DE60117978T2

DE60117978T2 - Modifizierung des hepatitis b kernantigens

Info

Publication number: DE60117978T2
Application number: DE60117978T
Authority: DE
Inventors: Mark Page; Jing-Li Li; Paul Biomedical Research And Study C Pumpens; Biomedical Research& Study Ctr. Galina Riga BORISOVA
Original assignee: UCB Pharma Ltd
Current assignee: UCB Pharma Ltd
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2021-06-23
Also published as: DK1294893T3; AU2001266163B2; ATE320493T1; EP1294893A2; US20040054139A1; PT1294893E; WO2001098333A2; ES2260235T3; CA2413546C; WO2001098333A3; JP2004500868A; DE60117978D1; AU6616301A; CA2413546A1; EP1294893B1

Description

Die Erfindung betrifft modifizierte Formen des Core-Antigens von Hepatitis-B-Virus (HBV) und prophylaktische und therapeutische Impfstoffe, die das modifizierte Antigen enthalten.
Hintergrund der Erfindung
HBV stellt nach wie vor ein bedeutendes Gesundheitsproblem sowohl in den Industrie- als auch den Entwicklungsländern dar. Eine Infektion mit dem Virus kann zu einer akuten oder chronischen Erkrankung führen, welche bei einem Anteil von Fällen zu hepatozellulärem Karzinom und Tod führen kann. Das Virus ist doppelschalig und seine DNA liegt geschützt innerhalb einer Proteinstruktur, bezeichnet als Core-Antigen (HBcAg). Das Core ist von einem Hüllprotein umgeben, bekannt als das Oberflächen- oder S-Antigen (HBsAg).
HBcAg ist ein ungewöhnliches Antigen, das als ein Transportvehikel für spezifische Peptide in das Immunsystem ausgenützt werden kann. Das Antigen ist zum Präsentieren von T-Helfer-, B- und cytotoxischen Lymphocyt-(CTL)-Epitopen von einer Vielzahl viraler und bakterieller Pathogene, einschließlich Epitopen vom Oberflächenantigen von HBV, Hüllproteinen von Hepatitis-A- und Antigenen von Hepatitis-C-Virus, verwendet worden. Für einen Überblick siehe Ulrich et al. (1998), Advances in Virus Research 50, 141–182.
HBcAg ist ein ausgezeichnetes Vehikel für die Präsentation von Epitopen aufgrund der Molekularstruktur des Proteins, welche sich selbst zu Partikeln zusammensetzt. Jeder Partikel wird aus entweder 180 oder 240 Kopien eines monomeren Polypeptids geschaffen. Das Polypeptid weist 183 oder 185 Aminosäuren (aa) in Abhängig keit vom Subtyp des HBV auf. Das Monomer bildet bei Erreichung einer geeigneten Konzentration innerhalb der Wirtszelle einen Partikel von etwa 27 nm Durchmesser. Strukturelle Studien haben gezeigt, dass Aminosäuren innerhalb der Region von Resten 68 bis 90 eine Spike-Struktur auf der Oberfläche des Partikels bilden, die als die E1-Schleife bekannt ist. Zwei durch Disulfid-Bindungen verbundene Monomere verknüpfen sich zu einem Dimer-Spike, dessen exponierteste Aminosäure an Position 80 sitzt (im Zentrum der E1-Schleife).
In EP-A-421635 (The Wellcome Foundation Limited) ist eine Modifikation des HBV-Core-Gens beschrieben, um die Einführung von Fremdepitopen in die E1-Schleife zu ermöglichen, ohne das Potential des Proteins zur Bildung von Partikeln zu verändern. Die Einführung an dieser Stelle erlaubt eine maximale Exposition des inserierten Epitops an der Spitze jedes Spikes, der durch Dimere des Proteins geschaffen ist. Da etwa 180 (oder 240) Kopien jedes Monomers pro Partikel vorliegen, ist jeder Partikel zum Präsentieren von 180 (oder 240) Kopien des Epitops von Interesse in der Lage.
So kann HBcAg zur Erzeugung von Hybridpartikeln verwendet werden, die als prophylaktische und therapeutische Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten Verwendung finden sollen. Allerdings ist in der Anfangsphase der Arbeit ein hoch unreines Nukleinsäure-Profil aufgrund der dem Core-Protein zueigenen Natur, an Nukleinsäure zu binden, identifiziert worden. Von der Bindung der Nukleinsäure ist bekannt, dass sie mit vier Arginin-Wiederholungen (Repeats) verbunden ist, die am C-Terminus des Proteins zu finden sind. Die Entfernung dieser Repeats unter Verwendung gentechnischer Werkzeuge ist als machbar nachgewiesen worden und führt zur Produktion von Partikeln, die die Nukleinsäure nicht einkapseln. Allerdings scheint die Entfernung dieser Region die inhärente Stabilität der Partikelstruktur herabzusetzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Um die Partikelstabilität aufrecht zu erhalten und zugleich das Problem der Nukleinsäure-Unreinheit zu überwinden, haben die Erfinder eine alternative und neuartige Strategie entwickelt. Die Strategie beinhaltet das Erzeugen eines Klons, in welchem ein oder mehrere der Arginin-Wiederholungen von HBcAg entfernt sind, doch in dem das C-terminale Cystein rückbehalten ist. Die Entfernung der Arginin-Wiederholungen vermindert die Bindung an Nukleinsäure, während die Rückbehaltung des C-terminalen Cysteins die Bildung einer Disulfid-Bindung erlaubt, die in der nativen Struktur für die Bildung eines stabilen Partikels wichtig ist. Die deletierte(n) Wiederholungen) kann/können durch Sequenzen ersetzt werden, die T-Helfer-, B- oder CTL-Epitope von bakteriellen oder viralen Pathogenen, Parasiten, Allergenen oder Krebs-assoziierten Antigenen codieren. Dies wird durch Einführung einer geeigneten Klonierungsstelle anstelle der deletierten Region ermöglicht.
Somit stellt die Erfindung ein Protein bereit, das HBcAg umfasst, worin ein oder mehrere der vier Arginin-Wiederholungen abwesend sind und ein C-terminaler Cysteinrest anwesend ist. Ein Epitop von einem anderen Protein als HBcAg kann anstelle des/der abwesenden Arginin-Wiederholungen) vorhanden sein. Das Protein kann in eine pharmazeutische Zusammensetzung für die prophylaktische oder therapeutische Impfung, z.B. gegen HBV, aufgenommen werden.
Das Protein der Erfindung kann ein zweites Epitop von einem anderen Protein als HBcAg umfassen, und das zweite Epitop kann in der E1-Schleife von HBcAg liegen. Durch Platzieren eines T-Helfer-Epitops in den C-Terminus und eines B-Zell-Epitops in die E1-Schleife ist eine Steigerung der Antwort auf das B-Zell-Epitop durch intrastrukturelle T-Zell-Hilfe möglich. Außerdem kann die Strategie zur Verdopplung der Zahl eines bestimmten Epitops auf jedem Partikel angewendet werden, indem dieselbe Sequenz sowohl in die E1-Schleife als auch die C-terminale Region kloniert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Aminosäuresequenz des Hepatitis-B-Cores unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes. Die C-terminale Sequenz (aa135–185) ist zur Detaillierung der Deletionsstrategie hervorgehoben. Die vier Arginin-(R)-Wiederholungen sind zur Betonung fett gedruckt und unterstrichen. Drei bzw. vier Regionen der Arginin-Wiederholungen sind von aa154–178 bzw. aa146–178 unterstrichen. Die Deletion der unterstrichenen Regionen unter Einführung der SpeI-Restriktionsstelle generiert Konstrukte, die durch Plasmide pTCR₁₅₄ bzw. pTCR₁₄₆ codiert sind. pTCR₁₅₄ behält die N-terminale Arginin-Wiederholung bei, und bei pTCR₁₄₆ sind alle vier Arginin-Wiederholungen deletiert.
2: DNA-Sequenz, die für HBcAg codiert, und Lokalisation und Orientierung der für die PCR verwendeten Oligonukleotid-Primer. Die Position der SpeI-Restriktionsstelle ist für Oligos MGR371, MGR369 und MGR370 angegeben (siehe Tabelle 1).
3: DNA- und Aminosäuresequenzen von in das Core inserierten pre-S2- und S-Epitopen. 3A zeigt die Sequenz von aa20–55 der pre-S2-Region des HBV-ayw-Subtyps. 3B zeigt die Sequenz von aa110–147 des S-Antigens des adw-Subtyps. 3C zeigt die Sequenz von aa110–157 des S-Antigens des adw-Subtyps.
4: Agarosegelelektrophorese von inversen PCR-Fragmenten. Bahnen 1, 2, 3 und 4 = Fragmente für pTCR₁₄₆, pTCR₁₅₄, pTCSR₁₄₆ bzw. pTCSR₁₅₄. Bahn 5 = Größenmarker. Alle Fragmente betragen etwa 5 kb, wie erwartet.
5: Immunoblot-Analyse der Expression des Core-Proteins in Lysaten von E. coli-Bakterien, die mit 3'-Austauschplasmid-Konstrukten transformiert sind. Alle Proben exprimieren ein Anti-Core-Antikörper-reaktives Protein von verschiedenen relativen Molekulargewichten in Abhängigkeit vom Vorhandensein oder der Abwesenheit von Austauschsequenzen und der Größe des Austauschs. Probenreihenfolge:
Bahn 1 = pTCR₁₄₆ E. coli HB101
Bahn 2 = pTCR₁₄₆/S110–157 E. coli HB101
Bahn 3 = pTCR₁₄₆/S2–2 E. coli HB101
Bahn 4 = pTCR₁₅₄ E. coli HB101
Bahn 5 = pTCR₁₅₄/S110–147 E. coli HB101
Bahn 6 = pTCR₁₅₄/S110–157 E. coli HB101
Bahn 7 = pTCR₁₅₄/S2–2 E. coli HB101
Bahn 8 = pTCSR₁₄₆ E. coli BB101
Bahn 9 = pTCSR₁₄₆/S 110–157 E. coli HB101
Bahn 10 = pTCSR₁₄₆/S2–2 E. coli HB101.
6: Immunoblot-Analyse der Expression der S-Sequenz in Lysaten von Bakterien, die mit 3'-Austauschplasmid-Konstrukten transformiert sind. Konstrukte, die die S-Sequenzen enthalten (Bahnen 2, 4, 5 und 7) sind Anti-S-Antikörper-reaktiv. Probenreihenfolge:
Bahn 1 = pTCR₁₄₆ E. coli HB101
Bahn 2 = pTCR₁₄₆/S110–157 E. coli HB101
Bahn 3 = pTCR₁₅₄ E. coli HB101
Bahn 4 = pTCR₁₅₄/S110–147 E. coli HB101
Bahn 5 = pTCR₁₅₄/S110–157 E. coli HB101
Bahn 6 = pTCSR₁₄₆ E. coli HB101
Bahn 7 = pTCSR₁₄₆/S110–157 E. coli HB101
Bahn 8 = Prestain-Marker(Novex).
7: Immunoblot-Analyse der Expression der pre-S2-Sequenz in Lysaten von Bakterien, die mit 3'-Austauschplasmid-Konstrukten transformiert sind. Konstrukte, die die pre-S2-Sequenzen enthalten (Bahnen 2, 4 und 6) sind pre-S2-Antikörperreaktiv. Probenreihenfolge:
Bahn 1 = pTCR₁₄₆ E. coli HB101
Bahn 2 = pTCR₁₄₆/S2–2 E. coli HB101
Bahn 3 = pTCR₁₅₄ E. coli HB101
Bahn 4 = pTCR₁₅₄/S2–2 E. coli HB101
Bahn 5 = pTCSR₁₄₆ E. coli HB101
Bahn 6 = pTCSR₁₄₆/S2–2 E. coli HB101
Bahn 7 = Prestain-Marker(Novex).
8: Zeigt gemittelte Anti-HBc-Antworten in Mäusen, die mit verschiedenen, in den Beispielen beschriebenen Konstrukten immunisiert worden sind. Die Titer wurden als die negativen Logarithmen der EC50-(effektive Konzentration, 50%)- Serumverdünnung auf der Grundlage der sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Modifikationen der HBcAg-Sequenz
Wie oben erwähnt, ist HBcAg ein Protein von 183 oder 185 Aminosäuren in Abhängigkeit vom Subtyp des HBV. Die beiden zusätzlichen Aminosäuren in der 185-Form des Proteins sind zwischen den ersten und den zweiten Arginin-Wiederholungen lokalisiert. Die Sequenz einer 185-Aminosäure-Form des Proteins mit einer Presequenz ist in 1 gezeigt. In 1 verläuft die reife HBcAg-Sequenz vom Met-Rest an Position 25 zum Cys-Rest am extremen C-Terminus, wobei die Sequenz von Resten 1 bis 24 die pre-Sequenz darstellt. Die vier Arginin-Wiederholungen sind an den folgenden Positionen lokalisiert:
Eine oder mehrere der Arginin-Wiederholungen ist im Protein der Erfindung deletiert. Demnach ist es möglich, eine, zwei, drei oder alle vier der Wiederholungen zu deletieren und die erste Wiederholung, die zweite Wiederholung, die dritte Wiederholung und/oder die vierte Wiederholung zu deletieren. Jegliche Kombination der vier Wiederholungen kann deletiert werden. Die erste Wiederholung ist primär für die RNA-Bindung verantwortlich, und die zweiten, dritten und vierten Wiederholungen sind primär für die DNA-Bindung verantwortlich, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform die erste Wiederholung beibehalten bleibt und die zweiten bis vierten Wiederholungen deletiert werden, um die DNA-Bindung spezifisch zu vermindern.
Eine Sequenz, die zwischen Resten 145 und 182 von HBcAg liegt, ist generell in den Proteinen der Erfindung abwesend, und vorzugsweise ist eine Sequenz, die zwischen Resten 150 und 177 liegt, abwesend. Die deletierte Sequenz kann die Gesamtheit der Sequenz von Rest 154 bis Rest 182 (oder von Rest 150 bis Rest 177) umfassen oder kann lediglich einen Teil der Sequenz zwischen diesen Resten umfassen. Gleichermaßen kann sich die deletierte Sequenz auf beiden Seiten dieser Reste erstrecken. Wie hierin verwendet, bedeuten Ausdrucksweisen wie „eine Sequenz, die zwischen Resten x und y liegt, ist abwesend", dass die Sequenz, die abwesend ist, Reste x und y beinhalten kann. Die Entfernung der Sequenz stromaufwärts des Rests 145 kann die Partikel-Bildungsfähigkeit des Proteins beeinflussen und ist daher allgemein nicht empfehlenswert. In 185-aa-Formen von HBcAg kann die deletierte Sequenz bei Rest 184 enden, und in 183-aa-Formen kann sie bei Rest 182 enden.
Der C-terminale Cysteinrest im Protein der Erfindung ist typischerweise der natürliche Rest vom C-Terminus von HBcAg, welchem typischerweise die Sequenz unmittelbar stromaufwärts des Rests in HBcAg vorangeht. Die vorangehende HBcAg-Sequenz kann 1 bis 7 Reste, d.h. 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Reste, umfassen. So kann der C-Terminus des Proteins der Erfindung die Sequenz Gln Cys, Ser Gln Cys, Glu Ser Gln Cys, Arg Glu Ser Gln Cys, Ser Arg Glu Ser Gln Cys, Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys oder Ser, Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys aufweisen. Der Cys-Rest ist möglicherweise jedoch nicht der von HBcAg; in diesem Fall kann ein Protein gemäß der Erfindung durch Verkürzen der HBcAg-Sequenz und Ergänzen der verkürzten Sequenz durch eine andere Sequenz, einschließlich eines Cys-Rests und wahlweise eines Epitops von einem anderen Protein als HBcAg, konstruiert werden. Der Cys-Rest ist typischerweise am extremen C-terminalen Ende des Proteins der Erfindung lokalisiert, doch kann er eine Anzahl von Aminosäureresten vom extremen C-terminalen Ende betragen. Z.B. kann er 1 bis 20, 1 bis 10 oder 1 bis 5 Reste vom C-Terminus betragen. In jedem Fall muss der Cys-Rest zur Bildung einer Disulfid-Bindung in der Lage sein.
Das Protein der Erfindung umfasst typischerweise die folgenden Elemente, die in einer N-terminalen nach C-terminalen Richtung verknüpft sind:

(i) einen N-terminalen Teil von HBcAg, welcher die Bildung von Partikeln vermittelt, z.B. Reste 1 bis 144 (oder 1 bis 146 oder 1 bis 154), und
(ii) einen C-terminalen Teil von HBcAg, umfassend das C-terminale Cystein;

Wo das Protein außerdem ein Epitop von einem anderen Protein als HBcAg anstelle des/der abwesenden Arginin-Wiederholungen) umfasst, enthält das Protein typischerweise die folgenden Elemente, die in einer N- nach C-terminalen Richtung verknüpft sind:

(i) einen N-terminalen Teil von HBcAg, welcher die Bildung von Partikeln vermittelt, z.B. Reste 1 bis 144 (oder 1 bis 146 oder 1 bis 154),
(ii) ein Epitop von einem anderen Protein als HBcAg, und
(iii) einen C-terminalen Teil von HBcAg, umfassend das C-terminale Cystein;

Wo das Protein ein Epitop von einem anderen Protein als HBcAg in der E1-Schleife umfasst, enthält das Protein typischerweise die folgenden Elemente, die in einer N- nach C-terminalen Richtung verknüpft sind:

(i) einen N-terminalen Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend z.B. Reste 1 bis 67 (oder 1 bis 74 oder 1 bis 79),
(ii) ein Epitop von einem anderen Protein als HBcAg,
(iii) einen zweiten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend z.B. Reste 91 bis 144 (oder 91 bis 146, 91 bis 154, 86 bis 144, 86 bis 146, 86 bis 154, 80 bis 144, 80 bis 146 oder 80 bis 154), und
(iv) einen dritten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend das C-terminale Cystein;

Wo das Protein der Erfindung sowohl ein erstes Epitop von einem anderen Protein als HBcAg anstelle des/der abwesenden Arginin-Wiederholungen) als auch ein zweites Epitop von einem anderen Protein als HBcAg in der E1-Schleife umfasst, enthält das Protein typischerweise die folgenden Elemente, die in einer N- nach Cterminalen Richtung verknüpft sind:

(i) einen N-terminalen Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend z.B. Reste 1 bis 67 (oder 1 bis 74 oder 1 bis 78);
(ii) ein Epitop von einem anderen Protein als HBcAg,
(iii) einen zweiten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend z.B. Reste 91 bis 144 (oder 91 bis 146, 91 bis 154, 86 bis 144, 86 bis 146, 86 bis 154, 80 bis 144, 80 bis 146 oder 80 bis 154),
(iv) ein weiteres Epitop von einem anderen Protein als HBcAg, und
(v) einen dritten Teil der HBcAg- Sequenz, umfassend das C-terminale Cystein;

Wie aus obigem erkennbar sein wird, erwägen die Erfinder spezifisch die Modifikation der HBcAg-Sequenz in einer Anzahl von Weisen, einschließlich der Deletion einer oder mehrerer der Arginin-Wiederholungen, der Insertion eines heterologen Epitops anstelle des/der deletierten Wiederholungen) und die Insertion eines zweiten Heterologs in die E1-Schleife. Eine weitere Modifikation der HBcAg-Sequenz ist jedoch möglich. Diese weitere Modifikation kann durch eine Substitution, Insertion, Deletion oder Extension erfolgen. Die Größe einer Insertion, Deletion oder Extension kann z.B. von 1 bis 200 aa, von 1 bis 100 aa oder von 1 bis 50 aa, von 1 bis 20 aa oder von 1 bis 6 aa in der Sequenz von HBcAg betragen. Substitutionen können eine Anzahl von Aminosäuren von bis zu beispielsweise 1, 2, 5, 10, 20 oder 50 Aminosäuren über die Länge der HBcAg-Sequenz einbeziehen. Das modifizierte Protein behält allgemein die Fähigkeit zur Bildung von Partikeln bei. Die Substitutionen werden generell konservativ sein und können beispielsweise gemäß der folgenden Tabelle vorgenommen werden, worin Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in der selben Zeile in der dritten Spalte füreinander substituiert werden können.
Jeder Teil der HBcAg-Sequenz im Protein der Erfindung weist vorzugsweise zumindest 70% Sequenzidentität zur entsprechenden Sequenz eines natürlichen HBcAg-Proteins auf, wie etwa dem Protein mit der in SEQ ID NR. 2 gezeigten Sequenz. Bevorzugter beträgt die Identität zumindest 80%, zumindest 90%, zumindest 98%, zumindest 97% oder zumindest 99%. Die Methoden zur Messung der Identität der Proteinsequenz (und Nukleinsäuresequenz) sind im Fachgebiet wohlbekannt. Z.B. bietet das UWGCG-Package das BESTFIT-Programm (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, S. 387–395). Entsprechend können die PILEUP- und BLAST-Algorithmen für das Alignment der Sequenzen verwendet werden (wie z.B. beschrie ben bei Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36: 290–300 und Altschul, S. F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10).
Das Protein der Erfindung kann sich selbst zu Partikeln zusammensetzen, die den durch natives HBcAg gebildeten Partikeln stark ähneln können. Die Partikel können 20 bis 40 nm im Durchmesser betragen, doch betragen vorzugsweise etwa 27 nm im Durchmesser (welches die Größe der nativen HBcAg-Partikel ist). Sie enthalten keine nachweisbaren oder verminderten Mengen an Nukleinsäure (DNA und RNA) im Vergleich zu Partikeln des nativen HBcAg. Sie können 160 bis 260 Monomere des Proteins der Erfindung enthalten, doch vorzugsweise enthalten sie etwa 180 oder etwa 240 Monomere (was die Anzahl der Monomere in nativen HBcAg-Partikeln ist).
Die Bestimmung der Partikelbeschaffenheit eines Proteins gemäß der Erfindung kann durch Größenausschlusschromatographie und/oder Elektronenmikroskopie erfolgen. Die Bestimmung des DNA-Gehalts der Partikel kann durch Agarosegelelektrophorese oder Spektrophotometrie erfolgen. Ein von Birnbaum und Nasal (1990, J. Virology 64 3319–3330) adaptiertes Verfahren kann angewendet werden. Das Protein kann mit Proteinase K verdaut und die Nukleinsäure unter Verwendung eines handelsüblichen DNA-Gewinnungskits (z.B. Qiagen, QIAquick^TM PCR Purification Kit) extrahiert werden. Die gereinigte DNA kann unter Verwendung einer hoch empfindlichen DNA-Färbemittels (z.B. Novex, SYBER Green I^TM) in einem 1,5% Agarosegel, gefolgt von Elektrophorese, sichtbar gemacht werden. Das nach der Extraktion erhaltene DNA-Produkt kann unter Verwendung des optische Dichte (OD) 260 nm : 280 nm-Verhältnisses gemäß Sambrook et al. (1989, Molecular cloning – A laboratory manual, 2. Auflage, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press) z.B. unter Verwendung eines Pharmacia Biotech Ultraspec 2000^TM quantifiziert werden.
Die Epitope
Als allgemeine Regel sollten die in das Protein der Erfindung inserierten Epitope die Faltung des HBcAg oder seinen Selbstzusammenbau zu Partikeln nicht verhindern. Außerdem sollten für eine verbesserte Immunogenität die B-Zell-Epitope an der O berfläche des Partikels exponiert sein. Die T-Zell-Epitope brauchen für eine optimale Präsentation nicht an der Oberfläche des Partikels exponiert zu sein.
Es gibt drei bevorzugte Regionen für die Insertion der Epitope, nämlich den C-Terminus anstelle des/der deletierten Arginin-Wiederholung(en), die E1-Schleife und den N-Terminus. Diese drei Regionen tolerieren die Insertion von Fremdsequenzen allesamt gut. Wird ein Epitop in die E1-Schleife von HBcAg platziert, so kann es in die Sequenz der Aminosäurereste 68 bis 90, 69 bis 90, 71 bis 90, 75 bis 85 oder 78 bis 83 inseriert werden. Am bevorzugtesten ist die Insertion des Epitops zwischen die Reste 79 und 80 oder 80 und 81. HBcAg-Reste von der E1-Schleife können in den Proteinen der Erfindung deletiert sein, sodass das inserierte Epitop die gesamte oder einen Teil der Sequenz der Schleife ersetzt.
Ein in einem Protein der Erfindung vorhandenes heterologes Epitop kann ein B-Zell-Epitop oder ein T-Zell-Epitop sein. In dem Falle, dass ein Epitop ein T-Zell-Epitop ist, kann es ein T-Helfer-(Th)-Zell-Epitop (entweder ein Th1- oder ein Th2-Epitop) oder ein cytotoxisches Lymphocyt-(CTL)-Epitop sein.
Das Protein der Erfindung kann mehr als ein heterologes Epitop enthalten, z.B. bis zu 2, 3, 5 oder 8 heterologe Epitope, wobei in diesem Fall jedes Epitop an derselben Stelle oder an unterschiedlichen Stellen in HBcAg vorhanden sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eines der Epitope ein T-Helfer-Zell-Epitop und ein anderes ein B-Zell- oder ein CTL-Epitop. Das Vorhandensein des T-Helfer-Zell-Epitops erhöht die Immunantwort gegen das B-Zell- oder CTL-Epitop. Wo zwei oder mehrere heterologe Epitope im Protein der Erfindung vorhanden sind, können sie vom gleichen Organismus oder dem gleichen Protein sein. Tatsächlich können die Epitope dieselben sein; dies erlaubt eine Verdoppelung oder weitere Multiplikation der Zahl der auf den Partikeln vorhandenen Epitope.
Die Größe der Sequenz, die ein in das Protein der Erfindung inseriertes Epitop umfasst, kann zwischen breiten Grenzen variieren, doch wird sie allgemein von 6 bis 120 aa, zum Beispiel von 6 bis 80 aa oder 6 bis 40 aa, betragen. Ein Epitop kann konformationell oder linear sein.
Die Wahl des Epitops hängt von der Erkrankung ab, gegen die eine Impfung gewünscht wird. Typischerweise stammt das Epitop von einem Pathogen, wie etwa einem Virus, einem Bakterium oder einem Protozoe, doch kann es auch von einem Krebs-assoziierten Antigen oder einem Allergen stammen. Zu Beispielen der Pathogene, deren Epitope inseriert werden können, zählen Hepatitis-A-Virus (HAV), HBV, Hepatitis-C-Virus (HCV), Influenza-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus, Poliovirus, Herpes-simplex-Virus, Tollwut-Virus, Katzenleukämie-Virus, humanes Immunschwäche-Virus Typ I (HIV1), humanes Immunschwäche-Virus Typ II (HIV2), Affen-Immunschwäche-Virus (SIV), humanes Rhinovirus, Dengue-Virus, Gelbfieber-Virus, humanes Papillomavirus, Plasmodium falciparum (ein Erreger von Malaria) und Bakterien wie Mycobacteria, Bordetella, Salmonella, Escherichia, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia und Brucella.
Spezifisch kann das Bakterium Mycobacterium tuberculosum – der Erreger von Tuberkulose; Bordetella perfussis oder Bordetella paraperfussis – der Erreger von Keuchhusten; Salmonella typhimurium – der Erreger von Salmonellosis bei verschiedenen Tier-Spezies; Salmonella typhi – der Erreger von humanem Typhus; Salmonella enteritidis – ein Erreger von Lebensmittelvergiftung beim Menschen; Salmonella choleraesuis – ein Erreger von Salmonellosis bei Schweinen; Salmonella dublin – ein Erreger sowohl einer systemischen als auch diarrhoischen Erkrankung bei Rindern, insbesondere bei neugeborenen Kälbern; Escherichia coli – ein Erreger von Lebensmittelvergiftung beim Menschen; Haemophilus influenzae – ein Erreger von Meningitis; Neisseria gonorrhoeae – ein Erreger von Gonorrhö; Yersinia enterocolitica – ein Erreger eines Spektrums von Erkrankungen beim Menschen, das von Gastroenteritis bis zu fataler septicämischer Erkrankung rangiert; Brucella abortus – ein Verursacher von Abgängen und Unfruchtbarkeit bei Rindern und eine Bedingung, die als Malta-Fieber beim Menschen bekannt ist; oder Clostridium difficile – ein Erreger von pseudomembranöser Kolitis, sein.
Beispiele der Antigene, deren Epitope inseriert werden können, sind die pre-S1, pre-S2 und S-Antigene von HBV; die HAV-Oberflächenantigene, die HCV-Oberflächenantigene, Core-Protein und NS3-Protein; die HIV-Antigene gp120, gp160, gag, pol, Nef, Tat und Ref; die Malaria-Antigene, wie z.B. die Circumsporozoit-Proteine; die Influenza-Antigene HA, NP und NA; die Herpes-Virus-Antigene EBV p340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH und HSV-Early-Protein; die humanen Papillomavirus-Antigene E4, E6 und E7; die Krebs-Antigene karzinoembryonisches Antigen (CEA), P53, ras und myc; das Pertactin-Antigen von Bordetella pertussis; und das Hausstaubmilben-Allergen.
Die Erfindung eignet sich besonders zur prophylaktischen oder therapeutischen Impfung gegen HBV, da das Trägerprotein HBcAg von HBV stammt, und Epitope aus den pre-S1, pre-S2 und S-Regionen von HBV sind besonders bevorzugt. Ein pre-S1, pre-S2 oder S-Insert ist typischerweise mindestens 6 Aminosäuren lang, z.B. 6 bis 120 aa, 8 bis 80 aa oder 10 bis 40 aa lang. Das Insert kann zum Beispiel die Reste an den pre-S1-Positionen 1–9, 10–19, 20–29, 30–39, 40–49, 50–59, 60–69, 70–79, 80–89, 90–99, 100–109 oder 110–119 oder die Reste an pre-S2-Positionen 120–129, 130–139, 140–149, 150–159, 160–169 oder 170–174 beinhalten. Besonders bevorzugte Fragmente sind jene, die den pre-S1-Resten 20–47 und pre-S2-Resten 139–174 entsprechen. Pre-S1-Reste 21–28 entsprechen einem humanen T-Zell-Epitop. Ebenfalls bevorzugt sind Fragmente entsprechend den S-Resten 110–147 und 110–157 (wobei der erste Rest der S-Sequenz als Rest 1 gezählt wird).
Herstellung der Proteine der Erfindung
Die Proteine der Erfindung werden allgemein mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt. Die Erfindung beinhaltet ein Nukleinsäure-Molekül (z.B. DNA oder RNA), das ein Protein der Erfindung codiert, wie z.B. einen Expressionsvektor.
Das Nukleinsäure-Molekül kann ein Protein codieren, in welchem ein oder mehrere der Arginin-Wiederholungen deletiert und durch eine Restriktionsenzymstelle ersetzt worden sind, die eine einzelne in dem Nukleinsäure-Molekül darstellt, wie etwa eine Xbal-Stelle. Das Nukleinsäure-Molekül kann auch eine einzelne Restriktionsenzymstelle in der Sequenz, die die E1-Schleife codiert, und/oder im N-Terminus enthalten. Die einzelnen Restriktionsenzymstellen erlauben den Einbau von Sequenzen, die Epitope codieren, in das Nukleinsäure-Molekül, z.B. anstelle der deletierten Arginin-Wiederholung(en) oder in der E1-Schleife.
Ein Protein der Erfindung kann durch Kultivieren einer Wirtszelle, die ein das Protein codierendes Nukleinsäure-Molekül enthält, unter Bedingungen, bei denen das Protein exprimiert wird, und durch Rückgewinnen des Proteins produziert werden. Zu geeigneten Wirtszellen zählen Bakterien wie E. coli, Hefe, Säuger-Zelllinien und andere eukaryontische Zelllinien, z.B. Insekten-Sf9-Zellen.
Die Vektoren, die die Nukleinsäure-Moleküle gemäß der Erfindung darstellen, können z.B. Plasmid- oder Virus-Vektoren sein. Sie können einen Replikationsursprung, einen Promotor für die Expression der Sequenz, die das Protein codiert, einen Regulator des Promotors, wie etwa einen Enhancer, ein Transkriptions-Stoppsignal, ein Translations-Startsignal und/oder ein Translations-Stoppsignal enthalten. Die Vektoren können auch ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, z.B. ein Ampicillin-Resistenzgen im Falle eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycin-Resistenzgen für einen Säuger-Vektor. Vektoren können in vitro, zum Beispiel für die Produktion von RNA, oder zum Transformieren oder Transfizieren einer Wirtszelle verwendet werden.
Promotoren, Enhancer und andere Expressions-Regulationssignale können bezüglich ihrer Kompatibilität mit der Wirtszelle ausgewählt werden, für die der Expressionsvektor entworfen wird. Zum Beispiel können prokaryontische Promotoren verwendet werden, insbesondere solche wie der trc-Promotor, der zur Verwendung in E. coli-Stämmen (wie z.B. E. coli HB101) geeignet ist. Ein Promotor, dessen Aktivität als Reaktion auf eine Veränderung im umgebenden Umfeld, wie etwa anaerobe Bedingungen, ausgelöst wird, kann verwendet werden. Vorzugsweise kann ein htrA- oder nirB-Promotor verwendet werden. Diese Promotoren können insbesondere zum Exprimieren des Proteins in einem abgeschwächten Bakterium, z.B. zur Verwendung als ein Impfstoff, verwendet werden. Wird die Expression des Proteins der Erfindung in Säugerzellen in vitro durchgeführt, so können Säuger-Promotoren verwendet werden. Gewebe-spezifische Promotoren, z.B. Hepatocytenzell-spezifische Promotoren, können ebenfalls verwendet werden. Auch virale Promotoren können verwendet werden, zum Beispiel das murine Moloney-Leukämie-Virus-Long-Terminal-Repeat (MMLV LTR), der Rous-Sarcom-Virus-(RSV)-LTR-Promotor, der SV40-Promotor, der humane Cytomegalovirus-(CMV)-IE-Promotor, Herpes-simplex-Virus-Promotoren und Adenovirus-Promotoren. Alle diese Promotoren sind ohne weiteres im Fachgebiet verfügbar.
Ein Protein gemäß der Erfindung kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken zur Reinigung von Proteinen gereinigt werden. Das Protein kann beispielsweise in gereinigter, reiner oder isolierter Form bereitgestellt werden. Zur Verwendung in einem Impfstoff muss das Protein generell bei einem hohen Reinheitsgrad bereitgestellt werden, z.B. bei einem Grad, bei dem es mehr als 80%, mehr als 90%, mehr als 95% oder mehr als 98% des Proteins im Präparat stellt. Allerdings mag es wünschenswert sein, das Protein mit anderen Proteinen in der endgültigen Impfstoffformulierung zu mischen, zum Beispiel anderen Proteinen, die die pre-S1-, pre-S2- oder S-Sequenz von HBV umfassen. Das Protein ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von Nukleinsäure (DNA und RNA).
Impfstoffe
Der Hauptnutzen der Proteine der Erfindung ist der als therapeutischer oder prophylaktischer Impfstoff. Die Erfindung beinhaltet eine Impfstoff-Zusammensetzung, die ein Protein der Erfindung oder einen Partikel der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Das Prinzip hinter der prophylaktischen Impfung ist die Hervorrufung einer Immunantwort in einem Wirt, um ein immunologisches Gedächtnis im Wirt zu schaffen. Das bedeutet, dass dann, wenn der Wirt dem virulenten Pathogen ausgesetzt ist, er eine wirksame (schützende) Immunantwort hervorbringt, das heißt eine Immunantwort, die das Pathogen inaktiviert und/oder abtötet. Die Erfindung könnte die Grundlage eines prophylaktischen Impfstoff gegen einen Bereich von Krankheiten bilden, wie z.B. HBV, HAV, HCV, Influenza, Maul- und Klauenseuche, Polio, Herpes, Tollwut, AIDS, Dengue-Fieber, Gelbfieber, Malaria, Tuberkulose, Keuchhusten, Salmonellosis, Typhus, Lebensmittelvergiftung, Diarrhö, Meningitis und Gonorrhö. Die Epitope im Protein der Erfindung werden so gewählt, dass sie für die Krankheit geeignet sind, gegen die der Impfstoff Schutz bieten soll.
Das Prinzip hinter der therapeutischen Impfung ist die Stimulierung des Immunsystems des Wirts zur Abmilderung oder Ausmerzung einer Krankheit oder Bedingung. Es gibt eine Reihe von Krankheiten und Bedingungen, die für eine therapeutische Impfung empfänglich sein können, wie z.B. chronische Viruserkrankungen, einschließlich chronischem HBV und chronischem HCV, Krebs, und Allergien wie Asthma, Atopie, Ekzem, Rhinitis und Lebensmittelallergien.
Chronische Viruserkrankungen entstehen, wenn das Immunsystem eines infizierten Wirts darin versagt, das Virus zu eliminieren und so dem Virus das Fortbestehen im Wirt über einen langen Zeitraum hinweg ermöglicht. Die Erfindung kann dazu angewendet werden, das Immunsystem eines chronisch infizierten Individuums dazu zu veranlassen, das Virus zu eliminieren. Beispielsweise wird davon ausgegangen, dass Patienten mit chronischer Hepatitis eine inadäquate T-Zell-Antwort zeigen und dass die Stimulierung einer entsprechenden T-Zell-Antwort das Virus eliminieren kann. Um daher eine virale Hepatitis unter Anwendung der Erfindung zu behandeln, können T-Zell-Epitope in das Protein der Erfindung inseriert werden, wie etwa T-Zell-Epitope von den pre-S1- und pre-S2-Regionen von HBV.
Entsprechend wird im Falle von Krebs angenommen, dass eine Steigerung der T-Zell-Antwort auf Tumorantigene das Immunsystem darin unterstützen kann, den Tumor zu zerstören. Es wird davon ausgegangen, dass allergische Erkrankungen zumindest zum Teil durch eine unausgeglichene T-Zell-Antwort verursacht werden, wobei eine entzündliche Th2-Antwort über eine antagonistische Th1-Antwort dominiert, und dass Allergien daher durch eine Steigerung der Th1-Antwort behandelt werden können. Dies kann gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Proteins erreicht werden, welches eine Th1-Antwort stimuliert.
Mehr als ein Protein gemäß der Erfindung kann einem Patienten verabreicht werden. Weiterhin kann ein Protein gemäß der Erfindung in Kombination mit einer oder mehreren weiteren Zusammensetzungen verwendet werden. Zum Beispiel kann bei der Behandlung von chronischem HBV ein Protein gemäß der Erfindung in Kombination mit Interferon-gamma, Lamivudine^TM oder einem anderen immuntherapeutischen Mittel, wie Hepacare^TM (zuvor bekannt als Hepagene^TM) verwendet werden. Das Protein gemäß der Erfindung und die andere Zusammensetzung können gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden.
Geeignete Träger und Verdünnungsmittel zur Aufnahme in die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sind isotonische Kochsalzlösungen, z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung wird normalerweise ein Adjuvans enthalten, wie etwa Aluminiumhydroxid. Die Zusammensetzung kann zur parenteralen, intramuskulären, intravenösen, intranasalen, subkutanen oder transdermalen Verabreichung formuliert sein. Die Zusammensetzung umfasst das Protein, Partikel oder Nukleinsäure in einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge. Typischerweise wird das Protein oder die Partikel in einer Dosis von 0,01 bis 30 μg/kg Körpergewicht, vorzugsweise von 0,1 bis 10 μg/kg, bevorzugter von 0,1 bis 1 μg/kg Körpergewicht, verabreicht. Die Nukleinsäure der Erfindung kann direkt als ein nacktes Nukleinsäure-Konstrukt unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken oder unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Vektoren verabreicht werden. Die Menge an verabreichter Nukleinsäure liegt typischerweise im Bereich von 1 μg bis 10 mg, bevorzugt von 100 μg bis 1 mg. Der Impfstoff kann in einem Einzeldosis-Schema oder einem Vielfachdosis-Schema gegeben werden. Die Verabreichungswege und oben angegebenen Dosen sollen lediglich als eine Richtlinie dienen, da der Weg und die Dosis letztendlich im Ermessen des behandelnden Arztes liegen.
Experimenteller Abschnitt
Experiment 1
1. Materialien und Methoden
Neue Plasmid-Konstrukte wurden durch inverse PCR erzeugt, sodass drei oder vier C-terminale Arginin-Wiederholungs-Regionen deletiert waren und eine SpeI- Restriktionsstelle eingeführt war, um die Insertion von Austauschsequenzen, die für B- und T-Zell-Epitope codieren, zu ermöglichen (1).
Die Plasmid-Template der inversen PCR waren ptrc/core und ptrc/core-S1, die jeweils für Nicht-Hybrid-Hepatitis-B-Core und Hybrid-Hepatitis-B-Core codieren, die Aminosäuren 20–47 der pre-S1-Sequenz von Hepatitis-B-Oberflächenprotein inseriert zwischen Aminosäuren 79 und 80 der immundominanten E1-Schleife enthielten. Drei Oligonukleotid-Primer (Tabelle 1 und 2) wurden für die PCR-Reaktion verwendet. Diese Primer führen eine einzelne SpeI-Restriktionsstelle in die PCR-Fragmente ein. Die Primer wurden auch zur Schaffung neuer Fragmente entworfen, die bei Resten 146 oder 154 verkürzt waren, doch 7 Reste des C-Terminus, einschließlich des terminalen Cysteins an Position 185, beibehielten, was für die Aufrechterhaltung der Partikelstabilität durch Bildung von Disulfid-Bindungen für wichtig erachtet wird (1).
1.1 Konstruktion von parenteral verkürzten Plasmiden
Unter Verwendung der Primer MGR371/370 oder MGR369/370 (Tabelle 1 und 2) werden inverse PCR-Fragmente aus Plasmid-Templaten von ptrc/Core oder ptrc/Core-S1 erzeugt. Mit dieser Verfahrensweise werden 69 Nukleotide (die für 23 Aminosäuren (aa155–177) codieren) bzw. 93 Nukleotide (die für 31 Aminosäuren (146–177) codieren) entfernt. Die PCR-Fragmentgrößen wurden durch Analyse auf Agarosegelen bestätigt und dann mit SpeI-Restriktionsendonuklease verdaut, gefolgt von einer Reinigung auf Agarosegelen und Selbstligation, um Plasmide pTCR₁₄₆, pTCR₁₅₄, pTCSR₁₄₆ und pTCSR₁₅₄ zu erzeugen. pTCR-Plasmide sind von der ptrc/Core-Template hergeleitet, und die pTCSR-Plasmide sind von den ptrc/Core-S1-Templaten hergeleitet. Die 146- und 154-Nummerierung kennzeichnet die Aminosäure-Nummer am Verkürzungspunkt. Die vier parenteral verkürzten Plasmide wurden zum Transformieren von E. coli-HB101-Zellen verwendet, und positive Klone wurden durch diagnostische PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer MGR/MGR168 getestet. Die Core-Proteinexpression wurde durch Immunoblotting der bakteriellen Zelllysate unter Verwendung eines Maus-Anti-Core-Antikörpers bestätigt.
1.2 Subklonierung der Austauschsequenzen in verkürzte parenterale Plasmide
Drei Sequenzen wurden in das 3'-Ende der verkürzten parenteralen Plasmide subkloniert, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben. Hierzu zählen Sequenzen, die für Aminosäuren 110–147 und 110–157 des kleinen Hepatitis-B-Oberflächenproteins, und für aa20–55 der S2-Region des mittleren Hepatitis-B-Oberflächenproteins codieren (3).
Zur Einführung der 110–157-Sequenz (plus 2 Aminosäuren, die aus der Nhel-Restriktionsstelle resultieren) wurden Oligonukleotid-Primer MR245–247 (Tabelle 1B) zur Erzeugung eines PCR-Fragments von 147 Nukleotiden unter Verwendung von pMBdSRE/17 als Template erzeugt (3). Dieses Plasmid codiert für das kleine Hepatitis-B-Oberflächenprotein (adw-Subtyp) für die Expression in Säugerzellen unter Verwendung des Maus-Metallothionin-Promotors.
Zur Einführung der 110–147-Sequenz (plus 2 Aminosäuren aus der Nhel-Stelle) wurden Oligonukleotid-Primer MGR247/264 (Tabelle 1B) zur Erzeugung eines PCR-Fragments von 120 Nukleotiden unter Verwendung von pMBdSRE/17 als Template verwendet (3).
Zur Einführung der 20–55-Sequenz (plus 2 Reste aus der Nhel-Stelle) von pre-S2 wurden Oligonukleotid-Primer MGR243/249 (Tabelle 1B) zur Erzeugung eines PCR-Fragments von 114 Nukleotiden unter Verwendung von pMByS2R/8 als Template erzeugt (3). Dieses Plasmid codiert für das mittlere Hepatitis-B-Oberflächenprotein (ayw-Subtyp) unter Kontrolle des Metallothionin-Promotors für die Säugerzell-Expression.
Die PCR-Fragmente wurden mit Nhel-Restriktionsendonuklease verdaut und auf Agarosegelen gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden dann mit SpeI-verdauten, Phosphatase-behandelten parentalen Plasmiden ligiert (Abschnitt 1.1). E. coli- HB101-Zellen wurden dann mit den resultierenden Plasmiden transformiert und positive Klone durch diagnostische PCR unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer MGR61/168 getestet, wobei mit für das Insert spezifischen Antikörpern immungeblottet und die Inserte partiell DNA-sequenziert wurden.
2. Ergebnisse
2.1 Bestätigung der Generierung von inversen PCR-Fragmenten
Inverse PCR-Fragmente für pTCR₁₄₆, pTCR₁₅₄, pTCSR₁₄₆ und pTCSR₁₅₄ wurden durch Auftrennung auf 1% Agarosegelen analysiert (4). Die PCR-Fragmente wurden als von geeigneter Größe festgestellt (etwa 5.2 kb) und wurden mittels diagnostischer PCR als korrekt bestätigt (nicht gezeigt). Die Immunoblot-Analyse zeigte, dass die parentalen Konstrukte und jene, die die inserierten Sequenzen enthielten, dass Core-Protein exprimierten, dass auf einen Anti-Core-Antikörper reaktiv war (5). Außerdem wurde die Bestätigung der Proteinexpression der inserierten Sequenzen durch Immunoblotting unter Verwendung von Anti-S- (6) und Anti-pre-S2-Antikörpern (7) gezeigt.
Tabelle 1.
Für die inverse und diagnostische PCR verwendete Oligonukleotid-Primer
Tabelle 1A

Fettdruck steht für SpeI-Stellen

Tabelle 1B
Experiment 2
Zusammenfassung
Volllängen- und C-terminal verkürzte Hepatitis-B-Core-Antigen-(HBc)-Derivate, die lange Fremdaminosäure-Insertionen an Position 144 trugen, wurden konstruiert. HBV preS1, preS2 und HIV-1-Gag-Fragmente von 50–100 Aminosäuren Länge wurden als solche Insertionen verwendet, und die entsprechenden rekombinierten Gene wurden in E. coli-Zellen exprimiert. Die entsprechenden chimären HBc- und HBcΔ-Derivate wurden gereinigt und antigenisch und immunogenisch untersucht. Eine Subklassen-Analyse der induzierten Anti-HBc-Immunantwort in Mäusen zeigte, dass das Ig-Verhältnis von IgG1-, IgG2a- und IgG2b-Antikörpern vom IgG1 > IgG2a ≥ 2gG2b-Muster, welches typisch für C-terminal verkürzte HBcΔ-Derivate ist, zu IgG2a ≥ IgG2b ≥ IgG1, welches für Volllängen-HBc-Derivate typisch ist, nach der Immunisierung mit C-terminal verkürzten HBcΔ-Derivate, die lange C-terminale Additionen von 50–100 Aminosäuren Länge trugen, wiederhergestellt wurde.
Materialien und Methoden
Bakterienstämme
Die E. coli-Stämme RR1 (F, hsdS20 (r^– _b, m^– _b), recA⁺, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Sm^r), xyl-5, mtl-1, supE44, λ^–), und K802 (hsdR, gal, met, supE, mcrA, mcrB) wurden für die Selektion bzw. Expression der chimären Gene verwendet.
Tiere
Weibliche BALB/C (H-2^d) Mäuse wurden in einem Alter von etwa 7–10 Wochen bei einem Gewicht von 20 mg verwendet. Weibliche New Zealand White Kaninchen wurden zum Erhalt der polyklonalen Antikörper verwendet.
Konstruktion der HBc-Derivate
Vektoren, basierend auf Plasmiden pH8c3 und pH8c16–15. Vektor pHBc3 wurde durch Stellen des HBc-Gens unter die Kontrolle des Tandem-Repeats von E. coli trp-Promotoren konstruiert. Vektor pHBc16–15 wurde durch Inserieren eines Oligonukleotid-Linkers, der Cla I/Eco RV-Restriktionsstellen trug, in Position 144 des HBc-Gens konstruiert.
Konstruktion von chimären HBc-Derivaten. Die Struktur der HBc- und HBcΔ-Derivate ist in Tabelle 2 gezeigt. Die rekombinanten Gene wurden durch Einführen der geeigneten HBV-pre-S1-, pre-S2- und HIV-1-gag-Fragmente in die Cla 1-Stelle des pHBc16–15-Vektors mit oder ohne In-Frame-Junction des C-terminalen Teils des HBc-Gens konstruiert.
Reinigung der chimären HBc-Derivate
E. coli-Zellen wurden über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 37°C in 750 ml-Kolben, die 300 ml an M9 Minimal Medium, ergänzt mit 1% Casaminosäuren (Difco Laboratories, Sparks, USA) und 0,2% Glucose, enthielten, gezüchtet. Eine optische Dichte OD₅₄₀ von 2–5 wurde gewöhnlich erreicht. Allgemein wurden die Zellen pelletiert und durch 30-minütige Inkubation auf Eis in Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA, 50 μg/ml PMSF, 2 mg/ml Lysozym, lysiert und dann dreimal für 15 sec bei 22 kHz ultrabeschallt. Die Lysate wurden dann auf 10 mM MgCl₂ und 20 μg/ml DNAase eingestellt. Nach einer Niedergeschwindigkeitszentrifugation wurden die Proteine aus dem Überstand mit Ammoniumsulfat bei einer 33% Sättigung für 1–2 h bei 4°C ausgefällt. Die Pellets wurden in einem standardmäßigen PBS-Puffer, enthaltend 0,1% Triton X-100^TM, resuspendiert, und 5 ml der Lösungen wurden auf eine Sepharose CL4B^TM-Säule (2,5 × 85 cm) aufgeladen und mit PBS-Puffer ohne Triton X-100 eluiert. Das Vorhandensein von HBc-Polypeptiden in den Fraktionen wurde mittels PAGE getestet. Die positiven Fraktionen wurden gepoolt und durch Ammoniumsulfat-Präzipitation bei 33% Sättigung für 20 h bei 4°C konzentriert. Die Pellets wurden in PBS- oder in Tris-Saline-Puffer, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, zu einer Endkonzentration von etwa 5–20 mg/ml resuspendiert, über Nacht gegen 2000 Volumen desselben Puffer dialysiert und bei –70°C oder bei –20°C in 50% Glycerol gelagert.
Polyacrylamidgelelektrophorese und Western Blotting
Für die PAGE-Analyse wurden die Bakterien pelletiert, in SDS-Gelelektrophorese-Probenpuffer, enthaltend 2% SDS und 2% 2-Mercaptoethanol, suspendiert und durch Erhitzen bei 100°C für 5 min lysiert. Die Proteine wurden durch Laemmli-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in einem Slab-Gel-(150 × 150 × 0,75 mm)-Apparat mit einem Gradienten von 12–18% Laufgel und 4% Sammelgel aufgetrennt. Das Western Blotting wurde allgemein wie bei Towbin et al. (1979) in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 4350–4354 beschrieben durchgeführt. Nitrocellulosefolien (0,2 μ, Millipore, Bedford, USA) wurden mit den Anti-HBc-Antikörpern und Anti-preS1-Antikörper in Verdünnungen von 1 : 100 bis 1 : 1000 über Nacht und dann mit einem Anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 1000) für 1–2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 3,3'-Diaminobenzidin entwickelt. Parallel dazu wurden die Gele gemäß Ohsawa und Ebata (1983) Anal. Biochem. 135 409–415, silbergefärbt.
Immunisationen
Mäuse (fünf pro Gruppe) wurden am Tag 0 intraperitoneal mit 0,02 mg der chimären Partikel in komplettem Freund-Adjuvans (CFA, Difco), gefolgt von zwei Booster-Immunisationen in inkomplettem Freund-Adjuvans (IFA, Difco), gegeben an Tagen 10 (0,01 mg intraperitoneal) und 24 (0,01 mg intraperitoneal und 0,01 mg subkutan), immunisiert. Die am Tag 32 erhaltenen Seren wurden mittels ELISA auf ihre Reaktivität mit HBc-Partikeln analysiert.
ELISA
Für den ELISA wurden rekombinante HBc-Partikel auf 96-Well-Mikrotiterplatten durch Lufttrocknen unter einer chemischen Haube über Nacht beschichtet. Die Wells wurden mit 0,5% BSA in PBS für 1 h blockiert, mit Reihenverdünnungen der verschiedenen Antikörper für 1 h bei 37°C inkubiert und mit den entsprechenden zweiten Antikörpern, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Sigma), gemäß den Protokollen der Hersteller inkubiert. Die Platten wurden fünfmal zwischen den Inkubationen mit 0,05% Tween-20^TM in PBS und fünfmal mit destilliertem Wasser zur Entfernung des Tween-20 gewaschen. Die optischen Absorbanzen wurden bei 492 nm in einem automatischen Immunoscan MS^TM-Lesegerät gemessen. Die Titer wurden als die negativen Logarithmen der EC50 (effektive Konzentration, 50%)-Serumverdünnung auf der Grundlage von sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet. GraphPad Prism^® Version 3.02-Software wurde für die mittleren Titerberechnungen verwendet.
Ergebnisse
Immunogenität der rekombinanten Proteine. Um die Immunogenität des HBc-Trägers und der inserierten preS1-, preS2- und Gag-Sequenzen zu messen, wurden einzelne Mäuse-Seren mittels direktem ELISA unter Verwendung von rekombinantem HBcAg und synthetischen preS1-, preS2- und HIV-1 p24-Peptiden auf einem festen Träger wiederholt getestet. Die Immunisation mit chimären Partikeln induzierte hohe Mengen an Anti-HBc und relativ geringe Mengen an Anti-Insertions-Antikörpern (nicht gezeigt).
Induktion verschiedener Immunglobulin-Subklassen durch chimäre HBcΔ-preS1-(20–47)-Partikel. Um die erhaltenen Immunisationsdaten zu mitteln und sie für eine vergleichende Subklassen-Analyse der induzierten Immunglobuline informativer zu machen, haben wir den mittleren Titer für jede Gruppe der immunisierten Tiere als die negativen Logarithmen der EC50 (wirksame Konzentration, 50%)-Serumverdünnung auf der Grundlage der sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet (GraphPad Prism^® Version 3.02). Diese Daten zur Anti-HBc-Antwort der immunisierten Mäuse, welche einen direkten Vergleich zu den gemittelten Titern erlauben, sind in 8 wiedergegeben.
Die in 8 vorgestellten Daten zeigen, dass der Wildtyp-HBcAg eine Anti-HBc-Antwort mit der Immunglobulin-Subklassen-Verteilung IgG2a ≥ IgG2b ≥ IgG1 induziert, wohingegen die Immunantwort auf die C-terminal verkürzte HBcΔ-Struktur T31 das IgG1 > IgG2b ≥ IgG2a-Subklassen-Verteilungsmuster zeigt. Das Volllängen-HBc-Derivat 10–62, welches eine 50aa lange preS1-Insertion trägt, zeigt eine Subklassen-Verteilung analog der des Volllängen-HBc-Vektors. Darüber hinaus macht ein Austausch des C-Terminus des HBc-Moleküls gegen eine lange Fremdinsertion (50 Aminosäuren der preS1-Sequenz) im HBc-Derivat 10–140 die Subklassen-Verteilung der Anti-HBc-Antikörper ziemlich ähnlich zu der, die durch die Volllängen-HBc-Struktur induziert wird (8). Das HBcΔ-Derivat 48–2 mit einer 100aa langen Insertion von HIV-1-Gag besetzt eine intermediäre Position in dieser Orientierung zwischen Wildtyp-HBcAg und C-terminal verkürzten HBcΔ-T31-Strukturen.
Tabelle 2. Struktur der HBc-Derivate mit C-terminalen Insertionen. Aminosäuren, die an HBc auftreten, und Insertionssequenz-Junktionen sind im unteren Fall gezeigt.
Vollängen-HBc-Derivate
C-terminal verkürzte HBc-Derivate

Claims

Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein Protein, das ein Hepatitis-B-Core-Antigen (HbcAg) umfasst, worin ein oder mehrere der vier Arginin-Wiederholungen („Repeats") abwesend sind und ein C-terminaler Cysteinrest vorhanden ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin ein erstes Epitop von einem Protein, das ein anderes als HBcAg ist, anstelle des/der abwesenden Arginin-Wiederholung(en) vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die erste Arginin-Wiederholung vorhanden ist und die zweiten bis vierten Arginin-Wiederholungen abwesend sind.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin eine zwischen Resten 145 und 182 von HBcAg liegende Sequenz abwesend ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin eine zwischen Resten 150 und 177 von HBcAg liegende Sequenz abwesend ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, welche ein zweites Epitop von einem Protein, das ein anderes als HBcAg ist, umfasst, welches zweite Epitop in der E1-Schleife liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin das zweite Epitop ein B-Zell-Epitop ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, worin das erste Epitop ein T-Zell-Epitop ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das erste Epitop ein T-Helferzell-Epitop ist und das zweite Epitop ein B-Zell-Epitop ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, welche die ersten und zweiten Epitope umfasst, wobei die Epitope dieselben sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei das erste und/oder das zweite Epitop von Hepatitiv-B-Virus (HBV) stammt.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das erste und/oder das zweite Epitop aus der pre-S1-, pre-S2- oder S-Region von HBV stammt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend die folgenden, in einer N-terminalen nach C-terminalen Richtung verknüpften Elemente: (i) einen N-terminalen Teil von HBcAg, welcher die Bildung von Partikeln vermittelt, und (ii) einen C.terminalen Teil von HBcAg, umfassend das C-terminale Cystein; worin zumindest ein Teil der Sequenz von HBcAg aus zwischen dem N-terminalen Teil und dem C-terminalen Teil, umfassend ein oder mehrere der Arginin-Wiederholungen, abwesend ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend die folgenden, in einer N- nach C-terminalen Richtung verknüpften Elemente: (i) einen N-terminalen Teil von HBcAg, welcher die Bildung von Partikeln vermittelt, (ii) ein Epitop von einem Protein, das ein anderes als HbcAg ist; und (iii) einen C.terminalen Teil von HBcAg, umfassend das C-terminale Cystein; worin zumindest ein Teil der Sequenz von HBcAg zwischen dem N-terminalen Teil und dem C-terminalen Teil, umfassend ein oder mehrere der Arginin-Wiederholungen, abwesend ist und durch das Epitop ersetzt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend die folgenden, in einer N- nach C-terminalen Richtung verknüpften Elemente: (i) einen N-terminalen Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend Reste 1 bis 67, (ii) ein Epitop von einem Protein, das ein anderes als HbcAg ist, (iii) einen zweiten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend Reste 91 bis 144, und (iv) einen dritten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend das C-terminate Cystein; worin zumindest ein Teil der Sequenz von HBcAg aus zwischen Resten 145 und dem C-terminalen Cystein, umfassend ein oder mehrere der Arginin-Wiederholungen, abwesend ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend die folgenden, in einer N- nach C-terminalen Richtung verknüpften Elemente: (i) einen N-terminalen Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend Reste 1 bis 67, (ii) ein Epitop von einem Protein, das ein anderes als HBcAg ist, (iii) einen zweiten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend Reste 91 bis 144, (iv) ein weiteres Epitop von einem Protein, das ein anderes als HbcAg ist, (v) einen dritten Teil der HBcAg-Sequenz, umfassend das C-terminale Cystein; worin zumindest ein Teil der Sequenz von HBcAg aus zwischen Resten 145 und dem C-terminalen Cystein, umfassend ein oder mehrere der Arginin-Wiederholungen, abwesend ist.
Impfstoffzusammensetzung, umfassend einen Partikel, der mehrfache Kopien eines Proteins, wie in einem der vorangehenden Ansprüche definiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16, oder ein Partikel nach Anspruch 17, zur Verwendung bei einer Methode zur prophylaktischen oder therapeutischen Imfpung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Protein oder Partikel nach Anspruch 18 zur Verwendung bei einer Methode zur prophylaktischen oder therapeutischen Impfung des menschlichen oder tierischen Körpers gegen HBV.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 16, oder eines Partikels nach Anspruch 17, zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische oder therapeutische Impfung des menschlichen oder tierischen Körpers gegen HBV.