DE60114176T2

DE60114176T2 - Verfahren zur herstellung von cla-isomeren

Info

Publication number: DE60114176T2
Application number: DE60114176T
Authority: DE
Inventors: Asgeir Saebo; Christian Per SAEBO
Original assignee: Natural ASA
Current assignee: Aker Biomarine AS
Priority date: 2000-04-24
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-04-25
Also published as: WO2001081290A2; CA2406228C; JP2004516232A; AU5762701A; EP1276709A2; ES2247105T3; AU2001257627B2; CA2406228A1; NO20025084L; NO20025084D0; NO327744B1; US6380409B1; DE60114176D1; ATE307108T1; WO2001081290A3; EP1276709B1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Lipidbiochemie und insbesondere die Herstellung von verschiedenen Isomeren der konjugierten Linolsäure.
Hintergrund der Erfindung
1978 entdeckten Forscher an der Universität von Wisconsin die Identität einer in gegartem Rindfleisch enthaltenen Substanz, die die Mutagenese zu hemmen scheint. Es wurde herausgefunden, dass die Substanz ein Gemisch aus Positionsisomeren der Linolsäure (C18:2) mit konjugierten Doppelbindungen ist. Die c9,t11- und t10,c12-Isomere sind in größter Menge vorhanden, aber es ist ungewiss, welche Isomere für die beobachtete biologische Aktivität verantwortlich sind. Es wurde bei markierten Aufnahmeuntersuchungen beobachtet, dass das 9,11-Isomer ein wenig besser aufgenommen und in den Phospholipidanteil bzw. die Phospolipidfraktion des tierischen Gewebes eingebaut zu werden scheint, und das 10,12-Isomer, zu einem geringeren Umfang (Ha, et al., Cancer Res., 50: 1097 [1990]).
Die mit konjugierten Linolsäuren (CLA genannt) verbundene biologische Aktivität ist mannigfaltig und komplex. Zur Zeit ist sehr wenig über die Wirkungsmechanismen bekannt, obwohl verschiedene präklinische und klinische Studien, die im Gang sind, wahrscheinlich neuen Aufschluss über die phy siologischen und biochemischen Wirkungsweisen geben werden. Die antikarzinogenen Eigenschaften der CLA wurden gut dokumentiert. Die Verabreichung von CLA hemmt die Entstehung von Brusttumoren bei Ratten, wie von Birt, et al., Cancer Res., 52: 2035s [1992] nachgewiesen. Ha, et al., supra, berichteten über ähnliche Ergebnisse in einem Vordermagen-Neoplasiemodell der Maus. CLA wurde auch als starkes zytotoxisches Agens gegen menschliche Melanom-, kolorektal- und Brustkrebszellen als Ziel in vitro identifiziert.
Obwohl die Mechanismen der CLA-Wirkung noch unklar sind, gibt es Hinweise darauf, dass eine Komponente/einige Komponenten des Immunsystems, zumindest in vivo, beteiligt sein könnten. Das U.S. Patent Nr. 5,585,400 (Cook, et al., durch Bezugnahme hierdurch mit einbezogen) offenbart ein Verfahren, um allergische Reaktionen in Tieren, die durch Typ I- oder IgE-Überempfindlichkeit vermittelt sind, durch Verabreichung einer Diät, die CLA enthält, abzuschwächen. Es wurde auch gezeigt, dass CLA in Konzentrationen von ungefähr 0,1 bis 1,0 % ein effektives Hilfsmittel beim Erhalten von weißen Blutkörperchen ist. U.S. Patent Nr. 5,674,901 (Cook, et al., durch Bezugnahme hierdurch mit einbezogen) offenbarte, dass orale oder parenterale Verabreichung von CLA entweder in Form einer freien Säure oder eines Salzes zu einer Erhöhung der CD-4 und CD-8 Lymphozyten-Subpopulationen, verbunden mit zellulärer Immunität, führt. Beeinträchtigungen durch die Vorbehandlung mit exogenem Tumornekrosefaktor könnten indirekt durch eine Erhöhung oder ein Halten der Pegel an CD-4- und CD-8-Zellen in Tieren, denen CLA verabreicht wurde, verringert werden. Schließlich beschreibt das U.S. Patent Nr. 5,430,066 (Cook, et al., durch Bezugnahme hierdurch mit einbezogen) die Wirkung von CLA bei der Vorbeugung von Gewichtsverlust und Anorexie durch Immunstimulation.
Abgesehen von möglichen therapeutischen und pharmakologischen Anwendungen von CLA, wie oben dargelegt, gab es große Aufregung hinsichtlich der Verwendung von CLA als Nahrungsergänzungsmittel. Es wurde herausgefunden, dass CLA eine tiefgreifende allgemeine Wirkung auf die Körperbeschaffenheit hat, insbesondere hinsichtlich der Umleitung der Aufteilung von fetter und magerer Gewebsmasse. Das U.S. Patent Nr. 5,554,646 (Cook, et al., durch Bezugnahme hierdurch mit einbezogen) offenbart ein Verfahren, das CLA als Nahrungsergänzungsmittel nutzt, wobei Schweine, Mäuse und Menschen eine Diät erhielten, die 0,5 % CLA beinhaltet. Bei jeder Spezies wurde ein deutlicher Verlust an Fettgehalt mit einem gleichzeitigen Anstieg der Proteinmasse beobachtet. Es ist interessant, dass in diesen Tieren die Steigerung des Fettsäuregehalts der Diät durch Zusatz von CLA zu keinem Anstieg des Körpergewichts führte, aber mit einer Umverteilung von Fett und magerem Gewebe innerhalb des Körpers einherging. Ein anderes interessantes diätetisches Phänomen ist die Wirkung einer CLA-Supplementierung auf die Nahrungsverwertung. Das U.S. Patent Nr. 5,428,072 (Cook, et al., durch Bezugnahme hierdurch mit einbezogen) stellte Daten zur Verfügung, die zeigen, dass die Beimischung von CLA in Tierfutter (Vögel und Säugetiere) die Effizienz der Nahrungsverwertung erhöht, was zu einer größeren Gewichtszunahme bei den mit CLA supplementierten Vögeln und Säugetieren führte. Die möglichen vorteilhaften Wirkungen einer CLA-Supplementierung für Nutztierzüchter ist offensichtlich.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bezüglich CLA, der sein frühes wirtschaftliches Potential unterstreicht, ist, dass es natürlicherweise in Lebens- und Futtermitteln vorkommt, die sowohl von Menschen als auch von Tieren konsumiert werden. Insbesondere ist CLA reichlich in Produkten von Wiederkäuern enthalten. Zum Beispiel wurden verschiedene Studien durchgeführt, in denen CLA in verschiedenen Milchprodukten untersucht wurde. Aneja, et al., (J. Dairy Sci., 43: 231 [1990)] beobachteten, dass die Verarbeitung von Milch zu Jogurt zu einer Konzentrierung von CLA führte. Shanta, et al., (Food Chem., 47: 257 [1993]) zeigten, dass eine Steigerung sowohl der Verarbeitungstemperatur als auch die Zufügung von Molke die CLA-Konzentration während der Zubereitung von verarbeitetem Käse erhöhte. In einer separaten Studie berichteten Shanta, et al. (J. Food Sci., 60: 695 [1995]), dass während die Verarbeitungs- und Lagerungsbedingungen die CLA-Konzentrationen nicht merklich reduzieren, sie keine Steigerungen beobachteten. Tatsächlich haben verschiedene Studien gezeigt, dass saisonale Abweichungen oder Abweichungen innerhalb der Tiere bis zu dreifache Unterschiede im CLA-Gehalt der Kuhmilch ausmachen können (siehe z. B. Parodi, et al., J. Dairy Sci., 60: 1550 [1977]). Auch Nahrungsmittelfaktoren wurden in die CLA-Gehaltsabweichung einbezogen (Chin, et al., J. Food Comp. Anal., 5: 185 [1992]). Durch diese Abweichung des CLA-Gehalts aus natürlichen Quellen wird die Aufnahme von vorgeschriebenen Mengen von verschiedenen Nahrungsmitteln nicht garantieren, dass das Individuum oder das Tier die optimale Dosis erhalten wird, um sicherzustellen, dass der gewünschte Ernährungseffekt erreicht wird.
Bei der Entwicklung einer definierten kommerziellen CLA-Quelle für sowohl therapeutische als auch Ernährungsanwendungen wird ein Verfahren für die Generierung von großen Mengen bestimmten Materials benötigt. Das Problem der meisten CLA-Produkte, die durch konventionelle Ansätze hergestellt sind, ist ihre Heterogenität und die beträchtliche Abweichung der Isoformen von Charge zu Charge. Eine neue Veröffentlichung dokumentiert diese Abweichung und weist auf die Notwendigkeit für Produzenten von CLA hin, die kom plexe Natur ihrer Produkte zu beachten (Siehe Christie et al., JAOCS, 74(11): 1231 [1997]).
Erhebliche Beachtung erhielt auch die Tatsache, dass die Aufnahme von großen Mengen hydrierter Öle und Fette anstelle von tierischem Talg in einer Ernährung resultiert, die einen hohen Gehalt an trans-Fettsäuren hat. Holman, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 4830 [1991]) zeigten zum Beispiel, dass in der Leber von Ratten, die mit hydrierten Ölen gefüttert wurden, eine Anreicherung von ungewöhnlichen mehrfach ungesättigten Fettsäure-Isomeren auftrat, die den normalen Stoffwechsel von natürlich vorkommenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu stören schienen. Deshalb besteht ein großer Bedarf an chemischen und biologischen Analysen der verschiedenen CLA-Isomere.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Lipidbiochemie und insbesondere die Herstellung verschiedener Isomere der konjugierten Linolsäure (Octadecadiensäure). Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Herstellung irgendeines bestimmten Octadecadiensäure-Isomers beschränkt. Vielmehr kann eine Auswahl an Isomeren hergestellt werden, die c9,t11-Octadecadiensäure, t8,c10-Octadecadiensäure, t10,c12-Octadecadiensäure, c11,t13-Octadecadiensäure, c7,t9-Octadecadiensäure, t6,c8-Octadecadiensäure, t11,c13-Octadecadiensäure, c12,t14-Octadecadiensäure, c6,t8-Octadecadiensäure, t5,c6-Octadecadiensäure, c5,t7-Octadecadiensäure, t4,c6-Octadecadiensäure, t3,c5-Octadecadiensäure, t12,c14-Octadecadiensäure, c13,t15-Octadecadiensäure und c14,t16-Octadecadiensäure umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Isomere können als freie Fettsäuren, Alkylester oder Acylglyceride bereitgestellt werden. Die vorliegende Erfindung stellt entspre chend in einigen Ausführungsformen ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die mehr als 25 eines der vorhergehenden Isomere umfasst. In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die mehr als 40 % eines der oben genannten Isomere umfasst. In wieder anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die mehr als 50 % eines der oben genannten Isomere umfasst. Die Isomere können wieder als freie Fettsäuren, Alkylester oder Acylglyceride bereitgestellt werden. In einigen anderen bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die mehr als 50 % c11,t13-CLA umfasst. In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die mehr als 60 % c11,t13-CLA umfasst.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Acylglycerinen bereit, die Reste von Isomeren konjugierter Linolsäure umfassen, wobei der Fettsäuregehalt der oben genannten Glycerine mindestens 25 % des konjugierten Linolsäureisomers ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus t8,c10-Octadecadiensäure, c11,t13-Octadecadiensäure, c7,t9-Octadecadiensäure, t6,c8-Octadecadiensäure, t11,c13-Octadecadiensäure, c12,t14-Octadecadiensäure, c6,t8-Octadecadiensäure, t5,c6-Octadecadiensäure, c5,t7-Octadecadiensäure, t4,c6-Octadeca-diensäure, t3,c5-Octadecadiensäure, t12,c14-Octadeca-diensäure, c13,t15-Octadecadiensäure und c14,t16-Octadeca-diensäure besteht. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Acylglycerinen bereit, die Isomerreste konjugierter Linolsäure umfassen, wobei der Fettsäuregehalt dieser Acylglycerine mindestens 45 % eines konjugierten Linolsäureisomers ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus t8,c10-Octadecadiensäure, c11,t13-Octadecadiensäure, c7,t9-Octadecadiensäure, t6,c8-Octadecadiensäure, t11,c13-Octadecadiensäure, c12,t14-Octadecadiensäure, c6,t8-Octadecadiensäure, t5,c6-Octadecadiensäure, c5,t7-Octadecadiensäure, t4,c6-Octadecadiensäure, t3,c5-Octadecadiensäure, t12,c14-Octadecadiensäure, c13,t15-Octadecadiensäure und c14,t16-Octadecadiensäure besteht. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Acylglycerinen bereit, das Isomerreste konjugierter Linolsäure umfasst, wobei der Fettsäuregehalt dieser Acylglycerine mindestens 50 % eines konjugierten Linolsäureisomers enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus t8,c10-Octadecadiensäure, c11,t13-Octadecadiensäure, c7,t9-Octadecadiensäure, t6, c8-Octadecadiensäure, t11,c13-Octadecadiensäure, c12,t14-Octadecadiensäure, c6,t8-Octadecadiensäure, t5,c6-Octadecadiensäure, c5,t7-Octadecadiensäure, t4,c6-Octadecadiensäure, t3,c5-Octadecadiensäure, t12,c14-Octadecadiensäure, c13,t15-Octadecadiensäure und c14,t16-Octadecadiensäure besteht.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung bereit, die Isomere konjugierter Linolsäure umfasst, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen mindestens 25 % eines ersten Isomers einer Octadecadiensäure und mindestens 25 eines Schwesterisomers des ersten Isomers umfasst oder enthält. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf irgendein Paar von Schwesterisomeren beschränkt. Allerdings kann eine Vielfalt von Schwesterisomerpaaren betrachtet werden, die c9,t11-Octadecadiensäure und t8,c10-Octadecadiensäure, t10,c12-Octadecadiensäure und c11,t13-Octadecadiensäure, c7,t9-Octadecadiensäure und t6,c8-Octadecadiensäure, t11,c13-Octadecadiensäure und c12,t14-Octadecadiensäure, c6,t8-Octadecadiensäure und t5,c6-Octadecadiensäure, c5,t7-Octadecadiensäure und t4,c6-Octadecadiensäure, c4,t6-Octadecadiensäure und t3,c5-Octadecadiensäure, t12,c14-Octadecadiensäure und c13,t15-Octadecadiensäure, und t13,c15-Octadecadiensäure und c14,t16-Octadecadiensäure umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist. Die Isomere können als freie Fettsäuren, Alkylester oder Acylglyceride bereitgestellt werden.
In wieder anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Octadecadiensäure-Isomerpaaren und/oder einzelnen Octadecadiensäure-Isomeren bereit, die folgende Schritte umfassen: a) Bereitstellen eines ersten teilweise gereinigten Octadecadiensäure-Isomers; und b) Behandlung des ersten Octadecadiensäure-Isomers unter solchen Bedingungen, dass das konjugierte Bindungssystem wandert, wodurch ein Gemisch gebildet wird, das mindestens erste und zweite Isomere der Octadecadiensäure enthält. In wieder anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren als Schritt c) das Abtrennen der zumindest ersten und zweiten Isomere der Octadecadiensäure, um ein zweites gereinigtes Octadecadiensäure-Isomer bereitzustellen. Die Bedingungen umfassen ein Erwärmen des teilweise gereinigten Octadecadiensäure-Isomers. In wieder anderen Ausführungsformen wird der Abtrennungsschritt durch Gas-Flüssigkeitschromatographie durchgeführt. In einigen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der c9,t11- und t8,c10-Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer ist die andere der t8,c10 und c9,t11-Octadecadiensäuren. In einigen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der t10,c12- und c11,t13-Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer ist die andere der t10,c12- und c11,t13- Octadecadiensäuren. In manchen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der c7,t9- und t6,c8-Octadediensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer die andere der c7,t9- und t6,c8-Octadecadiensäuren. In einigen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der t11,c13- und c12,t14-Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer ist die andere der t11,c13- und c12,t14-Octadecadiensäuren. In einigen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der c6,t8- und t5,c6-Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer die andere der c6,t8- und t5,c6-Octadecadiensäuren. In anderen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der c5,t7- und t4,c6-Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer die andere der c5,t7- und t4,c6-Octadecadiensäuren. In einigen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der t3,c5- und c4,t6-Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer die andere der c4,t6- und t3,c5-Octadecadiensäuren. In einigen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der t12,c14- und c13,t15-Octadecadiensäuren und das zweite teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer die andere der t12,c14- und c13,t15-Octadecadiensäuren. In anderen Ausführungsformen ist das erste, teilweise gereinigte Octadecadiensäure-Isomer eine der c14,t16- und t13,c15- Octadecadiensäuren und das zweite Octadecadiensäure-Isomer die andere dieser c14,t16- und t13,c15-Octadecadiensäuren.
In einigen Ausführungsformen ist das zweite Isomer in einer Konzentration von über 30 % des ersten Isomers vorhanden. In anderen Ausführungsformen ist das zweite Isomer in einer Konzentration von über 40 % des ersten Isomers vorhanden. In weiteren Ausführungsformen ist das zweite Isomer in ei ner Konzentration zwischen 20 % und 80 % des ersten Isomers vorhanden.
„Konjugierte Linolsäure" oder „CLA", wie hier verwendet, bezieht sich auf irgendeine konjugierte Linolsäure oder freie Octadecadienfettsäure. Es ist beabsichtigt, dass diese Bezeichnung alle Positions- und geometrischen Isomere der Linolsäure mit zwei konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen irgendwo im Molekül umfasst und betrifft. CLA unterscheidet sich von gewöhnlicher Linolsäure darin, dass gewöhnliche Linolsäure Doppelbindungen an den Kohlenstoffatomen 9 und 12 hat. Beispiele für CLA umfassen cis- und trans-Isomere („E/Z-Isomere") der folgenden Positionsisomere: 2,4-Octadecadiensäure, 4,6-Octadecadiensäure, 6,8-Octadecadiensäure, 7,9-Octadecadiensäure, 8,10-Octadeca-diensäure, 9,11-Octadecadiensäure und 10,12-Octadecadien-säure, 11,13-Octadecadiensäure. „CLA", wie hier verwendet, umfasst ein einzelnes Isomer, ein ausgewähltes Gemisch von zwei oder mehr Isomeren und ein nicht ausgewähltes Gemisch von Isomeren, die aus natürlichen Quellen gewonnen wurden, so wie auch synthetische und semisynthetische CLA.
Der Begriff „isomerisierte konjugierte Linolsäure", wie hier verwendet, bezieht sich auf CLA, die durch chemische Verfahren synthetisiert wurde (z. B. wässrige alkalische Isomerisierung, nicht wässrige alkalische Isomerisierung oder alkalische Alkoholat-Isomerisierung).
Der Begriff „konjugierter Linolsäurerest", wie hier verwendet, bezieht sich auf irgendeine Komponente oder eine Vielzahl von Komponenten, die konjugierte Linolsäuren oder Derivate enthalten. Beispiele umfassen Fettsäuren, Alkylester und Triglyceride der konjugierten Linolsäure, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es ist beabsichtigt, dass „Triglyeride" der CLA, wie hier verwendet, CLA an einer beliebigen oder an allen von drei Positionen (z. B. die Positionen SN-1, SN-2 oder SN-3) am Glyceringrundgerüst enthalten. Ein Triglycerid mit CLA kann entsprechend irgendeines der Positions- und geometrischen Isomere der CLA enthalten. „Acylglycerin", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Glycerinmolekül mit einem (Monoacylglycerin), zwei (Diacylglycerin) oder drei (Triacylglycerin oder Triglycerid) Fettsäureresten an einer der verfügbaren Positionen am Glycerinmolekül. Gemische aus Triglyceriden oder Acylglycerinen können unterschiedliche Mengen von bestimmten CLA-Isomeren enthalten, abhängig von der Konzentration des jeweiligen Isomers der CLA, das zur Herstellung des Triglyerids verwendet wird, und, wenn zur Herstellung des Triglycerids oder Acylglycerins enzymatische Verfahren eingesetzt werden, von der Spezifität der verwendeten Lipase oder der Lipasen. Demnach ist es geeignet, das hergestellte Triglycerid- oder Acylglyceringemisch oder die -zusammensetzung hinsichtlich der Menge auf Prozentbasis eines bestimmten CLA-Isomers zu charakterisieren, das in der gesamten Mischung oder Zusammensetzung enthalten ist. Als nicht beschränkendes Beispiel kann gesagt werden, dass eine Triglycerid- oder Acylglycerinzusammensetzung mit CLA-Resten an den verschiedenen Positionen des Glycerinrückgrats einen Fettsäurerestgehalt von wenigstens 25 % eines bestimmten konjugierten Linolsäureisomers aufweist, wenn das konjugierte Linolsäureisomer wenigstens 25 % irgendeiner der Positionen SN-1, SN-2 und SN-3 der Triglyceride des Gemisches besetzt. Auf andere Weise betrachtet, wird das erhaltene Gemisch der Fettsäuresalze mindestens 25 des jeweiligen Isomers umfassen, wenn die Fettsäurereste durch Verseifung entfernt werden.
Es ist hier beabsichtigt, dass „Ester" der CLA eines und alle Positions- und geometrischen Isomere der CLA umfasst, die durch eine Esterbindung an eine Alkoholgruppe oder andere chemische Gruppen gebunden sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf physiologisch akzeptable, natürlich vorkommende Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol oder Propanol). Deshalb kann ein CLA-Ester oder verestertes CLA irgendeines der Positions- und geometrischen CLA-Isomere enthalten.
Es ist beabsichtigt, dass „nicht natürlich vorkommende Isomere" der CLA c11,t13; t11,c13; t11,t13; c11,c13; c8,t10; t8,c10; t8,t10; c8,c10 und trans-trans-Isomere der Octadecadiensäure einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Diese Definition schließt jedoch t10,c12- und c9,t11-Isomere der Octadecadiensäure nicht ein. Auf „nicht natürlich vorkommende Isomere" kann auch als „Nebenisomere" der CLA Bezug genommen werden, da diese Isomere im Allgemeinen in geringen Mengen gebildet werden, wenn die CLA durch Alkaliisomerisierung synthetisiert wird.
CLA mit „geringer Verunreinigung", wie hier verwendet, bezieht sich auf CLA-Zusammensetzungen, die freie Fettsäuren, Alkylester und Triglyceride umfassen, die weniger als insgesamt 1 % 8,10-Octadecadiensäuren, 11,13-Octadecadiensäuren oder trans-trans-Octadecadiensäuren enthalten.
„c", wie hier verwendet, umfasst eine chemische Bindung an der cis-Orientierung und „t" bezieht sich auf eine chemische Bindung an der trans-Orientierung. Wenn ein Positionsisomer der CLA ohne ein „c" oder „t" bezeichnet ist, umfasst diese Bezeichnung alle vier möglichen Isomere. Beispielsweise umfasst 10,12-Octadecadiensäure c10,t12-; t10,c12-; t10,t12- und c10,c12-Octadecadiensäure, während t10,c12-Octadecadiensäure oder CLA sich nur auf das einzelne Isomer bezieht.
Der Begriff „Öl", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine frei fließende Flüssigkeit mit langkettigen Fettsäuren (z. B. CLA), Triglyceriden oder anderen langkettigen Kohlenwasserstoffgruppen. Die langkettigen Fettsäuren schließen die verschiedenen CLA-Isomere ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „physiologisch akzeptabler Träger", wie hier verwendet, bezieht sich auf irgendeinen Träger oder ein Vehikel, der/das allgemein bei öligen Arzneimitteln verwendet wird. Solche Träger oder Vehikel beinhalten, aber beschränken sich nicht auf Öle, Stärken und Zucker (z. B. Saccharose und Laktose).
Der Begriff „orales Verabreichungsvehikel", wie hier verwendet, bezieht sich auf irgendein Mittel der oralen Verabreichung von Arzneimitteln, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kapseln, Pillen, Tabletten und Sirupe.
Der Begriff „Nahrungsprodukt", wie hier verwendet, bezieht sich auf irgendein Nahrungs- oder Futtermittel, das für den Verbrauch durch Menschen, nicht wiederkäuenden Tieren oder Wiederkäuern geeignet ist. Das „Nahrungsprodukt" kann ein vorbereitetes und abgepacktes Nahrungsmittel (z. B. Mayonnaise, Salatdressing, Brot oder Käsewaren) oder ein Tierfutter (z. B. extrudiertes und pelletiertes Tierfutter oder grobes Mischfutter) sein. „Vorbereitetes Nahrungsprodukt" meint jedes schon abgepackte Nahrungsmittel, das für den menschlichen oder tierischen Verbrauch zugelassen ist.
Der Begriff „Nahrungsmittel", wie hier verwendet, bezieht sich auf irgendeine Substanz, die für den menschlichen oder tierischen Verbrauch geeignet ist.
Der Begriff „flüchtige organische Verbindung", wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Kohlenstoff enthaltende Verbindung, die teilweise oder komplett in gasförmigem Zustand bei einer bestimmten Temperatur vorliegt. Flüchtige organische Verbindungen können durch die Oxidation einer organischen Verbindung (z. B. CLA) gebildet werden. Flüchtige organische Verbindungen umfassen, aber beschränken sich nicht auf Pentan, Hexan, Heptan, 2-Butenal, Ethanol, 3-Methylbutanal, 4-Methylpentanon, Hexanal, Heptanal, 2-Pentylfuran und Octanal.
Der Begriff „metallisches Oxidationsmittel und Chelatbildner", wie hier verwendet, bezieht sich auf jedes Antioxidationsmittel, das Metalle chelatiert. Beispiele umfassen, aber beschränkten sich nicht auf Lezithin und Zitronensäureester.
Der Begriff „teilweise reinigen", wie hier verwendet, meint jedes Verfahren, das etwas von einer verunreinigenden Substanz von der interessierenden Komponente entfernt, wie z. B. das Entfernen von unerwünschten Isomeren aus einer konjugierten Linolsäurepräparation. Der Prozentsatz einer gereinigten Komponente wird so in der Probe erhöht (d. h. die interessierende Komponente wird konzentriert).
Der Begriff „Schwesterisomere", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Paar von konjugierten Linolsäureisomeren, die durch eine Behandlung (z. B. Erhitzen) ineinander umgewandelt werden können. Beispiele für Schwesterisomere sind in Tabelle 1, infra, aufgeführt.
Der Begriff „konjugiertes Bindungssystem", wie hier verwendet, bezieht sich auf die folgende Anordnung von ungesättigten Doppelbindungen in einer Kohlenhydratkette: -C=C-C=C- (d. h. zwei Doppelbindungen, die durch eine Einfachbindung getrennt sind).
Der Begriff „wandern", wie hier verwendet, bezieht sich, wenn er in Bezug auf ein konjugiertes Bindungssystem in Kohlenhydratketten verwendet wird, auf die Umlagerung von ungesättigten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen innerhalb der Kohlenhydratkette, so dass sich die Doppelbindungen aufwärts oder abwärts der Kette bewegen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Lipidbiochemie und insbesondere die Herstellung von verschiedenen Isomeren der konjugierten Linolsäure. Es wurde gezeigt, dass die Umlagerung der Doppelbindungen der Linolsäure an konjugierte Positionen während der Behandlung mit Katalysatoren wie Nickel oder Alkali bei hohen Temperaturen und während einer Autooxidation stattfindet. Theoretisch würden sich acht mögliche geometrische Isomere der 9,11- und 10,12-Octadecadiensäure (c9,c11; c9,t11; t9,c11; t9,t11; c10,c12; c10,t12; t10,c12 und t10,t12) aus der Isomerisierung der c9,c12-Octadecadiensäure bilden. Ein genereller Mechanismus der Isomerisierung der Linolsäure wurde von J.C. Cowan (JAOCS 72:492-99 [1950]) beschrieben. Man nimmt an, dass die Doppelbindung durch das Ergebnis einer Kollision mit einem aktivierenden Katalysator polarisiert wird. Das polarisierte Kohlenstoffatom und sein angrenzender Kohlenstoff sind dann frei, um zu rotieren und die Kräfte zu bewirken, dass das mangelhafte Kohlenstoffatom im wesentlichen planar ausgerichtet wird. Wenn sich das System dann bewegt, um diese Kräfte, die als Ergebnis der Kollision entstanden, freizusetzen, werden cis- und trans-Isomere gebildet. Die Bildung bestimmter CLA-Isomere ist thermodynamisch bevorzugt. Das liegt an den co-planaren Eigenschaften der fünf Kohlenstoffatome rund um die konjugierte Doppelbindung und an dem räumlichen Konflikt des Resonanzradikals. Die relativ höhere Verteilung der 9,11- und 10,12-Isomeren scheint aus der weiteren Stabilisierung der geometrischen c9,t11- oder t10,c12- Isomere zu resultieren.
Die Fortschritte in der Gaschromatographie haben es den Forschern ermöglicht, die Isomerzusammensetzung von CLA-Proben genau zu bestimmen. Diese Studien zeigen, dass weit mehr als 8 Isomere tatsächlich während der Konjugation gebildet werden. In Christie et al., (JAOCS 74 (11):1231 [1997]) wurde berichtet, dass die Isomerverteilung in einer handelsüblichen CLA-Probe wie folgt war: 8,10 (14 %); 9,11 (30 %); 10,12 (31 %) und 11,13 (24 %). In einer anderen Studie von Christie et al. (Lipids 33(2):217–21 [1998]) wurde über die folgende CLA-Isomerzusammensetzung eines handelsüblichen CLA-Präparats berichtet: t11,t13 (0,74 %); t10,t12 (1,23 %); t9,t11 (1,18 %); t8,t10 (0,46 %); c11,t13 und t11,c13 (21,7 %); c10,t12 und t10,c12 (29,0 %); c9,t11 und t9,c11 (29,5 %); c8,t10 und t8,c10 (12,3 %); c11,c13 (0,96 %); c10,c12 (0,88 %); c9,c11 (0,88 %) und c8,c10 (0,20 %). Wie man diesen Studien entnehmen kann, können andere CLA-Isomere wesentlich zur Zusammensetzung von Alkaliisomerisierten CLA-Präparaten beitragen, obwohl die Bildung bestimmter Isomere bevorzugt wird.
A. Wandern von konjugierten Doppelbindungen
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen bereit, die bezüglich verschiedener CLA-Isomere angereichert sind. In einigen Ausführungsformen der Erfindung wird ein teilweise gereinigtes oder konzen triertes Isomer der CLA unter Bedingungen behandelt, die ein Wandern des Doppelbindungssystems verursachen. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Bedingungen ein Erhitzen von zumindest einem Isomer auf etwa 200–240 °C, vorzugsweise auf etwa 220 °C. In anderen Ausführungsformen umfassen diese Bedingungen desweiteren das Reagieren des oder der teilweise gereinigten oder konzentrierten Isomere unter Stickstoff in einem geschlossenen Behälter. Mit Bezug auf Tabelle 1 können die Isomerpräparate in Spalte 1 für die Herstellung von Präparaten verwendet werden, die einen beträchtlichen Gehalt des entsprechenden Isomers in Spalte 2 enthalten. Nach der anfänglichen Umwandlungsreaktion wird das Präparat sowohl das Start- als auch das „Schwester"-Isomer enthalten. Ebenso können die Isomerpräparate in Spalte 2 verwendet werden, um beträchtliche Mengen des entsprechenden Isomers in Spalte 1 zu erzeugen. Die Präparate, die beide Isomere enthalten, können weiterbehandelt werden, um das Schwesterisomer (z. B. durch Gaschromatographie) zu reinigen. Wie für Fachleute zu verstehen ist, ist es möglich, mit mehr als einem teilweise gereinigten Isomer zu beginnen, wodurch ein Präparat hergestellt wird, das vier, sechs, acht oder mehr Isomere enthält. In weiteren Ausführungsformen kann ein gereinigtes Präparat des Schwesterisomers durch dem Fachmann bekannte Verfahren (d. h. Gas-Flüssigkeitschroma-tographie) aus dem behandelten Präparat, das das Ausgangsisomer und dessen Schwesterisomer enthält, hergestellt werden.
Wie in den Beispielen gezeigt, resultierte die Behandlung der gereinigten t10,c12-Octadecadiensäure in der Erzeugung von c11,t13-Octadecadiensäure. Ebenso kann konzentrierte oder teilweise gereinigte c11,t13-Octadecadiensäure verwendet werden, um t10,c12-Octadecadiensäure herzustellen. Nachdem das teilweise gereinigte Isomer behandelt wurde, um ein Schwesterisomer zu erzeugen, umfasst das entstandene Präparat, verglichen mit dem teilweise gereinigten Ausgangsisomer, vorzugsweise ungefähr mehr als 20 % des Schwesterisomers. In anderen Ausführungsformen umfasst das entstandene Präparat, verglichen mit dem teilweise gereinigten Ausgangsisomer, ungefähr mehr als 40 % des Schwesterisomers. In weiteren Ausführungsformen umfasst das entstandene Präparat, verglichen mit dem teilweise gereinigten Ausgangsisomer, zwischen etwa 20 % und 80 % des Schwesterisomers. In weiteren Ausführungsformen umfasst oder besteht das entstandene Präparat im Wesentlichen aus mehr als etwa 20 des Schwesterisomers auf einer Gewicht/Gewichts-Basis (z. B. enthält das Präparat ca. 20 g des Schwesterisomers und ca. 80 g des teilweise gereinigten Anfangsisomers). In weiteren Ausführungsformen umfasst das entstandene Präparat mehr als etwa 40 % des Schwesterisomers auf einer Ge wicht/Gewichts-Basis. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Präparat zwischen etwa 20 % und 80 % des Schwesterisomers auf einer Gewicht/Gewichts-Basis.
Experimente
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu zeigen und näher zu erläutern und sollen nicht als den Gültigkeitsbereich beschränkend gedeutet werden.
In der folgenden experimentellen Offenbarung werden die folgenden Abkürzungen angewendet: M (molar); mM (millimolar), μM (mikromolar); kg (Kilogramm); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); L oder l (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); KOH (Kaliumhydroxid); HCL (Salzsäure) und HG (Quecksilber).
BEISPIEL 1
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von c11,t13-Octadecadiensäure aus t10,c12-Octadecadiensäure. Fünfzig Gramm KOH wurden in Propylenglykol unter mäßigem Erwärmen gelöst. Hundert Gramm 98 % Linolsäure wurden dann dem Gemisch hinzugefügt und das Gemisch wurde auf 150 °C erhitzt und für 3 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde dann gekühlt und mehrere Male mit heißem Wasser gewaschen und dann unter Vakuum bei mäßiger Hitze getrocknet. Das entstandene CLA-Gemisch bestand aus c9,t11- und t10,c12-Octadecadiensäure sowie aus Spuren von CLA-Isomeren. Das Gemisch wurde durch Refluxkochen in saurem Methanol zu Methylester umgewandelt. Fünfzig Gramm konjugierte freie Fettsäuren wurden in Methanol gelöst, das 4,5 % Schwefelsäure enthielt, und unter Re fluxbedingungen für 1 Stunde in einem Wasserbad gekocht.

Das Gemisch wurde gekühlt und die Bodenschicht verworfen. Frisches Methanol mit 4,5 % Schwefelsäure wurde hinzugefügt und das Gemisch für eine weitere Stunde unter Refluxbedingungen gekocht. Nach dem Abkühlen wurde dieses Methylestergemisch mehrere Male mit Wasser gewaschen und dann unter Vakuum bei mäßiger Hitze getrocknet. Zehn Gramm des Methylesters wurde in Aceton gelöst und über Nacht in einem Gefrierschank auf –60 °C gekühlt. Ein fester Niederschlag wurde durch Filtration wiedergewonnen und in Aceton wieder gelöst und noch einmal auf –60 °C über Nacht gekühlt. Der Niederschlag wurde unter Vakuum getrocknet und es wurde durch GLC-Analyse nachgewiesen, dass er 97 % t10,c12-CLA enthielt. Die analytische Ausstattung umfasste einen Perkin Elmer GLC mit Auto-Sampler. Die Säule war ein hochpolarer Kieselglas-Typ. Die folgende Programmeinstellung wurde verwendet:

Injektion:	Splitless bei 250 °C
Detektion:	Flammenionisationsdetektor bei 280 °C
Träger:	Helium bei psig.
Heizprogramm:	80 °C–130 °C (45 °C/min), dann 1 °C/min auf 220 °C und 220 °C für 10 min.
Säule:	WCOT FUSED SILICA 0,25mm × 100m, CP-SIL 88 for FAME, df = 0,2.

Ein Gramm gereinigtes t10,c12-Isomer wurde dann in einem geschlossenen Röhrchen mit Stickstoff bedeckt und für zwei Stunden bei 220 °C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden die entstandenen Methylester durch GC wie oben analysiert. Der relative Gehalt an t10,c12 in dem Gemisch wurde auf 52,32 reduziert und das c11,t13-Isomer war mit einem Gehalt von 41,96 % (siehe Tabelle 2) vorhanden.
BEISPIEL 2
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von t8,c10-Octadecadiensäure aus c9,t11-Octadecadiensäure. Gereinigte c9,t11-Octadecadiensäure kann von handelsüblichen Quellen bezogen werden (Matreya, State College, PA) oder durch Fermentation mit Mikroorganismen aus Pansen erhalten werden (siehe z. B. U. S. Pat. No. 5,674,901, durch Bezugnahme hierdurch mit einbezogen). Die gereinigte c9,t11-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 bis 50 %) t8,c10-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein verschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben wird und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 3
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von t6,c8-Octadecadiensäure aus c7,t9-Octadecadiensäure. Gereinigte c7,t9-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab erhalten werden. Die gereinigte c7,t9-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 bis 50 %) t6,c8-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein verschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben wird und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 4
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von c12,t14-Octadecadiensäure aus t11,c13-Octadecadiensäure. Gereinigte t11,c13-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab (z. B. gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren) erhalten werden. Die gereinigte t11,c13-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 % bis 50 %) c12,t14-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein geschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 5
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von t5,c6-Octadecadiensäure aus c6,t8-Octadecadiensäure. Gereinigte c6,t8-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab erhalten werden. Die gereinigte c6,t8-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 bis 50 %) t5,c6-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein geschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 6
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von t4,c6-Octadecadiensäure aus c5,t7-Octadecadiensäure. Gereinigte c5,t7-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab erhalten werden. Die gereinigte c5,t7-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 bis 50 %) t4,c6-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein geschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 7
Herstellung von CIA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von t3,c5-Octadecadiensäure aus c4,t6-Octadecadiensäure. Gereinigte c4,t6-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab erhalten werden. Die gereinigte c4,t6-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 bis 50 %) t3,c5-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein geschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 8
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von c13,t15-Octadecadiensäure aus t12,c14-Octadecadiensäure. Gereinigte t12,c14-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab erhalten werden. Die gereinigte t12,c14-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 % bis 50 %) c13,t15-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein geschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 9
Herstellung von CLA-Isomeren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von c14,t16-Octadecadiensäure aus t13,c15-Octadecadiensäure. Gereinigte t13,c15-Octadecadiensäure kann durch Gaschromatographie in präparativem Maßstab erhalten werden. Die gereinigte t13,c15-Octadecadiensäure wird zu einer hochprozentigen (z. B. 25 % bis 50 %) c14,t16-Octadecadiensäure umgewandelt, indem die c9,t11-Octadecadiensäure in ein geschlossenes Röhrchen unter Stickstoff gegeben wird und auf 220 °C für ungefähr 2 Stunden erhitzt wird.
BEISPIEL 10
Die Herstellung von Triacylglycerinen von CLA durch direkte Veresterung
Immobilisierte Candida antarctica-Lipase (1,25 g) wird zu einem Gemisch aus Glycerin (1,22 g, 13,3 mmol) und dem gewünschten CLA-Isomer zugegeben. Das Gemisch wird behutsam auf einer magnetischen Rührer-Heißplatte bei 65 °C unter kontinuierlichem Vakuum von 0,01–0,5 Torr gerührt. Das während des Reaktionsverlaufs volatile bzw. verdampfende Wasser wird kontinuierlich in mit flüssigem Stickstoff gekühlten Fallen kondensiert. Nach 48 Stunden wird die Reaktion unterbrochen, n-Hexan hinzugefügt und das Enzym durch Filtration abgetrennt. Die organische Phase wird mit einer alkalischen wässrigen Lösung aus Natriumkarbonat behandelt, um überschüssige freie Fettsäuren zu entfernen (wenn benötigt). Das organische Lösungsmittel (nach Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat, wenn zweckmäßig) wird in vacuo auf einem rotierenden Evaporator entfernt, gefolgt von einer Hochvakuumbehandlung, um ein nahezu reines Produkt zu erhalten. Wenn stöchiometrische Mengen freier Fettsäuren verwendet werden, wird eine Titration mit standardisiertem Natriumhydroxid durchgeführt, um die Menge an freiem Fettsäuregehalt des rohen Reaktionsprodukts zu bestimmen.
BEISPIEL 12
Herstellung von Triacylglyceriden
CLA-Isomere werden, wie oben beschrieben, hergestellt und in einer molekularen Destillationsanlage bei 150 °C und einem Druck von 10^–2 mbar destilliert. Als nächstes werden 1000 kg des destillierten Produkts mit 97 kg reinem Glycerin und 80 kg Lipase gemischt. Die Reaktion findet für 12 Stunden bei 55 °C unter Vakuum und mit Rühren statt. Das Triacylglyceridprodukt wird in einem molekularen Destillationsapparat destilliert, um nicht reagierte Fettsäuren zu entfernen.
BEISPIEL 13
Herstellung von c11,t13-CLA
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer CLA-Probe, die näherungsweise 60 % des c11,t13-Isomers der CLA enthält. Kurz gesagt werden zwei Portionen eines 95 %-igen t10,c12-Fettsäureethylestergemischs zu jeweils 30 g in 70 ml-Teströhrchen übertragen. Die Teströhrchen wurden mit Stickstoff gereinigt und verschlossen. Die Teströhrchen wurden für eine Minute in einem 100 °C warmem Wasserbad vorgeheizt und dann direkt in ein 220 °C heißes Ölbad gegeben. Nach zwei Stunden wurde eines der Teströhrchen aus dem Ölbad genommen und abgekühlt. Das andere Teströhrchen wurde nach einer weiteren Stunde herausgenommen und dann abgekühlt. Die Isomerprofile der anfänglichen Probe und der zwei erhitzten Proben wurden durch GC bestimmt (Tabelle 13).
Drei Proben wurden aus jeder der beiden erhitzten Proben genommen und in 3,5, 4,5 oder 5,5 ml Aceton pro Gramm Fett in 70-ml Teströhrchen verdünnt (Tabelle 14). Die Teströhrchen mit Acetonlösung wurden dann in einem Gefrierschrank auf –60 °C abgekühlt. Nach drei Tagen wurden Proben aus den Überstandsfraktionen genommen. Das Isomerprofil der Überstandsfraktionen wurde durch GC bestimmt (Tabelle 15).
Das Erhitzen der anfänglichen Probe (gesamt-CLA ungefähr 99 %, Ölsäure 0,9 %) auf 220 °C für 2 und 3 Stunden verursachte eine teilweise Umwandlung des t10,c12-Isomers in ein c11,t13-Isomer. Die erhitzten Proben enthielten 35–45 c11,t13-Isomer (Tabelle 13). Die exakte Menge des Isomers konnte wegen der unvollständigen Trennung unter den gewählten GC-Bedingungen nicht bestimmt werden.
Die Kristallisierung der Probe, die für 2 Stunden erhitzt war, unterschied sich von der Kristallisierung der für 3 Stunden erhitzten Probe dadurch, dass bessere (festere) Kristalle gebildet wurden. Die für 3 Stunden erhitzte Probe ergab schmierige Kristalle. Die Analyse der Überstandsfraktionen zeigte, dass die Kristallisierung der für 2 Stunden erhitzten Probe eine bessere Trennung mit einem höheren Gehalt an c11,t13 in der Überstandsfraktion ergab. Der Gehalt an c11,t13- und t10,c12-CLA lag in diesen Überstandsfraktionen bei 56–60 % bzw. 27–30 %. Der Gehalt an c11,t13 war in den Überstandsfraktionen der Proben mit niedrigerem Fett/Aceton-Verhältnis etwas höher (Tabelle 15).

* In den erhitzten Proben stellen die Werte der c9,t11-Spalte c9,t11 und t8,c10 wegen ähnlicher Umwandlung aus c9,t11 dar. Die Werte, die für die Mengen an c10,c12 und c11,c13 angegeben sind, sind die durch GC integrierten Werte. Diese Werte können von dem tatsächlichen Gehalt aufgrund der unvollständigen Trennung auf den Chromatogrammen abweichen.

* Die beiden erhitzten Proben wurden in gleichen Mengen verdünnt.

* In den erhitzten Proben stellen die Werte in der c9,t11-Spalte c9,t11 und t8,c10 wegen ähnlicher Umwandlung aus c9,t11 dar. Die Werte, die für die Mengen an c10,c12 und c11,c13 angegeben sind, sind die durch GC integrierten Werte. Diese Werte können von dem tatsächlichen Gehalt aufgrund der unvollständigen Trennung auf den Chromatogrammen abweichen.

Aus den obigen Ausführungen geht hervor, dass die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen aus CLA-Isomeren bereitstellt.

Claims

Verfahren mit den folgenden Schritten: a) Bereitstellen eines ersten, teilweise gereinigten Octadecadiensäure-Isomers mit einem konjugierten Bindungssystem, und b) Erhitzen des teilweise gereinigten Octadecadiensäure-Isomers auf 200–240 °C, so dass das besagte konjugierte Bindungssystem wandert, wodurch ein Gemisch gebildet wird, das mindestens das erste Octadecadiensäure-Isomer und ein zweites Octadecadiensäure-Isomer umfasst, wobei das erste und zweite Octadecadiensäure-Isomer aus der folgenden Liste von Paaren ausgewählt sind:

und wobei das zweite Isomer in einer Konzentration von größer als 20 Gewichts-% des besagten ersten Isomers vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das des weiteren den Schritt des c) Trennens des ersten, teilweise gereinigten Octadecadiensäure-Isomers und des zweiten Octadecadiensäure-Isomers umfasst, um ein zweites, teilweise gereinigtes Octadecadiensäure-Isomer bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Trennschritt durch Gas- oder Flüssigkeitschromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Octadecadiensäure-Isomer einen Alkylester umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das des weiteren ein Synthetisieren eines Acylglycerols mit dem mindestens das erste Octadecadiensäure-Isomer und ein zweites Octadecadiensäure-Isomer umfassenden Gemisch umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Acylglycerol ein Triglycerid ist.