DE60109625T3

DE60109625T3 - Flüssige arzneizubereitung enthaltend ein erythropoietin derivat

Info

Publication number: DE60109625T3
Application number: DE60109625.8T
Authority: DE
Inventors: Apollon Papadimitriou
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2017-08-03
Anticipated expiration: 2021-05-09
Also published as: DE60109625T2; PL219131B1; EP1311285A2; ECSP024352A; IL152659A0; CA2408685A1; RU2281116C2; AR035034A1; BRPI0110914B1; JP2003533487A; JO3404B1; HUP0302114A2; AU784091B2; DK1311285T3; BRPI0110914B8; DE60109625D1; NO330934B1; MEP90708A; RS51292B; CZ304855B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pegyliertes humanes Erythropoietinprotein, ein mehrfach geladenes anorganisches Anion in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, der geeignet ist, um den pH-Wert der Lösung im Bereich von etwa 5,5 bis etwa 7,0 zu halten und gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe umfasst, wobei das Anion ein Sulfatanion ist. Diese Zusammensetzung ist insbesondere für die Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit Erythropoiese nützlich.
Erythropoiese ist die Bildung von roten Blutkörperchen, die erfolgt, um die Zellzerstörung auszugleichen. Erythropoiese ist ein kontrollierter physiologischer Mechanismus, der es ermöglicht, dass ausreichend rote Blutkörperchen für eine einwandfreie Gewebeoxygenierung zur Verfügung stehen. Natürlich auftretendes humanes Erythropoietin (hEPO) wird in der Niere produziert und ist der humorale Plasmafaktor, welcher die Bildung von roten Blutkörperchen anregt (Carnot, P und Deflandre, C (1906) C. R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5: 372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W und Plzak, LF (1957) Nature 179: 6331–4). Natürlich auftretendes EPO regt die Teilung und Differenzierung gebundener Erythroid-Nachkommen im Knochenmark an und übt seine biologische Aktivität durch Binden an Rezeptoren auf Erythroidvorläufern aus (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419).
Erythropoietin wurde biosynthetisch unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie hergestellt (Egrie, JP, Strickland, TW, Lane J et al. (1986) Immunobiol. 72: 213–224) und ist das Produkt eines klonierten humanen EPO-Gens, welches in die Ovarialgewebezellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) insertiert und exprimiert wurde. Die Primärstuktur der vorherrschenden vollständig verarbeiteten Form von hEPO ist in SEQ ID NO. 1 veranschaulicht. Es liegen zwei Disulfidbrücken zwischen Cys⁷-Cys¹⁶¹ und Cys²⁹-Cys³³ vor. Das Molekulargewicht der Polypeptidkette von EPO ohne die Zuckergruppen beträgt 18236 Da. In dem intakten EPO-Molekül gehören ungefähr 40% des Molekulargewichts zu den Kohlenwasserstoffgruppen, die das Protein an Glykosylierungsstellen des Proteins glykosylieren (Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A und Fukuda, M (1987), J. Biol. Chem. 262: 12059).
Da humanes Erythropoietin für die Bildung roter Blutkörperchen wesentlich ist, ist das Hormon bei der Behandlung von Bluterkrankungen nützlich, die durch eine geringe oder mangelhafte Bildung roter Blutkörperchen gekennzeichnet sind. Klinisch wird EPO für die Behandlung von Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF) (Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73–78; Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108–114) und bei AIDS und Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI In: MB, Ganick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspecitve. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: S. 301–324) verwendet.
Bekannte pharmazeutische Zusammensetzungen weisen zumindest einen der folgenden Nachteile auf:

– sie sind Lyophilisate. Abgesehen von dem komplizierten Herstellungsverfahren besitzen Lyophilisate den Nachteil, dass sie vor der Injektion in Menschen rekonstituiert werden müssen. Dies macht eine zusätzliche Bedienung durch medizinisches Personal notwendig, was lästig ist und das Risiko einer falschen Handhabung des pharmazeutischen Produktes mit sich bringt;
– sie enthalten humanes Serumalbumin als einen Zusatzstoff. Da humanes Serumalbumin ein Produkt ist, welches aus humanem Körperfluid gewonnen wird, besteht ein Risiko viraler Infektionen durch Verunreinigungen in der Albuminzubereitung. Außerdem sind allergische Reaktionen möglich;
– alle derzeit kommerziell erhältlichen Erythropoietin-Zusammensetzungen sind bei erhöhten Temperaturen, d. h. oberhalb von Kühlschranktemperatur, die normalerweise zwischen 2 und 8°C liegt, nicht stabil. Daher müssen sie in einem Kühlschrank (2–8°C) gelagert werden und können nicht bei Raumtemperatur (ungefähr 20°C) gelagert werden. Dies führt zu erhöhten Kosten, die durch Lagerung und Versenden bei niedriger Temperatur verursacht werden und es verursacht zudem Umstände bei der Handhabung des Arzneistoffprodukts. Nicht stabil bedeutet in diesen Zusammenhang, dass eine Lagerung bei erhöhten Temperaturen, z. B. 25°C für einen längeren Zeitraum (d. h. mehrere Monate oder mehr als 6 Monate), zu einer Degradation des Proteins führt. Degradation beschreibt in diesem Zusammenhang physikalische Veränderungen (z. B. Aggregation oder Denaturierung) und chemische Veränderungen (z. B. Oxidation oder Modifikation chemischer Bindungen im Allgemeinen) des Proteinmoleküls, die bekannterweise bevorzugt bei erhöhten Temperaturen (oberhalb von 8°C) auftreten. Inkubieren eines Proteins in der Nähe oder oberhalb von dessen Übergangstemperatur (die auch Schmelztemperatur genannt wird) führt zum Entfalten des Proteins, d. h. die native Struktur und die biologische Aktivität des Polypeptids gehen verloren. Die Übergangstemperatur steht in engem Zusammenhang mit der Temperaturstabilität des Proteins und ist von der Umgebung des Proteins (z. B. pH-Wert, Salze, Ionenstärke, Puffersubstanz etc.) abhängig. Beispielsweise kann die Denaturierung zu Aggregation von Erythropoietinmolekülen, d. h. Bildung von Dimeren (kovalent oder nicht kovalent), Aggregaten höherer Ordnung und sogar Partikeln führen. Dies führt zu einer verringerten Wirksamkeit des Wirkstoffs und könnte unerwünschte Nebenwirkungen nach der Injektion in Menschen hervorrufen.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem ist daher, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die geeignet ist, die oben genannten Nachteile zu minimieren oder zu unterdrücken.
Das Problem wird erfindungsgemäß gelöst, indem eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt wird, die ein humanes pegyliertes Erythropoietinprotein, ein mehrfach geladenes anorganisches Anion in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,0 und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe umfasst, wobei das Anion ein Sulfatanion ist.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Formulierung eines pegylierten Erythropoietins in dieser Zusammensetzung dessen Stabilität bei Temperaturen oberhalb von Kühlschranktemperatur (2–8°C) insbesondere bei Raumtemperatur (d. h. unterhalb von 25°C) und sogar bei höheren Temperaturen, z. B. bei 40°C verbessert. Dies bedeutet, dass die Zusammensetzung ohne Kühlen für einen längeren Zeitraum gelagert werden kann, ohne dass ein entscheidendes Maß an Wirksamkeit verloren geht und ohne signifikante Degradation.
Wenn nicht anders angegeben, werden die folgenden Definitionen verwendet, um die Bedeutung und den Rahmen der verschiedenen, hierin zur Beschreibung der Erfindung verwendeten Bezeichnungen zu veranschaulichen und zu definieren.
Die Bezeichnung „mehrfach geladenes anorganisches Anion” bezeichnet ein Sulfatanion. Das mehrfach geladene anorganische Anion kann in Form eines entsprechenden Salzes, z. B. des Natriumsalzes, des Kaliumsalzes und deren Mischungen, und/oder in Form der Pufferverbindungen zugegeben werden.
Die Bezeichnung „isoosmolar oder isotonisch” bedeutet eine Lösung, die mit Körperfluiden gemischt werden kann, ohne deren Bestandteile zu beeinträchtigen. Lösungen, die mit Blut isotonisch sind, wie beispielsweise Natriumchlorid 0,9%, weisen denselben osmotischen Druck wie Serum auf und beeinträchtigen die Membranen der roten Blutkörperchen nicht. Im Allgemeinen sind Lösungen, die isotonisch mit Blut sind, etwa 290 mosm/kg H₂O.
Die Bezeichnung „starke anorganische Säure” bezieht sich auf anorganische Säuren, die in einer 1 N-Lösung eine 20 bis 100%ige Dissoziierung zeigen, z. B. H₂SO₄.
Die Bezeichnung „pharmazeutisch annehmbar”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass der Puffer oder die Salze vom Gesichtspunkt der Toxizität her annehmbar sind.
Die Bezeichnung „Verdünner” bedeutet einen Inhaltsstoff in einer medizinischen Zubereitung, die keine pharmakologische Wirksamkeit besitzt, die jedoch pharmazeutisch notwendig oder wünschenswert ist. Ein Verdünner kann beispielsweise eine Flüssigkeit für das Auflösen von Wirkstoff(en) der/die injiziert werden soll(en), z. B. Wasser, sein.
Die Bezeichnung „Lösungsmittel” bezieht sich auf eine Flüssigkeit, die eine weitere Substanz in Lösung hält, d. h. diese auflöst, z. B. Wasser.
Die Bezeichnung „Konservierungsstoffe” bezieht sich auf eine Substanz, die zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugegeben wird, um das Bakterienwachstum zu verhindern, z. B. Benzalkoniumchlorid oder Benzylalkohol.
Die Bezeichnung „Polyol” bezieht sich auf irgendeine Substanz mit mehreren Hydroxylgruppen, einschließlich mehrwertigen Alkoholen und Kohlenhydraten. Die mehrwertigen Alkohole schließen solche Verbindungen wie Sorbit, Mannitol und Glyzerin ein. Kohlenhydrate sind cyclische Moleküle, die eine Keto- oder Aldehydgruppe aufweisen, wie z. B. Saccharose oder Trehalose.
Die Bezeichnung „Erythropoietin” oder „Erythropoietinprotein” bezieht sich auf ein Protein mit der in vivo biologischen Aktivität zu bewirken, dass Knochenmarkszellen die Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen steigern und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Erythropoietin und Analoga, die im Folgenden definiert sind.
Die Bezeichnung „pegyliertes Erythropoietin (Peg-EPO oder PEG-EPO)” bezieht sich auf ein Erythropoietinprotein, das kovalent mit ein bis drei Polyethylenderivaten verknüpft ist, wie unten beschrieben.
Die Bezeichnung „Vorrichtung” bedeutet eine Vorrichtung für einen speziellen Zweck. In der vorliegenden Erfindung ist es der Zweck, die Verabreichung der flüssigen pharmazeutischen Zusammensetzung zu ermöglichen, zu unterstützen oder zu vereinfachen.
Beschreibung der Zeichnungen:
1: Primärstuktur von humanem EPO (165 Aminosäuren) (SEQ ID NO. 1).
2: Primärstuktur von humanem EPO (166 Aminosäuren) (SEQ ID NO. 2).
3: Einfluss des pH-Wertes auf die thermische Stabilität. Die Übergangstemperatur ist gegen den pH-Wert aufgetragen.
4: Einfluss der Ionenstärke auf die thermische Stabilität. Die Übergangstemperatur ist gegen die Phosphatkonzentration aufgetragen.
5: Abhängigkeit der thermischen Stabilität von der Puffersubstanz.
6 zeigt, dass Sulfat auch bei niedrigem pH-Wert (z. B. pH 6,2) ein geeigneter Puffer/ein geeignetes Additiv ist, während Phosphat bei pH 6,2 weniger geeignet ist als bei pH 7,5. Dies zeigt, dass Sulfat die thermische Stabilität selbst bei niedrigem pH-Wert hoch hält.
7: Abhängigkeit der peg-EPO-Aggregation vom pH-Wert. Peg-EPO-Proben wurden nach Wärmebelastung (wie oben beschrieben) durch SDS-PAGE analysiert. Die Proteine wurden mit Silber angefärbt. Linie 1: Molekulargewichtsstandard. Linie 2: pH 5. Linie 3: pH 5, reduziert. Linie 4: pH 6. Linie 5: pH 6, reduziert. Linie 6: pH 6,5. Linie 7: ph 6,5, reduziert. Linie 8: pH 7. Linie 9: pH 7, reduziert. Linie 10: peg-EPO, unbelastet.
8 zeigt, dass die Verwendung von 1 mg/ml Acetylcystein als Antioxidanz die Bildung von Aggregaten unter Wärmebelastung verhindert. Aggregation von pegEPO unter Wärmebelastung (20 min 80°C): Linie 1: pegEPO bei pH 7,5, nicht belastet; Linie 2: pegEPO bei pH 7,5, belastet; Linie 3: pegEPO bei pH 6,2, belastet; Linie 4: pegEPO bei pH 6,2, belastet, reduziert; Linie 5: pegEPO bei pH 7,5, + 1 mg/ml N-Acetyl-cystein, belastet; Linie 6: pegEPO bei pH 7,5, + 1 mg/ml N-Acetyl-cystein, belastet; reduziert.
9: Sialinsäure(NANA)-Gehalt von peg-EPO-Proben in neuen Formulierungen, die für sechs Monate bei verschiedenen Temperaturen gelagert wurden.
10: Maus-Bioaktivitätsassay von peg-EPO-Proben die für sechs Monate bei verschiedenen Temperaturen in 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2 gelagert wurden.
11: Größenausschlusschromatographie Overlay von peg-EPO-Proben, die für 6 Monate in 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2 gelagert wurden (von unten nach oben: Puffer, Ausgangsmaterial, 4°C, 25°C, 30°C und 40°C).
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, die ein humanes pegyliertes Erythropoietinprotein, ein mehrfach geladenes anorganisches Anion in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer, der geeignet ist, um den pH-Wert der Lösung im Bereich von etwa 5,5 bis 7,0 zu halten, und gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe umfasst, wobei das Anion ein Sulftatanion ist.
Erfindungsgemäß ist die Zusammensetzung eine flüssige Lösung, z. B. eine wässrige Lösung. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die obigen pharmazeutischen Zusammensetzungen isotonische Lösungen.
Das Anion ist ein Sulfatanion. Die Konzentration des mehrfach geladenen anorganischen Anions kann zwischen 10 und 200 mmol/l Sulfat variieren.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Puffer, um den pH-Wert im Bereich von ungefähr 5,5 bis ungefähr 7,0, bevorzugt im Bereich von 5,8 bis 6,7, weiter bevorzugt im Bereich von 6,0 bis 6,5 und am meisten bevorzugt bei ungefähr pH 6,2 zu halten, kann ein herkömmlicher Puffer organischer oder anorganischer Säuren (z. B. Phosphatpuffer, Arginin/H₂SO₄/Na₂SO₄-Puffer oder irgendein anderes pharmazeutisch annehmbares Puffersystem) sein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung einen Phosphat- oder einen Arginin/H₂SO₄/Na₂SO₄-Puffer, weiter bevorzugt einen 10 bis 50 mmol/l Phosphatpuffer. Selbstverständlich sind auch Kombinationen dieser Puffersysteme Teil der vorliegenden Erfindung. Der pH-Wert kann mit einer entsprechenden Base, z. B. NaOH in dem Phosphatpuffersystem bzw. mit einer entsprechenden Säure, z. B. Schwefelsäure, in dem Argininpuffersystem angepasst werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe umfassen. Diese pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffe können ausgewählt werden aus pharmazeutisch annehmbaren Salzen, Verdünnern und/oder Lösungsmitteln und/oder Konservierungsmitteln etc., z. B. Tonizitätsmitteln (isotonisch machenden Mittel), Polyolen, Antioxidantien oder nicht-ionischen Detergenzien. Beispiele für diese Substanzen sind Natriumchlorid, Calciumchlorid, Sorbit, Mannitol, Glycerin, Saccharose, Trehalose, Acetylcystein, Polysorbat 20, Polysorbat 80 oder Pluronic F68.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen ein Polyol ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mannitol, Sorbit, Glycerin, Trehalose und Saccharose, bevorzugt Mannitol, enthalten. Die Konzentration des Polyols kann zwischen 1 und 10% (w/v) variieren.
Beispiele für Antioxidantien sind Cystein, Methionin, Acetylcystein oder Ascorbinsäure, bevorzugt Methionin. Antioxidantien können üblicherweise in einer Konzentration zwischen 0,01% und 0,5% (w/v) zugegeben werden, oder zum Beispiel im Fall von Methionin in einer Konzentration von 1–20 mM.
Die oben beschriebenen Zusammensetzungen können gegebenenfalls auch ein isotonisch machendes Mittel in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 0,9% w/w umfassen. Diese Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt; Beispiele für diese Mittel sind Natriumchlorid oder Natriumsulfat. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Zusammensetzungen isotonische Lösungen. Die obige Zusammensetzung kann auch ein nicht-ionisches Detergenz, wie Polysorbat 20, Polysorbat 80 oder Pluronic F68 enthalten, bevorzugt Pluronic F68, z. B. bis zu 1% (w/v), werter bevorzugt bis zu 0,1% (w/v), z. B. 0,001 bis 0,01% (w/v).
Die obige Zusammensetzung kann auch zusätzliche Salze, z. B. bis zu 1 mmol/l CaCl₂, enthalten.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere nützlich für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein pegyliertes Erythropoietin als pharmazeutisch wirksamen Inhaltsstoff umfassen. Die Bezeichnung „Erythropoietin” oder „Erythropoietinprotein” oder „EPO” ist wie folgt: die Bezeichnungen beziehen sich insbesondere auf ein Glycoprotein, z. B. das humane Erythropoietin, z. B. mit der in (SEQ ID NO. 1) oder (SEQ ID NO. 2) angegebenen Aminosäuresequenz oder einer Aminosäuresequenz, die dazu im wesentlichen homolog ist, dessen biologische Eigenschaften die Anregung der Bildung roter Blutkörperchen und die Anregung der Teilung und Differenzierung von gebundenen Erythroid-Nachkommen im Knochenmark betreffen. Wie hierin verwendet, beinhalten diese Bezeichnungen solche Proteine, die bewusst modifiziert wurden, wie zum Beispiel durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch zufällige Mutationen. Diese Bezeichnungen beinhalten auch Analoga mit 1 bis 6 zusätzlichen Stellen zur Glycosylierung, Analoga, die mindestens eine zusätzliche Aminosäure an dem carboxyterminalen Ende des Glycoproteins aufweisen, wobei die zusätzliche Aminosäure mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält und Analoga, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die eine Umordnung von mindestens einer Stelle für die Glycosylierung beinhalten. Diese Bezeichnungen schließen sowohl natürliches als auch rekombinant hergestelltes humanes Erythropoietin ein.
Wie im Folgenden ausführlicher dargelegt wird, ist die Herstellung und Reinigung von EPO im Stand der Technik gut bekannt. Mit Erythropoietin ist das natürliche oder rekombinante humane Protein gemeint, das aus irgendeiner herkömmlichen Quelle, wie beispielsweise aus Geweben, durch Proteinsynthese, in Zellkultur mit natürlichen oder rekombinanten Zellen erhalten wird. Jegliche Proteine, welche die Aktivität von Erythropoietin besitzen, wie beispielsweise Muteine oder anders modifizierte Proteine, sind eingeschlossen. Rekombinantes EPO kann durch Expression in CHO-, BHK- oder HeLa-Zelllinien durch rekombinante DNA-Technologie oder durch endogene Genaktivierung hergestellt werden. Die Expression von Proteinen einschließlich durch endogene Genaktivierung ist im Stand der Technik bekannt und zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,733,761 , 5,641,670 und 5,733,746 und in den internationalen Patentveröffentlichungen Nr. WO 93/09222 , WO 94/12650 , WO 95/31560 , WO 90/11354 , WO 91/06667 und WO 91/09955 offenbart, deren Inhalte hierin als Referenz inbegriffen sind. Die EPO-Spezien für die Herstellung von Erythropoietin-Glycoproteinprodukten sind humane EPO-Spezien.
Weiter bevorzugt ist die EPO-Spezies das humane EPO mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 angegeben ist, weiter bevorzugt ist die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 1.
Ferner kann Erythropoietin ein Glycoprotein-Analogon mit von 1 bis 6 zusätzlichen Stellen für eine Glycosylierung sein. Die Glycosylierung eines Proteins mit einer oder mehreren Olisaccharidgruppen erfolgt an spezifischen Positionen entlang eines Polypeptidrückgrats und beeinflusst stark die physikalischen Eigenschaften des Proteins, wie beispielsweise die Proteinstabilität, Sekretion, subzelluläre Lokalisierung und biologische Aktivität. Üblicherweise treten zwei Typen von Glycosylierungen auf. O-verknüpfte Oligosaccharide sind an Serin- oder Threoninreste gebunden und N-verknüpfte Oligosaccharide sind an Asparaginreste gebunden. Ein Typ eines Oligosaccharids, welches sowohl an N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden auftritt, ist N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure), bei der es sich um eine Familie von Aminozuckern mit 9 oder mehr Kohlenstoffatomen handelt. Sialinsäure ist üblicherweise der terminale Rest an sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden und, da sie eine negative Ladung trägt, verleiht sie dem Glycoprotein saure Eigenschaften. Humanes Erythropoietin mit 165 Aminosäuren enthält drei N-verknüpfte und eine O-verknüpfte Oligosaccharidkette, welche etwa 40% des gesamten Molekulargewichts des Glycoproteins ausmachen. N-verknüpfte Glycosylierung tritt an Asparaginresten, die sich an den Positionen 24, 38 und 83 befinden, auf und O-verknüpfte Glycosylierung tritt an einem Serinrest, der sich an Position 126 befindet, auf. Die Oligosaccharidketten sind mit terminalen Sialinsäureresten modifiziert. Die enzymatische Entfernung aller Sialinsäurereste von dem glycosylierten Erythropoietin führt zu einem Verlust der in vivo Aktivität, aber nicht der in vitro Aktivität, da die Sialylierung von Erythropoietin dessen Bindung und anschließende Clearance durch hepatisches Bindungsprotein verhindert.
Die Bezeichnung „Erythropoietin” der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst Analoga von humanem Erythropoietin mit einer oder mehreren Veränderungen in der Aminosäuresequenz von humanem Erythropoietin, was zu einer Erhöhung der Anzahl an Stellen für eine Sialinsäureanbindung führt. Diese Glycoproteinanaloga können durch seitengerichtete Mutagenese gebildet werden und weisen Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten auf, welche die für eine Glycosylierung zur Verfügung stehenden Stellen vermehren oder verändern. Glycoprotein-Analoga mit größeren Sialinsäurewerten als denen, die bei humanem Erythropoietin angetroffen werden, werden durch Hinzufügen von Glycosylierungsstellen gebildet, welche die für die biologische Aktivität benötigte sekundäre oder tertiäre Konformation nicht beeinträchtigen. Die Glycoproteine der vorliegenden Erfindung beinhalten auch Analoga mit erhöhten Kohlenhydratbindungswerten an einer Glycosylierungsstelle, welche üblicherweise die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in enger Nachbarschaft zu einer N-verknüpften oder O-verknüpften Stelle einschließen. Die Glycoproteine der vorliegenden Erfindung beinhalten auch Analoga mit einer oder mehreren Aminosäuren, die sich von dem carboxyterminalen Ende von Erythropoietin erstrecken und mindestens eine zusätzliche Kohlenhydratstelle aufweisen. Die Erythropoietinproteine der vorliegenden Zusammensetzung umfassen auch Analoga mit einer Aminosäuresequenz, welche eine Umordnung von mindestens einer Stelle für eine Glycosylierung einschließen. Eine solche Umordnung einer Glycosylierungsstelle schließt die Deletion einer oder mehrerer Glycosylierungsstellen in humanem Erythropoietin und das Hinzufügen von einer oder mehreren nicht natürlich auftretenden Glycosylierungsstellen ein. Eine Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratketten an Erythropoietin und daher der Anzahl an Sialinsäuren pro Erythropoietinmolekül kann vorteilhafte Eigenschaften mit sich bringen, wie beispielsweise eine erhöhte Löslichkeit, höhere Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse, verringerte Immunogenität, erhöhte Serumhalbwertszeit und erhöhte biologische Aktivität. Erythropoietin-Analoga mit zusätzlichen Glycosylierungsstellen sind in der europäischen Patentanmeldung 640 619 von Elliot, veröffentlicht am 1. März 1995, ausführlicher offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Erythropoietinproteine mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens eine zusätzliche Stelle für die Glycosylierung beinhaltet, wie beispielsweise jedoch nicht begrenzt auf Erythropoietine, welche die Sequenz von humanem Erythropoietin aufweisen, die durch eine der folgenden Modifikationen modifiziert ist:
Asn³⁰Thr³²;
Asn⁵¹Thr⁵³,
Asn⁵⁷Thr⁵⁹;
Asn⁶⁹;
Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;
Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Asn¹³⁶Thr¹³⁸;
Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;
Thr¹²⁵; und
Pro¹²⁴Thr¹²⁵.
Die hierin verwendete Schreibweise für eine Modifizierung der Aminosäuresequenz bedeutet, dass die Position(en) des entsprechenden nicht-modifizierten Proteins (z. B. hEPO von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2), die durch die hochgestellte(n) Zahl(en) angegeben ist/sind, ausgetauscht ist/sind gegen die Aminosäure(n), die direkt der/den entsprechenden hochgestellte(n) Zahl(en) vorausgeht/vorausgehen.
Das Erythropoietin-Protein kann auch ein Analogon sein, das mindestens eine zusätzliche Aminosäure am carboxyterminalen Ende des Glycoproteins aufweist, wobei die zusätzliche Aminosäure mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält. Die zusätzliche Aminosäure kann ein Peptidfragment, das von dem carboxyterminalen Ende von humanem Choriongonadotropin stammt, umfassen. Bevorzugt ist das Glycoprotein ein Analogon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) humanem Erythropoietin mit der Aminosäuresequenz Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Lou Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NO. 3), die sich vom Carboxyterminus erstreckt; (b) dem Analogon von (a) ferner umfassend Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; und (c) dem Analogon von (a) ferner umfassend Asn³⁰ Thr³² Val⁶⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.
Das Erythropoietinprotein kann auch ein Analogon sein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche eine Umordnung von mindestens einer Glycosylierungsstelle einschließt. Die Umordnung kann eine Deletion irgendeiner der N-verknüpften Kohlenhydratstellen in humanem Erythropoietin und ein Hinzufügen einer N-verknüpften Kohlenhydratstelle in Position 88 der Aminosäuresequenz von humanem Erythropoietin umfassen. Bevorzugt ist das Glycoprotein ein Analogon ausgewählt aus der Gruppe von Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO und Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ EPO.
Genauer beinhaltet das pegylierte Erythropoietinprotein der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, pegylierte Derivate davon. Pegylierte Derivate von Erythropoietin und deren Herstellung ist im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in EP-A-539,167 , EP-A-605,963 , WO 93/25212 , WO 94/20069 , WO 95/11924 , US-Patent Nr. 5,56 , EP-A-584,876 , WO 92/16555 , WO 94/28024 , WO 97/04796 , US-Patente Nrn. 5,359,030 und 5,681,811 , US-Patent Nr. 4,179,337 , japanisches Patent, WO 98/32466 , US-Patent Nr. 5,324,650 beschrieben. Eine bevorzugte Ausführungsform von pegylierten Erythropoietinspezien betrifft die im Folgenden beschriebenen Derivate.
Dem entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Erythropoietin-Konjugat, wobei das Konjugat ein Erythropoietinprotein wie oben definiert umfasst, das mindestens eine freie Aminogruppe aufweist und die biologische in vivo Aktivität besitzt, zu bewirken, dass Knochenmarkszellen die Bildung von Retikulocyten und roten Blutkörperchen erhöhen und welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Erythropoietin und Analoga davon, welche die Sequenz von humanem Erythropoietin aufweisen, modifiziert durch Hinzufügen von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder durch Umordnen mindestens einer Glycosylierungsstelle; wobei das Erythropoietin kovalent an „n” Poly(ethylenglycol)-Gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR verknüpft ist, wobei das -CO (d. h. Carbonyl) jeder Poly-(ethylenglycol)-Gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl ist; x 2 oder 3 ist; m von etwa 450 bis etwa 900 ist; n von 1 bis 3 ist; und n und m so gewählt sind, dass das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins von 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt. Diese Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche die hierin beschriebenen Konjugate enthalten, in denen der Prozentsatz an Konjugaten, in denen n 1 ist mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92%, weiter bevorzugt 96% aller Konjugate der Zusammensetzung beträgt.
Genauer können die obigen Konjugate durch Formel (I) wiedergegeben werden P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂PCH₂)_m-OR]_n (I) worin P der Rest eines wie hierin beschriebenen Erythropoietinproteins ist (d. h. ohne die Aminogruppe oder die Aminogruppen, welche eine Amidverknüpfung mit dem in Formel I gezeigten Carbonyl bilden), wobei sie die biologische in vivo Aktivität besitzen, zu bewirken, dass Knochenmarkszellen die Bildung von Retikulocyten und roten Blutkörperchen steigern; und wobei R Niederalkyl ist; x 2 oder 3 ist; m von etwa 450 bis etwa 900 ist; n von 1 bis 3 ist; und n und m so gewählt sind, dass das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins von 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
Wie hierin verwendet, bedeutet „Niederalkyl” eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit eins bis sechs Kohlenstoffatomen. Beispiele für Niederalkylgruppen beinhalten Methyl, Ethyl und Isopropyl. Gemäß dieser Erfindung ist R ein beliebiges Niederalkyl. Konjugate, in welchen R Methyl ist, sind bevorzugt.
Das Symbol „m” bedeutet die Anzahl an Ethylenoxid-Resten (OCH₂CH₂) in der Poly-(ethylenoxid)-Gruppe. Eine einzelne PEG(Polyethylenglycol)-Untereinheit von Ethylenoxid besitzt ein Molekulargewicht von etwa 44 Dalton. Somit hängt das Molekulargewicht des Konjugats (ohne das Molekulargewicht von EPO) von der Anzahl „m” ab. In den Konjugaten dieser Erfindung ist „m” von 450 bis etwa 900 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa), bevorzugt von etwa 650 bis etwa 750 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 30 kDa). Die Zahl m ist so ausgewählt, dass das resultierende erfindungsgemäße Konjugat eine physiologische Aktivität besitzt die mit derjenigen von nicht-modifiziertem EPO vergleichbar ist, wobei die Aktivität dieselbe wie, größer als oder ein Teil der entsprechenden Aktivität von nicht-modifiziertem EPO bedeuten kann. Ein Molekulargewicht von „etwa” einer bestimmten Zahl bedeutet, dass es innerhalb eines vernünftigen Bereichs dieser Zahl liegt, wie durch herkömmliche analytische Verfahren ermittelt. Die Zahl „m” ist so ausgewählt, dass das Molekulargewicht jeder Poly-(ethylenglycol)-Gruppe, die kovalent mit dem Erythropoietinglycoprotein verknüpft ist, von etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa beträgt und bevorzugt etwa 30 kDa beträgt.
In den Konjugaten dieser Erfindung ist die Zahl „n” die Anzahl an Poly(ethylenoxid)-Gruppen, die durch Amidverknüpfung(en) kovalent an freie Aminogruppen (einschließlich ε-Aminogruppen einer Lysinaminosäure und/oder der aminoterminalen Aminogruppe) eines Erythropoietinproteins gebunden sind. Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann eine, zwei oder drei PEG-Gruppen pro EPO-Molekül aufweisen. „n” ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3, bevorzugt ist „n” 1 oder 2 und werter bevorzugt ist „n” 1. Ein bevorzugtes Konjugat der oben beschriebenen Konjugate umfasst Verbindungen, in denen x 2 ist, m 650 bis 750 ist, n 1 ist und R Methyl ist.
Die Verbindung der Formel (I) kann aus dem bekannten Polymermaterial:
in welchem R und m wie oben beschrieben sind hergestellt werden, durch Kondensieren der Verbindung der Formel (II) mit dem Erythropoietinglycoprotein. Verbindungen der Formel (II), in welchen x 3 ist, sind alpha-Niederalkoxy, Butansäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol)-(Niederalkoxy-PEG-SBA). Verbindungen der Formel (II), in welchen x 2 ist, sind alpha-Niederalkoxy, Propionsäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol)-(Niederalkoxy-PEG-SPA). Es kann jedes beliebige herkömmliche Verfahren zur Umsetzung eines aktivierten Esters mit einem Amin unter Bildung eines Amids verwendet werden. In der oben beschriebenen Reaktion ist der exemplarisch aufgeführte Succinimidylester eine Abgangsgruppe, welche die Amidbildung bewirkt. Die Verwendung von Succinimidylestern, wie beispielsweise den Verbindungen der Formel II, zur Bildung von Konjugaten mit Proteinen, sind in US-Patent Nr. 5,672,662 , erteilt am 30. September 1997 (Harris et al.) offenbart.
Humanes EPO enthält neun freie Aminogruppen, die aminoterminale Aminogruppe plus die ε-Aminogruppen von 8 Lysinresten. Wenn das Pegylierungsreagenz mit einer SBA-Verbindung der Formel II kombiniert wurde, so wurde gefunden, dass bei pH 7,5, einem Protein:PEG-Verhältnis von 1:3 und einer Reaktionstemperatur von 20–25°C eine Mischung von mono-, di- und Spurender tripegylierten Spezies gebildet wurden. Wenn das Pegylierungsreagenz eine SPA-Verbindung der Formel II war, so wurde bei den gleichen Bedingungen, außer dass das Protein:PEG-Verhältnis 1:2 war, vorrangig die monopegylierte Spezies gebildet. Das pegylierte EPO kann als eine Mischung verabreicht werden oder als verschiedene, durch Kationenaustauschchromatographie getrennte pegylierte Spezien. Durch Beeinflussung der Reaktionsbedingungen (z. B. Verhältnis der Reagenzien, pH-Wert, Temperatur, Proteinkonzentration, Reaktionszeit etc.) können die relativen Mengen der verschiedenen pegylierten Spezies variiert werden.
Die wie oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch ein wie oben definiertes Erythropoietinprotein enthalten, das mindestens eine freie Aminogruppe aufweist und die biologische in vivo Aktivität besitzt, zu bewirken, dass Knochenmarkszellen die Produktion von Retikulocyten und roten Blutkörperchen steigern und welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus humanem Erythropoietin und Analoga davon, welche die Primärstruktur von humanem Erythropoietin aufweisen, modifiziert durch Hinzufügen von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen, wobei das Glycoprotein kovalent verknüpft ist an ein bis drei Niederalkoxypoly(ethylenglycol)-Gruppen, wobei jede Poly(ethylenglycol)-Gruppe kovalent mit dem Glycoprotein verknüpft ist über einen Linker der Formel -C(O)-X-S-Y-, wobei das C(O) des Linkers eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet, X -CH₂)_k- oder -CH₂(OCH₂CH₂)_k- ist, k von 1 bis 10 ist, Y
oder
ist, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)-Einheit von etwa 20 Kilodalton bis etwa 40 Kilodalton beträgt und das Molekulargewicht des Konjugats von etwa 51 Kilodalton bis etwa 175 Kilodalton beträgt.
Diese Erythropoietinspezies kann auch durch Formel (III) wiedergegeben werden P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (III) worin R ein beliebiges Niederalkyl sein kann, womit eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit eins bis sechs Kohlenstoffatomen gemeint ist, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Isopropyl etc. Ein bevorzugtes Alkyl ist Methyl. X kann -(CH₂)_k- oder -CH₂(OCH₂CH₂)_k- sein, worin k von 1 bis etwa 10 ist. Bevorzugt ist k von 1 bis etwa 4, weiter bevorzugt ist k 1 oder 2. Am meisten bevorzugt ist X -(CH₂).
In Formel I ist Y
bevorzugt
weiter bevorzugt
In Formel (III) ist die Zahl m so ausgewählt, dass das resultierende Konjugat der Formel (III) eine physiologische Aktivität aufweist, die mit der von nicht-modifiziertem EPO vergleichbar ist, wobei die Aktivität dieselbe, mehr als oder ein Teil der entsprechenden Aktivität von nicht-modifiziertem EPO bedeuten kann. m bedeutet die Anzahl an Ethylenoxidresten in der PEG-Einheit. Eine einzelne PEG-Untereinheit von -(OCH₂CH₂)- weist ein Molekulargewicht von etwa 44 Dalton auf. Somit hängt das Molekulargewicht des Konjugats (ohne das Molekulargewicht des EPO) von der Zahl m ab. Ein Molekulargewicht von „etwa” einer bestimmten Zahl bedeutet, dass es innerhalb eines vernünftigen Bereichs dieser Zahl liegt, wie durch herkömmliche analytische Verfahren bestimmt. m ist eine ganze Zahl im Bereich von etwa 450 bis etwa 900 (entsprechend einem Molekulargewicht von 20 bis 40 kDa), bevorzugt ist m vom etwa 550 bis etwa 800 (etwa 24 bis 35 kDa) und am meisten bevorzugt ist m von etwa 650 bis etwa 700 (etwa 29 bis etwa 31 kDa).
In Formel (III) ist die Zahl n die Anzahl an ε-Aminogruppen einer Lysinaminosäure in einem Erythropoietinprotein, das kovalent über eine Amidverknüpfung an eine PEG-Einheit gebunden ist. Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann eine, zwei oder drei PEG-Einheiten pro EPO-Molekül aufweisen. n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3, bevorzugt ist n 1 oder 2 und weiter bevorzugt ist n 1.
Bevorzugte Erythropoietinproteine der Formel (III) werden durch die Formeln
und
wiedergegeben.
Am meisten bevorzugte Erythropoietinglycoprotein-Produkte werden durch die Formel
wiedergegeben, wobei in den obigen Formeln n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; m eine ganze Zahl von 450 bis 900 ist; R Niederalkyl ist; X -(CH₂)_k- oder -CH₂(OCH₂CH₂)_k- ist und P der Rest des Erythropoietinglycoproteins ist ohne die Aminogruppe oder Gruppen, welche eine Amidverknüpfung mit X bilden.
Andere bevorzugte Erythropoietinglycoprotein-Produkte werden durch die Formeln
wiedergegeben.
Weiter bevorzugte Erythropoietinglycoprotein-Produkte werden durch die Formel
wiedergegeben.
Diese Erythropoietinproteine können hergestellt werden durch

(a) kovalentes Umsetzen einer ε-Aminogruppe einer Lysinaminosäure eines Erythropoietinproteins, wiedergegeben durch die Formel P-[NH₂]_n, mit einem bifunktionalen Reagenz, wiedergegeben durch die Formel Z-CO-X-S-Q, unter Bildung eines Intermediats mit einer Amidverknüpfung, wiedergegeben durch die Formel: P-[NH-CO-X-S-Q]_n worin P ein Erythropoietinprotein abzüglich der Aminogruppe, welche eine Amidverknüpfung bildet, ist; n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; Z eine reaktive Gruppe, z. B. ein Carbonsäure-NHS-Ester ist; X -(CH₂)_k- oder -CH₂(OCH₂CH₂)_kist, worin k von 1 bis etwa 10 ist; und Q eine Schutzgruppe wie Alkanoyl, z. B. Acetyl, ist.
(b) kovalentes Umsetzen des Intermediats mit einer Amidverknüpfung aus Schritt (a) mit einem aktivierten Poly(ethylenglycol)-Derivat, wiedergegeben durch die Formel W-[OCH₂CH₂]_m-OR, unter Bildung eines Erythropoietinglycoprotein-Produkts, wiedergegeben durch die Formel
worin W eine reaktive Sulfhydrylform von Y ist; m eine ganze Zahl im Bereich von etwa 450 bis etwa 900 ist; R Niederalkyl ist und Y wie oben definiert ist.

In dieser Ausführungsform ist das bifunktionale Reagenz bevorzugt N-Succinimidyl-S-acetylthiopropionat oder N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat, Z ist bevorzugt N-Hydroxysuccinimid und das aktivierte Poly(ethylenglycol)-Derivat W-[OCH₂CH₂]_m-OR ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Jodacetylmethoxy-PEG, Methoxy-PEG-vinylsulfon und Methoxy-PEG-maleimid.
Genauer können die Erythropoietinproteine der Formel (III) hergestellt werden durch kovalentes Verknüpfen von Thiolgruppen mit EPO („Aktivierung”) und Kopplung des resultierenden aktivierten EPOs mit einem Poly(ethylenglycol)(PEG)-Derivat. Der erste Schritt zur Herstellung von pegyliertem EPO gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein kovalentes Verknüpfen von Thiolgruppen über NH₂-Gruppen von EPO. Diese Aktivierung von EPO wird mit bifunktionellen Reagenzien durchgeführt, die eine geschützte Thiolgruppe und eine zusätzliche reaktive Gruppe tragen, wie beispielsweise aktive Ester (z. B. einen Succinimidylester), Anhydride, Ester von Sulfonsäuren, Halogenide von Carbonsäuren bzw. Sulfonsäuren. Die Thiolgruppe ist durch im Stand der Technik bekannte Gruppen, z. B. Acetylgruppen, geschützt. Diese bifunktionellen Reagenzien sind in der Lage, mit den ε-Aminogruppen der Lysinaminosäuren unter Bildung einer Amidverknüpfung zu reagieren. Der erste Schritt der Reaktion ist unten dargestellt:
EPO, n und X sind wie oben definiert und Z ist eine im Stand der Technik bekannte reaktive Gruppe, z. B. ein N-Hydroxy-Succinimid(NHS)-Substituent der Formel
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivierung der ε-Amino-Lysin-Gruppen durch Umsetzung mit bifunktionellen Reagenzien, die eine Succinimidyleinheit aufweisen, durchgeführt. Die bifunktionellen Reagenzien können unterschiedliche Arten von Spacern tragen, z. B. -(CH₂)_k- oder -CH₂(OCH₂CH₂)_k-Einheiten, worin k von 1 bis etwa 10 ist, bevorzugt von 1 bis etwa 4 und weiterbevorzugt 1 oder 2 und am meisten bevorzugt 1. Beispiele dieser Reagenzien sind N-Succinimidyl-S-acetylthiopropionat (SATP) und N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA)
Acetylthioalkyl-carbonsäure-NHS-ester, wie
2-(Acetylthio)-(ethoxy)_k-essigsäure-NHS-ester
wobei k wie oben definiert ist.
Die Herstellung der bifunktionellen Reagenzien ist im Stand der Technik bekannt. Vorläufer von 2-(Acetylthio)-(ethoxy)_k-essigsäure-NHS-estern sind in DE-3924705 beschrieben, während die Derivatisierung zu der Acetylthioverbindung von March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375–376, beschrieben ist. SATA ist kommerziell erhältlich (Molecular Probes, Eugene, OR, USA und Pierce, Rockford, IL).
Die Anzahl an Thiolgruppen, die zu einem EPO-Molekül hinzugefügt werden sollen, kann durch Anpassen der Reaktionsparameter, d. h. der Protein(EPO)-Konzentration und des Protein/bifunktionelles Reagenz-Verhältnisses ausgewählt werden. Bevorzugt wird das EPO durch kovalentes Verknüpfen von 1 bis 5 Thiolgruppen pro EPO-Molekül, weiter bevorzugt von 1,5 bis 3 Thiolgruppen pro EPO-Molekül aktiviert. Diese Bereiche betreffen die statistische Verteilung der Thiolgruppe über die EPO-Proteinpopulation.
Die Reaktion wird zum Beispiel in einer wässrigen Pufferlösung, pH 6,5–8,0 durchgeführt, z. B. in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,3. Das bifunktionelle Reagenz kann in DMSO hinzugegeben werden. Nach Beendigung der Reaktion, bevorzugt nach 30 Minuten, wird die Reaktion durch Zugeben von Lysin angehalten. Überschüssiges bifunktionelles Reagenz kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, z. B. durch Dialyse oder Säulenfiltration, abgetrennt werden. Die durchschnittliche Anzahl an zu dem EPO hinzugefügten Thiolgruppen kann durch photometrische Verfahren bestimmt werden, die zum Beispiel in Grasetti, D. R: und Murray, J. F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41–49 (1967) beschrieben sind.
Auf die obige Reaktion folgt eine kovalente Kopplung eines aktivierten Poly(ethylenglycol)(PEG)-Derivats. Geeignete PEG-Derivate sind aktivierte PEG-Moleküle mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 20 bis etwa 40 kDa, weiter bevorzugt von etwa 24 bis etwa 35 kDa und am meisten bevorzugt etwa 30 kDa.
Aktivierte PEG-Derivate sind im Stand der Technik bekannt und sind zum Beispiel in Morpurgo, M. et al., J. Bioconj. Chem. (1996) 7, Seite 363 ff. für PEG-Vinylsulfon beschrieben. Geradkettige und verzweigtkettige PEG-Spezien sind geeignet für die Herstellung der Verbindungen der Formel I. Beispiele für reaktive PEG-Reagenzien sind Jod-acetyl-methoxy-PEG und Methoxy-PEG-vinylsulfon:
Die Verwendung dieser jodaktivierten Substanzen ist im Stand der Technik bekannt und wird z. B. von Hermanson, G. T. in Bioconjugagte Techniques, Academic Press, San Diego (1996) Seiten 147–148 beschrieben.
Am meisten bevorzugt werden die PEG-Spezies durch Maleimid aktiviert unter Verwendung von (Alkoxy-PEG-Maleimid), wie beispielsweise mit Methoxy-PEG-Maleimid (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Die Struktur von Alkoxy-PEG-maleimid ist wie folgt:
wobei R und m wie oben definiert sind, bevorzugt
Die Kopplungsreaktion mit Alkoxy-PEG-maleimid erfolgt nach der in situ Spaltung der Thiolschutzgruppe in einer wässrigen Pufferlösung, z. B. 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2. Die Spaltung der Schutzgruppe kann zum Beispiel mit Hydroxyamin in DMSO bei 25°C, pH 6,2 für etwa 90 Minuten durchgeführt werden. Für die PEG-Modifizierung sollte das Molverhältnis von aktiviertem EPO/Alkoxy-PEG-maleimid von etwa 1:3 bis etwa 1:6 und bevorzugt 1:4 betragen. Die Reaktion kann angehalten werden durch Zugeben von Cystein und Umsetzung der verbleibenden Thiol(-SH)-Gruppen mit N-Methylmaleimid oder anderen geeigneten Verbindungen, die zur Bildung von Disulfidbindungen in der Lage sind. Aufgrund der Reaktion jeglicher verbleibender Thiolgruppen mit einer Schutzgruppe, wie zum Beispiel N-Methylmaleimid oder einer anderen geeigneten Schutzgruppe, können die EPO-Glycoproteine in den Konjugaten dieser Erfindung solche Schutzgruppen enthalten. Im Allgemeinen ergibt die hierin beschriebene Vorgehensweise eine Mischung von Molekülen mit variierenden Anzahlen an Thiolen, die durch verschiedene Anzahlen der Schutzgruppe geschützt sind, abhängig von der Anzahl an aktivierten Thiolgruppen an dem Glycoprotein, die nicht an PEG-Maleimid konjugiert waren.
Während N-Methylmaleimid dieselbe Art von kovalenter Bindung bildet, wenn es verwendet wird, um die verbleibenden Thiolgruppen an dem pegylierten Protein zu blockieren, führen Disulfidverbindungen über eine intermolekulare Sulfid/Disulfid-Austauschreaktion zu einer Disulfid-verbrückten Kopplung des Blockierungsreagenzes. Bevorzugte Blockierungsreagenzien für diese Art der Blockierungsreaktion sind oxidiertes Glutathion (GSSG), Cystein und Cystamin. Während mit Cystein keine zusätzliche Nettoladung in das pegylierte Protein eingeführt wird, führt die Verwendung der Blockierungsmittel GSSG oder Cystamin zu einer zusätzlichen negativen oder positiven Ladung.
Die weitere Reinigung der Verbindungen der Formel (III) einschließlich der Trennung von mono-, di- und tripegylierten EPO-Spezies kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden, z. B. Säulenchromatographie.
Eine Zusammensetzung, die pegylierte Erythropoietinderivate umfasst, enthält bevorzugt mindestens 90% Mono-PEG-Konjugate, d. h. solche, in denen n 1 ist, und kann wie in Beispiel 5 gezeigt hergestellt werden. Üblicherweise sind Mono-PEG-Konjugate von Erythropoietinglycoproteinen wünschenswert, da sie eher eine höhere Aktivität als Di-PEG-Konjugate besitzen. Der Prozentsatz an Mono-PEG-Konjugaten sowie das Verhältnis von Mono- und Di-PEG-Spezies kann kontrolliert werden, indem breitere Fraktionen um den Elutionspeak zusammengefasst werden, um den Prozentsatz an Mono-PEG zu verringern oder indem engere Fraktionen verwendet werden, um den Prozentsatz an Mono-PEG in der Zusammensetzung zu erhöhen. Etwa 90% Mono-PEG-Konjugate stellt ein gutes Gleichgewicht von Ausbeute und Aktivität dar. Manchmal können Zusammensetzungen, in denen zum Beispiel mindestens zweiundneunzig Prozent oder mindestens sechsundneunzig Prozent der Konjugate Mono-PEG-Spezies (n gleich 1) sind, gewünscht werden. In einer Ausführungsform dieser Erfindung liegt der Prozentsatz an Konjugaten mit n gleich 1 bei neunzig Prozent bis sechundneunzig Prozent.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können 10 bis 10000 μg eines Erythropoietinproteins pro ml umfassen, wie oben definiert. Bevorzugt umfassen die Zusammensetzungen 10 bis 1000 μg, z. B. 10, 50, 100, 400, 800 oder 2500 μg pro ml.
Weiter können die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung 10 μg bis 10000 μg Erythropoietinprotein pro ml, 10–200 mmol/l Sulfat, 10 bis 50 mmol/l Phosphat, pH 6,0 bis 6,5, umfassen. Diese Zusammensetzung kann auch bis zu 20 mM Methionin, 1–5% eines Polyols (w/v), bis zu 0,1% Pluronic F68 (w/v) und gegebenenfalls bis zu 1 mM CaCl₂ umfassen. Ein Beispiel dieser Zusammensetzung umfasst 10 μg bis 10000 μg Erythropoietinprotein pro ml, 40 mmol/l Sulfat, 10 mmol/l Phosphat, 3% Mannitol (w/v), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v), pH 6,2.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung 10 μg bis 10000 μg Erythropoietinprotein pro ml, 10–100 mmol/l NaCl, 10 bis 50 mmol/l Phosphat, pH 6,0 bis 7,0, gegebenenfalls 1–5% (w/v) eines Polyols umfassen. Ferner kann diese Zusammensetzung bis zu 20 mM Methionin, bis zu 0,1% Pluronic F68 (w/v) und gegebenenfalls 7,5 μmol/l CaCl₂ umfassen. Insbesondere kann diese Zusammensetzung 10 μg bis 10000 μg Erythropoietinprotein pro ml, 100 mmol/l NaCl, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v) und 10 mmol/l Phosphat, pH 7,0, umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die obige Zusammensetzung, welche 10 μg bis 10000 μg Erythropoietinprotein pro ml, 10 bis 50 mmol/l Arginin, pH 6 bis pH 6,5, 10 bis 100 mmol/l Natriumsulfat umfasst. Außerdem kann diese Zusammensetzung bis zu 20 mM Methionin, bis zu 0,1% Pluronic F68 (w/v), gegebenenfalls bis zu 1 mmol/l CaCl₂ und gegebenenfalls 1–5% (w/v) eines Polyols umfassen. Insbesondere kann diese Zusammensetzung 10 μg bis 10000 μg Erythropoietinprotein pro ml, 40 mmol/l Arginin, pH 6,2, 30 mmol/l Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v) und gegebenenfalls 1 mmol/l CaCl₂ umfassen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, umfassend 10 bis 10000 μg pro ml Erythropoietin, bevorzugt 25 bis 2500 μg/ml Erythropoietin und

(a) 10 mM Natrium/Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,0 oder
(b) 10 mM Natriumphosphat, 120 mM Natriumsulfat, pH 6,2 oder
(c) 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), pH 6,2 oder
(d) 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v), pH 6,2 oder
(e) 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), pH 6,2 oder
(f) 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v), pH 6,2.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen eine Menge an Erythropoietinprotein von 50, 100, 400, 800 oder 2500 μg/ml. Die am meisten bevorzugten Zusammensetzungen umfassen jeweils 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v), pH 6,2 oder 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol (w/v), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (w/v), pH 6,2.
Ebenso sind Zusammensetzungen in Form eines sprühgetrockneten Pulvers offenbart.
Ferner ist eine Zusammensetzung offenbart, bei der es sich um ein Lyophilisat oder ein sprühgetrocknetes Pulver der Zusammensetzungen wie oben beschrieben handelt. Die Zusammensetzung kann rekonstituiert werden, um durch die Zugabe eines Lösungsmittels, z. B. Wasser, eine flüssige Lösung zu bilden oder sie kann direkt z. B. durch eine Inhalationsvorrichtung oder eine transdermale Applikationsvorrichtung angewendet werden.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung wie oben beschrieben, umfassend Mischen eines Erythropoietinproteins mit einer Lösung, die ein mehrfach negativ geladenes Anion und gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe, wie oben definiert, umfasst.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, für die Herstellung von Medikamenten, die zur Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen nützlich sind, die mit Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF) in Zusammenhang stehen, AIDS und/oder für die Behandlung von Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen. Dies schließt ein Verfahren für die Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen, die mit Anämie bei Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF) zusammenhängen, AIDS und Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen ein, welches den Schritt der Verabreichung einer wie oben definierten Zusammensetzung bei einem Patienten umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Vorrichtungen zur lokalen und systemischen andauernden Freisetzung, die eine wie oben definierte Zusammensetzung umfassen. Dabei könnte es sich um irgendeine Art von Implantat handeln, das eine kontrollierte Freisetzung von Erythropoietin bereitstellt, welches die oben beschriebene Zusammensetzung umfasst. Die oben beschriebene Zusammensetzung kann auch als eine vorgefüllte Spritze bereitgestellt werden oder in irgendeiner anderen Applikationsvorrichtung, wie beispielsweise einer nadelfreien Injektionsvorrichtung oder einer Inhalationsvorrichtung.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann als eine Dosierungseinheit zur injizierbaren oder intravenösen Verabreichung vorliegen. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in flüssiger Form gelagert werden und anschließend in Dosierungseinheitsformen zur intravenösen oder injizierbaren Verabreichung aufgeteilt werden. Daher kann die flüssige Zusammensetzung dieser Erfindung in so geringen Mengen wie 0,3 ml zur Verwendung als Einzeldosisform zur Verabreichung vorliegen. Andererseits kann das Volumen der beanspruchten Zusammensetzung so groß wie etwa 60 l sein, wenn es vor der Aufteilung in einer abgepackten Dosierungsform gelagert wird. Angesichts ihrer erhöhten Stabilität kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in großen Behältern gelagert werden, um so später in Verpackungsmittel eingebracht zu werden, die für die Verteilung an Ärzte, Patienten und Krankenhäuser geeignet sind.
Die injizierbare Lösung dieser Erfindung kann durch solche herkömmlichen Injektionsmittel, wie beispielsweise Spritzen, verabreicht werden, die im Allgemeinen die Verabreichung von 0,3 ml bis 20 ml dieser Zusammensetzung als eine Einzeldosierungseinheit erlauben. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung durch Injektion unter Verwendung von Ampullen verabreicht werden, die diese Zusammensetzung entweder als ein Lyophilisat oder als ein sprühgetrocknetes Pulver enthalten, welches dann vor der Injektion auf herkömmliche Weise rekonstituiert wird. Andererseits können die Zusammensetzungen aufgrund der Stabilität der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsformen, wie beispielsweise Phiolen verteilt werden, die von etwa 0,3 ml bis etwa 10 ml dieser Zusammensetzung enthalten. Außerdem können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen intravenös verabreicht werden unter Verwendung von Infusionsbeuteln. Diese Beutel enthalten von etwa 20 ml bis etwa 500 ml der Lösung, abhängig von dem Zeitraum, innerhalb dessen die Lösung einem Patienten verabreicht werden soll. Gemäß dieser Erfindung kann die erfindungsgemäße flüssige Lösung in Lagerungsbehältern gelagert werden, aus welchen sie weiter in kleine Dosierungsformverpackungen aufgetrennt werden können, zur Verteilung an Ärzte, Krankenhäuser und Patienten. Aufgrund der Stabilität der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können die Zusammensetzungen für lange Zeiträume vor der Verabreichung in solchen Lagerungsbehältern gelagert werden.
Die Herstellung von Erythropoietin als Bestandteil der oben beschriebenen Zusammensetzungen oder als Ausgangspunkt für die Herstellung von Erythropoietinderivaten, wie oben beschrieben, ist ausführlich beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,547,933 und 5,621,080 , in EP-B 0 148 605 , Huang, S. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708–2712, EP-B 0 205 564 , EP-B 0 209 539 und EP-B 0 411 678 sowie in Lei, P. H. et al. J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116–3121 und Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059–12076 beschrieben. Erythropoietin für therapeutische Verwendungen kann auf rekombinante Weise hergestellt werden ( EP-B 0 148 605 , EP-B 0 209 539 und Ecri, J. C., Strickland, T. W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213–224).
Verfahren für die Expression und Herstellung von Erythropoietin in serumfreiem Medium sind beispielsweise in der am 14. November 1996 veröffentlichten WO 96/35718 von Burg, und der am 12. Juni 1992 veröffentlichten europäischen Patentveröffentlichung Nr. 513 738 von Koch beschrieben. Zusätzlich zu den oben erwähnten Veröffentlichungen ist bekannt, dass eine serumfreie Fermentierung von rekombinanten CHO-Zellen, die ein EPO-Gen enthalten, durchgeführt werden kann. Solche Verfahren sind z. B. in EP-A 0 513 738 , EP-A 0 267 678 beschrieben und in allgemeiner Form von Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445–453, EP-A 0 248 656 , Kovar, J. und Franec, F. Methods in Enzymology 421 (1986) 277–292, Bavista, B., Exp. cology 271 (1981) 45–51, EP-A 0 481 791 , EP-A 0 307 247 , EP-A 0 343 635 , WO 88/00967 .
In EP-A-0 267 678 werden eine Ionenaustauschchromatographie an S-Sepharose, eine präparative Revers-Phasen HPLC an einer C₈-Säule und eine Gelfiltrationschromatographie zur Reinigung von EPO beschrieben, das nach Dialyse in serumfreier Kultur produziert wurde. In diesem Zusammenhang kann der Gelfiltrationschromatographie-Schritt durch Ionenaustauschchromatographie an S-Sepharose fast flow ersetzt werden. Es wird außerdem vorgeschlagen, dass vor der Ionenaustauschchromatographie eine Farbchromatographie an einer Blue Trisacryl-Säule durchgeführt werden kann.
Ein Verfahren für die Reinigung von rekombinantem EPO wird von Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352–359 beschrieben. In diesem Verfahren wird EPO jedoch vor den Reinigungsschritten mit einer Lösung von Tween^®20, Phenylmethylsulfonylfluorid, Ethylmaleimid, Pepstatin A, Kupfersulfat und Oxaminsäure behandelt. Veröffentlichungen, einschließlich der am 14. November 1996 veröffentlichten WO 96/35718 von Burg, offenbaren ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin in einem serumfreien Fermentationsprozess (EPOsf).
Die spezifische Aktivität von EPO oder EPO-Konjugaten gemäß dieser Erfindung kann mit verschiedenen, im Stand der Technik bekannten Assays bestimmt werden. Die biologische Aktivität der gereinigten EPO-Proteine dieser Erfindung ist derart, dass eine Verabreichung des EPO-Proteins durch Injektion an humanen Patienten zu einer im Vergleich zu nicht injizierten oder Kontrollgruppen von Subjekten erhöhten Produktion von Reticulocyten und roten Blutkörperchen durch Knochenmarkszellen führt. Die biologische Aktivität der EPO-Proteine oder von deren Fragmenten, welche erfindungsgemäß erhalten und gereinigt wurden, kann mittels Verfahren gemäß Annable et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99–112 und Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) getestet werden. Ein weiterer biologischer Assay zur Bestimmung der Aktivität des EPO-Proteins, der normocytämische Mausassay, ist in Beispiel 6 beschrieben.
Die Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden Beispiele, welche die hierin beschriebene Erfindung veranschaulichen aber nicht begrenzen, besser verständlich.
BEISPIELE
Beispiel 1: Fermentation und Reinigung von humanem EPO
a) Inoculum Herstellung und Fermentation
Eine Phiole der Working Cell Bank, die von einer EPO produzierenden CHO-Zelllinie (ATCC CRL8695, offenbart in EP 411 678 (Genetics Institute) kann verwendet werden) stammt, wird aus dem Gasraum des Flüssigstickstoff-Lagerungstanks entnommen. Die Zellen werden in Glas-Spinner-Kolben transferiert und in einem befeuchteten CO₂-Inkubator in einem Hydrogencarbonat gepufferten Medium kultiviert. Typische serumfreie Medien, die für die Inoculum-Herstellung und Fermentation verwendet werden, sind in der am 12. Juni 1992 veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 513 738 von Koch, oder in der am 14. November 1996 veröffentlichten WO 96/35718 von Burg offenbart und enthalten beispielsweise als Medium DMEM/F12 (z. B. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, Bestellnummer 57–736) und zusätzlich Natriumhydrogencarbonat, L+Glutamin, D+Glucose, rekombinantes Insulin, Natriumselenit, Diaminobutan, Hydrocortison, Eisen(II)-Sulfat, Asparagin, Asparaginsäure, Serin und einen Stabilisator für Säugerzellen wie beispielsweise Polyvinylalkol, Methylzellulose, Polydextran, Poly(ethylenglycol), Pluronic F68, Plasmaexpander Polygelin (HEMACCEL^®) oder Polyvinylpyrrolidon ( WO 96/35718 ).
Die Kulturen werden mikroskopisch auf die Abwesenheit von kontaminierenden Mikroorganismen überprüft und die Zelldichten werden bestimmt. Diese Tests werden bei jedem Spaltungsschritt durchgeführt.
Nach dem anfänglichen Wachstumszeitraum wird die Zellkultur mit frischem Medium auf die Ausgangszelldichte verdünnt und durchläuft einen weiteren Wachstumszyklus. Diese Prozedur wird wiederholt, bis ein Kulturvolumen von etwa 2 l pro Glasspinnerkolben erhalten worden ist. Nach ungefähr 12 Verdopplungen sind 1 bis 5 Liter dieser Kultur verfügbar, welche dann als Inoculum für den 10 l-Inocolum-Fermentierer verwendet wird.
Nach 3–5 Tagen kann die Kultur in den 10 l-Fermentierer als Inocolum für den 100 l-Inocolum-Fermentierer verwendet werden.
Nach weiteren 3–5 Tagen Kultivierung kann die Kultur in dem 100 l-Fermentierer als Inocolum für den 1000 l-Produktionsfermentierer verwendet werden.
b) Ernten und Zelltrennung
Ein chargenweises Rückführungsverfahren wird eingesetzt, d. h. wenn die gewünschte Zelldichte erreicht ist werden ungefähr 80% der Kultur geerntet. Die verbleibende Kultur wird mit frischem Kulturmedium ergänzt und bis zur nächsten Ernte kultiviert. Ein Produktionsdurchgang besteht aus maximal 10 aufeinander folgenden Ernten: 9 teilweise Ernten und 1 Gesamternte am Ende der Fermentation. Das Ernten findet alle 3–4 Tage statt.
Das bestimmte Erntevolumen wird in ein gekühltes Gefäß überführt. Die Zellen werden durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und verworfen. Der EPO-haltige Überstand des Zentrifugationsschritts wird in-line filtriert und in einem zweiten gekühlten Gefäß gesammelt. Jede Ernte wird während der Reinigung separat verarbeitet.
Ein typisches Verfahren zur Reinigung von EPO-Protein ist in der am 14. November 1996 veröffentlichten WO 96/35718 von Burg offenbart. Das Reinigungsverfahren wird im Folgenden erläutert.
a) Blue Sepharose Chromatographie
Blue Sepharose (Pharmacia) besteht aus Sepharosebeads, an deren Oberfläche der Cibacron Blau-Farbstoff kovalent gebunden ist. Da EPO stärker an Blue Sepharose bindet als die meisten nicht proteinartigen Kontaminantien, einige proteinartigen Verunreinigungen und PVA, kann EPO in diesem Schritt angereichert werden. Die Elution der Blue Sepharose Säule wird durchgeführt, indem die Salzkonzentration sowie der pH-Wert erhöht wird.
Die Säule wird mit 80–100 l Blue Sepharose gefüllt, mit NaOH regeneriert und mit Ausgleichspuffer (Natrium-/Calciumchlorid und Natriumacetat) ausgeglichen. Der angesäuerte und filtrierte Fermentiererüberstand wird aufgetragen. Nach Beendigung des Auftragens wird die Säule zunächst mit einem dem Ausgleichspuffer ähnlichen Puffer, der eine höhere Natriumchloridkonzentration enthält und anschließend mit einem Tris-Basenpuffer gewaschen. Das Produkt wird mit einem Tris-Rasenpuffer eluiert und in einer einzelnen Fraktion gemäß dem Hauptelutionsprofil gesammelt.
b) Butyl Toyopearl Chromatographie
Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) ist eine Matrix auf Polystyrolbasis, an die aliphatische Butylreste kovalent gebunden sind. Da EPO stärker an dieses Gel bindet als die meisten Verunreinigungen und PVA, muss es mit einem Puffer, der Isopropanol enthält, eluiert werden.
Die Säule wird mit 30–40 l Butyl Toyopearl 650 C gepackt, mit NaOH regeneriert und mit einem Tris-Rasenpuffer gewaschen und mit einem Tris-Rasenpuffer, der Isopropanol enthält ausgeglichen.
Das Blue Sepharose Eluat wird auf die Isopropanolkonzentration in dem Säulenausgleichspuffer eingestellt und auf die Säule aufgetragen. Anschließend wird die Säule mit Ausgleichspuffer mit erhöhter Isopropanolkonzentration gewaschen. Das Produkt wird mit Elutionspuffer (Tris-Rasenpuffer mit hohem Isopropanolgehalt) eluiert und in einer einzelnen Fraktion gemäß dem Hauptelutionsprofil gesammelt.
c) Hydroxyapatit-Ultrogel-Chromatographie
Das Hydroxyapatit-Ultrogel (Biosepra) besteht aus Hydroxyapatit, der in einer Agarosematrix enthalten ist, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern. EPO weist eine geringe Affinität zu Hydroxyapatit auf und kann daher bei geringeren Phosphatkonzentrationen eluiert werden als Proteinverunreinigungen.
Die Säule wird mit 30–40 l Hydroxyapatit-Ultrogel gefüllt und mit einem Kaliumphosphat/Calciumchlorid-Puffer und NaOH und anschließend mit einem Tris-Basenpuffer regeneriert. Anschließend wird sie mit einem Tris-Rasenpuffer, der eine geringe Menge an Isopropanol und Natriumchlorid enthält, ausgeglichen.
Das EPO-haltige Eluat der Butyl-Toyopearl-Chromatographie wird auf die Säule geladen. Anschließend wird die Säule mit Ausgleichspuffer und einem Tris-Rasenpuffer ohne Isopropanol und Natriumchlorid gewaschen. Das Produkt wird mit einem Tris-Basenpuffer, der eine geringe Konzentration an Kaliumphosphat enthält, eluiert und in einer einzelnen Fraktion entsprechend dem Hauptelutionsprofil gesammelt.
d) Reverse-Phasen HPLC an Vydac C4
Das RP-HPLC-Material Vydac C4 (Vydac) besteht aus Silicagelpartikeln, deren Oberflächen C4-Alkylketten tragen. Die Abtrennung von EPO von den proteinartigen Verunreinigungen beruht auf den Unterschieden in der Stärke von hydrophoben Wechselwirkungen. Die Elution wird mit einem Acetonitrilgradienten in verdünnter Trifluoressigsäure durchgeführt.
Die präparative HPLC wird unter Verwendung einer Säule aus rostfreiem Stahl durchgeführt (gefüllt mit 2,8 bis 3,2 l an Vydac C4-Silicagel). Das Hydroxyapatit-Ultrogel-Eluat wird angesäuert, indem Trifluoressigsäure hinzugefügt wird, und es wird auf die Vydac C4-Säule geladen. Für das Waschen und die Elution wird ein Acetonitrilgradient in verdünnter Trifluoressigsäure verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und unmittelbar mit Phosphatpuffer neutralisiert. Die EPO-Fraktionen, die innerhalb der IPC-Grenzen liegen, werden gesammelt.
e) DEAE Sepharose Chromatographie
Das DEAE Sepharose(Pharmacia)-Material besteht aus Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen, die kovalent an die Oberfläche von Sepharosebeads gebunden sind. Die Bindung von EPO an die DEAE-Gruppen wird durch ionische Wechselwirkungen vermittelt. Acetonitril und Trifluoressigsäure gelangen durch die Säule ohne zurückgehalten zu werden. Nachdem diese Substanzen ausgewaschen worden sind, werden Spurenverunreinigungen entfernt, indem die Säule mit Acetatpuffer bei einem niedrigen pH-Wert gewaschen wird. Anschließend wird die Säule mit neutralem Phosphatpuffer gewaschen und EPO wird mit einem Puffer mit erhöhter Ionenstärke eluiert.
Die Säule wird mit DEAE-Sepharose fast flow gepackt. Das Säulenvolumen wird so angepasst, dass eine EPO-Beladung im Bereich von 3–10 mg EPO/ml Gel gewährleistet ist. Die Säule wird mit Wasser und Ausgleichspuffer (Natrium-/Kaliumphosphat) gewaschen. Die gesammelten Fraktionen des HPLC-Eluats werden aufgebracht und die Säule wird mit Ausgleichspuffer gewaschen. Anschließend wird die Säule mit Waschpuffer (Natriumacetatpuffer) gewaschen und anschließend mit Ausgleichspuffer gewaschen. Anschließend wird EPO mit Elutionspuffer (Natriumchlorid, Natrium-/Kaliumphosphat) von der Säule eluiert und in einer einzelnen Fraktion entsprechend dem Hauptelutionsprofil gesammelt.
Das Eluat der DEAE-Sepharose-Säule wird auf die bestimmte Leitfähigkeit eingestellt. Die resultierende Arzneimittelsubstanz wird steril in Teflongefäße filtriert und bei –70°C gelagert.
Beispiel 2: Pegylierung von EPO mit mPEG-SBA
EPO, welches entsprechend dem serumfreien Verfahren von Beispiel 1 (EPOsf) gereinigt wurde, war wie durch analytische Verfahren bestimmt wurde, homogen und zeigte das typische Isoformmuster, welches aus 8 Isoformen besteht. Es wies eine spezifische biologische Aktivität von 190000 IU/mg auf, wie durch den normocytämischen Mausassay bestimmt wurde. Das verwendete Pegylierungsreagenz war ein Methoxy-PEG-SBA, bei dem es sich um eine Verbindung der Formel II handelt, worin R Methyl ist; x 3 ist; und m von 650 bis 750 beträgt (durchschnittlich etwa 680, entsprechend einem durchschnittlichen Molekülgewicht von etwa 30 kDa).
Pegylierungsreaktion
Zu einhundert Milligramm EPOsf (9,71 ml einer 10,3 mg/ml EPOsf-Stammlösung, 5,48 μmol) wurden 10 ml eines 0,1 M Kaliumphosphatpuffers, pH 7,5, der 506 mg an 30 kDa Methoxy-PEG-SBA (16,5 μmol) (erhalten von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) enthielt zugefügt und für 2 h bei Raumtemperatur (20–23°C) gemischt. Die letztendliche Proteinkonzentration betrug 5 mg/ml und das Verhältnis Protein:PEG-Reagenz betrug 1:3. Nach zwei Stunden wurde die Reaktion angehalten, indem der pH-Wert mit Eisessig auf 4,5 eingestellt wurde und es wurde bei –20°C gelagert, bis es für die Reinigung bereit war.
Reinigung

1. Konjugatmischung: Etwa 28 mg an SP-SEPHAROSE FF (Sulfopropyl-Kationenaustauschharz) wurde in eine AMICON Glassäule (2,2 × 7,5 cm) gepackt und mit 20 mmol Acetatpuffer pH 4,5 bei einer Flussrate von 150 ml/h ausgeglichen. Sechs Milliliter der Reaktionsmischung, die 30 mg Protein enthielt, wurden mit dem Ausgleichspuffer 5fach verdünnt und auf die Säule gegeben. Nicht adsorbierte Materialien wurden mit dem Puffer ausgewaschen und die adsorbierte PEG-Konjugatmischung wurde mit 0,175 M NaCl in dem Ausgleichspuffer von der Säule eluiert. Nicht modifiziertes EPOsf, welches noch auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Die Säule wurde in dem Ausgangspuffer wieder ausgeglichen. Die Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und ihr Pegylierungsgrad wurde bestimmt. Es wurde gefunden, dass das 1,75 M NaCl-Eluat mono- ebenso wie di- und Spurenmengen der tripegylierten Spezies enthielt, während das 750 mM NaCl-Eluat nicht modifiziertes EPOsf enthielt.
2. Di-PEG und Mono-PEG-EPOsf: Die im vorherigen Schritt von der Säule eluierte gereinigte Konjugatmischung wurde mit dem Puffer 4fach verdünnt und erneut auf die Säule aufgetragen und wie beschrieben gewaschen. Di-PEG-EPOsf und Mono-PEG-EPOsf wurden mit 0,1 M NaCl bzw. 0,175 M NaCl getrennt von der Säule eluiert. Die Elution wurde mit 750 mM NaCl durchgeführt, um jegliches verbleibendes nicht-modifiziertes EPOsf zu eluieren.

Alternativ wurde die Reaktionsmischung mit dem Acetatpuffer 5fach verdünnt und auf die SP-Sepharose-Säule aufgetragen (~0,5 mg Protein/ml Gel). Die Säule wurde gewaschen und adsorbiertes Mono-PEG-EPOsf, Di-PEG-EPOsf und nicht-modifiziertes EPOsf wurden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, eluiert.
Ergebnisse
PEG-EPOsf wurde synthetisiert, indem ein lineares PEG-Molekül mit einem Anzahlmittleren Molekulargewicht von 30 kDa konjugiert wurde. PEG-EPOsf wurde aus der Reaktion zwischen den primären Aminogruppen von EPOsf und dem Succinimidylester-Derivat einer 30 kDa PEG-Butansäure gewonnen, was zu einer Amidbindung führte.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die gereinigte Konjugatmischung umfasste mono- und di-PEG-EPOsf und war frei von nicht-modifiziertem EPOsf, wie durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt wurde. Die Konjugatmischung entsprach 23,4 mg oder 78% des Ausgangsmaterials. Eine Kationenaustauschchromatographische Trennung von mono- und di-PEG-EPOsf zeigte, dass das Verhältnis von mono- zu di-PEG in der Konjugatmischung etwa 1:1 betrug. Nach der Beendigung der Reaktion betrug das Verhältnis der einzelnen Komponenten von mono-:di-:nicht-modifiziert 40:38:20 (%). Die Gesamtausbeute war nahezu quantitativ. Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse der EPOsf-Pegylierung

Probe Protein (mg) Ausbeute (%)

Reaktionsmischung 30 100

Mono- 12,0 40

Di- 11,4 38

Nicht-modifiziert 6,0 20

Konjugatmischung 23,4 78
Beispiel 3: Pegylierung von EPO mit mPEG-SPA
Ein anderes Aliquot des in Beispiel 2 verwendeten EPOsf wurde mit 30 kDa Methoxy-PEG-SPA umgesetzt (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama). Die Reaktion wurde mit einem Verhältnis von Protein:Reagenz von 1:2 durchgeführt und die Reinigungsverfahren entsprachen denen von Beispiel 2. Es wurde vorrangig die monopegylierte Spezies hergestellt.
Beispiel 4: Kovalentes Verknüpfen von Thiolgruppen an EPO
Dieses Beispiel offenbart die Bestimmung der Reaktionsbedingungen für das kovalente Verknüpfen von Thiolgruppen an EPO. Um die Bedingungen zu bestimmen, wurden unterschiedliche Mengen eines Reagenzes, welches eine blockierte Thiolgruppe, hier SATA oder SATP (gelöst in DMSO mit 10 mg/ml) enthielt, zu der EPO-Lösung hinzugefügt, hier zu 1 ml an 5 mg/ml EPO in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,3. Die Reaktion wurde für etwa 30 Minuten gerührt (25°C) und durch die Zugabe von 1 M Lysinlösung mit 10 mM angehalten. Überschüssige Mengen an SATA und SATP wurden durch Dialyse gegen 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl und 2 mM EDTA, pH 6,2, entfernt. Nach der Entfernung der Acetylschutzgruppe mit Hydroxylamin wurde die Anzahl an Thiolgruppen, die kovalent an EPO geknüpft waren, photometrisch mit Dithiodipyridin gemäß dem von Grasetti, D. R. und Murray, J. F. in J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, Seite 41–49 (1967) beschriebenen Verfahren bestimmt.
Die Anzahl an kovalent verknüpften Thiolgruppen pro EPO-Molekül ist nachfolgend gezeigt.

Molares Verhältnis EPO:SATA oder SATP Mol Thiolgruppen/mol EPO

EPO:SATA = 1:3 1,5

EPO:SATA = 1:5 2,4

EPO:SATA = 1:6 3,2

EPO:SATP = 1:5 1,3

EPO:SATP = 1:4 2,5

EPO:SATP = 1:6 3,7
Beispiel 5: Modifikation von aktiviertem EPO mit Methoxy-PEG-Maleimid
A) Aktivierung von EPO
100 mg EPO, hergestellt gemäß Beispiel 1 (190000 IU/mg, wie durch den normocytämischen Mausassay bestimmt), wurden gemäß Beispiel 2 mit SATA aktiviert (Molverhältnis: EPO/SATA = 1/5). Das resultierende EPO („aktiviertes EPO”), welches kovalent verknüpfte blockierte Thiolgruppen trägt, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch Dialyse von Nebenprodukten wie N-Hydroxy-succinimid oder nicht umgesetztem SATA abgetrennt. Eine Lösung von 4,5 mg/ml aktiviertem EPO in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2, wurde erhalten.
B) Pegylierung von aktiviertem EPO
380 mg Methoxy-PEG-Maleimid mit der „am meisten bevorzugten” oben veranschaulichten Struktur (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc. Huntsville (Alabama, USA)) wurde in der obigen Lösung, die 95 mg aktiviertes EPO enthielt (4,5 mg/ml in 10 mM Kaliumphosphat, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6,2) gelöst. Das resultierende Molverhältnis zwischen aktiviertem EPO und Methoxy-PEG-Maleimid in der Lösung betrug 1:4. Durch Zugabe von 1 M wässriger Hydroxylaminlösung mit 30 mM, pH 6,2, zu der obigen Lösung, wurden die Blockierungen der kovalent verknüpften blockierten Thiolgruppen des aktivierten EPO entfernt. Das resultierende aktivierte EPO in der Reaktionsmischung der Lösung enthielt freie Thiol(-SH)-Gruppen. Nach dem Entfernen der Blockierungen der Thiolgruppen folgte unmittelbar die Kopplungsreaktion zwischen dem aktivierten EPO, welches nun freie Thiol(-SH)-Gruppen enthielt und Methoxy-PEG-Maleimid für 90 Minuten (rühren, 25°C). Die Kopplungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,2 M wässriger Cysteinlösung bis 2 mM zu der Reaktionsmischung angehalten. Nach 30 Minuten wurden überschüssige freie Thiolgruppen des aktivierten EPO, die nicht mit Methoxy-PEG-Maleimid reagierten, durch Zugabe einer 0,5 M N-Methylmaleimid-Lösung in DMSO blockiert, um eine Konzentration von 5 mM zu erreichen. Nach 30 Minuten wurde die resultierende Reaktionsmischung, welche nun pegylierte EPO-Spezies enthielt, gegen 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, für ≥ 15 Stunden dialysiert.
C) Reinigung der pegylierten EPO-Spezies:
Für die Abtrennung der pegylierten EPO-Spezies aus der Reaktionsmischung wurde das folgende Reinigungsverfahren durchgeführt: Eine 50 ml Q-Sepharose ff-Säule wurde mit 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, ausgeglichen. Die in Schritt B) erhaltene Reaktionsmischung wurde auf die Säule aufgetragen (Flussrate: 3 Säulenvolumina (CV) pro Stunde). Um nicht umgesetztes Methoxy-PEG-Maleimid-Reagenz abzutrennen, wurde die Säule mit 5 CVs an 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, gewaschen. Pegylierte EPO-Spezies wurden durch Elution mit einem zunehmenden Salzgradienten, bestehend aus 5 CVs Puffer A (10 mM Kaliumphosphat, pH 7,5) und 5 CVs Puffer B (10 mM Kaliumphosphat, 500 mM NaCl, pH 7,5), mit einer Flussrate von 3 CV pro Stunde abgetrennt. Bezogen auf den NaCl-Gradienten wurden zuerst die pegylierten EPO-Spezies (tri-, di- und monopegylierte EPO-Spezies), anschließend die nicht pegylierten EPO-Spezies eluiert. Die Fraktion des Eluats, welche die pegylierten EPO-Spezies (tri-, di- und monopegylierte EPO-Spezies) enthielt, wurde zusammengefasst und filtriert (Sterilfiltration mit einem 0,2 um Filter).
Gehalt und Reinheit der tri-, di- und monopegylierten EPO-Spezies wurden auf Coomassie-angefärbten SDS-PAA-Gelen (Laemmli, Nature 227, 680–685 (1970)) bewertet, während Proteinkonzentrationen bei 280 nm gemäß dem Beer-Lambert-Gesetz gemessen wurden. Die scheinbaren Molekulargewichte der EPO-Spezies, die durch SDS-PAA-Elektrophorese bestimmt wurden, waren etwa 68 kDa (monopegylierte EPO-Spezies), etwa 98 kDa (dipegylierte EPO-Spezies) und etwa 128 kDa (tripegylierte EPO-Spezies).
Eine weitere Trennung der tri-, di- und monopegylierten EPO-Spezies kann durch Chromatographie, z. B. durch Größenausschlusschromatographie (Superdex, pg 200; Pharmacia) erreicht werden. Die Bestimmung der biologischen in vivo Aktivität des Eluats, welches tri-, di- und monopegylierte EPO-Spezies enthielt, wurde durch das unten beschriebene Verfahren durchgeführt.
Beispiel 6: In vivo Wirkung von pegyliertem EPO, bestimmt durch den normocytämischen Mausassay
Der normocytämische Mausbioassay ist im Fachbereich bekannt (Pharm. Europa Spec. Ausgabe Erythropoietin BRP Bio 1997 (2)) und ist ein Verfahren in der Monographie von Erythropoietin von Ph. Eur. BRP. Die Proben wurden mit BSA-PBS verdünnt. Normalen gesunden Mäusen im Alter von 7–15 Wochen wurden s. c. 0,2 ml der EPO-Fraktion, welche nicht pegyliertes EPO oder tri-, di- und monopegylierte EPO aus Beispiel 2 oder 3 enthielt, verabreicht. Über einen Zeitraum von 6 Tagen wurde Blut durch Punktierung der Schwanzvene entnommen und so verdünnt, dass 1 μl Blut in 1 ml einer 0,15 μmol Acridinorange-Anfärbelösung enthalten war. Die Anfärbezeit betrug 3 bis 10 Minuten. Das Zählen der Reticulocyten wurde mikrofluorometerisch in einem Flusscytometer durch Analyse des roten Fluoreszenzhistogramms durchgeführt.
Die Reticulocytenanzahlen wurden als absolute Werte angegeben (pro 30000 analysierte Blutzellen). Für die angegebenen Daten bestand jede Gruppe aus 5 Mäusen pro Tag, und den Mäusen wurde nur einmal Blut entnommen.

In separaten Versuchen wurde Mäusen eine einzelne Dosis an nicht modifiziertem EPO (25 ng EPO), die PEG(SBA)-EPO-Mischung aus Beispiel 2 (10 ng Konjugat), mono- und dipegylierte EPOs aus Beispiel 2 (10 ng Konjugat), das PEG(SPA)-EPO aus Beispiel 3 (10 ng Konjugat) und Pufferlösung verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen die überlegene Wirkung und die verlängerte Halbwertszeit der pegylierten EPO-Spezies, angezeigt durch die entscheidend erhöhten Mengen an Reticulocyten und die Verschiebung des Reticulocytenanzahl-Maximums bei Verwendung derselben Dosis pro Maus (10 ng) im Vergleich zu einer Dosis von 25 ng an nicht modifiziertem EPO. Tabelle 2

	EPO (nicht modifiziert)	30 kDa SPA PEG	Mono 30K SBA	Di 30K SBA	PEG-EPO SBA Konjugatmischung	Kontrollpuffer
72 h	1000	1393	1411	994	1328	857
96 h	500	1406	1501	926	1338	697
120 h	~200	1100	1182	791	944	701
144 h	~0	535	607	665	660	708

Beispiel 7: Herstellung von überwiegend mono-PEG-EPO
Pegylierungsreaktion
Ausgehend von 100 mg (5,48 μmol) EPOsf in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden 329 mg (10,96 μmol) an 30 kDa PEG-SPA-Reagenz hinzugefügt, welches in 3 ml 1 mM HCl aufgelöst war. Es wurde ausreichend 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, zugegeben, um ein Reaktionsmischungsvolumen von 20 ml zu erhalten. Die letztendliche Proteinkonzentration betrug 5 mg/ml und das Verhältnis Protein:PEG-Reagenz war 1:2. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h bei Raumtemperatur (20–22°C) gemischt. Nach 2 h wurde die Reaktion durch Anpassen des pH-Werts auf 4,5 mit Eisessig angehalten und gefroren bei –20°C gelagert, bis sie für die Reinigung bereit war.
Reinigung
Die Reaktionsmischung aus dem vorherigen Schritt wurde 1:5 mit 10 mM Natriumacetat, pH 4,5, verdünnt und auf 300 ml SP-Sepharose FF (Sulfopropyl-Kationenaustauschharz) aufgetragen, welches in eine 4,2 × 19 cm Säule gepackt war. Die Säule war zuvor mit demselben Puffer ausgeglichen worden. Die Säuleneluate wurden bei 280 nm mit einem Gilson UV-Monitor untersucht und mit einem Kipp und Zonen-Rekorder aufgezeichnet. Die Säule wurde mit 300 ml oder 1 Bettvolumen an Ausgleichspuffer gewaschen, um überschüssige Reagenzien, Reaktionsnebenprodukte und oligomeres PEG-EPO zu entfernen. Daraufhin folgte ein Waschen mit 2 Bettvolumina an 100 mM NaCl, um die PEG-EPO zu entfernen. Anschließend wurde mono-PEG-EPO mit 200 mM NaCl eluiert. Während der Elution des mono-PEG-EPO wurden die ersten 50 ml des Proteinpeaks verworfen und das mono-PEG-EPO wurde als eine Fraktion von 150 ml gesammelt. Nicht modifiziertes EPOsf, welches auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Alle Elutionspuffer wurden in dem Ausgleichspuffer hergestellt. Alle eluierten Proben wurden durch SDS-PAGE und durch Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie (SEC) analysiert. Die gesammelte mono-PEG-EPO-Fraktion, welche aus der 150 ml Fraktion erhalten wurde, welche kein nachweisbares nicht modifiziertes EPOsf aufwies, wurde anschließend auf ungefähr 4,5–7,5 mg/ml konzentriert und in den Lagerungspuffer, 10 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,5, diafiltriert. Konzentrieren/Diafiltration wurde bei Umgebungstemperatur mit einem Millipore Labscale^TM TFF System durchgeführt, welches mit 50 kDa cut off Millipore Pellicon XL Biomax 50 Membran ausgestattet war. Das konzentrierte mono-PEG-EPO wurde steril filtriert und gefroren gelagert bei –20°C.
Ungefähr 75% des EPOsf waren pegyliert. Nach der Reinigung betrug die Gesamtausbeute ungefähr 30% mono-PEG-EPO ohne nachweisbares nicht modifiziertes EPOsf und etwa 25% di-PEG-EPO. Oligomere und nicht pegyliertes EPOsf trugen zu dem verbleibenden Protein bei. Die gesammelte mono-PEG-EPO-Fraktion, welche aus der 150 ml Fraktion erhalten wurde, enthielt etwa 90% mono-PEG-EPO und etwa 10% di-PEG-EPO.
Beispiel 8: Thermostabilität von EPO und pegyliertem EPO in verschiedenen Formulierungen: Analyse durch DSC (differenzielle Scanning-Kalorimetrie)
Es ist allgemein akzeptiert, dass die Übergangstemperatur der thermischen Denaturierung, welche durch differenzielle Scanning-Kalorimetrie gemessen wird, ein gültiger Indikator für die Thermostabilität von Proteinen ist. Erythropoietin oder pegylierte Erythropoietinlösungen mit Konzentrationen zwischen 0,6 und 1,2 mg/ml wurden in verschiedenen Puffern mit oder ohne Stabilisatoren mittels einer Nano-DSC (Calorimetric Sciences Corportion, Utah, USA) bei einer Erwärmungsrate von 2 K/min analysiert. Eine Erhöhung der Übergangstemperatur zeigt eine Erhöhung der thermischen Stabilität des Proteins. Die gemessenen Temperaturwerte sollten nicht als absolute Werte verstanden werden, sondern geben vielmehr Unterschiede in der Stabilität der einzelnen Formulierungen relativ zueinander wieder.
Um den optimalen pH-Wert der Formulierung zu definieren, wurde die pH-Abhängigkeit der thermischen Denaturierung von pegyliertem Erythropoietin im Bereich zwischen 4 und 9 untersucht. Die Proteinproben wurden in 30 mM Na₂HPO₄, 30 mM Natriumcitrat, 30 mM Borat analysiert. 1 zeigt ein Plateau der maximalen Übergangstemperatur zwischen etwa pH 6 bis etwa pH 9 und einen scharfen Abfall unterhalb von pH 5,5. Dies zeigt, dass der optimale pH-Wert für eine maximale thermische Stabilität oberhalb von pH 5,5 liegt (3).
Um die Auswirkung der Ionenstärke zu untersuchen, wurde die Abhängigkeit der thermischen Denaturierung von der Phosphatkonzentration bestimmt. 4 zeigt, dass die thermische Stabilität mit einer ansteigenden Ionenstärke der Formulierung ansteigt.
Der Einfluss der Puffersubstanz wurde ebenfalls durch DSC untersucht. Aus 5 ist ersichtlich, dass die am besten geeigneten Puffer oder Zusatzstoffe für eine hohe thermische Stabilität Sulfat, Citrat oder Phosphat sind. Glycin, welches als Puffer in gegenwärtig verfügbaren Formulierungen (siehe oben) verwendet wird, ist nicht sehr geeignet.
6 zeigt, dass Sulfat ebenfalls ein geeigneter Puffer/Zusatzstoff bei niedrigem pH-Wert (z. B. pH 6,2) ist, während Phosphat bei pH 6,2 im Vergleich zu pH 7,5 weniger geeignet ist. Dies zeigt, dass Sulfat die thermische Stabilität selbst bei niedrigem pH-Wert hoch hält. Dieser Befund ermöglicht eine Formulierung bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 6,5 ohne gravierende Verluste der thermischen Stabilität von Erythropoietin.
Beispiel 9: Aggregierung von EPO und PEG-EPO unter thermischer Belastung: Analyse durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese)
Um die Auswirkung von Wärmebelastung auf das Erythropoietinprotein zu untersuchen, wurden Proben in unterschiedlichen Formulierungen einer Wärmebelastung (20 min 80°C) ausgesetzt und durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden (mit DTT in dem Probenpuffer) und nicht reduzierenden (ohne DTT im Probenpuffer) Bedingungen analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion kovalenter Aggregatbildung. Wie oben ausgeführt, ist die Aggregatbildung einer der Hauptabbauwege von Proteinen und sollte daher in pharmazeutischen Formulierungen von Proteinen verhindert werden. Aggregate, welche in Abwesenheit von Reduktionsmittel (z. B. DTT) nachweisbar sind und in Anwesenheit von Reduktionsmittel nicht nachweisbar sind, werden sehr leicht durch falsche Disulfidverbrückung, eine Oxidationsreaktion unter Wärmebelastung, gebildet. 5 zeigt die pH-Wert Abhängigkeit der Aggregation unter Wärmebelastung. Dieses Experiment zeigt deutlich, dass die Bildung von Aggregaten bei einem pH-Wert von weniger als 6,5 unterdrückt wird. Je höher der pH-Wert ist, um so höher ist das Ausmaß an Aggregierung. Die meisten der gebildeten Aggregate können durch Behandlung der Proben mit einem Reduktionsmittel während SDS-PAGE reduziert werden, was nahelegt, dass ein großer Anteil der Aggregate, die unter Wärmebelastung gebildet werden, disulfidverbrückte Dimere, Oligomere und Aggregate höherer Ordnung darstellen. Zusammengefasst zeigt dies, dass die Bildung von Aggregaten zu einem großen Teil verhindert werden kann, indem der pH-Wert der Formulierung bei oder unterhalb von pH 6,5 gehalten wird.
7: Abhängigkeit der PEG-EPO-Aggregierung vom pH-Wert. PEG-EPO-Proben nach der Wärmebelastung (wie oben beschrieben) wurden durch SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden mit Silber angefärbt. Linie 1: Molekulargewichtsstandard. Linie 2: pH 5. Linie 3: pH 5, reduziert. Linie 4: pH 6. Linie 5: pH 6, reduziert. Linie 6: pH 6,5. Linie 7: pH 6,5, reduziert. Linie 8: pH 7. Linie 9: pH 7, reduziert. Linie 10: PEG-EPO, nicht belastet.
Die Bildung von Aggregaten kann ebenfalls durch die Verwendung von Antioxidantien verhindert werden. 8 zeigt, dass die Verwendung von 1 mg/ml Acetylcystein als Antioxidanz die Bildung von Aggregaten unter Wärmebelastung verhindert. Daher ist es nützlich, Antioxidantien, wie z. B. Acetylcystein, bei niedrigem pH-Wert, z. B. pH 6,2, zu verwenden, um die Aggregatbildung unter Wärmebelastung zu verhindern.
6: Die PEG-EPO-Aggregation kann durch pH 6,2 und/oder Acetylcystein verhindert werden. PEG-EPO-Proben nach Wärmebelastung (wie oben beschrieben) wurden durch SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden mit Silber angefärbt. Linie 1: PEG-EPO, nicht belastet. Linie 2: pH 7,5, belastet. Linie 3: pH 6,2, belastet. Linie 4: pH 6,2, belastet, reduziert. Linie 5: pH 7,5, 1 mg/ml Acetylcystein, belastet. Linie 6: pH 7,5, 1 mg/ml Acetylcystein, belastet, reduziert.
Beispiel 10: Stabilität von PEG-EPO in verschiedenen Formulierungen bei 4, 25, 30 und 40°C

Pegyliertes EPO in verschiedenen Formulierungen wird bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Zu angegebenen Zeitpunkten werden Proben entnommen und die Stabilität wird durch Reverse-Phasen Hochleistungschromatographie (rpHPLC), Hochleistungsgrößenausschlusschromatographie (SEC) und Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht. In Tabelle 3 wird die Stabilität von PEG-EPO in verschiedenen Formulierungen bei unterschiedlichen Temperaturen verglichen. Diese Daten zeigen deutlich die Überlegenheit der hierin enthaltenen Formulierungen im Hinblick auf Proteingewinnung und Aggregierung. Tabelle 3: Stabilität von PEG-EPO in verschiedenen Formulierungen bei unterschiedlichen Temperaturen:

		%Gewinnung nach 6 Monaten bei				Aggregierung bei 30°C nachweisbar (+/–)
Formulierung *	PegEPO (μg/ml)	4°C	25°C	30°C	40°C	Aggregierung bei 30°C nachweisbar (+/–)
A	10	92	91	n. b.	39	n. b.
B	50	97	98	97	78	–
C	50	95	79	79	52	+
E	50	103	102	100	87	–
A	100	96	97	n. b.	50	n. b.
B	400	101	101	101	77	–
C	400	100	94	90	56	+
D	400	98	96	93	73	–
E	400	99	98	100	66	–

* die Formulierungen sind:
Formulierung A: 10 mM Natriumphosphat, 100 mM Natriumchlorid, pH 7,5.
Formulierung B: 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2.
Formulierung C: 10 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,0.
Formulierung D: 10 mM Natriumphosphat, 120 mM Natriumsulfat, pH 6,2
Formulierung E: 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, 1 mM CaCl₂, pH 6,2.

Beispiel 11: Optimierte Formulierungen unterdrücken Oxidation von Methionin54 in EPO-Protein, Methionin als Antioxidanz

Pegyliertes EPO in verschiedenen Formulierungen wird bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Nach 6 Monaten werden Proben genommen und das Ausmaß der Methionin54-Oxidation wird wie folgt bestimmt. EPO-Proben werden mit der Endo-Proteinase LysC behandelt. Die resultierenden Peptide werden durch Reverse-Phasen Chromatographie getrennt. Das Verhältnis von oxidiertem Peptid T8 (welches oxidiertes Methionin54 enthält) zu Peptid T8 (welches nicht oxidiertes Methionin54 enthält) wird berechnet. Die Daten sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4: Ausmaß der Methionin54 Oxidation von EPO-Protein in verschiedenen Formulierungen nach 6 Monaten bei den angegebenen Temperaturen

		% oxidiertes Methionin54
Formulierung *	PegEPO (μ9/ml)	4°C	25°C	30°C	40°C
A	400	2,00	15,89	24,89	37,89
B	400	2,33	6,55	12,88	30,24
C	400	2,51	2,95	5,99	14,4
A	50	5,37	21,36	30,62	48,05
B	50	3,44	13,38	16,59	30,83
C	50	4,41	5,52	10,01	15,62

* die Formulierungen sind im Folgenden aufgelistet
Formulierung A: 10 mM Natriumphosphat, 100 mM Natriumchlorid, pH 7,0.
Formulierung B: 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2.
Formulierung C: 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, 1 mM Methionin, pH 6,2.

Diese Daten zeigen deutlich, dass die bevorzugte Formulierung der vorliegenden Erfindung (10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2) anderen Formulierungen, wie 10 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,0, überlegen ist, was das Ausmaß der Methionin54 Oxidation angeht. Die Zugabe von 1 oder 10 mM Methionin in die Formulierung unterdrückt die Oxidation von Methionin54 deutlich. Daher wirkt Methionin als ein Antioxidanz und stabilisiert EPO.
Beispiel 12: Sialinsäuregehalt von peg-EPO-Proben in verschiedenen Formulierungen
Um die Integrität der Kohlenhydratstruktur des peg-EPO-Glycoproteins zu analysieren, wird der Sialinsäuregehalt von peg-EPO-Proben in optimierten Formulierungen nach einer sechsmonatigen Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen durch Standardverfahren analysiert. Diese Daten zeigen, dass die Integrität der Kohlenhydratstruktur durch Lagerung des Proteins in den hierin beschriebenen neuen Formulierungen nicht negativ beeinflusst wird (9).
Beispiel 13: Bioaktivität von pegyliertem EPO nach Lagerung bei erhöhter Temperatur für längere Zeiträume
Um zu beweisen, dass die Lagerung von peg-EPO in 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2 die Bioaktivität in vivo nicht negativ beeinflusst, wurde ein Standard-Maus-EPO-Assay durchgeführt (siehe Beispiel 6). Peg-EPO-Proben, welche für 6 Monate in 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2 bei den angegebenen Temperaturen gelagert wurden, zeigten nach der Lagerung bei 4, 25 und 30°C keinen Verlust an in vivo Aktivität im Vergleich zu frischem Referenzstandard (10).
Beispiel 14: Aggregatgehalt von peg-EPO nach Lagerung bei erhöhter Temperatur für 6 Monate
Um den Aggregatgehalt in peg-EPO-Proben nach Lagerung bei erhöhter Temperatur in 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% (w/v) Mannitol, pH 6,2 zu analysieren, wurden nach 6 Monaten Proben genommen und durch Größenausschlusschromatographie analysiert.
Keine Aggregate waren nachweisbar bei 4, 25 und 30°C, was die Stabilität von pegyliertem EPO in den oben genannten Formulierungen beweist. 11 zeigt eine Überlagerung der Größenausschlusschromatogramme. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Flüssige pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein pegyliertes menschliches Erythropoietin-Protein, ein mehrfach geladenes anorganisches Anion in einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer, welcher geeignet ist, den Lösungs-pH im Bereich von 5,5 bis 7,0 zu halten, und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe, wobei die flüssige Zusammensetzung bei Raumtemperatur stabil ist, wobei das Anion ein Sulfatanion ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, welche eine wässrige Lösung ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 2, welche eine isotonische Lösung ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, umfassend 10 bis 200 mmol/l Sulfat.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, wobei der pH 5,8 bis 6,7 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei der pH 6,0 bis 6,5 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei der pH etwa 6,2 ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, wobei der Puffer aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus einem Phosphat- oder einem Arginin/H₂SO₄/Na₂SO₄-Puffer besteht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei der Puffer ein 10 bis 50 mmol/l Phosphatpuffer ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 9, wobei die Zusammensetzung einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus pharmazeutisch akzeptablen Salzen, Verdünnern, Lösungsmitteln und Konservierungsmitteln besteht.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 10 und 11, wobei die pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffe aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Tonizitätsmitteln, Polyolen, Antioxidationsmitteln und nichtionischen Detergenzien besteht.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 10 bis 12, wobei der pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoff ein Polyol ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei das Polyol aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Mannitol, Sorbitol, Glycerin, Trehalose und Saccharose besteht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei das Polyol Mannitol ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 10 bis 15, welche ein Antioxidationsmittel umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei das Antioxidationsmittel Methionin ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 10 bis 17, welche bis zu 1 mmol/l CaCl₂ umfasst.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 12 bis 18, wobei das nichtionische Detergenz Polysorbat 80, Polysorbat 20 oder Pluronic F68 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, wobei das nichtionische Detergenz Pluronic F68 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei die Zusammensetzung bis zu 1% (Gew./Vol.) des nichtionischen Detergenzes umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Zusammensetzung bis zu 0,1% (Gew./Vol.) des nichtionischen Detergenzes umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Erythropoietin-Protein ein Konjugat ist, wobei das Konjugat ein menschliches Erythropoietin-Glycoprotein umfasst, wobei das Glycoprotein kovalent mit ”n” Poly-(Ethylenglykol)-Gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR verbunden ist, wobei das -CO von jeder Poly-(Ethylenglykol)-Gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet, wobei R Niederalkyl ist, x 2 oder 3 ist, m von etwa 450 bis etwa 900 ist, n von 1 bis 3 ist, und n und m so gewählt sind, dass das Molekulargewicht des Konjugats minus des Erythropoietin-Glycoproteins von 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 23 mit einem Erythropoietin-Protein der Formel: P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n wobei m, n, x und R wie oben sind und P der Rest des Glycoproteins ohne die n Aminogruppe(n) ist, welche Amidbindung(en) mit der (den) Poly-(Ethylenglykol)-Gruppe(n) bilden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 24, wobei in Formel (I) x 2 ist, m 650 bis 750 ist, n 1 ist und R Methyl ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Erythropoietin-Protein ein Konjugat ist, wobei das Konjugat ein menschliches Erythropoietin-Glycoprotein umfasst, wobei das Glycoprotein kovalent mit von eins bis drei Niederalkoxy-Poly-(Ethylenglykol)-Gruppen verbunden ist, wobei jede Poly-(Ethylenglykol)-Gruppe kovalent mit dem Glycoprotein über einen Linker der Formel -C(O)-X-S-Y- verbunden ist, wobei das C(O) des Linkers eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet, X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- ist, k 1 bis 10 ist, Y
ist, wobei das mittlere Molekulargewicht von jeder Poly-(Ethylenglykol)-Gruppe von etwa 20 Kilodalton bis etwa 40 Kilodalton ist und das Molekulargewicht des Konjugates von etwa 51 Kilodalton bis etwa 175 Kilodalton ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, wobei das Erythropoietin-Protein ein Konjugat der Formel:
ist, wobei n eine Ganzzahl von 1 bis 3 ist, m eine Ganzzahl von 450 bis 900 ist, R Niederalkyl ist, X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- ist und P der Rest des Erythropoietin-Glycoproteins ohne die Aminogruppe oder Gruppen ist, welche eine Amidbindung mit X bilden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 27, wobei das Erythropoietin-Protein ein Konjugat der Formel:
ist, wobei n eine Ganzzahl von 1 bis 3 ist, m eine Ganzzahl von 450 bis 900 ist, R Niederalkyl ist, X -(CH₂)_k- oder -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k- ist und P der Rest des Erythropoietin-Glycoproteins ohne die Aminogruppe oder Gruppen ist, welche eine Amidbindung mit X bilden.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 28, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 29, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml, 10–200 mmol/l Sulfat und 10 bis 50 mmol/l Phosphat pH 6,0 bis 6,5.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 30, umfassend bis zu 20 mM Methionin, 1–5% eines Polyols (Gew./Vol.), bis zu 0,1% Pluronic F68 (Gew./Vol.) und gegebenenfalls bis zu 1 mM CaCl₂.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 30 bis 31, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml, 40 mmol/l Sulfat, 10 mmol/l Phosphat, 3% Mannitol (Gew./Vol.), 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 (Gew./Vol.), pH 6,2.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 29, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml, 10 bis 100 mmol/l NaCl, 10 bis 50 mmol/l Phosphat pH 6,0 bis 7,0, gegebenenfalls 1–5% eines Polyols.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 33, umfassend bis zu 20 mM Methionin, bis zu 0,1% Pluronic F68 und gegebenenfalls 7,5 μmol/l CaCl₂.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 33 oder 34, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml, 100 mmol/l NaCl, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 und 10 mmol/l Phosphat, pH 7,0.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 29, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml, 10 bis 50 mmol/l Arginin, pH 6 bis pH 6,5, 10 bis 100 mmol/l Natriumsulfat.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 36, umfassend bis zu 20 mM Methionin, bis zu 0,1% Pluronic F68, gegebenenfalls bis zu 1 mmol/l CaCl₂ und gegebenenfalls 1–5% eines Polyols.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 36 oder 37, umfassend 10 μg bis 10000 μg Erythropoietin-Protein pro ml, 40 mmol/l Arginin, pH 6,2, 30 mmol/l Natriumsulfat, 3% Mannitol, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68 und gegebenenfalls 1 mmol/l CaCl₂.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 29, umfassend 25 bis 2500 μg/ml Erythropoietin-Protein und a) 10 mM Natrium/Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,0, oder b) 10 mM Natriumphosphat, 120 mM Natriumsulfat, pH 6,2, oder c) 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, pH 6,2, oder d) 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68, pH 6,2, oder e) 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, pH 6,2, oder f) 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68, pH 6,2.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 39, wobei die Menge von Erythropoietin-Protein 50, 100, 400, 800 oder 2500 μg/ml ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 40, umfassend 10 mM Natriumphosphat, 40 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68, pH 6,2.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 40, umfassend 40 mM Arginin, 30 mM Natriumsulfat, 3% Mannitol, 10 mM Methionin, 0,01% Pluronic F68, pH 6,2.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 42, wobei das Erythropoietin-Protein die Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 aufweist.
Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 43, umfassend Mischen eines pegylierten menschlichen Erythropoietin-Proteins mit einer Lösung, welche ein mehrfach geladenes Anion umfasst und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe, und Einstellen des pHs auf 5,5 bis 7,0 unter Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Puffers, wobei das Anion ein Sulfatanion ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 43 zur Herstellung von Medikamenten geeignet zur Behandlung und Vorsorge von Krankheiten, welche mit Anämie in Patienten mit chronischem Nierenversagen (CRF), AIDS korreliert sind, und/oder zur Behandlung von Krebspatienten, welche eine Chemotherapie durchlaufen.
Vorrichtung zur lokalen und systemischen verzögerten Freisetzung, umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 43, welche aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einem Implantat, einer Spritze und einer Inhalationsvorrichtung.