Schritten: (d) Spalten der ligierten Sonden, um jeden Marker freizusetzen; (e) Registrieren der Menge jedes Markers durch Massenspektrometrie; und (f) Aktivieren des verlängerten doppelsträngigen Abschnitts, um eine Ligierung daran zu ermöglichen; wobei (g) die Schritte (b) bis (f) in einem Zyklus über eine ausreichende Anzahl von Malen wiederholt werden, um die Sequenz der oder jeder einzelsträngigen Nukleinsäure durch Bestimmen der Reihenfolge der Freisetzung jedes Markers zu bestimmen, wobei die Marker der Hybridisierungssonden jeweils aus einem Satz sind, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert.
Verfahren nach Anspruch 58, bei dem die Hybridisierungssonden ein Satz von 256 4-meren sind, wobei jede Sonde in dem Satz eine andere Kombination von Nukleinsäurebasen aufweist.
Verfahren zur Charakterisierung einer Probe, die Peptide, Polypeptide und/oder Proteine umfasst, nach Anspruch 32, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe, die Peptide, Polypeptide und/oder Proteine umfasst, wobei jedes Peptid, Polypeptid und/oder Protein daran spaltbar angebracht einen Massenmarker oder eine Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern umfasst, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, wobei jedes Peptid, Polypeptid und/oder Protein mit seinem Marker oder seiner Kombination von Markern in Beziehung gebracht werden kann; (b) Analysieren der markierten Peptide, Polypeptide und/oder Proteine durch Massenspektrometrie, um die Marker nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 60, bei dem die Probe bereitgestellt wird, indem man Peptide durch die Einwirkung eines Spaltungsmittels auf eine Probe bildet, welche Polypeptide und/oder Proteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 60 oder Anspruch 61, bei dem die markierten Peptide, Polypeptide und/oder Proteine vor der Analyse durch ein chromatographisches oder elektrophoretisches Verfahren aufgetrennt werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 60-62, bei dem eine Mehrzahl von Proben bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 63, bei dem die Mehrzahl von Proben vor der Analyse gepoolt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 60-64, bei dem eines oder mehrere der Peptide, Polypeptide und/oder Proteine in der Probe posttranslational modifiziert sind und ein Kohlenhydrat umfassen und wobei das Verfahren die Biotinylierung des modifizierten Peptids, Polypeptids oder Proteins durch Anbringen von Biotin über eine Carbonylgruppe des Kohlenhydrats umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 60-64, bei dem eines oder mehrere der Peptide, Polypeptide und/oder Proteine in der Probe durch Tyrosinphosphorylierung posttranslational modifiziert ist und wobei das Verfahren das Auftrennen derartiger modifizierter Peptide, Polypeptide und/oder Proteine durch Affinitätschromatograpie unter Verwendung eines Anti-Phosphortyrosin-Antikörpers umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 60-64, wobei das Verfahren die Isolierung eines einzigen Peptidfragments aus jedem Peptid, Polypeptid und/oder Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 67, bei dem jedes isolierte Fragment ein terminales Fragment ist.
Verfahren nach Anspruch 68, wobei das Verfahren umfasst: (a) Behandeln einer Probe, die eine Population einer Mehrzahl von Polypeptiden umfasst, mit einem Spaltungsmittel, von dem bekannt ist, dass es in Polypeptid-Ketten einen spezifischen Aminosäure-Rest oder eine spezifische Aminosäuresequenz erkennt und an einer Spaltungsstelle spaltet, wodurch die Population unter Erzeugung von Peptidfragmenten gespaltet wird; (b) Isolieren einer Population von Peptidfragmenten, die als einen Bezugs-Terminus den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids tragen, aus dem sie fragmentiert wurden, wobei jedes Peptidfragment am anderen Ende die Spaltungsstelle trägt, die proximal zu dem Bezugs-Terminus liegt; (c) Markieren jedes Bezugs-Terminus der Polypeptide vor oder nach Isolierung der Peptidfragmente mit einem Massenmarker oder einer Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, wobei jeder Bezugs-Terminus mit seinem Marker oder seiner Kombination von Markern in Beziehung gebracht werden kann; und (d) Bestimmen einer Signatur-Sequenz eines oder mehrerer der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie, wobei die Signatur-Sequenz die Sequenz einer vorbestimmten Anzahl von Aminosäure-Resten ist, die von der Spaltungsstelle weg verlaufen; wobei eine Signatur-Sequenz jedes Polypeptid charakterisiert.
Verfahren nach Anspruch 68, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen einer Probe, die ein oder mehrere Polypeptide umfasst, mit einem ersten Spaltungsmittel, um Polypeptidfragmente zu erzeugen; (b) Isolieren eines oder mehrerer Polypeptidfragmente, wobei jedes Fragment den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids umfasst, aus dem es fragmentiert wurde; (c) Markieren jedes Terminus der Polypeptide vor oder nach dem Isolieren der Polypeptidfragmente mit einem Massenmarker oder einer Kombination von Massenmarkern aus einem Satz von Massenmarkern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-14 definiert, wobei jeder Terminus mit seinem Marker oder seiner Kombination von Markern in Beziehung gebracht werden kann; und (d) Identifizieren der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie; (e) Wiederholen der Schritte (a)-(d) bei der Probe unter Verwendung eines zweiten Spaltungsmittels, das an einer anderen Stelle als das erste Spaltungsmittel spaltet; und (f) Charakterisieren des einen oder der mehreren Polypeptide in der Probe aus den in den Schritten (d) und (e) identifizierten Fragmenten.
Verwendung eines Satzes oder eines Arrays von Markern, wie in irgendeinem der Ansprüche 1-26 definiert, in einem Verfahren zur Analyse durch Massenspektrometrie.
Verwendung nach Anspruch 71 in einem Verfahren zur zweidimensionalen Elektrophorese-Analyse.
Verwendung nach Anspruch 71 in einem Verfahren zur zweidimensionalen Massenspektrometrie-Analyse.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-73 in einem Verfahren zur Sequenzierung einer oder mehrerer Nukleinsäuren.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 71-73 in einem Verfahren zur Genexpressions-Profilierung.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 71-73 in einem Verfahren zur Proteinexpressions-Profilierung.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 71-73 in einem Verfahren zur Nukleinsäure-Sortierung.