DE60114804T2

DE60114804T2 - Konstruierte fluoreszenzproteine mit langen wellenlängen

Info

Publication number: DE60114804T2
Application number: DE60114804T
Authority: DE
Inventors: Rebekka Wachter; James S. Remington
Original assignee: University of Oregon; Oregon State Board of Higher Education; Oregon State
Current assignee: University of Oregon; Oregon State Board of Higher Education; Oregon State
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: DK1285065T3; US6593135B2; US20100145024A1; DE60114804D1; WO2001090147A3; US20030013149A1; CA2408302C; US20110275107A1; US20040014128A1; CA2408302A1; JP4427222B2; WO2001090147A2; ES2253384T3; AU2001263269A1; JP2004502410A; EP1285065B1; ATE309356T1; EP1285065A2; US7544776B2; US8263412B2

Description

Fluoreszenzmoleküle sind als Reportermoleküle in vielen Testsystemen aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Einfachheit einer Quantifizierung attraktiv. In jüngerer Zeit waren Fluoreszenzproteine das Ziel großen Interesses aufgrund dessen, dass sie in vivo von biologischen Systemen produziert werden können und verwendet werden können, um intrazelluläre Ereignisse zu verfolgen, ohne die Notwendigkeit in die Zelle über Mikroinjektion oder Permeabilisierung eingebracht zu werden. Das grüne Fluoreszenzprotein von Aequorea victoria ist insbesondere als Fluoreszenzprotein interessant. Eine cDNA für das Protein wurde kloniert (D.C. Prasher et al., "Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent Protein", Gene (1992) 111:229-33). Es kann nicht nur die primäre Aminosäuresequenz des Proteins von der cDNA exprimiert werden, sondern das exprimierte Protein kann auch fluoreszieren. Dies zeigt, dass das Protein die Zyklisierung und Oxidation durchlaufen kann, von der angenommen wird, dass sie für eine Fluoreszenz notwendig ist. Das grüne Fluoreszenzprotein ("GFP") von Aequorea ist eine stabile, gegenüber Proteolyse resistente einzelne Kette aus 238 Resten und weist zwei Absorptionsmaxima bei etwa 395 und 475 nm auf. Die relativen Amplituden dieser zwei Peaks sind gegenüber äußeren Faktoren (W.W. Ward, Bioluminescence and Chemiluminescence (M.A. DeLuca und W.D. McElroy, Herausgeber) Academic Press S. 235-242 (1981), W.W. Ward & S.H. Bokman, Biochemistry 21:4535-4540 (1982), W.W. Ward et al., Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982)) und gegenüber der Bestrahlungsgeschichte empfindlich (A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995)), was vermutlich zwei oder mehrere Grundzustände widerspiegelt. Eine Anregung bei dem primären Absorptionspeak von 395 nm ergibt ein Emissionsmaximum bei 508 nm mit einer Quantumausbeute von 0,72-0,85 (O. Shimomura und F.H. Johnson, J. Cell. Comp. Physiol. 59:223 (1962), J.G. Morin und J.W. Hastings, J. Cell. Physiol. 77:313 (1971), H. Morise et al., Biochemistry 13:2656 (1974), W.W. Ward, Photochem. Photobiol. Reviews (Smith, K.C. Hrsg.) 4:1 (1979), A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995), D.C. Prasher, Trends Genet. 11:320-323 (1995), M. Chalfie, Photochem. Photobiol. 62:651-656 (1995), W.W. Ward, Bioluminescence and Chemiluminescence (M.A. DeLuca und W.D. McElroy, Herausgeber) Academic Press S. 235-242 (1981), W.W. Ward & S.H. Bokman, Biochemistry 21:4535-4540 (1982), W.W. Ward et al., Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982)). Das Fluorophor resultiert aus der autokatalytischen Zyklisierung des Polypeptid-Rückgrats zwischen den Resten Ser⁶⁵ und Gly⁶⁷ und der Oxidation der β-Bindung von Tyr⁶⁶ (A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995), C.W. Cody et al., Biochemistry 32:1212-1218 (1993), R. Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504 (1994)). Eine Mutation von Ser⁶⁵ zu Thr (S65T) vereinfacht das Exzitationsspektrum zu einem einzelnen Peak bei 488 nm mit einer verstärkten Amplitude (R. Heim et al., Nature 373:664-665 (1995)), das nicht mehr Anzeichen von Konformationsisomeren aufweist (A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995)).
Fluoreszenzproteine wurden als Marker für eine Genexpression, Tracer für eine Abstammung von Zellen und als Fusionstags für eine Überwachung der Proteinlokalisation innerhalb von lebenden Zellen verwendet (M. Chalfie et al., "Green fluorescent protein as a marker for gene expression", Science 263:802-805, A.B. Cubitt et al., "Understanding, improving and using green fluorescent proteins", TIBS 20, November 1995, S. 448-455, US-PS 5,491,084, M. Chalfie und D. Prasher). Ferner wurden veränderte Versionen des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea identifiziert, die veränderte Fluoreszenzcharakteristika, einschließlich veränderter Exzitations- und Emissionsmaxima, sowie Exzitations- und Emissionsspektren mit verschiedenen Formen aufweisen (R. Heim et al., "Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994) 91:12501-04, R. Heim et al., "Improved green fluorescence", Nature (1995) 373:663-665).
Eine zweite Klasse von Anwendungen beruht auf dem GFP als einem spezifischen Indikator einer gewissen zellulären Eigenschaft und hängen somit von den bestimmten spektralen Charakteristika der verwendeten Variante ab. Bezüglich jüngerer Übersichtsartikel über GFP-Varianten und deren Anwendungen vergleiche Palm & Wlodawer, 1999; Tsien, 1998 und bezüglich einer Übersicht über spezielle Anwendungen vergleiche Sullivan & Kay, 1999. Biosensoranwendungen umfassen die Verwendung von unterschiedlich gefärbten GFPs für einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), um Protein-Protein-Interaktionen (Heim, 1999) oder Ca²⁺-Konzentrationen (Miyawaki et al., 1999) zu überwachen, und Rezeptorinsertionen innerhalb von GFP-Oberflächenschleifen, um eine Ligandbindung zu überwachen (Baird et al., 1999, Doi & Yanagawa, 1999).
Die Fluoreszenzemission einer Reihe von Varianten ist gegenüber der Acidität der Umgebung hochgradig empfindlich (Elsliger et al., 1999, Wachter et al., 1998). Somit war eine besonders erfolgreiche Anwendung des grünen Fluoreszenzproteins (GFP) als ein visueller Reporter in lebenden Zellen die Bestimmung des pH-Werts in Organellen oder im Cytosol (Kneen et al., 1998, Llopis et al., 1998, Miesenbock et al., 1998, Robey et al., 1998). Es stellte sich heraus, dass die zwei Chromophoren-Ladungszustände mit der pH-Sensitivität des intakten Proteins in Beziehung stehen und sie wurden kristallographisch hinsichtlich konformeller Veränderungen in der Nähe des phenolischen Endes (Elsliger et al., 1999) und spektroskopisch unter Verwendung von Raman-Untersuchungen (Bell et al., 2000) charakterisiert. Die neutrale Form des Chromophors, Bande A, absorbiert bei etwa 400 nm in den meisten Varianten, während das Chromophor-Anion, bei dem das phenolische Ende deprotoniert ist (Bande B), im blauen bis grünen Bereich absorbiert, abhängig von den speziellen Mutationen in der Nähe des Chromophors. WT-GFP zeigt spektrale Charakteristika, die mit zwei Grundzuständen konsistent sind, die durch eine Kombination der Banden A und B charakterisiert sind, wobei das Verhältnis zwischen einem pH-Wert von 6 und 10 verhältnismäßig unvariabel ist (Palm & Wlodawer, 1999, Ward et al., 1982). Es wurde vorgeschlagen, dass ein inneres Gleichgewicht besteht, bei dem ein Proton zwischen dem Chromophor-Phenolat und dem Carboxylat von Glu222 über einen breiten pH-Bereich geteilt wird (Brejc et al., 1997, Palm et al., 1997). Jüngere elektrostatische Berechnungen stützten dieses Modell (Scharnagl et al., 1999) und bestimmen den theoretischen pK_a-Wert für eine vollständige Deprotonierung des Chromophors auf etwa 13, was mit der Feststellung einer Verdopplung der Emissionsintensität bei einem pH-Wert von 11 bis 12 konsistent ist (Bokman & Ward, 1981, Palm & Wlodawer, 1999).
Im Gegensatz zu WT-GFP titriert der Chromophor der meisten Varianten mit einem einzelnen pK_a-Wert. Die Farbemission und der pK_a-Wert des Chromophors werden stark durch die Umgebung des Proteins moduliert (Llopis et al., 1998). Glu222 ist unter GFP-Homologen vollständig konserviert (Matz et al., 1999) und seine Substitution durch ein Glutamin verringert drastisch die Wirksamkeit einer Bildung des Chromophors (Elsliger et al., 1999). Eine Protonierung von Glu222 in S65T und in GFPs mit der T203Y-Mutation (YFPs) ist im Allgemeinen vermutlich für eine Senkung des pK_a-Werts des Chromophors von dem des WT auf etwa 5,9 in GFP S65T (Elsliger et al., 1999, Kneen et al., 1998) und 5,2-5,4 in YFP (GFP S65G/V68L/S72A/T203Y) (Ormv et al., 1996, Wachter & Remington, 1999) ver antwortlich. Bei den YFPs ist vermutlich die kristallographisch identifizierte Stapel-Wechselwirkung des Chromophors mit Tyr203 größtenteils für die spektrale Rot-Verschiebung verantwortlich (Wachter et al., 1998). Eine gelbe Variante des grünen Fluoreszenzproteins zu Halogeniden und Nitraten ist von R.M. Wachter und S.J. Remington beschrieben (Current Biology, Band 9, Nr. 17, 1999, Seiten R628-R629).
Im Gegensatz zu anderen Varianten haben wir festgestellt, dass der pK_a-Wert des YFP-Chromophors eine starke Abhängigkeit von der Konzentration bestimmter kleiner Anionen wie Chlorid zeigt (Wachter & Remington, 1999), und dass sich der pK_a-Wert von etwa 5,2 auf 7,0 in Gegenwart von 140 mM NaCl erhöht (Elsliger et al., 1999). Diese Sensitivität kann ausgenutzt werden, um die Schaffung neuer GFPs als Biosensoren zu ermöglichen, um Ionen zu messen, die sowohl im Cytoplasma als auch in zellulären Kompartirnenten (Wachter & Remington, 1999) in lebenden Zellen vorliegen. Die Erfindung umfasst die Schaffung und Verwendung neuer GFP-Varianten, die die Fluoreszenzmessung einer Vielzahl von Ionen, einschließlich Halogeniden wie Chlorid und Iodid, ermöglichen. Diese Eigenschaften steuern Variabilität und Verwendbarkeit zu dem Arsenal von biologisch basierten Fluoreszenzindikatoren bei. Es besteht ein Bedarf für veränderte Fluoreszenzproteine mit veränderten Fluoreszenzeigenschaften und mit der Fähigkeit, auf Ionenkonzentrationen mittels einer Veränderung der Fluoreszenzeigenschaften zu reagieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A-1B. (A) Schematische Darstellung des Rückgrats von GFP, produziert von Molscript (J.P. Kráulis, J. Appl. Cryst., 24:946 (1991)). Der Chromophor ist als ein Kugel-Stab-Modell gezeigt. (B) Schematische Darstellung der Gesamtstruktur von GFP. Ungefähre Nummern der Reste markieren den Anfang und das Ende der sekundären Strukturelemente.
2A-2C. (A) Stereodarstellung des Chromophors und von Resten in unmittelbarer Nähe. Kohlenstoffatome sind als offene Kreise dargestellt, Sauerstoffatome sind ausgefüllt und Stickstoffatome sind schattiert. Lösungsmittelmoleküle sind als isolierte ausgefüllte Kreise gezeigt. (B) Teil der finalen 2F_o-F_c-Elektronendichtekarte, die bei 1,0 o fassoniert ist, was die Elektronendichte zeigt, die den Chromophor umgibt. (C) Schematische Darstellung, die die ersten und zweiten Sphären einer Koordinierung des Chromophors zeigt. Wasserstoffbindungen sind als gestrichelte Linien gezeigt und weisen die angegebenen Längen in A auf. Eingeschobenes Bild: Vorgeschlagene Struktur der Carbinolamin-Zwischenverbindung, die vermutlich während einer Bildung des Chromophors gebildet wird.
3 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:1) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea.
4A-B zeigen die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:3) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:4) des veränderten Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteins S65G/S72A/T203Y, wobei bevorzugte Säugercodons und eine optimale Kozak-Sequenz verwendet werden.
5A bis 5AT zeigen die Koordinaten für die Kristallstruktur des Aequorea bezogenen grünen Fluoreszenzproteins S65T.
6 zeigt die Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren für die veränderten Fluoreszenzproteine 20A und 10C (Tabelle F). Die vertikale Linie bei 528 nm vergleicht die Emissionsmaxima von 10C, links der Linie und 20A, rechts der Linie.
7 zeigt Absorptions-Scans von YFP bei einer variablen NaCl-Konzentration und bei einem konstanten pH-Wert von 6,4, der mit 20 mM MES abgepuffert ist (-O- mM NaCl, -∇- 15 mM NaCl, -☐- 50 mM NaCl, -♢- 100 mM NaCl und -Δ- 400 mM NaCl). Bande A entspricht der neutralen Form des Chromophors (λ_max 392 nm) und Bande B entspricht dem Anion des Chromophors (λ_max 514 nm).
8 zeigt eine normalisierte Fluoreszenzemission von (a) YFP und (b) YFP-H148Q als eine Funktion des pH-Werts und der [CI-]-Konzentration bei einer konstanten Ionenstärke von 150 mM. Der pH-Wert wurde mit 20 mM TAPS, pH 8,0 (O), 20 mM HEPES, pH 7,5 (Δ), 20 mM PIPES, pH 7,0 (♢) und 20 mM MES, pH 6,5 (∇) und pH 6,0 ( ) gesteuert. 8(b) umfasst auch die Fluoreszenzemission von YFP-H148Q als eine Funktion der [I-]-Konzentration bei pH 7,5 (*). Kaliumchlorid (oder -iodid) wurde in der angegebenen Konzentration zugegeben und die Ionenstärke wurde auf 150 mM mit Kaliumglukonat eingestellt. Die Proben mit etwa 0,01 mg/ml Protein wurden bei 514 nm angeregt und die Emissionsintensität wurde bei 528 nm bestimmt.
9 zeigt eine Stereoansicht der 2F_o-F_c-Elektronendichtekarte des YFP-H 148Q-Chromophors, von Tyr203, Arg96, Gln69 und dem verborgenen Iodid nach Verfei nerung. Die 2,1 Å-Auflösungskarte wurde bei einer Standardabweichung von +1 fassoniert. Diese Figur wurde durch das Programm BOBSCRIPT gezeichnet.
10 zeigt eine schematische Darstellung mit allen Resten, die Atome innerhalb von 5 Å des verborgenen Iodids in der Kristallstruktur von YFP-H148Q enthalten (Iodid-Tränkung).
11 zeigt eine Stereoansicht eine Überlagerung einer Untergruppe von Resten, die die Anionen-Bindehöhle von YFP-H148Q auskleiden, mit und ohne Iodid (Iodidgebundene Struktur, grau; Apo-Struktur, schwarz). Das Iodid ist durch den zentralen Kreis dargestellt. Diese Figur wurde durch das Programm MOLSCRIPT gezeichnet (Kraulis, 1991).
12 zeigt eine schematische Darstellung der unmittelbaren Umgebung des Chromophors von YFP-H148Q in der (a) Apo-Struktur und (b) Iodid-gebundenen Struktur.
13 zeigt eine Stereoansicht der Lösungsmittel-zugänglichen Oberfläche der Iodid-gebundenen YFP-H148Q-Struktur, die unter Verwendung eines 1,4 Å-Sondenradius berechnet wurde. Die Oberfläche wurde nach Entfernen aller Wassermoleküle und des Iodids berechnet. Der Chromophor und alle Oberflächensegmente, die mit dem Chromophor in Kontakt stehen, sind auch gezeigt. Die äußere Oberfläche des Proteins verläuft entlang der linken Kante der Figur. Diese Figur wurde unter Verwendung des Programms MidasPlus^TM (UCSF, 1994) erstellt.
14 zeigt die Rückgrat-Atomstruktur der β-Stränge 7 und 8 von YFP, der Apo-Struktur von YFP-H148Q und der Iodid-gebundenen Struktur von YFP-H148Q. Die Seitenkette von His148 (YFP) und Gln148 (YFP-H148Q) und wenige Wassermoleküle sind auch dargestellt. Die gestrichelten Linien stellen mögliche Wasserstoffbindungen dar.
15 zeigt den pK_a-Wert des YFP-Chromophors als eine Funktion der Halogenidkonzentration (-♢-Fluorid, -∇-Iodid, -Δ-Chlorid, -O-Bromid). Der pK_a-Wert des Chromophors wurde aus Absorptions-Scans bei veränderlichen Halogenidkonzentrationen abgeschätzt (vgl. Materialien und Methoden). Es erfolgte eine Kurvenanpassung der Daten an die Gleichung 1 (vergleiche Text).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden funktionelle veränderte Fluoreszenzproteine mit veränderten Fluoreszenzcharakteristika bereitgestellt, die leicht von gegenwärtig bestehenden grünen und blauen Fluoreszenzproteinen unterschieden werden können. Solche veränderten Fluoreszenzproteine ermöglichen die gleichzeitige Messung von zwei oder mehreren Vorgängen in Zellen und können als Fluoreszenzenergiedonoren oder -akzeptoren sowie Biosensoren für einen Nachweis von Anionen verwendet werden. Veränderte Fluoreszenzproteine mit längeren Wellenlängen sind besonders geeignet, da eine photodynamische Toxizität und Autofluoreszenz von Zellen signifikant bei längeren Wellenlängen vermindert sind. Insbesondere führt das Einbringen der Substitution T203X, worin X eine aromatische Aminosäure ist, zu einer Erhöhung der Exzitations- und Emissionswellenlängenmaxima von Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteinen.
In einem Aspekt wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, dass eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution unterscheidet, die nicht mehr als etwa 0,5 nm von dem Chromophor des veränderten Fluoreszenzproteins entfernt liegt, wobei die Substitution die elektronische Umgebung des Chromophors verändert, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea verschiedene Fluoreszenzeigenschaft aufweist.
In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist, und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Substitution bei T203 und insbesondere T203X unterscheidet, wobei X eine aromatische Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus H, Y, W oder F, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist. In einer Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Substitution bei 565, wobei die Substitution ausgewählt ist aus S65G, S65T, S65A, S65L, S65C, S65V und S65I. In einer weiteren Ausfüh rungsform unterscheidet sich die Aminosäuresequenz um nicht mehr als die Substitutionen S65T/T203H, S65T/T203Y, S72A/F64L/S65G/T203Y, S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y, S72A/S65G/V68L/T203Y, S65G/S72A/T203Y oder S65G/S72A/T203W. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Substitution bei Y66, wobei die Substitution ausgewählt ist aus Y66H, Y66F und Y66W. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Mutation aus Tabelle A. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Faltungsmutation. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich die Nukleotidsequenz, die für das Protein kodiert, von der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 durch die Substitution von mindestens einem Codon durch ein bevorzugtes Säugercodon. In einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül ein Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein ein interessierendes Polypeptid und das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution bei L42, V61, T62, V68, Q69, Q94, N121, Y145, H148, V150, F165, I167, Q183, N185, L220, E222 (nicht E222G) oder V224 unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist. In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresubstitution wie folgt:
L42X, worin X ausgewählt ist aus C, F, H, W und Y,
V61X, worin X ausgewählt ist aus F, Y, H und C,
T62X, worin X ausgewählt ist aus A, V, F, S, D, N, Q, Y, H und C,
V68X, worin X ausgewählt ist aus F, Y und H,
Q69X, worin X ausgewählt ist aus K, R, E und G,
Q94X, worin X ausgewählt ist aus D, E, H, K und N,
N121X, worin X ausgewählt ist aus F, H, W und Y,
Y145X, worin X ausgewählt ist aus W, C, F, L, E, H, K und Q,
H148X, worin X ausgewählt ist aus F, Y, N, K, Q und R,
V150X, worin X ausgewählt ist aus F, Y und H,
F165X, worin X ausgewählt ist aus H, Q, W und Y,
I167X, worin X ausgewählt ist aus F, Y und H,
Q183X, worin X ausgewählt ist aus H, Y, E und K,
N185X, worin X ausgewählt ist aus D, E, H, K und Q,
L220X, worin X ausgewählt ist aus H, N, Q und T,
E222X, worin X ausgewählt ist aus N und Q, oder
V224X, worin X ausgewählt ist aus H, N, Q, T, F, W und Y.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Expressionsvektor bereitgestellt, der Expressionskontrollsequenzen umfasst, die operativ mit einem jeglichen der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle verbunden sind. In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine rekombinante Wirtszelle bereitgestellt, die den vorstehend beschriebenen Expressionsvektor umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein bereitgestellt, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution unterscheidet, die nicht mehr als etwa 0,5 nm von dem Chromophor des veränderten Fluoreszenzproteins entfernt liegt, wobei die Substitution die elektronische Umgebung des Chromophors verändert, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein bereitgestellt, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens die Aminosäuresubstitution bei T203 und insbesondere T203X unterscheidet, wobei X eine aromatische Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus H, Y, W oder F, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist. In einer Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Substitution bei 565, wobei die Substitution ausgewählt ist aus S65G, S65T, S65A, S65L, S65C, S65V und S65I. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich die Aminosäuresequenz um nicht mehr als die Substitutionen S65T/T203H, S65T/T203Y, S72A/F64L/S65G/T203Y, S72A/S65G/V68L/T203Y,S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y,S65G/S72A/T203Y oder S65G/S72A/T203W. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Substitution bei Y66, wobei die Substitution ausgewählt ist aus Y66H, Y66F und Y66W. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Aminosäuresequenz ferner eine Faltungsmutation. In einer weiteren Ausführungsform ist das veränderte Fluoreszenzprotein Teil eines Fusionsproteins, wobei das Fusionsprotein ein interessierendes Polypeptid und das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein bereitgestellt, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ FD NO:2 durch mindestens eine Aminosäuresubstitution bei L42, V61, T62, V68, Q69, Q94, N121, Y145, H148, V150, F165, I167, Q183, N185, L220, E222 oder V224 unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Fluoreszenz-markierter Antikörper bereitgestellt, der einen Antikörper umfasst, der an ein jegliches der vorstehend beschriebenen funktionellen veränderten Fluoreszenzproteine gekoppelt ist. In einer Ausführungsform ist der Fluoreszenz-markierte Antikörper ein Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein den Antikörper in Fusion an das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen Antikörper kodiert und die an eine Nukleotidsequenz fusioniert ist, die für ein erfindungsgemäßes funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß eine Fluoreszenz-markierte Nukleinsäuresonde bereitgestellt, die eine Nukleinsäuresonde umfasst, die an ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein gekoppelt ist, dessen Aminosäuresequenz Teil der Erfindung ist. Die Fusion kann über ein Linkerpeptid erfolgen.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Gemisch ein Ziel enthält, bereitgestellt, das ein In-Kontakt-Bringen des Gemisches mit einer Fluoreszenz-markierten Sonde, die eine Sonde und ein erfindungsgemäßes funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein umfasst, und ein Bestim men, ob das Ziel an die Sonde gebunden hat, umfasst. In einer Ausführungsform wird das Zielmolekül auf einer festen Matrix abgefangen.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Veränderung eines funktionellen veränderten Fluoreszenzproteins mit einer Fluoreszenzeigenschaft, die zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedlich ist, bereitgestellt, das ein Substituieren einer Aminosäure, die nicht mehr als 0,5 nm von einem jeglichen Atom in dem Chromophor eines Aequorea-bezogenen grünen Fluoreszenzproteins entfernt liegt, durch eine andere Aminosäure umfasst, wobei die Substitution eine Fluoreszenzeigenschaft des Proteins verändert. In einer Ausführungsform verändert die Aminosäuresubstitution die elektronische Umgebung des Chromophors.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Veränderung eines funktionellen veränderten Fluoreszenzproteins mit einer zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaft bereitgestellt, das ein Substituieren von Aminosäuren in einer Schleifendomäne eines Aequorea-bezogenen grünen Fluoreszenzproteins durch Aminosäuren umfasst, um eine Konsensus-Sequenz für eine Phosphorylierung oder für eine Proteolyse zu schaffen.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Erzeugung eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers bereitgestellt, das ein Bereitstellen eines Donormoleküls, das ein erfindungsgemäßes funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein umfasst, ein Bereitstellen eines geeigneten Akzeptormoleküls für das Fluoreszenzprotein und ein Bringen des Donormoleküls und des Akzeptormoleküls in einen ausreichend nahen Kontakt umfasst, um einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer zu ermöglichen.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Erzeugung von Fluoreszenzresonanzenergietransfer bereitgestellt, das ein Bereitstellen eines Akzeptormoleküls, das ein erfindungsgemäßes funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein umfasst, ein Bereitstellen eines geeigneten Donormoleküls für das Fluoreszenzprotein und ein Bringen des Donormoleküls und des Akzeptormoleküls in einen ausreichend nahen Kontakt umfasst, um einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer zu ermöglichen. In einer Ausführungsform ist das Donormolekül ein verändertes Fluoreszenzprotein, dessen Aminosäuresequenz die Substitution T203I umfasst, und das Akzeptormolekül ist ein verändertes Fluoreszenzprotein, dessen Aminosäuresequenz die Substitution T203X umfasst, wobei X eine aromatische Aminosäure ist, die aus H, Y, W oder F ausgewählt ist, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Kristall eines Proteins bereitgestellt, das ein Fluoreszenzprotein mit einer Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen zu SEQ ID NO:2 identisch ist, wobei der Kristall mit mindestens einer Auflösung von 2,0 bis 3,0 Å streut.
In einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Berechnungsverfahren zum Entwerfen eines Fluoreszenzproteins bereitgestellt, das ein Bestimmen aus einem dreidimensionalen Modell eines kristallisierten Fluoreszenzproteins, das ein Fluoreszenzprotein mit einem gebundenen Liganden umfasst, von mindestens einer wechselwirkenden Aminosäure des Fluoreszenzproteins, die mit mindestens einer ersten chemischen Gruppe des Liganden wechselwirkt, und ein Auswählen mindestens einer chemischen Modifikation der ersten chemischen Gruppe umfasst, um eine zweite chemische Gruppe mit einer Struktur zu erzeugen, um entweder eine Wechselwirkung zwischen der wechselwirkenden Aminosäure und der zweiten chemischen Gruppe im Vergleich zu der Wechselwirkung zwischen der wechselwirkenden Aminosäure und der ersten chemischen Gruppe zu senken oder zu erhöhen.
In einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Berechnungsverfahren zum Modellieren der dreidimensionalen Struktur eines Fluoreszenzproteins bereitgestellt, das ein Bestimmen einer dreidimensionalen Beziehung zwischen mindestens zwei Atomen umfasst, die in den Atomkoordinaten der 5-1 bis 5-28 aufgeführt sind.
In einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung bereitgestellt, die eine Speichervorrichtung und mindestens 10 in der Vorrichtung gespeicherte Atomkoordinaten umfasst, die aus den Atomkoordinaten ausgewählt sind, die in den 5-1 bis 5-28 aufgeführt sind. In einer Ausführungsform ist die Speichervorrichtung eine Computer-lesbare Vorrichtung, die die Codons speichert und als Input die Atomkoordinaten empfängt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Computer-lesbare Vorrichtung eine Floppy Disk oder ein Laufwerk.
In einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine erste Substitution an Position T203, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Y, W oder F, und mindestens eine zweite Substitution an Position H148 unterscheidet.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens eines interessierenden Anions in einer Probe, das die Schritte eines Einbringens eines veränderten grünen Fluoreszenzproteins in eine Probe, wobei das veränderte grüne Fluoreszenzprotein eine Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine erste Substitution an Position T203 unterscheidet, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Y, W oder F, und ein Bestimmen der Fluoreszenz des veränderten grünen Fluoreszenzproteins in der Probe umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine erste Substitution an Position T203, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Y, W oder F, und mindestens eine zweite Substitution an der Position H148 unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Wirtszelle, die ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein umfasst, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine erste Substitution an Position T203, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Y, W oder F, und mindestens eine zweite Substitution an Position H148 unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluores zenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Definitionen
Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie sie herkömmlicherweise von dem Fachmann verstanden werden. Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die zu den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Durchführung oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, sind die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Erfindung sind die nachstehenden Begriffe nachstehend definiert.
"Bindepaar" betrifft zwei Gruppen (z.B. chemisch oder biochemisch), die eine Affinität füreinander aufweisen. Beispiele für Bindepaare umfassen Antigen/Antikörper, Lectin/Avidin, Zielpolynukleotid/Sondenoligonukleotid, Antikörper/Anti-Antikörper, Rezeptor/Ligand, Enzym/Ligand und dergleichen. "Ein Mitglied eines Bindepaares" betrifft eine Einheit des Paars, wie ein Antigen oder einen Liganden.
"Nukleinsäure" betrifft ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidpolymer in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form und umfasst, wenn nicht anderweitig begrenzt, bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden, die in einer ähnlichen Weise wie natürlich auftretende Nukleotide fungieren können. Man wird erkennen, dass, wenn ein Nukleinsäuremolekül durch eine DNA-Sequenz dargestellt ist, dies auch RNA-Moleküle mit der entsprechenden RNA-Sequenz umfasst, worin "U" "T" ersetzt.
"Rekombinantes Nukleinsäuremolekül" betrifft ein Nukleinsäuremolekül, das nicht natürlich vorkommt und das zwei Nukleotidsequenzen umfasst, die nicht natürlich miteinander verbunden sind. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle werden durch künstliche Rekombination wie genetische Veränderungstechniken oder chemische Synthese produziert.
In Bezug auf eine Nukleotidsequenz bedeutet ein Peptid "kodieren", dass die Sequenz bei einer Transkription und Translation von mRNA das Polypeptid erzeugt. Dies umfasst sowohl den kodierenden Strang, dessen Nukleotidsequenz zu der mRNA identisch ist und dessen Sequenz gewöhnlich in dem Sequenzprotokoll bereitgestellt wird, sowie den komplementären Strang, der als Matrize für eine Transkription verwendet wird. Wie der Fachmann erkennen wird, umfasst dies auch alle degenerierten Nukleotidsequenzen, die die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Nukleotidsequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, umfassen Sequenzen, die Introns enthalten.
"Expressionskontrollsequenzen" betrifft Nukleotidsequenzen, die die Expression einer Nukleotidsequenz regulieren, mit der sie operativ verbunden sind. Expressionskontrollsequenzen sind mit einer Nukleotidsequenz "operativ verbunden", wenn die Expressionskontrollsequenzen die Transkription und gegebenenfalls Translation der Nukleotidsequenz kontrollieren und regulieren. Somit können Expressionskontrollsequenzen geeignete Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, ein Startcodon (d.h. ATG) vor einem Protein-kodierenden Gen, Splicing-Signale für Introns, ein Aufrechterhalten des richtigen Leserasters des Gens, um eine korrekte Translation der mRNA zu erlauben, und Stopp-Codons umfassen.
"Natürlich auftretend" wie hier verwendet und auf einen Gegenstand angewandt betrifft die Tatsache, dass ein Gegenstand in der Natur aufgefunden werden kann. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynukleotid-Sequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorkommt, der von einer natürlichen Quelle isoliert werden kann und nicht zielgerichtet durch den Menschen im Labor modifiziert wurde, natürlich auftretend.
"Operativ verbunden" betrifft eine Nachbarschaft, wobei die Komponenten, die derartig beschrieben werden, in einer Beziehung stehen, die ihnen erlaubt, in ihrer beabsichtigten Weise zu fungieren. Eine Kontrollsequenz, die mit einer kodierenden Sequenz "operativ verbunden" ist, ist in einer derartigen Weise ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, beispielsweise wenn die geeigneten Moleküle (wie Inducer und Polymerasen) an die Kontroll- oder regulatorische(n) Sequenz(en) gebunden sind.
"Kontrollsequenz" betrifft Polynukleotid-Sequenzen, die notwendig sind, um die Expression von kodierenden und nicht-kodierenden Sequenzen, an die sie ligiert sind, zu bewirken. Die Art solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich abhängig von dem Wirtsorganismus. In Prokaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen im All gemeinen einen Promotor, Ribosomenbindestellen und eine Transkriptionsterminationssequenz. In Eukaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotoren und Transkriptionsterminationssequenzen. Der Begriff "Kontrollsequenzen" soll minimal Komponenten umfassen, deren Gegenwart eine Expression beeinflussen kann, und kann auch zusätzliche Komponenten umfassen, deren Gegenwart vorteilhaft ist, wie Leader-Sequenzen und Fusionspartnersequenzen.
"Isoliertes Polynukleotid" betrifft ein Polynukleotid eines genomischen, cDNA- oder synthetischen Ursprungs oder einer Kombination davon, wobei aufgrund seines Ursprungs das "isolierte Polynukleotid" (1) nicht mit der Zelle assoziiert ist, in der das "isolierte Polynukleotid" natürlich vorgefunden wird, oder (2) operativ mit einem Polynukleotid verbunden ist, mit dem es in der Natur nicht verbunden ist.
"Polynukleotid" betrifft eine polymerische Form von Nukleotiden mit mindestens 10 Basen Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide oder eine modifizierte Form eines der beiden Nukleotidtypen. Der Begriff umfasst einzel- und doppelsträngige Formen von DNA.
Der Begriff "Sonde" betrifft eine Substanz, die spezifisch an eine andere Substanz (ein "Ziel") bindet. Sonden umfassen beispielsweise Antikörper, Nukleinsäuren, Rezeptoren und deren Liganden.
"Modulation" betrifft die Fähigkeit, eine funktionelle Eigenschaft einer biologischen Aktivität oder eines Vorgangs (wie Enzymaktivität oder Rezeptorbindung) entweder zu verstärken oder zu hemmen. Eine solche Verstärkung oder Hemmung kann von dem Auftreten eines spezifischen Ereignisses wie einer Aktivierung eines Signaltransduktionswegs abhängen und/oder kann sich nur in bestimmten Zelltypen manifestieren.
Der Begriff "Modulator" betrifft ein chemisches (natürlich auftretend oder nicht-natürlich auftretend) wie ein synthetisches Molekül (wie Nukleinsäure-, Protein-, Nicht-Peptid- oder organisches Molekül) oder einen Extrakt, der aus biologischen Materialien wie Bakterien, Pflanzen, Pilzen oder tierischen (insbesondere Säuger-) Zellen oder Geweben hergestellt wurde. Modulatoren können auf ihre mögliche Aktivität als Inhibitoren oder Aktivatoren (direkt oder indirekt) eines biologischen Vorgangs oder von biologischen Vorgängen (wie Agonist, teilweiser Antagonist, teilweiser Agonist, inverser Agonist, Antagonist, antineoplastische Mittel, cytotoxische Mit tel, Inhibitoren einer neoplastischen Transformation oder Zellproliferation, Zellproliferation-fördernde Mittel und dergleichen) durch Einbau in die hier beschriebenen Screeningtests getestet werden. Die Aktivität eines Modulators kann bekannt, unbekannt oder teilweise bekannt sein.
Der Begriff "Testchemikalie" betrifft eine Chemikalie, die durch ein oder mehrere erfindungsgemäße Screeningverfahren als ein möglicher Modulator getestet werden soll. Es ist gewöhnlich unbekannt, ob eine Testchemikalie an das interessierende Ziel bindet. Der Begriff "Kontroll-Testchemikalie" betrifft eine Chemikalie, von der bekannt ist, dass sie an das Ziel bindet (wie ein bekannter Agonist, Antagonist, teilweiser Agonist oder inverser Agonist). Gewöhnlich werden verschiedene vorbestimmte Konzentrationen von Testchemikalien für ein Screening verwendet wie 0,01 μM, 0,1 μM, 1,0 μM und 10,0 μM.
Der Begriff "Ziel" betrifft eine biochemische Einheit, die in einem biologischen Vorgang einbezogen ist. Ziele sind typischerweise Proteine, die eine nützliche Rolle bei der Physiologie oder Biologie eines Organismus spielen. Eine therapeutische Chemikalie bindet an ein Ziel, um dessen Funktion zu verändern oder zu modulieren. Wie hier verwendet können Ziele Zelloberflächenrezeptoren, G-Proteine, Kinasen, Ionenkanäle, Phospholipasen und andere hier beschriebene Proteine umfassen.
Der Begriff "Markierung" betrifft eine durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel nachweisbare Zusammensetzung. Beispielsweise umfassen verwendbare Markierungen 32P, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenzproteine, Elektronendichte-Reagenzien, Enzyme (wie sie beispielsweise herkömmlich in einem ELISA verwendet werden), Biotin, Digoxigenin oder Haptene und Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind. Beispielsweise können erfindungsgemäße Polypeptide als nachweisbare Markierungen beispielsweise durch deren Einbau in ein Polypeptid hergestellt werden und verwendet werden, um Antikörper zu markieren, die spezifisch mit dem Polypeptid reagieren. Eine Markierung erzeugt häufig ein messbares Signal wie Radioaktivität, Fluoreszenzstrahlung oder Enzymaktivität, die für eine Quantifizierung der Menge der gebundenen Markierung verwendet werden können.
Der Begriff "Nukleinsäuresonde" betrifft ein Nukleinsäuremolekül, das an eine spezifische Sequenz oder Untersequenz eines anderen Nukleinsäuremoleküls bindet. Eine Sonde ist vorzugsweise ein Nukleinsäuremolekül, das über komplementäre Basenpaarung an die vollständige Sequenz oder an eine Untersequenz einer Ziel-Nukleinsäure bindet. Es wird verstanden werden, dass Sonden an Zielsequenzen binden können, die keine vollständige Komplementarität mit der Sondensequenz aufweisen, abhängig von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen. Sonden sind vorzugsweise direkt markiert, beispielsweise mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphoren, Chromogenen, Fluoreszenzproteinen, oder sie sind indirekt markiert wie mit Biotin, an das ein Streptavidinkomplex später binden kann. Durch Testen des Vorliegens oder Fehlens der Sonde kann man das Vorliegen oder das Fehlen der ausgewählten Sequenz oder Untersequenz nachweisen.
Eine "markierte Nukleinsäuresonde" ist eine Nukleinsäuresonde, die entweder kovalent, über einen Linker oder über ionische, van der Waals- oder Wasserstoffbindungen an eine Markierung gebunden ist, so dass das Vorliegen der Sonde durch Nachweis des Vorliegens der an die Sonde gebundenen Markierung nachgewiesen werden kann.
Die Begriffe "Polypeptid" und "Protein" betreffen ein Polymer von Aminosäureresten. Die Begriffe finden Anwendung auf Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich auftretenden Aminosäure sind, sowie auf natürlich auftretende Aminosäurepolymere. Der Begriff "rekombinantes Protein" betrifft ein Protein, das durch Expression einer die Aminosäuresequenz des Proteins kodierenden Nukleotidsequenz von einem rekombinanten DNA-Molekül produziert wird.
Der Begriff "rekombinante Wirtszelle" betrifft eine Zelle, die ein rekombinantes Nukleinsäuremolekülumfasst. Somit können beispielsweise rekombinante Wirtszellen Gene exprimieren, die nicht in der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle vorliegen.
Die Begriffe "isoliert", "aufgereinigt" oder "biologisch rein" betreffen ein Material, das im Wesentlichen oder wesentlich frei von Bestandteilen ist, die normalerweise das Material, wie es in dem nativen Zustand vorliegt, begleiten. Reinheit und Homogenität werden typischerweise unter Verwendung analytischer chemischer Techniken wie Polyacrylamidgelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt. Ein Protein- oder Nukleinsäuremolekül, das die vorherrschende Protein- oder Nukleinsäurespezies in einer Zubereitung ist, ist im Wesentlichen aufgereinigt. Im Allgemeinen wird ein isoliertes Protein- oder Nukleinsäuremolekül mehr als 80% aller in der Zubereitung vorliegenden makromolekularen Spezies umfassen. Vorzugsweise ist das Protein aufgereinigt, so dass es mehr als 90% aller vorliegender makromolekularer Spezies darstellt. Mehr bevorzugt ist das Protein zu mehr als 95% aufgereinigt und am meisten bevorzugt ist das Protein zu wesentlicher Homogenität aufgereinigt, wobei andere makromolekulare Spezies nicht durch herkömmliche Verfahren nachgewiesen werden.
Der Begriff "natürlich auftretend", wie er auf einen Gegenstand angewandt wird, betrifft die Tatsache, dass ein Gegenstand in der Natur aufzufinden ist. Beispielsweise ist eine Polypeptid- oder Polynukleotid-Sequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorliegt, der von einer natürlichen Quelle isoliert werden kann und nicht zielgerichtet durch den Menschen im Labor modifiziert wurde, natürlich auftretend.
Der Begriff "Antikörper" betrifft ein Polypeptid, das im Wesentlichen durch ein Immunglobulin-Gen oder durch Immunglobulin-Gene oder durch Fragmente davon kodiert wird und das spezifisch einen Analyten (Antigen) bindet und erkennt. Die bekannten Immunglobulin-Gene umfassen die kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-konstante Region-Gene, sowie die unzähligen Immunglobulin-variable Region-Gene. Antikörper treten beispielsweise als intakte Immunglobuline oder als eine Reihe von gut charakterisierten Fragmenten auf, die durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen produziert werden. Dies umfasst beispielsweise Fab'- und F(ab)'₂-Fragmente. Der Begriff "Antikörper" wie hier verwendet umfasst auch Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation von ganzen Antikörpern oder de novo unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren produziert werden.
Der Begriff "Immunoassay" betrifft einen Test, der einen Antikörper verwendet, um spezifisch einen Analyten zu binden. Der Immunoassay ist durch die Verwendung von spezifischen Bindeeigenschaften eines bestimmten Antikörpers gekennzeichnet, um den Analyten zu isolieren, auf ihn abzuzielen und/oder zu quantifizieren.
Der Begriff "identisch" im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen betrifft die Reste in den zwei Sequenzen, die in einem Alignment auf eine maximale Übereinstimmung identisch sind. Wenn ein Prozentwert an Sequenzidentität in Bezug auf Proteine oder Peptide verwendet wird, ist anerkannt, dass sich Positionen von Resten, die nicht identisch sind, häufig durch konservative Amino säuresubstitutionen unterscheiden, wobei Aminosäurereste gegen andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (wie Ladung oder Hydrophobizität) ersetzt sind und daher nicht die funktionellen Eigenschaften des Moleküls verändern. Falls sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepasst werden, um bezüglich der konservativen Art der Substitution zu korrigieren. Mittel für ein Bewerkstelligen dieser Anpassung sind bekannt. Typischerweise umfasst dies eine Bewertung einer konservativen Substitution als eine teilweise und nicht als eine vollständige Fehlpaarung, wobei dadurch die prozentuale Sequenzidentität erhöht wird. Somit wird beispielsweise, falls einer identischen Aminosäure eine Bewertung von 1 zugewiesen wird und einer nicht-konservativen Substitution eine Bewertung von 0 zugewiesen wird, einer konservativen Substitution eine Bewertung zwischen 0 und 1 zugewiesen. Die Bewertung von konservativen Substitutionen wird beispielsweise gemäß bekannter Algorithmen berechnet; vergleiche beispielsweise Meyers und Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988), Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, Pearson und Liprnan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, Higgins und Sharp (1988) Gene, 73: 237-244 und Higgins und Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10881-90, Huang et al. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8, 155-65, und Pearson et al. (1994) Methods in Molecular Biology 24, 307-31. Ein Alignment erfolgt auch häufig durch Betrachtung und manuelles Alignment.
"Konservativ modifizierte Veränderungen" einer bestimmten Nukleinsäuresequenz betrifft diejenigen Nukleinsäuren, die für identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder, falls die Nukleinsäure keine Aminosäuresequenz kodiert, im Wesentlichen identische Sequenzen. Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes kodiert eine große Anzahl an funktionell identischen Nukleinsäuren ein bestimmtes Polypeptid. Zum Beispiel kodieren die Codons CGU, CGC, CGA, CGG, AGA und AGG alle die Aminosäure Arginin. Somit kann an jeder Position, an der ein Arginin durch ein Codon spezifiziert wird, das Codon durch ein jegliches der entsprechenden beschriebenen Codons verändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu verändern. Solche Nukleinsäureveränderungen sind "stille Veränderungen", die eine Art von "konservativ modifizierten Veränderungen" sind. Jede Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, beschreibt auch jede mögliche stille Veränderung. Der Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (mit der Ausnahme von AUG, das herkömmlicherweise das einzige Codon für Methionin ist) durch Standardverfahren verändert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu ergeben. Dementsprechend ist jede "stille Veränderung" einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, implizit in jeder beschriebenen Sequenz offenbart. Ferner wird der Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren (typischerweise von weniger als 5%, mehr typisch weniger als 1%) in einer kodierten Sequenz verändern, hinzufügen oder deletieren, "konservativ modifizierte Veränderungen" sind, wobei die Veränderungen zu der Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure führen. Konservative Aminosäuresubstitutionen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind bekannt. Die nachstehenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die zueinander konservative Substitutionen darstellen:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T)
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E)
3) Asparagin (N), Glutamin (Q
4) Arginin (R), Lysin (K)
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V) und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

Der Begriff "komplementär" bedeutet, dass ein Nukleinsäuremolekül die Sequenz des Bindepartners eines anderen Nukleinsäuremoleküls aufweist. Somit ist die Sequenz 5'-ATGC-3' komplementär zu der Sequenz 5'-GCAT-3'.
Eine Aminosäuresequenz oder eine Nukleotidsequenz ist zu einer Referenzsequenz "im Wesentlichen identisch" oder "im Wesentlichen ähnlich", falls die Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz mindestens 80% Sequenzidentität mit der Referenzsequenz über ein bestimmtes Vergleichsfenster aufweist. Somit umfassen im Wesentlichen ähnliche Sequenzen diejenigen mit beispielsweise mindestens 85% Sequenzidentität, mindestens 90% Sequenzidentität, mindestens 95% Sequenzidentität oder mindestens 99% Sequenzidentität. Zwei Sequenzen, die zueinander identisch sind, sind natürlich auch im Wesentlichen identisch.
Eine bestimmte Nukleotidsequenz ist zu einer Referenz-Nukleotidsequenz "im Wesentlichen komplementär", falls das Komplement der bestimmten Nukleotidsequenz im Wesentlichen identisch zu der Referenz-Nukleotidsequenz ist.
Der Begriff "stringente Bedingungen" betrifft eine Temperatur und Ionenbedingungen, die bei einer Nukleinsäurehybridisierung verwendet werden. Stringente Bedingungen sind Sequenz-abhängig und sind unter verschiedenen Umgebungsparametern unterschiedlich. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen derart ausgewählt, dass sie etwa 5°C bis 20°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) der spezifischen Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Der T_m-Wert ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz an eine vollständig passende Sonde hybridisiert.
Der Begriff "allelische Varianten" betrifft polymorphe Formen eines Gens an einem bestimmten Genlokus, sowie cDNAs, die von mRNA-Transkripten der Gene abgeleitet sind, und die durch diese kodierten Polypeptide.

Der Begriff "bevorzugtes Säugercodon" betrifft die Untergruppe an Codons aus dem für eine Aminosäure kodierenden Satz an Codons, die am häufigsten in Proteinen verwendet wird, die in Säugerzellen exprimiert werden, wie ausgewählt aus der nachstehenden Liste:

Aminosäure	Bevorzugte Codons für hohe Expression in Säugern
Gly	GGC, GGG
Glu	GAG
Asp	GAC
Val	GUG, GUC
Ala	GCC, GCU
Sex	AGC, UCC
Lys	AAG
Asn	AAC
Met	AUG
Ile	AUC
Thr	ACC
Txp	UGG
Cys	UGC
Tyr	UAU, UAC
Leu	CUG
Phe	WC
Arg	CGC, AGG, AGA
Gln	CAG
His	CAC
Pro	CCC

Fluoreszenzmoleküle sind beim Fluoreszenzresonanzenergietransfer ("FRET") verwendbar. FRET beteiligt ein Donormolekül und ein Akzeptormolekül. Um die Wirksamkeit und Nachweisbarkeit von FRET zwischen einem Donor- und Akzeptormolekül zu optimieren, müssen mehrere Faktoren ausgeglichen werden. Das Emissionsspektrum des Donors sollte so stark wie möglich mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors überlappen, um das Überlappungsintegral zu maximieren. Auch sollte die Quantumausbeute der Donoreinheit und der Extinktionskoeffizient des Akzeptors so hoch wie möglich sein, um den R₀-Wert, die Entfernung, bei der die Energietransferwirksamkeit 50% beträgt, zu maximieren. Jedoch sollten die Anregungsspektren des Donors und Akzeptors so wenig wie möglich überlappen, so dass eine Wellenlängenregion gefunden werden kann, bei der der Donor wirksam angeregt werden kann, ohne dass der Akzeptor direkt angeregt wird. Aus direkter Anregung des Akzeptors entstehende Fluoreszenz ist schwierig von Fluoreszenz zu unterscheiden, die von FRET stammt. In ähnlicher Weise sollten die Emissionsspek tren des Donors und des Akzeptors so wenig wie möglich überlappen, so dass die zwei Emissionen klar unterschieden werden können. Eine hohe Fluoreszenzquantumausbeute der Akzeptoreinheit ist erwünscht, falls die Emission von dem Akzeptor entweder als alleinige Auslesung oder als Teil eines Emissionsverhältnisses gemessen werden soll. Ein Faktor, der bei der Auswahl des Donor- und Akzeptorpaars berücksichtigt werden soll, ist die Wirksamkeit des Fluoreszenzresonanzenergietransfers zwischen ihnen. Vorzugsweise beträgt die Wirksamkeit von FRET zwischen dem Donor und dem Akzeptor mindestens 10%, mehr bevorzugt mindestens 50% und noch mehr bevorzugt mindestens 80%.
Der Begriff "Fluoreszenzeigenschaft" betrifft den molaren Extinktionskoeffizienten bei einer geeigneten Anregungswellenlänge, die Fluoreszenzquantumwirksamkeit, die Form des Anregungsspektrums oder Emissionsspektrums, das Anregungswellenlängenmaximum und Emissionswellenlängenmaximum, das Verhältnis von Anregungsamplituden bei zwei verschiedenen Wellenlängen, das Verhältnis von Emissionsamplituden bei zwei verschiedenen Wellenlängen, die Lebensdauer des angeregten Zustands oder die Fluoreszenz Anisotropie. Ein messbarer Unterschied in einer jeglichen dieser Eigenschaften zwischen Aequorea-Wildtyp-GFP und der mutierten Form ist geeignet. Ein messbarer Unterschied kann durch Bestimmen der Menge einer jeglichen quantitativen Fluoreszenzeigenschaft wie der Menge an Fluoreszenz bei einer bestimmten Wellenlänge oder des Integrals an Fluoreszenz über das Emissionsspektrum bestimmt werden. Eine Bestimmung von Verhältnissen der Anregungsamplitude oder Emissionsamplitude bei zwei verschiedenen Wellenlängen ("Anregungsamplitude-Verhältnisbildung" bzw. "Emissionsamplitude-Verhältnisbildung") sind besonders vorteilhaft, da das Verhältnisbildungsverfahren eine innere Referenz bereitstellt und Veränderungen bei der absoluten Leuchtstärke der Anregungsquelle, der Empfindlichkeit des Detektors und Strahlungsstreuung oder Auslöschen durch die Probe beseitigt.
II. VERÄNDERTE FLUORESZENZPROTEINE MIT LANGEN WELLENLÄNGEN
A. Fluoreszenzproteine
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff "Fluoreszenzprotein" ein jegliches Protein, das fluoreszieren kann, wenn es mit einer geeigneten elektromagnetischen Strahlung angeregt wird. Dies umfasst Fluoreszenzproteine, deren Aminosäuresequenzen entweder natürlich auftreten oder verändert sind (d.h. Analoga oder Mutanten). Vie le Cnidarier verwenden grüne Fluoreszenzproteine (GFPs) als Energietransferakzeptoren bei der Biolumineszenz. Ein "grünes Fluoreszenzprotein" wie hier verwendet ist ein Protein, das grünes Licht fluoresziert. In ähnlicher Weise fluoreszieren "blaue Fluoreszenzproteine" blaues Licht und "rote Fluoreszenzproteine" fluoreszieren rotes Licht. GFPs wurden aus der Nordwestpazifik-Qualle Aequorea victoria, der Seeanemone, Renilla reniformis, und Phialidium gregarium isoliert; W.W. Ward et al., Photochem. Photobiol., 35:803-808 (1982), L.D. Levine et al., Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85 (1982).
Eine Vielzahl von Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteinen mit geeigneten Exzitations- und Emissionsspektren wurde durch Modifizieren der Aminosäuresequenz des natürlich auftretenden GFP von Aequorea victoria verändert (D.C. Prasher et al., Gene, 111:229-233 (1992), R. Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-04 (1994), US-Patentanmeldung 08/337,915, eingereicht am 10. November 1994, Internationale Anmeldung PCT/US95/14692, eingereicht am 10. November 1995).
Wie hier verwendet, ist ein Fluoreszenzprotein ein "Aequorea-bezogenes Fluoreszenzprotein", falls eine jegliche kontinuierliche Sequenz von 150 Aminosäuren des Fluoreszenzproteins mindestens 85% Sequenzidentität mit einer entweder kontinuierlichen oder nicht-kontinuierlichen Aminosäuresequenz des Wildtyp-Aequoreagrünen Fluoreszenzproteins mit 238 Aminosäuren der 3 (SEQ ID NO:2) aufweist. Mehr bevorzugt ist ein Fluoreszenzprotein ein Aequorea-bezogenes Fluoreszenzprotein, falls eine jegliche kontinuierliche Sequenz von 200 Aminosäuren des Fluoreszenzproteins mindestens 95% Sequenzidentität mit einer kontinuierlichen oder nicht-kontinuierlichen Aminosäuresequenz aus dem Wildtyp-Aequorea-grünen Fluoreszenzprotein von 3 (SEQ ID NO:2) aufweist. In ähnlicher Weise kann das Fluoreszenzprotein Bezug zu Renilla- oder Phialidium-Wildtyp-Fluoreszenzproteinen unter Verwendung der gleichen Standards aufweisen.
Aequorea-bezogene Fluoreszenzproteine umfassen beispielsweise und ohne Begrenzung (natives) Wildtyp-Aequorea victoria-GFP (D.C. Prasher et al., "Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein", Gene, (1992) 111:229-33), dessen Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:1) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) in 3 gezeigt sind, allelische Varianten dieser Sequenz wie Q80R, worin der Glutaminrest an der Position 80 durch Arginin substituiert ist (M. Chalfie et al., Science, (1994) 263:802-805), diejenigen veränderten Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteine, die hier beschrieben sind, z.B. in Tabelle A oder Tabelle F, Varian ten, die eine oder mehrere Faltungsmutationen umfassen, und Fragmente dieser Proteine, die fluoreszieren, wie Aequorea-grünes Fluoreszenzprotein, von dem die zwei aminoterminalen Aminosäuren entfernt wurden. Mehrere dieser Proteine enthalten unterschiedliche aromatische Aminosäuren innerhalb des zentralen Chromophors und fluoreszieren bei einer deutlich kürzeren Wellenlänge als Wildtyp-Spezies. Zum Beispiel enthalten veränderte Proteine P4 und P4-3 (zusätzlich zu anderen Mutationen) die Substitution Y66H, während W2 und W7 (zusätzlich zu anderen Mutationen) Y66W enthalten. Andere Mutationen, die sowohl nahe an der Chromophorregion des Proteins und entfernt von ihr in der Primärsequenz liegen, können die spektralen Eigenschaften des GFP beeinflussen und sind in dem ersten Teil der nachstehenden Tabelle aufgeführt. TABELLE A
Weitere Mutationen in Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteinen, die als "Faltungsmutationen" bezeichnet werden, verbessern die Fähigkeit von Fluoreszenzproteinen, sich bei höheren Temperaturen zu falten und stärker zu fluoreszieren, wenn sie in Säugerzellen exprimiert werden, haben jedoch nur eine geringe oder keine Wirkung auf die Peak-Wellenlängen der Anregung und Emission. Es soll angemerkt werden, dass diese mit Mutationen kombiniert werden können, die die spektralen Eigenschaften von GFP beeinflussen, um Proteine mit veränderten spektralen Eigenschaften und Faltungseigenschaften zu erzeugen. Faltungsmutationen umfassen: F64L, V68L, S72A und auch T44A, F99S, Y145F, N146I, M153T oder A, V163A, I167T, S175G, S205T und N212K.
Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Schleifendomäne" eine Aminosäuresequenz eines Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteins, die die Aminosäuren verbindet, die bei der Sekundärstruktur der elf Stränge des Fasses oder der zentralen Helix beteiligt sind (Reste 56-72) (vgl. 1A und 1B).
Wie hier verwendet ist die "Fluoreszenzproteingruppe" eines Fluoreszenzproteins der Teil der Aminosäuresequenz eines Fluoreszenzproteins, der, falls die Aminosäuresequenz des Fluoreszenzproteinsubstrats optimal mit der Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden Fluoreszenzproteins ausgerichtet wird, zwischen den aminoterminalen und carboxyterminalen Aminosäuren, jeweils einschließlich, der Aminosäuresequenz des natürlich auftretenden Fluoreszenzproteins liegt.
Man hat festgestellt, dass Fluoreszenzproteine genetisch an andere Zielproteine fusioniert werden können und als Marker verwendet werden können, um die Lokalisierung und Menge des produzierten Zielproteins zu identifizieren. Dementsprechend werden erfindungsgemäß Fusionsproteine bereitgestellt, die eine Fluoreszenzproteingruppe und weitere Aminosäuresequenzen umfassen. Solche Sequenzen können beispielsweise bis etwa 15, bis etwa 50, bis etwa 150 oder bis etwa 1000 Aminosäuren lang sein. Die Fusionsproteine besitzen die Fähigkeit, bei einer Anregung durch elektromagnetische Strahlung zu fluoreszieren. In einer Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein einen Polyhistidin-Tag, um bei der Aufreinigung des Proteins Hilfe zu leisten.
B. Verwendung der Kristallstruktur eines grünen Fluoreszenzproteins um Mutanten mit veränderten Fluoreszenzeigenschaften zu entwerfen
Unter Verwendung von Röntgenkristallographie und Computerbearbeitung wurde erfindungsgemäß ein Modell der Kristallstruktur des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea erstellt, das die relative Position der Atome in dem Molekül zeigt. Diese Information ist bei der Identifizierung von Aminosäuren hilfreich, deren Substitution die Fluoreszenzeigenschaften des Proteins verändert.
Fluoreszenzeigenschaften von Aequorea-bezogenen Fluoreszenzproteinen hängen teilweise von der elektronischen Umgebung des Chromophors ab. Im Allgemeinen beeinflussen Aminosäuren, die innerhalb von etwa 0,5 nm des Chromophors liegen, die elektronische Umgebung des Chromophors. Daher kann eine Substitution solcher Aminosäuren Fluoreszenzproteine mit veränderten Fluoreszenzeigenschaften erzeugen. Im angeregten Zustand neigt die Elektronendichte dazu, sich von dem Phenolat zu dem Carbonylende des Chromophors zu verschieben. Daher neigt eine Platzierung von ansteigend positiver Ladung in der Nähe des Carbonylendes des Chromophors dazu, die Energie des angeregten Zustandes zu verringern und eine Rotverschiebung bei dem Absorptions- und Emissionswellenlängenmaximum des Proteins zu verursachen. Eine Verringerung der positiven Ladung in der Nähe des Carbonylendes des Chromophors neigt dazu, die gegenteilige Wirkung aufzuweisen, was eine Blauverschiebung der Wellenlängen des Proteins erzeugt.
Aminosäuren mit geladenen (ionisiertes D, E, K und R), Dipol- (H, N, Q, S, T, und ungeladenes D, E und K) und polarisierbaren Seitengruppen (wie C, F, H, M, W und Y) sind für eine Veränderung der elektronischen Umgebung des Chromophors geeignet, insbesondere wenn sie eine Aminosäure mit einer ungeladenen, nichtpolaren oder nicht-polarisierbaren Seitenkette substituieren. Im Allgemeinen verändern Aminosäuren mit polarisierbaren Seitengruppen die elektronische Umgebung am wenigstens und man vermutet dementsprechend, dass sie eine verhältnismäßig kleinere Veränderung in einer Fluoreszenzeigenschaft erzeugen. Aminosäuren mit geladenen Seitengruppen verändern die Umgebung am meisten und man vermutet dementsprechend, dass sie eine vergleichsweise größere Veränderung in einer Fluoreszenzeigenschaft erzeugen. Jedoch ist es wahrscheinlicher, dass Aminosäuren mit geladenen Seitengruppen die Struktur des Proteins zerstören und eine korrekte Faltung verhindern, falls sie in der Nähe des Chromophors ohne eine jegliche zusätzliche Solvatisierung oder Salzverbrückung verborgen sind. Daher ist es am wahr scheinlichsten, dass geladene Aminosäuren toleriert werden und hilfreiche Wirkungen ergeben, wenn sie andere geladene oder hochgradig polare Aminosäuren, die bereits solvatisiert oder bei Salzbrücken beteiligt sind, ersetzen. In bestimmten Fällen, falls eine Substitution durch eine polarisierbare Aminosäure ausgewählt wird, kann die Struktur des Proteins die Auswahl einer größeren Aminosäure, wie W, viel weniger geeignet machen. Alternativ können Positionen, die durch Aminosäuren mit geladenen oder polaren Seitengruppen besetzt sind, die ungünstig ausgerichtet sind, durch Aminosäuren substituiert werden, die weniger geladene oder polare Seitengruppen aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Aminosäure, deren Seitengruppe einen in eine Richtung in dem Protein orientierten Dipol aufweist, durch eine Aminosäure mit einem in eine unterschiedliche Richtung orientierten Dipol ersetzt werden.
Insbesondere führt Tabelle B mehrere Aminosäuren auf, die innerhalb von etwa 0,5 nm von dem Chromophor entfernt liegen und deren Substitution in veränderten Fluoreszenzeigenschaften resultieren kann. Die Tabelle zeigt unterstrichen bevorzugte Aminosäuresubstitutionen an der angegebenen Position, um eine Fluoreszenzeigenschaft des Proteins zu verändern. Um solche Substitutionen einzubringen, stellt die Tabelle auch Codons für Primer bereit, die bei einer Stellen-gerichteten Mutagenese, die eine Amplifikation einbezieht, verwendet werden. Diese Primer wurden ausgewählt, um ökonomisch die bevorzugten Aminosäuren zu kodieren, sie kodieren jedoch genauso andere Aminosäuren wie angegeben oder sogar ein Stopp-Codon, das durch Z gekennzeichnet ist. Beim Einbringen von Substitutionen unter Verwendung von solchen degenerierten Primern ist die effizienteste Strategie ein Screening der Ansammlung, um Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften zu identifizieren, und sodann ihre DNA zu sequenzieren, um herauszufinden, welche der möglichen Substitutionen verantwortlich ist. Codons sind in doppelsträngiger Form mit oben liegendem Sinnstrang und unten liegendem Antisinn-Strang gezeigt. Bei Nukleinsäuresequenzen sind: R = (A oder g), Y = (C oder T), M = (A oder C), K = (g oder T), S = (g oder C), W = (A oder T), H = (A, T oder C), B = (g, T oder C), V = (g, A oder C), D = (g, A oder T), N = (A, C, g oder T).
TABELLE B
Beispiele für Aminosäuren mit polaren Seitengruppen, die durch polarisierbare Seitengruppen ersetzt werden können, umfassen beispielsweise diejenigen in Tabelle C.
TABELLE C
In einer Ausführungsform kann eine Aminosäure, die nahe zu einer zweiten Aminosäure innerhalb von etwa 0,5 nm des Chromophors liegt, bei einer Substitution die elektronischen Eigenschaften der zweiten Aminosäure verändern und wiederum die elektronische Umgebung des Chromophors verändern. Tabelle D zeigt zwei solcher Aminosäuren. Die Aminosäuren L220 und V224 liegen nahe zu E222 und sind in dem β-Faltblatt in der gleichen Richtung orientiert.
TABELLE D
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Substitution bei Q69 unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu Aequoreagrünem Fluoreszenzprotein unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist. Vor zugsweise ist die Substitution bei Q69 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K, R, E und G. Die Q69-Substitution kann mit anderen Mutationen kombiniert werden, um die Eigenschaften des Proteins zu verbessern, wie eine funktionelle Mutation bei 565.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Substitution bei E222, ausgenommen E222G, unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu Aequorea-grünem Fluoreszenzprotein unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist. Vorzugsweise ist die Substitution bei E222 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N und Q. Die E222-Substitution kann mit anderen Mutationen kombiniert werden, um die Eigenschaften des Proteins zu verbessern, wie eine funktionelle Mutation bei F64.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein funktionelles verändertes Fluoreszenzprotein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen zu der Aminosäuresequenz des grünen Fluoreszenzproteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) identisch ist und das sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine Substitution bei Y145 unterscheidet, wobei das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein eine zu dem grünen Fluoreszenzprotein von Aequorea unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaft aufweist. Vorzugsweise ist die Substitution bei Y145 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus W, C, F, L, E, H, K und Q. Die Y145-Substitution kann mit anderen Mutationen kombiniert werden, um die Eigenschaften des Proteins zu verbessern wie Y66.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch Computer-bezogene Ausführungsformen, einschließlich Berechnungsverfahren einer Verwendung der Kristallkoordinaten zum Entwerfen von neuen Fluoreszenzproteinmutationen und Vorrichtungen zur Speicherung der Kristalldaten, einschließlich Koordinaten. Zum Beispiel umfasst die Erfindung eine Vorrichtung, die eine Speichervorrichtung und mindestens zehn in der Vorrichtung gespeicherte Atomkoordinaten umfasst, die ausgewählt sind aus den in den 5-1 bis 5-28 aufgeführten Atomkoordinaten. Mehr Koordinaten können gespeichert werden, abhängig von der Komplexität der Berechnungen oder dem Ziel einer Verwendung der Koordinaten (wie etwa 100, 1000 oder mehr Koordinaten).
Beispielsweise werden größere Zahlen von Koordinaten für detailliertere Darstellungen der Struktur des Fluoreszenzproteins erwünscht sein. Typischerweise ist die Speichervorrichtung eine Computer-lesbare Vorrichtung, die Codes speichert, wie sie als Input die Atomkoordinaten empfängt. Nichtsdestotrotz sind andere bekannte Speichermittel auch vorgesehen. Die Computer-lesbare Vorrichtung kann eine Floppy Disk oder ein Laufwerk sein.
C. Verwendung der Kristallstruktur von YFP, um Mutanten mit veränderten Anionen-Bindeeigenschaften zu entwerfen
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung die Verwendung von Röntgenkristallographie und Computerbearbeitung, um ein Modell der Kristallstruktur von YFP zu erstellen, das die relative Position und Aminosäuren, die mit gebundenen Ionen Wechselwirken, zeigt. Diese Information ist bei der Identifizierung von Aminosäuren hilfreich, deren Substitution die Spezifität und Affinität der Bindungsstelle für verschiedene Anionen verändert. Da die Bindung des Anions nahe zu dem Chromophor von YFP erfolgt, führt eine Bindung zu einer Modulierung der Fluoreszenzeigenschaften von YFP, die verwendet werden können, um eine Anionenbindung und daher die Konzentration des Anions zu überwachen.
Die Anionenbindestelle, die in YFP-H148Q vorgefunden wird, zeigt viele der Charakteristika, die allgemein bei Halogenid-Bindestellen in anderen Proteinen anzutreffen sind. Im Fall der Anionen-enthaltenden Höhle in YFP-H148Q ist die Bindestelle von amphiphiler Natur, wobei eine Seite mit polaren und geladenen Gruppen (Tyr203, das Chromophor, Arg96, Gln69 und Gln 183) und die andere Seite mit hydrophoben Resten (Ile152, Leu201, Val163, Val150 und Phe165) ausgekleidet ist.

Das Entwerfen von veränderten Fluoreszenzproteinen mit veränderten Anionen-Bindespezifitäten erfordert eine Berücksichtigung einer Reihe von Faktoren. Beispielsweise ist einer der signifikantesten Faktoren, die Anteil an der Anionenaffinität und -selektivität haben, die elektrostatische Konfiguration und der Aufbau der Bindetasche. Bei YFP umfassen diese die in der nachstehenden Tabelle E aufgeführten Gruppen. TABELLE E Ursprüngliche Position und vermutete Rolle

S65, Y66, G67	bildet Chromophor, aromatische Kante-Wechselwirkung mit Ion
Q69	Wasserstoffbindungen zu Ion
R96	Ladungswechselwirkung mit Ion
Q183	Ladungswechselwirkung mit Ion
Y203	Wasserstoffbindungen zu Ion (Y)

Im Allgemeinen kann eine Anionenbindung durch Schaffung von mehr und/oder festeren Bindewechselwirkungen zwischen dem interessierenden Anion und polaren Gruppen in der Bindetasche verbessert werden. Beispielsweise kann entweder eine direkte Substitution der vorstehenden polaren Reste durch polarere Reste oder eine Substitution von Resten von unterschiedlichen Größen, die wirksamer mit dem Anion Wechselwirken können, die Ionenbindung verbessern. Beispielsweise kann die Größe und Position des Chromophors durch die Substitution von S65 zu G, A, C, V, L, I oder T verändert werden. Y66 kann durch Substitution zu H, F oder W verändert werden. Q69 kann zu N oder K, R96 zu K, Q 183 zu N oder K substituiert werden.
Hydratationsenergie
Des Weiteren erfordert die Bindung eines Anions in einer verborgenen Höhle in der Nähe des Chromophors einen Austausch von Ionen-Lösungsmittel-Interaktionen durch Ionen-Protein-Interaktionen. Relative Bindungsenergien von monovalenten Anionen an YFP (Tabelle J) und YFP-H148Q (Jayaraman et al., 2000) in Relation zu ihrer Hydratationsenergie zeigen, dass Hydratationskräfte wichtigen Anteil an einer Bindung haben. In den nachstehenden Reihen von Monoanionen sind die Hydratationsenergien von schwach zu stark geordnet: CO₄- < I- < NO₃- < SCN- < Br- < Cl- < F(Wright & Diamond, 1977). Polyatomare Monoanionen und Iodid haben verhältnismäßig schwache Hydratationsenergien, während die anderen Halogenide stärker mit Wasser interagieren. Im Fall der sphärisch symmetrischen Halogenide nimmt die Hydratationsenergie mit abnehmendem Atomvolumen zu (Born, 1920), was der Grund dafür ist, dass größere Halogenide leichter in die hydrophobere Umgebung des Inneren eines Proteins einzubauen sind. Der Trend, der für eine Anionenbindung an die YFPs beobachtet wird, folgt im Groben den vorstehenden Reihen (Tabelle J). Die Proteininteraktion nimmt im Allgemeinen mit abnehmender Hydrata tionsenergie zu, mit der Ausnahme von Fluorid, das aufgrund seiner kleinen Größe bei einer Proteinbindung nicht vollständig dehydratisieren kann.
Die Entwicklung von Anionenbindestellen mit höherer Affinität erfordert daher die Schaffung von ausreichenden Ionen-Protein-Wechselwirkungen, beispielsweise durch die Substitution von hydrophoben Resten, die die Ionenbindetasche auskleiden, durch polarere Reste mit einem stärkeren Wasserstoff-bindenden Potential. Beispiele für diesen Typ an Substitutionen zur Verbesserung der Ionenbindung für kleinere und größere Anionen sind in Tabelle F gezeigt. TABELLE F i) Mutation von Aminosäuren um die Ionenbindetasche, um die Bindeaffinität für kleinere Anionen als Iodid zu erhöhen.
ii) Mutation von Aminosäuren um die Ionenbindetasche, um die Bindungsaffinität für größere Anionen als Iodid zu erhöhen.
Größe der Bindetasche
Die Größe und Form der Bindetasche kann auch von besonderer Wichtigkeit aufgrund der verborgenen Natur der Bindestelle für größere Anionen sein. TCA mit einem mittleren geometrischen Durchmesser von 6,2 Å (Halm & Frizzell, 1992) ist offensichtlich zu groß, um mit YFP in einem messbaren Ausmaß wechselzuwirken, während das etwas kleinere TFA schwache Bindung zeigt (Tabelle J). Verbesserungen in der Bindeaffinität von größeren Anionen könnten somit durch die Substitution von Aminosäuren, die die Bindetasche auskleiden, durch kleinere Reste wie vorstehend in Tabelle F gezeigt, sowie Erhöhung der Lösungsmittelzugänglichkeit wie nachstehend erörtert, erreicht werden.
Konformationelle Veränderungen bei einer Anionenbindung
Eine Reihe von konformationellen Veränderungen von verschiedenen Seitenketten, die die Bindetasche in YFP auskleiden, sind für eine Halogenidbindung notwendig. Die größten Bewegungen werden für Gln69 und Gln 183 festgestellt, obwohl die apolaren Seitenketten von Leu201, Ile152, Val150 und Val163 (11) alle Bewegungen durchlaufen, um die Größe der Höhle in Gegenwart von gebundenem Halogenid zu erhöhen. Ein weiterer Ansatz in Richtung festerer Anionenbindung ist daher die Substitution der Reste, die die dramatischste konformationelle Änderung bei einer Bindung durchlaufen, durch kleinere Reste. Diese Veränderungen können den Bedarf für strukturelle Umordnungen bei einer Bindung verringern, wodurch eine Anionenbindung energetisch bevorzugter gemacht wird. Diese Veränderungen umfassen die in der vorstehenden Tabelle F aufgeführten, sowie die Substitution von Q69 gegen N.
Lösungsmittelzugänglichkeit
Die Ergebnisse aus den strukturellen Bestimmungen verschiedener Mutationen bei His 148 legen nahe, dass spezifische Mutationen an dieser Stelle zu Gesamtstrukturangleichungen in dem β-Fass führen können, die direkt sowohl eine Lösungsmittelzugänglichkeit, als auch das Volumen der Bindetasche beeinflussen können. Eine Substitution von His148 beispielsweise zu kleineren Aminosäuren wie Q, N, G, A, L, V und I würde daher nach Vorhersage eine Lösungsmittelzugänglichkeit zu dem Chromophor erhöhen und folglich eine Bindung zu den größeren Anionen verbessern. In ähnlicher Weise wäre wahrscheinlich, dass eine Substitution von His148 durch größere Aminosäuren wie F oder W eine Anionenzugänglichkeit zu dem Chromophor verringert. In ähnlicher Weise könnten subtilere Veränderungen durch Substitution der Positionen 147 und 149 durch kleinere oder größere Aminosäuren erreicht werden.
Diese Mutationen werden typischerweise in das YFP-Matrizenprotein durch oligovermittelte Stellen-gerichtete Mutagenese eingebracht, um Bibliotheken von mutierten Proteinen herzustellen, die typischerweise eine Wahrscheinlichkeit von 10% dafür aufweisen, dass sie den Wildtyp-Aminosäurerest enthalten, und eine Wahrscheinlichkeit von 90% dafür aufweisen, dass sie einen der verschiedenen mutierten Reste enthalten. Unter Verwendung dieses Ansatzes ist es möglich, schnell Bibliotheken zu screenen, die verschiedene Kombinationen von Mutanten enthalten, um die besten Kombinationen für ein spezifisches interessierendes Anion zu identifizieren. Typischerweise kann dieser Vorgang iterativ wiederholt werden, um sicherzustellen, dass der Sequenzraum um die Bindetasche vollständig bezüglich eines jeglichen spezifischen interessierenden Anions untersucht wurde.
D. Herstellung von veränderten Fluoreszenzproteinen
Eine rekombinante Produktion eines Fluoreszenzproteins umfasst eine Expression eines Nukleinsäuremoleküls mit Sequenzen, die für das Protein kodieren.
In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure für ein Fusionsprotein, in dem ein einzelnes Polypeptid die Fluoreszenzproteingruppe in einem größeren Polypeptid umfasst. Das größere Polypeptid kann ein zweites funktionelles Protein wie einen FRET-Partner oder ein Frotein mit einer zweiten Funktion (wie ein Enzym, einen Antikörper oder ein anderes Bindeprotein) umfassen. Nukleinsäuren, die für Fluoreszenzproteine kodieren, sind als Ausgangsmaterialien geeignet.
Die Fluoreszenzproteine können als Fusionsproteine durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden. Eine rekombinante Herstellung von Fluoreszenzproteinen umfasst eine Expression von Nukleinsäuren mit Sequenzen, die die Proteine kodieren. Nukleinsäuren, die für Fluoreszenzproteine kodieren, können durch bekannte Verfahren erhalten werden. Fluoreszenzproteine können durch stellengerichtete Mutagenese von anderen Nukleinsäuren, die für Fluoreszenzproteine kodieren, oder durch zufällige Mutagenese, hervorgerufen durch eine Erhöhung der Fehlerrate einer PCR des ursprünglichen Polynukleotids mit 0,1 mM MnCl₂ und unaus geglichene Nukleotidkonzentrationen hergestellt werden; vgl. z.B. US-Patentanmeldung 08/337,915, eingereicht am 10. November 1994, oder Internationale Anmeldung PCT/US95/ 14692, eingereicht am 10. November 1995. Die Nukleinsäure, die für ein grünes Fluoreszenzprotein kodiert, kann durch Polymerase-Kettenreaktion von cDNA aus A. victoria unter Verwendung von Primern, die auf der DNA-Sequenz des grünen Fluoreszenzproteins von A. victoria basieren, wie in 3 dargestellt, isoliert werden. PCR-Verfahren sind beispielsweise in der US-PS 4,683,195, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 und Erlich, Hrsg., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989) beschrieben.
Die Herstellung von Expressionsvektoren und die Expression von Genen in transfizierten Zellen umfasst die Verwendung von molekularen Klonierungstechniken, die auch bekannt sind; vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) und Current Frotocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg. (Current Protocols, eine Zusammenarbeit zwischen Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc.). Der Expressionsvektor kann für eine Funktion in Prokaryonten oder Eukaryonten durch Einbau von geeigneten Promotoren, Replikationssequenzen, Markern usw. angepasst werden.
Nukleinsäuren, die für eine Transfektion von Zellen mit Sequenzen verwendet werden, die für eine Expression des interessierenden Polypeptids kodieren, werden im Allgemeinen in der Form eines Expressionsvektors vorliegen, der Expressionskontrollsequenzen umfasst, die operativ mit einer Nukleotidsequenz verbunden sind, die für eine Expression des Polypeptids kodiert. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Nukleotidsequenz, die für eine Expression eines Polypeptids kodiert" eine Sequenz, die bei einer Transkription und Translation von mRNA das Polypeptid erzeugt. Dies kann Sequenzen umfassen, die beispielsweise Introns enthalten. Expressionskontrollsequenzen sind operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden, wenn die Expressionskontrollsequenzen die Transkription und, so weit geeignet, Translation der Nukleinsäuresequenz steuern und regulieren. Somit können Expressionskontrollsequenzen geeignete Promotoren, Enhancer, Transkriptionsterminatoren, ein Start-Codon (d.h. ATG) vor einem Protein-kodierenden Gen, Splicingsignale für Introns, eine Aufrechterhaltung des richtigen Leserasters des Gens, um eine korrekte Translation der mRNA zu ermöglichen, und Stopp-Codons umfassen.
Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren mit der Sequenz, die für das Fluoreszenzprotein kodiert, und geeigneten Transkriptions-/Translations-Kontrollsignalen herzustellen. Diese Verfahren umfassen in vitro-rekombinante DNA-Techniken, synthetische Techniken und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination; vgl. beispielsweise die in Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989, beschriebenen Techniken.
Eine Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch herkömmliche Verfahren erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Falls der Wirt ein Prokaryont wie E. coli ist, können kompetente Zellen, die zur DNA-Aufnahme fähig sind, aus Zellen hergestellt werden, die nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet wurden und sodann durch das CaCl₂-Verfahren in an sich bekannter Weise behandelt wurden. Alternativ dazu können MgCl₂ oder RbCl verwendet werden. Eine Transformation kann auch nach Bildung eines Protoplasten der Wirtszelle oder durch Elektroporation erfolgen.
Falls der Wirt ein Eukaryont ist, können Transfektionsverfahren von DNA wie Calciumphosphat-Co-Präzipitate, herkömmliche mechanische Verfahren wie Mikroinjektion, Elektroporation, Insertion eines in Liposomen eingeschlossenen Plasmids oder Virusvektoren verwendet werden. Eukaryontische Zellen können auch mit DNA-Sequenzen, die für das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid kodieren, und einem zweiten fremden DNA-Molekül, das für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, wie das Herpes simplex-Thymidinkinasegen co-transfiziert werden. Ein weiteres Verfahren ist eine Verwendung eines eukaryontischen viralen Vektors wie Affenvirus 40 (SV40) oder Rinder-Papilloma-Virus, um transient eukaryontische Zellen zu infizieren oder transformieren und das Protein zu exprimieren (Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, Hrsg., 1982). Vorzugsweise wird ein eukaryontischer Wirt als die Wirtszelle wie hier beschrieben verwendet.
Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von entweder mikrobiell oder eukaryontisch exprimierten erfindungsgemäßen Polypeptiden können jegliche herkömmliche Verfahren sein wie beispielsweise präparative chromatographische Auftrennungen und immunologische Auftrennungen, beispielsweise diejenigen, die die Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder Antigen einbeziehen. In einer Ausführungsform können rekombinante fluoreszierende Proteine durch Expression einer Nukleinsäure, die für das Protein in E. coli kodiert, produziert werden. Aequo rea-bezogene Fluoreszenzproteine werden am besten durch Zellen exprimiert, die bei etwa 15°C bis 30°C kultiviert werden, jedoch sind höhere Temperaturen (wie 37°C) möglich. Nach einer Synthese sind diese Enzyme bei höheren Temperaturen (wie 37°C) stabil und können in Tests bei diesen Temperaturen verwendet werden.
Eine Vielzahl von Wirt-Expressions-Vektorsystemen kann für eine Expression einer Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz verwendet werden. Diese umfassen in nicht begrenzender Weise Mikroorganismen wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren mit einer Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz transformiert wurden, Hefe, die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren mit der Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz transformiert wurde, Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (wie Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV, Tabak-Mosaikvirus, TMV) infiziert wurden oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (wie Ti-Plasmid) mit einer Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz transformiert wurden, Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (wie Baculovirus) mit einer Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz infiziert wurden oder Tierzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (wie Retroviren, Adenovirus, Vacciniavirus) mit einer Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz infiziert wurden, oder transformierte Tierzellsysteme, die für eine stabile Expression verändert wurden.
Abhängig von dem verwendeten Wirts-/Vektorsystem kann ein jegliches einer Reihe von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, Transkriptions-Enhancer-Elemente, Transkriptionsterminatoren usw., in dem Expressionsvektor verwendet werden (vgl. beispielsweise Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Zum Beispiel können bei einer Klonierung in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren wie pL des Bakteriophagen Σ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromoter) und dergleichen verwendet werden. Bei einer Klonierung in Säugerzellsystemen können Promotoren, die von dem Genom von Säugerzellen (wie Metallothionein-Promoter) oder von Säugerviren (wie die retrovirale lange terminale Wiederholung, der späte Promoter von Adenovirus, der 7,5K-Promoter von Vacciniavirus) abgeleitet sind, verwendet werden. Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken hergestellt werden, können auch verwendet werden, um für eine Transkription der inserierten Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz zu sorgen.
In bakteriellen Systemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhafterweise ausgewählt werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung bezüglich des exprimierten Fluoreszenzproteins. Beispielsweise können, wenn große Mengen des Fluoreszenzproteins produziert werden sollen, Vektoren erwünscht sein, die die Expression von großen Mengen an Fusionsproteinprodukten, die leicht aufgereinigt werden, steuern. Diejenigen, die so verändert sind, dass sie eine Spaltstelle enthalten, um bei einer Wiedergewinnung des Fluoreszenzproteins zu unterstützen, sind bevorzugt.
In Hefe kann eine Reihe von Vektoren mit konstitutiven oder induzierbaren Promotoren verwendet werden. Bezüglich einer Übersicht wird auf Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Kapitel 13, 1988, Grant et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Herausgeber Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Band 153, Seiten 516-544, 1987, Glover, DNA Cloning, Band II, IRL Press, Wash., D.C., Kapitel 3, 1986 und Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Hrsg. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Band 152, Seiten 673-684, 1987 und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Hrsg. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Bände I und II, 1982, verwiesen. Ein konstitutiver Hefepromoter wie ADH oder LEU2 oder ein induzierbarer Promoter wie GAL kann verwendet werden (Cloning in Yeast, Kapitel 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Band 11, A Practical Approach, Hrsg. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Alternativ können Vektoren verwendet werden, die eine Integration von fremden DNA-Sequenzen in das Hefe-Chromosom fördern.
In Fällen, bei denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression einer Fluoreszenzprotein-kodierenden Sequenz durch einen jeglichen einer Reihe von Promotoren angetrieben werden. Beispielsweise können virale Promotoren wie die 35S RNA- und 19S RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., Nature 310:511-514, 1984) oder der Hüllprotein-Promoter von TMV (Takamatsu et., EMBO J. 6:307-311, 1987) verwendet werden. Alternativ können Pflanzenpromotoren wie die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680, Broglie et al., Science 224:838-843, 1984) oder Hitzeschockpromotoren wie hsp17.5-E oder hsp17.3-B aus Sojabohne (Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565, 1986) verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzen-Virusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation usw. eingebracht werden.
Für Übersichtsartikel bezüglich solcher Techniken wird beispielsweise auf Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Abschnitt VIII, Seiten 421-463, 1988 und Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2. Auflage, Blackie, London, Kapitel 7-9, 1988, verwiesen.
Ein alternatives Expressionssystem, das für eine Expression eines Fluoreszenzproteins verwendet werden könnte, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird Autographa californica-nukleärer Polyhedrosisvirus (AcNPV) als ein Vektor für eine Expression von Fremdgenen verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die für das Fluoreszenzprotein kodierende Sequenz kann in nichtessentielle Regionen (beispielsweise das Polyhedringen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promoters (beispielsweise des Polyhedrinpromoters) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion der für das Fluoreszenzprotein kodierenden Sequenz wird zu einer Inaktivierung des Polyhedringens und zu einer Produktion von nicht-okkludiertem rekombinantem Virus (d.h. Virus, dem die Proteinhülle, die durch das Polyhedringen kodiert wird, fehlt) führen. Diese rekombinanten Viren werden sodann für eine Infektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet, in denen das inserierte Gen exprimiert wird; vgl. Smith et al., J. Viol. 46:584, 1983, Smith, US-PS 4,215,051 .
Eukaryontische Systeme und vorzugsweise Säugerexpressionssysteme ermöglichen richtige posttranslationale Modifikationen von exprimierten Säugerproteinen. Eukaryontische Zellen, die die zelluläre Maschinerie für eine korrekte Prozessierung des Primärtranskripts, Glykosylierung, Phosphorylierung und vorteilhafterweise Sekretion des Genprodukts aufweisen, sollten als Wirtszellen für die Expression von Fluoreszenzprotein verwendet werden. Solche Wirtszelllinien können in nicht begrenzender Weise CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293 und WI38 umfassen.
Säugerzellsysteme, die rekombinante Viren oder virale Elemente verwenden, um eine Expression zu steuern, können verändert werden. Beispielsweise kann, wenn Adenovirus-Expressionsvektoren verwendet werden, die für das Fluoreszenzprotein kodierende Sequenz an einem Adenovirus-Transkriptions-/Translations-Kontrollkomplex wie den späten Promoter und die dreiteilige Leadersequenz ligiert werden. Dieses chimäre Gen kann sodann in das Adenovirusgenom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination inseriert werden. Eine Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (wie Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig ist und fähig ist, das Fluoreszenzprotein in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe beispielsweise Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3655-3659, 1984). Alternativ kann der Vaccinia-Virus-7.5K-Promoter verwendet werden (vgl. beispielsweise Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7415-7419, 1982, Mackett et al., J. Virol. 49:857-864, 1984, Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931, 1982). Von speziellem Interesse sind auf Rinderpappilomavirus basierende Vektoren, die die Fähigkeit aufweisen, als extrachromosomale Elemente zu replizieren (Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1: 486, 1981). Kurz nach Eintritt dieser DNA in Mäusezellen repliziert das Plasmid bis zu etwa 100 bis 200 Kopien pro Zelle. Eine Transkription der inserierten cDNA erfordert nicht die Integration des Plasmids in das Chromosom des Wirts, wodurch ein hoher Grad einer Expression erreicht wird. Diese Vektoren können für eine stabile Expression durch Einbau eines selektierbaren Markers in das Plasmid wie das neo-Gen verwendet werden. Alternativ kann das retrovirale Genom für eine Verwendung als ein Vektor modifiziert werden, der fähig ist, die Expression des Fluoreszenzprotein-Gens in Wirtszellen einzubringen und zu steuern (Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6349-6353, 1984). Starke Expression kann auch dadurch erreicht werden, dass induzierbare Promotoren, einschließlich in nicht begrenzender Weise den Metallothionein IIA-Promoter und Hitzeschock-Promotoren, verwendet werden.
Die Erfindung kann eine Lokalisationssequenz wie eine Kernlokalisationssequenz eine Lokalisationssequenz für das endoplasmatische Retikulum, eine Peroxisomen-Lokalisationssequenz, eine mitochondriale Lokalisationssequenz oder ein lokalisiertes Protein umfassen.
Lokalisationssequenzen können Zielsteuerungssequenzen sein, die beispielsweise in "Protein Targeting", Kapitel 35 von Stryer, L., Biochemistry (4. Auflage) W.H. Freeman, 1995, beschrieben sind. Die Lokalisationssequenz kann auch ein lokalisiertes Protein sein. Einige wichtige Lokalisationssequenzen umfassen diejenigen, die den Kern (KKKRK), die Mitochondrien (aminoterminal MLRTSSLFTRRVQPSLFRNILRLQST), das endoplasmatische Retikulum (KDEL am C-Terminus, unter der Annahme, dass eine Signalsequenz am N-Terminus vorliegt), Peroxisomen (SKF am C-Terminus), eine Prenylierung oder Insertion in die Plasmamembran (CaaX, CC, CXC oder CCXX am C-Terminus), die cytoplasmatische Seite der Plasmamembran (Fusion an SNAP-25) oder dem Golgi-Apparat (Fusion an Furin) ansteuern.
Für eine Langzeitproduktion mit hoher Ausbeute von rekombinanten Proteinen ist eine stabile Expression bevorzugt. Eher als eine Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit der Fluoreszenzprotein-cDNA, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (wie Promoter, Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) gesteuert wird, und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinantem Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und sich zu vermehren, um Foci zu bilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien expandiert werden können. Beispielsweise können nach dem Einbringen von Fremd-DNA veränderte Zellen 1 bis 2 Tage in einem angereicherten Medium vermehrt werden und sie werden sodann auf ein Selektionsmedium umgestellt. Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden. Beispielsweise können in nicht begrenzender Weise Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase- (Wigler et al., Cell, 11: 223, 1977), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase- (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962) und Adenin-Phosphoribosyltransferase-Gene (Lowy et al., Cell, 22:817, 1980) in tk-, hgprt- oder aprt-Zellen verwendet werden. Auch kann eine Antimetaboliten-Resistenz als die Basis für eine Selektion verwendet werden wie dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567, 1980, O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 1527, 1981), gpt, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072, 1981), neo, das Resistenz gegenüber dem Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981) und hygro, das Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre et al., Gene, 30: 147, 1984). In jüngerer Zeit wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden, hisD, das Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047, 1988), und ODC (Ornithin-Decarboxylase), die Resistenz gegenüber dem Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO, verleiht (McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg., 1987).
DNA-Sequenzen, die für das erfindungsgemäße Fluoreszenzprotein-Polypeptid kodieren, können in vitro durch DNA-Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. "Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor propagiert und seine DNA exprimiert werden kann. Der Begriff umfasst auch eine jegliche Nachkommenschaft der Wirtszelle. Es soll verstanden werden, dass alle Nachkommen nicht zu der parentalen Zelle identisch sein können, da Mutationen vorliegen können, die während einer Replikation auftreten. Jedoch sind solche Nachkommen von dem Begriff "Wirtszelle" umfasst. Verfahren eines stabilen Transfers, anders gesagt, wenn die Fremd-DNA kontinuierlich in dem Wirt aufrecht erhalten wird, sind bekannt.
Der Expressionsvektor kann in eine Wirtszelle für eine Expression der rekombinanten Nukleinsäure transfiziert werden. Wirtszellen können für hohe Grade an Expression selektiert werden, um das Fluoreszenzprotein-Fusionsprotein aufzureinigen. E. coli ist für diesen Zweck geeignet. Alternativ kann die Wirtszelle eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, die ausgewählt wird, um die Aktivität eines durch die Zelle produzierten Enzyms zu untersuchen. In diesem Fall ist das Linkerpeptid derart ausgewählt, dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch die Protease erkannt wird. Die Zelle kann beispielsweise eine kultivierte Zelle oder eine Zelle in vivo sein.
Ein primärer Vorteil von Fluoreszenzprotein-Fusionsproteinen ist, dass sie durch normale Proteinbiosynthese hergestellt werden, wodurch vollständig eine organische Synthese und das Erfordernis für maßgeschneiderte unnatürliche Aminosäureanaloga vermieden werden. Die Konstrukte können in E. coli in einem großen Maßstab für in vitro-Tests exprimiert werden. Eine Aufreinigung aus Bakterien ist vereinfacht, wenn die Sequenzen Polyhistidin-Tags für eine Ein-Schritt-Aufreinigung durch Nickelchelat-Chromatographie umfassen. Alternativ können die Substrate direkt in einer gewünschten Wirtszelle für in situ-Tests exprimiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein transgenes nichtmenschliches Tier bereitgestellt, das eine Nukleinsäuresequenz exprimiert, die für das Fluoreszenzprotein kodiert.
Die erfindungsgemäßen "nicht-menschlichen Tiere" umfassen ein jegliches nicht-menschliches Tier mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Fluoreszenzprotein kodiert. Solche nicht-menschlichen Tiere umfassen Vertebraten wie Nager, nicht-menschliche Primate, Schaf, Hund, Kuh, Schwein, Amphibien und Reptilien. Bevorzugte nicht-menschliche Tiere sind aus der Nagerfamilie ausgewählt, einschließlich Ratte und Maus, am meisten bevorzugt Maus. Die erfindungsgemäßen "transgenen nicht-menschlichen Tiere" werden durch Einbringen von "Transgenen" in die Keimbahn des nicht-menschlichen Tiers hergestellt. Embryonale Zielzellen bei verschie denen Entwicklungsstufen können für ein Einbringen von Transgenen verwendet werden. Verschiedene Verfahren werden abhängig von dem Entwicklungsstadium der embryonalen Zielzelle verwendet. Die Zygote ist das beste Ziel für eine Mikroinjektion. In der Maus erreicht der männliche Pronukleus die Größe von etwa 20 μm Durchmesser, was eine reproduzierbare Injektion von 1-2 pl DNA-Lösung ermöglicht. Die Verwendung von Zygoten als ein Ziel für einen Gentransfer hat einen hauptsächlichen Vorteil darin, dass in den meisten Fällen die injizierte DNA in das Wirtsgen vor der ersten Spaltung eingebaut werden wird (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985). Als eine Konsequenz werden alle Zellen des transgenen nicht-menschlichen Tiers das eingebaute Transgen tragen. Dies wird im Allgemeinen auch durch die effiziente Transmission des Transgens an Nachkommen des Ursprungstiers reflektiert, da 50% der Keimzellen das Transgen tragen werden. Eine Mikroinjektion von Zygoten ist das bevorzugte Verfahren zum Einbau von Transgenen bei der Durchführung der Erfindung.
Der Begriff "transgen" wird verwendet, um ein Tier zu beschreiben, das exogenes genetisches Material innerhalb aller seiner Zellen umfasst. Ein "transgenes" Tier kann durch Kreuzung von zwei chimären Tieren hergestellt werden, die exogenes genetisches Material in bei der Reproduktion verwendeten Zellen umfassen. 25% der sich ergebenden Nachkommen werden transgene Tiere sein, die das exogene genetische Material in all ihren Zellen in beiden Allelen tragen. 50% der sich ergebenden Tiere werden das exogene genetische Material in einem Allel umfassen und 25% werden kein exogenes genetisches Material umfassen.
Eine retrovirale Infektion kann auch für ein Einbringen eines Transgens in ein nicht-menschliches Tier verwendet werden. Der sich entwickelnde nichtmenschliche Embryo kann in vitro zu dem Blastozysten-Stadium kultiviert werden. Während dieser Zeit können die Blastomere Ziele für eine retrovirale Infektion sein (Jaenich, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-1264, 1976). Eine wirksame Infektion der Blastomere wird durch enzymatische Behandlung, um die zona pellucida zu entfernen, erhalten (Hogan, et al., (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Das virale Vektorsystem, das verwendet wird, um das Transgen einzubringen, ist typischerweise ein replikationsdefizientes Retrovirus, das das Transgen trägt (Jahner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931, 1985, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985). Eine Transfektion wird einfach und wirksam durch Kultivieren der Blastomere auf einer Monolayer von Virus-produzierenden Zellen erhalten (Van der Putten, supra, Stewart et al., EMBO J., 6:383-388, 1987). Alternativ kann eine Infektion bei einer späteren Stufe erfolgen. Virus oder Virus-produzierende Zellen können in das Blastozöl injiziert werden (D. Jahner et al., Nature 298:623-628, 1982). Die meisten der Ursprungstiere werden das Transgen in einer mosaikartigen Struktur aufweisen, da ein Einbau nur in einer Untergruppe der Zellen auftritt, die das transgene nicht-menschliche Tier bildeten. Ferner können die Ursprungstiere verschiedene retrovirale Insertionen des Transgens an verschiedenen Positionen in dem Genom enthalten, die sich im Allgemeinen in dem Nachkommen segregieren werden. Zusätzlich ist es auch möglich, Transgene in die Keimlinie durch intrauterine retrovirale Infektion des Embryos während der Trächtigkeit einzubringen, wenn auch bei niederer Wirksamkeit (D. Jahner et al., supra).
Ein dritter Typ von Zielzellen für ein Einbringen eines Transgens ist die embryonale Stammzelle (ES). ES-Zellen werden aus Embryonen vor der Implantation erhalten, in vitro kultiviert und mit Embryonen fusioniert (M. J. Evans et al., Nature 292:154-156, 1981, M.O. Bradley et al., Nature 309: 255-258, 1984, Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069, 1986 und Robertson et al., Nature 322:445-448, 1986). Transgene können wirksam in ES-Zellen durch DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion eingebracht werden. Solche transformierten ES-Zellen können sodann mit Blastozysten aus einem nicht-menschlichen Tier vereinigt werden. Die ES-Zellen kolonisieren sodann den Embryo und leisten einen Beitrag zu der Keimlinie des sich ergebenden chimären Tiers (bezüglich einer Übersicht vgl. Jaenisch, R., Science 240: 1468-1474, 1988).
"Transformiert" betrifft eine Zelle, in die (oder in dessen Vorfahr) mittels rekombinanter Nukleinsäuretechniken ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingebracht wurde. "Heterolog" betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die entweder von einer anderen Spezies abstammt oder bezüglich entweder der Ursprungsform oder der primär in der Zelle exprimierten Form modifiziert ist.
"Transgen" betrifft ein jegliches Stück an DNA, das künstlich in eine Zelle inseriert wird und Teil des Genoms des Organismus wird (d.h. entweder stabil integriert oder als ein stabiles extrachromosomales Element), der sich aus der Zelle entwickelt. Ein solches Transgen kann ein Gen umfassen, das teilweise oder vollständig heterolog (d.h. fremd) zu dem transgenen Organismus ist, oder kann ein Gen darstellen, das zu einem endogenen Gen des Organismus homolog ist. Von dieser Definition eingeschlossen ist ein Transgen, das durch Bereitstellung einer RNA-Sequenz erzeugt wird, die in DNA transkribiert und sodann in das Genom eingebaut wird. Die erfindungsgemäßen Transgene umfassen DNA-Sequenzen, die für das Fluoreszenzprotein kodieren, das in einem transgenen nicht-menschlichen Tier exprimiert werden kann. Der Begriff "transgen" wie hierin verwendet umfasst des Weiteren einen jeglichen Organismus, dessen Genom durch in vitro-Manipulation des frühen Embryos oder des befruchteten Eis oder durch eine jegliche transgene Technologie, um einen spezifischen Gen-Knockout zu induzieren, verändert wurde. Der Begriff "Gen-Knockout" wie hier verwendet betrifft die gezielte Zerstörung eines Gens in vivo mit einem vollständigen Verlust der Funktion, die durch eine jegliche transgene Technologie erreicht wurde, die dem Fachmann bekannt ist. In einer Ausführungsform sind transgene Tiere mit Gen-Knockouts diejenigen, in denen das Zielgen nicht-funktionell durch Insertion in das Gen mittels homologer Rekombination gemacht wurde. Wie hier verwendet umfasst der Begriff "transgen" eine jegliche bekannte transgene Technologie, die einen Organismus erzeugen kann, der ein eingebrachtes Transgen trägt, oder einen Organismus produzieren kann, in dem ein endogenes Gen nicht-funktionell gemacht wurde oder "ausgeschaltet" wurde.
III. VERWENDUNG VON VERÄNDERTEN FLUORESZENZPROTEINEN
Die erfindungsgemäßen Proteine sind in jeglichen Verfahren verwendbar, bei denen Fluoreszenzproteine eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen veränderten Fluoreszenzproteine sind als Fluoreszenzmarker in den vielen Möglichkeiten verwendbar, in denen Fluoreszenzmarker bereits eingesetzt werden. Dies umfasst beispielsweise eine Kopplung von veränderten Fluoreszenzproteinen an Antikörper, Nukleinsäuren oder andere Rezeptoren für eine Verwendung in Nachweistests, wie Immunoassays oder Hybridisierungsassays.
Die erfindungsgemäßen veränderten Fluoreszenzproteine sind zum Nachverfolgen der Bewegung von Proteinen in Zellen verwendbar. In dieser Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül, das für das Fluoreszenzprotein kodiert, an ein Nukleinsäuremolekül fusioniert, das für das interessierende Protein in einem Expressionsvektor kodiert. Bei einer Expression in der Zelle kann das interessierende Protein basierend auf Fluoreszenz lokalisiert werden. In einer anderen Version werden zwei interessierende Proteine mit zwei veränderten Fluoreszenzproteinen mit unterschiedlichen Fluoreszenzcharakteristika fusioniert.
Die erfindungsgemäßen veränderten Fluoreszenzproteine sind in Systemen zum Nachweis einer Induktion von Transkription verwendbar. In bestimmten Ausführungsformen wird eine Nukleotidsequenz, die für das veränderte Fluoreszenzprotein kodiert, an interessierende Expressionskontrollsequenzen fusioniert und der Expressionsvektor in eine Zelle transfiziert. Eine Induktion des Promoters kann durch Nachweis der Expression und/oder der Menge an Fluoreszenz gemessen werden. Solche Konstrukte können verwendet werden, um Signalwege vom Rezeptor zum Promotor nachzuverfolgen.
Die erfindungsgemäßen veränderten Fluoreszenzproteine sind in Anwendungen einsetzbar die FRET einbeziehen. Solche Anwendungen können Ereignisse als eine Funktion der Bewegung eines Fluoreszenzdonors und Fluoreszenzakzeptors zueinander oder weg voneinander nachweisen. Ein Mitglied oder beide Mitglieder des Donor/Akzeptor-Paars können ein fluoreszierendes Protein sein. Ein bevorzugtes Donor- und Akzeptor-Paar für auf FRET basierende Tests ist ein Donor mit einer T203I-Mutation und ein Akzeptor mit der Mutation T203X, worin X eine aromatische Aminosäure-39, insbesondere T203Y, T203W oder T203H ist. In einem besonders geeigneten Paar enthält der Donor die nachstehenden Mutationen: S72A, K79R, Y145F, M153A und T203I (mit einem Exzitationspeak von 395 nm und einem Emissionspeak von 511 nm) und der Akzeptor enthält die nachstehenden Mutationer: S65G, S72A, K79R und T203Y. Dieses spezielle Paar stellt eine weite Trennung zwischen den Exzitations- und Emissionspeaks des Donors bereit und stellt eine gut e Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Donors und dem Exzitationsspektrum des Akzeptors bereit. Andere Mutanten mit einer Rot-Verschiebung wie die hier beschriebenen können auch als Akzeptor in einem solchen Paar verwendet werden.
In einem Aspekt wird FRET zum Nachweis der Spaltung eines Substrats eingesetzt, bei dem der Donor und der Akzeptor an das Substrat an gegenüberliegenden Seiten der Spaltstelle gekoppelt sind. Bei einer Spaltung des Substrats trennt sich das Donor/Akzeptor-Paar physikalisch, wodurch FRET beseitigt wird. Die Tests beinhalten ein In-Kontakt-Bringen des Substrats mit einer Probe und eine Bestimmung einer qualitat ven oder quantitativen Veränderung des FRET. In einer Ausführungsform wird da:. veränderte Fluoreszenzprotein in einem Substrat für β-Lactamase verwendet. Beispiele für solche Substrate sind in der US-Patentanmeldung 08/407,544, eingereicht am 20. März 1995 und in der internationalen Anmeldung PCT/US96/04059, eingereicht am 20. März 1996, beschrieben. In einer anderen Ausführungsform sind ein verändertes Fluoreszenzprotein-Donor/Akzeptor-Paar Teil eines Fusionsproteins, das durch ein Peptid mit einer proteolytischen Spaltstelle gekoppelt ist. Solche Tandem-Fluoreszenzproteine sind in der US-Patentanmeldung 08/594,575, eingereicht am 31. Januar 1996, beschrieben.
In einem weiteren Aspekt wird FRET zum Nachweis von Veränderungen des Potentials über eine Membran verwendet. Ein Donor und ein Akzeptor werden auf gegenüberliegende Seiten einer Membran gegeben, so dass einer die Membran in Reaktion auf eine Spannungsveränderung überschreitet. Dies erzeugt einen messbaren FRET. Ein solches Verfahren ist in der US-Patentanmeldung 08/481,977, eingereicht am 7. Juni 1995 und in der internationalen Anmeldung PCT/US96/09652, eingereicht am 6. Juni 1996, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen veränderten Proteine sind zur Herstellung von Biosensoren für eine Bestimmung der Konzentrationen von Ionen in Proben und lebenden Zellen und transgenen Organismen verwendbar. Beim Binden eines Ions an das Fluoreszenzprotein tritt eine Veränderung in mindestens einer messbaren Fluoreszenzeigenschaft des veränderten Fluoreszenzproteins auf, die die Grundlage für die Bestimmung des Vorliegens des interessierenden Ions bereitstellt.
Die erfindungsgemäßen veränderten Proteine sind für die Herstellung von Fluoreszenzsubstraten für Proteinkinasen verwendbar. Solche Substrate umfassen eine Aminosäuresequenz, die durch Proteinkinasen erkennbar ist. Bei einer Phosphorylierung durchläuft das veränderte Fluoreszenzprotein eine Veränderung in einer Fluoreszenzeigenschaft. Solche Substrate sind zum Nachweis und für eine Messung der Proteinkinaseaktivität in einer Probe einer Zelle bei Transfektion und Expression des Substrats verwendbar. Vorzugsweise wird die Kinase-Erkennungsstelle innerhalb von etwa 20 Aminosäuren eines Terminus des veränderten Fluoreszenzproteins eingesetzt. Die Kinase-Erkennungsstelle kann auch in eine Schleifendomäne des Proteins eingesetzt werden (vergleiche z.B. 1B). Verfahren zur Herstellung von Fluoreszenzsubstraten für Proteinkinasen sind in der US-Patentanmeldung 08/680,877, eingereicht am 16. Juli 1996, beschrieben.
Eine Proteaseerkennungsstelle kann auch in eine Schleifendomäne eingebracht werden. Bei einer Spaltung ändert sich eine Fluoreszenzeigenschaft in einer messbaren Weise.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Testchemikalie. Typischerweise umfasst das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen einer Testchemikalie mit einer Probe, die eine biologische Einheit, die mit einem funktionellen veränderten Fluoreszenzprotein markiert ist, oder ein für dieses funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein kodierendes Polynukleotid enthält. Durch eine Überwachung der Fluoreszenz (d.h. eine Fluoreszenzeigenschaft) von der Probe, die das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein enthält, kann bestimmt werden, ob eine Testchemikalie aktiv ist. Kontrollen können eingebaut werden, um die Spezifität des Signals sicherzustellen. Solche Kontrollen umfassen Messungen einer Fluoreszenzeigenschaft bei Fehlen der Testchemikalie, bei Gegenwart einer Chemikalie mit einer erwarteten Aktivität (wie einem bekannten Modulator) oder veränderte Kontrollen (wie Fehlen von veränderten Fluoreszenzproteinen, Fehlen von Polynukleotiden für veränderte Fluoreszenzproteine oder Fehlen von operativer Verbindung der veränderten Fluoreszenzproteine).
Die Fluoreszenz in Gegenwart einer Testchemikalie kann größer sein oder geringer sein als bei Fehlen der Testchemikalie. Zum Beispiel kann, falls das veränderte Fluoreszenzprotein als ein Reporter der Genexpression verwendet wird, die Testchemikalie die Genexpression herauf- oder herunterregulieren. Für solche Screening-Typen ist das Polynukleotid, das für das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein kodiert, operativ mit einem genomischen Polynukleotid oder einem re verbunden. Alternativ ist das funktionelle veränderte Fluoreszenzprotein mit einem zweiten funktionellen Protein fusioniert. Diese Ausführungsform kann verwendet werden, um eine Lokalisation des zweiten Proteins zu verfolgen oder Protein-Frotein-Interaktionen unter Verwendung von Energietransfer zu verfolgen.
IV. VERFAHREN
Fluoreszenz in einer Probe wird mit Hilfe eines Fluorimeters gemessen. Im Allgemeinen tritt Anregungsstrahlung von einer Anregungsquelle mit einer ersten Wellenlänge durch Anregungsoptik. Die Anregungsoptik verursacht, dass die Anregungsstrahlung die Probe anregt. In Reaktion darauf emittieren Fluoreszenzproteine in der Probe Strahlung, die eine Wellenlänge aufweist, die von der Anregungswellenlänge verschieden ist. Sammlungsoptik sammelt sodann die Emission aus der Probe. Die Vorrichtung kann eine Temperatursteuereinheitumfassen, um die Probe bei einer spezifischen Temperatur zu halten, während sie untersucht wird. Gemäß einer Ausführungsform bewegt ein Mehrfachachsen-Translationstisch eine Mikroti terplatte, die eine Mehrzahl von Proben hält, um verschiedene Wells, die exponiert werden sollen, zu positionieren. Der Mehrfachachsen-Translationstisch, die Temperatursteuereinheit, eine Autofokussierungsvorrichtung und Elektronik, die mit einer Bildgebung und Datensammlung assoziiert ist, können durch einen geeigneterweise programmierten Digitalcomputer verwaltet werden. Der Computer kann auch die während des Tests gesammelten Daten in ein anderes Format für eine Darstellung transformieren. Dieser Vorgang kann miniaturisiert und automatisiert werden, um ein. Screening von vielen Tausenden von Verbindungen zu ermöglichen.
Verfahren zum Durchführen von Tests auf Fluoreszenzmaterialien sind bekannt und beispielsweise beschrieben in Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, Band 30, Hrsg. Tayler, D.L. & Wang, Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), Seiten 219-243; Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), Seiten 296-361.
Mutagenese und Herstellung von Protein
YFP-Varianten und -Revertanten wurden gemäß Herstellerangaben und unter Verwendung des YFP-Klons 10c als Matrize unter Verwendung des auf PCR-basierenden QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) hergestellt (Ormo et al., 1996). Mutationen wurden durch Sequenzierung des gesamten Gens bestätigt und alle GFP-Varianten wurden wie beschrieben exprimiert und aufgereinigt (Ormo et al., 1996).
Fluoreszenzmessungen
Kleine Mengen von konzentriertem Protein wurden 25-fach in eine Reihe von Puffern (20 mM MES pH 6,0, MES pH 6,5, PIPES pH 7,0, HEPES pH 7,5 und TAPS pH 8,0) mit einer konstanten Ionenstärke verdünnt. Die Puffer enthielten veränderliche Konzentrationen von entweder Kaliumchlorid oder Kaliumiodid und die Ionenstärke wurde auf 150 mM mit Kalium-D-Gluconat eingestellt. Fluoreszenzmessungen als eine Funktion des pH-Werts und der Halogenid-Konzentration erfolgten auf einem Hitachi F4500-Fluoreszenzspektrophotometer bei Raumtemperatur (λ_ex = 514 nm), wobei die Emission zwischen 520 und 550 nm dreimal bei einer Geschwindigkeit von 60 nm/min. gescannt wurde. Maximale Emission bei 528 nm wurde gemittelt und in Hinblick auf die Fluoreszenz ohne Halogenide normalisiert.
Kristallwachstum und Datensammlung
YFP-H148Q wurde auf 15 mg/ml in 20 mM TRIS pH 7,9 konzentriert und Kristalle wurden in hängenden Tropfen mit 5 μl Protein und 5 μl Mutterlösung gezüchtet. Die Mutterlösung enthielt 22% PEG 1550 bei einem pH-Wert von 5,5 in 100 mM Natriumacetat und 90 mM MgCl₂. Die stäbchenförmigen Kristalle wiesen einen Durchmesser von etwa 0,04 mm und eine Länge von bis zu 1,0 mm auf und wuchsen innerhalb von 1,5 bis 2 Jahren bei 4°C. Ein Kristall wurde in synthetischer Mutterlösung mit den vorstehend beschriebenen Bestandteilen ohne MgCl₂, jedoch mit 100 mM Kaliumiodid und 20% Ethylenglykol für eine Cryo-Protektion getränkt (als Iodid-Tränken bezeichnet). Ein weiterer Kristall wurde in der vorstehend beschriebenen Mutterlösung mit 100 mM MgCl₂ und 20% Ethylenglykol getränkt (als Chlorid-Tränken bezeichnet). Beide Tränkungen erfolgten bei einem pH-Wert von 4,6 für 4 Stunden bei Raumtemperatur und eine Datensammlung folgte unmittelbar danach. Die Kristalle wurden flash-gefroren und Röntgenstreudaten wurden bei 100 K unter Verwendung einer RAXIS-IIc-Bildplatte auf einem Rigaku RUH3-rotierenden Anodengenerator, der mit Spiegeln ausgestattet war, gesammelt.
Strukturbestimmung von YFP-H148Q und Identifizierung von Iodid-Bindestellen
Die zwei Datensätze wurden mit Denzo v1.9 bearbeitet und unter Verwendung von ScalePack bewertet (Otwinowski & Minor, 1997). Die Raumgruppe ist P2₁2₁2₁ mit Einheitszellparametern von a = 51,2, b = 62,8 und c = 68,7 Å für das Iodid-Tränken und a = 51,7, b = 62,6 und c = 66,2 Å für das Chlorid-Tränken. Die Kristalle sind nahezu isomorph zu den beschriebenen YFP-H148G- (Wachter et al., 1998) und GFP S65T-Kristallen (Ormo et al., 1996), und die YFP-H 148G-Koordinatendatei 2yfp (Wachter et al., 1998) wurde als Modell für eine Phasenbildung verwendet. Ein Modell für den anionischen Chromophor wurde durch halbempirische Molekülorbital-Berechnungen unter Verwendung von AM1 in dem Programm SPARTAN Version 4.1 erhalten (Wavefunction Inc., Irvine, CA).
Eine anomale Unterschiede-Karte wurde aus dem Datensatz berechnet, der von dem Iodid-Tränken abgeleitet war (anomale Daten waren 65% vollständig), da Iod ein signifikantes anomales Signal bei der In-House-CuK_α-Wellenlänge von 1,54 Å aufweist. Schweratom-Phasen wurden näherungsweise durch Subtraktion von 90° von berechneten Proteinphasen unter Verwendung des Programms Scaleit in dem CCP4-Programmpaket berechnet (Collaborative Computational Project N. 4, 1994). Die anomale Unterschiede-Karte identifizierte zwei Iodid-Positionen, wobei eine in dem Proteininneren verborgen war und eine auf der Proteinoberfläche lag.
Verfeinerung von YFP-H148Q mit und ohne gebundenem Iodid
Die zwei Datensätze, die aus dem Iodid- und aus dem Chlorid-Tränken abgeleitet waren, wurden in einer ähnlichen Weise verfeinert. Nach einer anfänglichen Starrkörperverfeinerung auf 4,0 Å wurde eine Positionsverfeinerung unter Verwendung der Daten auf 3,0 Å und sodann zur Auflösungsgrenze (Tabelle 1) unter Verwendung des Programms TNT (Tronrud et al., 1987) durchgeführt. Während früher Zyklen der Verfeinerung wurden gebundene Halogenide nicht aufgebaut und das Glutamin an Position 148 wurde als ein Glycin aufgebaut. Elektronendichtekarten (2F₀–F_c und F₀–F_c) wurden intermittierend unter Verwendung von O untersucht (Jones et al., 1991). Die F₀–F_c-Karten zeigten deutlich die Positionen der verborgenen und an der Oberfläche liegenden Iodide bei 11 bzw. 5,5 rms Abweichung, die in den Zentren der zwei anomale Unterschiede-Dichtepeaks lagen, obwohl keine positiv Unterschied-Dichte festgestellt wurde, die mit der Bindung des verborgenen Chlorids konsistent war. Die Dichte für die Gln 148-Seitenkette war frühzeitig deutlich sichtbar, was einen Aufbau des Glutamins als ein Rotamer ermöglichte, das von dem ursprünglichen Histidin unterschiedlich war.
B-Faktoren wurden unter Verwendung der Default-TNT B-Faktorkorrelationsbibliothek verfeinert. B-Faktor-Korrelationswerte, die von His und Phe abgeleitet waren, wurden verwendet, um die Chromophorenatome aufzubauen. Gebundene Lösungsmittelmoleküle wurden zu dem Modell soweit geeignet hinzugefügt, wie bewertet aus der Differenzdichte und Nähe der Wasserstoffbindungspartner. Vor einer Verfeinerung der Belegung durch die gebundenen Halogenide wurden die B-Faktoren für diese Halogenide fixiert. Der thermische Faktor für das verborgene Iodid wurde auf den durchschnittlichen B-Faktor der dazu am nächsten liegenden 12 Atome, 30 Å², eingestellt (5) und der thermische Faktor für das Oberflächen-Iodid wurde auf den durchschnittlichen B-Faktor der 6 am nächsten liegenden Lösungsmittelmoleküle, die an die Proteinoberfläche gebunden waren, 39 Å², eingestellt. Der letzte Schritt in der Verfeinerung war die Verfeinerung der Belegung durch die zwei gebundenen Halogenide.
Bestimmung des pK_a-Werts des Chromophors und der Iodid-Bindungskonstanten durch Absorption
Der pK_a-Wert des Chromophors wurde aus Absorptionsscans bei veränderlichen Anionenkonzentrationen bestimmt. Absorptionsscans wurden bei Raumtemperatur zwischen 250 und 600 nm (Shimadzu 2101-Spektrophotometer) mit 0,05 mg/ml YFP unter zwei verschiedenen pH-Bedingungen, die für das spezifische Anion geeignet waren, wobei aus einer Reihe von Puffern ausgewählt wurde (20 mM Äpfelsäure pH 5,8, Äpfelsäure pH 6,1, MES pH 6,4, HEPES pH 7,1), gesammelt. Die optische Dichte des Chromophoren-Anions (514 bis 515 nm für YFP und YFP-H148Q bei dem Puffer-pH, sowie die optische Dichte bei einem pH-Wert von 9 ohne wechselwirkende Anionen wurden in der Henderson-Hasselbach-Gleichung verwendet, um den pK_a-Wert des Chromophors für jede untersuchte Bedingung zu ermitteln. Mikroskopische Bindungskonstanten für eine Anionenbindung des Proteins wurden durch Kurvenanpassung des pK_a-Werts des Chromophors zu der Anionenkonzentration unter Verwendung eines Ausdrucks für ein gekoppeltes Gleichgewicht, das zwei unterschiedliche Liganden einbezieht, extrahiert.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, sind jedoch nicht begrenzend zu verstehen.
BEISPIELE
Als ein Schritt zum Verständnis der Eigenschaften von GFP und um dabei zu helfen, GFPs mit veränderten Eigenschaften zu versehen, haben wir die dreidimensionale Struktur bei einer Auflösung von 1,9 Å der S65T-Mutante (R. Heim et al., Nature 373:664-665 (1995)) von A. victoria GFP bestimmt. Diese Mutante enthält auch die häufige Q80R-Substitution, die zufällig bei der frühen Verteilung der GFP-cDNA auftrat, und es ist nicht bekannt, dass sie irgendwelche Wirkungen auf die Eigenschaften des Proteins hat (M. Chalfie et al., Science 263:802-805 (1994)).
S65T-GFP (R. Heim et al., Nature 373:664-665 (1995)) mit einem Histidin-Tag wurde in JM109/pRSETs in 41 YT-Nährmedium mit Ampicillin bei 37°C, 450 Upm und 5 l/Min. Luftstrom überexprimiert. Die Temperatur wurde auf 25°C bei A₅₉₅ = 0,3 gesenkt, gefolgt von einer Induktion mit 1 mM Isopropylthiogalactosid für 5 Stunden. Zellpaste wurde bei –80°C über Nacht gelagert, sodann in 50 mM HEPES pH 7,9, 0,3 M NaCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert, einmal durch eine French-Presse bei 10 000 psi geleitet und sodann bei 20 kUpm 45 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarosesäule (Qiagen) aufgetragen, gefolgt von einem Waschen mit 20 mM Imidazol und einer Elution mit 100 mM Imidazol. Grüne Fraktionen wurden gepoolt und einer chymotryptischen (Sigma) Proteolyse (1:50 w/w) 22 Stunden bei Raumtemperatur unterzogen. Nach Zugabe von 0,5 mM PMSF wurde der Verdau erneut auf die Ni-Säule aufgetragen. Eine N-terminale Sequenzierung bestätigte das Vorliegen des richtigen N-terminalen Methionins. Nach Dialyse gegen 20 mM HEPES, pH 7,5 und einer Konzentration auf A₄₉₀ = 20 wurden stäbchenförmige Kristalle bei Raumtemperatur in hängenden Tropfen mit 5 μl Protein und 5 μl Well-Lösung, 22-26% PEG 4000 (Serva), 50 mM HEPES, pH 8,0-8,5, 50 mM MgCl₄ und 10 mM 2-Mercaptoethanol, innerhalb von 5 Tagen erhalten. Kristalle wiesen einen Durchmesser von 0,05 mm und eine Länge von bis zu 1,0 mm auf. Die Raumgruppe war P2₁2₁2₁ mit a = 51,8, b = 62,8, c = 70,7 Å, Z = 4. Zwei Kristallformen von Wildtyp-GFP, ohne Bezug zu der erfindungsgemäßen Form, wurden von M.A. Perrozo, K.B. Ward, R.B. Thompson und W.W. Ward, J. Biol. Chem. 203, 7713-7716 (1988) beschrieben.
Die Struktur von GFP wurde durch multiplen isomorphen Austausch und anomale Streuung (Tabelle E), Lösungsmittel-Abflachung, Phasenkombination und kristallographische Verfeinerung bestimmt. Das bemerkenswerteste Merkmal der Faltung von GFP ist ein elfsträngiges β-Fass (β-barrel), das um eine einzelne zentrale Helix gewickelt ist (1A und 1B), wobei jeder Strang aus etwa 9 bis 13 Resten besteht. Das Fass bildet einen nahezu perfekten Zylinder mit einer Länge von 42 A und einem Durchmesser von 24 Å. Die N-terminale Hälfte des Polypeptids umfasst drei anti-parallele Stränge, die zentrale Helix und sodann drei weitere anti-parallele Stränge, wobei der letztere (Reste 118-123) zu dem N-terminalen Strang (Reste 11-23) parallel ist. Das Polypeptid-Rückgrat kreuzt sodann den "Boden" des Moleküls, um die zweite Hälfte des Fasses in einem fünfsträngigen griechischer-Schlüssel-Motiv auszubilden. Das obere Ende des Zylinders besitzt eine Kappe aus drei kurzen verzerrten helikalen Segmenten, während ein kurzes sehr verzerrtes helikales Segment die Kappe für den Boden des Zylinders bildet. Die Hauptketten-Wasserstoffbindung, die die Oberfläche des Zylinders besetzt, ist sehr wahrscheinlich die Ursache für die ungewöhnliche Stabilität des Proteins gegenüber einer Denaturierung und Proteolyse. Es gibt keine langen Segmente des Polypeptids, die herausgeschnitten werden könnten, wobei die Intaktheit der Schale um den Chromophor beibehalten bleibt. Somit würde es schwierig erscheinen, GFP zu verändern, um dessen Molekulargewicht durch einen großen Prozentwert zu verringern (J. Dopf & T.M. Horiagon Gene 173:39-43 (1996)).
Der p-Hydroxybenzylidenimidazolidinon-Chromophor (C.W. Cody et al. Biochemistry 32:1212-1218 (1993)) ist vollständig vor der großen Menge an Lösungsmittel geschützt und liegt zentral in dem Molekül. Die gesamte und vermutlich steife Einkapselung ist möglicherweise für die kleine Stokes-Verschiebung (d.h. Wellenlängen-Unterschied zwischen Exzitations- und Emissionsmaxima), hohe Quantumausbeute einer Fluoreszenz, Unfähigkeit von O₂, den angeregten Zustand auszulöschen (B.D. Nageswara Rao et al., Biophys. J. 32:630-632 (1980)) und die Beständigkeit des Chromophors gegenüber einer Titration des äußeren pH-Werts (W.W. Ward, Bioluminescence and Chemiluminescence (M.A. DeLuca und W.D. McElroy, Hrsg.) Academic Press, Seiten 235-242 (1981); W.W. Ward & S.H. Bokman, Biochemistry 21:4535-4540 (1982); W.W. Ward et al., Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982)) verantwortlich. Sie ermöglicht auch eine Rationale darüber, warum die Bildung des Fluorophors ein spontaner intramolekularer Vorgang sein sollte (R. Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504 (1994)), da es schwierig ist, sich vorzustellen, wie ein Enzym Zutritt zu dem Substrat bekommen könnte. Die Ebene des Chromophors ist in etwa senkrecht (60) zu der Symmetrieachse des umgebenden Fasses. Eine Seite des Chromophors steht einer überraschend großen Höhle gegenüber, die ein Volumen von etwa 135 A3 einnimmt (B. Lee & F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)). Die Atomradien waren diejenigen von Lee & Richards, berechnet unter Verwendung des Programms MS mit einem Sondenradius von 1,4 Å (M.L. Connolly, Science 221:709-713 (1983)). Die Höhle öffnet sich nicht gegenüber dem Hauptlösungsmittel. Vier Wassermoleküle liegen in der Höhle, die eine Kette von Wasserstoffbindungen bilden, die die verborgenen Seitenketten von Glu²²² und Gln⁶⁹ verbindet. Sofern nicht besetzt, würde man annehmen, dass eine derart große Höhle das Protein um mehrere kcal/mol destabilisiert (S.J. Hubbard et al., Protein Engineering 7:613-626 (1994), A.E. Eriksson et al., Science 255:178-183 (1992)). Ein Teil des Volumens der Höhle könnte die Konsequenz der Verdichtung sein, die sich aus Zyklisierungs- und Dehydratisierungsreaktionen ergibt. Die Höhle könnte auch temporär das Oxidationsmittel, höchstwahrscheinlich O₂ beherbergen (A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995), R. Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504 (1994), S. Inouye & F.I. Tsuji, FEBS Lett. 351:211- 214 (1994)), das die α-β-Bindung von Tyr⁶⁶ dehydrogeniert. Der Chromophor, die Höhle und Seitenketten, die mit dem Chromophor in Kontakt stehen, sind in 2A und ein Teil der finalen Elektronendichtekarte in dieser Nähe in 2B gezeigt.
Die gegenüberliegende Seite des Chromophors ist gegenüber mehreren aromatischen und polaren Seitenketten gepackt. Von speziellem Interesse ist das komplizierte Netzwerk von polaren Wechselwirkungen mit dem Chromophor (2C). His¹⁴⁸, Thr²⁰³ und Ser²⁰⁵ bilden Wasserstoffbindungen mit der phenolischen Hydroxylgruppe. Arg⁹⁶ und Gln⁹⁴ interagieren mit der Carbonylgruppe des Imidazolidinonrings und Glu²²² bildet eine Wasserstoffbindung mit der Seitenkette von Thr⁶⁵, Weitere polare Interaktionen wie Wasserstoffbindungen zu Arg⁹⁶ von der Carbonylgruppe von Thr⁶² und der Seitenketten-Carbonylgruppe von Gln¹⁸³ stabilisieren vermutlich das verborgene Arg⁹⁶ in seiner protonierten Form. Diese verborgene Ladung legt wiederum nahe, dass eine teilweise negative Ladung auf dem Carbonyl-Sauerstoffatom des Imidazolidinonrings des deprotonierten Fluorophors liegt wie zuvor vorgeschlagen (W.W. Ward, Bioluminescence and Chemiluminescence (M.A. DeLuca und W.D. McElroy, Hrsg.) Academic Press, Seiten 235-242 (1981), W.W. Ward & S.H. Bokman, Biochemistry 21:4535-4540 (1982), W.W. Ward et al., Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982)). Arg⁹⁶ ist möglicherweise für die Bildung des Fluorophors wesentlich und könnte den anfänglichen Ringschluss unterstützen. Schlussendlich zeigt Tyr¹⁴⁵ eine typische stabilisierende Kante-Fläche-Wechselwirkung mit dem Benzylring. Trp⁵⁷, der einzige Tryptophanrest in GFP, liegt 13 Å bis 15 Å von dem Chromophor entfernt und die langen Achsen der zwei Ringsysteme sind nahezu parallel. Dies zeigt, dass ein wirksamer Energietransfer zu dem letzteren auftreten sollte, und erklärt, warum keine getrennte Tryptophanemission feststellbar ist (D.C. Prasher et al., Gene 111:229-233 (1992)). Die zwei Cysteine in GFP, Cys⁴⁸ und Cys⁷⁰, liegen 24 Å voneinander entfernt, zu weit entfernt, um eine Disulfidbrücke auszubilden. Cys⁷⁰ ist verborgen, Cys⁴⁸ sollte jedoch verhältnismäßig zugänglich gegenüber Sulfhydryl-spezifischen Reagenzien sein. Ein solches Reagenz, 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure), markiert GFP und löscht dessen Fluoreszenz (S. Inouye & F.I. Tsuji, FEBS Lett. 351:211-214 (1994)). Diese Wirkung wurde der Notwendigkeit für eine freie Sulfhydrylgruppe zugewiesen, könnte jedoch auch ein spezifisches Löschen durch die 5-Thio-2-nitrobenzoatgruppe widerspiegeln, die an Cys⁴⁸ binden würde.
Obwohl die Elektronendichtekarte größtenteils mit der vorgeschlagenen Struktur des Chromophors (D.C. Prasher et al., Gene 111:229-233 (1992), C.W. Cody et al., Biochemistry 32:1212-1218 (1993)) in der cis [Z-]-Konfiguration konsistent ist, und es keine Anzeichen für eine jegliche substanzielle Fraktion des gegenteiligen Isomers um die Doppelbindung des Chromophors gibt, finden sich unterschiedliche Merkmale bei > 4σ in der endgültigen (F₀-F_c) Elektronendichtekarte, die dahingehend interpretiert werden können, dass sie entweder das intakte, nicht-zyklisierte Polypeptid oder ein Carbinolamin darstellen (Nebenbild zu 2C). Dies legt nahe, dass eine signifikante Fraktion, möglicherweise soviel wie 30%, der Moleküle in dem Kristall die abschließende Dehydratisierungsreaktion nicht durchlaufen haben. Eine Bestätigung der unvollständigen Dehydratisierung ergibt sich aus einer Elektrospray-Massenspektrometrie, die in übereinstimmender Weise zeigt, dass die durchschnittlichen Massen von sowohl Wildtyp-, als auch S65T-GFP (3108614 bzw. 31099,5f4 Da) 6-7 Da größer als für die vollständig gereiften Proteine vorhergesagt (31079 bzw. 31093 Da) sind. Eine solche Abweichung könnte durch eine 30-35%-Molfraktion von Apoprotein oder Carbinolamin mit einem 18 oder 20 Da höheren Molekulargewicht erklärt werden. Die natürliche Menge von ¹³C und ²H und die begrenzte Auflösung des Hewlett-Packard 5989B-Elektrospraymassenspektrometers, das für diese Messungen verwendet wurde, erlauben keine Auflösung der einzelnen Peaks, ergeben jedoch stattdessen einen durchschnittlichen Massepeak mit einer vollen Breite bei halbem Maximum von etwa 15 Da. Die gezeigten Molekulargewich-te umfassen den His-tag, der die Sequenz MRGSHHHHHH GMASMTGGQQM GRDLYDDDDK DPPAEF (SEQ ID NO:5) aufweist. Mutanten von GFP, die die Wirksamkeit der Reifung des Fluorophors erhöhen, könnten etwas strahlendere Zubereitungen ergeben. In einem Modell für das Apoprotein liegt die Thr⁶⁵-Tyr⁶⁶-Peptidbindung in etwa in der α-helikalen Konformation vor, während das Peptid von Tyr⁶⁶-Gly⁶⁷ nahezu senkrecht zu der Helixachse durch seine Wechselwirkung mit Arg⁹⁶ zu stehen scheint. Dies stützt ferner die Spekulation, dass Arg⁹⁶ bei der Bildung der Konformation, die für eine Zyklisierung erforderlich ist, und möglicherweise auch für eine Beschleunigung des Angriffs von Gly⁶⁷ auf das Carbonylkohlenstoffatom von Thr⁶⁵ wichtig ist (A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995)).
Die Ergebnisse einer früheren zufälligen Mutagenese haben mehrere Aminosäureseitenketten mit wesentlichen Wirkungen auf die Spektren und das Atommodell impliziert. Es wird bestätigt, dass diese Reste nahe zu dem Chromophor liegen. Die Mutationen T203I und E222G haben grundlegende, jedoch gegensätzliche Konsequenzen auf das Absorptionsspektrum (T. Ehrig et al., FEBS Letters 367:163-166 (1995)). T203I (mit Wildtyp-Serbs) weist nicht den 475 nm-Absorptionspeak auf, der gewöhnlich dem anionischen Chromophor zugewiesen wird, und zeigt nur den 395 nm-Peak, der vermutlich den neutralen Chromophor wiedergibt (R. Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504 (1994), T. Ehrig et al., FEBS Letters 367:163-166 (1995)). Tatsächlich ist Thr²⁰³ über Wasserstoffbindungen zu dem phenolischen Sauerstoffatom des Chromophors gebunden, so dass ein Austausch durch Ile eine Ionisierung des phenolischen Sauerstoffatoms behindern sollte. Eine Mutation von Gluaaa zu Gly (T. Ehrig et al., FEBS Letters 367:163-166 (1995)) weist stark die gleiche spektroskopische Wirkung auf wie ein Austausch von Ser⁶⁵ durch Gly, Ala, Cys, Val oder Thr, nämlich eine Suppremierung des 395 nm-Peaks zugunsten eines Peaks bei 470-490 nm (R. Heim et al., Nature 373:664-665 (1995), S. Delagrave et al., Bio/Technology 13:151-154 (1995)). Tatsächlich sind Glu²²² und der Rest von Thr⁶⁵ zueinander über Wasserstoffbindungen in der erfindungsgemäßen Struktur verbunden, wobei möglicherweise die ungeladene Carboxylgruppe von Glu²²² als ein Donor für das Seitenketten-Sauerstoffatom von Thr⁶⁵ fungiert. Die Mutationen E222G, S65G, S65A und S65V würden alle eine solche H-Bindung unterdrücken. Um zu erklären, warum nur Wildtyp-Protein beide Anregungspeaks aufweist: Ser⁶⁵, im Gegensatz zu Thr⁶⁵, könnte eine Konformation einnehmen, in der seine Hydroxylgruppe eine Wasserstoffbindung für Glu²²² bereitstellt und Glu²²² als ein Anion stabilisiert, dessen Ladung sodann eine Ionisierung des Chromophors verhindert. Die Struktur erklärt auch, warum manche Mutationen neutral zu sein scheinen. Beispielsweise ist Gln⁸⁰ ein Oberflächen-Rest, der weit von dem Chromophor entfernt liegt, was erklärt, warum dessen zufällige und häufige Mutation zu Arg keine offensichtliche intramolekulare spektroskopische Wirkung aufzuweisen scheint (M. Chalfie et al., Science 263:802-805 (1994)).
Die Entwicklung von GFP-Mutanten mit rot-verschobenen Exzitations- und Emissionsmaximaist eine interessante Herausforderung bei einer Veränderung des Proteins (A.B. Cubitt et al., Trends Biochem. Sci. 20:448-455 (1995), R. Heim et al., Nature 373:664-665 (1995), S. Delagrave et al., Bio/Technology 13:151-154 (1995)). Solche Mutanten wären auch für ein Vermeiden einer zellulären Autofluoreszenz bei kurzen Wellenlängen, für eine gleichzeitige Vielfarben-Beschreibung der Aktivität von zwei oder mehreren zellulären Prozessen und für eine Ausnutzung des Fluoreszenzresonanzenergietransfers als ein Signal einer Protein-Protein-Wechselwirkung wertvoll (R. Heim & R.Y. Tsien, Current Biol. 6:178-182 (1996)).
Umfangreiche Versuche unter Verwendung von zufälliger Mutagenese haben das Emissionsmaximum um höchstens 6 nm zu längeren Wellenlängen, auf 514 nm verschoben (R. Heim & R.Y. Tsien, Current Biol. 6:178-182 (1996)). Zuvor beschrie bene Mutanten mit einer "Rot-Verschiebung" unterdrückten lediglich den Exzitationspeak bei 395 nm zugunsten des Peaks bei 475 nm ohne eine jegliche signifikante Rot-Verschiebung der 505 nm-Emission (S. Delagrave et al., Bio/Technology 13:151-154 (1995)). Da Thr²⁰³ benachbart zu dem phenolischen Ende des Chromophors liegt, mutierten wir es zu polaren aromatischen Resten wie His, Tyr und Trp in der Hoffnung, dass die zusätzliche Polarisierbarkeit ihrer Systeme die Energie des angeregten Zustands des benachbarten Chromophors senken würde. Alle drei Substitutionen verschoben tatsächlich den Emissionspeak auf mehr als 520 nm (Tabelle F). Eine besonders attraktive Mutation war T203Y/S65G/V68L/S72A mit Exzitations- und Emissionspeaks bei 513 bzw. 527 nm. Diese Wellenlängen sind ausreichend unterschiedlich von vorherigen GFP-Mutanten, um einfach durch geeignete Filtersätze auf einem Fluoreszenzmikroskop unterscheidbar zu sein. Der Exzitationskoeffizient, 36 500 M^-1cm^-1 und die Quantumausbeute, 0,63, sind nahezu so hoch wie diejenigen von S65T (R. Heim et al., Nature 373:664-665 (1995)).
Ein Vergleich von Aequorea-GFP mit anderen Proteinpigmenten ist aufschlussreich. Leider wurde sein nächstverwandtes charakterisiertes Homolog, das GFP aus der Seeanemone Renilla reniformis (O. Shimomura und F.H. Johnson, J. Cell. Comp. Physiol. 59:223 (1962), J. G. Morin und J.W. Hastings, J. Cell. Physiol. 77:313 (1971), H. Morise et al., Biochemistry 13:2656 (1974), W.W. Ward, Photochem. Photobiol. Reviews (Smith, K.C., Hrsg.) 4:1 (1979), W.W. Ward, Bioluminescence and Chemiluminescence (M.A. DeLuca und W.D. McElroy, Hrsg.), Academic Press, Seiten 235-242 (1981), W.W. Ward & S.H. Bokman, Biochemistry 21:4535-4540 (1982), W.W. Ward et al., Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982)), nicht sequenziert oder kloniert, obwohl dessen Chromophor wie in Wildtyp-Aequorea-GFP von der gleichen FSYG-Sequenz abgeleitet ist (R.M. San Pietro et al., Photochem. Photobiol. 57:635 (1993)). Das näheste Analogon, für das eine dreidimensionale Struktur verfügbar ist, ist das fotoaktive gelbe Protein (PYP, G. E. O. Borgstahl et al., Biochemistry 34:6278-6287 (1995)), ein 14 kDa-Photorezeptor aus einem halophilen Bakterium. PYP absorbiert in seinem nativen dunklen Zustand maximal bei 446 nm und transduziert Strahlung mit einer Quantumausbeute von 0,64, wobei es dem lange Wellenlänge-Absorptionsmaximum in der Nähe von 475 nm und der Fluoreszenzquantumausbeute von 0,72-0,85 des Wildtyp-GFP ziemlich nahe kommt. Der grundlegende Chromophor in beiden Proteinen ist eine anionische p-Hydroxycinnamylgruppe, die kovalent an das Protein über eine Thioesterbindung in PYP und einen heterocyclischen Iminolactam in GFP gebunden ist. Beide Proteine stabilisieren die negative Ladung an dem Chromophor mit Hilfe von verborgenen kationischen Arginin- und neutralen Glutaminsäuregruppen, Arg⁵² und Glu⁴⁶ in PYP und Arg⁹⁶ und Glu²²² in GFP, obwohl in PYP die Reste nahe zu dem Oxyphenylring liegen, während sie in GFP näher an dem Carbonylende des Chromophors liegen. Jedoch weist PYP eine Gesamt-α/β-Faltung mit geeigneter Flexibilität und Signaltransduktionsdomänen auf, um ihm zu ermöglichen, die zelluläre fototaktische Reaktion zu vermitteln, während GFP ein viel regelmäßigeres und steiferes β-Fass ist, um eine parasitische Verschwendung der Energie des angeregten Zustands als thermische oder konformelle Bewegungen zu minimieren. GFP ist ein elegantes Beispiel dafür, wie eine visuell ansprechende und äußerst hilfreiche Funktion, eine wirksame Fluoreszenz, spontan aus einer geschlossenen und ökonomischen Proteinstruktur erzeugt werden kann.
A. Zusammenfassung der Bestimmung der GFP-Struktur
Daten wurden bei Raumtemperatur intern unter Verwendung von entweder Molecular Structure Corp. R-axis II- oder San Diego Multiwire Systems (SDMS)-Detektoren (Cu Kα) und später bei dem Strahl X4A bei dem Brookhaven National Laboratory bei der Selenabsorptionskante (λ = 0,979 Å) unter Verwendung von Fotoplatten gesammelt. Daten wurden unter Verwendung des HKL-Pakets (Z. Otwinowski, in Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Data Collection and Processing, L. Sawyer, N. Isaacs, S. Bailey, Hrsg. (Science and Engineering Research Council (SERC), Daresbury Laboratory, Warrington, UK, (1991)), Seiten 56-62, W. Minor, XDISPLAYF (Purdue University, West Lafayette, IN, 1993)) oder der SDMS-Software (A.J. Howard et al., Meth. Enzymol. 114:452-471 (1985)) ausgewertet. Jeder Datensatz wurde aus einem einzigen Kristall gesammelt. Ein Tränken mit Schweratomen erfolgte bei 2 mM in Mutterlösung für zwei Tage. Anfängliche Elektronendichtekarten basierten auf drei Schweratomderivaten unter Verwendung von In-House-Daten und sie wurden später durch die Synchrotron-Daten ersetzt. Die EMTS-Differenz-Patterson-Karte wurde durch Betrachtung gelöst und sodann verwendet, um Unterschiede-Fourier-Karten der anderen Derivate zu berechnen. Eine Lack of closure-Verfeinerung der Schweratomparameter erfolgte unter Verwendung des Protein-Pakets (W. Steigemann, in der Doktorarbeit (Technische Universität, München, 1974)). Die MIR-Karten waren viel schwächer als die Gesamt-Leistungszahl nahe legen würde und es war klar, dass die EMTS-isomorphen Unterschiede die Phasenlage dominierten. Die verbesserte anomale Belegung für die Synchrotron-Daten stellte eine teilweise Lösung des Problems bereit. Es wird angemerkt, dass die Phasenleistung für die Synchrotron-Daten verringert war, jedoch war die Leistungszahl unverändert.
Alle experimentellen Elektronendichtekarten wurden durch Lösungsmittelabflachung unter Verwendung des Programms DM des CCP4-Pakets (CCP4: A Suite of Frograms for Protein Crystallography (SERC Daresbury Laboratory, Warrington WA4 4AD, UK, 1979)) unter Annahme eines Lösungsmittelgehalts von 38% verbessert. Eine Phasenkombination erfolgte mit PHASCO2 des Protein-Pakets unter Verwendung eines Gewichts von 1,0 auf dem Atommodell. Schweratomparameter wurden sodann durch Verfeinerung gegen kombinierte Phasen verbessert. Ein Modellaufbau erfolgte mit FRODO und O (T.A. Jones et al., Acta. Crystallogr. Sect. A 47:110 (1991), T.A. Jones, in Computational Crystallography, D. Sayre, Hrsg. (Oxford University Press, Oxford, 1982), Seiten 303-317) und eine kristallographische Verfeinerung erfolgte mit dem TNT-Paket (D.E. Tronrud et al., Acta Cryst. A 43:489-503 (1987)). Bindungslängen und -winkel für den Chromophor wurden unter Verwendung von CHEM3D (Cambridge Scientific Computing) abgeschätzt. Eine endgültige Verfeinerung und ein Modellaufbau erfolgten gegen den X4A Selenomethion-Datensatz unter Verwendung von (2F_o-F_c)-Elektronendichtekarten. Die Daten jenseits von 1,9 Å-Auflösung wurden in diesem Stadium nicht verwendet. Das endgültige Modell enthält die Reste 2-229, da die terminalen Reste in der Elektronendichtekarte nicht sichtbar sind, und die Seitenketten von mehreren ungeordneten Oberflächenresten wurden weggelassen. Die Dichte ist schwach für die Reste 156-158 und die Koordinaten für diese Reste sind unzuverlässig. Diese Unordnung ist mit vorhergehenden Analysen konsistent, die zeigten, dass die Reste 1 und 233-238 verzichtbar sind, jedoch weitere Verkürzungen eine Fluoreszenz verhindern können (J. Dopf & T.M. Horiagon, Gene 173:39-43 (1996)). Das Atommodell wurde in der Protein-Datenbank (Zugangscode 1EMA) hinterlegt. Tabelle G Beugungsdatenstatistiken
Phasenstatistika
Atommodell-Statistiken

Proteinatome 1790

Lösungsmittelatome 94

Auflösungsbereich (Å) 20-1,9

Anzahl an Reflektionen (F > 0) 17676

Vollständigkeit 84.

R-Faktor^(h) 0,175

65

Mittlerer B-Wert (Å²) 24,1

Abweichungen von dem Idealzustand

Bindungslängen (Å) 0,014

Bindungswinkel (°) 1,9

Eingeschränkte B-Werte (Å²) 4,3

Ramachandran-Ausreißer 0
Anmerkungen:

(a) Vollständigkeit ist das Verhältnis von beobachteten Reflexionen zu theoretisch möglichen Reflexionen, ausgedrückt als Prozentwert.
(b) Schale gibt die höchste Auflösungsschale mit typischerweise einer Breite von 0,1 bis 0,4 Å an.
(c) Rmerge = Σ|I – <I>|/Σ I, worin <I> der Mittelwert von einzelnen Messungen von Intensitäten I ist.
(d) Riso = Σ|I_DER – I_NAT|/Σ I_NAT
(e) Derivate waren EMTS = Ethylmercurithiosalicylat (modifizierte Reste Cys⁴⁸ und Cys⁷⁰), SeMet = Selenomethionin-substituiertes Protein (Met¹ und Met²³³ konnten nicht lokalisiert werden), HgI₄-SeMet = Doppelderivat HgI₄ auf SeMet-Hintergrund.
(f) Phasenleistung = <F_H>/<E>, worin <F_H> = Effektwert (rms)-Schweratomstreuung und <E> = lack of closure.
(g) FOM, mittlere Leistungszahl.
(h) Standard-kristallographischer R-Faktor, R = Σ ||F_obs| – |F_calc||/ Σ |F_obs|

B. Spektrale Eigenschaften von Thr²⁰³ ("T203")-Mutanten im Vergleich zu S65T
Die Mutationen F64L, V68L und S72A verbessern die Faltung von GFP bei 37° (B.P. Cormack et al., Gene 173:33 (1996)), verschieben jedoch nicht signifikant die Emissionsspektren. TABELLE H
C. YFP und YFP-H148Q als Halogenidsensoren bei saurem und neutralem pH-Wert
Das Absorptionsspektrum für YFP ist eine Funktion der NaCl-Konzentration (7) mit einer Konversion von Bande B, dem Chromophor-Anion (λmax 514 nm), zu Bande A, der neutralen Form (λmax 392 nm), bei Zugabe von Chlorid. Da nur das Anion in den YFPs fluoresziert, tritt gleichzeitig mit einer Erhöhung von (NaCl] eine Suppression der Fluoreszenz auf. Für YFP wird ein sauberer isosbestischer Punkt beobachtet (7), während für YFP-H148Q der isosbestische Punkt weniger gut definiert ist (Jayaraman et al., 2000). Der Effekt ist vollständig reversibel. In YFP-H148Q und YFP-H148G erfährt das Absorptionsmaximum der Bande A eine Blau-Verschiebung um 20 nm (von 415 nm auf 395 nm) bei Zugabe von Salz, obwohl das Absorptionsmaximum der Bande B unberührt bleibt. Die detaillierten Bindegleichgewichte und Anionen-Spezifitäten werden nachstehend erörtert.
Um weiter die Verwendbarkeit der YFPs als Halogenidsensoren zu etablieren, insbesondere für Organellen, die saurer sind als das Cytosol (pH 7,4), wo ein CFTR-Pumpen getestet wurde (Jayaraman et al., 2000), wurde die Emissionsintensität von YFP und YFP-H148Q zwischen 0 und 150 mM NaCl bei einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 (8A, B) unter Bedingungen einer konstanten Ionenstärke gemessen. Es wurde festgestellt, dass YFP eine ausgezeichnete Sonde unter sauren Bedingungen darstellt. Bei einem pH-Wert von 6,0 nimmt die Fluoreszenz um 39% von 0 bis 20 mM NaCl ab, während bei dem cytosolischen pH-Wert von 7,5 die Abnahme nur 3,2% unter identischen Bedingungen beträgt. Im Fall von mit NaCl titriertem YFP-H148Q ist der Fluoreszenzverlust auch groß bei einem pH-Wert von 6,0 (48%) und bleibt ziemlich signifikant (11%) bei einem pH-Wert von 7,5. Für Messungen der Chloridkonzentrationen in dem niedrigen millimolaren Bereich in der Nähe eines neutralen pH-Werts scheint YFP-H148Q die bevorzugte Sonde zu sein. Falls Chlorid gegen Iodid ausgetauscht wird, ist der Fluoreszenzverlust von YFP-H148Q sehr viel größer, sogar bei einem pH-Wert von 7,5, wo ein Verlust von 50% festgestellt wird (0 bis 20 mM NaI) (8B). Diese Beobachtung wurde kürzlich in vivo in Studien eines Cl-/I--Austausches durch den CFTR-Kanal in Plasmamembranen ausgenutzt (Jayaraman et al., 2000). Im Gegensatz zu der vorstehend beschriebenen Variante ist in dem ursprünglichen YFP die Größe des Iodideffekts mehr vergleichbar zu dem Chlorideffekt (vergleiche nachstehend beschriebene Bindedaten).
D. Kristallographische Identifizierung und Beschreibung von Halogenid-Bindestellen
Es wurden zwei Kristallstrukturen von YFP-H148Q bestimmt, wobei eine zwei gebundene Iodide enthält (Tränken mit 100 mM Iodid) und die andere keine gebundenen Halogenide enthält (Tränken mit 200 mM Chlorid). Die jeweiligen R-Faktoren sind 18,8% und 20,4% bei einer Auflösung von 2,1 Å und die Geometrie ist verhältnismäßig gut. Eine Zusammenfassung der relevanten kristallographischen Statistiken ist in Tabelle I wiedergegeben. Da Iod ein anomales Signal bei der In-House-CuKa-Wellenlänge aufweist, wurde eine anomale Differenzkarte für das Tränken mit Iodid berechnet, um Schweratompositionen zu identifizieren. Es wurden zwei verschiedene Elektronendichtepeaks bei Effektivwerten von 7,7 bzw. 5,5 festgestellt, wobei einer in der Nähe des Chromophors und im Proteininneren verborgen lag und der andere in einer kleinen Einbuchtung auf der Proteinoberfläche in der Nähe von Trp57 bei der Kappe des Fasses lag (Daten nicht gezeigt).
Das verborgene Iodid verfeinerte bis zu einer Belegung von 0,60, wobei der thermische Faktor bei 30 Å² fixiert wurde, was zeigt, dass eine Bindung in dem Kristall bei 100 mM Iodid nicht nahezu so fest wie in Lösung ist, wo die Bindungskonstante 2,7 mM beträgt (vergleiche nachstehend). Dieses Iodid liegt 4,3 Å entfernt von dem he terocyclischen Carbonylsauerstoffatom des Chromophors und ist an einer Ladungswechselwirkung mit Arg96 bei einer Entfernung von 4,1 Å zu NE2 der Guanidiniumgruppe beteiligt (9 und 10), eine verborgene positive Ladung, die möglicherweise eine große Fraktion der Anionen-Bindeenergie bereitstellt. Ferner ist das Iodid über Wasserstoffbindungen sowohl an die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr203, als auch das Seitenkettenamidstickstoffatom von Gln69 gebunden, wobei die Wasserstoffbindungsentfernungen 3,3 bzw. 3,2 Å betragen (9 und 10). Diese Entfernungen liegen im Bereich von Wasserstoffbindungsentfernungen, die für ein mit einem Sauerstoffatom oder einem Stickstoffatom wechselwirkendem Iodid erwartet werden. Eine statistische Datenbankanalyse der Kristallstrukturen von kleinen Molekülen zeigte, dass der mittlere Abstand zwischen einem Iodid und einer phenolischen Hydroxylgruppe 3,47 Å und zwischen einem Iodid und einem sp²-hybridisierten Stickstoffatom 3,66 Å beträgt (Steiner, 1998). Es stellte sich heraus, dass in einer Kristallstruktur von Haloalkan-Dehalogenase mit gebundenem Iodid das Iodid 3,4 und 3,6 Å von den Indol-Stickstoffatomen der zwei Tryptophangruppen, 3,3 Å von einem Lösungsmittelmolekül und 4,2 Å von dem phenolischen Sauerstoffatom eines Tyrosins entfernt liegt (Verschueren et al., 1993).
Das verborgene Halogenid weist auch Wechselwirkungen mit den aromatischen Ringen des Chromophors und von Tyr203 auf (9). Anionen liegen häufig vorzugsweise in oder in der Nähe der Ebene von aromatischen Ringen, da die Wasserstoffatome von aromatischen Ringen eine teilweise positive Ladung tragen (Burley & Petsko, 1988). In YFP-H148Q liegt das Iodid nicht ganz in der Ebene eines der beiden π-Systeme, liegt jedoch nahezu in gleicher Entfernung von den zwei Ebenen, versetzt zu dem Zentrum der Stapel-Wechselwirkung, 4,1 Å entfernt von dem aromatischen CE1 von Tyr203 und 4,5 Å entfernt von dem aromatischen CD2 des Chromophors (9). Auf der gegenüberliegenden Seite der Bindestelle kleidet eine Reihe von hydrophoben Resten die Halogenid-Bindestelle aus, bestehend aus Ile 152, Leu201, Val163, Val150 und Phe165, die alle in der Nähe eines van der Waals-Kontakts mit dem Iodid stehen. Sowohl aromatische Kante-Wechselwirkungen mit Tyrosinen und Tryptophanen, als auch apolare Wechselwirkungen mit hydrophoben Seitenketten finden sich herkömmlicherweise in anderen Halogenid-Bindestellen in Proteinen wie in Haloalkan-Dehalogenasen (Pikkemaat et al., 1999).
Das zweite, Oberflächen-gebundene Iodid ist über Wasserstoffbindungen mit dem Amid-Stickstoffatom von Trp 57 und mehreren geordneten Lösungsmittelmolekülen verbunden. Dieses exponierte Anion liegt 16 Å von dem phenolischen Sauerstoff atom des Chromophors entfernt, was zeigt, dass sein Einfluss auf den Ladungszustand des Chromophors vernachlässigbar ist. Die Belegung dieses Halogenids verfeinert auf 0,41 mit einer Fixierung des B-Faktors auf 39 Å², was mit einer schwachen Bindung im Vergleich zu dem zu dem Chromophor benachbarten primären Iodid konsistent ist.
E. Konformationsänderungen in der Nähe des verborgenen Iodids
Die Anionen-Bindetasche in der Nähe des Chromophors scheint in der Apo-Struktur von YFP-H 148Q leer zu sein trotz der Tatsache, dass die Kristalle in Gegenwart von 180 mM Chlorid gezüchtet wurden, gefolgt von einem Tränken in 200 mM Chlorid. Die Lösungs-Bindungskonstante von 28 mM für Chlorid zeigt, dass die Tasche bei dem pH-Wert der Kristall-Mutterlösung, 4,6, größtenteils durch Chlorid belegt ist (vergleiche nachstehend). Wie es bei dem Tränken mit Iodid festgestellt wurde, scheinen die Moleküle in den Kristallen keine Anionen so fest wie in Lösung zu binden, was möglicherweise an Kristall-Packungskräften liegt. Das Volumen der inneren Höhle in YFP-H148Q beträgt 55 Å³, wie berechnet unter Verwendung einer Sonde mit einem Radius von 1,2 Å (Connolly, 1985).
Die Iodid-enthaltende Höhle in der gebundenen Struktur von YFP-H148Q ist größer, 91 Å³, um das eher große Iodid, das ein van der Waals-Volumen von 42 A³ aufweist, zu beherbergen. Eine Reihe von konformellen Änderungen von verschiedenen Seitenketten, die die Tasche auskleiden, wird beobachtet (11). Die größte Bewegung wird von Gln69 beobachtet, wo die Seitenketten-Amidgruppe aus dem Zentrum der Höhle herausschwang, was zu einer Bewegung von 2,6 Å des NE2, das über Wasserstoffbindungen mit dem Halogenid verbunden ist, führt (11 und 12). Das NE2 von Gln183 bewegte sich um 1,0 Å heraus, obwohl unklar ist, ob es ein Wasserstoffbindungsdonor für das Iodid oder Gln94 ist (NE2 und OE können gegenüberliegend zugewiesen werden). Die apolaren Seitenketten von Leu201, Ile 152, Val150 und Val163 (11) durchlaufen alle Bewegungen, um die Höhlengröße in Gegenwart von Iodid zu erhöhen, wobei sich ihre terminalen Kohlenstoffatome (CD 1 im Fall von Leucin und Isoleucin, CG1 im Fall der Valine) um 2,4 Å, 1,9 Å, 1,6 Å bzw. 1,2 Å bewegen. Die aromatische Ringebene von Phe165 hat um etwa 25° rotiert.
Die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr203 hat sich in Richtung der Iodid-enthaltenden Höhle um 0,6 Å bewegt, was wahrscheinlich die Wasserstoffbindungswech selwirkung mit dem Halogenid verbessert (12). Es scheint etwas Flexibilität bei der Positionierung der Seitenkette von Tyr203 in der Nähe des Chromophors aufzutreten, vermutlich da sie in eine große mit Wasser gefüllte Höhle herausragt, die ursprünglich in der Struktur von GFP S65T identifiziert wurde (Ormo et al., 1996). Eine C_α-Kohlenstoff-Überlagerung von 5 Strukturen von YFP und seinen Varianten (Wachter et al., 1998) zeigt, dass die C_β-Atome von Tyr203 sich ziemlich gut überlagern, während das phenolische Sauerstoffatom um bis zu 1,4 Å variiert. Die Wasserstoffbindung zwischen Tyr203 und dem Halogenid scheint von großer Wichtigkeit für die Bildung einer Halogenid-Bindestelle mit halbwegs fester Affinität zu sein (vergleiche nachstehende Mutationsanalyse). Die Verschiebung des Chromophors in Richtung des Halogenids kann auch dazu dienen, um aromatische Kante-Wechselwirkungen mit dem Anion zu verbessern. Als eine Konsequenz hat sich die Carboxylatgruppe von Glu222 von dem Ring-Stickstoffatom des Chromophors weggedreht (Entfernung erhöht sich von 3,3 auf 3,6 Å) und ist nun an einer festen Wasserstoffbindung zu Ser205 beteiligt (12).
F. Beziehung zwischen einer Anionenbindung und der Höhlengröße
Die verborgene Iodid-Stelle in YFP-H148Q identifiziert eine kleine Höhle, die in einer Reihe von untersuchten Strukturen vorliegt und dessen Größe nicht stark variiert (13). Bei einer Berechnung der van der Waals-Volumina unter Verwendung einer Kugel mit einem Sondenradius von 1,2 Å (Connolly, 1985) beträgt das Volumen dieser Höhle 21 Å³ in WT-GFP (Brejc et al., 1997), 19 Å³ in GFP-S65T (Ormo et al., 1996), 16 Å³ in YFP und YFP-H148G (Wachter et al., 1998) und 21 Å³ in YFP-H148G, getränkt in 500 mM KBr, wo die kristallographische Analyse zeigt, dass die Bindestelle auch leer ist (unveröffentlichte Daten). Die Position dieser Höhlen ist im Wesentlichen in den vorstehend aufgeführten GFPs gleich, wobei ihr Zentrum in der Nähe zu Val150, Val163, Leu201, Ile152, Gln183 und Gln69 liegt, jedoch etwa 6,6 Å von der Methylenbrücke des Chromophors und 6,1 Å von Arg96 entfernt liegt. WT (vergleiche nachstehend) und S65T-GFP (Wachter & Remington, 1999) scheinen nicht mit NaCl wechselzuwirken. Auf der anderen Seite weisen alle untersuchten YFPs Anionen-Wechselwirkungen auf, wobei die festeste C1--Bindung für YFP festgestellt wurde (vergleiche nachstehend). Deutlich stehen die Höhlengröße und -position nicht direkt mit einer CI--Bindung in Beziehung.
Die vorstehend beschriebenen Höhlen sind zu klein, um Chlorid, Bromid oder Iodid zu binden, deren van der Waals-Volumina 24,8 bis 54 Å³ betragen. Konformelle Veränderungen sind deutlich notwendig, um die Wechselwirkung mit jeglichen Anionen zu ermöglichen. In der Apo-Struktur von YFP-H148Q ist die Höhle etwas größer, sogar bei Fehlen von gebundenen Anionen, wobei das Volumen 55 Å³ beträgt. Bei dieser Variante ist die Höhle in Richtung des Chromophors verlängert und das Volumen ist durch kleine Bewegungen der Seitenkettenatome (0,4 Å und 1,2 Å), die die Bindungsstelle auskleiden (Gln69, Tyr203, Val150, Val163, Phe165, Arg96, His181), und des Chromophors selbst erhöht. Viele dieser Reste durchlaufen weitere Verschiebungen bei einer Iodidbindung wie vorstehend und in 6 beschrieben. Kompensationsbewegungen der terminalen Seitenketten-Kohlenstoffatome von Ile152 (2,1 Å) und Leu201 (2,3 Å) führen zu einem gewissen Grad an Umpackung des hydrophoben Kerns ohne dass die benachbarte Höhlen-Oberfläche stark verändert wird. Die größere Höhlengröße von YFP-H148Q kann teilweise für die unerwartet starke Bindung von Iodid im Vergleich zu Chlorid verantwortlich sein.
G. Relaxierung des β-Fasses in Reaktion auf die H148Q-Substitution und eine Iodidbindung
Sowohl das Einbringen von H148Q in einen YFP-Hintergrund bei Fehlen von Halogeniden, als auch die Bindung von Iodid an YFP-H148Q führen zu strukturellen Anpassungen der β-Stränge 7 (Reste 143 bis 154) und 8 (Reste 160 bis 171). Diese Anpassungen sind in C_α-Überlagerungen von YFP und YFP-H148Q mit einer Abweichung des Effektivwerts von 0,42 Å und von YFP-H148Q mit und ohne I- mit einer Abweichung des Effektivwerts von 0,47 Å zu erkennen (14). An einer Kappe des Fasses sind die Stränge 7 und 8 über eine Schleife verbunden, die auf Rest 158 konzentriert ist, während in der Nähe der anderen Kappe des Fasses Strang 7 eine β-Ausbauchung um den Rest 148 ausbildet und Hauptketten-β-Faltblattwechselwirkungen zerstört sind (Ormo et al., 1996, Wachter et al., 1998). Anstelle dessen bilden mehrere geordnete Lösungsmittelmoleküle und Seitenketten-Kontakte (His 148 in YFP, Gln 148 in YFP-H148Q) ein Wasserstoffbindungsnetzwerk zwischen den Strängen (14). Bei einer Substitution von His 148 durch Gln wird das α-Kohlenstoffatom von Rest 166 in Richtung des Zentrums des Fasses um 0,94 Å gezogen und das α-Kohlenstoffatom des Rests 148 wird um 0,94 Å hinausgedrängt. Diese Bewegungen werden durch strukturelle Anpassungen innerhalb der Regionen der benachbarten Schleife kompensiert (1,4 Å-Verschiebung durch das α-Kohlenstoffatom von Rest 172 und 0,94 Å durch das α-Kohlenstoffatom von Rest 157). Keiner dieser Reste ist in Kristallkontakten in einer der beiden Strukturen beteiligt.
Bei einer Bindung von Iodid an YFP-H148Q wird Lys166 aus dem Zentrum des Fasses um 1,0 Å zurückgedrückt und liegt in der Nähe seiner ursprünglichen Position in YFP (14). Diese Verschiebung in der Position tritt möglicherweise in Reaktion auf die Erweiterung der verborgenen Höhle auf. Lys166 ist nicht an einen Kristallkontakt in einer der zwei Strukturen beteiligt, während in der Nähe Arg168 eine intermolekulare Salzbrücke mit Asp149 bei einer Iodidbindung, jedoch nicht ohne diese ausbildet. Die Wasserstoffbindung des Sauerstoffatoms des Lys166-Rückgrats zu der Seitenkette von Gln148 wird durch diese Bewegung nicht zerstört. Kompensationsverschiebungen werden erneut an dem Ende dieses Strangs beobachtet, wo die Rückgratschleifenreste 172 und 173 um bis zu 1,7 Å hineingezogen werden, obwohl die Dichte in diesem Bereich weniger gut definiert ist. Ob eine Halogenid-Bindung an YFP eine ähnliche Wirkung auf die β-Ausbauchungsregion wie in YFP-H148Q aufweist, ist unbekannt. Rückgratbewegungen in Position 148 wurden zuvor in YFP-H148G beobachtet (Wachter et al., 1998), was mit einer erhöhten Flexibilität in diesem Teil des Fasses konsistent ist.
H. Lösungsmittel-Zugänglichkeit des Chromophors in YFP-H148Q
Die Struktur von YFP-H148Q zeigt, dass die Gln 148-Seitenkette im Gegensatz zu dem ursprünglichen Histidinimidazol, das zu der Hydroxylgruppe des Chromophors eine Wasserstoffbindung ausbildet (Wachter et al., 1998), in Richtung des Proteinäußeren herausgeschwungen wird (9) und eine Barriere gegenüber dem Hauptlösungsmittel darstellt. Sogar bevor eine Struktur verfügbar war, wurde von uns vorhergesagt, dass Gln148 in das Lösungsmittel herausklappen könnte (Ekliger et al., 1999), da eine teilweise Exposition des Chromophors gegenüber äußerem Lösungsmittel den höheren pKa-Wert von YFP-H148Q im Vergleich zu YFP erklären kann (vergleiche Tabelle K). Sowohl in der Apo-, als auch in der Iodid-gebundenen Struktur von YFP-H148Q ist das Amidstickstoffatom NE2 der Gln148-Seitenkette über Wasserstoffbindungen mit dem Rückgrat-Carbonylsauerstoffatom von Lys166 verbunden und das Amid-Sauerstoffatom OE1 ist über Wasserstoffbindungen mit dem Rückgrat-Stickstoffatom von Asn149 verbunden (12 und 14), weit entfernt von dem Chromophor. Berechnungen einer Lösungsmittel-zugänglichen Oberfläche (Connolly, 1983) unter Verwendung eines Sonden-Kugelradius von 1,4 Å wie implementiert von MidasPlusTM zeigen, dass eine oberflächliche Einstülpung auf der Proteinoberfläche dort ausgebildet wird, wo die Wildtyp-Imidazolgruppe von His148 lag (13). Diese Lösungsmitteltasche steht nahezu in Kontakt mit der van der Waals-Oberfläche des Chromophors. Unter Berücksichtigung von Protein-Atmungsbewegungen ist es wahrscheinlich, dass ein gewisser Grad an Lösungsmittelzugänglichkeit, der in der Kristallstruktur nicht feststellbar ist, auftritt. Im Vergleich zu YFP-H148G (Wachter et al., 1998), wo der Lösungsmittelkanal direkt in Kontakt mit der Chromophorenhülle steht, ist der Kanal von YFP-H148Q verkürzt, was mit Tripletzustand-Fotobleichexperimenten konsistent ist, die nahe legten, dass der Chromophor nicht gegenüber Wasserphase-Löschern exponiert ist (Jayaraman et al., 2000).
I. Energetische Analyse einer Bindung zwischen einer Anionen- und Protonenbindung
Die starke Abhängigkeit des pKa-Werts des Chromophors von einer spezifischen Anionenbindung kann durch ein gekoppeltes Bindegleichgewicht beschrieben werden, das die Wechselwirkung zwischen zwei unterschiedlichen Liganden berücksichtigt, dem Anion, das in der Nähe von Arg96 bindet, und dem Proton, das an das phenolische Ende des Chromophors bindet. Eine positive Kooperativität wird durch die Tatsache angezeigt, dass eine Bindung des Anions eine Bindung des Protons erleichtert, was den pKa-Wert des Chromophors erhöht. Die Bindungskonstante für eine Anionenbindung wird daher durch die Menge einer Protonenbindung beeinflusst und umgekehrt. Somit kann man in einem einfachen System mit jeweils einer Bindungsstelle für zwei unterschiedliche Liganden zwei mikroskopische Bindungskonstanten definieren, k₁ für eine Anionenbindung, falls das Proton vorliegt und k₂ für eine Anionenbindung, wenn das Proton fehlt. Unsere kristallographische Analyse für YFP-H148Q ist mit einer relevanten Bindungsstelle für das Anion konsistent und eine zuvorige kristallographische Analyse von S65T ist mit einer Protonenbindungsstelle auf dem Chromophor konsistent (Elsliger et al., 1999). Das beobachtete Ausmaß einer Anionenbindung ist eine Funktion des pH-Werts und somit liegen die makroskopischen Bindungskonstanten irgendwo zwischen den begrenzenden Werten von k₁ und k₂.
Eine mathematische Beschreibung wurde durch J. Wyman (1964) entwickelt und wird von Cantor und Schimmel in Biophysical Chemistry, Teil III (Cantor & Schimmel, 1980) wiedergegeben. Hier wenden wir die allgemeine Gleichung 15-79 auf den speziellen Fall an, dass eine Bindungsstelle für jeden Liganden vorliegt, wobei pK_a den pK_a-Wert des Chromophors bei Fehlen jeglicher gebundener Anionen wiedergibt: pKa = log {(k1 + [Chlorid])/k1} – log {(k2 + [Chlorid])/k2} + pKa. Gleichung (1)
Unter Verwendung von Absorptionsmessungen bei sowohl pH 6,5 als auch pH 7,0 wurde der pK_a-Wert von YFP als eine Funktion der Anionenkonzentration für eine große Zahl verschiedener Ionen bestimmt. Die Konzentration des spezifischen interessierenden Anions variierte zwischen 0 und mindestens 150 mM (für die Halogenide so hoch wie 400 mM, 15) und die Ionenstärke wurde durch die Zugabe von Kaliumgluconat gesteuert, das nicht mit den YFPs wechselwirkt (Wachter & Remington, 1999). Ergebnisse für wechselwirkende Anionen wurden an die Gleichung (1) angepasst und die mikroskopischen Bindekonstanten k₁ uns k₂, wo möglich, aus der Kurvenanpassung extrahiert (15 und Tabelle J). Im Allgemeinen scheinen kleine monovalente Anionen etwas Wechselwirkung mit YFP aufzuweisen. Die Bindung ist am stärksten für Fluorid, wobei der k₁-Wert 0,214 mM beträgt. Andere Anionen, von denen festgestellt wurde, dass sie Wechselwirken, einschließlich der anderen Halogenide, weisen mikroskopische Bindungskonstanten in dem unteren millimolaren Bereich auf, wobei bei Trifluoressigsäure (TFA) die schwächste Wechselwirkung in diesen Reihen auftritt (k₁ = 21,2 mM).
Es scheint keine jegliche spezifische Abhängigkeit von der molekularen Form für diese Wechselwirkung zu geben, da triatomare lineare (wie Thiocyanat), quadratische planare (wie Perchlorat), trigonale (wie Nitrit) und sphärische (wie Halogenid) Moleküle auch binden. Formiat modulierte den pK_a-Wert des Chromophors genauso (k₁ = 7,47 mM), obwohl ein vorhergehendes etwas vorläufiges Experiment mit Fluoreszenz keine Wechselwirkung anzeigte (Wachter & Remington, 1999). Wie erwartet, ist eine Anionenbindung an den anionischen Chromophor ungünstig, wobei der k₂-Wert in dem höheren millimolaren oder in dem molaren Bereich, häufig außerhalb des Messbereichs liegt (Tabelle J). Tabelle J. Anionenbindung an den YFP-Chromophor in Reihenfolge einer abnehmenden Wechselwirkungsstärkea.

^a Konjugierte Basen (vorherrschendes Ion bei einem pH-Wert von 6 bis 7) sind in der Reihenfolge einer abnehmenden Wechselwirkungsstärke aufgeführt.
^b Die Zahlen in Klammern sind eine untere Abschätzung der Standardabweichung wie bestimmt durch Kaleidagraph^TM.
^c Diese Bindungskonstanten konnten nicht bestimmt werden, da sie außerhalb des Messbereich liegen und möglicherweise in dem molaren Bereich liegen.

Bivalente Anionen wie Phosphat und Sulfat und größere monovalente Anionen wie Gluconat, gute Puffer (wie HEPES, PIPES), Isethionat (2-Hydroxyethansulfonsäure) und TCA (Trichloressigsäure) weisen keine Wechselwirkung auf (Tabelle J) wie durch einen konstanten pK_a-Wert von etwa 5,4 für YFP angezeigt wird, der im Wesentlichen dem entspricht, der gemessen wird, falls die Messungen in Puffern mit niedriger Ionenstärke und ohne Salze durchgeführt werden (Wachter & Remington, 1999). Etwas kleinere monovalente Anionen, die keine Wechselwirkungen aufwei sen, umfassen Phosphorsäure, Bicarbonat und Acetat. Die Hydratisierungsenergie kann für eine Unterscheidung von Anionen wichtig sein, da Acetat stark solvatisiert ist, während TCA nur leicht in wässrigen Lösungsmitteln hydratisiert ist (March, 1992). Die für YFP in Tabelle J dargestellte Reihe ist zu der sehr ähnlich, die für YFP-H148Q durch Fluoreszenz bei einem pH-Wert von 7,5 bestimmt wurde (Jayaraman et al., 2000), wobei nur geringe Unterschiede in der Reihenfolge auftreten. Zum Beispiel bindet YFP-H148Q Br- stärker als Cl, während im Fall von YFP die Reihenfolge umgekehrt ist, möglicherweise aufgrund der größeren Bindungsstelle in YFP-H148Q.
J. Identifizierung von Schlüsselresten für eine Anionenbindung durch Mutationsanalyse
Um zu identifizieren, welche Substituenten in YFP (S65G/V68L/S72A/T203Y) einen Anteil an der spezifischen Anionenbindung in der Nähe des Chromophors haben, wurde eine Mutationsanalyse durchgeführt, worin die vier Substitutionen einzeln zu dem Wildtyp zurückgeführt wurden. Sodann wurde der pK_a-Wert dieser Revertanten bei Fehlen von wechselwirkenden Anionen bestimmt und ihre Affinität für Chlorid und Iodid durch eine Bestimmung des pK_a-Werts als eine Funktion der Halogenidkonzentration gemessen, gefolgt von einem Anpassen der Kurve an die Gleichung (1). Revertante 1 (S65G/S72A/T203Y) und Revertante 2 (S65G/V68L/S72A) wiesen ein exaktes pH- und Halogenid-Titrationsverhalten, wie es für die YFPs beobachtet wird, auf und ihre pK_a- und k₁-Werte für eine Chlorid- und Iodidbindung sind in Tabelle K mit denjenigen verglichen, die für die YFPs erhalten wurden. Eine Reversion des Rests 68 oder des Rests 203 steigert den pK_a-Wert des Chromophors auf 5,8 bzw. 6,4. Eine Reversion des Rests 68 führt zu einem leichten Verlust der Chlorid-Affinität (k₁ = 13,2 mM im Vergleich zu 4,69 mM in YFP), während eine Reversion des Rests 203 dramatisch die Wechselwirkung schwächt (k₁ = 153 mM). Wie aus Tabelle K ersichtlich, ist die Chlorid-Affinität stark mit dem pK_a-Wert des Chromophors gekoppelt, wobei eine Schwächung der Anionenwechselwirkung bei steigendem pK_a-Wert auftritt. Tabelle K. Mikroskopische Dissoziationskonstanten für Chlorid- und Iodidbindung an die YFPs und seine Revertanten.

^a Eine untere Abschätzung der Standardabweichung (wie von Kaleidagraph^TM wiedergegeben) ist in Klammern angegeben.
^b Der pK_a-Wert des Chromophors bestimmt durch Absorption ohne jegliche wechselwirkende Anionen wie Chlorid (gepuffert mit HEPES oder PIPES, 150 mM Gluconat).

Da die einzige Ausnahme für diese Regel Revertante 2 darstellt, scheint die Korrelation nur in Gegenwart von T203Y intakt zu sein. Diese Substitution scheint für starke Anionenwechselwirkungen unverzichtbar zu sein.
Eine Iodidbindung scheint beträchtlich fester zu sein als eine Chloridbindung für alle getesteten Varianten (Tabelle K). Eine jegliche Korrelation mit dem pK_a-Wert des Chromophors ist bestenfalls schwach. Die relative Selektivität von Iodid gegenüber Chlarid ist für YFP-H148Q am stärksten, gefolgt von YFP-H148G. Dies kann die Tatsache widerspiegeln, dass Iodid ein zu Chlorid größeres weicheres Ion ist und schwieriger in eine kleine Höhle einzupassen ist, wenn nicht die spezielle Variante eine strukturelle Entspannung des β-Fasses erlaubt (vergleiche vorstehend).
Revertanten 3 (S72A/T203Y) und 4 (T203Y) waren schwieriger zu analysieren, da deren Titrationsverhalten ähnlich zu WT GFP ist. Ihre Absorptionsspektren zeigen einen gemischten Grundzustand der Banden A und B und sind bei einem pH-Wert von über 6,5 nahezu pH-unabhängig. Eine Anregung von entweder Bande A oder B führt zu einer grünen Fluoreszenz bei diesen Revertanten, was an eine Deprotonierung des angeregten Zustands erinnert, die für WT GFP beschrieben wurde (Chattoraj et al., 1996). Eine Zugabe von NaCl auf 250 mM zu den Revertanten 3 und 4 bei einem pH-Wert von 6,5 verändert das Verhältnis der zwei Adsorptionsbanden nur in einem geringen Ausmaß, was zu etwa einer 20%igen Abnahme der Bande B zugunsten der Bande A führt. Bei WT GFP wird bei einem pH-Wert von 6,5 keine spektrale Änderung bei Zugabe von 250 mM NaCl unter Bedingungen einer konstanten Ionenstärke beobachtet, was mit einer Sensitivität gegenüber der Ionenstärke (Ward et al., 1982), jedoch nicht einer spezifischen Anionenbindung konsistent ist.
Veröffentlichungen

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Claims

Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein funktionelles manipuliertes fluoreszierendes Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz des grün-fluoreszierenden Proteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) ist und die sich von SEQ ID NO:2 durch i) mindestens eine erste Substitution an der Position T203Y und ii) mindestens eine zweite Substitution an der Position H148 und iii) mindestens eine dritte Substitution an einer der folgenden Positionen: V150T oder A, V163S, T oder A, I152L oder F165Y unterscheidet, wobei das funktionelle manipulierte fluoreszierende Protein eine unterschiedliche fluoreszierende Eigenschaft aufweist als das grünfluoreszierende Protein von Aquorea und eine Fluoreszenzmessung von Haliden ermöglicht.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine zweite Substitution an der Position H148 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H148R, H148G, H148Q, H148A, H148N und H148K.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine dritte Substitution an der Position V150 V150T ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine dritte Substitution an der Position V163 V163S ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine dritte Substitution an der Position V163 V163T ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine dritte Substitution an der Position V163 V163A ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine dritte Substitution an der Position V150 V150A ist.
Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens eines Anions von Interesse in einer Probe, umfassend die Schritte 1) Einführen eines manipulierten grün-fluoreszierenden Proteins in eine Probe, wobei das manipulierte grün-fluoreszierende Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz des grün-fluoreszierenden Proteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) ist und sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine erste Substitution an der Position T203Y, mindestens eine zweite Substitution an der Position H148 und mindestens eine dritte Substitution an einer der folgenden Positionen: V150T oder A, V163S, T oder A, I152L oder F165Y unterscheidet, wobei das funktionelle manipulierte fluoreszierende Protein eine unterschiedliche fluoreszierende Eigenschaft aufweist als das grünfluoreszierende Protein von Aequorea und eine Fluoreszenzmessung von Haliden ermöglicht, 2) Bestimmung der Fluoreszenz des manipulierten grün-fluoreszierenden Proteins in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 8, weiter umfassend den Schritt des Vergleichens der Fluoreszenz des manipulierten grün-fluoreszierenden Proteins in der Probe mit der Fluoreszenz einer Kontrolle des manipulierten grünfluoreszierenden Proteins, das in eine Kontrollprobe, die das Anion von Interesse bei einer bekannten Konzentration umfasst, eingeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Probe mindestens eine lebende Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Anion von Interesse ein Halid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das manipulierte fluoreszierende Protein durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert wird.
Funktionelles manipuliertes fluoreszierendes Protein, das durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird.
Wirtszelle, umfassend ein funktionelles manipuliertes fluoreszierendes Protein gemäß Anspruch 13.
Verfahren zum Screening der Wirkungen von Testverbindungen auf die Ionenkanalaktivität,umfassend die Schritte i) Bereitstellen einer Zelle, umfassend a) ein manipuliertes grün-fluoreszierendes Protein, wobei das manipulierte grün-fluoreszierende Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen identisch mit der Aminosäuresequenz des grün-fluoreszierenden Proteins von Aequorea (SEQ ID NO:2) ist und sich von SEQ ID NO:2 durch mindestens eine erste Substitution an der Position T203Y, mindestens eine zweite Substitution an der Position H148 und mindestens eine dritte Substitution an einer der folgenden Positionen: V150T oder A, V1635, T oder A, I152L oder F165Y unterscheidet, wobei das funktionelle manipulierte fluoreszierende Protein eine unterschiedliche fluoreszierende Eigenschaft aufweist als das grün-fluoreszierende Protein von Aequorea und eine Fluoreszenzmessung von Haliden ermöglicht, b) einen Ionenkanal von Interesse, ii) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Testverbindung, iii) Bestimmen der Fluoreszenz von dem manipulierten grün-fluoreszierenden Protein.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verfahren weiter den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Zelle mit einem bekannten Aktivator des Ionenkanals von Interesse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend den Schritt des Vergleichens der Fluoreszenz von dem manipulierten grün-fluoreszierenden Protein in der Zelle mit der Fluoreszenz einer Kontrolle des manipulierten grün-fluoreszierenden Proteins, das in eine Kontrollzelle eingeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Ionenkanal von Interesse Halide transportiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das manipulierte fluoreszierende Protein eines gemäß Anspruch 13 ist.