DE60115958T2

DE60115958T2 - Zwillingsarginin translokation in bacillus

Info

Publication number: DE60115958T2
Application number: DE60115958T
Authority: DE
Inventors: Douwe Jan JONGBLOED; Paul Jörg MÜLLER; Maarten Jan VAN DIJL; Sierd Bron
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2000-09-18
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-09-18
Also published as: US20020110860A1; US7316924B2; WO2002022667A2; AU2001292749A1; US7884191B2; US20080248525A1; DK1356060T3; EP1356060B1; US7884192B2; EP1356060A2; ATE312932T1; DE60115958D1; WO2002022667A3; US20080166757A1; US7897742B2; US20090093025A1; WO2002022667A9

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Expression von Proteinen in einer Wirtszelle. Die vorliegende Erfindung stellt Expressionsvektoren, Verfahren und Systeme für die Produktion von Proteinen in einer Wirtszelle bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eubakterien exportieren zahlreiche Proteine durch die Plasmamembran hindurch entweder in den periplasmatischen Raum (Gram-negative Arten) oder in das Wachstumsmedium (Gram-positive Arten). Das Gram-positive Eubakterium Bacillus subtilis und insbesondere seine nahen Verwandten Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus lichenifomis sind für ihre hohe Kapazität, Proteine (in Gramm pro Liter-Konzentrationen) in das Medium zu sekretieren, wohlbekannt. Diese Eigenschaft, welche die effiziente Abtrennung von (sekretierten) Proteinen vom zytoplasmatischen Massen-Protein-Komplement ermöglicht, hat zur kommerziellen Verwertung der Letztgenannten Bacilli als wichtige "Zellfabriken" geführt. Trotz ihrer hohen Kapazität, Proteine Gram-positiven Ursprungs zu sekretieren, ist die Sekretion von rekombinanten Proteinen Gram-negativen eubakteriellen oder eukaryotischen Ursprungs durch Bacillus Arten häufig ineffizient. Dies kann auf einer Vielfalt von (potentiellen) Engpässen im Sekretionsweg beruhen, wie einem schlechten Targeting an die Membran, einer Vortranslokations-Faltung, einer ineffizienten Translokation, einer langsamen oder unkorrekten Nachtranslokation-Faltung des sekretorischen Proteins und einer Proteolyse. Bemerkenswerterweise betreffen viele dieser Probleme die spezifischen Eigenschaften des allgemeinen sekretorischen (Sec) Wegs, der bisher in allen dokumentierten Versuchen verwendet wurde, um Bacilli für die Sekretion von heterologen Proteinen von kommerziellem oder biomedizinischem Wert zu verwenden.
Allgemeine Strategien für die Sekretion von heterologen Proteinen durch Bacilli beruhen auf der Fusion mit einem Amino-terminalen Signalpeptid im Raster des betreffenden Proteins, welches dieses Protein in den Sec-abhängigen Sekretionsweg lenkt. Nach Translokation durch die Membran hindurch wird das Signalpeptid von einer Signalpeptidase entfernt, was eine Voraussetzung für die Freisetzung des translozierten Proteins aus der Membran und seine Sekretion in das Medium ist. Wie am Beispiel von Human-Interleukin-3 gezeigt, das von B. licheniformis in Gramm pro Liter-Konzentrationen sekretiert wird, ermöglicht diese Strategie eine Proteinproduktion auf kommerziell signifikanten Niveaus.
Zwei Haupthürden sind für die Sekretion von heterologen Proteinen über den Sec-abhängigen Weg identifiziert worden. Die erste ist der Translokationsprozess durch die Sec-Maschinerie, die aus einem proteinhaltigen Kanal in der Membran (der aus SecY, SecE, SecG und SecDF-YrbF besteht) und einem Translokationsmotor (SecA) zusammengesetzt ist. Es ist bekannt, dass die Sec-Maschinerie ihre Substrate in ungefaltetem Zustand durch die Membran "fädelt". Dementsprechend ist diese Maschinerie inhärent nicht in der Lage, Proteine zu translozieren, die sich im Zytosol falten. Ein zweiter Engpass ist für andere heterologe Proteine identifiziert worden, die korrekt transloziert werden, sich aber in der Zellwandumgebung langsam oder unkorrekt falten, wahrscheinlich, weil diesem Kompartiment die geeigneten Chaperone-Moleküle fehlen, um deren Faltung zu unterstützen. Molekulare Chaperone der Hsp60- und Hsp70-Klasse sind für die Faltung vieler Proteinen wesentlich, aber diese sind alle in bakteriellen extrazytoplasmatischen Kompartimenten abwesend. Da die Membran-Zellwandumgebung von Bacilli hoch proteolytisch ist, werden sich langsam oder unkorrekt faltende translozierte Proteine häufig abgebaut, bevor sie in das Medium sekretiert werden. Dementsprechend ist die Proteinsekretion über den Sec-Weg nur für die Produktion einer Unterklasse von heterologen Proteinen ein hoch effizientes Werkzeug.
Die Proteinproduktion und -sekretion aus Bacillus-Arten ist ein Haupt-Produktionswerkzeug mit einem Markt von mehr als $ 1 Milliarde pro Jahr. Jedoch sind, wie oben angemerkt, die Standard-Exporttechnologien auf der Grundlage des gut charakterisierten allgemeinen sekretorischen (Sec-) Wegs häufig für die Produktion von Proteinen nicht verwendbar. So wäre es vorteilhaft, über einen alternativen Mechanismus für die Produktion und Sekretion von Proteinen zu verfügen.
Die WO 99/51753 offenbart die Expression und Sekretion von chimären Polypeptiden mit einem E. coli Zwillingsarginin-Signalpeptid in Zellen mit geeigneten Membran-Targeting- und -Translokations- (MTT-) Genen.
Tjalsma et al. (Microbiology and Molecular Biology Reviews, Sept. 2000, S. 515–547) besprechen Hinweise, dass B. subtilis einen Zwillingsarginin-Sekretionsweg besitzen könnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Hierin werden Verfahren zur Produktion eines heterologen Polypeptids in einer bakteriellen Wirtszelle bereitgestellt, wie in den beigefügten Ansprüchen beschrieben.
In einem Aspekt der Erfindung ist die Wirtszelle ein Gram-positives Bakterium. Der Gram-positive Mikroorganismus ist bevorzugt ein Mitglied der Gattung Bacillus. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Wirtszelle Bacillus subtilis.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Wirtszelle ein Gram-negativer Mikroorganismus. Der Gram-negative Mikroorganismus ist bevorzugt ein Mitglied der Gattung Pantoaea, bevorzugt Pantoaea citrea. In einer alternativen Ausführungsform ist der Gram-negative Mikroorganismus bevorzugt Escherichia coli.
So ist die Wirtszelle genetisch verändert, um ein gewünschtes Protein, wie ein Enzym, einen Wachstumsfaktor oder ein Hormon, zu produzieren. Das Enzym kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Carbohydrasen, einschließlich Amylasen, Cellulasen, Xylanasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen; Acylasen, Amidasen, Esterasen, Oxidasen.
Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich. Es versteht sich jedoch, dass die detaillierte Beschreibung und die speziellen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, lediglich zur Erläuterung angegeben sind, da dem Fachmann aus dieser detaillierten Beschreibung verschiedene Änderungen und Abwandlungen innerhalb des Bereichs der Ansprüche ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Tat-Komponenten von B. subtilis und E. coli. Die Aminosäuresequenzen von Tat-Komponenten von B. subtilis und E. coli, wie aus der SubtiList- (http://bioweb.pasteur.fr/Genolist/SubtiList.html) und Colibri (http://bioweb.pasteur.fr/Genolist/Colibri.html)-Datenbank abgeleitet, wurden für Vergleiche verwendet. Identische Aminosäuren [*] oder konservative Ersetzungen [.] sind markiert. Mutmaßliche Transmembran-Segmente, durch graue Schattierung angezeigt, wurden mit dem TopPred2-Algorithmus (34,35) vorhergesagt. (A) Vergleich von TatAc (YnzA), TatAd (YczB) und TatAy (YdiI) von B. subtilis (Bsu) mit TatA, TatB und TatE von E. coli (Eco). (B) Vergleich von TatCd (YcbT) und TatCy (YdiJ) von B. subtilis mit TatC von E. coli.
2. Die tatAC-Regionen von B. subtilis und E. coli. (A) Chromosomale Organisation der B. subtilis-tatAd-tatCd- und -TatAy-TatCy-Region (angepasst aus der SubtiList-Datenbank). Man bemerke, dass das tatAd- und tatCd-Gen stromabwärts vom PhoD-Gen angeordnet sind. (B) Chromosomale Organisation der E. coli-tatABCD-Region (angepasst aus der Colibri-Datenbank).
3. Konstruktion von tatC-Mutantenstämmen von B. subtilis. (A) Schematische Darstellung der Konstruktion von B. subtilis-ΔtatCd und B. subtilis-ΔtatCy. Das chromosomale tatCd-Gen wurde mit einem Kanamycin-Resistenzmarker (Km^r) durch homologe Rekombination unterbrochen. Zu diesem Zweck wurde B. subtilis 168 mit dem Plasmid pJCd2 transformiert, das in B. subtilis nicht replizieren kann und eine mutierte Kopie des tatCd-Gens enthält, bei dem ein inneres BclI-AccI-Fragment durch einen Km^r-Marker ersetzt ist. Das chromosomale tatCy-Gen wurde mit einem Spectinomycin-Resistenzmarker (Sp^r) durch homologe Rekombination unterbrochen. Zu diesem Zweck wurde B. subtilis 168 mit dem Plasmid pJCy2 transformiert, das in B. subtilis nicht replizieren kann und eine mutierte Kopie des tatCy-Gens mit einem Sp^r-Marker an der PstI-Stelle enthält. Nur Restriktionsstellen, die für die Konstruktion relevant sind, sind gezeigt. tatCd', 5'-Ende des tatCd-Gens; 'tatCd, 3'-Ende des tatCd-Gens; tatCy', 5'-Ende des tatCy-Gens; 'tatCy, 3'-Ende des tatCy-Gens. (B) Schematische Darstellung der tatCd-Region von B. subtilis ItatCd. Durch eine Integration vom Campbell-Typ des pMutin2-Derivats pMICd1 in das B. subtilis 168-Chromosom wurde das tatCd-Gen unter die Kontrolle des IPTG-abhängigen Pspac-Promotors gestellt, der durch das Produkt des lacI-Gens suprimiert werden kann. Gleichzeitig wurde das spoVG-laZ-Reportergen von pMutin2 unter die Transkriptionskontrolle der tatCad-Promotorregion gestellt. PCR-amplifizierte Regionen sind mit schwarzen Balken angezeigt. Ori pBr322, Replikationsfunktionen von pBR322; Ap^r, Ampicillin-Resistenzmarker; Em^r, Erythromycin-Resistenzmarker; tatCd', 3'-verkürztes tatCd-Gen; T1T2, Transkriptionsterminatoren auf pMutin2. (C) Schematische Darstellung der tatCy-Region von B. subtilis ItatCy. Durch eine Integration vom Campbell-Typ des pMutin2-Derivats pMICy1 in das B. subtilis 168-Chromosom wurde das tatCy-Gen unter die Kontrolle des IPTG-abhängigen Pspac-Promotors gestellt. Gleichzeitig wurde das spVG-lacZ-Reportergen von pMutin2 unter die Transkriptionskontrolle der tatCy-Promotorregion gestellt. tatCy', 3'-verkürztes tatCy-Gen.
4. TatCd ist für die Sekretion von PhoD erforderlich. B. subtilis 168 (Elternstamm), B. subtilis ΔtatCd, B. subtilis ΔtatCy oder B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy wurde unter Bedingungen von Phosphat-Mangel unter Verwendung von LPDM- Medium gezüchtet. Um die Sekretion von PhoD (A) oder PhoB (B) zu untersuchen, wurden B. subtilis-Zellen durch Zentrifugation vom Wachstumsmedium abgetrennt. Sekretiertes PhoD und PhoB im Wachstumsmedium wurden mittels SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von PhoD- oder PhoB-spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht. (C) Zellen von B. subtilis 168 und B. subtilis ItatCd-ΔtatCy wurden unter Bedingungen von Phosphat-Mangel in LPDM-Medium gezüchtet. Als nächstes wurden Zellen und Wachstumsmedium durch Zentrifugation getrennt, und PhoD wurde mittels SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von PhoD-spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht.
5. Zweidimensionale Gelelektrophorese-Analyse der TatC-abhängigen Sekretion von PhoD. B. subtilis 168 oder B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy wurde unter Bedingungen von Phosphat-Mangel in LPDM-Medium gezüchtet. Sekretierte Proteine wurden durch zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert, wie im Abschnitt Experimentelle Verfahren angegeben. Die Namen der durch Massenspektrometrie identifizierten Proteine sind angegeben.
6. TatC-abhängige Sekretion der B. subtilis-Lipase LipA. B. subtilis 168 (Elternstamm), B. subtilis ΔtatCd, B. subtilis ΔtatCy oder B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy wurden in TY-Medium bis zum Ende der exponentiellen Vermehrungsphase gezüchtet. Um die Sekretion von LipA zu untersuchen, wurden B. subtilis-Zellen durch Zentrifugation vom Wachstumsmedium abgetrennt. Proteine im Wachstumsmedium wurden 20-fach nach Fällung mit Trichloressigsäure konzentriert, und Proben für eine Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden präpariert. Sekretiertes LipA im Wachstumsmedium wurde mittels SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von LipA-spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht.
7. Vorhergesagte Zwillingsarginin(RR-)Signalpeptide von B. subtilis. Die aufgeführten Signalpeptide enthalten zusätzlich zu den Zwillingsargininen mindestens einen weiteren Rest der Consensus-Sequenz (R-R-X-ϕ ~ ϕ; fett gedruckt). Die Zahl der Reste in der N- und H-Domäne jedes Signalpeptids und die durchschnittliche Hydrophobie (h) jeder dieser Domänen, wie durch den Algorithmus von Kyte und Doolittle bestimmt (Kyte, J. und R. F. Doolittle [1982] A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157: 105–32), sind angegeben. Weiter sind die RR-Motive in der N-Domäne und die SPase I-Erkennungsstellen in der C-Domäne (d.h. Positionen –3 bis –1 relativ zu der vorhergesagten SPase-Spaltungsstelle) gezeigt. Proteine, denen eine (mutmaßliche) SPase I-Spaltungsstelle fehlt, von denen einige zusätzliche Transmembran-Domänen enthalten, sind mit ^"TM" angezeigt. Ein Protein, das Zellwandbindungs-Sequenzwiederholungen enthält, ist mit ^"W" angezeigt.
8. Processing von PrePhoD in E. coli TG1. (A) E. coli TG1I, welche das Plasmid pARphoD trägt, das Wildtyp-PhoD codiert, wurde in M9 minimalem Medium bis zur frühen logarithmischen Phase gezüchtet. 1 Stunde vor der Markierung wurde die Expression von phoD mit IPTG (1 mM) induziert. Die Zellen wurden 1 min lang mit [35S]-Methionin markiert, wonach nicht-radioaktives Methionin zugesetzt wurde. Proben wurden zu den Chase-Zeiten 10, 20, 40 und 60 min entnommen und mit monospezifischen Antikörpern gegen PhoD einer Immunpräzipitation unterzogen, gefolgt von SDS-PAGE unter Verwendung eines 10%-igen Polyacrylamidgels und Fluorographie. M, Molekulargewichtmarker; Glu, nicht-induzierte Kontrolle. (B) In-vivo-Protease-Kartierung von PhoD in E. coli TG1 (pAR3phoD). Die Zellen wurden in Sphäroplasten überführt und mit Proteinase K, Proteinase K und Trition X-100 behandelt oder blieben unbehandelt, wie angegeben. Die Lokalisation von prePhoD ist angezeigt. Die Zugänglichkeit von Proteinase K zum Zytosol wurde durch Überwachen von SecB in einem 15%-igen Polyacrylamidgel analysiert. PhoD und SecB wurden durch monospezifische Antikörper nachgewiesen.
9. Induktion und Processing von SP_Bla-PhoD in E. coli TG1. (A) E. coli TG1 (pMUTIN2bla-phoD) wurde in TY-Medium bis zur logarithmischen Vermehrungsphase gezüchtet. Die Expression von bla-phoD wurde mit IPTG (1 mM, Bahnen 2–4) induziert, oder sie blieb nicht-induziert (Bahn 1). Zum Zeitpunkt der Induktion wurden die Kulturen mit Natriumazid (3 mM, Bahn 3), mit Nigericin (1 μM, Bahn 4) behandelt oder blieben unbehandelt (Bahn 2). Proben wurden 20 min nach Induktion von SP_Bla-PhoD entnommen, lysiert, und die Zellextrakte wurden mittels SDS-PAGE unter Verwendung von 10%-igem Polyacrylamid analysiert. B und C, TG1 (pMUTIN2bla-phoD) wurde in M9 minimalem Medium bis zur frühen logarithmischen Phase gezüchtet. 1 Stunde vor Markierung wurde die Expression von phoD mit IPTG (1 mM) induziert. Während eine Kultur unbehandelt blieb (B), wurde die andere bei der Induktion mit Natriumazid (3 mM) behandelt (C). Die Zellen wurden 1 min lang mit [35S]-Methionin markiert, wonach nicht-radioaktives Methionin zugesetzt wurde. Die Proben wurden zu Zeiten nach Chase entnommen, wie in den Figuren angezeigt, und mit Antikörpern gegen PhoD einer Immunpräzipitation unterzogen, gefolgt von SDS-PAGE unter Verwendung eines 12,5%-igen Polyacrylamidgels und Fluorographie. Die Lokalisation von SP_Bla-PhoD und reifem PhoD ist angezeigt. [14C]-markierter Molekulargewichtsmarker.
10. Lokalisation von SP_PhoD-LacZ in E. coli TG1 in Abwesenheit oder Anwesenheit von B. subtilis tatAd/Cd. E. coli TG1-Stämme, die entweder das Plasmid pAR3phoD-lacZ (A) oder die Plasmide pAR3phoD-lacZ, pREP4 und pQE9tatAd/Cd (B) trugen, wurden in TY-Medium bis zur exponentiellen Vermehrung gezüchtet, und die Expression von phoD-lacZ und tatAd/Cd wurde 1 Stunde lang mit Arabinose (0,2%-ig) bzw. IPTG (1 mM) induziert. Die subzelluläre Lokalisation von SP_PhoD-LacZ wurde durch In-vivo-Protease-Kartierung gemäß 8B detektiert. SP_PhoD-LacZ und SecB wurden mittels Antiseren gegen LacZ und SecB überwacht. Banden, die SP_PhoD-LacZ, LacZ und SecB darstellen, sind angezeigt.
11. Processing von SP_PhoD-LacZ in E. coli TG1, die B. subtilis tatAd/Cd coexprimiert. E. coli-Stämme, TG1(pAR3phoD-lacZ) (A) und TG1(pAR3phoD-lacZ, pREP4, pQE8tatAd/Cd) (B), wurden in M9 minimalem Medium bis zur frühen logarithmischen Phase gezüchtet und 1 Minute lang mit [35S]-Methionin markiert und anschließend mit nicht-radioaktivem Methionin der Chase-Phase unterzogen. Proben wurden zu den angezeigten Chase-Zeiten entnommen und weiter durch Immunpräzipitation mit Antiserum gegen LacZ verarbeitet, gefolgt von SDS-PAGE unter Verwendung eines 7,5%-igen Polyacrylamidgels und Fluorographie.
Banden, die SP_PhoD-LacZ und LacZ darstellen, sind angezeigt. M, [14C]-markierter Molekulargewichtsmarker.
12. TatAd/Cd-vermittelter Transport von SP_PhoD-LacZ in E. coli ist ΔpH-abhängig. E. coli TG1 (pAR3phoD-lacZ, pREP4, pQE9tatAd/Cd) wurde im TY-Medium bis zur exponentiellen Vermehrung gezüchtet, Nigericin (1 μM) (A) oder Natriumazid (3 mM) (B) wurde vor der Induktion der Genepxression zu den Kulturen gegeben. Die Lokalisation von LacZ wurde durch In-vivo-Protease-Kartierung analysiert, wie in 10 beschrieben. Proben wurden einem immunologischen Nachweis von LacZ mit spezifischen Antikörpern unterzogen. Banden, die SP_PhoD-LacZ, LacZ und SecB darstellen, sind angezeigt.
13. Lokalisation von SP_PhoD-LacZ in einem E. coli-Stamm, der arm an tatABCDE war. Der E. coli-Stamm TG1 Δtat, 48CDE (pAR3phoD-lacZ, pREP4 und pQE9tatAd/Cd) wurde in TY-Medium gezüchtet, die Synthese von SP_PhoD-LacZ und TatAd/Cd wurde induziert, und sie wurden einer In-vivo-Protease-Kartierung unterzogen, wie in 10 beschrieben. LacZ und SecB wurden mittels SDS-PAGE und Western-Blotting sichtbar gemacht.
14. Homologe aus B. alcalophilus. B. subtilis-Sequenzen wurden für eine BLAST-Suche des B. alcalophilus-Genoms in einer Hausdatenbank verwendet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun in Einzelheiten lediglich mittels Hinweis unter Verwendung der folgenden Definitionen und Beispiele beschrieben.
Falls nicht anders hierin definiert, weisen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung auf, wie sie üblicherweise vom gewöhnlichen Fachmann verstanden wird, an den sich diese Erfindung richtet. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2. Aufl., John Wiley and Sons, New York (1994) und Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) stellen für den Fachmann ein allgemeines Lexikon für viele der in dieser Erfindung verwendeten Ausdrücke bereit. Obwohl irgendwelche Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Numerische Bereiche schließen die Zahlen ein, welche den Bereich definieren. Falls nicht anders angegeben, sind Nukleinsäuren von links nach rechts in 5' nach 3'-Richtung geschrieben; Aminosäuresequenzen sind von links nach rechts jeweils in Amino- bzw. Carboxy-Orientierung geschrieben. Praktiker werden insbesondere auf Sambrook et al., 1989, und Ausubel FM et al., 1993, bezüglich Definitionen und Ausdrücken auf dem Gebiet hingewiesen. Es versteht sich, dass diese Erfindung nicht auf die speziellen beschriebenen Methoden, Protokolle und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können.
Die hierin bereitgestellten Überschriften sind keine Beschränkungen der verschiedenen Aspekte oder Ausführungsformen der Erfindung, die unter Bezugnahme auf die Beschreibung als Ganze erhalten werden können. Demgemäß sind die unmittelbar nachstehend definierten Ausdrücke vollständiger durch Bezugnahme auf die Beschreibung als Ganze definiert.
Wie hierin verwendet, schließt die Gattung Bacillus alle dem Fachmann bekannten Mitglieder ein, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alcalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis.
Der Ausdruck "Polypeptid", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Verbindung, die aus einer einzigen Kette von Aminosäurenresten besteht, die durch Peptidbindungen verknüpft sind. Der Ausdruck "Protein", wie hierin verwendet, kann synonym mit dem Ausdruck "Polypeptid" sein oder kann zusätzlich einen Komplex von zwei oder mehr Polypeptiden bezeichnen.
Die Ausdrücke "chimäres Polypeptid" und "Fusionspolypeptid" werden hierin austauschbar verwendet und bezeichnen ein Signalpeptid aus phoD, das mit dem interessierenden Protein oder heterologen Protein verknüpft ist.
Ein "Signalpeptid", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Amino-terminale Verlängerung an einem zu sekretierenden Protein. Nahezu alle sekretierten Proteine verwenden eine Amino-terminale Protein-Verlängerung, die eine kritische Rolle beim Targeting auf das und bei der Translokation des Vorläufer-Proteins) durch die Membran hindurch spielt und die durch eine Signalpeptidase während oder unmittelbar nach dem Membrantransport proteolytisch entfernt wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet ein "interessierendes Protein" oder "interessierendes Polypeptid" das durch die Wirtszelle zu exprimierende und sekretierende Protein. Bei dem interessierenden Protein kann es sich um irgendein Protein handeln, das bis jetzt für eine Expression in Prokaryoten in Betracht gezogen worden ist. Das interessierende Protein ist heterolog zum Wirt.
Die Ausdrücke "isoliert" oder "gereinigt", wie hierin verwendet, bezeichnen eine Nukleinsäure oder eine Aminosäure, die von mindestens einer Komponente entfernt ist, mit der sie natürlich assoziiert ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "heterologes Protein" ein Protein oder Polypeptid, das nicht natürlich in einer Wirtszelle vorkommt. Beispiele für heterologe Proteine umfassen Enzyme, wie Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen, Amylasen, andere Carbohydrasen und Lipasen; Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen; Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Das heterologe Gen kann therapeutisch bedeutende Proteine oder Peptide, wie Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren sowie Impfstoffe und Antikörper, codieren. Das Gen kann kommerziell wichtige industrielle Proteine oder Peptide, wie Proteasen, Carbohydrasen, wie Amylasen und Glucoamylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen, codieren. Das interessierende Gen kann ein natürlich vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Der Ausdruck "homologes Protein" bezeichnet ein Protein oder Polypeptid, das in einer Wirtszelle nativ oder natürlich vorkommend ist.
Der Ausdruck "Nukleinsäure-Molekül" umfasst RNA-, DNA- und cDNA-Moleküle. Es versteht sich, dass als Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes eine Vielheit von Nukleotid-Sequenzen, die ein gegebenes Protein, wie TatC und/oder TatA, codieren, erzeugt werden kann. Die vorliegende Erfindung zieht jede mögliche Varianten-Nukleotidsequenz, die TatC und/oder TatA codiert, in Betracht, die alle im Hinblick auf die Degeneration des genetischen Codes möglich sind.
Ein "heterologes" Nukleinsäure-Konstrukt oder eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz weist einen Abschnitt der Sequenz auf, der für die Zelle nicht nativ ist, in der es bzw. sie exprimiert wird. Heterolog mit Bezug auf eine Kontrollsequenz bezeichnet eine Kontrollsequenz (d.h. Promotor oder Enhancer), die in der Natur nicht fungiert, um das gleiche Gen zu regulieren, dessen Expression aktuell reguliert wird. Im Allgemeinen sind heterologe Nukleinsäuresequenzen für die Zelle oder das Genom, in dem sie vorliegen, nicht endogen und sind durch Infektion, Transfektion, Mikroinfektion, Elektroporation oder dergleichen zu der Zelle hinzugefügt worden. Ein "heterologes" Nukleinsäure-Konstrukt kann eine Kombination einer Kontrollsequenz/codierenden DNA-Sequenz enthalten, welche die gleiche ist wie oder eine andere als eine Kombination einer Kontrollsequenz/codierenden DNA-Sequenz, die in der nativen Zelle gefunden wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Vektor" ein Nukleinsäure-Konstrukt, das für eine Übertragung zwischen verschiedenen Wirtszellen entworfen ist. Ein "Expressionsvektor" bezeichnet einen Vektor, der die Fähigkeit hat, heterologe DNA-Fragmente zu enthalten und in einer fremden Zelle zu exprimieren. Viele prokaryotische und eukaryotische Expressionvektoren sind im Handel erhältlich. Die Wahl von geeigneten Expressionvektoren liegt im Vermögen des Fachmanns.
Demgemäß ist eine "Expressionskassette" oder ein "Expressionsvektor" ein rekombinant oder synthetisch erzeugtes Nukleinsäure-Konstrukt mit einer Reihe von spezifizierten Nukleinsäure-Elementen, welche die Transkription einer speziellen Nukleinsäure in einer Zielzelle ermöglichen. Die rekombinante Expressionskassette kann einem Plasmid, Chromosom, Mitochondrien-DNA, Plastiden-DNA, einem Virus oder einem Nukleinsäure-Fragment einverleibt werden. Typisch umfasst der rekombinante Expressionskassetten-Abschnitt eines Expressionsvektors unter anderen Sequenzen eine Nukieinsäuresequenz, die zu transkribieren ist, und einen Promotor.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Plasmid" ein ringförmiges doppelsträngiges (ds) DNA-Konstrukt, das als Klonierungsvektor verwendet wird und das ein extrachromosomales selbst-replizierendes genetisches Element in vielen Bakterien und einigen Eukaryoten bildet.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "einen selektierbaren Marker codierende Nukleotidsequenz" eine Nukleotidsequenz, die zur Expression in Säugerzellen in der Lage ist und wobei die Expression des selektierbaren Markers Zellen, die das exprimierte Gen enthalten, die Fähigkeit verleiht, sich in Anwesenheit eines entsprechenden selektiven Agens zu vermehren.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Promotor" eine Nukleinsäuresequenz, die fungiert, um die Transkription eines stromabseitigen Gens zu lenken. Der Promotor ist im Allgemeinen für die Wirtszelle geeignet, in der das Zielgen exprimiert wird. Der Promotor ist zusammen mit anderen Transkriptions- und Translations-Regulationsnukleinsäuresequenzen (auch als "Kontrollsequenzen" bezeichnet) erforderlich, um ein gegebenes Gen zu exprimieren. Im Allgemeinen umfassen die Transkriptions- und Translations-Regulationssequenzen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Promotorsequenzen, Ribosomenbindungsstellen, Transkriptionsstart- und -stopp-Sequenzen, Translations-Start- und -stopp-Sequenzen und Enhancer- oder Aktivator-Sequenzen.
"Chimäres Gen" oder "heterologes Nukleinsäure-Konstrukt", wie hierin definiert, bezeichnet ein nicht-natives Gen (d.h. eines, das in einen Wirt eingeführt worden ist), das aus Teilen von verschiedenen Genen, einschließlich Regulationselementen, zusammengesetzt sein kann. Ein chimäres Genkonstrukt für eine Transformation einer Wirtszelle ist typisch aus einer Transkriptions-Regulationsregion (Promotor) zusammengesetzt, die operativ mit einer heterologen Protein-codierenden Sequenz oder in einem selektierbaren chimären Markergen mit einem selektierbaren Markergen verknüpft ist, welches ein Protein codiert, das transformierten Zellen Antibiotikum-Resistenz verleiht. Ein typisches chimäres Gen der Erfindung für eine Transformation in eine Wirtszelle umfasst eine Transkriptions-Regulationsregion, die konstitutiv oder induzierbar ist, eine ein Signalpeptid codierende Sequenz, eine ein Protein codierende Sequenz und eine Terminatorsequenz. Ein chimäres Genkonstrukt kann auch eine zweite DNA-Sequenz einschließen, die ein Signalpeptid codiert, wenn die Sekretion des Ziel-Proteins gewünscht wird.
Eine Nukleinsäure ist "operativ verknüpft", wenn sie in eine funktionale Beziehung mit einer weiteren Nukleinsäuresequenz gestellt wird. Zum Beispiel ist DNA, die einen sekretorischen Leader codiert, operativ mit DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operativ mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operativ mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so angeordnet ist, dass sie die Translation erleichtert. Allgemein bedeutet "operativ verknüpft", dass die DNA-Sequenzen aneinander angrenzend und im Fall eines sekretorischen Leaders aneinander angrenzend und in Lesephase verknüpft sind. Jedoch müssen Enhancer nicht angrenzend sein. Die Verknüpfung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen bewerkstelligt. Wenn derartigen Stellen nicht existieren, werden gemäß herkömmlicher Praxis synthetische Oligonukleotid-Adaptoren oder -Linker verwendet.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Gen" das DNA-Segment, das an der Produktion einer Polypeptid-Kette beteiligt ist und der codierenden Region vorangehende oder nachfolgende Regionen einschließen kann oder nicht, z.B. 5' nicht-translatierte (5' UTR) oder "Leader"-Sequenzen und 3' UTR oder "Trailer"-Sequenzen sowie dazwischenliegende Sequenzen (Introne) zwischen einzelnen codierenden Segmenten (Exonen).
Eine Nukleinsäuresequenz wird als "selektiv hybridisierbar" mit einer Bezugs-Nukleinsäuresequenz angesehen, wenn die zwei Sequenzen spezifisch unter mäßig bis hoch stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen miteinander hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes oder der Sonde. Zum Beispiel tritt eine "maximale Stringenz" typisch bei etwa Tm-5°C (5°C unterhalb der Tm der Sonde) auf; "hohe Stringenz" bei etwa 5–10°C unterhalb der Tm; "mittlere Stringenz" bei etwa 10–20° unterhalb der Tm der Sonde; und "niedrige Stringenz" bei etwa 20–25°C unterhalb der Tm. Funktionell können maximale Stringenz-Bedingungen verwendet werden, um Sequenzen zu identifizieren, die eine strikte Identität oder nahezu strikte Identität mit der Hybridisierungssonde aufweisen; während hoch stringente Bedingungen verwendet werden, um Sequenzen mit etwa 80%-iger oder höherer Sequenzidentität mit der Sonde zu identifizieren.
Mäßig und hoch stringente Hybridisierungsbedingungen sind in der Technik wohlbekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Kapitel 9 und 11 und in Ausubel, F. M., et al., 1993, ausdrücklich hierin durch Bezugnahme aufgenommen). Ein Beispiel für hoch stringente Bedingungen schließt eine Hybridisierung bei etwa 42°C in 50%-igem Formamid, 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Träger-DNA, gefolgt von zweimaligem Waschen in 2 × SSC und 0,5% SDS bei Raumtemperatur und zwei weitere Mal in 0,1 × SSC und 0,5% SDS bei 42°C, ein.
Wie hierin verwendet, schließt "rekombinant" die Bezugnahme auf eine Zelle oder einen Vektor ein, die bzw. der durch Einführen einer heterologen Nukleinsäuresequenz modifiziert worden ist, oder dass die Zelle von einer so modifizierten Zelle abstammt. So exprimieren zum Beispiel rekombinante Zellen als Ergebnis eines gezielten menschlichen Eingriffs Gene, die nicht in identischer Form innerhalb der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle gefunden werden, oder exprimieren native Gene, die ansonsten abnormal exprimiert werden, unterexprimiert werden oder überhaupt nicht exprimiert werden.
Wie hierin verwendet, bedeuten die Ausdrücke "transformiert", "stabil transformiert" oder "transgen" mit Bezug auf eine Zelle, dass die Zelle eine nicht-native (heterologe) Nukleinsäuresequenz in ihrem Genom integriert oder als episomales Plasmid aufweist, welche über zwei oder mehr Generationen aufrechterhalten wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Expression" den Prozess, durch welchen ein Polypeptid auf der Basis der Nukleinsäuresequenz eines Gens produziert wird. Der Prozess umfasst sowohl Transkription als auch Translation.
Der Ausdruck "eingeführt" im Zusammenhang mit dem Inserieren einer Nukleinsäuresequenz in eine Zelle bedeutet "Transfektion" oder "Transformation" oder "Transduktion" und umfasst den Hinweis auf die Einverleibung einer Nukleinsäuresequenz in eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle, wobei die Nukleinsäuresequenz dem Genom der Zelle (zum Beispiel der Chromosomen-, Plasmid-, Plastiden- oder Mitochondrien-DNA) einverleibt sein kann, in ein autonomes Replikon überführt sein kann oder vorübergehend exprimiert werden kann (zum Beispiel transfizierte mRNA).
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die in Mikroorganismen verwendet werden können, um den Engpass für die Proteinsekretion und die Produktion von Proteinen in sekretierter Form zu verbessern, wenn die Proteine rekombinant eingeführt und von der Wirtszelle überexprimiert werden. Die von Bacillus subtilis abstammenden Sekretionsfaktoren TatC und TatA und insbesondere das TatCd- und TatCy-Peptid sowie die Gene, die sie codieren, sind hierin beschrieben.
Die kürzliche Entdeckung eines allgegenwärtigen Translokationswegs, der speziell für Proteine mit einem Zwillingsarginin-Motiv in ihrem Signalpeptid erforderlich ist, hat das Interesse auf dessen Membran-gebundene Komponenten fokussiert, von denen eine als TatC bekannt ist. Anders als die meisten Organismen, deren Genom vollständig sequenziert worden ist, enthält das Gram-positive Eubakterium Bacillus subtilis zwei tatC-artige Gene, die als tatCd und tatCy bezeichnet werden. Das entsprechende TatCd- und TatCy-Protein weisen das Potential auf, an der Translokation von 27 Proteinen mit mutmaßlichen Zwillingsarginin-Signalpeptiden beteiligt zu sein, von denen 6 bis 14 wahrscheinlich in das Wachstumsmedium sekretiert werden. Unter Verwendung eines Ansatzes der molekularen Erforschung der Protein-Genom-Wechselwirkung zeigen wir, dass PhoD von B. subtilis, eine Phosphodiesterase, die einer neuen Poteinfamilie angehört, bei der alle bekannten Mitglieder mit typischen Zwillingsarginin-Signalpeptiden synthetisiert werden, über den Zwillingsarginin-Translokationsweg sekretiert wird. Bemerkenswerterweise ist TatCd von großer Wichtigkeit für die Sekretion von PhoD, wohingegen TatCy für diesen Prozess nicht erforderlich ist. So scheint TatC eine Spezifitätsdeterminante für die Proteinsekretion über den Tat-Weg zu sein. Auf der Grundlage unserer Beobachtungen stellen wir die Hypothese auf, dass die TatC-bestimmte Wegspezifität auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen TatC-artigen Proteinen und anderen Weg-Komponenten, wie TatA, beruht, von denen drei Paraloga in B. subtilis anwesend sind.
Tat-Nukleinsäure- und -Aminosäuresequenzen
Das TatCd-Polynukleotid mit der Sequenz, die der in 1 oder 14 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, codiert den Bacillus subtilis-Sekretionsfaktor TatCd. Das Bacillus subtilis-TatCd wurde über eine FASTA-Suche der translatierten Bacillus subtilis-Genomsequenzen unter Verwendung einer Consensussequenz von TatC identifiziert, die von E. coli abstammt. Eine FASTA-Suche der translatierten Bacillus subtilis-Genomsequenzen mit der E. coli-TatC-Sequenz allein identifizierte das B. subtilis-TatCd nicht.
Gram-positive Polynukleotid-Homologe von B. subtilis-tatCd können durch in der Technik bekannte Standardverfahren beispielsweise aus klonierter DNA (z.B. einer DNA-"Bibliothek"), genomischen DNA-Bibliotheken, durch chemische Synthese, wenn identifiziert, durch cDNA-Klonieren oder durch das Klonieren von genomischer DNA oder Fragmenten davon, die aus einer gewünschten Zelle gereinigt sind, erhalten werden. (Siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K., Bd. I, II.) Eine bevorzugte Quelle ist aus genomischer DNA. Nukleinsäuresequenzen, die von genomischer DNA abgeleitet sind, können zusätzlich zu codierenden Regionen Regulationsregionen enthalten. Was immer die Quelle ist, das isolierte TatCd-Gen sollte molekular in einen geeigneten Vektor für die Propagierung des Gens kloniert werden.
Beim molekularen Klonieren des Gens aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme geschnitten werden. Alternativ kann man DNAse in Anwesenheit von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann zum Beispiel durch Beschallung physikalisch geschert werden. Die linearen DNA-Fragmente können dann gemäß Größe durch Standardtechniken, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie, aufgetrennt werden.
Wenn die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann die Identifikation des spezifischen DNA-Fragments, welches das tatCd enthält, in einer Anzahl von Weisen bewerkstelligt werden. Zum Beispiel kann ein B. subtilis-tatCd-Gen oder dessen spezifische RNA oder ein Fragment davon, wie eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert werden und dann in Hybridisierungsassays verwendet werden, um ein Gram-positives tatC-Gen zu detektieren. (Benton, W. und Davis, R., 1977, Science, 196: 180; Grunstein, M. und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961). Jene DNA-Fragmente, die eine wesentliche Sequenzähnlichkeit mit der Sonde aufweisen, werden unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Die Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes, wie in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd 152, Academic Press, San Diego CA) gelehrt und verleihen eine definierte "Stringenz", wie nachstehend erklärt.
"Maximale Stringenz" findet typisch bei etwa Tm-5°C (5°C unterhalb der Tm der Sonde) statt; "hohe Stringenz" bei etwa 5°C bis 10°C unterhalb der Tm; "mittlere Stringenz" bei etwa 10°C bis 20°C unterhalb der Tm; und "niedrige Stringenz" bei etwa 20°C bis 35°C unterhalb der Tm. Wie es der Fachmann versteht, kann eine Hybridisierung mit maximaler Stringenz verwendet werden, um identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen, während eine Hybridisierung mit mittlerer oder niedriger Stringenz verwendet werden kann, um Polynukleotidsequenz-Homolge zu identifizieren oder nachzuweisen.
Der Ausdruck "Hybridisierung", wie hierin verwendet, soll "das Verfahren, durch welches ein Nukleinsäure-Strang sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet" einschließen (Coombs J. (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY).
Das Amplifikationsverfahren, wie es in Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Technologien durchgeführt wird, ist in Dieffenbach C. W. und G. S. Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) beschrieben. Eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens etwa 10 Nukleotiden und so viel wie etwa 60 Nukleotiden aus der TatCd-Nukleotidsequenz, bevorzugt etwa 12 bis 30 Nukleotiden und bevorzugter etwa 20–25 Nukleotiden, kann als Sonde oder PCR-Primer verwendet werden.
Das B. subtilis-tatCd-Polynukleotid, das der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht, codiert B. subtilis-TatCd. Die vorliegende Erfindung kann Aminosäure-Varianten der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz von Grampositiven Mikroorganismen verwenden, die mindestens 80% identisch, mindestens 90% identisch und mindestens 95% identisch mit der in 1 gezeigten Sequenz sind, solange die Aminosäuresequenz-Variante in der Lage ist, durch Modulation der Sekretion von Proteinen in Gram-positiven Mikroorganismen zu funktionieren.
Der in 1 gezeigte Sekretionsfaktor TatCd wurde einer FASTA (Lipmann-Pearson-Routine) -Aminsäure-Suche gegen eine Consensus-Aminosäuresequenz für TatCd unterzogen. Das Aminosäure-Alignment ist in 1 gezeigt.
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung stellt Expressionssysteme für die erhöhte Produktion und Sekretion von gewünschten heterologen Proteinen in einem Wirtsmikroorganismus bereit.
I. Codierende Sequenzen
Ein Vektor kann mindestens eine Nukleinsäure-Kopie umfassen, die einen TatC- und/oder TatA-Sekretionsfaktor eines Gram-positiven Mikroorganismus codiert, und umfasst vorzugsweise mehrere Kopien. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Gram-positive Mikroorganismus Bacillus. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Gram-positive Mikroorganismus Bacillus subtilis. In einer bevorzugten Ausführungsform können Polynukleotide, die B. subtilis-TatC und/oder -TatA oder Fragmente davon oder Fusionsproteine oder homologe Polynukleotidsequenzen codieren, welche Aminosäurevarianten von TatC und/oder TatA codieren, verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, welche die Expression von TatC und/oder TatA bzw. Aminosäure-Varianten davon in Gram-positiven Wirtszellen steuern. In einer bevorzugten Ausführungsform gehört die Wirtszelle der Gattung Bacillus an. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle B. subtilis.
Wie es vom Fachmann verstanden wird, kann es vorteilhaft sein, Polynukleotidsequenzen zu produzieren, die nicht natürlich vorkommende Codons besitzen. Von einer speziellen Gram-positiven Wirtszelle bevorzugte Codons (Murray E. et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17: 477–508) können zum Beispiel gewählt werden, um die Expressionsrate zu erhöhen oder um rekombinante RNA-Transkripte mit wünschenswerten Eigenschaften, wie einer längeren Halbwertszeit als Transkripte, die aus natürlich vorkommenden Sequenzen produziert werden, zu produzieren.
Geänderte Gram-positive tatC- und/oder tatA-Polynukleotidsequenzen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten, was ein Polynukleotid zum Ergebnis hat, welches das gleiche oder ein funktional äquivalentes TatC- und/oder TatA-Homolog codiert. Wie hierin verwendet, ist "Deletion" als eine Änderung entweder der Nukleotid- oder der Aminosäuresequenz definiert, in der ein oder mehrere Nukleotide bzw. Aminosäurereste abwesend sind.
Wie hierin verwendet, ist eine "Insertion" oder "Addition" die Änderung einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, welche im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden Gram-positiven TatC und/oder TatA die Addition eines oder mehrerer Nukleotide bzw. Aminosäurereste zum Ergebnis hatte.
Wie hierin verwendet, resultiert eine "Substitution" aus dem Ersatz eines oder mehrerer Nukleotide oder einer oder mehrerer Aminosäuren durch andere Nukleotide bzw. Aminosäuren.
Das codierte Protein kann auch Deletionen, Insertionen und Substitutionen von Aminosäureresten zeigen, die eine stumme Änderung produzieren und eine funktional äquivalente Gram-positive TatC- und/oder TatA-Variante zum Ergebnis haben. Absichtliche Aminosäure-Substitutionen können auf der Grundlage einer Ähnlichkeit der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste vorgenommen werden, solange die Variante die Fähigkeit beibehält, die Sekretion zu modulieren. Zum Beispiel umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilie-Werten umfassen Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Das TatC- und/oder TatA-Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann gentechnisch verändert werden, um die Klonierung, das Processing und/oder die Expression des Genprodukts zu modifizieren. Zum Beispiel können unter Verwendung von Techniken, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, zum Beispiel ortsgerichteter Mutagenese, um zum Beispiel neue Restriktionsstellen zu inserieren, Glycosylierungsmuster zu ändern oder die Codon-Präferenz zu ändern, Mutationen eingeführt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein TatC- und/oder TatA-Polynukleotid an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Es kann auch ein Fusionsprotein konstruiert werden, das eine Spaltstelle enthält, die zwischen der TatC- und/oder TatA-Nukleotidsequenz und der heterologen Proteinsequenz angeordnet ist, so dass das TatC- und/oder TatA-Protein von der heterologen Einheit abgespalten und gereinigt werden kann.
II. Vektor-Sequenzen
Expressionsvektoren, die bei der Expression der Sekretionsfaktoren der vorliegenden Erfindung in Gram-positiven Mikroorganismen verwendet werden, umfassen mindestens einen Promotor, der mit einem Gram-positiven tatC und/oder tatA assoziiert ist, wobei der Promotor in der Wirtszelle funktional ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor der Wildtyp-Promotor des gewählten Sekretionsfaktors, und in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor heterolog zum Sekretionsfaktor, aber immer noch in der Wirtszelle funktional.
Zusätzliche Promotoren, die mit heterologer, gewünschte Proteine oder Polypeptide codierender Nukleinsäure assoziiert sind, können über rekombinante DNA-Techniken eingeführt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle in der Lage, heterologes Protein oder Polypeptid überzuexprimieren, und Nukleinsäure, die einen oder mehrere Sekretionsfaktor(en) codiert, wird rekombinant eingeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Nukleinsäure, die TatC und/oder TatA codiert, stabil in das Mikroorganismus-Genom integriert. In einer weiteren Ausführungsform ist die Wirtszelle so genetisch verändert, dass sie einen Sekretionsfaktor der vorliegenden Erfindung überexprimiert, und Nukleinsäure, die das heterologe Protein oder Polypeptid codiert, wird über rekombinante DNA-Techniken eingeführt. Die vorliegende Erfindung umfasst Gram-positive Wirtszellen, die andere dem Fachmann bekannte Sekretionsfaktoren oder andere dem Fachmann bekannte oder in der Zukunft identifizierte Sekretionsfaktoren überexprimieren können.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine Kassette mit mehreren Klonierungsstellen, welche vorzugsweise mindestens eine Restriktionsendonuklease-Stelle umfasst, die einmalig in dem Vektor vorkommt, um die Leichtigkeit der Nukleinsäure-Manipulation zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor auch einen oder mehrere selektierbare Marker. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck selektierbarer Marker ein Gen, das zur Expression in dem Gram-positiven Wirt in der Lage ist, was die Leichtigkeit der Selektion jener Wirte ermöglicht, die den Vektor enthalten. Beispiele für derartige selektierbare Marker umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Antibiotika, wie Erythromycin, Actinomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin.
III. Transformation
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Nukleinsäure, die einen oder mehrere Gram-positive Sekretionsfaktor(en) codiert, über einen Expressionsvektor, der innerhalb der Wirtszelle replizieren kann, in eine Gram positive Wirtszelle eingeführt. Geeignete replizierende Plasmide für Bacillus sind in Molecular Biological Methods for Bacillus, Hsg. Harwood und Cutting, John Wiley & Sons, 1990, hierdurch ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben; siehe Kapitel 3 über Plasmide. Geeignete replizierende Plasmide für B. subtilis sind auf Seite 92 aufgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform ist Nukleinsäure, die ein tatC und/oder tatA eines Gram-positiven Mikroorganismus codiert, stabil in das Mikroorganismus-Genom integriert. Bevorzugte Gram-positive Wirtszellen sind diejenigen der Gattung Bacillus. Eine weitere bevorzugte Gram-positive Wirtszelle ist B. subtilis. Mehrere Strategien sind in der Literatur für das direkte Klonieren von DNA in Bacillus beschrieben worden. Plasmidmarker-Genrettungs-Transformation beinhaltet die Aufnahme eines Donor-Plasmids durch kompetente Zellen, die ein partiell homologes residentes Plasmid tragen (Contente et al., Plasmid 2: 555–571 (1979); Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223: 185–191 (1990); Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154 (3): 1077–1087 (1983); und Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169 (3): 1205–1211 (1987)). Das eintretende Donor-Plasmid rekombiniert mit der homologen Region des residenten "Helfer"-Plasmids in einem Prozess, der eine chromosomale Transformation nachahmt.
Die Transformation durch Protoplasten-Transformation ist für B. subtilis in Chang und Cohen, (1979) Mol. Gen. Genet. 168: 111–115; für B. megaterium in Vorobjeva et al., (1980) FEMS Microbiol. Letters 7: 261–263; für B. amyloliquefaciens in Smith et al., (1986) Appl. and Env. Microbiol. 51: 634; für B. thuringiensis in Fisher et al., (1981) Arch. Microbiol. 139: 213–217; für B. sphaericus in McDonald (1984) J. Gen. Microbiol. 130: 203; und für B. larvae in Bakhiet et al., (1985) 49: 577, beschrieben. Mann et al., (1986, Current Microbiol. 13: 131–135) berichten über die Transformation von Bacillus-Protoplasten, und Holubova, (1985) Folia Microbiol. 30: 97, offenbart Verfahren zur Einführung von DNA in Protoplasten unter Verwendung von DNA-haltigen Liposomen.
Identifikation von Transformanten
Obwohl die Anwesenheit/Abwesenheit einer Markergen-Expression nahelegt, dass das interessierende Gen ebenfalls anwesend ist, sollten dessen Anwesenheit und Expression bestätigt werden. Zum Beispiel können, wenn die tatC und/oder tatA codierende Nukleinsäure in eine Markergensequenz inseriert ist, rekombinante Zelle, die das Insert enthalten, durch Abwesenheit der Markergen-Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen unter der Kontrolle eines einzigen Promotors in Tandem mit Nukleinsäure angeordnet werden, welche den Sekretionsfaktor codiert. Die Expression des Markergens als Antwort auf Induktion oder Selektion zeigt gewöhnlich auch die Expression des Sekretionsfaktors an.
Alternativ können Wirtszellen, welche die codierende Sequenz für einen Sekretionsfaktor enthalten und das Protein exprimieren, durch eine Vielfalt von dem Fachmann bekannten Verfahren identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Protein-Bioassay- oder -Immunoassay-Techniken, die Technologien auf Membran-Basis, Lösungs-Basis oder Chip-Basis für den Nachweis und/oder die quantitative Bestimmung der Nukleinsäure oder des Proteins einschließen.
Die Anwesenheit der tatC- und/oder tatA-Polynukleotidsequenz kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Abschnitten oder Fragmenten nachgewiesen werden, die von dem B. subtili-tatC- und/oder -tatA-Polynukleotid abstammen.
Sekretionsassays
Mittel zur Bestimmung der Sekretionsniveaus eines heterologen Proteins in einer Gram-positiven Wirtszelle und der Nachweis sekretierter Proteine umfassen die Verwendung entweder von polyklonalen oder von monoklonalen Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind. Beispiele umfassen Enzyme-linked-immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunassay (RIA) und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Diese und andere Assays sind unter anderem in Hampton R. et al. (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) und Maddox D. E. et al. (1983, J. Exp. Med. 158: 1211) beschrieben.
Eine große Vielfalt von Markierungen und Konjugationstechniken sind dem Fachmann bekannt und können in verschiedenen Nuklein- und Aminosäureassays verwendet werden. Mittel zur Erzeugung markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden für den Nachweis spezifischer Polynukleotidsequenzen umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, End-Markierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nukleotids. Alternativ kann die Nukleotidsequenz oder ein Teil davon in einen Vektor für die Produktion einer mRNA-Sonde kloniert werden. Derartige Vektoren sind in der Technik bekannt, sind im Handel erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder SP6, und markierter Nukleotide zu synthetisieren.
Eine Anzahl von Firmen, wie Pharmacia Biotech (Piscataway NJ), Promega (Madison WI) und US Biochemical Corp (Cleveland OH) liefern kommerzielle Kits und Protokolle für diese Verfahren. Geeignete Reporter-Moleküle oder Markierungen umfassen diese Radionuklide, Enzyme, fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder chromogenen Agenzien sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen. Patente, welche die Verwendung derartiger Markierungen lehren, umfassen die US-Patente 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Auch rekombinante Immunglobuline können erzeugt werden, wie im US-Patent Nr. 4,816,567 gezeigt.
Reinigung von Proteinen
Wirtszellen, die mit heterologes Protein codierenden Polynukleotidsequenzen transformiert sind, können unter Bedingungen kultiviert werden, die für die Expression und Gewinnung des codierten Proteins aus der Zellkultur geeignet sind. Das von einer rekombinanten Wirtszelle produzierte Protein, das einen Sekretionsfaktor der vorliegenden Erfindung umfasst, wird in das Kulturmedium sekretiert. Andere rekombinante Konstrukte können die heterologen Polynukleotidsequenzen mit einer Nukleotidsequenz verknüpfen, die eine Polypeptid-Domäne codiert, welche die Reinigung eines löslichen Proteins erleichtern wird (Kroll, D. J. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 441–53).
Derartige die Reinigung erleichternde Domänen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Metall-chelatierende Peptide, wie Histidin-Tryptophan-Module, welche ein Reinigung auf immobilisierten Metallen ermöglichen (Porath, J. (1992) Protein Expr. Purif. 3: 263–281), Protein A-Domänen, welche eine Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die Domäne, die in dem FLAGS-Verlängerungs/Aftinitätsreinigungssystem (Immunex Corp, Seattle WA) verwendet wird. Der Einschluss einer spaltbaren Linker-Sequenz, wie Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego CA), zwischen der Reinigungsdomäne und dem heterologen Protein kann verwendet werden, um die Reinigung zu erleichtern.
In den vorliegenden Untersuchungen demonstrieren wir zum ersten Mal, dass ein funktionaler Tat-Weg, der für die Sekretion des PhoD-Proteins erforderlich ist, in dem Gram-positiven Eubakterium B. subtilis existiert. Das TatCd-Protein, das durch eines der zwei tatC-Gene von B. subtilis spezifiziert wird, spielt eine kritische Rolle in diesem Sekretionsweg. Im Gegensatz dazu scheint das TatCy-Protein von geringerer Bedeutung für die PhoD-Sekretion zu sein. Obwohl keine spezielle Funktion für TatCy identifiziert wurde, zeigen unsere Ergebnisse, dass das entsprechende Gen unter Bedingungen des Phosphat-Mangels transkribiert wird, wenn TatCd seine kritische Rolle bei der PhoD-Sekretion erfüllt. Weiter scheint TatCy aktiv an der RR-Präprotein-Translokation beteiligt zu sein, wie aus der Tatsache gefolgert, dass in einigen Experimenten niedrige Niveaus der PhoD-Sekretion durch B. subtilis ΔtatCd (aber niemals durch tatCd-tatCy-Doppelmutanten) beobachtet wurden. Bemerkenswerterweise implizieren diese Beobachtungen, dass TatC eine Spezifitätsdeterminante für die Proteinsekretion über den Tat-Weg ist. In der Tat legt unsere Beobachtung, dass die Sekretion von PhoD in Abwesenheit von TatCy erhöht war, nahe, dass abortive Wechselwirkungen zwischen prePhoD und TatCy oder TatCy-haltigen Translokasen stattfinden können. Nichtsdestoweniger können alternative, indirektere Erklärungen für diese Beobachtung derzeit nicht ausgeschlossen werden. Interessanterweise erinnert die positive Auswirkung der tatCy-Mutation auf die PhoD-Sekretion an die Wirkung, die beobachtet wurde, als gewisse Gene (d.h. sipS und/oder sipU für paraloge Signalpeptidasen vom Typ I von B. subtilis unterbrochen wurden. Dies hatte signifikant verbesserte Processingraten der α-Amylase-AmyQ-Vorstufe durch die verbleibenden Signalpeptidasen vom Typ I (d.h. SipT, SipV und/oder SipW; Tjalsma et al. (1998) Genes Dev. 12, 2318–2331, Tjalsma et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 25983–25992, und Bolhuis et al. (1996), Mol. Microbiol. 22, 605–618) zur Folge. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass allgemein die Anwesenheit von zwei oder mehr paralogen Sekretionsmaschinerie-Komponenten in B. subtilis noch undefinierte, abortive Wechselwirkungen mit gewissen sekretorischen Präproteinen zur Folge haben kann.
Das PhoD-Protein von B. subtilis wird mit einem typischen RR-Signalpeptid synthetisiert, das eine lange hydrophile N-Region mit einem Consensus-RR-Motiv und eine mild hydrophobe H-Region enthält (Tabelle I). In der Tat enthält das RR-Signalpeptid von PhoD keine nachweisbaren atypischen Merkmale für RR-Signalpeptide (siehe: Berks, B. C. (1996) Mol. Microbiol. 22, 393–404), und deshalb ist es derzeit nicht klar, warum PhoD spezifisch die Anwesenheit von TatCd für eine effiziente Sekretion erfordert. Bemerkenswerterweise wurde die Sekretion von YdhF, dem einzigen anderen Protein mit einem vorhergesagten RR-Signalpeptid, das bislang durch 2D-Gelelektrophorese identifiziert werden konnte, nicht in der ΔtatCd-ΔtatCy-Mutanten beeinflusst. Diese Beobachtung zeigt, dass das RR-Motiv im YdhF-Signalpeptid dieses Protein nicht in den Tat-Weg lenkt. Stattdessen wird YdhF sehr wahrscheinlich über den Sec-Weg sekretiert, was auf der relativ kurzen, aber hoch hydrophoben H-Region des YdhF-Signalpeptids beruhen könnte. Ähnlich wurde kürzlich gezeigt, dass das WapA- und WprA-Protein von B. subtilis, die vorhergesagte RR-Signalpeptide aufweisen (Tabelle I), auf stark Ffh- und SecA-abhängige Weise sekretiert werden (Hirose et al. (2000) Micorbiology 146, 65–75), was impliziert, dass diese Proteine nicht den Tat-Weg verwenden. Obwohl die H-Regionen dieser Signalpeptide von ähnlicher Größe sind wie diejenige des PhoD-Signalpeptids, sind sie signifikant hydrophober. Die letztgenannte Beobachtung legt nahe, dass wie in E. coli (Cristóbal et al. (1999) EMBO J. 18, 2982–2990) die Hydrophobie der H-Region eine wichtige Determinante ist, welche ermöglicht, dass die Zelle zwischen Sec-Typ- und RR-Signalpeptiden unterscheidet. Bemerkenswerterweise sind die vorhergesagten RR-Motive von WapA, WprA und YdhF auch von früher beschriebenen RR-Signalpeptiden verschieden, da sie einen Lys- oder Ser-Rest an der +3 Position relativ zu den Zwillingsargininen enthalten (Tabelle I). In der Tat fehlen an der +2 und +3 Position relativ zu den Zwillingsargininen von bekannten RR-Signalpeptiden hydrophile Reste vollständig (Berks, B. C. (1996) Mol. Microbiol. 22, 393–404, Brink et al. (1998) FEBS Lett. 434, 425–430, Sargent et al. (1998) EMBO J. 17, 3640–3650, Chaddock et al. (1995) EMBO J. 14, 2715–2722, Sargent et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 36073–36082, und Santini et al. (1998) EMBO J. 17, 101–112). Wenn eine geringe Gesamt-Hydrophobie und die Anwesenheit von hydrophoben Resten an der +2 und +3 Position als Kriterien für die Vorhersage von RR-Signalpeptiden verwendet werden, kann die Gesamtzahl von vorhergesagten B. subtilis-Signalpeptiden dieses Typs von 27 auf 11 verringert werden. Bemerkenswerterweise enthalten von diesen 11 Präproteinen 4 zusätzliche Transmembran-Segmente, und einem fehlt eine Signalpeptidase-Spaltungsstelle. So würde man auf der Grundlage dieser stringenteren Kriterien vorhersagen, dass lediglich 6 Proteine von B. subtilis (d.h. AlbB, LipA, PhoD, YkpC, YkuE und YwbN) über den Tat-Weg in das Wachstumsmedium sekretiert werden. Dies würde erklären, warum die Sekretion von lediglich einem Protein, PhoD, unter Bedingungen des Phosphat-Mangels nachweisbar in B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy beeinflusst war. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu bemerken, dass die TatC-abhängige Sekretion von einigen anderen Proteinen mit (vorhergesagten) RR-Signalpeptiden in den vorliegenden Untersuchungen unbemerkt geblieben sein könnte, da sie unter Bedingungen des Phosphat-Mangels mit sehr niedrigen Niveaus exprimiert werden. Weiter ist es denkbar, dass andere TatC-abhängige Proteine in der 2D-Gelelektrophorese-Analyse aufgrund ihrer schlechten Trennung in der ersten Dimension verfehlt wurden.
Interessanterweise wurde vorhergesagt, dass auch das YdhF-Protein ein Lipoprotein ist (Tabelle I; Tjalsma et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 1698–1707). Die Tatsache, dass YdhF im Wachstumsmedium gefunden wurde, legt entweder nahe, dass diese Vorhersage falsch war, oder dass YdhF über ein nachfolgendes Processing-Ereignis, das der Spaltung durch die Lipoprotein-spezifische (Typ II) Signalpeptidase folgt, in das Wachstumsmedium freigesetzt wird (Prágai et al. (1997) Microbiology 143, 1327–1333). Derartige nachfolgende Processing-Ereignisse sind früher für andere Bacillus-Lipoproteine beschrieben worden (siehe: Tjalsma et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 1698–1707). In der Tat erklärt die letztgenannte Möglichkeit am wahrscheinlichsten, warum das Phosphat-bindende Protein PstS, das ein typisches Lipoprotein ist (früher als YqgG bekannt; Tjalsma et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 1698–1707, und Qi, Y. und Hulett, F. M. (1989) J. Bacterial. 180, 4007–4010), im Wachstumsmedium gefunden wurde. Wie es für Lipoproteine erwartet wird, waren signifikante Mengen von PstS auch in Zell-assoziierter Form vorhanden (Antelmann, H., Schart, C. und Hecker, M. (2000) J. Bacteriol. im Druck und Eymann et al. (1996) Microbiology 142, 3163–3170).
Eines der herausragenden Merkmale des Tat-Wegs von E. coli ist dessen Fähigkeit, voll gefaltete Proteine, die vor dem Export aus dem Zytoplasma Cofaktoren binden, und selbst multimere Enzym-Komplexe zu translozieren (Berks, B. C. (1996) Mol. Microbiol. 22, 393–404, Weiner et al. (1998) Cell 93, 93–101, Santini et al. (1998) EMBO J. 17, 101–112, und Rodrigue et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 13223–13228). Ähnlich wurde gezeigt, dass der thylakoidale Tat-Weg gefaltete Proteine transloziert (Bogsch et al. (1997) EMBO J. 16, 3851–3859, und Hynds et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34868–34874). So scheint es, als ob dieser Weg für den Transport von Proteinen verwendet wird, die mit Sec inkompatibel sind, entweder weil sie vor der Translokation gefaltet werden müssen oder weil sie sich zu rasch oder zu eng falten, um einen Transport über das Sec-System zu gestatten, von dem bekannt ist, dass es Proteine in ungefalteter Konformation transportiert (siehe: Dalbey, R. E. und Robinson, C. (1999) Trends Biochem. Sci. 24, 17–22). Im Einklang mit dieser Idee wurde gezeigt, dass gefaltete Präproteine, von denen einige biologisch aktiv waren, in tat-Mutanten von E. coli akkumulieren (Sargent et al. (1998) EMBO J. 17, 3640–3650, Bogsch et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 18003–18006, Weiner et al. (1998) Cell 93, 93–101, und Sargent et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 36073–36082). Deshalb ist es denkbar, dass der Tat-Weg von B. subtilis ebenfalls am Transport von gefalteten Cofaktor-bindenden Proteinen beteiligt ist. Diese Ansicht wird durch die Beobachtung gestützt, dass das Eisen-Schwefel-Cluster-bindende Rieske-Protein QcrA von B. subtilis (Yu et al. (1995) J. Bacteriol. 177, 6751–6760) mit einem vorhergesagten RR-Signalpeptid synthetisiert wird (Tabelle I). Nichtsdestoweniger wird die prePhoD-Akkumulation im Vergleich zum Elternstamm in B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy nicht erhöht. Dies legt nahe, dass prePhoD entweder vor der Translokation nicht gefaltet wird oder dass gefaltetes prePhoD gegenüber zytosolischen Proteasen von B. subtilis empfindlich ist. Wir bevorzugen die erste Möglichkeit, da die meisten nativen B. subtilis-Proteine gegen eine Proteolyse hoch resistent sind, vorausgesetzt, dass sie richtig gefaltet sind (siehe: Stephenson et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64, 2875–2881, Bolhuis et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 15865–15868, und Bolhuis et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65, 2934–2941). Im Einklang mit der Idee, dass prePhoD in locker gefalteter oder ungefalteter Konformation sekretiert werden könnte, steht die Beobachtung, dass locker gefaltete Proteine über den thylakoidalen Tat-Weg transportiert werden können (Bogsch et al. (1997) EMBO J. 16, 3851–3859, und Hynds et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34868–34874). Bemerkenswerterweise werden die vier bekannten Homologe von PhoD, die alle in Streptomyces-Arten identifiziert wurden, mit einem typischen RR-Signalpeptid synthetisiert (Tabelle IV). So scheint es, dass PhoD-artige Proteine einer neuen Familie von Proteinen mit einem noch undefinierten Erfordernis für eine Translokation über den Tat-Weg angehören. In dieser Hinsicht ist es interessant zu bemerken, dass die N-Regionen der RR-Signalpeptide von PhoD und PhoD-artigen Proteinen zu den längsten N-Regionen von bekannten RR-Signalpeptiden gehören (siehe: Berks, B. C. (1996) Mol. Microbiol. 22, 393–404).
Schließlich ist eines der bemerkenswertesten Ergebnisse unserer derzeitigen Untersuchungen die Beobachtung, dass TatC eine Spezifitätsdeterminante für die Proteinsekretion über den Tat-Weg von B. subtilis ist. Interessanterweise stellt dieser Befund zu einem gewissen Ausmaß die Hypothese in Frage, dass die TatA-artigen Komponenten dieses Wegs eine Rezeptor-ähnliche Funktion aufweisen (Chanal et al. (1998) Mol. Microbiol. 30, 674–676, und Settles et al. (1997) Science 278, 1467–1470). Stattdessen legt er nahe, dass TatC-artige Proteine spezifische Elemente von gewissen exportierten Proteinen, wie das RR-Signalpeptid, erkennen. So könnten unsere Ergebnisse die erste experimentelle Stütze für das "Seeanemonen"-Modell von Berks et al. (Mol. Microbiol. (2000) 5, 260–274) darstellen, in dem auf der Grundlage von theoretischen Überlegungen vorgeschlagen wird, dass die TatABE-Proteine einen Protein-leitenden Kanal bilden, während das TatC-Protein als RR-Signalpeptid-Rezeptor wirkt. Alternativ ist es noch denkbar, dass gewisse Proteine mit RR-Signalpeptiden von TatA-artigen Proteinen erkannt werden, vorausgesetzt, dass ein spezifisches TatC-artiges Partner-Protein anwesend ist. Eine dritte Möglichkeit wäre, dass spezifische TatA- und TatC-artige Partner-Proteine zusammen an einer Substrat-Erkennung beteiligt sind. Die Tatsache, dass weder TatAc noch TatAd von B. subtilis in der Lage waren, tatA-, tatB- oder tatE-Mutationen in E. coli zu komplementieren, und dass TatCd von B. subtilis nicht in der Lage war, die E. coli tatC-Mutation zu komplementieren (unsere unveröffentlichten Beobachtungen), legt nahe, dass die TatC-determinierte Wegspezifität, wie in den vorliegenden Untersuchungen beschrieben, auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen TatA- und TatC-artigen Proteinen beruht. Wenn dies der Fall ist, implifiziert dies, dass B. subtilis zwei parallele Wege für die Zwillingsarginin-Translokation enthält, wobei an einem das TatCd-Protein beteiligt ist. Wie in den vorliegenden Untersuchungen gezeigt, scheint die TatCd-abhängige Translokation spezifisch unter Bedingungen von Phosphat-Mangel aktiviert zu werden, vielleicht mit dem alleinigen Zweck der Translokation von PhoD. Ähnlich zu der Situation in B. subtilis können parallele Wege für die Zwillingsarginin-Translokation in anderen Organismen, wie Archaeoglobus fulgidus, vorhanden sein, von dem gezeigt wurde, dass er zwei paraloge tatC-artige Gene enthält (Berks et al. (2000) Mol. Microbiol. 5, 260–274, und Klenk et al. (1997) Nature 390, 364–370).
Zusätzliche Arbeiten, die als Stütze für die vorliegende Erfindung durchgeführt wurden, zeigen an, dass sowohl tatCd als auch tatCy TAT-Komponenten und auch für die Sekretion von anderen Genen verantwortlich sein können. In der Tat beseitigt mit Bezug auf 6 eine tatCd-Deletion die Sekretion von LipA vollständig. 6 legt jedoch auch nahe, dass, obwohl tatCd die primäre Tat-Komponente ist, TatCy eine gewisse Rolle bei der Sekretion von LipA spielt (obwohl nicht so stringent wie TatCd).
Der bakterielle Zwillingsarginin-Translokations- (Tat-) Weg ist kürzlich für PhoD von Bacillus subtilis, einer ein Zwillingsarginin-Signalpeptid enthaltenden Phosphodiesterase, beschrieben worden. Die Expression von phoD, die als Antwort auf einen Phosphat-Mangel induziert wird, ist mit der Expression des tatA_d- und tatC_d-Gen coreguliert, welche stromabwärts von phoD lokalisiert sind. Während tatCd von großer Bedeutung für die Sekretion von PhoD war, war die zweite Kopie eines tatC (tatCy) für diesen Prozess nicht erforderlich. Um die Spezifität des PhoD-Transports weiter zu charakterisieren, wurde die Translokation von PhoD in E. coli untersucht. Unter Verwendung von Genfusionen analysierten wir die spezielle Rolle des Signalpeptids und der reifen Region von phoD beim Kanalisieren des Transportwegs. Ein Hybrid-Protein, das aus dem Signalpeptid von TEM-β-Lactainase und reifem PhoD bestand, wurde Sec-abhängig transportiert, was anzeigt, dass der reife Teil von PhoD keine Information enthält, welche den gewählten Translokationsweg kanalisiert. prePhoD sowie aus dem Signalpeptid von PhoD (SP_phoD) und β-Galactosidase (LacZ) bestehendes Fusionsprotein verblieben in Escherichia coli zytosolisch. So scheint SP_phoD nicht von E. coli-Transportsystemen erkannt zu werden. Die Coexpression von B. subtilis-tatA_d/C_d-Genen hatte das Processing von SP_phoD-LacZ und die periplasmatische Lokalisation von LacZ zur Folge, was eine enge Substrat-Tat-Komponentenspezifität des PhoD-TatA_d/C_d-Transportsystems veranschaulicht. Während die Blockade des Sec-abhängigen Transports die Lokalisation von SP_phoD-LacZ nicht beeinflusste, waren die Translokation und das Processing vom pH-Gradienten der zytosolischen Membran abhängig. Der TatAd/Cd-vermittelte Transport von SP_phoD-LacZ wurde in Abwesenheit von E. coli-Tat-Proteinen beobachtet, was anzeigt, dass SP_phoD-Peptide und ihr übernommenes TatAd/Cd-Proteinpaar in E. coli ein autonomes Tat-System bilden. So besteht die minimale Anforderung eines aktiven Tat-abhängigen Protein-Translokationssystems aus einem Zwillingsarginin-Signalpeptid, das Tat-Substrat enthält, dessen spezifischen TatA/C-Proteinen und dem pH-Gradienten über die zytosolische Membran hinweg.
Die folgenden Herstellungen und Beispiele werden angegeben, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, die vorliegende Erfindung klarer zu verstehen und durchzuführen. Sie sollten nicht als Beschränkung des Bereichs der Ansprüche, sondern lediglich als erläuternd und repräsentativ für dieselben angesehen werden.
In der experimentellen Offenbarung, die folgt, gelten die folgenden Abkürzungen: Äq (Äquivalente); M (molar); μM (mikromolar); N (normal); Mol (Mol(e)); mMol (Millimol); μMol (Mikromol); nMol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); kg (Kilogramm); μg (Mikrogramm); l (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Micrometer); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); h (Stunden); min (Minuten); s (Sekunden); ms (Millisekunden); DSC (Dünnschichtchromatographie); TY, Trypton/Hefe-Extrakt; Ap, Ampicillin; DTT, Dithiotreit; Em, Erythromycin; HPDM, definiertes Medium mit hohem Phosphatgehalt; IPG, immobilisierter pH-Gradient; IPTG, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid; Km, Kanamycin; LPDM, definiertes Medium mit niedrigem Phosphatgehalt; MM, minimales Medium; OD, optische Dichte; PAGE, Polyacrylamidgelelektrophorese; PCR, Polymerase-Kettenreaktion; Sp, Spectinomycin; SSM, Schaeffers Sporulationsmedium; 2D, zweidimensional.
Beispiel 1
Identifikation von tat-Genen von B. subtilis
Um zu untersuchen, ob B. subtilis einen potentiellen Tat-Weg enthält, wurde unter Verwendung der vollständigen Sequenz des B. subtilis-Genoms (Kunst et al. (1997) Nature 390, 249–256) eine Suche nach Homologen von E. coli-Tat-Proteinen durchgeführt. Zuerst zeigten Sequenz-Vergleiche, dass B. subtilis drei paraloge Gene (d.h. yczB, ydiI und ynzA) enthält, die Proteine mit einer Sequenzähnlichkeit zu den drei Paralogen E. coli-TatA, -TatB- und -TatE-Proteinen spezifizieren. Speziell zeigte das YdiI-Protein (57 Reste), das zu TatAy umbenannt wurde, den höchsten Grad an Sequenzähnlichkeit mit dem E. coli-TatA-Protein (58% identische Reste und konservative Ersetzungen); das YczB- Protein (70 Reste), das zu TatAd umbenannt wurde, zeigte den höchsten Grad an Sequenzähnlichkeit mit dem E. coli-TatB-Protein (54% identische Reste und konservative Ersetzungen); und das YnzA-Protein (62 Reste), das zu TatAc umbenannt wurde, zeigte den höchsten Grad an Sequenzähnlichkeit mit dem E. coli-TatB-Protein (53% identische Reste und konservative Ersetzungen). Alle drei B. subtilis-Proteine wurden zu TatA umbenannt, um mögliche Fehlinterpretationen bezüglich ihrer jeweiligen Funktionen zu vermeiden, die derzeit unbekannt sind. Wie TatA, TatB und TatE von E. coli scheinen die drei TatA-Proteine von B. subtilis eine Amino-terminale Membran-überspannende Domäne aufzuweisen (1A), und es wird vorausgesagt, dass die Carboxyl-terminalen Teile dieser Proteine in Richtung des Zytoplasmas liegen. Obwohl TatAc, TatAd und TatAy von B. subtilis eine signifikante Ähnlichkeit mit TatA, TatB und TatE von E. coli zeigen, wenn die Aminosäuresequenzen dieser Proteine paarweise verglichen werden, ist nur eine begrenzte Zahl von Resten in allen sechs Aminosäuresequenzen konserviert (17% identische Reste und konservative Ersetzungen; 1A).
Zweitens wurde gezeigt, dass B. subtilis im Gegensatz zu E. coli, die ein einziges tatC-Gen enthält (10), zwei paraloge tatC-artige Gene (d.h. ycbT und ydiJ) enthält. Das YcbT-Protein (245 Reste), das zu TatCd umbenannt wurde, und das YdiJ-Protein (254 Reste), das zu TatCy umbenannt wurde, zeigten eine signifikante Ähnlichkeit mit dem E. coli-TatC-Protein (57% identische Reste und konservative Ersetzungen in den drei ausgerichteten Sequenzen; 1B). Wie TatC von E. coli weisen TatCd und TatCy von B. subtilis sechs potentielle Transmembran-Segmente auf (1B), und es wird vorausgesagt, dass die Amino-Termini dieser Proteine in Richtung auf das Zytoplasma liegen (Daten nicht gezeigt).
Im Gegensatz zu E. coli, in dem das tatA-, tatB- und tatC-Gen ein einziges Operon bilden, während das tatE-Gen ein Monocistron ist (Sargent et al. (1998) EMBO J. 17, 3640–3650), sind die tat Gene von B. subtilis an drei unterschiedlichen Chromosomen-Regionen angeordnet. Zwei dieser Regionen enthalten benachbarte tatA- und tatC-Gene, wobei das tatAd- und das tatAy-Gen unmittelbar stromaufwärts vom tatCd- bzw. tatCy-Gen angeordnet sind (2). Bemerkenswerterweise sind das tatAd- und das tatCd-Gen, die bei 24,4° auf dem auf dem B. subtilis-Chromosom kartieren, unmittelbar stromabwärts vom phoD-Gen angeordnet, das ein sekretiertes Protein mit einem mutmaßlichen RR-Signalpeptid spezifiziert (Tabelle I). Weiter sind das tatAy- und das TatCy-Gen bei 55,3° auf dem B. subtilis-Chromosom innerhalb eines Genclusters mit unbekannter Funktion angeordnet (2), und das tatAc-Gen ist bei 162,7° auf dem B. subtilis-Chromosom angeordnet (Daten nicht gezeigt), unmittelbar stromabwärts vom cotC-Gen, das ein Sporenhüllen-Protein spezifiziert (Donovan et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 1–10). Schließlich ist ein tatD-artiges Gen, das als yabD bezeichnet wird, bei 4,1° auf dem B. subtilis-Chromosom unmittelbar stromabwärts vom metS-Gen angeordnet, welches eine Methionyl-tRNA-Synthetase codiert (Daten nicht gezeigt).
Zusammengenommen legen diese Beobachtungen stark nahe, dass B. subtilis einen tat-Weg für die Translokation von Proteinen mit RR-Signalpeptiden über die zytoplasmatische Membran besitzt. Weiter legt die Beobachtung, dass das tatAd- und tatCd-Gen stromabwärts vom phoD-Gen angeordnet sind, das ein Mitglied des pho-Regulons ist (Eder et al. (1996) Microbiology 142, 2041–2047), nahe, dass das tatAd- und das tatCd-Gen ausschließlich unter Bedingungen von Phosphat-Mangel exprimiert werden könnten.
Beispiel 2
TatC-abhängige Sekretion des PhoD-Proteins
Um zu untersuchen, ob in B. subtilis ein aktiver Tat-Weg existiert, wurden verschiedene Einfach- und Doppel-tatC-Mutanten konstruiert. Zu diesem Zweck wurde das tatCd-Gen entweder mit einem Km-Resistenzmarker unterbrochen oder es wurde unter die Kontrolle des IPTG-abhängigen Pspao-Promotors des Plasmids pMutin2 gestellt, was die B. subtilis-Stämme ΔtatCd bzw. ItatCd zum Ergebnis hatte (3, A und B).
Ähnlich wurde das tatCy-Gen entweder mit einem Sp-Resistenzmarker unterbrochen oder es wurde unter die Kontrolle des IPTG-abhängigen Pspac- Promotors des Plasmids pMutin2 gestellt, was die B. subtilis-Stämme ΔtatCy bzw. ItatCy zum Ergebnis hatte (3, A und C). Doppel-tatCd-tatCy-Mutanten wurden durch Transformieren der ΔtatCy-Mutante mit chromosomaler DNA des ΔtatCd- oder ItatCd-Mutantenstamms konstruiert.
Tabelle II führt die verwendeten Plasmide und Bakterienstämme an. TY¹-Medium (Trypton/Hefe-Extrakt) enthielt Bacto-Trypton (1%), Bacto-Hefeextrakt (0,5%) und NaCl (1%). Minimales Medium (MM) wurde hergestellt, wie in Tjalsma et al. (1998) Genes Dev. 12, 2318–2331, beschrieben. Schaeffers Sporulationsmedium (SSM) wurde hergestellt, wie in Schaeffer et al. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 271, 5463–5467, beschrieben. Definiertes Medium mit hohem Phosphatgehalt (HPDM) und niedrigem Phosphatgehalt (LPDM) wurde hergestellt, wie in Müller et al. (1997) Microbiology 143, 947–956, beschrieben. Um das anaerobe Wachstum zu testen, wurde S7-Medium hergestellt, wie in van Dijl et al. (1991) J. Gen. Microbiol. 137, 2073–2083, und van Dijl et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 40–48, beschrieben, und mit NaNO₃ (0,2%) und Glycerin (2%) supplementiert. Falls erforderlich, wurden die Medien für E. coli mit Ampicillin (Ap; 100 μg/ml), Erythromycin (Em; 100 μg/ml), Kanamycin (Km; 40 μg/ml) oder Spectinomycin (Sp; 100 μg/ml) supplementiert; die Medien für B. subtilis wurden mit Ein (1 μg/ml), Km (10 μg/ml), Sp (100 μg/ml) und/oder Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG; 100 μM) supplementiert.
Die Verfahren für die DNA-Reinigung, -Restriktion, -Ligation, -Agarosegelelektrophorese und die Transformation von E. coli wurden durchgeführt, wie in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben. Die Enzyme waren von Roche Molecular Biochemicals. B. subtilis wurde transformiert, wie in Tjalsma et al. (1997) J. Bio. Chem. 272, 25983–25992 beschrieben. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) wurde mit der Pwo-DNA-Polymerase (New England Biolabs) durchgeführt, wie in van Dijl et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 3611–3618, beschrieben.
Um B. subtilis ItatCd zu konstruieren, wurde die 5'-Region des tatCd-Gens mittels PCR mit den Primern JJ14bT (5'-CCC AAG CTT ATG AAA GGG AGG GCT TTT TTG AAT GG-3'), der eine HindIII-Stelle enthält, und JJ15bT (5'-GCG GAT CCA AAG CTG AGC ACG ATC GG-3'), der eine BamHI-Stelle enthält, amplifiziert. Die amplifizierten Fragmenten wurden mit HindIII und BamHI geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pMutin2 kloniert (Vagner et al. (1998) Microbiol. 144, 3097–3104), was pMICd1 zum Ergebnis hat. B. subtilis ItatCd wurde durch eine Integration vom Campbell-Typ (Einfach-Crossover) von pMICd1 in die tatCd-Region des Chromosoms erhalten.
Um B. subtilis ItatCy zu konstruieren, wurde die 5'-Region des tatCy-Gens mittels PCR mit den Primern JJ03iJ (5'-CCC AAG CTT AAA AAG AAA GAA GAT CAG TAA GTT AGG ATG-3'), der eine HindIII-Stelle enthält, und JJ04iJ (5'-GCG GAT CCA AGT CCT GAG AAA TCC G-3'), der eine BamHI-Stelle enthält, amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde mit HindIII und BamHI geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pMutin2 kloniert, was pMICy1 zum Ergebnis hatte. B. subtilis ItatCy wurde durch eine Integration vom Campbell-Typ (Einzel-Crossover) von pMICy1 in die tatCy-Region des Chromosoms erhalten.
Um B. subtilis ΔtatCd zu konstruieren, wurde das tatCd-Gen mittels PCR mit dem Primer JJ33Cdd (5'-GGA ATT CGT GGG ACG GCT ACC-3'), der eine EcoRI-Stelle und 5'-Sequenzen von tatCd enthält, und dem Primer JJ34Cdd (5'-CGG GAT CCA TCA TGG GAA GCG-3'), der eine BamHI-Stelle und 3'-Sequenzen von tatCd enthält, amplifiziert. Als nächstes wurde das PCR-amplifizierte Fragment mit EcoRI und BamHI geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pUC21 ligiert, was pJCd1 zum Ergebnis hatte. Das Plasmid pJCd2 wurde durch Ersatz eines inneren BclI-AccI-Fragments des tatCd-Gens in pJCd1 durch einen von pDG792 abstammenden Km-Resistenzmarker erhalten, welcher von BamHI- und ClaI-Restriktionsstellen flankiert war. Schließlich wurde B. subtilis ΔtatCd durch ein Doppel-Crossover-Rekombinationsereignis zwischen dem unterbrochenen tatCd-Gen von pJCd2 und dem chromosomalen tatCd-Gen erhalten.
Um B. subtilis ΔtatCy zu konstruieren, wurde das tatCy-Gen mittels PCR mit dem Primer JJ29Cyd (5'-GGG GTA CCG GAA AAC GCT TGA TCA GG-3'), der eine KpnI-Stelle und 5'-Sequenzen von tatCy enthielt, und dem Primer JJ30Cyd (5'-CGG GAT CCT TTG GGC GAT AGC C-3'), der eine BamHI-Stelle und 3'-Sequenzen von tatCy enthielt, amplifiziert. Als nächstes wurde das PCR-amplifizierte Fragment mit KpnI und BamHI geschnitten und in die Asp718- und BamHI-Stelle von pUC21 ligiert, was pJCy1 zum Ergebnis hatte. Das Plasmid pJCy2 wurde durch Ligieren eines von pDG1726 abstammenden Sp-Resistenzmarkers, der von PsfI-Restriktionsstellen flankiert war, in die einzige PsfI-Stelle des tatCy-Gens in pJCy1 erhalten. Schließlich wurde B. subtilis ΔtatCy durch ein Doppel-Crossover-Kombinationsereignis zwischen dem unterbrochenen tatCy-Gen von pJCy2 und dem chromosomalen tatCy-Gen erhalten.
Doppel-tatCd-tatCy-Mutanten wurden durch Transformieren der ΔtatCy-Mutante mit chromosomaler DNA des ΔtatCd- oder ItatCd-Mutantenstamms konstruiert. Die korrekte Integration von Plasmiden oder Resistenzmarkern in das Chromosom von B. subtilis wurde durch Southern-Blotting verifiziert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402) wurde für Proteinvergleiche in GenBank verwendet. Die Proteinsequenz-Alignments wurden mit dem ClustalW-Programm (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673–4680) unter Verwendung der Blosum-Matrizen oder der Version 6.7 des PCGene Analysis Program (Intelligenetics Inc.) durchgeführt. Mutmaßliche Transmembran-Segmente und deren Membran-Topologien wurden mit dem TopPred2-Algorithmus (Sipos et al. (1993) Eur. J. Biochem. 213, 1333–1340, und Cserzo et al. (1997) Protein Eng. 10, 673–676) vorhergesagt.
Kompetenz und Sporulation – Die Kompetenz für eine DNA-Bindung und -Aufnahme wurde durch Transformation mit Plasmid- oder chromosomaler DNA bestimmt (Bron et al. (1972) Mutat. Res. 15, 1–10). Die Sporulationseffizienz wurde durch Züchten in SSM-Medium über Nacht, Abtöten der Zellen mit 0,1 Volumina Chloroform und anschließendes Plattieren bestimmt.
Western-Blot-Analyse und Immundetektion – Um PhoB und PhoD zu detektieren, wurden B. subtilis-Zellen durch Zentrifugation (2 min, 14.000 U/min, Raumtemperatur) von dem Wachstumsmedium abgetrennt. Proteine im Wachstumsmedium wurden 20-fach nach Fällung mit Trichloressigsäure konzentriert, und Proben für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wurden hergestellt, wie zuvor von Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680–685, beschrieben. Nach Auftrennung durch SDS-PAGE wurden die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schüll) übertragen, wie in Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354, beschrieben. PhoB und PhoD wurden mit spezifischen Antikörpern (Müller, J. P. und Wagner, M. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 180, 287–296) und alkalische Phosphatase-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpern (SIGMA) gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht.
Zweidimensionale (2D-) Gelelektrophorese von sekretierten Proteinen. B. subtilis-Stämme wurden unter heftigem Bewegen bei 37°C in 1 Liter eines synthetischen Mediums (Antelmann et al. (1997) J. Bacteriol. 179, 7251–7256, und Antelmann et al. (2000) J. Bacteriol. im Druck) gezüchtet, das 0,16 mM KH₂PO₄ zur Induktion einer Phosphat-Mangel-Antwort enthielt. Eine Stunde nach der exponentiellen Vermehrung wurden die Zellen durch Zentrifugation von dem Wachstumsmedium abgetrennt. Die sekretierten Proteine in dem Wachstumsmedium wurden über Nacht mit eiskalter 10%-iger Trichloressigsäure gefällt und durch Zentrifugation (40.000 g, 2 h, 4°C) gesammelt. Das Pellet wurde dreimal mit 96%-igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400 μl Rehydratationslösung resuspendiert, die 2 M Thioharnstoff, 8 M Harnstoff, 1% Nonidet P40, 20 mM DTT und 0,5% Pharmalyte (pH 3–10) enthielt. Die Zellen wurden durch Beschallung aufgebrochen, wie in Eymann et al. (1996) Microbiology 142, 3163–3170, beschrieben, und die zellulären Proteine wurden in Rehydratationslösung resuspendiert, wie oben beschrieben. Proben von sekretierten oder zellulären Proteinen in Rehydratationslösung wurden für das Wiederaufquellan von Streifen mit immobilisiertem pH-Gradienten (IPG) (pH-Bereich 3–10) verwendet. Als nächstes wurde die Proteinauftrennung in den IPG-Streifen (Elektrophorese in der ersten Dimension) durchgeführt, wie vom Hersteller (Amersham Pharmacia Biotech) empfohlen. Die Elektrophorese in der zweiten Dimension wurde durchgeführt, wie in Bernhardt et al. (1997) Microbiology 143, 999–1017, beschrieben. Die resultierenden 2D-Gele wurden mit Silbernitrat (Blum et al. (1987) Electrophoresis 8, 93–99) oder Comassie-Brilliant-Blau R250 angefärbt.
Protein-Identifikafion. Der tryptische Verdau von Proteinen im Gel, aufgetrennt durch 2D-Gelelektrophorese, wurde unter Verwendung einer Peptid-Sammlungsvorrichtung (Otto et al. (1996) Electrophoresis 17, 1643–1650) durchgeführt. Für diesen Zweck wurden 0,5 μl Peptid-Lösung mit einem gleichen Volumen an gesättigter α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Lösung in 50%-igem Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure gemischt. Die resultierende Mischung wurde auf die Proben-Matrix eines Matrix-unterstützten Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometers (Voyager DE-STR, PerSeptive Biosystems) aufgetragen. Peptidmassen-Fingerabdrücke wurden unter Verwendung von "MS-it"-Software analysiert, die von Baker und Clausner über http.//prospector.ucsf.edu geliefert wurde.
Die Tatsache, dass Doppel-tatCd-tatCy-Mutanten erhalten werden konnten, zeigt, dass die TatC-Funktion für die Lebensfähigkeit von B. subtilis nicht wesentlich ist, zumindest nicht, wenn die Zellen aerobisch in TY oder minimalem Medium bei 37°C oder anaerobisch im S7-Medium, das mit NaNO₃ (0,2%) und Glycerin (2%) supplementiert ist, bei 37°C gezüchtet werden (Daten nicht gezeigt). Weiter inhibierte die ΔtatCd-ΔtatCy-Doppelmutation nicht die Entwicklung von Kompetenz für die DNA-Bindung und -Aufnahme, die Sporulation und die anschließende Sporenkeimung (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass diese primitiven Entwicklungsprozesse die TatC-Funktion nicht erfordern.
Die Auswirkungen von Einzel- und Doppel-tatC-Mutationen auf die Proteinsekretion über den Tat-Weg wurden unter Verwendung von PhoD als nativem Reporter-Protein untersucht. Zu diesem Zweck wurden tatC-Mutantenstämme unter Bedingungen des Phosphat-Mangels unter Verwendung von LPDM-Medium gezüchtet. Wie durch Western-Blotting gezeigt, war die Sekretion von PhoD in dem ΔtatCd-Mutantenstamm und der ΔtatCd-ΔtatCy-Doppelmutante stark verrin gert, wogegen sie im ΔtatCy-Mutantenstamm nicht beeinflusst oder sogar verbessert wurde (4A). Im Gegensatz wurde die Sekretion der alkalischen Phosphatase PhoB, die von dem Haupt- (Sec-) Weg für die Proteinsekretion abhängt (49), in den tatC-Mutanten von B. subtilis nicht beeinflusst (4B). Bemerkenswerterweise waren in einigen Experimenten sehr geringe Mengen an PhoD im Wachstumsmedium von B. subtilis ΔtatCd nachweisbar (Daten nicht gezeigt), aber niemals in demjenigen von ΔtatCd-ΔtatCy- oder ItatCd-ΔtatCy-Doppelmutanten (4, A und C). Wie mit dem B. subtilis-ItatCd-ΔtatCy-Doppelmutantenstamm beispielhaft aufgezeigt, enthielten die Zellen aller tatC-Mutantenstämme ähnliche Mengen an prePhoD, die mit jenen im Elternstamm 168 vergleichbar waren (4C; Daten nicht gezeigt). Schließlich zeigte die 2D-Gelelektrophorese von Proteinen im Medium von bezüglich Phosphat ausgehungerten Zellen von B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy oder des Elternstamms 168, dass PhoD das einzige Protein ist, dessen Sekretion nachweisbar durch die doppelte tatC-Mutation unter den Bedingungen von Phosphat-Mangel nachweisbar ist (5). Wie erwartet, wurde die Sekretion von Proteinen, denen ein RR-Signalpeptid fehlt, wie der Glycerophosphoryldiester-Phosphodiesterase GlpQ, der Pectat-Lyase Pel, der alkalischen Phosphatasen PhoA und PhoB, des Phosphat-bindenden Proteins PstS, der geringfügeren extrazellulären Serin-Protease Vpr, des PBSX-Prophagen-Proteins XkdE und des Proteins YncM mit unbekannter Funktion, durch die doppelte tatC-Mutation nicht signifikant beeinflusst. Überraschenderweise wurde jedoch die Sekretion des YdhF, eines Proteins mit unbekannter Funktion, das ein potentielles RR-Signalpeptid aufweist (Tabelle I), ebenfalls nicht durch die Unterbrechung von tatCd und tatCy beeinflusst (5). In Einklang mit den obigen Beobachtungen konnten mittels 2D-Gelelektrophorese keine Unterschiede zwischen den zellulären Protein-Genom-Wechselwirkungen von B. subtilis ΔtatCd-ΔtatCy und dem Elternstamm 168 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass in B. subtilis ein aktiver Tat-Weg existiert und dass TatCd eine kritische Rolle bei der Sekretion von PhoD spielt.
Beispiel 3
Expression von tatCd- und tatCy-Genen
Um die Expression der tatCd- und tatCy-Gene zu untersuchen, wurden die transkriptionellen tatCd-lacZ- und tatCy-lacZ-Genfusionen, die in B. subtilis ItatCd und ItatCy vorhanden waren, verwendet.
Enzymaktivitätsassays – Der Assay und die Berechnung von β-Galactosidase-Einheiten (ausgedrückt als Einheiten pro OD600) wurden ausgeführt, wie in Miller, J. H. (1982) Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben. Übernachtkulturen wurden in frischem Medium 100-fach verdünnt und Proben wurden in stündlichen Zeitabständen für OD600-Ablesungen und β-Galactosidase-Aktivitätsbestimmungen entnommen. Die Induktion der Phosphat-Mangel-Reaktion wurde durch alkalische Phosphatase-Aktivitätsbestimmungen überwacht, wie in Hulett et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 735–740, beschrieben.
Wie erwartet, konnte nach einem Mediumwechsel von Medium mit hohem Phosphat-Gehalt (HPDM) zu einem mit niedrigem Phosphat (LPDM), um eine Phosphat-Mangel-Reaktion zu induzieren, in B. subtilis ItatCd eine tatCd-Transkription beobachtet werden. In diesem Stamm wurden relativ niedrige, aber konstante Niveaus von β-Galactosidase-Produktion innerhalb eines Zeitraums von vier Stunden nach dem Wechsel zu LPDM-Medium erreicht, während in dem Ausgangsstamm 168 (keine lacZ-Genfusion vorhanden; Tabelle II) keine β-Galactosidase-Produktion nachweisbar war. Wenn Zellen von B. subtilis ItatCD in minimalem (MM)-, Sporulations (SSM)- oder Trypton/Hefeextrakt (TY)-Medium, von denen keines eine Phosphat-Mangel-Reaktion induziert, kultiviert wurden, war im Gegensatz dazu keine Transkription des tatCd-Gens detektierbar; unter diesen Bedingungen waren die β-Galactosidase-Spiegel in Zellen von B. subtilis ItatCd ähnlich zu jenen des Ausgangsstamms 168. Mit B. subtilis ItatCy wurden vollständig unterschiedliche Ergebnisse erhalten: das tatCy-Gen wurde in allen getesteten Kulturmedien transkribiert und bemerkenswerterweise war die Transkription von tatCy in LPDM-Medium viel höher als jene des tatCd-Gens (Tabelle III). Im Gegensatz zu dem tatCd-Gen wurden die höchsten Niveaus von tatCy-Transkription in MM- und TY-Medium beobachtet, während die niedrigsten Niveaus von tatCy-Transkription in SSM-Medium beobachtet wurden (Tabelle III). Als Schlussfolgerung zeigen diese Feststellungen, dass tatCd nur unter Bedingungen eines Phosphat-Mangels transkribiert wird im Gegensatz zu tatCy das unter allen getesteten Bedingungen transkribiert wird.
Beispiel 4
PhoD wird in E. coli nicht transportiert
Plasmide, Bakterienstämme und Medien – Tabelle 5 führt die verwendeten Plasmide und Bakterienstämme auf. TY-Medium (h-yptone (Trypton)/Hefeextrakt) enthielt Bacto-wiptone (Baktotrypton) (1%), Bakto-Hefeextrakt (0,5%) und NaCl (1%). Für Pulse-Chase-Markierungsexperimente wurde M9-Minimalmedium hergestellt, wie beschrieben (Miller et al. (1992) Suppression of the growth and export defects of an Escherichia coli secA(Ts) mutant by a gene cloned from Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet. 235, 89–96). Sofern erforderlich, wurden Medien mit Ampicillin (100 μg/ml), Kanamycin (40 μg/ml), Chloramphenicol (20 μg/ml), Tetracyclin (12,5 μg/ml), Arabinose (0,2%), Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG; 100 μM), Nigericin (1 μM) und/oder Natriumazid (3 mM) supplementiert. [³⁵S]-Methionin stammte von Hartman Analytic (Braunschweig, Deutschland), [¹⁴C]-markierter Molekulargewichtsmarker von Amersham International (Amersham, Bucks, Vereinigtes Königreich).
DNA-Techniken – Verfahren für die DNA-Reinigung, -Restriktion, -Ligation, Agarosegelelektrophorese und Transformation von E. coli wurden durchgeführt, wie in Sambrook et al. beschrieben. Restriktionsenzyme stammten von MBI Fermentas. Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) wurde mit VENT-DNA-Polymerase (New England Biolabs) ausgeführt.
Um pAR3phoD zu konstruieren, wurde das phoD-Gen einschließlich dessen Ribosomenbindungsstelle aus dem Chromosom des B. subtilis-Stammes 168 durch PCR unter Verwendung des Primers P1 (5'-GAG GAT CCA TGA GGA GAG AGG GGA TCT TGA ATG GCA TAC GAC-3'), welcher eine BamHI-Stelle enthielt, und des Primers P2 (5'-CGA TCC TGC AGG ACC TCA TCG GAT TGC-3'), welcher eine PstI-Stelle enthielt, amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde mit BamHI und PstI geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pAR3 kloniert. Das resultierende Plasmid pAR3phoD ermöglichte die durch Arabinose induzierbare Expression von Wildtyp-phoD in E. coli.
Um eine Genfusion zwischen bla- und phoD-Genen zu konstruieren, wurde keine Signalsequenz aufweisendes phoD unter Verwendung des Primers P3 (5'-GTA GGA TCC GCG CCT AAC TTC TCA AGC-3'), welcher eine BamHI-Stelle enthielt, und des Primers P2, welcher eine PstI-Stelle enthielt, amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde mit BamHI und PstI geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pUC19 kloniert, was zu dem Plasmid pUC19'phoD führte. Als nächstes wurde die 5'-Region von TEM-β-Lactamase, welche deren Signalsequenz codierte, aus dem Plasmid pBR322 durch PCR mit dem Primer B1 (5'-ATA GAA TTC AAA AAG GAA GAG TAT G-3'), welcher eine EcoRI-Stelle enthielt, und dem Primer B2 (5'-CTG GGG ATC CAA AAA CAG GAA GGC-3'), welcher eine BamHI-Stelle enthielt, amplifiziert. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten und in mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen pUC19'phoD inseriert, was zu dem Plasmid pUC19bla-phoD führte. Für eine leichte Selektion von rekombinanten Klonen wurde das Plasmid pOR124, welches ein Tetracyclin-Resistenzgen enthielt, 3' von der bla-phoD-Genfusion unter Verwendung einer einmalig vorkommenden PstI-Stelle inseriert. Aus dem resultierenden Plasmid pUC19bla-phoD-Tc wurde ein EcoRI-BglII-Fragment, welches bla-phoD und das Tetracyclin-Resistenzgen von pOR124 enthielt, isoliert und in mit EcoRI und BamHI geschnittenen pMUTIN2 inseriert. Bei dem Plasmid pMutin2bla-phoD steht die bla-phoD-Genfusion unter der Kontrolle des durch IPTG induzierbaren P_SPAC-Promotors.
Um eine aus der Signalsequenz von phoD und lacZ bestehende Genfusion zu konstruieren, wurde ein DNA-Fragment, welches das Signalpeptid von PhoD und die Translationsstartstelle von phoD codierte, durch PCR mit dem Primer P1, welcher eine BamHI-Stelle enthielt, und dem Primer P4 (5'-GAG AAG GTC GAC GCA GCA TTT ACT TCA AAG GCC CC-3'), welcher eine SalI-Stelle enthielt, amplifiziert und in die entsprechenden Stellen von pOR124 inseriert, was zu dem Plasmid pOR124phoD' führte. Als nächstes wurde das lacZ-Gen, welchem neun 5'-terminale Codons fehlten, unter Verwendung des Primers L1 (5'-ACC GGG TCG ACC GTC GTT TTA CAA CG-3'), welcher eine SalI-Stelle enthielt, und des Primers L2 (5'-GGG AAT TCA TGG CCT GCC CGG TT-3'), welcher eine EcoRI-Stelle enthielt, amplifiziert und nachfolgend in die entsprechenden Stellen von pOR124phoD inseriert. Das resultierende Plasmid pOR124phoD-lacZ wurde mit BamHI linearisiert und in mit BglII geschnittenen pAR3 inseriert. Das resultierende Plasmid pAR3phoD-lacZ ermöglicht die durch Arabinose induzierbare Expression der phoD-lacZ-Genfusion.
Um ein Plasmid zu erhalten, welches eine induzierbare Überexpression von tatA_d tatC_d von B. subtilis vermittelt, wurde die DNA-Region, die diese Gene einschließlich ihrer Ribosomenbindungsstellen enthielt, durch PCR mit dem Primer T1 (5'-CAA GGA TCC CGA ATT AAG GAG TGG-3'), welcher eine BamHI-Stelle enthielt, und dem Primer T2 (5'-GGT CTG CAG CTG CAC TAA GCG GCC GCC-3'), welcher eine PstI-Stelle enthielt, amplifiziert. Das amplifizierte Fragment wurde mit BamHI und PstI geschnitten und in die entsprechenden Stellen von pQE9 (QIAGEN) kloniert, was zu pQE9tatA_d/C_d führte.
Um TG1 ΔtatABCDE zu erhalten, wurden die Plasmide pFAT44 und nachfolgend pFAT126, welche im Leseraster erfolgende Deletionen der E. coli-tatE- bzw. tatABCD-Gene aufwiesen, in das Chromosom von TG1 transferiert, wie beschrieben. Der mutierte Stamm TG1 ΔtatABCDE wurde phänotypisch durch einen Septenbildungs-Phänotyp der mutierten Zellen, Überempfindlichkeit gegen SDS und Resistenz gegenüber P1-Phagen, wie beschrieben (Stanley et al. (2001) Escherichia coli strains blocked in Tat-dependent protein export exhibit pleiotropic defects in the cell envelope. J. Bacteriol. 183, 139–144), verifiziert.
SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse – SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde ausgeführt, wie von Laemmli (Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685) beschrieben. Nach Auftrennung durch SDS-PAGE wurden Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher und Schüll) transferiert, wie von Towbin et al. (Towbin et al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354) beschrieben. Proteine wurden unter Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen PhoD (16), LacZ (5PRIME-3PRIME, Boulder, USA) und SecB (Laborsammlung) und von alkalische Phosphatase-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpern (SIGMA) gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht.
Protein-Chase-Experimente, Immunpräzipitation und Proteinquantifizierung-Pulsmarkierungsexperimente von E. coli-Stämmen wurden ausgeführt, wie bereits früher beschrieben (Mililer et al. (1992) Suppression of the growth and export defects of an Escheitchia coli secA(Ts) mutant by a gene cloned from Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet. 235, 89–96). Kulturen wurden mit 100 μCi [³⁵S]-Methionin pulsmarkiert, mit unmarkiertem Methionin der Chase-Phase unterzogen, und Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen, unverzüglich gefolgt von einer Ausfällung mit Trichloressigsäure (0°C). Nach der Zelllyse wurden Proteine mit spezifischen Antikörpern gegen PhoD (Miller, J. P. und Wagner, M. (1999) Localisation of the cell wall-associated phosphodiesterase PhoD of Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Lett, 180, 287–296) oder β-Lactamase und β-Galactosidase (5PRIME-3PRIME, Boulder, USA) ausgefällt. Relative Radioaktivitätsmengen wurden unter Verwendung eines Phospholmager (Fuji) und der damit kombinierten Bildanalyse-Software PC-BAS abgeschätzt.
In-vivo-Protease-Kartierung – Eine In-vivo-Protease-Kartierung wurde gemäß Kiefer et al. (EMBO J. (1997) 16, 2197–2204) durchgeführt. Für die Sphäroblastenbildung wurden Zellen in TY-Medium bis zur exponentiellen Vermehrung kultiviert. Für die Induktion der Genexpression wurde das Medium mit Arabinose (0,2%) und/oder IPTG (1 mM) 60 min ergänzt. Nach der Sphäroblastenbildung wurden die Zellen mit Proteinase K (SIGMA) behandelt, mit Proteinase K und Triton X-100 behandelt oder blieben unbehandelt. Die Detektion von zytosolischem SecB enthüllte die Proteinase K-Resistenz von nicht mit Triton X-100 behandelten Sphäroblasten.
Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität – Der Assay und die Berechnung von β-Galactosidase-Einheiten (ausgedrückt als Einheiten pro OD₆₀₀) wurden, wie von Miller ((1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) beschrieben, unter Verwendung von 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG, Serva) ausgeführt. Die enzymatische Aktivität des Überstands von mit Lysozym behandelten Sphäroblasten reflektierte den periplasmatischen Raum. Die mit den Sphäroblasten assoziierte Aktivität repräsentierte die zytosolische und an die Zytoplasmamembran gebundene Aktivität.
PhoD wird in E. coli nicht transportiert – Das anfängliche Ziel bestand darin, zu testen, ob PhoD durch den Tat-Weg in E. coli exportiert werden könnte. Zu diesem Zweck stellten wir die dieses Peptid codierende (DNA) unter die Kontrolle des P_BAD-Promotors von Salmonella typhimurium, welcher auf dem Plasmid pAR3 lokalisiert war. Das resultierende Plasmid erlaubte die durch Arabinose induzierbare enzymatisch aktive Produktion von PhoD in E. coli TG1 (Daten nicht gezeigt). Da Phosphodiesterase für die Zellphysiologie von E. coli hochgradig toxisch ist, stoppte die Zellvermehrung unverzüglich nach der Induktion der phoD-Expression. Um den Transport von PhoD in E. coli TG1 (pARphoD) zu quantifizieren, wurden Pulse-Chase-Experimente ausgeführt. Wie in 8 gezeigt, wurde sogar nach 60 min Chase kein Processing des Wildtyp-prePhoD beobachtet, was anzeigt, dass prePhoD durch die E. coli-Tat-Maschinerie nicht transloziert wurde. Die Lokalisierung von PhoD wurde ferner durch In-vivo-Protease-Kartierung lokalisiert. Wie in 8 gezeigt, war prePhoD für Proteinase K auf der Außenseite der zytosolischen Membran nicht zugänglich, was zeigt, dass PhoD in E. coli TG1 (pARphoD) in einer zytosolischen Lokalisierung verbleibt.
PhoD kann über den Sec-abhängigen Proteintranslokationsweg transportiert werden – Das Fehlen eines prePhoD-Processing in E. coli könnte auf eine ineffiziente Erkennung des Signalpeptids von PhoD durch die E. coli-Tat-Maschinerie oder auf die Natur des reifen Teils des PhoD-Peptids zurückzuführen sein. Dieses B. subtilis-Protein könnte unerwartete Faltungseigenschaften oder die Notwendigkeit für Cofaktoren, die in E. coli nicht vorhanden sind, aufweisen. Um diese Frage anzusprechen, wurde die das reife PhoD-Peptid codierende DNA mit der Region fusioniert, welche das Signalpeptid von TEM-β-Lactamase (SP_Bla) codiert. Die resultierende Genfusion wurde in den pMUTIN2-Vektor kloniert, welcher einen IPTG-induzierbaren P_SPAC-Promotor enthielt, was die Synthese des SP_Bla-PhoD-Peptids ermöglichte. Der Transport und das Processing dieses Fusionsproteins wurden durch Immunblotting von Gesamtzellextrakten des E. coli-Stamms TG1 (pMUTIN2bla-phoD) analysiert. Wie in 8A, Bahn 2, gezeigt, wurde SP_Bla PhoD vollständig in ein Protein mit einem Molekulargewicht von reifem PhoD umgewandelt, was den effizienten Transport des Proteins anzeigt. Um den für die SP_Bla-PhoD-Translokation verwendeten Exportweg zu erhellen, wurde der Sec-abhängige Transport selektiv durch die Hinzufügung von Natriumazid (3 mM) gehemmt. Während die Anwesenheit von Natriumazid die Umwandlung von SP_Bla-PhoD zu PhoD vernichtete, verzögerte die Hinzufügung von Nigericin das Processing von SP_Bla-PhoD nicht (8A, Bahnen 3 und 4). Um die Sec-Abhängigkeit des SP_Bla-PhoD-Transports detaillierter zu analysieren, wurde die Expression von bla-phoD in E. coli TG1 (pMUTIN2bla-phoD) in Anwesenheit oder Abwesenheit von Natriumazid induziert, mit [³⁵S]-Methionin pulsmarkiert, und PhoD wurde nachfolgend immunpräzipitiert. 8B zeigt die Kinetik der Umwandlung von SP_Bla-PhoD zu reifem PhoD. Die Anwesenheit von Natriumazid verzögerte die Reifung von SP_Bla-PhoD signifikant (8C). Diese Daten zeigen, dass PhoD in E. coli Sec-abhängig transportiert werden kann. Folglich kann geschlossen werden, dass das Signalpeptid-lose PhoD-Peptid nicht die Exportroute einschlägt und einen effizienten Transport oder ein effizientes Processing nicht verhindert.
Das Signalpeptid von PhoD kann den Transport von LacZ in E. coli-Wildtypzellen nicht vermitteln – Es ist gezeigt worden, dass Signalpeptide, die ein Zwillingsarginin-Motiv enthalten, den Transport von heterologen Proteinen über die Tat-abhängige Translokationsroute vermitteln können (in einer Übersicht dargestellt in Wu et al. (2000) Bacterial twin-arginine signal peptide-dependent protein translocation pathway: evolution and mechanism. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 179–189). Das Signalpeptid der E. coli-TMAO-Reduktase (TorA) ist erfolgreich verwendet worden, um den Tat-abhängigen Transport des thylakoidalen Proteins 23K, der Glucose-Fructose-Oxidoreduktase GFOR von Zymomonas mobilis und des grünen fluoreszierenden Proteins GFP zu vermitteln. Andere Berichte gaben an, dass Tat-Signalpeptide die Spezifität des Tat-abhängigen Transports bestimmen könnten (Wu, a.a.O.). So konnte GFOR in E. coli nicht transloziert werden (28).
Um zu testen, ob das Signalpeptid von PhoD durch die E. coli-Tat-Maschinerie erkannt wird und den Transport eines Proteins in E. coli vermitteln könnte, konstruierten wir eine Genfusion, bestehend aus der die 56 Aminosäurereste des PhoD-Signalpeptids (SP_PhoD) codierenden Region und dem lacZ-Gen, welches β-Galactosidase als Reporter-Protein codiert. Das Genhybrid wurde in das Plasmid pAR3 inseriert, was zu dem Plasmid pAR3phoD-lacZ führte. Eine Induktion der Produktion des SP_PhoD-LacZ-Fusionsproteins in E. coli TG1 führte zu LacZ⁺-Kolonien (Daten nicht gezeigt). Folglich tritt in E. coli eine korrekte Faltung und Tetramerisierung des Peptids als Voraussetzung für dessen Aktivität auf.
Um zu analysieren, ob das Signalpeptid von PhoD eine Translokation von LacZ in eine extrazytosolische Lage vermitteln könnte, wurde die enzymatische Aktivität von LacZ in E. coli TG1 (pAR3phoD-lacZ) überwacht. Wie in Tabelle II gezeigt, verblieb die Hauptmenge der LacZ-Aktivität im Zytosol oder in der zytosolischen Membran. Da ein Fehlen von enzymatischer LacZ-Aktivität ein Ergebnis einer ineffizienten Faltung anstelle eines fehlenden Transports sein könnte, untersuchten wir als nächstes die Lokalisierung von LacZ durch Verwendung einer In-vivo-Protease-Kartierung. Wie in 9A gezeigt, konnte kein Processing von SP_PhoD-LacZ beobachtet werden. Das SP_PhoD-LacZ-Fusionsprotein war in Sphäroblasten einem Proteaseverdau nicht zugänglich. Wenn die Sphäroblasten durch die Hinzufügung von Triton X-100 zerstört wurden, wurde das unprozessierte SP_PhoD-LacZ-Protein Protease-empfindlich (9A, Bahn 3). Die Verlässlichkeit der Methode wurde durch Verwendung des zytosolischen Proteins SecB als interne Kontrolle verifiziert (9A). In Sphäroblasten war SecB gegen Proteinase K resistent, wurde aber nach Solubilisierung der Sphäroblasten mit Triton X-100 verdaut.
Der Export des SP_PhoD-LacZ-Fusionsproteins in E. coli erfordert die Anwesenheit der B. subtilis-TatA_d- und -TatC_d-Transportkomponenten – Die oben gezeigten Daten zeigen an, dass das Tat-System von E. coli den Transport von prePhoD oder des SP_PhoD-lacZ-Fusionsproteins nicht vermittelt. Das Fehlen einer Translokation könnte auf die Notwendigkeit von zusätzlichen Komponenten für die Translokation von PhoD, die nur in B. subtilis vorhanden sind, oder auf die Spezifität der Erkennung von PhoD als einem Tat-abhängigen Substrat zurückzuführen sein. Unsere frühere Beobachtung, dass nur das TatC_d-Protein, nicht aber die zweite Kopie von TatC den Tat-abhängigen Transport in B. subtilis vermitteln konnte, war ein erster Hinweis auf eine spezifische Erkennung von prePhoD. Um diese Hypothese zu testen, wurde das B. subtilis-tatA_d/C_d-Genpaar ausgehend von dem Chromosom von B. subtilis amplifiziert und unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren Promotors von pQE9 (QIAGEN) inseriert. Mit dem resultierenden Plasmid pQE9tatA_d/C_d und dem Repressorplasmid pREP4 wurden E. coli TG1 (pARphoD) und TG1 (pARphoD-lacZ) transformiert.
Um die Wirkung von TatA_d/C_d-Proteinen auf die Lokalisation von PhoD zu untersuchen, wurde die Expression von phoD wie auch von tatA_d/C_d in dem Stamm TG1 (pARphoD, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) mit Arabinose und IPTG induziert. Unerwarteterweise konnte in dem Stamm TG1 (pARphoD, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) unter Verwendung von Western-Blotting kein PhoD detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Eine Induktion von TatA_d/C_d-Proteinen in dem Stamm TG1 (pARphoD, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) führte zu einer stabilen Coproduktion von TatA_d/C_d-Proteinen und dem SP_PhoD-LacZ-Fusionsprotein (Daten nicht gezeigt). Das SP_PhoD-LacZ-Processing wurde in Abwesenheit und Abwesenheit von TatA_d/C_d unter Verwendung einer Pulse-Chase-Markierung und nachfolgenden Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern gegen LacZ analysiert. Während in TG1 (pARphoD'-LacZ) kein Processing von SP_PhoD-LacZ beobachtet werden konnte (10A), wurde das Peptid in dem Stamm TG1 (pARphoD, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) wenigstens teilweise prozessiert (10B).
Da das Processing des Translokationsprodukts ein Anzeichen für eine Membrantranslokation darstellt, aber nicht notwendigerweise beweist, dass ein Export des Proteins stattgefunden hat, untersuchten wir, ob LacZ in dem periplasmatischen Raum in TG1 (pARphoD, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) lokalisiert sein konnte. Wie in Tabelle II gezeigt, war die relative Menge von periplasmatischer LacZ-Aktivität im Vergleich zu TG1 (pARphoD'-lacZ) signifikant erhöht. Überraschender war die relative Aktivität von LacZ in dem tatA_d/C_d exprimierenden Stamm viel geringer im Vergleich zu jener von TG1 (pARphoD'-lacZ). Um die Lokalisierung des LacZ-Peptids zu überwachen, wurden Zellen des Stamms TG1 (pARphoD, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) in Sphäroblasten umgewandelt und mit Proteinase K behandelt. Wie in 10B gezeigt, war bei einer Coexpression von tatA_d/C_d das SP_PhoD-LacZ-Fusionsprotein einem Proteaseverdau in Sphäroblasten vollständig zugänglich. Die Resistenz von SecB gegenüber dem proteolytischen Verdau bestätigt die Verlässlichkeit der Methode. Unerwarteterweise waren sowohl die prozessierte Form als auch die Vorstufe des Fusionsproteins der Proteasebehandlung zugänglich. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass das SP_PhoD-LacZ-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum von E. coli transportiert wird, wenn die B. subtilis-tatA_d/C_d-Gene coexprimiert werden.
Der TatA_d/C_d-vermittelte Transport von SP_PhoD-LacZ erfordert einen delta pH-abhängigen Gradienten an der zytosolischen Membran und ist Sec-unabhängig – Um direkt zu beweisen, dass die Membrantranslokation des Systems von dem pH-Gradienten durch die zytosolische Membran hindurch abhängig ist, wurden Sec- und Tat-abhängige Proteintranslokationswege selektiv blockiert. Nigericin, ein Ionophor, welcher die Tat-abhängige Proteintranslokation als Ergebnis einer Zerstörung des Membranpotentials hemmt (29), blockierte effizient beides, Processing und Translokation von SP_PhoD-LacZ in TG1 (pARphoD'-lacZ, pREP4, pQE9tatA_d/C_d) (11A). Natriumazid (3 mM), welches den Sec-abhängigen Proteinexport starkt hemmt, indem es mit der Translokations-ATPase-Aktivität des SecA-Proteins interferiert (30), beeinflusste die Lokalisation und das Processing des SP_PhoD-LacZ-Fusionsproteins in diesem Stamm nicht, wie in 11B gezeigt.
Der TatA_d/C_d-vermittelte Transport von SP_PhoD-LacZ wird durch E. coli-Tat-Komponenten nicht unterstützt – Trotz der obigen Beobachtungen kann nicht ausgeschlossen werden, dass die E. coli-Tat-Maschinerie bei dem TatA_d/C_d-vermittelten Transport von SP_PhoD-LacZ nicht unterstützend tätig wird. Die E. coli-tat-Gene werden in E. coli konstitutiv exprimiert und bilden dementsprechend eine funktionale konstitutive Translokase-Einheit (Jack et al. (2001) Constitutive expression of Escherichia coli tat genes indicates an important role for the twin-arginine translocase during aerobic and anaerobic growth, J. Bacteriol. 183, 1801–1804). Um eine kooperative Wirkung von B. subtilis- und E. coli-Tat-Proteinen auszuschließen, wurden in dem E. coli-Stamm TG1 die tatABCDE-Gene deletiert, und dieser wurde nachfolgend mit den Plasmiden pARphoD'-LacZ, pREP4 und pQE9tatA_d/C_d transformiert. Processing und Lokalisation des SP_PhoD-LacZ-Fusionsproteins wurden unter identischen Bedingungen, wie für den E. coli-tat+-Stamm beschrieben, analysiert. Trotz der Tatsache, dass die Gesamtmenge von in der periplasmatischen Fraktion gefundenem LacZ im Vergleich zu dem E. coli-tat-Wildtypstamm, welcher phoD'-LacZ und tatA_d/C_d exprimierte, verringert war, war die relative Menge von periplasmatischem LacZ im Vergleich zu TG1 (pARphoD'-LacZ) signifikant erhöht (Tabelle II). Wie in 12 gezeigt, war in Abwesenheit der E. coli-tatABCDE-Gene die Hauptmenge des hybriden SP_PhoD-LacZ-Proteins für die Protease zugänglich, was die extrazytosolische Lokalisation von SP_PhoD-LacZ zeigt. Die Resistenz von SecB gegen den proteolytischen Verdau zeigte die Stabilität der Sphäroblasten (13). Überraschender konnte kein Processing des SP_PhoD-LacZ-Fusionsproteins in Abwesenheit von tatABCDE beobachtet werden. Zusammengenommen können die B. subtilis-Tat-Komponenten TatAd/Cd die Translokation des hybriden Peptids, bestehend aus dem Signalpeptid mit dem Zwilingsarginin-Motiv von PhoD und LacZ, vermitteln.
Obwohl die vorangegangene Erfindung relativ detailliert durch Erläuterungen und Beispiele für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben worden ist, wird offensichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche vorgenommen werden können. Tabelle I: Vorhergesagte Signalpeptide von B. subtilis mit Zwillingsarginin-Motiv*

* Mutmaßliche Signalpeptide mit Zwillingsarginin-Motiv wurden auf zwei Weisen identifiziert. Erstens wurde die Anwesenheit der Consensus-Sequenz R-R-X-ϕ-ϕ (ϕ ist ein hydrophober Rest) unmittelbar vor einer aminoterminalen hydrophoben Region, wie vorhergesagt mittels des TopPred2-Algorithmus (34,35), bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die ersten 60 Reste aller eingetragenen Proteine von B. subtilis in der SubtiList-Datenbank (http://bioweb.pasteur.fr/Genolist/Subtilist.html) verwendet. Zweitens wurden innerhalb der Gruppe von Membran-„Sorting"-Signalen mit Zwillingsarginin-Motiv abspaltbare Signalpeptide mittels des SignalP-Algorithmus (61,62) identifiziert. Konservierte Reste der Consensus-Sequenz mit Zwillingsarginin-Motiv (R-R-X-ϕ-ϕ) sind fettgedruckt angegeben. Zusätzlich sind positiv geladene Reste, die als ein so genanntes Sec-Vermeidungssignal („Sec-avoidance signal") wirken könnten (54), fettgedruckt und kursiv angegeben. Die hydrophobe H-Domäne ist in grauer Schattierung angegeben. In Signalpeptiden mit einer vorhergesagten Signalpeptidase I-Spaltstelle sind Reste von Position –3 bis –1 bezogen auf die Signalpeptidase I-Spaltstelle unterstrichen. Bemerkenswerterweise enthalten einige von diesen Proteinen ein oder mehrere mutmaßliche Transmembransegmente anderswo in dem Protein (angegeben mit „TM") oder sind mutmaßliche Lipoproteine. Reste, die eine so genannte Lipobox für eine Signalpeptidase II-Spaltung bilden, sind vergrößert angegeben.

₆₀₀

* Um die Transkription der tatCd- und tatCy-Gene zu untersuchen, wurden Zellen von B. subtilis ItatCd (tatCd-lacZ), ItatCy (tatCy-lacZ) oder des Ausgangsstamms 168 (keine lacZ-Genfusion) 10 h in LPDM-, MM-, SSM- oder TY-Medium nach Verdünnung ausgehend von einer Übernachtkultur kultiviert. Proben für β-Galactosidase-Aktivitätsbestimmungen wurden in stündlichen Zeitabständen beginnend 4 h nach der Verdünnung ausgehend von der Übernachtkultur entnommen. Da die β-Galactosidase-Aktivitäten während des gesamten Zeitraums der Probennahme geringe Schwankungen zeigten, wurden Durchschnittswerte bestimmt. Die Zahlen in der Tabelle repräsentieren Durchschnittswerte aus 3 unterschiedlichen Experimenten. Es ist anzumerken, dass für die Übernachtkultur von Zellen, die in LPDM-Medium kultiviert wurden, HPDM-Medium verwendet wurde, wohingegen Übernachtkulturen von Zellen, die in MM-, SSM- oder TY-Medium kultiviert wurden, mit den jeweiligen Medien hergestellt wurden.

* Homologe von B. subtilis-PhoD wurden anhand von Aminosäuresequenzähnlichkeitsrecherchen in GenBank unter Verwendung des BLAST-Algorithmus identifiziert. SP1 (Sco), Gen SCC75A,32c von Streptomyces coelicolor (CAB61732); SP2 (Sco), Gen SCF43A.18 von S. coelicolor (CAB48905); SP3 (Sco), Gen SC4G6.37 von S. coelicolor (CAB51460) und SP4, phoD-Gen von Streptomyces tendae (CAB62565). Die GenBank-Aufnahmenummern sind in Klammem angegeben. Konservierte Reste der Consensus-Sequenz mit Zwillingsarginin-Motiv sind fettgedruckt angegeben. Die hydrophobe H-Region ist grau schattiert angegeben. Signalpeptidase I-Erkennungssequenzen, die mittels des SignalP-Algorithmus (61, 62) vorhergesagt werden, sind unterstrichen.

^a Cm^r, Chloramphenicolresistenzmarker; AP^r, Ampicillinresistenzmarker; Km^r, Kanamycinresistenzmarker; Tc^r, Tetracyclinresistenzmarker; Em^r, Erythromycinresistenzmarker

Tabelle 6 – Lokalisierung von Q-Galactosidase-Aktivität in E. coli TG1 (pAR3phoD-lacZ)-Stämmen.
Um die Translokation des aus SP_PhoD und LacZ bestehenden hybriden Proteins zu untersuchen, wurden Zellen von E. coli-Stämmen in TY-Medium bis zu exponentieller Vermehrung kultiviert. Proben für β-Galactosidase-Aktivitätsbestimmungen wurden aus Überständen von mit Lysozym behandelten Zellen, die die periplasmatische Aktivität repräsentieren, und aus Sphäroblasten, welche die zellgebundene Aktivität repräsentieren, entnommen. Die Experimente wurden mit doppelt erstellten Kulturen ausgeführt. +/–, Standardabweichung.

Claims

Verfahren zur Produktion eines heterologen Polypeptids in Bakterien, umfassend: (a) Kultivieren von Bakterienzellen, die (i) funktionale B. subtilis TatCd- und -TatA-Gene besitzen; (ii) kein funktionales B. subtilis-TatCy-Gen aufweisen; und (iii) einen rekombinanten Expressionsvektor enthalten, welcher eine erste DNA-Sequenz umfasst, die eine PhoD-Signalsequenz codiert, welche operativ mit einer zweiten DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein heterologes Polypeptid codiert, derart, dass das heterologe Polypeptid durch die Zellen produziert wird; und (b) Gewinnen des heterologen Polypeptids aus dem Periplasma oder dem Kulturmedium.
Verfahren zur Produktion eines heterologen Polypeptids in Bakterien, umfassend: (a) Kultivieren von Bakterienzellen, die (i) B. subtilis-TatCd- und -TatA-Gene relativ zu anderen Komponenten des B. subtilis Zwillingsarginin-Sekretionswegs überexprimieren und (ii) einen rekombinanten Expressionsvektor enthalten, welcher eine erste DNA-Sequenz umfasst, die eine PhoD-Signalsequenz codiert, welche operativ mit einer zweiten DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein heterologes Polypeptid codiert, derart, dass das heterologe Polypeptid von den Zellen produziert wird; und (b) Gewinnen des heterologen Polypeptids aus dem Periplasma oder dem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem das TatA-Gen TatAd ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die Bakterienzellen Gram-positive Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 4, in dem die Bakterienzellen Bacillus sind.
Verfahren nach Anspruch 5, in dem die Bakterienzellen B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alcalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die Bakterienzellen Gram-negative Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 7, in dem die Bakterienzellen Pantoaea oder E. coli sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in dem das heterologe Polypeptid ein Enzym, Wachstumsfaktor oder Hormon ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in dem das heterologe Polypeptid nicht natürlich mit einem Sekretions-Signalpeptid assoziiert ist.