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Diese
Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Verwendung
in der diagnostischen Analyse eines Flüssigkeitsprobenkörpers durch
Bindungsuntersuchungen. Insbesondere werden eine optisch und fluidisch
verbesserte in-vitro-Diagnosetestkammer und ein Verfahren zur Kammerbenutzung
gegenüber
der Vorrichtung und dem Verfahren, die bzw. das in Sell et al,
US 4,567,149 , ausgegeben am
28. Januar 1986, offenbart werden, offenbart.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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In
Sell et al,
US 4,567,149 ,
ausgegeben am 28. Januar 1986, wurde eine Vorrichtung und ein damit
verknüpftes
Verfahren zur Verwendung in der diagnostischen Analyse eines Flüssigkeitsprobenkörpers durch
Bindungsuntersuchungen offenbart. Die Vorrichtung schloß einen
starren Körper
und eine Vielzahl von gestreckten Strängen ein, manchmal ebenfalls
bezeichnet als Filamente und/oder Bänder, jeweils beschichtet mit
einer Bindungsuntersuchungskomponente und gestützt am Körper in beabstandeter Beziehung
zum gleichzeitigen Kontakt mit einem flüssigen Probenkörper. Die
Vielzahl an länglichen
Strängen
wurde entlang einer länglichen
Vertiefung, die in dem starren Körper
gebildet ist, positioniert und im allgemeinen quer zur Längsachse
der Vertiefung. Ein transparentes Element, im folgenden bezeichnet
als ein Deckglas, befestigt am starren Körper schloß die längliche Vertiefung zwischen
einem Einlaß und
einem Auslaß entlang
eines gemeinsamen Reagenzflußweges
vom Einlaß zum
Auslaß ein.
Die Stränge
wurden während
der Handhabung der Vorrichtung geschützt.
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Bei
Verwendung konnte ein spezifisches Volumens des flüssigen Probenkörpers in
der Vertiefung eingeengt und isoliert werden, wo es mit den Strängen inkubieren
kann. Die Vorrichtung der Erfindung war insbesondere geeignet für ein Allergiescreenen,
wobei jeder gestreckte Strang ein Baumwollstrang beschichtet mit
einem spezifischen Allergen war.
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Der
in Sell et al verwendete starre Körper war bevorzugt gebildet
aus Kunststoff und schloß einen
flachen Boden ein, der die gestreckte Vertiefung umgab. Der Strang
wurde über
die Vertiefung gespannt, von Böden
auf gegenüberliegenden
Seiten der Vertiefung. Das Deckglas lag über den Strängen und wurde an den Böden an den
gegenüberliegenden
Seiten der Vertiefung befestigt. Um eine Insertion von verschiedenen
Flüssigkeiten
in die Vertiefung zu ermöglichen,
einschließend
den flüssigen,
zu testenden Probenkörper,
geeignete Waschlösungen
und eine markierte Antikörperlösung, schloß der starre Körper eine Öffnung an
jedem Ende der gestreckten Vertiefung ein. Die Vorrichtung schloß ferner
eine Pipettenprojektion in Ausrichtung mit der Öffnung, angeordnet an einem
Ende der Vertiefung, ein.
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Das
Deckglas schloß bevorzugt
einen dünnen
Kunststoffbogen in unmittelbarem Kontakt mit dem Boden des starren
Körpers
ein. Das Deckglas wies einen überliegenden
Seidenschirm mit einer Reihe von parallelen schmalen Öffnungen
auf, jeweils ausgerichtet mit einem getrennten Baumwollstrang. Der
Seidenschirm optimiert das Messen der Reaktion jedes Baumwollstrangs
durch Reduzierung der wechselwirkenden Effekte von benachbarten Strängen. Das
Deckglas wurde bevorzugt an dem Boden des starren Körpers durch
eine Ultraschallverschweißung
befestigt.
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Die
Vorrichtung des US-Patents 4,567,149 an Sell et al ist weithin akzeptiert
und noch in erfolgreicher Verwendung. Bei Verwendung werden der Träger und
die Stränge
mit einem flüssigen
Probenkörper,
wie einem menschlichen Serum, gefüllt und inkubiert. Ein sekundärer Antikörper (beispielsweise Antikörper konjugiert
zu Meerrettichperoxidase – die mit
Luminol reagiert) – wird
für etwa
vier Stunden inkubiert. Anschließend werden die Stränge mit
einem Puffer – eine
Salzlösung – gewaschen
und entwässert.
Dieses Waschen fand dreimal statt. Nach diesem Schritt wird ein
Fluid, welches eine chemilumineszente Reaktion induziert, eingeführt. Die
Menge an multiplen biologischen Agenzien, die mit den Bindungsuntersuchungskomponenten
beschichtet auf den Strängen
wechselwirken, wird bestimmt durch Notierung der Gegenwart und Abwesenheit
von Licht, das aus jeder der Vertiefungen emittiert wird. Wenn beispielsweise
ein Screenen für
die Gegenwart von multiplen, allergenspezifischen Antikörpern der
IgE-Klasse in einer flüssigen
Probe durchgeführt wird,
wird die Vorrichtung mit der Testprobe inkubiert und dann, nach
dem Waschen, mit einer Lösung
enthaltend markierte Antikörper
gegen die Antikörper der
IgE-Klasse inkubiert, die sich an die Stränge angebunden haben. Die Stränge werden
dann analysiert, um die Gegenwart der markierten Antikörper zu bestimmen.
Wenn die markierten Antikörper
mit einem radioaktiven Indikator, wie 125I,
markiert sind, kann diese Analyse unter Verwendung eines Gamma-Zählers erreicht werden. Alternativ
kann die Analyse erreicht werden durch Anordnen der Stränge angrenzend
an einen fotografischen Film zur Exposition und dann durch Messen
des Grads an Exposition oder aktueller durch Registrierung gegenüber einem Lichtdetektor,
entweder Faseroptik- oder Direktdetektion.
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Diese
Vorrichtung hat ein hohes Maß an kommerziellem
Erfolg erfahren. Diese Offenbarung ist eine Verbesserung dieser
Vorrichtung. Spezifischerweise haben wir eine systematische und
ausführliche
Analyse der Vorrichtung aus dem Stand der Technik unternommen. Im
folgenden werden dem Leser die spezifischen Bereiche der Verbesserung einzeln
genannt.
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Zunächst wies
die Vorrichtung der
US 4,567,169 an
Sell et al eine gestreckte, flache Vertiefung oder einen Kanal auf,
die bzw. der im Querschnitt einheitlich war, lediglich unterbrochen
durch die Stränge,
die die Kammer querten. Dies resultierte in einer Vorrichtung, die
etwa 1,5 Milliliter Serum erforderte, um das gewünschte Testergebnis zu erzeugen.
Unglücklicherweise
sind pädiatrische
Proben in den meisten Fällen
von einem kleineren Volumen. Es wurde beispielsweise bestimmt, daß eine Vorrichtung,
die 0,500 Milliliter oder weniger erfordert, größere Nützlichkeit aufweisen würde, insbesondere
auf dem Gebiet der Pädiatrie.
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Zweitens
ist bestimmt worden, daß Stränge im allgemeinen,
und Baumwollstränge
im besonderen, große
Volumina an Allergen/Antigen/Reaktant in ihrer Absorption benötigen. Beispielsweise
war es für 40
Milliliter Allergenextrakt erforderlich, 12 Yards an Strang zu beschichten,
der als einer von 600 Strängen
in den Einheiten der Vorrichtung von Sell et al,
US 4,567,149 , verwendet werden könnte. Diese
Gebrauchsrate erhöht
die Kosten des Tests, wie er ebenfalls eine Allergenextraktion im
sehr großen Maßstab erfordert.
Dies ist ein Nachteil, da es die Kosten des Produkts erhöht. Zusätzlich ist
der Strang ein Naturprodukt (Baumwolle), und es kann schwierig und
kostenträchtig
sein, die Qualität
von Charge zu Charge zu kontrollieren.
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Wie
im folgenden diskutiert wird, können
nun diese gleichen 40 Milliliter an Allergen für 20.000 Tests verwendet werden.
Das neue Design weist Allergene direkt angefügt an dem Polystyroldeckglas auf,
und kein Strang wird verwendet.
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Drittens
erforderte die Ausrichtung und die Registratur der einzelnen Stränge zwischen
den einzelnen Böden
der Vorrichtung eine konstante Aufmerksamkeit und Leistung. Eine
Fehlausrichtung mußte
vermieden werden, um „falsche
positive" oder „falsche
negative" Reaktionen
zu vermeiden.
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Viertens,
und sobald die Stränge
mit Reaktanten inkubiert worden waren – wie Serum, ist es erforderlich,
daß sie
gewaschen und entwässert
werden. Mit einem geraden Fließweg
erfordert ein Waschen der Stränge
ein überschüssiges Fluid.
Ferner stellten eingesetzte Baumwollstränge sowohl Resistenz gegenüber einem
einheitlichen Waschen und ebenso eine geförderte Fluidretention der menschlichen
Seren oder on Salzlösung
bereit. Spezifischerweise an der Verbindungsstelle der Stränge und
des Flußweges
tendierte restliche Lösung – entweder
die Seren oder die Salzlösung – dazu,
sich anzusammeln. Diese Ansammlung trat aufgrund der Kombination
der Oberflächenspannung
kombiniert mit den unregelmäßigen Oberflächen auf,
die bereitgestellt wurden, wo die Stränge in den Kanal der Vorrichtung
eintraten. Spezifischerweise führten
die Baumwollstränge
zusätzliche
hervorstechende Merkmale (Oberflächen)
ein, wo Fluid durch Oberflächenspannung
(Kapillarkräfte)
eingefangen werden konnte. Der Betreiber treibt gegenwärtig dieses
Fluid manuell heraus.
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Die
Vorrichtung wird gegenwärtig
für das in-vitro-Testen
von Immunreaktionen gegenüber
verschiedenen Allergenen verwendet. Aus einem fluidmechanischen
Ansatz heraus erfordert der Betrieb der Vorrichtung, daß Blutserum
in die Testkammer eingezogen wird, wo es in Kontakt mit den verschiedenen
Allergenen kommt, die in den Strängen
abgelagert sind. Das Serum wird anschließend entwässert (unter Schwerkraft) aus
der Testkammer, und eine Salzlösung
wird verwendet, um die Vorrichtung weiter zu waschen. Während des
Waschzyklus wird eine Düse
in den Einlaß über der
Vorrichtung insertiert, ausbildend eine hermetische Abdichtung,
die es Fluid ermöglicht,
unter Druck in die Testkammer injiziert zu werden. Wenn diese Abdichtung
durch das Entfernen der Düse
aufgebrochen wird, wird das resultierende Druckvakuum vermindert,
was es dem Fluid ermöglicht,
aus der Vorrichtung zu entwässern.
Das unvollständige
oder sogar inkonsistente Entwässern der
Waschlösung
aus der Testkammer stellt ein potentielles Verdünnungsproblem für den anschließenden Betrieb
der Vorrichtung dar, was den Betreiber veranlassen sollte, zu gewährleisten,
daß das
gesamte Fluid aus der Kammer nach dem Waschen ausgetragen wird.
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Fünftens könnte die
Lichtausgabe aus der Vorrichtung, die eine Reaktion anzeigt, verbessert werden.
Insbesondere könnten
Stränge,
die eine sehr hohe Reaktion anzeigen, Licht außerhalb ihres ablesbaren Bereichs
ausstrahlen, was die Verwendung eines Quenchreagenzes erforderlich
macht. Ferner, und wo eine Reaktion außerordentlich schwach war,
wurde eine Erhöhung
des Substrats benötigt.
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Sechstens
ist der Deckträger
aus extrudiertem Polystyrol hergestellt, der zu Kratzern neigt und schwierig
herzustellen ist unter den Erfordernissen von QA-Anstrengungen,
um Teile auszuwählen.
Obwohl die Kratzer lediglich kosmetische Defekte sind, würde ein
geformtes Teil diese eliminieren und kosteneffektiver sein.
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In
Kürze gesagt,
machten unsere detaillierten Studien klar, daß eine Verbesserung möglich war.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine geschlossene Kammer, die in
einem System zum Screenen eines flüssigen Probenkörpers durch
Bindungsuntersuchungen verwendet wird, wie es in Anspruch 1 beansprucht
wird, und ein entsprechendes Verfahren, wie es in Anspruch 12 beansprucht
wird. Die geschlossene Kammer schließt einen Einlaß, einen
Auslaß und
eine Vielzahl von diskreten, Reaktant enthaltenden Vertiefungen
ein, die durch einen gemeinsamen Reagenzflußweg zwischen dem Einlaß und dem
Auslaß verbunden
werden. Ein Element oder ein Deckglas, welches optional transparent
ist, definiert auf einer Innenseite desselben die Vielzahl von Vertiefungen.
Jede Vertiefung weist einen Boden zur Aufnahme eines Reaktanten
auf, der Licht bei Reaktion emittiert. Das Deckglas kann ferner
zwischen dem Boden und der Vielzahl von Vertiefungen und dem Äußeren des
Deckglases einen Lichtweg zur Detektion der Reaktion definieren.
Dieses Deckglas kann optional wenigstens eine Linse an jeder Vertiefung
definieren und ist ein geformtes Teil. Dieser Lichtweg reemittiert
Licht aus Reaktionen innerhalb der Vertiefung zum Äußeren des
Deckglases, was die Abwesenheit oder Anwesenheit einer Reaktion
anzeigt. Ein Bodenelement definiert für jede der Vielzahl von Vertiefungen
ein Flußumlenkelement. Das
Flußumlenkelement
ist eine kontinuierliche Oberfläche,
wobei die kontinuierliche Oberfläche
zu einer der Vielzahl von Vertiefungen herausragt zum Umlenken von
Fluid, das von dem Einlaß zum
Auslaß im
Inneren der Vertiefungen fließt.
Diese Umlenkung erlaubt ein Auswaschen der Fluide aus der Vielzahl der
Vertiefungen. Gleichzeitig erhöht
die kontinuierliche Oberfläche
und verbessert im wesentlichen ein Fluidentwässern der Spüllösung – gewöhnlicherweise
eine Salzlösung.
Wo eine Lösung
mit entweder der Emission oder Abwesenheit von Licht verwendet wird,
um eine Reaktion anzuzeigen, dienen der Lichtweg und die optionalen
Linsen dazu, sowohl das emittierte Licht zu konzentrieren als auch
falsche positive Indikationen zu inhibieren. Schließlich wird
eine opa ke Trennung mit Schlitzen zum Umgeben der einzelnen Linsen
und im allgemeinen Isolieren des Lichtweges aus jeder Vertiefung
offenbart. Eine verbesserte Detektion resultiert.
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Mit
dem Zusammenbau eines Deckglases, eines Bodenelements und einer
opaken Trennung resultiert eine Kammer, die ein geringes Volumen
an Patientenserum verwendet. Die vorliegende Kammer wird mit etwa
270 μl Flüssigkeit
gefüllt.
Die Kammer ist insbesondere geeignet im Falle von pädiatrischen Proben.
Gleichzeitig resultiert die Reduktion des Volumens nicht in schlechten
Wascheigenschaften. Die fluidische Auslegung der Kammer ermöglicht die
Verwendung kleiner Volumina an Patientenseren, ebenso gewährleistet
sie ein ausreichendes Waschen.
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Die
innere Testkammer mit ihren Flußvermehrungsmerkmalen
ist ausgelegt worden, basierend auf fluidmechanischen Prinzipien,
um das Waschen der Allergenvertiefungen und die Entwässerungseigenschaften
der Vorrichtung zu optimieren. Die Form, Größe und Anordnung von (a) den
Allergenkavitäten,
(b) der flußvermehrenden „kontinuierlichen
Oberfläche" und (c) den Kammereinlaß/-auslaß-Abschnitten
sind ausgewählt
worden, um: (1) das innere Volumen der Testkammer zu minimieren,
(2) Kapillarfluidretention während
des Entwässerns
zu reduzieren, (3) ein optimales Auswaschen der Allergenkavitäten bei
geringen und hohen Flußgeschwindigkeiten
zu halten, und (4) den effizienten Betrieb der Vorrichtung über einen
größeren Bereich
von Positionen zu ermöglichen.
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Die
konturierte „kontinuierliche
Oberfläche" erhöht die Waschfähigkeit
der Vorrichtung durch Rücklenkung
des Hauptkanalflusses in die Allergenkavitäten. Die Vorrichtung kann ohne
beträchtlichen Verlust
an Waschungs/Entwässerungseffizienz
bis zu 35 Grad versetzt von der nominellen vertikalen Position betrieben
werden.
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Die
Migration aus dem flachen Deckglas in Richtung auf die neuen Allergenvertiefungen
führte neue
Komplexitäten
in das Design ein. Wo das Entwässern
eines der Hauptprobleme mit der flachen Deckglaskonfiguration war,
waren hier die „Waschfähigkeit" der Vorrichtung
in der Gegenwart der Allergenkavitäten die Hauptbedenken. Das
heißt,
die Fähigkeit
des Flußmusters
induziert durch die Injektion der Waschlösung in die Kammer, um das
viskosere Reagenz oder Blutserum aus den Oberflächen und Ecken der Allergenkavitäten zu verdrängen. Somit
ist die innere Form der Testkammer ausgelegt, um einen ausreichend
starken Fluidstrom zu ermöglichen,
um in diese Kavitäten
einzudringen und diese zu säubern.
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Streng
aus einem fluidmechanischen Ansatz heraus ist es wünschenswert,
diese Kavitäten
so breit wie möglich
in der Richtung des Flusses und ebenfalls so flach wie möglich zu
haben. Jedoch müssen
die Kavitäten
ausreichend tief sein, um die Abscheidung der erforderlichen Menge
an zu testendem Material zu ermöglichen,
wie dem Allergen. Ferner können
die Kavitäten
nicht übermäßig breit
ohne einen nachteiligen Effekt auf die Optiken der Vorrichtung hergestellt
werden, d. h. der Fähigkeit
des Lichtweges und des Trennsystems (mit oder ohne die optionale
Linse), um das Licht zur Detektion effizient zu konzentrieren und
das emittierte Licht aus den angrenzenden Vertiefungen zu isolieren.
Daher ist das Design der Allergenkavitäten in einer Weise durchgeführt worden,
die die fließtechnischen,
optischen und chemischen Erfordernisse der Vorrichtung erfüllt.
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Eine
der erforderlichen Änderungen
war, eine Kammer auszulegen, die die Lichtausgabe fokussieren kann.
Diese Änderung
in der Auslegung ist aus drei Gründen
wichtig. Zuerst ist die neue Kammer so ausgelegt, um eine Untersuchungsspezifizität zu erhöhen, wenn
eine sehr hohe Patientenreaktion erfahren wird. Zweitens ist die
Kammer so ausgelegt, um eine Untersuchungssensitivität durch
Fokussierung des Lichts auf das Detektorsystem zu erhöhen. Drittens
wird das Licht nicht länger
aus einer Leitungsquelle, wie einem Strang, emittiert. Es wird statt dessen
aus der flachen Bodenfläche
eine Vertiefung emittiert.
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Aus
einem optischen Standpunkt heraus ist das Designziel, eine diagnostische
in-vitro-Testkammer
zu entwickeln, die es ermöglicht,
daß das
Licht emittiert durch mehrere Allergene angeordnet innerhalb einer
Kammer effizient gesammelt werden kann, während eine minimale Lichtüberschneidung
zwischen diesen multiplen Allergenen erhalten wird. Das Detektionssystem,
das die Lichtemission detektiert, arbeitet (wie beim Scannen) entlang
einer Leitung, die Licht sammelt, das in ihre Eintrittsöffnung innerhalb
eines gegebenen Winkelbereichs eintritt. In einer Detektionsvorrichtung,
die den zuvor beschriebenen Stand der Technik einsetzt, sammelt
eine Positionierung der Detektionsoptik (sie liest tatsächlich ab, wenn
die Scans vorbeigehen) das Licht aus einem einzelnen Allergen an
einer bestimmten Stelle entlang seiner Scanleitung. Aufgrund der
Erfordernis, rückwärts kompatibel
mit der bestehenden Detektionsausrüstung zu sein, ist ein gewisses
Maß der Kammergeometrie
fixiert. Zwei Stücke,
ein optisch absorbierender Hauptkörper und das optisch transparente
Deckglas aus der Kammer.
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Das
Allergen wird in beabstandeten Vertiefungen (die gleichmäßig beabstandet
sein können oder
nicht) direkt auf dem transparenten Deckglas angeordnet. Typischerweise
kann die Oberfläche
der Vertiefung, wo das Allergen angeordnet ist, durch Bestrahlung,
wie Gamma oder Ultraviolett, behandelt werden. Die Tiefe der Vertiefungen
und die Form der sich verjüngenden
Ränder
werden als ein Kompromiß bestimmt,
um die Lichtüberschneidung
zu minimieren und die Waschfähigkeiten
zu maximieren. Das Oberteil des Deckglases weist eine Reihe von Einkerbungen
zwischen jeder der Vertiefungen auf, die sich nicht vollständig durch
das Stück
erstrecken. Auf der Oberseite des Deckglases ist ein optisch opakes
Trennstück,
welches Schlitze aufweist, die direkt oberhalb jeder Allergenvertiefung
angeordnet sind. Die Schlitze erlauben es Licht, durch die Linsen
zum Detektor zu gelangen. Das Trennstück weist Finger oder einzelne
opake Trennungen mit Schlitzen auf, die sich in die Einkerbungen
im Deckglas erstrecken, um Licht zu blockieren, um zum angrenzenden
Ablesebereich zu gelangen.
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Auf
der Oberseite des Deckglases, direkt oberhalb der Vertiefungen,
die die Allergene halten, ist eine Reihe von gleichmäßig beabstandeten
Linsen. Die Linsen ragen in die Schlitze in der Trennung hervor
und können
verschiedene Formen aufweisen. Durch geeignetes Bemessen der Krümmung der
Linsen wird die Menge an Licht von jedem Allergen, die gesammelt
und durch das Detektionssystem detektiert wird, optimiert. Die Linsen
können
eine zylindrische Form, eine Ringkernform oder ein sphärisches Oberflächenprofil
aufweisen, um die Lichtsammeleffizienz zu optimieren.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1A ist
eine Seitenschnittansicht der zusammengesetzten, diagnostischen
in-vitro-Testkammer,
die von unten nach oben den unteren Testkammerkörper, das gemeinsame Reagenzvolumen;
das obere Deckglas, das die einzelnen Vertiefungen und Linsen definiert;
und die überliegende
optische Trennung veranschaulicht;
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1B ist
eine Seitenschnittansicht der zusammengebauten, diagnostischen in-vitro-Testkammer,
die von unten nach oben den unteren Testkammerkörper, das gemeinsame Reagenzvolumen;
das obere transparente Element, das die einzelnen Vertiefungen,
Lichtweg ohne Linsen definiert; und die überliegende optische Trennung
veranschaulicht;
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2 ist
eine vergrößerte schematische Darstellung
der Wirkung des Flußweges,
der einen Spülfluß im Inneren
einer Vertiefung innerhalb des transparenten Deckglases umlenkt;
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3A ist
eine perspektivische Ansicht des Bodenkammerelements definierend
den kontinuierlichen gekrümmten
Vorsprung zwischen dem Einlaß und
Auslaß der
Kammer dieser Erfindung;
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3B ist
eine perspektivische Ansicht des Deckglases von der Vertiefungsseite,
so realisiert, daß zum
Durchführen
eines Zusammenbaus eine Drehung des Deckglases um 180° gefordert
ist;
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3C ist
eine perspektivische Ansicht der optischen Trennung zum Überliegen
der einzelnen Linsen jeder der diagnostischen Vertiefungen;
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4A ist
eine Bodenansicht des Bodens des Kammerkörpers;
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4B ist
eine Seitenschnittansicht des Bodens des Kammerkörpers;
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4C ist
eine Aufsicht auf das Innere des Kammerkörpers;
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4D ist
eine Seitenschnittansicht des Eingangs in die Kammer in dem Boden
des Kammerkörpers;
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4E ist
eine Aufsicht des Eingangs in den Boden des Kammerkörpers;
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5A ist
eine Aufsicht des Deckglases integrierend zylindrische Linsen;
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5B ist
eine Seitenansicht des Deckglases veranschaulichend die Seitenansicht
der Linsen;
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5C ist
eine Bodenansicht der Platte nach 5A;
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5D ist
eine Aufsicht des Deckglases ohne Linsen;
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5E ist
eine Seitenansicht des Deckglases ohne Linsen;
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5F ist
eine Bodenansicht des Deckglases ohne Linsen;
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6A ist
eine Bodenansicht der optischen Trennung der Kammer;
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6B ist
eine Seitenschnittansicht der optischen Trennung des Kammerkörpers;
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6C ist
eine Aufsicht der optischen Trennung des Kammerkörpers; und
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6D ist
eine vergrößerte Seitenschnittansicht
aufgenommen an der optischen Trennung.
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BESCHREIBUNG
DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Unter
Bezugnahme auf die Seitenschnittansicht nach 1A kann
ein Gesamtverständnis
der zusammengesetzten Kammer C erhalten werden. Kammer C schließt einen
Boden B definierend Flußvorsprünge P ein.
Wie im folgenden dargelegt wird, ist es die Funktion des Bodens
B und der Flußvorsprünge P, eine
effiziente Säuberungswirkung
für die einzelnen
Vertiefungen W enthaltend die gewünschten Reaktanten R bereitzustellen.
Um beim Minimieren des Lichtübertrags
zu helfen, ist der Boden B hergestellt aus einem Material, welches
Licht absorbiert. Wir bevorzugen die Verwendung eines opaken Materials,
das Licht absorbiert, wie es sich von Materialien unterscheidet,
die in jeder Weise reflektiv sein können.
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Überliegend
dem Boden B und beabstandet vom Boden ist ein transparentes Element
oder ein Deckglas T, wie es in 1 gezeigt
ist. Das Deckglas T dient zu drei Hauptfunktionen. Zuerst und wenn
es aus der in 1A und 1B gezeigten
Anordnung invertiert ist, nehmen einzelne Vertiefungen W Reaktanten
R auf. Die Reaktanten R haften am Boden der Vertiefungen W, wenn
das Deckglas T invertiert ist (siehe 2).
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Zweitens
erlaubt die transparente Abdeckung oder das Deckglas T es Licht,
aus Reaktanten R in Vertiefungen W zu entweichen, wenn ein diagnostisches
Verfahren vollständig
ist. Neh mend das Beispiel eines Screeningtests für eine Allergie können eine
oder mehrere der Vertiefungen W Licht emittieren, was die Gegenwart
oder Abwesenheit eines spezifischen Typs einer allergischen Reaktion anzeigt.
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Drittens
definiert das Deckglas T lediglich in 1A Linsen.
Diese Linsen L sind typischerweise zylindrisch, liegen über den
Vertiefungen W über
und erlauben es einem im allgemeinen kollimierten Lichtstrahl B,
aus Reaktanten R bei Vervollständigung
einer diagnostischen Reaktion zu entweichen. In 1B ist
eine Ausführungsform
gezeigt, die keine Linsen L einschließt.
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Schließlich, und
passend um Linsen L herum, ist ein opakes Stück S gezeigt. Das opake Stück S schließt eine
opake Trennung mit Schlitzen 14 ein, die auf jeder Seite
der einzelnen Linsen L hervorragen. Es ist die Funktion der opaken
Trennung mit Schlitzen 14, Licht aus Reaktanten R in einer
Vertiefung W von einer Abgabe einer „falschen positiven" Anzeige zu begrenzen.
Dies kann auftreten durch das Licht, das aus einer Vertiefung zu
einer Linse überliegend
einer benachbarten Vertiefung W entweicht. Der Zweck des opaken
Stückes
S liegt ebenfalls darin, das Licht zu minimieren, das seitlich von einer
Vertiefung emittiert, um dann sich mit einer angrenzenden Vertiefung
zu schneiden und dann zu streuen.
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Unter
Bezugnahme auf die Seiten-an-Seiten-Perspektiven der 3A, 3B und 3C und
mit spezieller Aufmerksamkeit auf 3B kann der
Zusammenbau der diagnostischen Kammer dieser Erfindung leicht verstanden
werden. 3B veranschaulicht ein Deckglas
T von der Seite enthaltend die einzelnen Vertiefungen W. Es beginnt
mit Vertiefung W1 und endet mit Vertiefung W38. In dem hier gezeigten
Beispiel sind Vertiefungen W1, W2 und W3 jeweils mit einem Reagenz
R1, R2 und R3 befüllt.
Im normalen Verlauf des Vorgangs würde das Deckglas T 90° gedreht
werden und alle 38 Vertiefungen wären gefüllt, jeweils mit einem unterschiedlichen
Reagenz. Typischerweise würde
jedes Reagenz behandelt werden, bis eine Anhaftung an dem Boden
der Vertiefungen W stattgefunden hat. Im üblichen Fall wird dies lediglich
ein Trocknen unter gesteuerten Bedingungen erfordern. Sobald diese
Anhaftung stattgefunden hat, wird das Deckglas T aus der in 3B gezeigten
Position herumgedreht, so daß Linsen
L (nicht gezeigt) in Richtung des Betrachters liegen.
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Der
Rest des Aufbaus ist herkömmlich.
Das Deckglas T ist mit dem Boden B in einer fluiddichten Beziehung
angepaßt.
Zwischen dem Deckglas T und dem Boden B ist ein fluiddichtes Volumen
zwischen Einlaß I
und Auslaß O
definiert. Anschließend
wird ein opakes Stück
S über
dem Deckglas T an Linsen L mit opaker Trennung mit Schlitzen 14 angeordnet auf
jeder Seite jeder Linse L angepaßt. Es resultiert eine zusammengesetzte
diagnostische Testkammer C.
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Die
Verwendung der Testkammer C kann umrissen werden. Bei Verwendung
wird die Kammer C durch Einlaß I
mit Auslaß O
offen befüllt,
bis sie vollständig
mit Reagenz gefüllt
ist – welches
gewöhnlicherweise
Serum zur Detektion einer allergischen Reaktion ist. Wenn sie gefüllt ist,
werden Reaktanten R für
ein ausreichendes Intervall inkubiert, um die Gegenwart und/oder
Abwesenheit einer Reaktion anzuzeigen.
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Ein
sekundärer
Antikörper
(beispielsweise Antikörper
konjugiert mit Meerrettichperoxidase – welche mit Luminol reagiert),
wird dann inkubiert. Anschließend
werden die Vertiefungen W mit einer Salzlösung gewaschen und entwässert. Dieses
Waschen und Entwässern
setzt Flußvorsprünge P innerhalb
des kontinuierlichen Reagenzflußweges
ein.
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Nach
diesem Schritt wird ein Fluid, welches eine chemiluminszente Reaktion
induziert, eingeführt,
diese chemilumineszente Reaktion findet an Vertiefungen W statt,
wo Reaktanten R eine Reaktion aufweisen (siehe 2).
Die Menge an multiplen biologischen Agenzien, die mit den Bindungsuntersuchungskomponenten
beschichtet auf den Vertiefungen W wechselwirken, wird bestimmt
durch Beachtung der Gegenwart und/oder Abwesenheit von Licht, das
aus jeder der Vertiefungen emittiert wird.
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Wenn
beispielsweise die Gegenwart eines multiplen, allergen-spezifischen
Antikörpers
der IgE-Klasse in einer flüssigen
Probe gescreent wird, wird die Vorrichtung mit der Testprobe inkubiert
und dann, nach dem Waschen, mit einer Lösung enthaltend markierte Antikörper gegen
die Antikörper
der IgE-Klasse, die an den Vertiefungen angebunden sind, inkubiert.
Die Vertiefungen werden dann analysiert, um die Gegenwart der markierten
Antikörper
zu bestimmen. Wenn die markierten Antikörper mit einem radioaktiven
Tracer, wie 125I, markiert sind, kann diese
Analyse erreicht werden unter Verwendung eines Gamma-Zählers. Alternativ
kann die Analyse erreicht werden durch Anordnung der Vorrichtung
benachbart zu einem fotografischen Film zur Exposition und dann
Messen des Grads an Exposition oder aktueller durch Registrierung
gegenüber
einem Lichtdetektor, entweder mit Faseroptik- oder durch Direktdetektion.
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Nachdem
der Gesamtbetrieb beschrieben worden ist, kann die Aufmerksamkeit
nun gerichtet werden auf die Flußdynamiken und Optiken, die
aus dieser Offenbarung resultieren.
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Die
durchschnittliche Scherspannung, τ, entlang
der Kavitätswand
am Vertiefungsboden wurde optimiert. Diese Scherspannung stellt
ein Maß der Kraft
dar, die die Waschlösung
auf Reagenz oder Serumfluidteilchen ausüben würde, die entlang des Bodens
der Vertiefungen W liegen.
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Unter
Bezugnahme auf 2 wurden Computermodelle für alternative
Konfigurationen konstruiert und verwendet, um das Flußmuster
für die
Testkammer zu erhalten. Die bevorzugte Ausführungsform, die aus diesem
Test resultierte, ist in 2 gezeigt.
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Die
Größenordnung
der resultierenden Scherspannung, gemittelt entlang der Kavitätswand, wurde
berechnet und gegen den Basisfall normiert. Bei der Abwesenheit
irgendwelcher Unebenheiten an der Bodenkanalwand induziert der „Hochgeschwindigkeits"-Hauptkanalfluß lediglich,
als ein Ergebnis einer Scherung (oder Reibung) zwischen den Schichten,
einen Fluß innerhalb
der Kavität.
Dieser Fluß ist
typischerweise viel schwächer
als der Hauptkanalfluß.
Der effizienteste Fluß,
in Bezug auf die Wandscherung, findet bei einem Längenverhältnis (Tiefe
zu Breite) von 0,5 statt. Wenn die Kavität zu tief ist, wird dann induzierter
Fluß zu
schwach im Bereich benachbart zur oberen Kavitätswand. Wenn die Kavität zu schmal
ist, vermeidet sie die Einrichtung eines gut organisierten Flußmusters,
und die resultierende Wandscherung beginnt zu fallen (beachte die
Abnahme in τ, wenn die Kavitätstiefe
abnimmt).
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Die
bevorzugte Auslegung für
die Vertiefungs/Vorsprungs-Konfiguration kann in 1A und 1B erkannt
werden. 2 legt ein tatsächliches Flußmodell
dar, das den Fluidfluß durch
die Kavität nach 4 veranschaulicht. Während normalerweise Dimensionen
nicht wichtig sind für
die Erfindung, hat hier die Auslegung der Flußkammer dimensionale Bedeutung.
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Unter
Bezugnahme auf 1A und 1B ist
die Tiefe des Flußkanals
0,011 Inch. Der Kanal neigt sich mit einem Winkel von 27,4° nach oben
und nach unten. Der Kanal variiert in der Höhe um 0,020 Inch. Betrachtet
in der Ebene weist der Kanal etwa eine Breite von 0,157 Inch auf.
Der Vorsprung ist in Bezug auf die Vertiefung W zentriert. Das Gesamtvolumen,
um die Flußkavität zu füllen, ist
im Bereich von 270 μl.
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In
Kürze gesagt
ist die Geometrie der ausgewählten
Konfiguration basierend auf mehreren Iterationen bestimmt worden,
die eine sukzessive Verbesserung des Auslegungskonzepts erlaubten.
Die Basiskavitätsform
wurde von einer rechteckigen zur Oberseite eines Trapezes geändert.
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Ferner
erleichtern die Kavitätswände besser das
Entwässern
der Vorrichtung.
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Unter
der Annahme, daß eine
Linse, wie sie in 1A dargelegt ist, verwendet
wird, müssen
Optiken durch Linse L verhältnismäßig geringe
Lichtmengen zu irgendeinem bestimmten Testsystem liefern, das mit
der Vorrichtung verwendet wird. Gleichzeitig muß eine Lichtquerung zwischen
einer Vertiefung W mit einer Reaktion und einer angrenzenden Vertiefung
mit keiner Reaktion vermieden werden. Wir haben entdeckt, daß die Kombination
der zylindrischen Linsen L mit dem flachen Vertiefungsboden der
Vertiefungen W eine verhältnismäßig kollimierte Ausgabe
des Lichts aus der Reaktion erzeugt. Durch Konstruktion des Bodens
B und des opaken Stücks
S aus Kunststoff, der opak und für
das emittierte Licht absorbierend ist (anzeigend die Gegenwart oder
Abwesenheit einer Reaktion), wird die Lichtquerung minimiert.
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Es
wird verstanden, daß die
offenbarten Optiken in Kombination mit der Vertiefung W einen sorgsamen
Kompromiß darstellen,
der in großem
Maße empirisch
bestimmt worden ist.
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Es
ist betont worden, daß aufgrund
der verhältnismäßig kleinen
Größe und des
kleinen Volumens der Vorrichtung die Abmessung wichtig ist. Demzufolge
stellen wir die nun bevorzugten Produktionszeichnungen in Bezug
auf die tatsächliche
Vorrichtung als Teil dieser Offenbarung bereit. 4A-4E veranschaulichen
den opaken Boden. 5A-5C veranschaulichen
das Deckglas T mit zylindrischen Linsen integriert im Design. 6A-6D veranschaulichen
die optische Trennung. Diese sind alle bereitgestellt, so daß die wahre Dimensionalität dieser
Erfindung verstanden werden kann.
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Wir
ziehen die Verwendung aller unterschiedlichen Arten von Markierungen
für die
detektierte Reaktion in Erwägung.
Während
wir 125I und chemilumineszente Reaktionen
aufgezählt haben, werden
andere Formen von Markierungen ebenfalls geeignet sein. Beispielsweise
können
colorimetrisch verbesserte Reaktionen verwendet werden. Während ferner
wir als unser Hauptnutzen eine allergische Reaktion dargelegt haben,
können
andere Arten von Reaktionen ebenfalls verwendet werden. Diese anderen
Reaktionsarten können
eine Detektion von Krebsmarkierungsmitteln, Infektionserkrankungen,
Hormonen, autoimmunen Stoffen und Arzneimittelmißbrauch einschließen.