DE60116371T2 - Variante des modifizierten vaccinia ankara virus - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung stellt ein abgeschwächtes Virus bereit, das vom modifizierten Vacciniavirus Ankara abgeleitet ist und durch den Verlust seiner Fähigkeit zu einer reproduktiven Replikation in menschlichen Zelllinien charakterisiert ist. Sie beschreibt ferner rekombinante Viren, die von diesem Virus abgeleitet sind, und die Verwendung des Virus oder seiner Rekombinanten als Arzneimittel oder Impfstoff. Zusätzlich wird ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort selbst bei immungeschwächten Patienten, Patienten mit bereits bestehender Immunität gegenüber dem Vacciniavirus oder Patienten, die einer antiviralen Therapie unterzogen werden, bereitgestellt.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ist mit dem Vacciniavirus verwandt, einem Mitglied der Gattung Orthopoxvirus in der Familie der Poxviridae. MVA wurde durch 516 serielle Durchläufe auf CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) des Ankara-Stamms des Vacciniavirus (CVA) erzeugt (siehe Mayr, A., et al. Infection 3, 6–14 [1975]). Infolge dieser langfristigen Durchläufe fehlten in dem erhaltenen MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner genomischen Struktur und wurde daher als starke Wirtszelle beschrieben, die auf Vogelzellen beschränkt ist (Meyer, H., et al., J. Gen. Virol. 72, 1031–1038 [1991]). Es wurde in zahlreichen Tiermodellen gezeigt, dass das erhaltene MVA signifikant avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225–34). Zusätzlich wurde dieser MVA-Stamm in klinischen Versuchen als Impfstoff zur Immunisierung gegen die menschliche Pockenerkrankung getestet (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]). Diese Studien umfassten mehr als 120.000 Menschen, einschließlich Hochrisikopatienten, und bewiesen, das im Vergleich zu Impfstoffen auf Vaccinia-Basis MVA eine verringerte Virulenz oder Infektiosität aufwies, während es eine gute Immunogenität beibehielt.
  • In den folgenden Dekaden wurde MVA manipuliert, so dass es als viraler Vektor zur rekombinanten Genxpression oder als rekombinanter Impfstoff verwendet werden konnte (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032–40).
  • In dieser Hinsicht ist es besonders erstaunlich, dass, obwohl Mayr et al. in den 1970ern zeigten, dass MVA in Menschen und Säugetieren stark abgeschwächt und avirulent ist, einige kürzlich berichtete Beobachtungen (Blanchard et al., 1998, J Gen Virol 79, 1159–1167; Carroll & Moss, 1997, Virology 238, 198–211; Altenberger, US Patent 5,185,146; Ambrosini et al., 1999, J Neurosci Res 55(5), 569) gezeigt haben, dass MVA in Säugetier- und menschlichen Zelllinien nicht vollständig abgeschwächt ist, da eine Restreplikation in diesen Zellen stattfinden kann. Es wird angenommen, dass die Ergebnisse, die in diesen Veröffentlichungen berichtet wurden, mit verschiedenen MVA-Stämmen erhalten wurden, da sich die verwendeten Viren in ihren Eigenschaften deutlich unterschieden, insbesondere in ihrem Wachstumsverhalten in verschiedenen Zelllinien.
  • Das Wachstumsverhalten ist als Indikator für die Virusabschwächung anerkannt. Im Allgemeinen wird ein Virusstamm als abgeschwächt angesehen, wenn er seine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Wirtszellen verloren oder verringert hat. Die oben erwähnte Beobachtung, dass MVA nicht vollständig für eine Replikation in menschlichen und Säugetierzellen inkompetent ist, stellt die absolute Sicherheit von MVA als menschlichen Impfstoff oder Vektor für rekombinante Impfstoffe in Frage.
  • Insbesondere für einen Impfstoff, wie auch für einen rekombinanten Impfstoff ist das Gleichgewicht zwischen der Wirksamkeit und der Sicherheit des Impfstoff-Vek torvirus extrem wichtig.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, neuartige Virusstämme mit erhöhter Sicherheit für die Entwicklung sicherer Produkte, wie Impfstoffe oder Pharmazeutika, bereitzustellen. Ferner ist es eine weitere Aufgabe, Mittel zur Verbesserung eines bestehenden Impfschemas bereitzustellen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Zur Lösung der vorgehenden Aufgaben werden neue Vacciniaviren bereitgestellt, die zur reproduktiven Replikation in nichtmenschlichen Zellen und Zelllinien imstande sind, insbesondere in CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) und in der BHK- (Baby Hamster Kidney) Zelllinie (ECACC 85011433), aber nicht zur reproduktiven Replikation in menschlichen Zelllinien imstande sind.
  • Die bekannten Vacciniastämme replizieren reproduktiv in mindestens einigen menschlichen Zelllinien, insbesondere in der menschlichen Keratinozytenzelllinie HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106 (3): 761–71). Die Replikation in der Zelllinie HaCat ist für die Replikation in vivo vorhersagend, insbesondere für die in vivo Replikation in Menschen. Tatsächlich wird im Beispielabschnitt gezeigt, dass alle bekannten getesteten Vacciniastämme, die eine produktive Restreplikation in HaCat aufweisen, auch in vivo replizieren. Somit betrifft die Erfindung vorzugsweise Vacciniaviren, die nicht reproduktiv in der menschlichen Zelllinie HaCat replizieren. Insbesondere betrifft die Erfindung Vacciniavirusstämme, die nicht zur reproduktiven Replikation in einer der folgenden menschlichen Zelllinien imstande sind: der menschlichen Zervix-Adenokarzinomzellinie HeLa (ATCC Nr. CCL-2), der menschlichen Embryo-Nieren zelllinie 293 (ECACC Nr. 85120602), der menschlichen Knochen-Osteosarkomzellinie 143B (ECACC Nr. 91112502) und der Zelllinie HaCat.
  • Das Wachstumsverhalten oder die Amplifikation/Replikation eines Virus wird normalerweise durch das Verhältnis eines Virus, das von einer infizierten Zelle erzeugt wird (Output), zu der Menge, die ursprünglich zum Infizieren der Zellen in erster Stelle verwendet wurde (Input), ausgedrückt ("Amplifikationsverhältnis"). Ein Verhältnis von "1" zwischen Output und Input definiert einen Amplifikationsstatus, in dem die Menge an Virus, die von den infizierten Zellen erzeugt wird, dieselbe ist wie die Menge, die ursprünglich zum Infizieren der Zellen verwendet wurde. Dieser Status weist auf die Tatsache, dass die infizierten Zellen für die Virusinfektion und Virusreproduktion permissiv sind.
  • Ein Amplifiaktionsverhältnis von weniger als 1, d.h., eine Absinken der Amplifikation unter den Input-Wert, ist ein Indikator für einen Mangel an reproduktiver Replikation und somit ein Indikator für die Abschwächung des Virus. Daher war es für die Erfinder von besonderem Interesse, einen Stamm zu identifizieren und schließlich zu isolieren, der ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 in mehreren menschlichen Zelllinien aufweist, insbesondere in allen menschlichen Zelllinien 143B, HeLa, 293 und HaCat.
  • Somit bedeutet der Begriff "zur reproduktiven Replikation nicht imstande", dass das Virus gemäß der Erfindung ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 in menschlichen Zelllinien, wie der Zelllinien 293 (ECACC Nr. 85120602), 143B (ECACC Nr. 91112502), HeLa (ATCC Nr. CCL-2) und HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761–71) unter den Bedingungen, die in Beispiel 1 der vorliegenden Beschreibung für einige spezifische MVA-Stämme dargelegt sind, aufweist. Vorzugsweise ist die Amplifikationsrate des Virus gemäß der Erfindung in jeder der obengenannten menschlichen Zelllinien HeLa, HaCat und 143B 0,8 oder weniger.
  • In Beispiel 1 und in Tabelle 1 wird im Detail gezeigt, dass die Viren gemäß der vorliegenden Erfindung in keiner der Zelllinien 143B, HeLa und HaCat reproduktiv reproduzieren. Der besondere Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung, der in den Beispielen verwendet wurde, wurde bei der European Collection of Cell Cultures unter der Nummer V00083008 hinterlegt. Dieser Stamm wird in der gesamten Beschreibung als "MVA-BN" bezeichnet.
  • Die bekannten MVA-Stämme zeigen in mindestens einer der getesteten menschlichen Zelllinien eine Restreplikation (1, Beispiel 1). Alle bekannten Vacciniastämme zeigen mindestens eine gewisse Replikation in der Zelllinie HaCat, während die MVA-Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere MVA-BN, in HaCat-Zellen nicht produktiv replizieren. Genauer zeigt MVA-BN ein Amplifikationsverhältnis von 0,05 bis 0,2 in der menschlichen Embryo-Nierenzelllinie 293 (ECACC Nr. 85120602). In der menschlichen Knochen-Osteosarkomzellinie 143B (ECACC Nr. 91112502) liegt das Verhältnis im Bereich von 0,0 bis 0,6. Für die menschliche Zervix-Adenokarzinomzellinie HeLa (ATCC Nr. CCL-2) und die menschliche Keratinozytenzelllinie HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106 (3): 761–71) liegt das Amplifikationsverhältnis im Bereich von 0,04 bis 0,8 beziehungsweise 0,02 bis 0,8. MVA-BN hat ein Amplifikationsverhältnis von 0,01 bis 0,06 in Nierenzellen des African Green Monkey (CV1: ATCC Nr. CCL-70). Somit weist MVA-BN, das ein Prototypstamm gemäß der vorliegenden Erfindung ist, keine produktive Replikation in einer der getesteten menschlichen Zelllinien auf.
  • Das Amplifikationsverhältnis von MVA-BN liegt deutlich über 1 in CEF (Chicken Embryo Fibroblasts; Primärkultu ren) oder BHK- (Baby Hamster Kidney) Zelllinien (ATCC Nr. CRL-1632). Wie zuvor erklärt, zeigt ein Verhältnis von mehr als "1" eine reproduktive Replikation an, da die aus den infizierten Zellen erzeugte Virusmenge im Vergleich zu der Virusmenge, die zum Infizieren der Zellen verwendet wurde, erhöht ist. Daher kann das Virus in CEF-Primärkulturen mit einem Verhältnis über 500 oder in BHK-Zellen mit einem Verhältnis über 50 leicht vermehrt und amplifiziert werden.
  • In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung Derivate des Virus, die unter ECACC V0083008 hinterlegt sind. "Derivate" der Viren, die unter ECACC V0083008 hinterlegt sind, zeigen im Wesentlichen dieselben Replikationseigenschaften wie der hinterlegte Stamm, weisen aber Unterschiede in einem oder mehreren Teilen des Genoms auf. Viren mit denselben "Replikationseigenschaften" wie das hinterlegte Virus sind Viren, die in CEF-Zellen und den Zelllinien BHK, HeLa, HaCat und 143B mit ähnlichen Amplifikationsverhältnissen replizieren wie der hinterlegte Stamm, und die eine ähnliche Replikation in vivo zeigen, wie in dem AGR129 transgenen Mausmodell bestimmt wurde (siehe unten).
  • Die Vacciniavirusstämme gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, sind durch ein Versagen bei der in vivo Replikation gekennzeichnet. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich "Versagen bei der in vivo Replikation" auf Viren, die in Menschen und in dem in der Folge erklärten Mausmodell nicht replizieren. Das "Versagen bei der in vivo Replikation" kann vorzugsweise bei Mäusen festgestellt werden, die nicht imstande sind, reife B- und T-Zellen zu erzeugen. Ein Beispiel für solche Mäuse ist das transgene Mausmodell AGR129 (erhältlich von Mark Sutter, Institute of Virology, Universität von Zürich, Zürich, Schweiz). Dieser Mausstamm weist genspezifische ("gene-targeted") Spaltungen in den IFN Rezeptor Typ I (IFN-α/β) und Typ II (IFN-γ) Genen und in RAG auf. Aufgrund dieser Spaltungen haben die Mäuse kein IFN-System und sind nicht imstande, reife B- und T-Tellen zu erzeugen und als solches stark immungeschwächt und für ein replizierendes Virus äußerst anfällig. Anstelle der AGR129-Mäuse kann jeder andere Mausstamm verwendet werden, der nicht imstande ist, reife B- und T-Tellen zu erzeugen und als solches stark immungeschwächt und für ein replizierendes Virus äußerst anfällig ist. Insbesondere töten die Viren gemäß der vorliegenden Erfindung die AGR129-Mäuse nicht innerhalb einer Zeitperiode von mindestens 45 Tagen, vorzugsweise innerhalb von mindestens 60 Tagen, insbesondere innerhalb von 90 Tagen nach der Infektion der Mäuse mit 107 pfu Virus, das intraperitoneal verabreicht wurde. Vorzugsweise sind die Viren, die ein "Versagen bei der in vivo Replikation" aufweisen, weiter dadurch gekennzeichnet, dass kein Virus von Organen oder Geweben der AGR129-Mäuse 45 Tage, vorzugsweise 60 Tage und insbesondere 90 Tage nach der Infektion der Mäuse mit 107 pfu Virus, das intraperitoneal verabreicht wurde, gewonnen werden kann. Nähere Informationen in Bezug auf die Infektionstests mit AGR129-Mäusen und die Tests, die zur Bestimmung verwendet werden, ob ein Virus von Organen und Geweben infizierter Mäuse gewonnen werden kann, finden sich im Beispielabschnitt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Vacciniavirusstämme gemäß der vorliegenden Erfindung, isnbesondere MVA-BN und seine Derivate, durch eine höhere Immunogenität im Vergleich zu dem bekannten Stamm MVA 575 gekennzeichnet, wie in einem Mausmodell mit letaler Belastung bestimmt wurde. Die Einzelheiten dieses Experiments sind in Beispiel 2 beschrieben, das in der Folge angeführt ist. Kurz gesagt, in einem solchen Modell sterben nicht geimpfte Mäuse nach der Infektion mit replikationskompetenten Vaccciniastämmen, wie dem Western Reserve Stamm L929 TK+ oder IHD-J. Die Infektion mit replikationskompetenten Vacciniaviren wird im Kontext der Beschreibung des letalen Belastungsmodells als "Belastung" bezeichnet. Vier Tage nach der Belastung werden die Mäuse für gewöhnlich getötet und der virale Titer in den Ovarien wird durch Standard-Plaque-Assays unter Verwendung von VERO-Zellen bestimmt (Einzelheiten finden sich im Beispielabschnitt). Der virale Titer wird für nicht geimpfte Mäuse und für Mäuse bestimmt, die mit Vacciniaviren gemäß der vorliegenden Erfindung geimpft wurden. Insbesondere sind die Viren der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Test nach der Impfung mit 102 TCID50/ml Virus gemäß der vorliegenden Erfindung die Virustiter in den Ovarien um mindestens 70%, vorzugsweise um mindestens 80%, insbesondere um mindestens 90% im Vergleich zu nicht geimpften Mäusen verringert sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Vacciniaviren gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, zur Immunisierung mit "Prime/Boost"-Verabreichung des Impfstoffs zweckdienlich. Es gibt zahlreiche Berichte, die nahe legen, dass "Prime/Boost"-Schemen unter Verwendung von MVA als Abgabevektor schlechte Immunantworten induzieren und schlechter als DNA-Prime/MVA-Boost-Schemen sind (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397–402). In allen diesen Studien wurden MVA-Stämme verwendet, die sich von den Vacciniaviren gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheiden. Zur Erklärung der schlechten Immunantwort, wenn MVA zur "Prime"- und "Boost"-Verabreichung verwendet wurde, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Antikörper, die während der "Prime"-Verabreichung gegen MVA erzeugt werden, MVA neutralisieren, das in der zweiten Immunisierung verabreicht wird, wodurch eine effektive Verstärkung der Immunantwort verhindert wird. Im Gegensatz dazu wird von DNA-Prime/MVA-Boost-Schemen berichtet, dass sie bei der Erzeugung hoher Aviditätsantworten besser sind, da dieses Schema die Fähigkeit von DNA, die Immunantwort effektiv einzuleiten, mit den Eigenschaften von MVA kombiniert, diese Antwort bei nicht bereits bestehender Immunität gegenüber MVA zu verstärken. Wenn eine bereits bestehende Immunität gegenüber MVA und/oder Vaccinia eine Verstärkung der Immunantwort verhindert, hätte natürlich die Verwendung von MVA als Impfstoff oder Therapeutikum eine begrenzte Wirksamkeit, insbesondere bei den Individuen, die gegen Pocken geimpft sind. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Vacciniavirus gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch können insbesondere MVA-BN und seine Derivate, wie auch entsprechende rekombinante Viren, die heterologe Sequenzen beherbergen, zum effizienten Einleiten und anschließenden Verstärken von Immunantworten in nativen Tieren wie auch in Tieren mit einer bereits bestehenden Immunität gegenüber Pockenviren verwendet werden. Somit induziert das Vacciniavirus gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens im Wesentlichen denselben Pegel einer Immunität in Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Schemen.
  • Es wird davon ausgegangen, dass ein Vacciniavirus mindestens im Wesentlichen denselben Pegel an Immunität in Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Schemen induziert, wenn die CTL-Antwort, die in einem der folgenden zwei Assays ("Assay 1" und "Assay 2"), vorzugsweise in beiden Assays, gemessen wurde, in Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Schemen mindestens im Wesentlichen dieselbe ist. Insbesondere ist die CTL-Antwort nach einer Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Verabreichung in mindestens einem der Assays im Vergleich zu DNA-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen höher. Insbesondere ist die CTL-Antwort in beiden der folgenden Assays höher.
  • Assay 1: Für Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Bo ost"-Verabreichungen werden 6 bis 8 Wochen alte BALB/c (H-2d) Mäuse durch intravenöse Verabreichung mit 107 TCID50 Vacciniavirus gemäß der vorliegenden Erfindung einleitend immunisiert, das das murine Polytop exprimiert, wie in Thomson et al., 1988, J. Immunol. 160, 1717, beschrieben ist, und mit derselben Menge desselben Virus verstärkend immunisiert, das drei Wochen später auf dieselbe Weise verabreicht wird. Zu diesem Zweck ist es notwendig, ein rekombinantes Vacciniavirus zu konstruieren, das das Polytop exprimiert. Verfahren zur Konstruktion solcher rekombinanter Viren sind dem Fachmann bekannt und ausführlicher in der Folge beschrieben. In DNA-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen erfolgt die "Prime"-Impfung durch intramuskuläre Injektion der Mäuse mit 50 μg DNA, die dasselbe Antigen wie das Vacciniavirus exprimiert; die "Boost"-Verabreichung des Vacciniavirus erfolgt auf dieselbe Weise wie bei der Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Verabreichung. Das DNA-Plasmid, das das Polytop exprimiert, ist auch in der obengenannten Veröffentlichung von Thomson et al. beschrieben. In beiden Schemen wird die Entwicklung einer CTL-Antwort gegen die Epitope SYIPSAEKI, RPQASGVYM und/oder YPHFMPTNL zwei Wochen nach der "Boost"-Verabreichung bestimmt. Die Bestimmung der CTL-Antwort erfolgt vorzugsweise unter Verwendung der ELISPOT-Analyse, wie von Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4, 397–402, beschrieben und in dem Beispielabschnitt in der Folge für ein spezifisches Virus gemäß der vorliegenden Erfindung dargelegt ist. Das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung ist in diesem Versuch dadurch gekennzeichnet, dass die CTL-Immunantwort gegen die obengenannten Epitope, die durch die Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Verabreichung induziert wird, im Wesentlichen dieselbe, vorzugsweise mindestens dieselbe ist, wie jene, die durch DNA-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Verabreichung induziert wird, wie durch die Anzahl von IFN-γ produzierenden Zellen/106 Milzzellen bestimmt wird (siehe auch Versuchsabschnitt).
  • Assay 2: Dieser Assay entspricht im Prinzip Assay 1. Anstatt jedoch wie in Assay 1 107 TCID50 Vacciniavirus zu verwenden, das i.v. verabreicht wird, werden in diesem Assay 108 TCID50 Vacciniavirus gemäß der vorliegenden Erfindung subkutan zur "Prime"-Immunisierung und zur "Boost"-Immunisierung verwendet. Das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung ist in diesem Versuch dadurch gekennzeichnet, dass die CTL-Immunantwort gegen die obengenannten Epitope, die durch die Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Verabreichung induziert wird, im Wesentlichen dieselben, vorzugsweise mindestens dieselbe ist wie jene, die durch die DNA-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Verabreichung induziert wird, wie durch die Anzahl von IFN-γ produzierenden Zellen/106 Milzzellen bestimmt wird (siehe auch Versuchsabschnitt).
  • Die Stärke einer CTL-Antwort, die in einem der obengenannten Assays gemessen wird, entspricht dem Ausmaß des Schutzes.
  • Somit sind die Viren gemäß der vorliegenden Erfindung besonders für Impfzwecke geeignet.
  • Zusammenfassens ist das Vacciniavirus gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine der folgenden Eigenschaften hat:
    • (i) Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) und in der Zelllinie BHK, aber keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Zelllinie HaCat,
    • (ii) Keine Replikation in vivo in stark immungeschwächten Mäusen;
    • (iii) Induzieren einer höheren Immunogenität im Vergleich zu dem bekannten Stamm MVA 575 (ECACC V00120707) in einem Modell mit letaler Belastung und/oder
    • (iv) Induzieren im Wesentlichen desselben Immunitätspegels in Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen im Vergleich zu DNA-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen.
  • Vorzugsweise hat das Vacciniavirus gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens zwei der obengenannten Eigenschaften, bevorzugter mindestens drei der obengenannten Eigenschaften. Besonders bevorzugt sind Vacciniaviren mit allen der obengenannten Eigenschaften.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Impf-Kit, das ein Virus gemäß der vorliegenden Erfindung für die erste Impfung ("Prime-Impfung") in einer ersten Ampulle/einem ersten Behälter, und für eine zweite Impfung ("Boost-Impfung") in einer zweiten Ampulle/einem zweiten Behälter, umfasst. Das Virus kann ein nicht rekombinantes Vacciniavirus sein, d.h., ein Vacciniavirus, das keine heterologen Nukleinsäuresequenzen enthält. Ein Beispiel für ein solches Vacciniavirus ist MVA-BN und seine Derivate. Als Alterantive kann das Virus ein rekombinantes Vacciniavirus sein, das zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthält, die zu dem Vacciniavirus heterolog sind. Wie in anderen Abschnitten der Beschreibung dargelegt ist, können die heterologen Sequenzen für Epitope codieren, die eine Antwort durch das Immunsystem induzieren. Somit ist es möglich, das rekombinante Vacciniavirus zur Impfung gegen die Proteine oder Erreger zu verwenden, die das Epitop umfassen. Die Viren können so formuliert werden, wie in der Folge ausführlicher beschrieben ist. Die Virusmenge, die für jede Impfung verwendet wird, wurde oben definiert.
  • Für einen Fachmann ist bekannt, wie er Vacciniaviren mit mindestens einer der folgenden Eigenschaften erhalten kann:
    • – Fähigkeit zur reprodukten Replikation in CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) und in der BHK- (Baby Hamster Kidney) Zelllinie, aber keine Fähigkeit zur reprodukten Replikation in der menschlichen Keratinozytenzelllinie HaCat,
    • – Keine Replikation in vivo,
    • – Induzieren einer höheren Immunogenität im Vergleich zu dem bekannten Stamm MVA 575 in einem Modell mit letaler Belastung und/oder
    • – Induzieren eines im Wesentlichen gleichen Immunitätspegels in Vacciniavirus-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen im Vergleich zu DNA-"Prime"/Vacciniavirus-"Boost"-Schemen.
  • Ein Verfahren zum Erhalten eines solchen Virusstammes kann die folgenden Schritte umfassen:
    • (i) Einführung eines bekannten Vacciniavirus-Stammes, vorzugsweise MVA 574 oder MVA 575 (ECACC V00120707) in nicht menschliche Zellen, in welchen das Virus reproduktiv replizieren kann, wobei die nicht menschlichen Zellen vorzugsweise aus CEF-Zellen und der Zelllinie BHK ausgewählt sind,
    • (ii) Isolieren/Anreichern der Viruspartikel von diesen Zellen, und
    • (iii) Analysieren, ob das erhaltene Virus mindestens eine der zuvor definierten gewünschten biologischen Eigenschaften aufweist,
    wobei die obengenannten Schritte wahlweise wiederholt werden können, bis ein Virus mit den gewünschten Replikationseigenschaften erhalten wird. Die Erfindung betrifft des Weiteren Viren, die durch dieses Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Verfahren, wie die gewünschten biologischen Eigenschaften bestimmt werden können, werden in anderen Teilen dieser Beschreibung erklärt.
  • Durch die Anwendung dieses Verfahrens identifizierten und isolierten die Erfinder in mehreren Passagen einer Klonaufreinigung einen Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung, beginnend mit der MVA-Isolat-Passage 575 (MVA 575). Dieser neue Stamm entspricht dem oben erwähnten Stamm mit der Zugriffsnummer ECACC V0083008.
  • Das Wachstumsverhalten der Vacciniaviren gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere das Wachstumsverhalten von MVA-BN, zeigt, dass die Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung weitaus besser als jedes andere bisher charakterisierte MVA-Isolat hinsichtlich der Abschwächung in menschlichen Zelllinien und dem Versagen bei der in vivo Repliaktion sind. Die Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher ideale Kandidaten für die Entwicklung sicherer Produkte, wie Impfstoffe oder Pharamzeutika, wie in der Folge beschrieben wird.
  • In einer Ausführungsform wird das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, als Impfstoff gegen menschliche Pockenviruserkrankungen, wie Pocken, verwendet. In einer weiteren Ausführungsform kann das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung rekombinant sein, d.h., kann heterologe Gene, wie z.B. Antigene oder Epitope, die zu dem Virus heterolog sind, exprimieren, und kann somit als Impfstoff nützlich sein, um eine Immunantwort gegen heterologoge Antigene oder Epitope zu induzieren.
  • Der Begriff "Immunantwort" bezeichnet die Antwort des Immunssystems, wenn eine Fremdsubstanz oder ein Mikroorganismus in den Organismus eindringt. Per definitionem ist die Immunantwort in eine spezifische und eine unspezifische Antwort unterteilt, obwohl beide eng miteinander verknüpft sind. Die unspezifische Immmunantwort ist die unmittelbare Verteidigung gegen eine Vielzahl von Fremdsubstanzen und infektiösen Erregern. Die spezifische Immunantwort ist die Verteidigung, die nach einer Verzögerungsphase eintritt, wenn der Organismus das erste Mal mit einer Substanz belastet wird. Die spezifische Immunantwort ist äußerst effizient und für die Tatsache verantwortlich, dass ein Individuum, das sich von einer spezifischen Infektion erholt, gegen diese spezifische Infektion geschützt ist. Somit verursacht eine zweite Infektion mit demselben oder einem sehr ähnlichen infektiösen Erreger viel schwächere Symptome oder überhaupt keine Symptome, da es bereits eine "bestehende Immunität" gegen diesen Erreger gibt. Eine solche Immunität beziehungsweise das immunologische Gedächtnis halten für lange Zeit an, in einigen Fällen das ganze Leben. Daher kann das Induzieren eines immunologischen Gedächtnisses zur Impfung verwendet werden.
  • Das "Immunsystem" bezeichnet ein komplexes Organ, das an der Verteidigung des Organismus gegen Fremdsubstanzen und Mikroorganismen beteiligt ist. Das Immunsystem umfasst einen zellularen Teil, der mehrere Zelltypen umfasst, wie z.B. Lymphozyten und andere Zellen, die von weißen Blutzellen abgeleitet sind, und einen humoralen Teil, der kleine Peptide und Komplementfaktoren umfasst.
  • "Impfung" bedeutet, dass ein Organismus mit einem infektiösen Erreger belastet wird, z.B. in einer abgeschwächten oder inaktivierten Form des infektiösen Erregers, um eine spezifische Immunität zu induzieren. Der Begriff "Impfung" beinhaltet auch die Belastung eines Organismus mit rekombinanten Vacciniaviren gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere rekombinantem MVA-BN und seinen Derivaten, die Antigene oder Epitope exprimieren, die zu dem Virus heterolog sind. Beispiele für solche Epitope sind in anderen Teilen der Beschreibung angeführt und beinhalten z.B. Epitope von Proteinen, die von anderen Viren, wie dem Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus, HIV abgeleitet sind, oder Epitope, die von Proteinen abgeleitet sind, die mit der Entwicklung von Tumoren und Krebs in Zusammenhang stehen. Nach der Verabreichung des rekombinanten Vacciniavirus in den Körper werden die Epitope exprimiert und dem Immunsystem präsentiert, und es kann eine spezifische Immunantwort gegen diese Epitope induziert werden. Der Organismus ist somit gegen den Erreger/das Protein immunisiert, der/das das Epitop enthält, für das das rekombinante Vacciniavirus codiert.
  • "Immunität" bezeichnet einen teilweisen oder vollständigen Schutz eines Organismus vor Erkrankungen, die durch einen infektiösen Erreger verursacht werden, aufgrund einer erfolgreichen Beseitigung der vorangehenden Infektion mit dem infektiösen Erreger oder einem charakteristischen Teil desselben. Immunität beruht auf dem Vorhandensein, Einführen und Aktivieren spezialisierter Zellen des Immunsystems.
  • Wie zuvor hervorgehoben wurde, enthalten in einer Ausführungsform der Erfindung die rekombinanten Viren gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere das rekombinante MVA-BN und seine Derivate, mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz. Der Begriff "heterolog" wird in der Folge für jede Kombination von Nukleinsäuresequenzen verwendet, die normalerweise nicht in enger Verbindung mit dem Virus in der Natur vorgefunden wird, wobei ein solches Virus auch als "rekombinantes Virus" bezeichnet wird.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die heterologen Sequenzen vorzugsweise antigene Epitope, die von einer Nicht-Vaccinia-Quelle gewählt sind. Insbesondere exprimiert das rekombinante Virus ein oder mehrere antigene Epitope von Plasmodium falciparum, Mycobacteria, Influenza-Virus, von Viren, die aus der Familie der Flaviviren, Paramyxoviren, Hepatitisviren, menschlichen Immunschwächeviren oder von Viren ausgewählt sind, die hämorrhagisches Fieber verursachen, wie Hantaviren oder Filoviren, d.h., das Ebola- oder Marburg-Virus.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform, aber auch zusätzlich zu der obengenannten Auswahl antigener Epitope, können die heterologen Sequenzen aus einer anderen Pockenvirus- oder einer Vaccinia-Quelle gewählt werden. Diese viralen Sequenzen können zum Modifizieren des Wirtsspektrums oder der Immunogenität des Virus verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung für ein heterologes Gen/eine heterologe Nukleinsäure codieren, das/die ein Therapeutikum exprimiert. Ein "Therapeutikum", für das die heterologe Nukleinsäure in dem Virus codiert, kann z.B. eine therapeutische Nukleinsäure sein, wie eine Antisense-Nukleinsäure oder ein Peptid oder Protein mit gewünschter biologischer Aktivität.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Expression der heterologen Nukleinsäuresequenz vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, unter der Transkriptionskontrolle eines Pockenvirus-Promotors, insbesondere eines Vacciniavirus-Promotors.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Einführen der heterologen Nukleinsäuresequenz vorzugsweise in eine nicht essenzielle Region des Virusgenoms. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die heterologe Nukleinsäuresequenz an einer natürlich auftretenden Deletionsstelle des MVA-Genoms einge führt (offenbart in PCT/EP96/02926). Verfahren zum Einführen heterologer Sequenzen in das Pockenvirusgenom sind dem Fachmann bekannt.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Erfindung auch das Genom des Virus und seine Rekombinanten. Solche viralen Sequenzen können zum Identifizieren oder Isolieren des Virus oder seiner Rekombinanten verwendet werden, z.B. unter Verwendung von PCR, Hybridisierungstechnologien oder durch die Erstellung von ELISA-Tests. Ferner können solche viralen Sequenzen von einem Expressionsvektor exprimiert werden, um das codierte Protein oder Peptid zu erzeugen, das dann Deletionsmutanten eines Virus ergänzen kann, denen die virale Sequenz fehlt, die in dem Expressionsvektor enthalten ist.
  • Das rekombinante Virus gemäß der vorliegenden Erfindung kann für das Einführen der heterologen Nukleinsäuresequenzen in eine Zielzelle verwendet werden, wobei die Sequenz entweder homolog oder heterolog zu der Zielzelle ist. Das Einführen einer heterologen Nukleinsäuresequenzen in eine Zielzelle kann zur in vitro Erzeugung heterologer Peptide oder Polypeptide und/oder kompletter Viren, für die diese Sequenz codiert, verwendet werden. Dieses Verfahren umfasst die Infektion einer Wirtszelle mit dem rekombinanten MVA, die Kultivierung der infizierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen und die Isolation und/oder Anreicherung des Peptids, Proteins und/oder Virus, der/das von der Wirtszelle erzeugt wird.
  • Ferner kann das Verfahren zur Einführung einer homologen oder heterologen Sequenz in Zellen zur in vitro und vorzugsweise in vivo Therapie verwendet werden. Für die in vitro Therapie werden isolierte Zellen, die zuvor (ex vivo) mit dem Virus infiziert wurden, an den lebenden Tierkörper zum Induzieren einer Immunantwort verabreicht. Für die in vivo Therapie werden das Virus oder seine Rekombinanten direkt an den lebenden Tierkörper zum Induzieren einer Immunantwort verabreicht. In diesem Fall werden die Zellen, die die Inokulationsstelle umgeben, direkt in vivo durch das Virus oder seine Rekombinanten gemäß der Erfindung infiziert.
  • Da das Virus gemäß der Erfindung in menschlichen und Affenzellen stark in seinem Wachstum eingeschränkt und somit stark abgeschwächt ist, ist es ideal, einen weiten Bereich von Säugetieren, einschließlich Menschen, zu behandeln. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung und einen Impfstoff bereit, z.B. zum Induzieren einer Immunantwort in einem lebenden Tierkörper, auch in einem Menschen. Das Virus der Erfindung ist ferner in anderen Gentherapieprotokollen sicher.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann im Allgemeinen einen oder mehrere pharmazeutische unbedenkliche und/oder genehmigte Träger, Zusätze, Antibiotika, Konservierungsmittel, Adjuvantien, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisatoren enthalten. Solche Hilfssubstanzen können Wasser, Kochsalzlösung, Glycerol, Ethanol, Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-puffernde Substanzen oder dergleichen sein. Geeignete Träger sind für gewöhnlich große, langsam metabolisierende Moleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate oder dergleichen.
  • Für die Herstellung von Impfstoffen wird das Virus oder seine Rekombinanten gemäß der Erfindung in eine physiologisch unbedenkliche Form ungewandelt. Dies kann basierend auf der Erfahrung in der Herstellung von Pockenvirus-Impfstoffen erfolgen, die zur Impfung gegen Pocken verwendet werden (wie von Stickl., H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392, beschrieben). Zum Beispiel wird das aufgereinigte Virus bei –80°C mit einem Titer von 5 × 108 TCID50/ml gelagert, formuliert in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4. Zur Herstellung von Impfstoffgaben werden z.B. 102 bis 108 Partikel des Virus in 100 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% Humanalbumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative können Impfstoffgaben durch stufenweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung hergestellt werden. Diese Formulierung kann zusätzliche Zusätze, wie Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon, oder andere Zusätze, wie Antioxidantien oder inertes Gas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine (z.B. Humanserumalbumin) enthalten, die zur in vivo Verabreichung geeignet sind. Die Glasampulle wird dann verschlossen und kann zwischen 4°C und Raumtemperatur mehrere Monate gelagert werden. Solange jedoch kein Bedarf besteht, wird die Ampulle vorzugsweise bei Temperaturen unter –20°C gelagert.
  • Zur Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,5 ml einer wässerigen Lösung, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder Tris-Puffer, aufgelöst und entweder systemisch oder örtlich verabreicht werden, d.h., über eine parenterale, intramuskuläre oder andere Verabreichungsroute, die dem geübten Praktiker bekannt ist. Der Verabreichungsmodus, die Dosis und Anzahl von Verabreichungen kann von Fachleuten auf bekannte Weise optimiert werden.
  • Zusätzlich ist gemäß einer weiteren Ausführungsform das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung besonders zum Induzieren von Immunantworten in immungeschwächten Tieren nützlich, z.B. Affen (CD4 < 400/μl Blut), infiziert mit SIV, oder in immungeschwächten Menschen. Der Begriff "immungeschwächt" beschreibt den Status des Immunsystems eines Individuums, das nur unvollständige Immunantworten zeigt oder eine verminderte Verteidigungseffizienz gegen infektiöse Erreger aufweist. Noch interessanter und gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Virus der vorliegenden Erfindung Immunantworten in immungeschwächten Tieren oder Menschen verstärken, selbst bei bestehender Immunität gegen das Pockenvirus in diesen Tieren oder Menschen. Besonders interessant war, dass das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung Immunantworten auch bei Tieren oder Menschen verstärken kann, die einer antiviralen, z.B. antiretroviralen, Therapie unterzogen werden. "Antivirale Therapie" beinhaltet therapeutische Konzepte, zur Beseitigung oder Unterdrückung einer viralen Infektion, einschließlich z.B. (i) der Anwendung von Nukleotidanalogen, (ii) der Anwendung von Inhibitoren für virale enzymatische Aktivität oder virales Assembling, oder (iii) Anwendung von Zytokinen zur Beeinflussung von Immunantworten des Wirtes.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Impfstoff besonders, aber nicht ausschließlich, im Veterinärbereich anwendbar, z.B. zur Immunisierung gegen eine Tierpockeninfektion. Bei kleinen Tieren wird die Inokulation zur Immunisierung vorzugsweise parenteral oder nasal ausgeführt, während bei größeren Tieren oder Menschen eine subkutane, intramuskuläre oder orale Inokulation bevorzugt ist.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass bereits eine Impfstoffgabe, die eine wirksame Dosis von nur 102 TCID50 ("Tissue Culture Infectious Dose") des Virus gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, ausreichend ist, um eine vollständige Immunität gegen eine Belastung mit Wildtyp-Vacciniavirus in Mäusen zu induzieren. Dies ist insbesondere überraschend, da ein derart hoher Grad an Abschwächung des Virus gemäß der vorliegenden Erfindung eine negative Beeinflussung und somit Verringerung seiner Immunogenität erwarten ließe. Eine solche Erwartung beruht auf der Annahme, dass zum Induzieren einer Immunantwort die antigenen Epitope dem Immunsystem in ausreichender Menge präsentiert werden müssen. Ein Virus, das stark abgeschwächt ist und somit nicht repliziert, kann nur eine sehr geringe Menge an antigenen Epitopen präsentieren, das heißt, soviel, wie es selbst enthält. Diese Menge an Antigen, die von den viralen Partikeln getragen wird, wurde als unzureichend für die Einleitung einer potenten Immunantwort erachtet. Das Virus gemäß der Erfindung stimuliert jedoch selbst bei einer sehr geringen wirksamen Dosis von nur 102 TCID50 eine potente und schützende Immunantwort in einem Maus/Vaccinia-Belastungsmodell. Das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt somit eine unerwartete und sogar erhöhte Immunogenität im Vergleich zu anderen bisher charakterisierten MVA-Stämmen. Diese hohe Immunogenität macht das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung und jeden davon abgeleiteten Impfstoff zur Anwendung in immungeschwächten Tieren oder Menschen besonders nützlich.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Virus als Adjuvans verwendet. Ein "Adjuvans" im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Verstärker der spezifischen Immunantwort in Impfstoffen. "Die Verwendung des Virus als Adjuvans" bedeutet, dass das Virus in einen bereits bestehenden Impfstoff eingefügt wird, um das Immunsystem des Patienten, der den Impfstoff erhält, zusätzlich zu stimulieren. Die immunisierende Wirkung eines antigenen Epitops wird in den meisten Impfstoffen häufig durch die Zugabe eines sogenannten Adjuvans verstärkt. Ein Adjuvans stimuliert zusätzlich das Immunsystem, indem es eine stärkere spezifische Immunantwort gegen ein antigenes Epitop eines Impfstoffs verursacht. Diese Stimulation kann durch Faktoren des unspezifischen Immunsystems, wie Interferon und Interleukin, reguliert werden.
  • Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung das Virus in Säugetieren, einschließlich Menschen, zum Aktivieren, Unterstützen oder Unterdrücken des Immunsystems verwendet, und vorzugsweise zum Aktivieren der Immunantwort gegen jede antigene Determinante. Das Virus kann auch zum Unterstützen des Immunsystems in einer Situation verwendet werden, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen verbunden ist, wie im Falle von Stress.
  • Das Virus, das als Adjuvans verwendet wird, kann ein nicht rekombinantes Virus sein, d.h., ein Virus, das keine heterologe DNA in seinem Genom enthält. Ein Beispiel für diese Art von Virus ist MVA-BN. Als Alternative ist das Virus, das als Adjuvans verwendet wird, ein rekombinantes Virus, das in seinem Genom heterologe DNA-Sequenzen enthält, die von Natur aus nicht in dem viralen Genom enthalten sind. Zur Verwendung als Adjuvans enthält und exprimiert die rekombinante virale DNA des Virus vorzugsweise Gene, die für immunstimulierende Peptide oder Proteine, wie Interleukine, codieren.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, dass das Virus inaktiviert ist, wenn es als Adjuvans verwendet oder einem anderen Impfstoff hinzugefügt wird. Die Inaktivierung des Virus kann z.B. durch Wärme oder Chemikalien erfolgen, wie in der Technik bekannt ist. Vorzugsweise wird das Virus durch β-Propriolacton inaktiviert. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung kann das inaktivierte Virus Impfstoffen gegen zahlreiche infektiöse oder proliferative Erkrankungen zugegeben werden, um die Immunantwort des Patienten auf diese Erkrankung zu erhöhen.
  • Zusammenfassend umfasst die Erfindung inter alia die Ausführungsformen, die in dem Satz von Ansprüchen aufgelistet sind, alleine oder in Kombination.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Wachstumskinetik verschiedener Stämme von MVA in verschiedenen Zelllinien. In Teil A) sind die Ergebnisse nach den getesteten MVA-Stämmen gruppiert, wäh rend in Teil B) die Ergebnisse nach den getesteten Zelllinien gruppiert sind. B) Die Virusmenge, die von einer Zelllinie nach vier Tagen (D4) Kultur gewonnen wird, wurde durch Plaque-Assay bestimmt und als Verhältnis von Virus, das nach 4 Tagen gewonnen wurde, zu dem anfänglichen Inokulum am Tag 1 (D1) ausgedrückt.
  • 2: Schutz, der gegen eine letale Belastung von Vaccinia nach Impfungen mit entweder MVA-BN oder MVA 575 geboten wird. Der Schutz wird durch die Verringerung in Ovarientitern gemessen, die 4 Tage nach der Belastung mit Hilfe eines Standard-Plaque-Assays bestimmt wurden.
  • 3: Induzieren von CTL und Schutz, der gegen eine Influenza-Belastung unter Verwendung verschiedener "Prime-Boost"-Schemen geboten wird.
  • 3A: Induzieren von CTL-Antworten auf 4 verschiedene H-2d begrenzte Epitope nach Impfungen mit verschiedenen Kombinationen von DNA und MVA-BN Impfstoffen, die für ein murines Polytop codieren. BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden entweder mit DNA (intramuskulär) oder MVA-BN (subkutan) geimpft und erhielten drei Wochen später "Booster"-Immunisierungen. CTL-Antworten auf 4 verschiedene Epitope, für die die Impfstoffe (TYQRTRALV, Influenza; SYIPSAEKI, P.Berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalovirus; RPQASGVYM, LCV) codierten, wurden unter Verwendung eines ELISPOT-Assays 2 Wochen nach den "Booster"-Immunisierungen bestimmt.
  • 3B: Induzieren von CTL-Antworten auf 4 verschiedene Epitope nach Impfungen mit verschiedenen Kombinationen von DNA oder MVA-BN Impfstoffen, die für ein murines Polytop codieren. BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden entweder mit DNA (intramuskulär) oder MVA-BN (intravenös) geimpft und erhielten drei Wochen später "Booster"-Immunisierungen. CTL-Antworten auf 4 verschiedene Epitope, für die die Impfstoffe (TYQRTRALV, Influenza; SYIPSAEKI, P.Berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalovirus; RPQASGVYM, LCV) codierten, wurden unter Verwendung eines ELISPOT-Assays 2 Wochen nach den "Booster"-Immunisierungen bestimmt.
  • 3C: Frequenz von Peptid- und MVA-spezifischen T-Zellen nach homologem "Prime-Boost" unter Verwendung einer optimalen Dosis (1 × 108 TCID50) von rekombinantem MVA-BN, subkutan verabreicht. Gruppen von 8 Mäusen wurden mit zwei Gaben der Kombinationen geimpft, wie in der Figur angezeigt ist. Zwei Wochen nach der letzten Impfung wurde die Anzahl peptidspezifischer Splenozyten unter Verwendung eines IFN-Gamma-ELISPOT-Assays gemessen. Die Balken stellen die mittlere Anzahl spezifischer Punkte plus/minus Standardabweichung vom Mittelwert dar.
  • 4: SIV-Belastung von Affen, die mit MVA-BN nef oder MVA-BN geimpft wurden.
  • 5: Überlebensrate von geimpften Affen nach einer Infektion mit SIV.
  • 6: Affenserum-Antikörpertiter gegen MVA-BN. Die Antikörpertiter für jedes Tier sind als verschiedene Formen dargestellt, während der mittlere Titer als volles Rechteck dargestellt ist.
  • 7: SIV-Werte in immungeschwächten Affen (CD4 < 400 ml Blut) nach Impfungen mit MVA-BN codierendem tat. Affen hatten zuvor drei Impfungen mit entweder MVA-BN oder MVA-BN nef (Woche 0, 8, 16) erhalten und wurden mit einem pathogenen Isolat von SIV (Woche 22) infiziert. In Woche 100, 102 und 106 (durch Pfeile dargestellt) wurden die Affen mit MVA-BN tat geimpft.
  • 8: SIV-Werte in Affen, die einer antiretroviralen Therapie unterzogen wurden und therapeutische Impfungen mit MVA-BN erhielten. Drei Gruppen von Affen (n = 6) wurden mit SIV infiziert und täglich mit PMPA (durch eine schwarze Linie dargestellt) behandelt. In Woche 10 und 16 wurden die Tiere entweder mit Mischungen aus rekombinantem MVA oder Kochsalzlösung geimpft (durch Pfeile dargestellt).
  • 9: Humorale Antwort, die auf SIV nach einer Infektion und Impfungen mit rekombinantem MVA erzeugt wurde. Drei Gruppen (n = 6) von Affen wurden mit einem pathogenen Isolat von SIV (Woche 0) infiziert und dann mit der antiretroviralen Therapie (PMPA; angezeigt durch eine fette Linie) behandelt. Affen wurden mit Mischungen aus rekombinantem MVA oder Kochsalzlösung in Woche 10 und 16 geimpft. Antikörper gegen SIV wurden unter Verwendung von infizierten T-Zell-Lysaten als Antigen in einem Standard-ELISA bestimmt.
  • 10: Humorale Antwort, die in SIV-infizierten Affen, die einer antiretroviralen Therapie unterzogen wurden, gegen MVA erzeugt wurde. Drei Gruppen (n = 6) von Affen wurden mit einem pathogenen Isolat von SIV infiziert (Woche 0) und dann mit der antiretroviralen Therapie (PMPA; angezeigt durch eine fette Linie) behandelt. Affen wurden mit Mischungen aus rekombinantem MVA oder Kochsalzlösung in Woche 10 und 16 geimpft. Antikörper gegen MVA wurden unter Verwendung eines Standard-Capture-ELISA bestimmt.
  • 11: Induzieren von Antikörpern gegen MVA nach einer Impfung von Mäusen mit verschiedenen Pockenimpfstoffen. Die Antikörperwerte, die nach Impfungen mit MVA-BN (Woche 0 und 4) gegen MVA erzeugt wurden, wurden mit herkömmlichen Vacciniastämmen, Elstree und Wyeth, durch Schwanz-Skarifizierung (Woche 0) verabreicht, MVA 572 (Woche 0 und 4), und MVA-BN und MVA 572, verabreicht als Prä-Elstree-Impfstoff, verglichen. MVA 572 wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures als ECACC V94012707 hinterlegt. Die Titer wurden unter Verwendung eines Capture-ELISA bestimmt und durch lineare Regression unter Verwendung des linearen Teils der Graphik berechnet und als die Verdünnung definiert, die zu einer optischen Dichte von 0,3 führte. * MVA-BN:MVA-BN unterscheidet sich signifikant (p > 0,05) von MVA 572:MVA 572.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung näher. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die vorgelegten Beispiele in keiner Weise so zu interpretieren sind, dass die Anwendbarkeit der Technologie, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, auf diese Beispiele beschränkt ist.
  • Beispiel 1
  • Wachstumskinetik eines neuen MVA-Stamms in ausgewählten Zelllinien und Replikation in vivo
  • (i) Wachstumskinetik in Zelllinien:
  • Zur Charakterisierung eines neu isolierten Stamms gemäß der vorliegenden Erfindung (in der Folge als MVA-BN bezeichnet) wurde die Wachstumskinetik dieses neuen Stamms mit jener von anderen MVA-Stämmen verglichen, die bereits charakterisiert wurden.
  • Der Versuch erfolgte durch einen Vergleich der Wachstumskinetik der folgenden Viren in den anschließend aufgelisteten Primärzellen und Zelllinien:
    MVA-BN (Virusstamm #23, 18.02.99 crude, titriert bei 2,0 × 107 TCID50/ml.
    MVA, wie von Altenburger (US Patent 5,185,146) charakterisiert und in der Folge als MVA-HLR bezeichnet;
    MVA (Passage 575), wie von Anton Mayr (Mayr, A., et al. [1975] Infection 3; 6–14) charakterisiert und in der Folge als MVA 575 (ECACC V00120707) bezeichnet; und
    MVA-Vero, wie in der Internationalen Patentanmeldung PCT/EP01/02703 (WO 01/68820) charakterisiert (Virusstamm, Passage 49, #20, 22.03.99 crude, titriert bei 4,2 × 107 TCID50/ml).
  • Die verwendeten Primärzellen und Zelllinien waren Folgende:
    • CEF
    Chicken Embryo Fibroblasts (frisch hergestellt aus SPF-Eiern)
    HeLa
    Menschliches Zervix-Adenokarzinom (epithelial), ATCC Nr. CCL-2;
    143B
    Menschliches Knochen-Osteosarkom TK-, ECACC Nr. 91112502;
    HaCaT
    Menschliche Keratinozytenzelllinie, Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761–771;
    BHK
    Baby Hamster Kidney, ECACC 85011433;
    Vero
    Nieren-Fibroblasten des African Green Monkey, ECACC 85020299;
    CV1
    Nieren-Fibroblasten des African Green Monkey, ECACC 87032605.
  • Zur Infektion wurden verschiedene Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen bei einer Konzentration von 5 × 105 Zellen/Vertiefung geimpft und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 in DMEM (Gibco, Kat. Nr. 61965–026) plus 2% FCS, inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden bei etwa moi 0,05 eine Stunde bei 37°C, 5% CO2 infiziert (für die Infektion wurde angenommen, dass sich die Zellenanzahl über Nacht verdoppelt). Die Virusmenge, die für jede Infektion der verschiedenen Zelltypen verwendet wurde, betrug 5 × 104 TCID50 und dies wird als Input bezeichnet. Die Zellen wurden dann dreimal mit DMEM gewaschen und schließlich wurde 1 ml DMEM, 2% FCS zugegeben, und die Platten wurden zur Inkubation 96 Stunden (4 Tage) bei 37°C, 5% CO2, stehen gelassen. Diese Infektionen wurden durch Einfrieren der Platten bei –80°C gestoppt, die dann zur Titrationsanalyse bereit waren.
  • Titrationsanalyse (Immunfärbung mit einem Vacciniavirus-spezifischen Antikörper)
  • Zur Titration der Virusmenge wurden Testzellen (CEF) auf Platten mit 96 Vertiefungen in RPMI (Gibco, Kat. Nr. 61870–010), 7% FCS, 1% Antibiotic/Antimycotic (Gibco, Kat. Nr. 15240–062) bei einer Konzentration von 1 × 104 Zellen/Vertiefung geimpft und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Die Platten mit 6 Vertiefungen, die die Infektionsversuche enthielten, wurden dreimal gefroren/aufgetaut und Verdünnungen von 10–1 bis 10–12 wurden unter Verwendung von RPMI Wachstumsmedium hergestellt. Virusverdünnungen wurden auf Testzellen verteilt und fünf Tage bei 37°C, 5% CO2 inkubiert, um die Entwicklung eines CPE (zytopathischen Effekts) zu ermöglichen. Testzellen wurden 10 min fixiert (Aceton/Methanol 1:1), mit PBS gewaschen und mit polyklonalem Vacciniavirus-spezifischen Antikörper (Quartett Berlin, Kat. Nr. 9503–2057) bei einer 1:1000 Verdünnung in Inkubationspuffer eine Stunde bei RT inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS (Gibco, Kat. Nr. 20012–019) wurde der HPR-gekoppelte Anti-Kaninchen Antikörper (Promega Mannheim, Kat. Nr. W4011) bei einer 1:1000 Verdünnung in Inkubationspuffer (PBS, enthaltend 3% FCS) eine Stunde bei RT zugegeben. Die Zellen wurden erneut zweimal mit PBS gewaschen und mit Färbelösung (10 ml PBS + 200 μl gesättigte Lösung aus o-Dianisidin in 100% Ethanol + 15 μl H2O2, frisch hergestellt) gewaschen, bis braune Flecken sichtbar waren (zwei Stun den). Die Färbungslösung wurde entfernt, und PBS wurde zum Anhalten der Färbungsreaktion zugegeben. Jede Vertiefung, die einen braunen Fleck aufwies, wurde als CPE-positiv markiert, und der Titer wurde unter Verwendung der Formel von Kaerber (Assay auf der Basis von TCID50) berechnet. (Kaerber, G. 1931, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480).
  • Die Viren wurden zur Infektion doppelter Sätze von einerseits CEF und BHK, von welchen erwartet wurde, dass sie für MVA permissiv sind, und andererseits CV-1, Vero, HeLa, 143B und HaCat, von welchen erwartet wurde, dass sie für MVA nicht permissiv sind, bei einer geringe Infektionsmultiplizität d.h., 0,05 infektiöse Einheiten pro Zelle (5 × 104 TCID50) verwendet. Danach wurde das Virus-Inokulum entfernt und die Zellen wurden dreimal gewaschen, um alle verbleibenden, nicht absorbierten Viren zu entfernen. Die Infektionen wurden insgesamt 4 Tage belassen, wonach Virusextrakte hergestellt und dann auf CEF-Zellen titriert wurden. Tabelle 1 und 1 zeigen die Ergebnisse der Titrationsassays, wobei die Werte als Gesamtvirusmenge angegeben sind, die nach 4 Tagen Infektion erzeugt wurde.
  • Es wurde gezeigt, dass alle Viren in CEF-Zellen (Chicken Embryo Fibroblasts) wie erwartet gut amplifizierten, da dies eine permissive Zelllinie für alle MVAs ist. Zusätzlich wurde gezeigt, dass alle Viren in BHK (Hamster Kidney Zelllinie) gut amplifizierten. MVA-Vero zeigte die besten Ergebnisse, da BHK eine permissive Zelllinie ist.
  • Hinsichtlich der Replikation in Vero-Zellen (Affennieren-Zelllinie) amplifizierte MVA-Vero wie erwartet gut, nämlich tausendfach über dem Input. MVA-HLR und auch MVA 575 amplifizierten gut mit einer 33-fachen beziehungsweise 10-fachen Erhöhung über dem Input. Nur MVA-BN zeigte keine so gute Amplifikation in diesen Zellen im Vergleich zu den anderen, nämlich mit nur einer zweifachen Erhöhung über dem Input.
  • Auch hinsichtlich der Replikation in CV1 Zellen (Affennieren-Zelllinie) zeigte sich, dass MVA-BN in dieser Zelllinie stark abgeschwächt ist. Es zeigte eine 200-fache Senkung unter den Input. Ebenso amplifizierte MVA 575 nicht über den Input-Wert und zeigte eine leicht negative Amplifikation, nämlich eine 16-fache Senkung unter den Input. MVA-HLR amplifizierte am besten mit einer 30-fachen Erhöhung über dem Input, gefolgt von MVA-Vero mit einer 5-fachen Erhöhung über dem Input.
  • Am interessantesten ist ein Vergleich der Wachstumskinetik der verschiedenen Viren in menschlichen Zelllinien. Hinsichtlich der reproduktiven Replikation in 143B-Zellen (menschliche Knochenkrebs-Zelllinie) wurde gezeigt, dass MVA-Vero als einziges eine Amplifikation über dem Input zeigte (dreifache Erhöhung). Alle anderen Viren amplifizierten nicht über dem Input, aber es gab einen großen Unterschied zwischen dem MVA-HLR und sowohl MVA-BN als auch MVA 575. MVA-HLR war "grenzwertig" (einfache Senkung unter den Input), während MVA-BN die größte Abschwächung zeigte (300-fache Senkung unter den Input), gefolgt von MVA 575 (59-fache Senkung unter den Input). Zusammenfassend ist MVA-BN hinsichtlich der Abschwächung in menschlichen 143B-Zellen am besten.
  • Ferner wurde hinsichtlich der Replikation in HeLa-Zellen (menschliche Zervixkrebszellen) gezeigt, dass MVA-HLR gut in dieser Zelllinie amplifizierte, und sogar noch besser als in den permissiven BHK-Zellen (HeLa = 125-fache Erhöhung über dem Input; BHK = 88-fache Erhöhung über dem Input). MVA-Vero amplifizierte auch gut in dieser Zelllinie (27-fache Erhöhung über dem Input). MVA-BN und auch in einem geringeren Maße MVA 575 wurden jedoch in diesen Zelllinien abgeschwächt (MVA-BN = 29-fache Senkung unter den Input und MVA 575 = 6-fache Senkung unter den Input).
  • Hinsichtlich der Replikation in HaCat-Zellen (menschliche Keratinozyten-Zelllinie) wurde gezeigt, dass MVA-HLR gut in dieser Zelllinie amplifizierte (55-fache Erhöhung über dem Input). Sowohl das adptierte MVA-Vero als auch MVA 575 zeigten eine Amplifikation in dieser Zelllinie (1,2- beziehungsweise 1,1-fache Erhöhung über dem Input). MVA-BN jedoch zeigte als einziges eine Abschwächung (5-fache Senkung unter den Input).
  • Als Schlussfolgerung kann behauptet werden, dass MVA-BN der am stärksten abgeschwächte Virusstamm in dieser Virusgruppe ist: MVA-BN zeigt eine extreme Abschwächung in menschlichen Zelllinien, indem es ein Amplifikationsverhältnis von 0,05 bis 0,2 in menschlichen Embryo-Nierenzellen (293: ECACC Nr. 85120602) (Daten in der Tabelle 1 nicht enthalten) zeigt, des Weiteren ein Amplifikationsverhältnis von etwa 0,0 in 143B-Zellen; ein Amplifikationsverhältnis von etwa 0,04 in HeLa-Zellen; ein Amplifikationsverhältnis von etwa 0,22 in HaCat-Zellen zeigt. Zusätzlich zeigt MVA-BN ein Amplifikationsverhältnis von etwa 0,0 in CV1-Zellen. Nur in Vero-Zellen kann eine Amplifikation beobachtet werden (Verhältnis von 2,33), jedoch nicht in demselben Ausmaß, wie in den permissiven Zelllinien, wie BHK und CEF (vergleiche Tabelle 1). Somit ist MVA-BN der einzige bekannte MVA-Stamm, der ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 in allen menschlichen Zelllinien 143B, HeLa, HaCat und 293 zeigt.
  • MVA 575 zeigt ein ähnliches Profil wie MVA-BN, ist aber nicht so abgeschwächt wie MVA-BN.
  • MVA-HLR amplifizierte in allen getesteten Zelllinien (mit Ausnahme von 143B-Zellen) gut und kann daher als replikationskompetent in allen getesteten Zelllinien mit Ausnahme von 143B-Zellen angesehen werden. In einem Fall amplifizierte es sogar in einer menschlichen Zelllinie (HeLa) besser als in einer permissiven Zelllinie (BHK).
  • MVA-Vero zeigt eine Amplifikation in allen Zelllinien, aber in einem geringeren Ausmaß als für MVA-HLR gezeigt wurde (unter Beiseitelassung des 143B-Ergebnisses). Dennoch kann es hinsichtlich der Abschwächung nicht derselben "Klasse" wie MVA-BN oder MVA 575 zugeordnet werden.
  • 2. Replikation in vivo
  • Unter der Voraussetzung, dass einige MVA-Stämme eindeutig in vitro amplifizieren, wurde die Fähigkeit verschiedener MVA-Stämme zur in vivo Replikation unter Verwendung eines transgenen Mausmodells AGR129 untersucht. Dieser Mausstamm hat genspezifische Spaltungen in den IFN Rezeptor Typ I (IFN-α/β) und Typ II (IFN-γ) Genen und in RAG. Aufgrund dieser Spaltungen haben die Mäuse kein IFN-System und sind nicht imstande, reife B- und T-Zellen zu erzeugen und als solches stark immungeschwächt und für ein replizierendes Virus äußerst anfällig. Gruppen von sechs Mäusen wurden mit 107 pfu von entweder MVA-BN, MVA-HLR oder MVA 572 (bei 120.000 Menschen in Deutschland verwendet) immunisiert (i.p.) und täglich auf klinische Symptome überwacht. Alle Mäuse, die mit MVA HLR oder MVA 572 geimpft waren, starben innerhalb von 28 beziehungsweise 60 Tagen. Bei der Nekropsie gab es allgemeine Anzeichen einer schweren Virusinfektion im Großteil der Organe, und MVA (108 pfu) wurden mit Hilfe eines Standard-Plaque-Assays aus den Ovarien gewonnen. Im Gegensatz dazu überlebten Mäuse, die mit derselben Dosis MVA-BN (entsprechend dem hinterlegten Stamm ECACC V00083008) geimpft waren, mehr als 90 Tage und aus Organen und Gewebe konnte kein MVA gewonnen werden.
  • Wenn die Daten von den in vitro und in vivo Studien zusammengefasst werden, zeigen sie deutlich, dass MVA-BN stärker abgeschwächt ist als der Eltern- und kommerzielle MVA-HRL-Stamm.
  • Beispiel 2
  • Immunologische und in vivo Daten
  • Diese Versuche wurden für einen Vergleich verschiedener Dosis- und Impfungsschemen von MVA-BN im Vergleich zu anderen MVAs durchgeführt.
  • 2.1. Verschiedene Stämme von MVA unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, die Immunantwort zu stimulieren
  • Replikationskompetente Vacciniastämme induzieren eine potente Immunantwort in Mäusen und sind bei hohen Dosen letal. Obwohl MVA stark abgeschwächt sind und eine verminderte Fähigkeit zur Replikation auf Säugetierzellen haben, gibt es Unterschiede in der Abschwächung zwischen verschiedenen MVA-Stämmen. Tatsächlich scheint MVA-BN stärker abgeschwächt zu sein als andere MVA-Stämme, sogar der Elternstamm MVA 575. Zur Bestimmung, ob dieser Unterschied in der Abschwächung die Wirksamkeit von MVA, schützende Immunanworten zu induzieren, beeinflusst, wurden verschiedene Dosen von MVA-BN und MVA 575 in einem Vaccinia-Modell mit letaler Belastung verglichen. Die Höhe des Schutzes wurde durch eine Verringerung in Vacciniatitern in den Ovarien gemessen, die 4 Tage nach der Belastung bestimmt wurden, da dies eine quantitative Bewertung verschiedener Dosen und Stämme von MVA ermöglicht.
  • Letales Belastungsmodell
  • Spezifische, pathogenfreie, 6 bis 8 Wochen alte, weibliche BALB/c- (H-2d) Mäuse (n = 5) wurden mit verschiedenen Dosen (102, 104 oder 106 TCID50/ml) von entweder MVA BN oder MVA 575 imunisiert (i.p.). MVA-BN und MVA 575 wurde auf CEF-Zellen vermehrt und wurden Saccharoseaufgereinigt und in Tris, pH 7,4, formuliert. Drei Wochen später erhielten die Mäuse einen "Boost" derselben Dosis und desselben MVA-Stammes, woraufhin zwei Wochen später eine letale Belastung (i.p.) mit einem replikationskompetenten Vacciniastamm folgte. Als replikationskompetentes Vacciniavirus (abgekürzt als "rVV") wurde entweder der Stamm WR-L929 TK+ oder der Stamm IHD-J verwendet. Kontrollmäuse erhielten einen Placeboimpfstoff. Der Schutz wurde durch die Verringerung in den Ovarientitern gemessen, die 4 Tage nach der Belastung durch einen Standard-Plaque-Assay bestimmt wurden. Dazu wurden die Mäuse am Tag 4 nach der Belastung getötet und die Ovarien wurden entfernt, in PBS (1 ml) homogenisiert, und die viralen Titer wurden durch einen Standard-Plaque-Assay unter Verwendung von VERO-Zellen bestimmt (Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160: 1717).
  • Mäuse, die mit zwei Immunisierungen von entweder 104 oder 106 TCID50/ml MVA-BN oder MVA 575 geimpft wurden, waren vollständig geschützt, wie durch eine 100% Verringerung in den Ovarien-rVV-Titern 4 Tage nach der Belastung beurteilt wurde (2). Das Belastungsvirus war beseitigt. Die Unterschiede in den Schutzwerten, die durch MVA-BN oder MVA 575 geboten wurden, wurden jedoch bei geringeren Dosen beobachtet. Mäuse, die zwei Immunisierungen von 102 TCID50/ml MVA 575 erhalten hatten, waren nicht geschützt, wie durch die hohen Ovarien-rVV-Titer (Mittel 3,7 × 107 pfu +/– 2,11 × 107) beurteilt wurde. Im Gegensatz dazu induzierten Mäuse, die mit derselben Dosis MVA-BN geimpft waren, eine signifikante Verringerung (96%) in den Ovarien-rVV-Titern (Mittel 0,21 × 107 pfu +/– 0,287 × 107). Die Kontrollmäuse, die einen Placeboimpfstoff empfangen hatten, hatten einen mittleren viralen Titer von 5,11 × 107 pfu (+/– 3, 59 × 107) (2).
  • Beide Stämme von MVA induzieren schützende Immunantworten in Mäusen gegen eine letale rVV-Belastung. Obwohl beide Stämme von MVA gleichermaßen wirksam bei höheren Dosen sind, sind Unterschiede in ihrer Wirksamkeit bei suboptimalen Dosen deutlich erkennbar. MVA-BN ist in der Induzierung einer schützenden Immunantwort gegen eine letale rVV-Belastung, die mit der erhöhten Abschwächung von MVA-BN im Vergleich zu MVA 575 zusammenhängen könnte, potenter als sein Elternstamm MVA 575.
  • 2.2. MVA-BN in "Prime-Boost"-Impfschemen
  • 2.2.1.: Induzierung von Antikörpern gegen MVA nach einer Impfung von Mäusen mit verschiedenen Pockenimpfstoffen
  • Die Wirksamkeit von MVA-BN wurde mit anderen MVA- und Vacciniastämmen verglichen, die zuvor in der Bekämpfung von Pocken verwendet wurden. Diese enthielten einzelne Immunisierungen unter Verwendung der Elstree- und Wyeth-Vacciniastämme, die CEF-Zellen erzeugt und über Schwankz-Skarifizierung verabreicht wurden, und Immunisierungen unter Verwendung von MVA 572, das zuvor im Pockenbekämpfungsprogramm in Deutschland verwendet wurde. Zusätzlich wurden sowohl MVA-BN als auch MVA 572 als Vorimpfstoff verglichen, worauf Elstree über Skarifizierung folgte. Für jede Gruppe wurden acht BALB/c-Mäuse verwendet und alle MVA-Impfungen (1 × 107 TCID50) wurden subkutan in Woche 0 und Woche 3 verabreicht. Zwei Wochen nach der "Boost"-Immunisierung wurden die Mäuse mit Vaccinia (IHD-J) belastet und die Titer in den Ovarien wurden 4 Tage nach der Belastung bestimmt. Alle Impfstoffe und Schemen induzierten einen 100% Schutz.
  • Die Immunantworten, die unter Verwendung dieser verschiedenen Impfstoffe oder Schemen induziert wurden, wurden in Tieren vor der Belastung gemessen. Es wurden Assays zum Messen der Werte an neutralisierenden Antikörpern, der T-Zellproliferation, Zytokinproduktion (IFN-γ gegenüber IL-4) und der IFN-γ-Produktion durch T-Zellen verwendet. Das Ausmaß der T-Zell-Antworten, die durch MVA-BN induziert wurden, gemessen durch ELISPOT, war im Allgemeinen gleich anderen MVA und Vacciniaviren, die Bioäquivalenz aufweisen. Eine wö chentliche Analyse der Antikörpertiter gegen MVA nach den verschiedenen Impfungsschemen zeigte, dass Impfungen mit MVA-BN die Geschwindigkeit und Größe der Antikörperantwort im Vergleich zu anderen Impfschemen signifikant erhöhten (11). Tatsächlich waren die Antikörpertiter gegen MVA in Woche 2, 4 und 5 (1 Woche nach dem "Boost" in Woche 4) signifikant höher (p > 0,05), wenn eine Impfung mit MVA-BN erfolgte, im Vergleich zu Mäusen, die mit MVA 572 geimpft waren. Nach der "Boost"-Impfung in Woche 4 waren die Antikörpertiter in der MVA-BN Gruppe im Vergleich zu den Mäusen, die eine einzige Impfung mit einem der Vacciniastämme Elstree oder Wyeth erhielten, auch signifikant höher. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass zwei Impfungen mit MVA-BN eine bessere Antikörperantwort im Vergleich zu der klassischen Einzelimpfung mit herkömmlichen Vacciniastämmen (Elstree und Wyeth) induzierten, und bestätigen die Befunde von Abschnitt 1.5, dass MVA-BN stärker immunogen ist als andere MVA-Stämme.
  • 2.2.2.: MVA-"Prime"- und "Boost-" Schemen erzeugen denselben Schutzwert wie DNA-"Prime"/MVA-"Boost"-Schemen in einem Influenza-Belastungsmodell
  • Die Wirksamkeit von MVA-"Prime-Boost"-Schemen zur Erzeugung von CTL-Antworten hoher Avidität wurde bewertet und mit DNA-"Prime"/MVA-"Boost"-Schemen verglichen, von welchen berichtet wurde, dass sie besser wären. Die verschiedenen Schemen wurden unter Verwendung eines murinen Polytopkonstrukts bewertet, für das entweder ein DNA-Vektor oder MVA-BN codiert, und die Werte der CTL-Induktion wurden durch ELISPOT verglichen, während die Avidität der Antwort als Ausmaß des Schutzes gemessen wurden, der nach einer Belastung mit Influenza geboten wurde.
  • Konstrukte
  • Das DNA-Plasmid, das für das murine Polytop (10 CTL Epitope, einschließlich Influenza, Ovalbumin) codiert, wurde bereits beschrieben (Thomson et al., 1988, J. Immunol. 160: 1717). Dieses murine Polytop wurde in die Deletionsstelle II von MVA-BN eingeführt, auf CEF-Zellen vermehrt, Saccharose-aufgereinigt und in Tris, pH 7,4, formuliert.
  • Impfprotokolle
  • In der gegenwärtigen Studie wurden spezifische, pathogenfreie, 6 bis 8 Wochen alte, weibliche BALB/c- (H-2d) Mäuse verwendet. Gruppen von 5 Mäusen wurden zur ELISPOT-Analyse verwendet, während 6 Mäuse pro Gruppe für die Influenza-Belastungsversuche verwendet wurden. Die Mäuse wurden mit verschiedenen "Prime-Boost"-Schemen unter Verwendung von MVA oder DNA, die für das murine Polytop codieren, geimpft, wie in den Ergebnissen detailliert ist. Zur Immunisierung mit DNA wurden die Mäuse narkotisiert und erhielten dann eine Einzelinjektion von 50 μg endotoxinfreier Plasmid-DNA (in 50 μl PBS) in den Quadrizeps unter Narkose. Primäre Immunisierungen unter Verwendung von MVA erfolgten entweder durch intravenöse Verabreichung von 107 pfu MVA-BN pro Maus oder durch subkutane Verabreichung von 107 pfu oder 108 pfu MVA-BN pro Maus. "Boost"-Immunisierungen wurden drei Wochen nach den primären Immunisierungen verabreicht. Das "Boosten" mit Plasmid-DNA erfolgte auf dieselbe Weise wie die primäre Immunisierung mit DNA (siehe oben). Zur Ermittlung der CTL-Antworten wurden Standard-ELISPOT-Assays (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397–402) auf Splenozyten 2 Wochen nach der letzten "Booster"-Immunisierung unter Verwendung des Influenza CTL-Epitop-Peptids (TYQRTRALV), des P.Berghei Epitop-Peptids (SYIPSAEKI), des Cytomeglaovirus-Peptid-Epitops (YPHFMPTNL) und/oder des LCV-Peptid-Epitops (RPQASGVYM) durchgeführt. Für die Belastungsversuche wurden die Mäuse narkotisiert und i.n. mit einer subletalen Dosis des ressortanten Influenza-Virus, Mem71 (4,5 × 105 pfu in 50 ml PBS) infiziert. Am Tag 5 nach der Infektion wurden die Lungen entfernt und die viralen Titer doppelt auf der Madin-Darby-Canine-Kidney-Zelllinie unter Verwendung eiens Standard-Influenza-Plaque-Assays bestimmt.
  • Ergebnisse:
  • Bei Verwendung nur des DNA-Impfstoffs war das Induzieren von CTL gegen die 4 H-2d Epitope, für die das murine Polytop codierte, schlecht und es konnten nur schwache Antworten auf zwei der Epitope für P.Berghei (SYIPSAEKI) und das lymphozyte Choriomeningitis-Virus (RPQASGVYM) erfasst werden. Im Gegensatz dazu waren bei Verwendung eines DNA-"Prime"/MVA-"Boost"-Schemas (107 pfu MVA-BN, subkutan verabreicht) signifikant mehr CTL gegen SLY (8-fache Erhöhung) und RPQ (dreifache Erhöhung) induziert, und die Antworten wurden auch bei einem dritten Epitop für murines Cytomegalovirus (YPHFMPTNL) beobachtet (3A). Die Verwendung von 107 pfu MVA-BN, das subkutan verabreicht wurde, in einem homologen "Prime-Boost"-Schema induzierte dasselbe Ausmaß an Antworten wie DNA, gefolgt von MVA-BN (3A). Überraschenderweise gab es keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl von CTLs, die gegen die drei Epitope induziert wurden, wenn eine Immunisierung von MVA-BN (107 TCID50) verwendet wurde, was darauf hinweist, dass eine sekundäre Immunisierung mit MVA-BN CTL-Antworten nicht signifikant verstärkte.
  • Die subkutane Verabreichung von 107 pfu MVA wurde zuvor als die ineffizienteste Route und Viruskonzentration für die Impfung unter Verwendung anderer MVA-Stämme dargestellt, insbesondere im Vergleich zu intravenösen Immunisierungen (Schneider et al. 1998). Zur Definition optimaler Immunisierungsschemen wurde der obengenannte Versuch wiederholt, indem entweder die Virusmenge geändert oder der Verabreichungsmodus geändert wurde. In einem Versuch wurden 107 pfu MVA-BN intravenös verab reicht (3B). In einem weiteren Versuch wurden 108 pfu MVA-BN subkutan verabreicht (3C). In diesen Versuchen induzierten MVA-BN "Prime-Boost"-Immunisierungen höhere mittlere CTL-Zahlen für alle drei CTL-Epitope im Vergleich zu DNA-"Prime"/MVA-"Boost"-Schemen. Anders als 107 pfu MVA-BN, das subkutan verabreicht wurde, verstärkte auch die Immunisierung mit 107 pfu MVA-BN, intravenös verabreicht, und die Immunisierung mit 108 pfu, subkutan verabreicht, signifikant die CTL-Antworten, was eindeutig darauf hinweist, dass MVA-BN zum Verstärken von CTL-Antworten in Gegenwart einer bereits bestehenden Immunität für den Vektor verwendet werden kann.
  • 2.2.3: Wirksamkeit eines MVA-BN nef Impfstoffs in SIV-infizierten Rhesusaffen
  • Zur Bestimmung der Wirksamkeit eines MVA-BN nef Impfstoffs durch Bewertung der Virusbelastung und Verzögerung einer Erkrankung nach einer Belastung mit einem virulenten Primärisolat von SIV. Ferner bestimmt die Studie, ob MVA-BN zum sicheren Verstärken der "Boost"-Immunantworten in immungeschwächten Affen mit einer bereits bestehenden Immunität für MVA verwendet werden kann.
  • Impfungsprotokolle
  • Zwei Gruppen (n = 6) von Rhesusaffen (Macaca mulatta) wurden mit einer intramuskulären Bolus-Injektion mit entweder nur MVA-BN oder einem rekombinanten MVA-BN nef in Woche 0, 8 und 16 geimpft. In Woche 22 wurden alle Affen mit 50 MID50 eines pathogenen zellassoziierten SIV-Stammes (1 × C) von primärem, nicht kultivierten Rhesusaffen-PBMC über die intravenöse Route belastet. Der klinische Status der Tiere wurde öfters überwacht und regelmäßige Blutproben wurden zur Messung der Virämie, Immunparameter und einem vollen Umfang der Hämatologie und klinischen chemischen Blutuntersu chungsparameter entnommen. Die Tiere, die eine AIDsähnliche Erkrankung entwickelten, wurden getötet, und die überlebenden Affen wurden 99 Wochen nach der Impfung überwacht. In Woche 100 wurden alle überlebenden Affen mit MVA-BN tat i.m. immunisiert und erhielten weitere Immunisierungen mit demselben MVA-BN tat in Woche 102 und 106.
  • Es wurden keine nachteiligen Wirkungen nach einer der Impfungen mit entweder MVA-BN oder MVA-BN nef beobachtet. Nach der Infektion der Affen mit SIV stiegen die Virämiewerte scharf an und erreichten zwei Wochen nach der Infektion Spitzenwerte (4). Aufgrund der großen Standardabweichungen innerhalb der Gruppen gab es keinen signifikanten Unterschied in den Mittelwerten von SIV zwischen den Gruppen, die mit MVA-BN nef oder MVA-BN geimpft wurden. Es gab jedoch eine im Allgemeinen zehnfach geringere SIV-Belastung in der Gruppe, die mit dem MVA-BN nef geimpft war, im Vergleich zur Kontrollgruppe (MVA-BN). Ferner musste 35 Wochen nach der Infektion (der anfänglichen Beobachtungsperiode) nur 1 von den sechs Affen, die mit MVA-BN nef geimpft worden waren, aufgrund der Schwere der Erkrankung getötet werden, verglichen mit 4 von den 6 Tieren der Kontrollgruppe (5). Die Entwicklung der Erkrankung korrelierte eindeutig mit einer höheren Virusbelastung und als solches wurden die Tiere weitere 29 Wochen nach der Infektion beobachtet. Der MVA-BN nef Impfstoff schien den Fortlauf der Erkrankung im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu verzögern, und sogar in Woche 46 nach der Infektion überlebten 5 der 6 MVA-BN nef Tiere (5). In Woche 59 nach der Infektion wurden jedoch zwei weitere Tiere in der nef-geimpften Gruppe getötet, so dass fünf überlebende Tiere (drei von der MVA-BN nef Gruppe und zwei, die mit MVA-BN geimpft worden waren) überblieben. Eine Überprüfung der Antikörpertiter, die in diesen 12 Affen gegen MVA-BN erzeugt worden waren, zeigte eindeutig, dass MVA-BN die Immunantwort selbst in Gegenwart einer bereits bestehenden Immunität gegen MVA verstärken konnte (6). Nach der primären Immunisierung mit entweder MVA-BN oder MVA-BN nef erzeugten alle Affen eine Antikörperantwort gegen MVA mit einem mittleren Titer von 1000. Die Antikörperantwort wurde nach der sekundären Immunisierung signifikant verstärkt, was eindeutig zeigt, dass MVA für ein "Prime-Boost" der Immunantwort in gesunden Affen verwendet werden kann. Diese Antikörpertiter sanken allmählich, obwohl die Titer bis zur Woche 49 nach der Immunisierung ein Plateau erreichten, so dass die mittleren Titer gegen MVA in Woche 99 2000 betrugen.
  • Die fünf überlebenden Affen waren SIV-infiziert und immungeschächt mit CD4-Zählungen die geringer als 400/μl Blut waren. Zur Untersuchung der Wirkung einer Verwendung von MVA-BN in immungeschwächten Affen wurden die fünf Tiere dreimal mit MVA-BN tat in Woche 100, 102 und 106 nach der anfänglichen Impfung geimpft. Die erste Immunisierung mit MVA-BN tat verstärkte die Antikörperantwort gegen MVA in diesen immungeschwächten Affen signifikant, die mit der dritten Immunisierung sechs Wochen später weiter verstärkt wurde (6). Diese Ergebnisse zeigen ferner, dass MVA-BN Imunantworten in Gegenwart einer signifikanten, bereits bestehenden Immunität gegen MVA verstärken kann, selbst in immungeschwächten Affen. Obwohl die Immunantwort der Affen nach den Immunisierungen mit MVA-BN tat verstärkt wurde, blieben die SIV-Werte stabil, was darauf hinweist, dass Immunisierungen mit MVA-BN sicher sind und SIV-Werte in immungeschwächten Affen nicht beeinflussen (7).
  • Diese Studie zeigte, dass MVA-BN für ein "Prime-Boost" von Immunantworten in immungeschwächten Rhesusaffen verwendet werden kann, und dass MVA-BN Immunisierungen sicher sind und die Virämiewerte in SIV-infizierten Tieren nicht beeinflussen. Die Verzögerung im Fortlauf von AIDS-ähnlichen Erkrankungen in den Tieren, die mit dem MVA-BN nef Impfstoff geimpft sind, zeigt, dass auf nef eine Immunantwort erfolgreich erzeugt wurde.
  • 2.2.4: Therapeutische Impfung von SIV-infizierten Affen, die einer antiretrovialen Behandlung unterzogen werden
  • Ein therapeutischer HIV-Impfstoff auf MVA-BN Basis wird wahrscheinlich bei Individuen verwendet, die einer antiretroviralen Therapie unterzogen werden. Daher untersuchte diese Studie die Sicherheit (Wirkung auf SIV-Werte) und Wirksamkeit rekombinanter MVAs, die für eine Reihe von SIV-Antigenen (gag, pol, env, rev, tat und nef) codieren, in SIV-infizierten Affen, die mit PMPA behandelt werden. PMPA ist ein Nukleosidanalog und ist gegen HIV und SIV wirksam (Rosenwirth, B. et al., 2000, J Virol 74, 1704–11).
  • Konstrukte
  • Alle rekombinanten MVA-Konstrukte wurden auf CEF-Zellen vermehrt, Saccharose-aufgereinigt und in Tris, pH 7,4, formuliert.
  • Impfungsprotokoll
  • Drei Gruppen (n = 6) von Rhesusaffen (Macaca mulatta) wurden mit 50 MID50 eines pathogenen primären SIV-Isolats (1 × C) infiziert und dann täglich mit PMPA (60 mg/kg, s.c. verabreicht) 19 Wochen behandelt. In Woche 10 wurden die Tiere mit rekombinantem MVA-BN (i.m.) oder Kochsalzlösung geimpft und erhielten 6 Wochen später identische Impfungen. Gruppe 1 erhielt eine Mischung aus MVA gag-pol und MVA env, Gruppe 2 erhielt MVA tat, MVA rev und MVA nef, während Gruppe 3 Kochsalzlösung erhielt. Der klinische Status der Tiere wurde öfters überwacht und regelmäßige Blutproben wurden zur Messung der Virämie, Immunparameter und einem vollen Umfang der Hämatologie und klinischen chemischen Blutuntersuchungsparameter entnommen.
  • Alle Tiere entwickelten hohe SIV-Belastungen, die 2 Wochen nach der Infektion Spitzenwerte erreichten (8). Nach einer täglichen Behandlung mit PMPA sanken die SIV-Werte und stabilisierten sich bis Woche 9 auf niederen Werten. Wie in der vorangehenden Studie hatten die Impfungen mit MVA in Woche 10 und 16 keine Wirkung auf die SIV-Werte, was darauf hinweist, dass MVA-BN ein sicherer Imfpstoffvektor für immungeschwächte Tiere ist. Sobald die PMPA-Behandlung bei den Tieren abgesetzt wurde (Woche 21) stiegen die SIV-Werte. Obwohl drei Tiere in Gruppe 1 verringerte SIV-Werte im Vergleich zur Gruppe 3 aufwiesen, gab es keinen signifikanten Unterschied in der mittleren SIV-Belastung zwischen den Gruppen nach dem Ende der PMPA-Behandlung (8). Unter Verwendung eines ELISA für SIV-infizierte T-Zelllysate erzeugten Tiere in allen Gruppen eine Antikörperantwort auf SIV bis Woche 4 nach der Infektion (9). Der SIV-Antikörpertiter in der Kontrollgruppe (Kochsalzlösung) fiel während der PMPA-Behandlung und stieg rasch ab, als die PMPA-Behandlung beendet wurde, was den Abfall und die anschließende Erhöhung in den SIV-Werten während der antiretroviralen Therapie reflektiert (9). Ein ähnliches Muster im SIV-Antikörpertiter wurde in Gruppe 2 beobachtet, die MVA tat, MVA rev und MVA nef erhielt, was möglicherweise die zu geringe Expression dieser regulatorischen Proteine in den SIV-infizierten T-Zelllysaten reflektiert, die im ELISA verwendet wurden. Im Gegensatz dazu stiegen jedoch die Anti-SIV-Antikörpertiter in Gruppe 1 nach den Impfungen mit MVA gag-pol und MVA env in Woche 10, was darauf hinweist, dass rekombinantes MVA-BN die Immunantwort auf SIV in (SIV-) infizierten Tieren verstärken kann, die einer antiretroviralen Therapie unterzogen werden. Es ist von Bedeutung, dass die Anti-SIV-Antikörpertiter nach der sekundären Immunisierung in Woche 16 verstärkt wurden, was wieder zeigt, dass MVA die Immunantworten in immungeschwächten Tieren selbst in Gegenwart einer bereits bestehenden Immunität gegen MVA verstärken kann (8). Die Anti-MVA-Antikörpertiter in Gruppe 1 reflektierten auch dieses Muster mit der Erzeugung einer Antikörperantwort nach der primären Immunisierung, und diese wurde nach der sekundären Impfung signifikant verstärkt (10).
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  • Tabelle 1:
    Figure 00460001
    • Virusamplifikation über dem Inputwert nach 4 Tagen Infektion
    • Amplifikationsverhältnis = Output TCID50 – Input TCID50.
    • Werte sind in TCID50.
  • Figure 00470001
  • ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT RULE 13bis)
    Figure 00470002
    • Formular PCT/RO/134 (Juli 1992)
  • Figure 00470003
  • Figure 00480001
  • ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT RULE 13bis)
    Figure 00480002
    • Formular PCT/RO/134 (Juli 1992)
  • Figure 00490001
  • ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT RULE 13bis)
    Figure 00490002
    • Formular PCT/RO/134 (Juli 1992)

Claims (38)

  1. Modifiziertes Vacciniavirus Ankara-Stamm MVA-BN, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK), unter der Hinterlegungsnummer V00083008, und Derivate davon, wobei die Derivate dadurch gekennzeichnet sind, daß sie (i) zur reproduktiven Replikation in CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) und der Zellinie BHK (Baby Hamster Kidney), jedoch nicht zur reproduktiven Replikation in menschlichen Zellinien fähig sind und (ii) nicht in vivo in stark immungeschwächten Mäusen replizieren können.
  2. MVA-BN oder ein Derivat davon nach Anspruch 1, wobei es sich bei den menschlichen Zellinien um die menschliche Knochen-Osteosarkomzellinie 143B, die menschliche Keratinozytenzellinie HaCat und die menschliche Zervix-Adenokarzinomzellinie HeLa handelt.
  3. MVA-BN oder ein Derivat davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei die stark immungeschwächten Mäuse keine reifen B- und T-Zellen produzieren können.
  4. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei den stark immungeschwächten Mäusen um transgene AGR129-Mäuse handelt.
  5. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei MVA-BN oder das Derivat davon als Klon aufgereinigt wird.
  6. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend mindestens eine heterologe Nukleinsäuresequenz.
  7. MVA-BN oder ein Derivat davon nach Anspruch 6, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus einer für mindestens ein Antigen, antigenes Epitop und/oder Therapeutikum codierenden Sequenz.
  8. MVA-BN oder ein Derivat davon nach Anspruch 6, wobei die antigenen Epitope aus Viren, ausgewählt aus der Familie Influenzavirus, Flavivirus, Paramyxovirus, Hepatitisvirus, menschliches Immunschwächevirus oder aus hämorrhagisches Fieber verursachenden Viren, stammen.
  9. MVA-BN nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei es sich bei der heterologen Nukleinsäuresequenz um das nef-Gen handelt.
  10. Genom von MVA-BN oder eines Derivats davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder das Genom nach Anspruch 10 sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünner und/oder Zusatz.
  12. Impfstoff, umfassend MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder das Genom nach Anspruch 10.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder Impfstoff nach Anspruch 12, umfassend mindestens 102 TCID50 von MVA-BN oder eines Derivats davon.
  14. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder Genom nach Anspruch 10, Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 13 oder Impfstoff nach Anspruch 12 oder 13 zur Beeinflussung, vorzugsweise Induzierung, einer immunologischen Antwort in einem lebenden Tier, einschließlich dem Menschen.
  15. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder Genom nach Anspruch 10, Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 13 oder Impfstoff nach Anspruch 12 oder 13 zur Impfung eines lebenden Tiers, einschließlich des Menschen, gegen eine Erkrankung mit menschlichem Pockenvirus.
  16. MVA-BN oder ein Derivat davon, Genom, Zusammensetzung oder Impfstoff nach Anspruch 15, wobei es sich bei der Erkrankung mit menschlichem Pockenvirus um Pocken handelt.
  17. MVA-BN oder ein Derivat davon, Genom, Zusammensetzung oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Tier, einschließlich der Mensch, immungeschwächt ist.
  18. MVA-BN oder ein Derivat davon, Genom, Zusammensetzung oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das Tier, einschließlich der Mensch, eine bereits bestehende Immunität gegen Pockenviren aufweist.
  19. MVA-BN oder ein Derivat davon, Genom, Zusammensetzung oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das Tier, einschließlich der Mensch, einer antiviralen Therapie unterzogen wird.
  20. MVA-BN oder ein Derivat davon, Genom, Zusammensetzung oder Impfstoff nach Anspruch 19, wobei es sich bei der antiviralen Therapie um eine antiretrovirale Therapie handelt.
  21. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 6 bis 9 oder Genom nach Anspruch 10 zur Einführung einer homologen und/oder heterologen Nukleinsäuresequenz in Zielzellen.
  22. Verwendung von MVA-BN oder eines Derivats davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder des Genoms nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels oder Impfstoffs.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Arzneimittel oder der Impfstoff zur Induzierung einer immunologischen Antwort in einem lebenden Tier, einschließlich dem Menschen, zu verabreichen ist.
  24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, wobei sich das Arzneimittel oder der Impfstoff gegen Erkrankungen mit menschlichem Pockenvirus richtet.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich bei der Erkrankung mit menschlichem Pockenvirus um Pocken handelt.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei das Arzneimittel oder der Impfstoff mindestens 102 TCID50 von MVA-BN oder eines Derivats davon umfaßt.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei MVA-BN oder ein Derivat davon in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Inokulation ("Prime-Inokulation") und in einer zweiten Inokulation ("Boost-Inokulation") zu verabreichen ist.
  28. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei das Tier immungeschwächt ist.
  29. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 28, wobei das Tier eine bereits bestehende Immunität gegen Pockenviren aufweist.
  30. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei das Tier einer antiviralen Therapie unterzogen wird.
  31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei es sich bei der antiviralen Therapie um eine antiretrovirale Therapie handelt.
  32. MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Adjuvans.
  33. Verwendung von MVA-BN oder eines Derivats davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Adjuvans.
  34. Verfahren zur Einführung einer homologen und/oder heterologen Nukleinsäuresequenz in Zielzellen in vitro, bei dem man die Zielzellen mit MVA-BN oder einem Derivat davon nach Anspruch 6 bis 9 infiziert oder die Zielzelle mit dem Genom nach Anspruch 10 transfiziert.
  35. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, wobei man a) eine Wirtszelle mit MVA-BN oder einem Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 infiziert, b) die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und c) das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein isoliert und/oder anreichert.
  36. Verfahren zur Herstellung von MVA-BN oder eines Derivats davon, wobei man a) eine Wirtszelle mit MVA-BN oder einem Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 infiziert, b) die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und c) von der Wirtszelle produziertes MVA-BN oder ein Derivat davon isoliert und/oder anreichert.
  37. Zelle, vorzugsweise menschliche Zelle, enthaltend MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das Genom nach Anspruch 10.
  38. Kit zur Prime/Boost-Immunisierung, umfassend MVA-BN oder ein Derivat davon nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eine Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 13, einen Impfstoff nach Anspruch 12 oder 13 für eine erste Inokulation ("Prime-Inokulation") in einem ersten Fläschchen/Behälter und für eine zweite Inokulation ("Boost-Inokulation") in einem zweiten Fläschchen/Behälter.
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