DE60106727T2 - Verfahren und vorrichtung zur reinigung mit bakteriophagen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet von Bakteriophagen, Genauer ist sie gerichtet auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Reinigung mit Bakteriophagen.
  • 2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
  • Vancomycin-resistenter Enterococcus
  • Innerhalb der letzten zehn Jahre war das Auftreten von bakteriellen Pathogenen zu beobachten, die eine Resistenz gegenüber vielen, wenn nicht sogar allen antimikrobiellen Mitteln zeigen. Dies ist insbesondere in der institutionellen Umgebung relevant, in der sich nosokomiale Pathogene unter selektivem Druck wegen extensiven antimikrobiellen Gebrauchs befinden. Ein spezielles Problem in diesem Zusammenhang sind die Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE), die mit den Standardklassen von Antibiotika nicht behandelbar sind. Ungeachtet des kürzlich Auftretens von zwei Arzneimitteln, auf die VRE anfällig ist (Quinupristin/Dalfopristin und Linezolid [Plouffe JF, Emerging therapies for serious gram-positive bacterial infections: A focus on linezolid. Clin Infect dis 2000 Suppl 4: S 144–9]), bleiben diese Mikroorganismen ein wichtiger Grund für die Erkrankungen und die Sterblichkeit von immungeschwächten Patienten.
  • Enterokokken sind gram-positive fakultativ anaerobe Kokken, die sich in einer Vielzahl von Quellen in der Umgebung befinden, einschließlich Boden, Nahrung und Wasser. Sie sind des Weiteren eine übliche kolonisierende bakterielle Art im menschlichen Darmtrakt (d. h. der Darmtrakt dient als ein Reservoir für die Mikroorganismen). Obwohl die Taxonomie von Enterokokken noch nicht abgeschlossen ist, wird allgemein akzeptiert, das die Gattung aus 19 Arten besteht.
  • Antibiotische Behandlung von ernsten enterokokkischen Infektionen ist immer wegen der intrinsischen Resistenz des Organismus gegenüber den meisten antimikrobiellen Mitteln schwierig gewesen [Arden, R. C. and B. E. Murray, 1994, „Enterococcus: Antimicrobial resistence." In: Principles and Practice of Infectious Diseases Update, volume 2, number 4 (Februar 1994), New York: Churchill Livingstone, Inc. 15 pps; Lanman, D. und J. M. Quale, 1997, „Management of infections due to resistant enterococci: a review of therapeutic options" J. Antimicrob. Chemother., 40: 161–70; Moellering, R. C., 1998, „Vancomycin-resistente Enterococci." Clin. Infect. Dis. 26: 1196–9]. In den 1970er Jahren wurden enterokokkale Infektionen mit einer synergistischen Kombination eines Zellwand aktiven Mittels, solches wie Penecillin, und eines Aminoglykosids behandelt (Moellering, et al. (1971), „Synergy of penicillin and gentamicin against enterococci." J Infect. Dis., 124: S 207–9; Standiford, et al. (1970), „Antibiotic syngerism of enterococci: relation to inhibitory concentrations." Arch. Intern: Med., 126: 255–9). Wie auch immer, während der 1980er Jahre tauchen enterokokkale Arten mit einem hohen Grad an Aminoglykosid-Resistenz und Resistenz gegenüber Penecillin, die beide durch eine plasmid-kodierte β-Lactamase und durch einen Wechsel in dem Penecillin-bindenden Protein vermittelt wurden, (Mederski-Samoraj, et al. (1983), „High level resistance to gentamicin in clinical isolates of enterococci." J. Infect. Dis., 147: 751–7; Uttley, et al. (1988), „Vancomycin resistant enterococci." Lancet i: 57–8). 1988 wird das erste isolierte VRE identifiziert (Leclercq, et al. (1988), „Plasmid mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium." N Engl. J: Med., 319: 157–61). Solche Organismen, die wegen ihrer Resistenz gegenüber Vancomycin VRE genannt werden, sind auch gegenüber der Penecillin-Aminoglykosid-Kombination resistent. VRE beinhaltet Arten von einigen verschiedenen enterokokkalen Arten mit klinisch signifikanten VRE Infektionen hervorgerufen durch Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis.
  • Enterokokken können eine Vielzahl von Infektionen verursachen einschließlich Wundinfektionen, Endocarditis, Harntrakt-Infektionen Bacteremia. Nach Staphylococcus aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken sind Enterokokken die an häufigsten vorkommende Ursache von nosokomialer Bacteremia. Unter den immungeschwächten Patienten geht häufig eine Darmbesiedelung mit VRE voraus und fungiert als ein Risikofaktor für nachfolgende VRE-Bacteremia (Edmond, et al. (1995) „Vancomycin resistant Enterococcus faecium bacteremia: Risk factors for infenction." Clin. Inf. Dis., 20: 1126–33; Tornieporth, N. G., R. B. Roberts, J. John, A. Hafner, and L. W. Riley, 1996, "Risk factors associated with vancomycin-resistant Enterococcus faecium infection or colonization in 145 matched case patients and control patients." Clin. Infect. dis., 23: 767–72]. Durch die Verwendung von Puls-Feld-Gele-Elektrophorese als molekulares Schreibgerät konnten Untersuchende an der Universität von Maryland in Baltimore und am Baltimore VA Medical Center VRE-Arten nachweisen, die Bacteremia bei Krebs-Patienten verursachen und die fast immer identisch mit denen sind, die den Magen-Darm-Trakt der Patienten besiedeln (Roughmann MC, Qaiyumi S, Johnson JA, Schwalbe R, Morris JG (1997), „Recurrent vancomycin-resistant Enterococcus faecium bacteremia in a leukemia patient who was persistently colonized with vancomycin-resistanterterococci for two years." Clin Infect Dis 24: 514–5). Das Risiko, VRE zu bekommen, wächst signifikant für dem Fall, das eine hohe Rate an VRE-Kolonisierung unter den Patienten einer Krankenhaus-Station oder -Einheit vorhanden ist (d. h. wenn ein hoher „Kolonisierungsdruck" vorhanden ist). In einer Studie in den Niederlanden war unter den Patienten einer Intensiv-Stationseinheit der Kolonisierungsdruck die wichtigste Variable bei dem Erwerb von VRE (Bonten MJ, et al, „The role of „colonization pressure" in the spread of vancomycin-resistant enterococci: an important infection control variable." Arch intern Med 1998; 25: 1127–32). Bei individuellen Patienten konnte klar gezeigt werden, dass die Verwendung von Antibiotika die Dichte oder den Grad der Kolonisierung vergrößert (Donskey CJ et al, „Effects of antibiotic therapy on the density of vancomycin-resistant enterococci ini the stool of colonized patients." N Engl J Med 2000; 343: 1925–32); dieses würde wiederum nach sich ziehen, dass das Risiko von nachfolgenden Infektionen und das Risiko der Übertragung auf den Organismus von anderen Patienten wächst.
  • Mehrfach-Medikamenten resistente Staphylococcus aureus (Multi-Drug resistant Staphylococcus aureus – MDRSA)
  • S. areus ist verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheiten, die von leichten Haut-Infektionen bis zu lebensbedrohenden systemischen Infektionen einschließlich Endocarditis und Sepsis reichen [Lowy, F. D., 1998, „Staphylococcus aureus infections." N. Engl. J. Med., 8: 520–532]. Er ist eine übliche Ursache von in Gesellschaft und nosokomial erlangter Septicemia [z. B. stehen von ungefähr 2 Millionen jährlich in den vereinigten Staaten nosokomial erlangten Infektionen ungefähr 260.000 im Zusammenhang mit S. aureus (Emori, T. G., and R. P. Gaynes, 1993, „An overview of nosocomial infections, including the role of the microbiology laboratory," Clin. Microbiol. Rev., 4: 428–442)]. Ferner sind ungefähr 20% der menschlichen Bevölkerung ständig mit S. aureus kolonisiert und bis zu 50% der Bevölkerung ist zwischenzeitlich kolonisiert, wobei Patienten mit Diabetis, intravenöse Medikamenten-Benutzer, Dialyse-Patienten und Patienten mit AIDS die höchsten Raten an S. aureus Kolonisierung aufweisen [Tenover, F. C., and R. P. Gaynes, 2000, „The epidemiology of Staphylococcus infections," p. 414–421, In: V. A. Fischetti, R. P. Novick, J. J. Ferretti, D. A. Portnoy, and J. I. Rood (ed), Gram-positive pathogens, American Society for Microbiology, Washington, D. C.]. Der Organismus ist verantwortlich für ungefähr die Hälfte aller Infektionen der Haut und des damit zusammenhängenden Gewebes einschließlich Folliculitis, Cellulitis, Furuncules und Pyomyositis und ist eine der häufigsten Ursachen für surgikalen Nebeninfektionen. Die Sterblichkeitsrate für S. aureus Septicemia reicht von 11 bis 48% [Mortara, L. A., and A. S. Bayer, 1993, „Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. New diagnostic and therapeutic concepts." Infect. Dis. Clin. North. Am., 1: 53–68].
  • Methicillin war eines der ersten synthetischen Antibiotika, die für die Behandlung von Penicillin-resistenten Staphylokokken-Infektionen entwickelt wurden. Wie auch immer, die Häufigkeit von methicillin-resistenten S. aureus Arten oder „MRSA" (die auch resistent gegenüber Oxacillin und Nafcillin sind) hat in den Vereinigten Staaten und im Ausland drastisch zugenommen [Panlilio, A. L., D. H. Culver, R. P. Gaynes, S. Banerjee, T. S. Henderson, J. S. Tolson, and W. J. Martone, 1992, „Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in U.S. hospitals, 1975–1991." Infect. Control Hosp. Epidemiol., 10: 582–586]. Zum Beispiel waren gemäß dem nationalen nosokomialen Infektionskontrollsystem (National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) report, Datenzusammenfassung von Oktober 1986 bis April 1996, herausgegeben im Mai 1996, „A report from the National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System." Am. J. Infect. Control., 5: 380–388), annähernd 29% von 50.574 S. aureus nosokomialen Infektionen zwischen 1987 und 1997 resistent gegenüber β-lactam Antibiotika (z. B. Oxacillin, Nafcillin, Methicillin), und der Prozentsatz von MRSA-Arten unter den U.S.-Krankenhäusern erreichte gegen Ende der gleichen Periode annähernd 40%. An der Universität des Maryland Medical Centers sind jetzt mehr als 50% aller aus dem Blut isolierten S. aureus Methicillin-resistent.
  • In diesem Rahmen ist es ein großes Anliegen über das mögliche Auftreten von Methicillin-resistenten/mehrfach-Arzneimittel-resistenten S. aureus Arten, die Vancomycin-resistent sind – und die unbedingt unbehandelbar sein würden. Obwohl offenkundige Resistenz gegenüber Vancomycin in klinisch isoliertem bisher nicht dokumentiert wurde, gibt es einige Berichte über klinische Infektionen mit S. aureus Arten, die eine Zwischenresistenz gegenüber Vancomycin aufweisen (MICs = 8 μg/ml), die vorschlägt, dass unbehandelbare Staphylokokken-Infektionen nicht mehr weit entfernt sind [Tenover, F. C., and R. P. Gaynes. 2000]. Bei gegebener Virulenz von S. Aureus würde das Auftreten solcher unbehandelbaren Arten vernichtend sein und ein eine große Auswirkung auf die Art haben, wie Medizin in diesem Land praktiziert wird.
  • Staphylokokken-Arten einschließlich MDRSA sind übliche Kolonisierer der menschlichen Nase; in einer Öffentlichkeits-basierten Studie hatten 35% der Kinder und 28% ihrer Eltern nasalen Staphylokokken aureus Kolonisierung (Shopsin B, et al, „Prevalence of methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus in the community." J Infect Dis 2000; 182: 359–62). Personen, die nasal mit MDRSA kolonisiert sind, haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung ernster systemischer Infektionen mit diesen Mikroorganismen und insbesondere erhöht eine vorhergehende Infektion mit MDRSA das Risiko von nachfolgender Bacteremia mit MDRSA signifikant (Roughmann MC, „Predicting methicillin resistance and the effect of inadequate empiric therapy on survival in patients with Staphylococcus aureus bacteremia. Arch Intern Med 2000; 160: 1001–4). Wie bei VRE zu sehen erhöht die Rate der Kolonisierung von Personen mit MDRSA auf einer Einheit (der Kolonisierungsdruck) auch das Risiko des Erwerbs von MDRSA für andere Patienten auf dieser Einheit signifikant (Merrer J, et al, „Colonization pressure" and risk of acquisition of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a medical intensive care unit." Infect Control Hosp Epidemiol 2000; 21: 718–23).
  • Mehrfach-Medikamenten resistente Pseudomonas aeruginosa
  • Pseudomonas aeruginosa ist eine hoch virulent gram-negative Bakterienart, die verantwortlich ist für Bacteremia, Wundinfektionen, Pneumonia und Harnwegsinfektionen. Zunehmende Probleme mit mehrfach-antibiotischen Resistenzen gegenüber Pseudomonas wurden in Krankenhäusern registriert, mit besonderer Aufmerksamkeit auf Arten, die im allgemeinen als „Imipenem-resistente Pseudomonas" bezeichnet werden, die das letzte große antimikrobielle Mittel zum Ausdruck bringen, gegen das sie resistent geworden sind. Viele von diesen Arten sind resistent gegenüber allen großen Antibiotika-Klassen, was die substantiellen Schwierigkeiten bei der Behandlung von infizierten Patienten verdeutlicht.
  • Wie bei anderen gram-negativen Mikroorganismen gesehen tauchen Pseudomonas Arten oft als die erste Kolonisierungsflora des hinteren Pharynx während eines Krankenhausaufenthaltes auf. Arten, die im hinteren Pharynx vorhanden sind, werden abwechselnd wahrscheinlicher von den Lungen aspiriert und verursachen Pneumonia. In diesem Zusammenhang repräsentiert die Kolonisierung mit mehrfach-Medikamenten resistenten Pseudomonas einen potentiell ernsten Risikofaktor für die Entwicklung von mehrfach-Medikamenten resistenten Pseudomonas Pneumonia.
  • Bakteriophagen
  • Bakteriophagen wurde in diesem Jahrhundert für vieles therapeutisch verwendet. Bakteriophagen, die ihren Namen von dem griechischen Wort „phago" mit der Bedeutung „essen" oder „Bakterien Esser" ableiten, wurden unabhängig voneinander von Twort und von D'Herelle in der ersten Hälfte des zwanzigsten Jahrhunderts entdeckt. Früher Enthusiasmus führte zu ihrer Benutzung sowohl für die Prophylaxe wie auch für die Therapie von Krankheiten verursacht durch Bakterien. Wie auch immer, die Ergebnisse der frühen Studien, um Bakteriophagen als antimikrobielle Mittel zu evaluieren, standen variabel dem unkontrollierten Studium und der Unmöglichkeit Reagentien zu standardisieren zu. Später konnte aus gut konzipierten und kontrollierten Versuchen geschlossen werden, dass Bakteriophagen als antimikrobielle Mittel nicht brauchbar sind (Pyle, N. J. (1936), J. Bacteriol., 12: 245–61; Colvin, M. G. (1932), J. Infect Dis., 51: 17–29; Boyd et al. (1944), Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg., 37: 243–62).
  • Dieses anfängliche Scheitern der Phagen als antimikrobielle Mittel kann für das Scheitern verantwortlich sein, Phagen auszuwählen, die eine hohe in vitro lytische Aktivität, vor der in vivo Benutzung zeigten. Zum Beispiel wurden verwendete Phagen, die wenig oder keine Aktivität gegenüber tm Zielpathogen aufwiesen, gegen Bacterien eingesetzt, die resistent gegenüber Lysogenisation waren oder die Phagen selbst waren lysogenisch für das Ziel-Bakterium (Barrow, et al. (1997), „Bacteriophage therapy and prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of potential." Trends in Microbiology, 5: 268–71). Wie auch immer, mit dem besseren Verständnis der Phagen-Bakterium-Wechselwirkung und des bakteriellen Virulenz-Faktors wurde es möglich, Studien durchzuführen, die die in vivo anti-bakterielle Aktivität der Bakteriophagen zeigen (Asheshov, et al. (1937), Lancet, 1: 319–20; Ward, W. E. (1943), J. Infect. Dis., 72: 172–6; Lowbury, et al. (1953), J: Gen. Microbiol., 9: 524–35). Während der 1940er Jahre stellte Eli Lilly in den Vereinigten Staaten sechs Phagen-Produkte für den menschlichen Gebrauch kommerziell her einschließlich Zubereitungen, die gegen Staphylokokken, Streptokokken und andere Atempathogene gerichtet waren.
  • Mit dem Beginn der Antibiotika ging die therapeutische Verwendung der Phagen in den vereinigten Staaten und Westeuropa zurück und es wurde nur noch geringe nachfolgende Forschung durchgeführt. Wie auch immer, in den 1970er und 1980er Jahren gab es Berichte über Bakteriophagen-Therapien, die in Osteuropa weiter durchgeführt wurden, meistens in Polen und der früheren Sowjetunion.
  • Phagen-Therapie wurde in der früheren Sowjetunion und Osteuropa für über ein halbes Jahrhundert benutzt, wobei die Forschung und Produktion am Eliava Institut für Bakteriophagen in Tiblis konzentriert war, welches sich nun in der Republik von Georgien befindet. Die internationale Literatur enthält einige hundert Berichte über Phagen-Therapien, wobei der Großteil der Publikationen von Forschern aus der früheren Sowjetunion und osteuropäischen Ländern kommt. Um bloß einige Beispiele zu nennen, wurde darüber berichtet, dass Phagen effektiv sind bei der Behandlung von (i) Haut- und Blut-Infektionenverursacht durch Pseudomonas, Staphylokokken, Klebsiella, Proteus und E. coli [Cislo, M., M. Dabrowski, B. Weber-Dabrowska, and A. Woyton, 1987, „Bacteriophage treatment of suppurative skin infections," 35(2): 175–183; Slopek, S., I. Durlakowa, B. Weber-Dabrowska, A. Kucharewicz-Krukowska, M. Dabrowski, and R. Bisikiewicz, 1983, Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. I. General evaluation of the results," Archivum. Immunol. Therapiae Experimental, 31: 267–291; Slopek, S., B. Weber-Dabrowska, M. Dabrowski, and A. Kucharewicz-Krukowska, 1987, Results of bacteriophage treat ment of suppurative bacterial infections in the years 1981–1986,", 35: 569–83], (ii) staphylokokkale Lungen- und Pleuralinfektionen [Meladze, G. D., M. G. Mebuke, N. S. Chkhetia, N. I. Kiknadze, G. G. Koguashivili, I. L. Timoshuk, N. G. Larionova, and G. K. Vasadze, 1982, „The efficacy of Staphylococcal bacteriophage in treatment of purulent diseases of lungs and pleura," Grudnaya Khirurgia, 1: 53–56 (in Russian, summary in English)], (iii) P. aeruginosa Infektionen bei zystisch fibrosen Patienten [Shabalova, I. A., N. I. Karpanov, V. N. Krylov, T. O. Sharibjanova, and V. Z. Akhverdijan. „Pseudomonas aeruginosa bacteriophage in treatment of P. aeruginosa infection in cystic fibrosis patients," abstr. 443. In Proceedings of IX international cystic fibrosis congress, Dublin, Ireland], (iv) neonatale Sepsis (Pavlenishvili, I., and T. Tsertsvadze. 1985. „Bacteriophage therapy and enterosorbtion in treatment of sepsis of newbornes caused by gram-negative bacteria." In abstracts, p. 104, Prenatal and Neonathal Infections, Toronto, Canada], (v) surgikale Wundinfektionen (Peremitina, L. D., E. A. Berillo, and a. G. Khvoles, 1981, „Experience in the therapeutic use of bacteriophage preparations in supportive surgical infections." Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 9: 109–110 (in Russian)]. Verschiedene Reviews über die therapeutische Benutzung von Phagen wurden in den 1930er bis 40er Jahren veröffentlicht [Eaton, M. D., and S. Bayne-Jones, 1934, „Bacteriophage therapy: review of the principles and results of the use of bacteriophage in the treatment of infections," J. Am. Med. Assoc., p. 103; Krueger, A. P., and E. J. Scribner, 1941, „The bacteriophage: its nature and its therapeutic use," J. Am. Med. Assoc., p. 116] und kürzlich [Barrow, P. A., and J. S. Soothill, 1997, „Bacteriophage therapy and propylaxis – rediscovery and renewed assessment of potential," Trends in Microbiol., 5(7): 268–271; Lederberg, J., 1996, „Smaller fleas... ad infinitum: therapeutic bacteriophage," Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 93: 3167–3168]. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation in dem Journal of Infection (Alinsky, J., K. Iczkowski, A. Rapoport, and N. Troitsky, 1998, „Bacteriophages show promise as antimicrobial agents," J. Infect., 36: 5–15 fassen die Autoren Medline-Zitierungen (die zwischen 1966 und 1996 veröffentlicht wurden) über die therapeutische Verwendung von Phagen beim Menschen zusammen. Da gibt es 27 Publikationen aus Britannien, den U.S.A., Polen und der Sowjetunion und sie stellten fest, dass sich die insgesamt berichtete Erfolgsrate für Phagentherapie im Bereich von 80 bis 95% befand.
  • Es gibt einige britische Studien, die kontrollierte Tests von Bakteriophagen gegen spezifische Pathogene in experimentell infizierten Tiermodellen, solchen wie Mäusen und Meerschweinchen, durchführten (siehe z. B. Smith H. W., and M. B. Huggins „Successful treatment of experimental Escherichia coli infections in mice using phages: its general superiority over antibiotics" J. Gen. Microbiol., 128: 307–318 (1982); Smith, H. W., and M. B. Huggins „The control of experimental E. coli diarrhea in calves by means of bacteriophage". J. Gen. Microbiol., 133: 1111–1126 (1987); Smith, H. W., R. B. Huggins and K. M. Shaw „factors influencing the survival and multiplication of bacteriophages in calves and in their environment" J. Gen. Microbiol., 133: 1127–1135 (1987)). Diese Tests maßen objektive Kriterien, solche wie die Überlebensraten. Eine Wirksamkeit gegen Staphylokokken, Pseudomonas und Acinetobacter Infektionen wurde beobachtet. Diese Studien werden unten genauer beschrieben.
  • Eine U.S. Studie konzentriert sich auf die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Phagen in lebenden Tieren (Merril, C. R., B. Biswas, R. Carlton, N. C. Jensen, G. J. Greed, S. Zullo, S. Adhya „Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents" Proc. Natl. Acad Sci. USA, 93: 3188–3192 (1996)). Berichte aus den U.S., die sich mit der Bakteriophagen Verabreichung für diagnostische Zwecke beschäftigen, zeigen Phagen, die vorsichtig an Menschen verabreicht wurden, um die menschliche Immunantwort bei Adenosin-Deaminase-Mangelpatienten zu beobachten (Ochs, et al. (1992), „Antibody responses to bacteriophage phi X174 in patients with adenosine deaminase deficiency." Blood, 80: 1163–71), und zur Analyse der Wichtigkeit von Zell-verbundenen Molekülen bei der Immunantwort bei Menschen (Ochs et al. (1993), „Regulation of antibody responses: the role of complement acrd adhesion molecules." Clin. Immunol. Immunophatol., 67: S 33–40).
  • Ferner beschreiben polnische, georgische und russische Publikationen Experimente, bei denen Phagen systemisch, topisch oder oral verabreicht wurden, um ein weites Spektrum von antimikrobiell resistenten Pathogenen zu behandeln (siehe z. B. Shabalova, I. A., N. I. Karpanov, V. N. Krylov, T. O. Sharibjanova, and V. Z. Akhverdijan. Pseudomonas aeruginosa bacteriophage in treatment of P. aeruginosa infection in cystic fibrosis patients," Abstr. 443. In Proceedings of IX International Cystic Fibrosis Congress, Dublin, Ireland; Slopek, S., I. Durlakowa, B. Weber-Dabrowska, A. Kucharewicz-Krukowska, M. Dabrowski, and R. Bisikiewicz. 1983. „Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections. I. General evaluation of the results." Archivum. Immunol. Therapiae Experimental, 31: 267–291; Slopek S., B. Weber Dabrowska, M. Dabrowski, and A. Kucharewicz-Krukowska. 1987. „Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections in the years 1981–1986", Archivum Immunol. Therapiae Experimental, 35: 569–83).
  • Infektionen, die mit Bakteriophagen behandelt wurden, schließen ein Osteomyelitis, Sepsis, Empyema, Gastroenteritis, suppurative Wundinfektion, Pneumonia und Dermatitis. Pathogene, die beteiligt sind, schließen ein Staphylokokken, Streptokokken, Klebsiella, Shigela, Salmonella, Pseudomonas, Proteus und Escherichia. Diese Artikel berichten über einen Bereich der Erfolgsrate für eine Phagentherapie zwischen 80 und 95% mit nur seltener reversibler Allergie oder Magen-Darm-Nebenbeschwerden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Bakteriophagen eine brauchbare Ergänzung im Kampf gegen bakterielle Krankheiten sein können. Wie auch immer, diese Literatur beschreibt nicht, sieht in keiner Weise vor oder schlägt andererseits vor, Bakteriophagen zur Modifizierung der Zusammensetzung von kolonisierender Bakterienflora bei Menschen zu verwenden, um dadurch das Risiko der nachfolgenden Entwicklung von aktiven Infektionen zu reduzieren.
  • Salmonellen bei Menschen
  • Salmonellen sind die führende Ursache von Nahrungsmittel verursachten Krankheiten in den Vereinigten Staaten. 1993 schätzte die USDA, das es zwischen 700.000 und 3,8 Millionen Salmonellen-Fällen in diesem Land gab, mit den damit verbundenen medizinischen Kosten und dem Produktivitätsausfall von zwischen 600 Millionen und 3,5 Milliarden Dollar. Siehe Food Safety and Inspection Service, 1995; 9 CFR Part 308; Pathogen Reduction; Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP) Systems; Proposed Rule 60 Fed. Reg. 6774–6889; FoodNet, nicht veröffentlichte Daten. Exakter geschätzt wurde das Auftreten von CDC's FoodNet System, basierend auf der aktiven Überwachung von Daten von sieben Wachposten-Seiten, mit den neuesten Daten, die vorschlagen, dass es 1,4 Millionen Fälle jährlich sind. Siehe Mead, P. S., L. Slutsker, V. Dietz, L. F. McCraig, J. S. Brensee, C. Shapiro, P. M. Griffin, and R. V. Tauxe „Food-related illness and death in the United States" Emerg. Infect. Dis. 5: 607–625 (1999). Während es so aussieht, dass alle Salmonellen in der Lage sind, Krankheiten zu verursachen, sind S. typhimurium und S. enteritidis für 22,6% beziehungsweise 22% aller menschlichen Fälle in den Vereinigten Staaten zwischen 1991 und 1995 verantwortlich. Siehe Centers for Disease Control and Prevention „Salmonella Surveillance, Annual Summary" 1991, 1992, 1993–1995.
  • S. typhimurium hat eine besondere Bedeutung bekommen, wegen des kürzlichen Bekanntwerdens von einer hoch antibiotisch resistenten Art (resistent gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamide und Tetracycline), die als definitive type 104 (DT104) bezeichnet wurde. 1979–80 wurde dieses Resistenzmuster bei 0,6% der isolierten S. typhimurium beobachtet; 1996 hatten 34% aller U.S. isolierten, die durch öffentliche Gesundheitslabors untersucht wurden, dieses Muster, wobei das weitere Testen zeigt, dass fast 90% von diesen resistenten isolierten DT104 waren. Siehe Glynn, M. K., C. Bopp, W. DeWitt, P. Dabney, M. Mokhtar, and F. J. Angulo „Emergence of multidrug-resistant Salmonella enterica serotype typhimurium DT104 infections in the United States" N. Eng. J. Med. 19: 1333–8 (1988). Jüngste Daten schlagen auch vor, das Dt-104 anfängt, eine Resistenz gegenüber Trimethoprim und Quinolones zu entwickeln. Siehe Wall, P. G., D. Morgan, K. Lamden, M. Ryan, M. Griffin, E. J. Threlfall, L. R. Ward, and B. Rowe „A case control study of infection with an epidemic strain of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 in England and Wales" Commun. Dis. Rep. CDR Rev. 4: R130–8135 (1994). Während Daten über die Pathogenität beschränkt sind, scheint DT104 verantwortlich zu sein für eine wachsende menschliche Zahl der Erkrankungen und Sterblichkeit verglichen mit anderen Salmonellen. Siehe Centers for Disease Control „Multidrug resistant Salmonella serotype typhimurium – United States, 1996" Morbid Mortal Weekly Rep. 46: 308–10 (1997).
  • Unter S. enteritidis Fälle hat sich die Aufmerksamkeit auf die Phagentypen 8 und 4 fokussiert. Der Phagentyp 8 ist verantwortlich für fast die Hälfte aller U.S. S. enteritidis Fälle. Siehe Hickman-Brenner, F. W., A. D. Stubbs, and J. J. Farmer, III „Phage typing of Salmonella enteritidis in the United States" J. Clin. Microbiol., 29: 2817–23 (1991); Morris, J. G., Jr., D. M. Dwyer, C. W. Hoge, A. D. Stubbs, D. Tilghman, C. Groves, E. Israel, and J. P. Libonati „Changing clonal patterns of Salmonella enteritidis in Maryland: An evaluation of strains isolated between 1985–90" J. Clin. Microbiol., 30: 1301–1303 (1992). Der Phagentyp 4 wird weniger häufig beobachtet, aber wird in Verbindung gebracht mit jüngeren großen Ausbrüchen; er hat eine klar wachsende Virulenz bei Hühnern und kann wiederum eine wachsende Virulenz beim Menschen haben. Siehe Humphrey T. J., Williams A., McAlpine K., Lever M. S., Guard-Petter J., and J. M. cox „Isolates of Salmonella enterica Enteritidis PT4 with enhanced heat and acid tolerance are more virulent in mice and more invasive in chickens" Epidemiol. Infect. 117: 79–88 (1996); Rampling, A., J. R. Anderson, R. Upson, E. Peters, L. R. Ward, and B. Rowe „Salmonella enteritidis phage type 4 infection of broiler chickens: a hazard to public health" Lancet, ii: 436–8 (1989).
  • Bei gesunden Erwachsenen verursachen Salmonellen im allgemeinen eine selbstbegrenzte diarrheale Erkrankung; wie auch immer, diese Individuen können asymptomatisch den Organismus in ihrem Darmtrakt für sechs Monate oder länger nach dem Auftreten von Symptomen (konvaleszente Haltung) tragen, wobei sie als eine Quelle für die fortgesetzte Übertragung des Organismus in die Gemeinschaft dienen. Die älteren, die sehr jungen und Personen, die immungeschwächt sind, haben ein Risiko für Salmonellen Bacteremia, die in vielen der 5% der infizierten „hoch Risiko" Patienten auftreten. Siehe Taylor, J. L., D. M. Dwyer, C. Groves, A. Bailowitz, D. Tilghman, V. Kim, A. Joseph, and J. G. Morris, Jr. „Simultaneous outbreak of Salmonella enteritidis and Salmonella schwarzengrund in a nursing home: association of S. enteritidis with bacetemia and hospitalization" J. Infect. Dis. 167: 781–2 (1993). Zwischen 1% und 3% der infizierten Personen können auch eine Reaktive Arthritis entwickeln, mit der Möglichkeit einer damit verbundenen lang-anhaltenden Erkrankung.
  • Antibiotische Therapie von diarrhealen Erkrankungen ist nicht effektiv und kann eigentlich den Darmtransport verlängern. Siehe Alavidzw, Z., and I. Okolow „Use of specific bacteriophages in prophylaxis of intrahospital infections caused by P. aeruignosa" In: Abst., All-Soviet Union conference „Modern biology at the service of public health," Kiev, Ukraine (1988). Bacteremia wird offensichtlich mit Antibiotika behandelt, obwohl das Auftreten von hochresistenten Arten, solchen wie DT104, angefangen hat, Probleme in der Patientenbehandlung zu erzeugen. Siehe Wail, P. G., D. Morgan, K. Lamden, M. Ryan, M. Griffin, E. J. Threlfall, L. R. Ward, and B. Rowe „A case control study of infection with an epidemic strain of multiresistant Salmonella Typhimurium DT 104 in England and Wales" Commun. Dis. Rep. CDR Rev. 4-R130–R135 (1994). Gegenwärtig gibt es kein effektives Mittel für die Beschränkung oder Ausrottung des Organismus im Darmtrakt. Siehe Seill, M. A., S. M. Opal, J. Heelan, R. Giusti, J. E. Cassidy, R. White, and K. H. Mayer „Failure of ciprofloxacin to eradicate convalescent fecal excretion after acute Salmonellosis: experience during an outbreak in health care workers" Ann. Intern. Med. 119: 195–9 (1991).
  • Salmonellen in Hühnern
  • Die USDA schätzte, das in 50–75% der menschlichen Salmonellen-Fälle die Mikroorganismen erworben wurden von Fleisch, Geflügel oder Eiern, wobei Geflügel als der Hauptübertragungsweg dient. Salmonellen sind Teil der normalen kolonisierten Darmflora bei vielen Tieren einschließlich der Hühner. Studien, die in den frühen 1990er Jahren durch die USDA durchgeführt wurden, zeigen, dass vor dem Verkauf 20–25% der Brathähnchen-Leichen und 18% der Truthahn-Leichen mit Salmonellen kontaminiert waren. Siehe Food Safety and Inspection Service (1995); 9 CFR Part 308; Pathogen Reduction; Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP) Systems; Proposed Rule; 60 Fed. Reg. 6774–6889.
  • Kontaminierung kann von Reißen des Darmtraktes während der Schlachtung resultieren. Wie auch immer, mit den aktuellen Schlachtungstechniken, resultiert das Entfernen der Eingeweide selten in einem Darmriss und einer Leichen-Kontaminierung – und wenn es doch auftritt wird die Leiche unmittelbar für die „Wiederaufbereitung" markiert. Die häufigere Quelle der Salmonellen ist die Haut der Tiere selbst, wobei die Feder-Follikel als Zufluchtsort für Bakterien dienen. Im Gegensatz zu Rindern werden Hühner „mit Haut" geschlachtet, so dass ante mortem Kontaminierung der Federn ein wichtiges Element wird in der Bestimmung, ob Salmonellen aus den Leichen isoliert werden können. Die engen Unterkünfte in Hühnerställen und das Stapeln der Hühnerkisten auf den Lastwagen auf dem Weg zu den Schlachtereien führt zu häufigen Kontaminierungen der Federn durch Fäkalien. Wenn Mitglieder einer Horde einen hohen Grad an Darmkolonisierung mit Salmonellen haben, gibt es vielfältige Möglichkeiten für die Kontaminierung der Federn und Federfollikel mit den Mikroorganismen und damit für eine Salmonellen-Kontaminierung des Endproduktes.
  • Übereinstimmend mit dem CDC FoodNet/Salmonellen Überwachungssystem waren die fünf häufigsten menschlichen Samonellen-Arten in den Vereinigten Staaten zwischen 1990 und 1995 S. typhimurium, S. enteritidis, S. heidelberg, S. newport und S. hadar. Ferner waren übereinstimmend mit den USDA/FSIS Daten die fünf häufigsten Salmonellen-Serotypen, die aus Brathähnchen während der gleichen Periode isoliert wurden, S. heidelberg, S. kentucky, S. hadar, S. typhimurium und S. thomson. Während die Anmelder nicht in Erwägung ziehen, dass dies eine erschöpfende Liste ist, bemerken die Anmelder, das dies übliche Salmonellen Isolate und Serotypen sind.
  • Die Rate der Salmonellen-Kontaminierung von Geflügel-Leichen war der Hauptfokus von der jüngsten eingeführten Revision der nationalen Regeln zur Nahrungsmittel-Sicherheit (Pathogene Reduzierung; Gefahr-Analyse und kritische Kontrollpunkt (HACCP[Hazard Analysis and Critical Control Point])-Systeme), die ein behördliches Testen auf Salmonellen in allen Schlachtereien anordnet. Die jetzt in Kraft befindlichen Regeln verlangen, dass das Produkt getestet wird, indem eine ganze Hühner-Leiche in einen „Baggie" mit Kulturmedium getan und geschüttelt wird; das Wachsen von irgendeiner Salmonellen-Form zählt als positiver Test. Anlagen müssen spezifische Standards für die Prozente an kontaminiertem Produkt erfüllen, basierend auf den nationalen Durchschnitten; das Scheitern des Treffens dieser Standards führt zur Schließung der Anlage. Siehe Food Safety Inspection Service (1996); 9 CFR Part 304, et seq.; Pathogen Reduction; Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP) Systems; Final Rule 61 Fed. Reg. 38806-989.
  • Die Anliegen von Salmonellen-Kontaminierungen wurden auch ein Hauptpunkt im internationalen Handel mit Russland und anderen Ländern, die Millionen von Dollarwerten einem Embargo unterworfen haben wegen der Identifikation von Salmonellen in dem Produkt.
  • In dieser Umgebung sind strenge öffentliche Gesundheit, Regeln und Handel Anreize für die Hersteller, den Grad der Salmonellen-Kontaminierung in Geflügel zu reduzieren. Bestrahlung des rohen Produktes (d. h. der Hühner-Leichen) ist erfolgreich, aber teuer und ist begrenzt durch die geringe Anzahl an Bestrahlungsmöglichkeiten und durch das Konsumenten-Zustimmung. Die Behandlung von Hühnern mit Antibiotika rottet die Kolonisierung nicht aus, sondern tendiert einfach dazu, die resistenteren Organismen heraus zu selektieren. Antibiotika (im Gegensatz zu Phagen) zeigen im allgemeinen eine Aktivität gegenüber vielen bakteriellen Arten; ihre Anwendung kann zu ernsten Störungen in der mikrobiellen Ökologie des tierischen Darmtraktes führen mit dem begleitenden Verlust der "Kolonisierungs-Resistenz" und dem Überwachstum von Mikroorganismen die resistent gegenüber dem verwendeten antimikrobiellen Mittel sind. Impfung ist ebenso uneffektive in der Eliminierung von Salmonellen. Siehe Hassan, J. O., and R. Curtiss, III „Efficacy of a live avriulent Salmonella typhimurium vaccine in preventing colonization and invasion of laying hens by Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis" Avian. Dis. 41: 783–91 (1997); Methner, U., P. A., Barrow, G. Martin, and H. Meyer „Comparative study of the protective effect against Salmonella colonization in newly hatched SPF chickens using live, attenuated Salmonella vaccine strains, wild-type Salmonella strains or a competitive exclusion product" Int. J. Food Macrobiol., 35: 223–230 (1997); Tan, S., C. L. Gyles, and B. N. Wilkie „Evaluation of an aroA mutant Salmonella typhimurium vaccine in chickens using modified semisolid Rappaport Vassiliadis medium to monitor fecal shedding" Vet. Microbiol., 54: 247–54 (1997).
  • Konkurrierender Ausschluss (d. h. die Verwendung von „guten" Bakterien, um Salmonellen und andere „schlechte" Bakterien „heraus zu drängen") hat einen unterschiedlichen Erfolg gezeigt. Siehe Palmu, L., I. Camelin „The use of competitive exclusion in broilers to reduce the level of Salmonella contamination on the farm and at the processing plant" Poultry Sci. 76: 1501–5 (1997). Es gibt jetzt einen kommerziell erhältlichen konkurrierendes Ausschluss-Produkt, PreEmpt (Produkt von MS Bioscience), das aus 27 verschiedenen Bakterienarten besteht. In ersten Tests scheint es bei der Begrenzung der Salmonellen-Kolonisierung effektiv zu sein, aber seine Verwendung wird durch die Kosten behindert. Am wichtigsten aber ist, dass seine Wirksamkeit signifikant abfällt, wenn Antibiotika bei den Tieren als Wachstumsadditive verwendet werden (ein Standard-Verfahren in der Geflügel-Industrie).
  • Bei Abwesenheit von allen anderen definitiven Mitteln für die Ausrottung des Organismus hat die USDA das Konzept von Salmonellen-Kontrolle durch einen „mehrfach Hürden"-Zugang artikuliert, die ermutigende Durchführung von Verfahren, um das Risiko einer Kontaminierung während der Schlachtung zu reduzieren, während es zur gleichen Zeit angestrebt wird die Kolonisierung/Kontaminierung von Brathähnchenhorden durch den Organismus zu begrenzen. Unter diesen Umständen gibt es einen klaren Markt für Produkte und, die als Teil eines Überalles-Programmes der Salmonellen-Kontrolle verwendet werden können. Jedes dieser Produkte sollte billig, sicher und einfach zu benutzen sein, da würden auch potentielle Vorteile für Produkte sein, die richtig sein könnten gegenüber spezifischen Pathogenen, solchen wie S. enteritidis PT4 und S. typhimurim DT104.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Übereinstimmend mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung unter Verwendung mindestens eines Bakteriophagen offenbart. Das Verfahren beinhaltet die Schritte (1) Lagerung von mindestens einem Bakteriophagen in einem Behälter und (2) Aufbringen des mindestens einen Bakteriophagen auf eine Oberfläche, die gereinigt werden soll, mit einem dispergierenden Mechanismus.
  • Der Behälter kann unter anderem sein ein Druckbehälter (z. B. ein Aerosolkanister), er kann eine Nebelvorrichtung sein, er kann eine Abzugssprühvorrichtung sein, oder er kann eine Pumpsprühvorrichtung sein. Das Bakteriophage kann auf die Fläche oder ein Objekt geschüttet, gepinselt, gewischt, gemalt oder überzogen werden. Das Bakteriophage kann von einem Übertragungsmedium, welches ein Tuch, ein Schwamm, eine Rolle, ein Papierprodukt, ein Erfrischungstuch etc. sein kann, auf die Fläche oder das Objekt überfragen werden. Einmal aufgebracht, kann die Fläche oder das Objekt mit Wasser abgewaschen werden.
  • Man kann erwarten, dass die Entwicklung neuer Methoden/Antimikroben zur Reduzierung von Geflügel-Kontaminierung mit Salmonellen eine enorme Auswirkung auf die menschliche Gesundheit haben wird; diese Antimikroben können auch bei der Behandlung von Infektionen von Nutzen sein, die durch mehrfach Medikamenten resistente Salmonellen (z. B. DT104) Arten verursacht wurden. Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, Phagen zu isolieren und zu charakterisieren, die von nutzen beider Behandlung von Salmonellen-Infektionen sein können. Die vorliegenden Erfinder haben verschiedene Bakteriophagen aktiv diverse Salmonellen-Arten isoliert und haben die Verwendung dieser Phagen bei der Reinigung von mit Salmonellen kontaminierten Oberflächen gezeigt. Diese Phagen können bei der Behandlung von Salmonellen-Kontaminierungen von Krankheiten verursacht durch Salmonellen, einschließlich mehrfach Medikamenten resistenter DT104 Arten, verwendet werden.
  • Eine attraktive Verfahrensweise, die Rate der Salmonellen-Kontaminierung von Geflügel zu kontrollieren, ist es Salmonellen-spezifische Bakteriophagen zu verwenden.
  • Bakteriophagen sind spezifisch für Prokaryonten und sie sind hochselektiv für eine Bakterienart oder einen Serotypen (d. h. sie erlauben das Zielen auf spezielle Bakterien ohne die normale Flora zu unterbrechen). Zusätzlich sind Phagen relativ einfach in einem Produktionsmaßstab zu Züchten und zu Reinigen. Ferner haben ausgiebige Studien in der Sowjetunion und verschiedenen osteuropäischen Ländern die Sicherheit und die Effizienz von Bakteriophagen-Therapie für viele bakterielle Krankheiten gezeigt. Eine Ausweitung des Konzepts der Phagen-Behandlung auf die primäre Prävention von Salmonellosis durch (i) die Verabreichung spezieller Phagen an Hühner und (ii) durch die Verwendung von Phagen für die Umwelt-Reinigung von Hühnerställen, Verarbeitungsanlangen etc. kann die Salmonellen-Arten, die von großer Signifikanz für die öffentliche Gesundheit sind, reduzieren oder eliminieren.
  • Übereinstimmend mit der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verpackung von Lebensmitteln offenbart. Das Verfahren beinhaltet die Schritte (1) Bereitstellen einer Verpackung, die das Lebensmittel enthält; und (2) Einfügen einer Matrize, welche mindestens einen Bakteriophagen enthält, in die Verpackung.
  • Übereinstimmend mit einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verpackung von Lebensmitteln offenbart. Das Verfahren beinhaltet die Schritte (1) Bereitstellen eines Lebensmittels; (2) Bereitstellen eines Verpackungsmaterials, welches mindestens einen Bakteriophagen enthält; und (3) Verpacken des Lebensmittels mit dem Verpackungsmaterial.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Zeichnung von einem Geflügel-Verfahrensschema basierend auf der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen
  • Bakteriophagen-Technologie kann bei der Behandlung einer großen Vielzahl von bakteriellen Infektionen wertvoll sein, weil (i) Bakteriophagen hochspezifisch und sehr effektiv beim Zielen auf pathogene Bakterien sind, (ii) Bakteriophagen absolut spezifisch für Prokaryonten sind und nicht Menschen oder Tiere befallen, (iii) Bakte riophagen sicher sind, wie dies durch ihre extensive klinische Verwendung in Osteuropa und der früheren Sowjetunion und durch den kommerziellen Verkauf von Phagen in den 1949er Jahren in den Vereinigten Staaten unterstrichen wird, (iv) eine Phagen-Herstellung kann schnell modifiziert werden, um das Auftauchen von neu auftretenden Bakterien-Bedrohungen zu bekämpfen und (v) eine Phagen-Herstellung kann als kosteneffektiv für groß-maßstäbige Anwendungen in einer Vielzahl medizinsicher Umgebungen angesehen werden. Von besonderer Bedeutung ist, dass Bakteriophagen nicht-pathogene, „normale Flora"-Bakterien nicht töten werden und damit den „Kolonisierungs-Widerstand" von Reservoirs solchen wie dem menschlichen Darmtrakt, der Nase und dem hinteren Pharynx, erhalten. Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann man sich die Verwendung lytischer Phagen (in Kombination mit Antibiotika oder alleine) vorstellen, um prophylaktisch oder therapeutisch verschiedene Bakterien zu eliminieren, die fähig sind Erkrankungen des Magen-Darm-, des Genital- und des Atemtraktes und der Haut, des Mundraumes und des Blutkreislaufs zu verursachen.
  • VRE-aktive Bakteriophagen
  • Die vorliegenden Erfinder haben verschiedene lytische Phagen isoliert, die genetisch aktiv gegen diverse (wie nachgewiesen durch Puls-Feld-Gel-Elektrophorese und/oder arbiträre Kürzung mit Polymerase-Ketten-Reaktion oder anderen Nukleinsäure-Verstärkungstechniken) VRE-Arten sind. In vitro Anfälligkeitstests betreffend 234 VRE-Arten (184 E. faecium, 41 E. faecalis und 6 E. gallinarium, die von Patienten an der Universität von Maryland und dem Baltimore VA Medical Center isoliert wurden, und 3 E. faecium ATCC Arten) resultierten in der Intralytix-Phagenkollektion, die in der Lage ist, alle VRE-Arten in der Kollektion kumulativ aufzulösen, wobei eine besondere Phage in der Lage ist, 95% aller VRE-Arten aufzulösen. Ferner wurden Mäusen, deren Magen-Darm-Trakt mit VRE unter selektivem Druck durch Antibiotika-Verabreichung kolonialisiert wurde, orogastrikal VRE-aktive Phagen verabreicht, was in einer 1 zu 3 registrierten Reduzierung der VRE-Magen-Darm-Kolonisierung verglichen mit einer Kontrollgruppe von Tieren, der keine Phagen gegeben wurden, führte. Dies tritt innerhalb eines Zeitrahmens von 48 bis 72 Stunden auf. Es wurden keine Nebeneffekte aufgrund der Phagen beobachtet.
  • Bakteriophagen-Arten können isoliert werden durch analoge Verfahren zu denen, die verwendet werden, um die VRE-aktiven Arten, die hier beschrieben sind, zu isolieren. Geeignete Bakteriophagen können von jeder Probe isoliert werden, die Bakteriophagen enthält, die typischerweise in Verbindung mit ihrem Wirt-Bakterium gefunden wird. Folglich ist jede Quelle, bei der erwartet wird, dass sie VRE enthält, geeignet für die Verwendung als Quelle von VRE-aktiven Bakteriophagen. Solche Proben beinhalten Fäkalien-, Urin- oder Sputum-Proben von Patienten, besonders Patienten, die sich einer akuten oder prophylaktischen Antibiotika-Therapie unterziehen, Patienten auf Intensivstationen oder immungeschwächte Patienten. Solche Patienten können ebenfalls eingeschlossen sein, ohne es hierauf zu beschränken: Patienten mit Verbrennungen, Trauma-Patienten, Patienten, die Knochenmark und/oder Organ-Transplantationen erhalten haben, Krebs-Patienten, Patienten mit kongenialen oder erworbenen Immundefekt-Krankheiten, Dialyse-Patienten, Leber-geschädigte Patienten und Patienten mit akuten oder chronischen Nierenversagen. Körperflüssigkeiten beinhalten Ascites, pleurale Ergüsse, Gelenk-Ergüsse, Abszess-Flüssigkeiten und Material, das von Wunden erhalten wird. Obwohl Menschen das primäre Reservoir für VRE sind, kann der Organismus auch leicht in der direkten Umgebung des infizierten/kolonisierten Patienten gefunden werden, solcher wie Bettstangen, Bettlaken, Möbeln, etc. (Bodnar, U. R. et al. (1996), „Use of in house studies of molecular epidemiology and full species identification of controlling spread of vancomycin resistant Enterococcus faecalis isolates" J. Clin. Microbiol., 34: 2129–32; Bonten, M. J. M. et al. (1996), „Epidemiology of colonization of patients and the environment with vancomycin resistent enterococci" Lancet, 348: 1615–19; Noskin, G. A. (1995), „Recovery of vancomycin resistant enterococci on fingertips and environmental surfaces" Infect. Control Hosp. Epidemiol. 16: 577–81). Konsequenterweise können Proben für die Isolierung von Bakteriophagen auch von Nichtpatienten-Quellen erhalten werden, einschließlich Abwasser, speziell Abwasserströme in der Nähe von Intensivstationen oder anderen Krankenhausorten, oder von Tupfern in Krankenhausbereichen, die mit dem Risiko einer nosikomialen Infektion verbunden sind, solchen wie Intensivstationen. Andere brauchbare Stellen für Proben beinhalten Pflegeheime, Ruhehäuser, Militärbaracken, Studentenwohnheime, Klassenräume und medizinische Toiletten. Phagen können auch aus Flüssen und Seen, Brunnen, Wassertischen, so gut wie wie aus anderen Wasserquellen (einschließlich Salzwasser) isoliert werden. Bevorzugte Probenstellen beinhalten Wasserquellen in der Nähe von kontaminierten Stellen, die oben aufgeführt sind.
  • Brauchbare Verfahren zur Isolierung reiner Bacteriophagen-Arten aus einer Bakteriophagen-enthaltenden Probe sind gut bekannt und solche Verfahren können durch den Fachmann im Hinblick auf die Anleitung, die hier gegeben wird, angepasst werden. Eine Isolierung von VRE-aktiven Bakteriophagen aus brauchbaren Proben wird typischerweise durchgeführt, indem die Probe mit einer Nährstoffbrühe vermischt wird, impfen der Brühe mit einer Wirt-Bakterienart und heran züchten, um die Mischung mit Bakteriophagen, die die Wirt-Art infizieren können, anzureichern. Eine Enterkokkus sp. Art wird als die Wirt-Art verwendet, bevorzugt eine VRE-Art. Nach dem Heranzüchten zum Anreichern, wird die Mischung abfiltriert, um die Bakterien zu entfernen, wobei ein lytisches Bakteriophage in dem Filtrat verbleibt. Mehrfache Verdünnungen des Filtrates werden auf einem Rasen von VRE verteilt und eine VRE-aktive Phage infiziert und löst die benachbarten Bakterien auf. Wie auch immer, das Agar begrenzt die physikalische Ausdehnung des Phagen durch die Platte, die zu kleinen sichtbaren klaren Bereichen, sogenannten Plaques, auf der Platte führen, wo Bakteriophage VRE innerhalb des zusammenfließenden Rasens von VRE-Wachstum zerstört haben. Weil ein Plaque mit einer verschiedenen Morphologie einen Phagen-Partikel darstellt, das sich in VRE innerhalb dieses Bereiches des bakteriellen Rasens repliziert, kann die Reinheit einer Bakteriophagen-Herstellung garantiert werden durch die Entfernung des Materials in diesem Plaque mit einer Pasteur-Pipette (ein „Plaque-Pick") und durch die Verwendung dieses Materials zum Impfen für weitere Wachstumszyklen dieses Phagen. Das Bakteriophage, das in solchen Zyklen hergestellt wird, stellt eine einzelne Art oder „Monophage" dar. Die Reinheit der Phagen-Herstellung (einschließlich einer Bestätigung, das es sich um eine Monophage und nicht um ein polyvalente Phagen-Herstellung handelt) wird beurteilt durch eine Kombination von Elektronenmikroskopie, SDS-PAGE, DNA-Restriction-digest und analytische Ultrazentrifugation. Zusätzlich wird jede Phage einzeln durch sein DNA-Restriction-Digest Profil, eine Protein-Zusammensetzung und/oder eine Genom-Sequenz identifiziert.
  • Individuelle VRE-aktive Bakteriophagen-Arten (d. h. Monophagen) werden wie zur Anreicherung einer Kultur oben beschrieben gezüchtet und dann auf ihre Aktivität gegenüber mehreren VRE-Arten getestet, um ein VRE-aktives Bakteriophage mit einem breiten Spektrum auszuwählen. Bemühungen werden gemacht, um Phagen auszuwählen, die (i) litisch sind, (ii) spezifisch gegenüber Enterokokken sind, (iii) mehr als 70% der VRE-Arten in unserer VRE-Arten-Kollektion auflösen und/oder (iv) VRE-Arten auflösen, die vorher als resistent gegenüber anderen VRE-Phagen identifiziert wurden. Es ist auch möglich, passende Phagen auszuwählen basierend auf den Sequenzen von DNA oder RNA, die für Proteine codieren, die beim Binden und/oder dem Eintritt der Phagen in ihre spezifischen Wirte beteiligt sind, oder basierend auf den Aminosäuresequenzen oder antigenetischen Eigenschaften von solchen Proteinen.
  • Mengen von VRE-aktiven Bakteriophagen mit einem breiten Spektrum, die für therapeutische Verwendungen wie unten beschrieben gebraucht werden, können durch eine Kultur oder eine brauchbare Wirt-Art in der oben für die Anreicherung von Kulturen beschriebenen Weise hergestellt werden. Bei der Durchführung einer Anreicherung einer Kultur zur Herstellung von Bakteriophagen für therapeutische Verwendung wird eine Wirt-Art basierend auf ihrer Fähigkeit eine maximale Ausbeute an Phagen zu liefern ausgewählt, wie dies in Pilot-Experimenten mit einigen verschiedenen Wirt-VRE-Arten bestimmt wurde. Wenn zwei oder mehr Wirt-Arten eine vergleichbare Ausbeute liefern, wird die Art, die sensitiver gegenüber Antibiotika ist, ausgewählt.
  • Die hier beschriebenen Techniken zur Isolierung von VRE-Monophagen sind anwendbar auf die Isolierung von Bakteriophagen, die für andere pathogene Bakterien lytisch sind. Substitution der Wirt-Arten oder anderer Bakterien wird zu der Isolierung von Phagen führen, die spezifisch für diese Bakterien sind. Das Isolierungsverfahren mit Proben zu beginnen, die auch Bakterien der Wirt-Art enthalten, wird das Verfahren beschleunigen.
  • Isolierung von Phagen für MDRSA oder für resistente Pseudomonas Arten können durch einen Fachmann in einer Art erreicht werden, die komplett analog zu der Isolierung von VRE Phagen ist.
  • Bakteriophagen-Cocktails
  • Diese Erfindung betrachtet auch Phagen-Cocktails, die auf die Pathogene maßgeschneidert sein können, die in bestimmten Situationen besonders häufig vorkommen.
  • Typischerweise würden pathogene Bakterien zuerst von einer bestimmten Quelle isoliert (z. B. ein Patient oder ein Ort, der mit RE kontaminiert ist) und Anfälligkeitstests des Pathogens gegenüber verschiedenen Bakteriophagen-Arten würden durchgeführt analog zu antimikrobiellen Anfälligkeitstests. Wenn einmal das Anfälligkeitsprofil für jeden Phagen des Pathogens bestimmt ist, kann der passende Phagen-Cocktail aus Phagen-Arten, zu denen die Pathogene anfällig sind, formuliert und dem Patienten verabreicht werden. Weil Phagen oft in institutionellen Einrichtungen verwendet werden, in denen Pathogene resistent gegenüber vielen antimikrobiellen Mitteln sind, würden Phagen-Cocktails oft aus Phagen bestehen, die lytisch für die meisten besonders häufigen institutionellen Pathogene sind, welche neben Enterokokken Staphylokokkus aureus, Staphylokokkus epidermidis, E. coli und Pseudomonas aeruginosa sind. Auch weil Enterokokken oft in polymikrobielle Infektionen zusammen mit anderen Magen-Darm-Kommensalen, solchen wie in Beckenwundinfektionen, beteiligt sind, ist der Ansatz der angemessenste, Cocktails von Phagen, die lytisch gegen verschiedene bakterielle arten sind, therapeutisch zu verwenden. Weil Phagen-Cocktails, von Phagen gegen institutionelle Pathogene entwickelt wurden, ist die Isolierung solcher Phagen am erfolgreichsten aus dem Abwasser von diesen Institutionen. Typischerweise wird der Phagen-Cocktail einen oder mehrere VRE-aktive Bakteriophagen gemäß dieser Erfindung enthalten.
  • Es an angebracht sein, bestimmte Phagen-Cocktails in landwirtschaftlicher Umgebung zu verwenden, wo es bestimmte menschliche Pathogene, solche wie Salmonellen und Camphylobacter, gibt, die inhärent zu Geflügel oder Vieh sind und welche die Umgebung solcher Tiere in einer fortwährenden Basis kontaminieren. Das Ergebnis ist eine fortlaufende Quelle von Infektion durch solche Pathogene.
  • Bakteriophagen-Cocktails können gleichzeitig stattfindend angewendet werden – dass heißt sie können zur gleichen Zeit angewendet werden (z. B. in der gleichen Anwendung) oder sie können in durch Zeit getrennten separaten Anwendungen so angewendet werden, dass sie zur selben Zeit effektiv werden. Die Bakteriophagen können als eine einmalige Anwendung, als periodische Anwendungen oder als eine kontinuierliche Anwendung angewendet werden.
  • Andere Bakterien innerhalb der Betrachtung der vorliegenden Erfindung beinhalten unter anderem Campylobacter, E. coli H7:0157 und Listeria und Staphylokokkus.
  • Bakteriophagen als Reinigungsmittel
  • Phagen können als Reinigungsmittel auf einer Vielzahl von Gebieten verwendet werden. Obwohl die Begriffe „Phage" oder „Bakteriophage" unten verwendet werden können, sollte beachtet werden, dass dieser Begriff, wo es angemessen ist, breit ausgelegt werden sollte, um einen einzelnen Bakteriophagen, mehrere Bakteriophagen, solche wie einen Bakteriophagen-Cocktail, und Mischungen von einem Bakteriophagen mit einem Mittel, solches wie Desinfektionsmittel, ein Reinigungsmittel, ein Oberflächenmittel, Wasser, etc., zu beinhalten.
  • Die Wirksamkeit von Phagen-Behandlung zur Reduzierung bakterieller Beladung kann durch periodische Bestimmung der Quantität der Bakterien in Proben, die von der behandelten Umgebung entnommen wurden, bestimmt werden. In einer Ausführungsform kann dies täglich durchgeführt werden. Wenn die Anwendung von Phagen die bakterielle Beladung um mindestens 1log verglichen mit der Kontrolle (z. B. vor der Behandlung) innerhalb von 48.98 Stunden nach der Phagen-Anwendung reduziert, dann wird diese Dosis des speziellen Phagen als wirksam erachtet. Vorzugsweise wird die Kolonisierung um mindestens 3 logs reduziert.
  • Die Ausführungsform von dieser Anmeldung betrachtet die Einbeziehung von Bakteriophagen oder Matrizen oder unterstützende Medien, die Bakteriophagen enthalten, mit Verpackungen, die Fleisch, Erzeugnisse, geschnittenes Obst und Gemüse und andere Lebensmittel. Bakteriophagen-Zubereitungen, die einzelne Bakteriophagen oder Cocktails von Bakteriophagen speziell für das (die) gewünschte(n) Pathogen(e) können auf das Lebensmittel oder das Verpackungsmaterial vor der Verpackung gesprüht, beschichtet etc. werden. Die Bakteriophagen-Zubereitung kann auch als Teil einer Matrize in die Verpackung eingeführt werden, wobei die Matrize absorbierte oder auf andere Weise inkorporierte Phagen mit einer erstrebten Rate durch passive Mittel freisetzt, oder kann Teil einer biologisch abbaubaren Matrize sein, die entworfen wurde, Phagen mit einer angestrebten Rate beim Abbau freizusetzen. Beispiele von passiven Freisetzungsvorrichtungen können Absorberpads, die aus Papier oder anderem faserigem Material gemacht wurden, Schwämme oder Kunststoffmaterialien beinhalten.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein Polymer, das zur Verpackung brauchbar ist, mit einer Bakteriophagen-Zubereitung imprägniert sein. Ein brauchbares Verfahren zur Imprägnierung eines Polymeres mit einer Bakteriophagen-Zubereitung ist in dem U.S. Patent Nr. 601175,377 offenbart, welches in seiner Gesamtheit durch die Bezugnahme eingeführt wird. Brauchbare Polymere können diejenigen Polymere beinhalten, die durch die U.S. Food and Drug Administration zur Verpackung von Nahrungsmitteln anerkannt sind.
  • Vorrichtungen
  • 1. Allgemein
  • Übereinstimmend mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Phagen in einem Behälter gelagert werden und dann auf einen Bereich oder ein Objekt aufgebracht werden. Der Behälter kann in seiner Größe von einer kleinen Flasche bis zu einem großen industriellen Vorratstank, der beweglich oder fest sein kann, variieren.
  • Der Behälter der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Mechanismen für die Aufbringung des Phagen auf ein Objekt verwenden. Im allgemeinen kann jeder Mechanismus, der eine im Wesentlichen gerade Verteilung des Phagen zur Verfügung stellt, verwendet werden. Ferner sollte das Phage bei einem Druck verteilt werden, der keinen substantiellen Schaden an dem Objekt verursacht, auf das das Phage aufgebracht wird, oder bei einem Druck, der direkt oder indirekt Schaden an dem Phagen selbst verursacht.
  • Es konnte festgestellt werden, dass einige Bakteriophagen aufgrund von interfacialen Kräften deaktiviert werden können, während andere Bakteriophagen solche Kräfte überleben. Adams schlug vor, dass die Luft-Wasser-Phasengrenze für die Bakteriophagen-Deaktivierung verantwortlich ist. Siehe Adams, M. H. „Surface inactivation of bacterial viruses and of proteins" J. Gen. Physiol. 31: 417–432 (1948) (in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeführt). Zusätzlich fand Adams, dass es die Gegenwart von Proteinen in der Verdünnung ist, die verschieden Coli-Dysenterie Bakteriophagen vor der Deaktivierung schützt.
  • Trouwborst et al. Führten verschiedene Studien zur Deaktivierung von Bakteriophagen durch. Siehe Trouwborst, T., J. C. de Jong und K. C. Wnkler, „Mechanism of inactivation in aerosols of bacteriophage T1" J. Gen. Virol. 15: 235–242 (1972); Trouwborst, T., und K. C. Winkler, „Protection against aerosol inactivation of bacteriophage T1 by peptides ans amino acids" J. Gen. Virol. 17: 1–11 (1972); Trouwborst, T., und J. C. de Jong, „Interaction of some factors in the mechanism of inactivation of bacteriophage MS2 in aerosols" Appl. Microbiol. 26: 252–257 (1973); und Trouwborst, T., S. Kuyper, J. C. de Jong und A. D. Plantinga, „Inactivation of some bacterial and animal viruses by exposure to liquid-air interphases" J. Gen. Virol. 24: 155–165 (1974), alle diese in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeführt. In „Mechanism of inactivation in aerosols of bacteriophage T1" schlagen die Daten vor, dass das Überleben des Bakteriophagen T1 mit der relativen Luftfeuchtigkeit variiert, mit einem minimalen Überleben in der Nähe der relativen Luftfeuchtigkeit, die mit einer gesättigten Lösung des Salzes korrespondiert, und einem besseren Überleben bei einer niedrigeren Anfangssalzkonzentration. Die Autoren stellten fest, wenn das T1 Bakteriophage geschüttelt wurde oder wenn es ein Aerosol war, war die Oberflächen-Deaktivierung ein Hauptgrund der Deaktivierung. Die Daten schlagen vor, wie auch immer, das Brühe T1 vor der Aerosol-Deaktivierung schützte. In „Protection against aerosol-inactivation of bacteriophage T1 by peptides and amino acids" bestimmten Trouwborst et al. anschließend das das Phage T1 vor einer Aerosol-Deaktivierung durch Peptone und durch unpolare Aminosäuren, solche wie Leucin und Phenylalanin, geschützt werden kann. Zusätzlich fanden die Autoren, dass Peptone auch T1 vor Deaktivierung durch niedrige relative Luftfeuchtigkeit schützen.
  • In „Inactivation of some bacterial and animal viruses by exposure to liquid-air interfaces" setzen Trouwborst et al. die Bakteriophagen T1, T3, T5, MS2 des EMC Virus und des Semliki Forest Virus einer großen Luft/Wasser Phasengrenze aus. Die Autoren stellten fest, dass der EMC Virus für diese Behandlung nicht sensitiv war, dass die Phagen T3 und T5 ein bisschen beeinflusst wurden und das Phage T1 und das Semliki Forest Virus schnell deaktiviert wurden. Die Autoren fanden auch heraus, dass die Deaktivierung durch Belüftung durch die Zugabe von Peptonen, durch unpolare Carbonsäuren und durch das Oberflächenaktive Mittel OED verhindert werden kann. Ferner schlugen die Daten vor, das die Rate der Oberflächen-Deaktivierung stark von der Salzkonzentration des Mediums abhängig war.
  • In einer Studie, die von Thompson und Yates durchgeführt wurde („Bacteriophage Inactivation at the Air-Water-Solid Interface in Dynamic Batch Systems" Applied and Environmental Microbiology, 65: 1186–1190 (Mar. 1999), das in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeführt wird), werden drei Bakteriophagen (MS2, R17 und ΦX174) durch Rohre filtriert, die Glas- und Teflonperlen enthalten. Zwei der drei Phagen (MS2 und R17) wurden durch diese Aktion deaktiviert, während das dritte Bakteriophage (ΦX174) nicht deaktiviert wurde. Aufgrund der Daten schlugen die Autoren vor, das eine Deaktivierung abhängig ist von (1) der Gegenwart eines dynamischen Luft-Wasser-Festkörper Phasenübergangs (wobei der Festkörper eine hydrophobe Oberfläche ist), (2) die Ionenstärke der Lösung, (3) die Konzentration der oberflächenaktiven Verbindungen in der Lösung und (4) der Typ des verwendeten Virus.
  • In einer separaten Studie studierten Thompson et al. zusätzlich den Luft-Wasser-Phasenübergang und seinen deaktivierenden Effekt auf bestimmte Bakteriophagen. Siehe Thompson et al. „Role of the Air-Water-Solid Interface in Bacteriophage Sorption Experiments" Applied and Environmental Microbiology, 64: 304–309 (Jan. 1998) (die in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeführt wird). In dieser Studie wurde beobachtet, dass das Bakteriophage MS2 in Kontrollrohren, die aus Polypropylen gemacht wurden, deaktiviert wurde, wohingegen keine substantielle Deaktivierung von MS2 in Glasrohren stattfand. Im Gegensatz dazu machte das Bakteriophage ΦX174 weder in Polypropylen- noch in Glasrohren eine Deaktivierung mit. Diese Daten legten nahe, dass die Deaktivierung von MS2 auf den Einfluss der Luft-Wasser-Phasengrenzenkräfte zurückzuführen ist, während ΦX174 nicht durch die gleichen Kräfte beeinflusst wurde, die MS2 deaktivierten.
  • Zuletzt ist eine Studie auf die Art, Die Charakteristika und die Eigenschaften von Membranen gerichtet. Siehe Mix, T. W. „The physical chemistry of membrane virus interactions" Dev. Ind. Microbiol. 15: 136–142 (1974). Einige gemischte identifizierte Faktoren müssen in Erwägung gezogen werden, wenn man bestimmt, ob ein Virus auf einer Membran absorbiert werden wird, einschließlich der Natur der Membran und der Virusoberfläche, elektrostatischer Kräfte, Umgebungsfaktoren (pH-Wert, die Ge genwart von Elektrolyten, die Gegenwart von konkurrierenden Absorbern, Temperatur, Flussrate, etc.). Die Wichtigkeit der Faktoren kann für verschiedene Viren variieren.
  • Die unten diskutierten Vorrichtungen können für die meisten Bakteriophagen angemessen sein; wie auch immer, es kann möglich sein, die Lieferung spezifischer Bakteriophagen zu verbessern, indem Phagen ausgewählt werden, die in spezifischen Vorrichtungen stabil sind bevor sie für den beabsichtigten Zweck verwendet werden. Zusätzlich kann es von Nutzen sein, in Abhängigkeit von dem besonderen Bakteriophagen verschiedene Materialien zu verwenden (z. B. Glas versus Polypropylen). Zum Beispiel schlagen die Studien oben vor, dass das Phage ΦX174 effektiv sein würde, wenn es von einem Polypropylenrohr und einem Zerstäuber verteilt wird, so dass eine Vielzahl an Tropfen von dem Phagen geformt werden, während die Studien vorschlagen, dass das Phage MS2 bei dieser Behandlungsweise der Anwendung nicht wirksam sein würde. Daher sollten angemessene Vorrichtungen, Materialien und Phagen ausgewählt werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann das Phage unter kontrollierten Bedingungen erhalten werden, um den Grad der Aktivität des Phagen zu erhalten, solche wie in einer wässerigen oder einer nicht-wässerigen Lösung, einem Gel etc. In einer Ausführungsform kann das Phage in einem gefriergetrockneten Zustand aufbewahrt werden und kann kurz vor der Verwendung mit einem flüssigen Vehikel vermischt werden. Brauchbare Vehikel beinhalten Wasser, Chloroform und Mischungen davon. Andere Vehikel beinhalten Wasser, das biologisch kompatible gelöste Stoffe enthält, solche wie Salze und Puffer-Reagentien wie sie allgemein im Stand der Technik bekannt sind. Solche Salze und Puffer-Reagentien können auch aus unbeständigen Salzen bestehen, solchen wie Ammoniumchlorid oder können nicht-unbeständig sein, solchen wie Natriumchlorid. Diese Ausführungsform ist ausdrücklich vorgesehen, alle Kombinationen und Mischungen von wässerigen und organischen Lösungsmitteln und gelösten Stoffen zu beinhalten, die eine adäquate Phagen-Lebensfähigkeit erhalten, welche größer als 50% des Originaltiters sein kann, bevorzugter größer als 75% des Originaltiters oder am bevorzugtesten größer als 95% des Originaltiters.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Phage bei einer kontrollierten Temperatur erhalten werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Phage bei einem kontrollierten Druck erhalten werden.
  • 2. Spezielle Vorrichtungen
  • In einer Ausführungsform kann ein einfacher Hand-Spray-Mechanismus vorgesehen werden. In dieser Vorrichtung wird der Druck durch den Benutzer generiert, wenn der Benutzer die Pumpe drückt (oder wenn eine Auslöser-Pumpe benutzt wird, wenn der Benutzer den „Auslöser" zieht), was verursacht, dass das Phage und sein Carrier durch die Düse des Mechanismus gedrückt werden. In einer andern Ausführungsform kann das Phage unter Druck in einem Kanister aufbewahrt werden und kann auf konventionelle Art durch das Drücken eines Knopfes oder eines Ventils am oberen Ende des Kanisters entnommen werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine Nebelvorrichtung verwendet werden, um das Phage über einen Bereich zu dispergieren.
  • Zusätzlich zu manuellen Zerstäubern können Power-Zerstäuber verwendet werden, um das Phage aufzubringen. Beispiele eines brauchbaren Zerstäubers beinhalten den Power Painter, den AmSpray® Double Spray Piston Pump, die High Volume Low Pressure Pumpen und die Diaphragma-Pumpen erhältlich über Wagner Spraytech Corporation, Minneapolis, MN. Andere power-Zerstäuber einschließlich den viel größeren als die hier oben aufgelisteten sind innerhalb der Betrachtungsweise der vorliegenden Erfindung.
  • In einer anderen Ausführungsform können Rollen, solche wie eine Farbrolle, verwendet werden. Dies kann dünne Film-Auftragungen einschließen. Innerhalb der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind Rollen-Vorrichtungen einschließlich einer Roller-Vorrichtung, die mir einem Vorrat am Phagen verbunden ist, der durch die Rolle auf eine Oberfläche gebracht wird.
  • Power-Rollen können auch verwendet werden. Zum Beispiel kann die Wagner® Power Roller erhältlich über Wagner Spraytech Corporation, Minneapolis, MN verwendet werden. Andere Power Rollen sind innerhalb der Betrachtungsweise der vorliegenden Erfindung.
  • Für größere Anwendungen können Schläuche, Zerstäuber, Sprinkler oder andere brauchbare Vorrichtungen verwendet werden, um das Phage aus dem Behälter auf den Bereich oder auf das Objekt zu bringen.
  • Die Phagen können auch von Hand aufgebracht werden. Zum Beispiel können die Phagen mit einem Pinsel auf das Objekt aufgebracht werden. In anderen Ausführungsformen kann für die Aufbringung des Phagen auf das Objekt ein Transfer-Vehikel verwendet werden, solches wie ein Wischlappen, ein Papiertuch, ein Handtuch, ein Erfrischungstuch, ein Schwamm, etc. Das Transfer-Vehikel kann über einen Bereich oder ein Objekt gewischt werden, um das Phage auf den Bereich oder das Objekt aufzubringen. In einer Ausführungsform kann das Transfer-Vehikel vorgepackt sein, vergleichbar mit einem Alkoholtuch.
  • Wie oben diskutiert können die Phagen in ihrer gefriergetrockneten Form aufbewahrt werden und dann kurz vor der Verwendung mit dem Lösungsmittel kombiniert werden. In einer Ausführungsform kann eine Verpackung mit einer Glasampulle, die das Lösungsmittel enthält, ein Material beinhalten, das mit dem Phagen in der gefriergetrockneten Form beschichtet ist. Wenn ein Benutzer die Verwendung des Phagen wünscht, zerbricht der Benutzer die Ampulle wobei das Lösungsmittel mit dem Phagen vermischt wird. Andere Technologien zur getrennten Aufbewahrung der Phagen und Lösungsmittel und der Herstellung ihrer Mischung erst kurz vor der Verwendung sind gut bekannt und können ebenfalls verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine Vorrichtung verwendet werden, die die Aktivität des Phagen erhält. Zum Beispiel kann eine Vorrichtung zur Aufbewahrung von mindestens einem Bakteriophagen bei einer Temperatur und einem Druck, der ausreichend ist, die Aktivität des/r Phagen zu erhalten, aufbewahrt werden, die vergleichbar mit einem Feuerlöscher oder einem tragbaren Pflanzen-Zerstäuber ist. Dies kann das Bereitstellen einer Temperatur-Kontrollvorrichtung beinhalten, um die Temperatur konstant zu halten, die durch Strom, Batterien etc. angetrieben werden kann.
  • Die Vorrichtung kann tragbar sein, so dass sie zu den zu dekontaminierenden Stellen getragen werden kann, oder in Dekontaminierungs-Räumen etc. aufbewahrt werden.
  • In einer Ausführungsform kann das Phage eine vorbestimmte „shelf-life" haben und kann periodisch ausgetauscht werden. In einer Ausführungsform kann die Vorrichtung einen Sensor beinhalten, der warnt, wenn das Aktivität-Level des Phagen ein vorbestimmtes Level erreicht.
  • In einer anderen Ausführungsform können mehrere Fächer für mehrere Phagen bereit gestellt werden, die vor der Verteilung aus der Vorrichtung gemischt werden können. Fächer für mindestens ein Mittel, solches wie Wasser, Schäume, Desinfektionsmittel und andere Mittel können vorgesehen werden und können auch mit dem/den Phagen vor der Verteilung vermischt werden oder können separat verteilt werden.
  • Die Phagen können auch in Gelen oder Schäumen erhalten werden. Daher können Vorrichtungen verwendet werden, die Gele oder Schäume verteilen.
  • Beispiel 1. Erhalt von VRE Isolaten
  • Isolation von VRE
  • VRE wurden durch Standardmethoden von Patienten in den chirurgischen Intensiv- und Standardpflegeabteilungen des University of Maryland Medical Center in Baltimore erhalten. Trypticase Soja Agar, versetzt mit 5% Schafsblut (BBL, Cockeysville MD) wurde zur Isolierung von Enterokokken aus Urin, Wunden und sterilen Körperflüssigkeiten benutzt. VRE wurden aus Stuhlproben auf Colistin Nalidixinsäure (CNA) agar (Difco labs, Detroit, Michigan), versetzt mit defibriniertem Schafblut (5%), Vancomycin (10 μg/ml) und Amphotericin (1 μg/ml) isoliert. Siehe: Facklam, R. R., D. F. Sahm. 1995. Enterococcus. In: Manual of Clinical Microbiology, 6th edition, American Society for Microbiology, Washington, D. C., S. 308–312.
  • Identifizierung von VRE
  • Enterokokken wurden durch Esculin-Hydrolyse und Wachstum in 6.5%iger NaCl bei 45°C identifiziert. Die Identifizierung auf dem Spezies-Niveau wurde durch konventionelle Tests durchgeführt, beschrieben bei Facklam und Collins (Facklam, et al. (1989), "Identification of Enterococcus species isolated from human infections by a conventional method test scheme." J. Clin. Microbiol., 27: 731–4).
  • Test von VRE auf Antibiotika-Empfindlichkeit
  • Die Antibiotika-Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin, Vancomycin, Streptomycin und Gentamicin wurde durch die "E test quantitative minimum inhibitory concentration procedure" (AB Biodisk, Solna Sweden) bestimmt. Qualitätskontrollen mit Zell-Linien von von E. faecium (ATCC 29212, 51299) wurden zur Sicherstellung der Wirksamkeit jedes antibiotischen Mittels herangezogen. Mit Ausnahme von Vancomycin wurden die Empfindlichkeits-Kriterien des "National Committee for Clinical Laboratory"-Standards befolgt (National Committee for Clinical Laboratory Procedures (1993), "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically." 3rd Edition. National Committee for Clinical Laboratory Procedures (1993), "Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests" 5th Edition, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova PA). Ein VRE-Isolat wurde definiert als eines mit einer minimalen Inhibierungskonzentration von Vancomycin von mindestens 16 μg/ml.
  • Definition generisch eigenständiger VRE Zell-Linien
  • Eigenständige VRE-Isolate wurden als solche characterisiert durch Kontur-geklammerte Homogenfeldelektrophorese nach Verdauung der chromosomalen DNA mit Smal (Verina, P. et al. (1994) "Epidemiologic characterization of vancomycin resistant enterococci recovered from a University hospital" (Abstract). In: Abstracts of the 94th General Meeting of the American Society for Microbiology, Las Vegas NV; Dean, et al. (1994) "Vancomycin resistant enterococci (VRE) of the vanB genotype demonstrating glycoprotein (G) resistance inducible by vancomycin (V) or teicoplanin (T)" In: Abstracts of the 94th General Meeting of the American Society for Microbiology, Las Vegas NV.). Zusätzliche Elektrophorese-Studien nach ApaI-Verdauung wurden von VRE Zell-Linien durchgeführt, die sich nach der ersten Analyse nur durch 1–3 Banden unterschieden (Donahedian, S. M. et al. (1992) "Molecular typing of ampicillin-resistant, non-beta lactamase producing Enterococcus faecium isolates from diverse geographic areas." J. Clin. Microbiol., 30; 2757–61). Der Vancomycin-resistente Genotyp (vanA, vanB oder vanC) wurde durch Polymerase Kettenreaktion (PCR)-Analyse definiert, wofür spezifische Primer aus publizierten Gensequenzen ausgewählt wurden (Goering, R. V. and the Molecular Epidemiological Study Group (1994) "Guidelines for evaluating pulsed field restriction fragment patterns in the epidemiological analysis of nosocomial infections." (Abstract) Third International Meeting of Bacterial Epidemiological Markers; Cambridge England).
  • Beispiel 2. Isolierung eines VRE-Phagen
  • 500 ml Rohabwasser der University of Maryland wird gemischt mit 100 ml einer 10fach konzentrierten LB Brühe (Difco Laboratories). Dieses Abwasser-Brühe-Gemisch wird mit einer 18–24 Stunden-LB-Brühenkultur (1 ml) einer VRE-Zell-Linie beimpft und bei 37°C für 24 Stunden inkubiert, um die Mischung für den Bakteriophagen-Befall anzureichern. Nach Inkubation wird bei 5000 g für 15 min zentrifugiert um Material zu entfernen, dass die nachfolgende Filtration stören könnte. Der Überstand wird durch einen 0.45 μm Millipore-Filter filtriert. Das Filtrat wird mittels der "Streak Plate"-Methode und/oder dem "Appelman Tube Turbidity"-Test geprüft, um die lytische Aktivität gegenüber unterschiedlichen Zell-Linien von VRE nachzuweisen.
  • Methoden zum Test der Phagenaktivität gegenüber VRE-Isolaten
  • Drei Methoden wurden angewandt: Plaque-Prüfung, " Streak-Plate"-Methode und "Tube Turbidity"-Methode, und die Prozeduren für jede folgen.
  • Plaque-Prüfung
  • Eine 18–24-Stunden Nährbrühenkultur der VILE-Zell-Linie (0.1 ml) zum Test auf die Infektionsempfindlichkeit und Verdünnungen einer VRE-Phagen-Präparation (1.0 ml) werden gemischt und dann bei 45°C zu 4.5 ml einer 0.7% Lösung von geschmolzenem Agar in Nährbrühe gegeben. Diese Mischung wird vollständig in eine Petrischale gegossen, die 25 ml der Nährbrühe, verfestigt mit 2% Agar, enthält. Während der Übernacht-Inkubation bei 37°C wachsen die VRE in dem Agar und bilden einen einheitlichen Bewuchs mit einigen VRE-Zellen, die durch den Phagen infiziert sind. Diese Phagen vermehren sich, zerstören die ursprünglich infizierte Zelle und infizieren und lysieren schließlich auch die benachbarten Bakterienzellen. Das Agar limitiert die physikalische Ausbreitung der Phagen über die Platte, was in kleinen, sichtbar klaren Flächen, benannt Plaques, resultiert, in denen der Bakteriophage VRE inmitten des gleichmäßigen Bewuchses zerstört hat.
  • Die Zahl der Plaques, die bei gegebenem Volumen und gegebener Konzentration gebildet werden, reflektiert den Titer der Bakteriophagen-Präparation. Da ein Plaque mit einer bestimmten Morphologie einen Phagenpartikel repräsentiert, der in diesem Bereich des Bakterienbewuchses in VRE repliziert wurde, kann zudem auch die Reinheit der Bakteriophagen-Präparation sichergestellt werden, wenn das Material in diesem Plaque mit einer Pasteurpipette entfernt (ein "Plaque pick") und als Impfstoff für weitere Wachstumszyklen des Phagen verwendet wird. Auf dieser Basis d. h. mit weiteren Plaque-Prüfungen mittels Phagen aus diesem "Plaque pick", kann man erwarten, dass alle neuen Plaques das Erscheinungsbild und die Morphologie des ersten Plaques aufweisen, was einen weiteren Beweis für die Reinheit des Präparats darstellt.
  • "Streak Plate"-Methode
  • 18-Stunden LB-Brühenkulturen der verschiedenen zu testenden Enterokokken-Zellkinien werden bei 37°C wachsen lassen (resultierend in ca. 109 CPU/ml), und ein wenig einer jeden Kultur wird in einer einzelnen Linie über eine Nähr-Agarplatte gestrichen. Dies resultiert für jede Platte in einigen verschiedenen VRE, die jeweils in einer Linie angeordnet sind. Einzelne Tropfen der zu testenden Phagen-Filtrate werden auf die Striche aller VRE-Bewuchse aufgetragen, und die Platte wird 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Zeit werden die Striche der verschiedenen VRE Zell-Linien nach klaren Bereichen abgesucht, die die Fähigkeit eines speziellen Phagen zur Lyse einer speziellen VRE Zell-Linie anzeigen.
  • Der VRE-Wirt-Bereich für ein gegebenes Phagen-Filtrat kann dadurch nachgewiesen werden, bei welchen VRE-Strichen es einen klaren, nichtbewachsenen Bereich liefert und bei welchen VRE der Phage dies nicht vermag.
  • "Appelman Tube Turbidity"-Test (from Adams, M. H. 1959. Bacteriophages. Interscience Publ. New York N. Y.):
  • 18 Stunden LB-Brühenkulturen verschiedener VRE-Zell-Linien werden präpariert. 0.1 ml Phagen-Filtrat oder einer Verdünnung davon wird zu 4.5 ml einer VRE-Brühenkultur gegeben und für 4 Stunden (bei Monophagen) bzw. 4–18 Stunden (bei polyvalenten Phagen) bei 37°C inkubiert. Phagen-freie VRE-Brühenkulturen werden zur Kontrolle genutzt. Brühenkulturen, die üblicherweise aufgrund des Bakterienwachstums trüb sind, werden zur Prüfung der Lyse-Aktivität des Phagen herangezogen, die durch das Aufklaren der Trübung nachgewiesen werden kann.
  • Der Wirt-Bereich für einen gegebenen Phagen kann nachgewiesen werden, indem die Trübung bei einer Brühenkultur verschwindet und bei einer anderen nicht.
  • Beispiel 3. Eine Phagen-Linie ist aktiv gegenüber mehr als 200 VRE-Isolaten
  • Eine Sammlung von 234 VRE-Isolaten: 187 E. faecium, wovon 3 Linien aus ATCC stammen, 41 E. faecalis Linien und 6 E. gallinarium Linien sowie 6 E. faecium Linien, die Vancomycin-sensitiv sind, wurden auf ihre Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion mit 7 Monophagen, die wie in Beispiel 2 gezeigt isoliert wurden, getestet. Die Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion wurde durch die drei beschriebenen Techniken bestimmt. Die Mehrzahl der VRE Linien in dieser Sammlung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, von Patienten an den University of Maryland und Baltimore VA Medical Centers erhalten. Die VRE-Isolate wurden mittels gepulster Gelelektrophorese als unterschiedlich und genetisch voneinander abweichend bestimmt. Von den 7 Monophagen weisen VRE/E2 und VRE/E3 einen relativ engen Wirtsbereich auf. Diese zwei sind jedoch in der Lage, den geringen Anteil der VRE-Linien zu befallen, die gegenüber den anderen Phagen immun sind. Ein Phagen-Cocktail, bestehend aus den oben benannten 7 VRE-Monophagen lysiert 95% der VRE-Linien aus der Sammlung.
  • Beispiel 4. Produzieren von Bakteriophagen-haltigen Kompositionen
  • 0.1 ml Mengen einer 18–24 Stunden LB Brühenkultur (LB Brühenkultur enthält Bacto LB Broth. Miller (Luria-Bertani, dehydratisiert), rekonstituiert nach Anweisung von Difco Laboratories, Detroit, Michigan) einer Zell-Linie von VRE, die zuvor nach dem Kriterium ausgesucht wurde, eine maximale Ausbeute an Bakteriophagen zu erzeugen, werden mit 1.0 ml eines VRE-Monophagen-Filtrats vermischt und anschließend bei 45°C zu 4.5 ml einer Lösung von 0.7% geschmolzenem Agar in Nährbrühe gege ben. Diese Mischung wird vollständig in eine Petrischale gegossen, die 25 ml der Nährbrühe, verfestigt mit 2% Agar, enthält. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wird die dünne, weiche obere Schicht der Platte mit den Phagen vorsichtig abgekratzt und mit einem geringen Volumen der Brühe vermischt (1 ml pro abgeerntete Platte). Diese Suspension wird bei 5000–6000 g und 4°C für 20 min zentrifugiert, und der Phagen-enthaltende Überstand wird sorgfältig entfernt. Der Überstand wird filtriert durch ein 0.45 μm Filter und bei 30.000 g und 4°C für 2–3 Stunden zentrifugiert.
  • Das phagenhaltige Pellet wird in 1–5 ml Phosphat-Puffer suspendiert und durch Ionenaustauschchromatographie an einer "Q resource"-Ionentauschersäule (Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.) mit 0–1 M NaCl-Gradient im Anfangspuffer weiter gereinigt. Phagen eluieren üblicherweise zwischen 150–170 mM NaCl, und jede Fraktion wird mittels des Standard-Plaque-Tests auf den Phagengehalt überprüft. Die gesammelten und geprüften Fraktionen werden solange vereinigt, bis der Phagen-Titer mehr als 3 Zehnerpotenzen unter dem ursprünglichen Titer liegt (z. B. 1010 PFU/ml wird auf die Säule gegeben, dann werden nur Fraktionen vereinigt, deren Titer über 107 PFU/ml liegt). Die vereinigten Fraktionen werden mit dem "Limulus Amebocyte Lysate Assay" (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) auf Endotoxin überprüft. Präparate mit > 50 EU/ml Endotoxin werden durch eine "Affi-prep polymyxin support"-Säule (Bio-Rad Labs, Hercules, CA) gegeben, um verbliebenes Endotoxin zu entfernen.
  • Der Puffer der vereingten Phagen-Fraktionen wird durch Größenausschlußchromatographie an Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) gegen Ammonium-Bicarbonat ausgetauscht. 1 ml-Proben der gereinigten Phagen-Lösung werden in Gegenwart von Gelatine gefriergetrocknet und bei Raumtemperatur gelagert. Die Reinheit der Phagenpräparation wird durch eine Kombination von Elektronenmikroskopie, SDS-PAGE, DNA restriction digest und analytischer Ultrazentrifugation bewertet.
  • Beispiel 5. Bestimmung einer schützenden Dosis von Bakteriophagen
  • Etablierung einer selbsterhaltenden VRE-Besiedlung im Tier-Modell
  • CD-I-Mäuse werden 7 Tage vorbehandelt mit 0.1 mg/ml Gentamicin und 0.5 mg/ml Streptomycin im Trinkwasser zur Reduktion der normalen Darmflora. VRE wird dann den Mäusen verabreicht in Form einer Nahrungstablette, die mit 106 CFU von VRE beimpft ist. Die Darmbesiedlung durch VRE wird überprüft durch Standardkolonie-Zählungen von > 103 CFU von VRE/Gramm Kot auf CNA-Agar, der 10 μg/ml Vancomycin, 1 μg/ml Amphotericin B und 10 μg/ml Gentamicin enthält. Die Besiedlung wird als erfolgreich eingestuft, wenn eine konstante Abstoßung von > 103 CFU von VRE pro Gramm Kot für 5–7 Tage nach der Einnahme der beimpften Nahrungstablette gemessen wird. Die VRE-Besiedlung nach dieser Methode kann bis zu 4 Wochen anhallen. Die Mäuse werden während der gesamten Dauer des Experiments mit Trinkwasser versorgt, dass die oben benannten Antibiotika enthält.
  • Nutzung eines in-vivo-Mausmodells zur Demonstration der Effizienz lytischer Bakteriophagen in der Reduktion der gastrointestinalen VRE-Besiedlung
  • Vierundzwanzig Stunden nach der Detektion von > 103 CFU von VRE/Gramm Kot wird den Mäusen VRE-Phage gegeben (durch Konsum einer Nahrungstablette, die mit 109 PFU von VRE beimpft ist). Kontrollgruppen bestehen aus (1) Nicht-VRE-Mäuse ohne Phagen-Gabe, (2) VRE-Mäuse ohne Phagen-Gabe, und (3) Nicht-VRE-Mäuse mit Phagen-Gabe. Jede der Kontroll-Gruppen besteht aus 5 Tieren.
  • Die Effizienz der Phagen-Behandlung in der Reduktion der gastrointestinalen VRE-Besiedlung wurde bestimmt durch die tägliche Quantifizierung von VRE im Kot der Mäuse der verschiedenen Gruppen. Zusätzlich wurden zum Ende der Studie alle Mäuse geopfert, um die Zahl der VRE und der Phagen jeweils in Leber, Milz und Blut zu bestimmen. Wenn die Phagen-Gabe die VRE-Besiedlung oder VRE-Gesamtmenge in den Mäusen relativ zu den Kontrollgruppen um mindestens eine Zehnerpotenz reduzieren konnte, wurde die entsprechende Dosis des entsprechenden Phagen als effektiv erachtet. Vorzugsweise wurden mehr als drei Zehnerpotenzen Differenz bei der Besiedlung beobachtet.
  • Beispiel 6. Isolierung und Charakterisierung von Phagen mit lytischer Wirkung gegenüber ausgewählten Salmonella Serotypen
  • Isolierung und Reinigung von Bakteriophagen
  • Salmonella-spezifische Bakteriophagen wurden durch Standardtechniken aus unter schiedlichen Quellen in Maryland isoliert. Die Reinigung wurde durch eine Kombination von Niedrig- und Hochgeschwindigkeitszentrifugation und durch sequentielle Fraktionierung an verschiedenen chromatographischen Medien erzielt. Der Puffer gereinigter Phagenlösungen wurde gegen physiologischen Phosphatpuffer/NaCl, pH 7.6, ausgetauscht. Das Endprodukt wurde mittels eines 0.22 μm Filters sterilisiert, der Titer bestimmt, und in sterilen Glasampullen bei 40°C gelagert.
  • Die Bakteriophagen-Isolate wurden gegen eine Sammlung von 245 Salmonella-Zell-Linien getestet. Die Sammlung beinhaltete S. hadar (84 Linien), S. typhimurium (42 Linien), S. enteritidis (24 Linien), S. heidelberg (2X Linien) und S. newport (18 Linien). Vierundvierzig der verbleibenden 56 Linien werden gruppiert in 17 Serotypen und 12 Linien liessen sich nicht typifizieren. Genetisch lag eine diverse Linienpopulation mit 78 PFGE Typen vor.
  • Sieben Klone von Salmonella-spezifischen lytischen Bakteriophagen wurden aus Umgebungs-Quellen isoliert. Die Elektronenmikroskopie identifizierte diese als "tailed phages" aus den Familien Myoviridae und Siphoviridae. Der aktivste Phagen-Klon lysierte 220 (90%) der Salmonella-Linien, darunter alle DT-104 ("multi-drug"-resistente) Salmonella Isolate. Der zweitaktivste Phagenklon lysierte 74% der Zelllinien.
  • Gepulste Gelelektrophorese (Pulsed Field Gel Electrophoreses, PFGE)
  • Die schnelle PFGE-Analyse, die für die Analytik von E. coli 0157:07 Zell-Linien entwickelt worden war, wurde zur PFGE-Analyse der Salmonella Zell-Linien herangezogen [5]. Alle Zell-Linien wurden nach Verdauung mit XbaI analysiert, und ausgewählte Zell-Linien wurden zudem nach Verdauung ihrer DNA mit AvrII- und SpeI-Restriktions-Enzymen analysiert. Der CDC Standard S. newport Zell-Linie am01144 (XbaI-verdaut) wurde als Referenz-Zell-Linie für alle Experimente eingesetzt. Da die Zahl der Salmonella Zell-Linien pro PFGE-Typ limitiert war, wurde nicht bestimmt, ob es zu Assoziationen zwischen bestimmten Klon-Gruppen kam oder zu einer Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber diesen Phagen.
  • Der Zielbereich wurde um 5% weiter erweitert durch die Konstruktion eines "Cocktail von Phagen", bestehend aus drei Phagen. Diese Cocktail war effizient in der Reduktion von Salmonella-Zählungen auf experimentell kontaminierten Oberflächen, und das Versprühen von 1 × 105 PFU vom Phagen vermindert die Zahl der Salmonella von 1 × 107 CFU hin zu nicht detektierbaren Leveln binnen weniger als 48 Stunden. Die Phagen-Klons und der Phagen-Cocktail waren inaktiv gegenüber anderen getesteten bakteriellen Spezies, zum Beispiel E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, K. pneumoniae und L monocytogenes, was nahe legt, das ihre Aktivität derjenigen der Salmonellen Spezies vergleichbar ist.
  • Studien zur fertigen Geflügelprodukt-Dekontaminierung
  • Im Einzelhandel gekaufte Hühner (2 Hühner pro Gruppe) wurden experimentell mit einer Rifampin-resistenten, Phagen-sensitiven Salmonellen-Art kontaminiert (1 × 103 CFU pro bard) und sie wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Ein Phagen-Cocktail (10 ml, 1 × 107 PFU/ml) wurde über die Hühner in Gruppe 3A gesprüht und die Hühner in Gruppe 2A wurden mit sterilem Wasser besprüht. Die Hühner wurden auf die Anwesenheit der getesteten Salmonellen-Art unter Verwendung der US-DA/FSIS Standardmethoden für Salmonellen-Feststellung untersucht.
  • Die Ergebnisse der Studien zur fertigen Geflügelprodukt-Dekontaminierung zeigten, das die Anzahl der Salmonellen, die von der Phagen-behandelten Gruppe erhalten wurden (Gruppe 3A), ungefähr 103-fach geringer war als die, die von der Phagen-unbehandelten Kontroll-Gruppe erhalten wurden (Gruppe 2A). Diese Daten legen nahe, dass Salmonellen spezifische Phagen bei der Reinigung von fertigen Geflügelprodukten von Nutzen sein können; d. h. bei der Reduzierung/Eliminierung restlicher Salmonellen-Kontaminierung der Vögel nach dem Kühlen.
  • Vorsichtig gesagt
  • Salmonellen-spezifische Phagen-Zubereitungen, die einen oder mehrere lytische Monophagen enthalten, können bei der Reduzierung/Eliminierung von Salmonellen-Kontaminierungen von Umgebungsoberflächen von Nutzen sein und daher können sie brauchbar bei der Dekontaminierung von Geflügel-Anlagen, Hühnerställen, etc. sein. Ferner können Salmonellen-spezifische Phagen brauchbar bei der Reinigung von fertigen Geflügelprodukten sein; d. h. bei der Reduzierung/Eliminierung restlicher Salmonellen-Kontaminierung der Vögel nach dem Kühlen.
  • Vergleichsbeispiel 7 – Reinigung von frisch geschnittenen Produkten mit Bakteriophagen
  • Eine Studie wurde durchgeführt, um zu bestimmen (i) die Überlebens- und Wachstumsrate von Salmonella enteritidis (choleraesuis) auf frisch geschnittenen Stücken von Apfel und Honigmelonen unter den Bedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Länge der Inkubation) die auch während ihrer Verarbeitung und Lagerung geherrscht haben und (ii) die Wirksamkeit von spezifischen Phagen für die Benutzung als Biokontrollmittel auf frisch geschnittenen Früchten, die mit Salmonellen kontaminiert wurden.
  • Frucht
  • Die gesamten Früchte wurden vor dem Schneiden mit 70%igen Ethanol desinfiziert. „Roter Delicious" Äpfel, der bei 1°C gelagert wurde, wurde mit einem Apfelschneider in acht Stücke geschnitten und verletzt (Conwas, W. S., B. Leverentz, R. A. Saftner, W. J. Janisiewicz, C. E. Sams und E. Leblanc „Survival and growth if Listeria monocytogenes on fresh-cut apple slices and its interaction with Glomerella cingulata und Penicillium expansum" Plant Disease 84: 177–181 (2000)). Die Honigmelonen, die im lokalen Supermarkt gekauft wurden, wurden mit einem sterilen Messer am Äquator durchgeschnitten. Zwei Ringe wurden aus dem Zentrum jeder Melone geschnitten, und jeder Ring wurde in 12 gleich große Stücke geschnitten. Der Bereich des pH-Wertes des Apfels und der Honigmelone wurde mit einer pH Kombinationselektrode bestimmt, Semi-Micro (81-03 RossTM, Orion Research Inc., Beverly, MA), wobei die pH Werte 4,1–4,7 bzw. 5,7–5,9 waren.
  • Herstellung des bakteriellen Impfserums
  • Eine Riampicin resistente Phagen-Zubereitung, anfällig für Salmonella enteritidis Arten, von der Bakterienarten Sammlung von Intralytix Inc. (Baltimore, MD) wurde verwendet, um die Apfel- und Honigmelonenstücke experimentell zu kontaminieren. Das Bakterium wuchs über Nacht bei 37°C auf L-Agar, welches mit 100 μg/ml Rifampicin (Sigma #R-3501) ergänzt wurde, die Bakterien wurden gesammelt und mit steriler Salzlösung (0,9% NaCl) gewaschen und die bakterielle Suspension wurde auf eine Konzentration von 1 × 106 CFU/ml verdünnt.
  • Phagen
  • Die Phagen-Mischung (SCPLX-Phagen), die vier verschiedene lytische Phagen enthält, die spezifisch für Salmonella enteritidis sind, wurde von Intralytix mit einer Konzentration von 1010 PFU/mI in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung erhalten. Die Lösung wurde unmittelbar vor der Aufbringung auf die Fruchtstücke mit steriler Salzlösung verdünnt (107 PFU/ml Endkonzentration).
  • Bakterielle Impfung und Aufbringung der Phagen
  • 25 μl der bakteriellen Suspension wurden auf die Wunden, die in die Fruchtstücke gemacht wurden, aufgebracht. Nach der Auftragung der Salmonellen Arten, wurden 25 μl der Phagen-Mischung auf die Wunden aufgebracht und die Stücke wurden in 475 ml Mason Gläsern gestellt, die mit einem Plastikfilm abgedeckt wurden. Real View laboratory sealing Film (Norton Performance Plastics) wurde zum Verschließen der Gläser verwendet, die die Apfelstücke enthalten, und ein Std-Gauge Film mit einer hohen Sauerstoff-Transfer-Rate LDX5406, Produkt 9NK27 (Cryovac, Duncan, SC) wurde verwendet, um die Gläser zu verschließen, die die Honigmelonen-Stücke enthalten.
  • Zurückgewinnung der Bakterien und der Phagen
  • Nach der Impfung wurden die Mason Gläser, die die Fruchtstücke enthalten, bei 5, 10 und 20°C gelagert. Die Anzahl der CFU/ml auf den Apfel- und Honigmelonenstücken wurde 0, 3, 24, 48 120 und 168 Stunden nach der Impfung bestimmt (4 Fruchtstücke pro Behandlung für jede Zeit der Wiedergewinnung). Die Wiedergewinnung und die Bestimmung der Menge der Bakterien wurde entsprechend des vorher beschriebene Verfahrens durchgeführt. Nach dem Überziehen der Proben wurde die verbleibende Lösung filtersterilisiert (0,45 μm Supor Membran, Acrodisk, Pall Gelman) und bei 4°C gelagert. Der Titer der Phagen in diesem Filtrat wurde gemäß den Standardverfahren bestimmt (Adams, M. H. „Bacteriophages" Interscience Publishers, New York (1959)). Alle Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit sicher zu stellen.
  • RAPD und PFGE
  • Die RAPD Technik wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, wobei ein RAPD Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) verwendet wurde, der ready-to-go Analysenperlen enthält, und die DNA Muster wurden durch Elektrophorese in 2% Agarose Gel in einem TAE-Puffer analysiert. PFGE wurde wie vorher beschrieben durchgeführt, wobei der CHEF Mapper (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.) verwendet wurde.
  • Statistische Analysen
  • Die Anzahl der CFU/Wunde auf den Apfelstücken wurde mit einem Drei-Faktor allgemeinen linearen Modell unter Verwendung von PROC MIXED (SAS/STAD® Software: Wechsel und Verbesserungen durch Release 6.12, pp. 1167, Cary, NC 1997 („SAS Institute")) mit der Behandlung, der Temperatur und der Zeit als die drei Faktoren analysiert. Die Annahmen des allgemeinen linearen Modells wurden getestet. Um die Schwankungen der Heterogenität zu korrigieren, wurden die Werte in ihren log10 (log×) überführt und die Behandlungen wurden für die Analyse in ähnlichen Schwankungsgruppen zusammengefasst. Die Mittelwerte wurden unter Verwendung eines paarweisen Vergleichs mit Sidak eingestellten p-Werten verglichen, so dass der experimentelle Fehler für die Vergleichskategorie 0,05 war.
  • Die Analyse für die Daten der Honigmelonen wurde in zwei Teile durchgeführt, weil die Werte für 5°C bei 120 und 168 Stunden alle Null waren.
  • Teil 1: Die CFU Werte für 0, 3, 24 und 48 Stunden wurden mit einem Drei-Faktor allgemeinen linearen Modell unter Verwendung von PROC MIXED („SAS Institute") mit der Behandlung, der Temperatur und der Zeit als die drei Faktoren analysiert. Die Annahmen des allgemeinen linearen Modells wurden getestet. Um die Schwankungen der Heterogenität zu korrigieren, wurden die Werte in ihren log10 plus 1 (log(x + 1)) überführt und die Behandlungen wurden für die Analyse in ähnlichen Schwankungsgruppen zusammengefasst. Die Mittelwerte wurden unter Verwendung eines paarweisen Vergleichs mit Sidak eingestellten p-Werten verglichen, so dass der experimentelle Fehler für die Vergleichskategorie 0,05 war. Um den Einfluss der Zeit oder der Temperatur auf die Behandlung der Phagen zu testen, wurde die Größe der Differenz zwischen der Phagen-Behandlung und der Kontrolle bei jeder Temperatur zu einer gegebenen Zeit gegen die Differenz für die anderen Temperaturen zur selben Zeit verglichen.
  • Teil 2: Die CFU Werte für 0, 3, 24, 48, 120 und 168 Stunden bei 10 und 20°C wurden mit einem Vier-Faktor allgemeinen linearen Modell unter Verwendung von PROC MIXED (SAS Institute) mit der Behandlung, der Temperatur und der Zeit als feste Faktoren und dem Experiment als Zufallsfaktor analysiert. Die Annahmen des allgemeinen linearen Modells wurden getestet. Um die Schwankungen der Heterogenität zu korrigieren, wurden die Werte in ihren log10 plus 1 (log(x + 1)) überführt und die Behandlungen wurden für die Analyse in ähnlichen Schwankungsgruppen zusammengefasst. Die Mittelwerte wurden unter Verwendung eines paarweisen Vergleichs mit Sidak eingestellten p-Werten verglichen, so dass der experimentelle Fehler für die Vergleichskategorie 0,05 war. Um den Einfluss der Zeit oder der Temperatur auf die Behandlung der Phagen zu testen, wurde die Größe der Differenz zwischen der Phagen-Behandlung und der Kontrolle bei 10°C wurde verglichen mit der Differenz für 20°C für jede Zeitperiode.
  • Resultate
  • a. Salmonella Wachstum auf Obst
  • Salmonella enteritidis überlebte bei 5°C und wuchs bei 10 und 20°C auf "Red Delicious" Apfelschnitzen (pH 4.1–4.7) sowie auf Honigmelonen-Scheiben (pH 5.7–5.9), die für 168 Stunden gelagert wurden. Wie erwartet wurde das stärkste Bakterienwachstum bei frisch geschnittenem Obst und bei 20°C beobachtet, mit einer rasch wachsenden Zahl an Bakterien binnen der ersten 24 Stunden nach der Beimpfung (um ca. 3.5 Zehnerpotenzen) sowohl bei Honigmelonen wie auch bei "Red Delicious" Äpfeln, und weiter steigend um zwei Zehnerpotenzen bei Honigmelonen. Im allgemeinen wuchs Salmonella besser an Honigmelonen als an Äpfeln, mit der stärksten beobachteten Differenz (ca. 2 Zehnerpotenzen) zwischen Gruppen, die für 168 Stunden bei 20°C inkubiert wurden. Bei geringerer Temperatur (4°C) stagnierten die Populationen und Salmonella wuchs an keiner der getesteten frischgeschnittenen Obstsorten merklich; auf Honigmelonen nahm die Bakterien-Population nach 120 Stunden sogar ab.
  • Mehrere Schritte wurden unternommen um zu verhindern, daß keine Wild-Typ Salmonella Zell-Linien (die zu Beginn auf der Obstoberfläche gewesen sein könnten) kultiviert wurden. Zum Beispiel: (i) die nichtgeschnittenen Oberflächen der Früchte wurden zu Beginn eines jeden Experiments mit 70%igem Ethanol gereinigt, und (ii) Rifampin (150 μg/ml) wurde dem entsprechenden Medium zugesetzt um sicherzustellen, daß nur die originale, Rifampin-resistente Test-Zell-Linie quantifiziert wurde. Zusätzlich wurden nach jedem Experiment 10–15 zufällig ausgewählte Kolonien durch RAPD und/oder PFGE analysiert, und die Muster wurden verglichen mit dem aus der Test-Zell-Linie S. enteritidis.
  • b. Phagenpersistenz auf Obst
  • Die Mischung von Salmonella enteritidis-spezifischen Phagen nahm auf Honigmelonen während einer Dauer von 168 Stunden kontinuierlich um etwa 3 Zehnerpotenzen ab. Dieser Abfall war vergleichbar für alle Temperaturen. Im Kontrast hierzu nahm die Phagenkonzentration auf Apfel-Scheiben nach 3 Stunden um etwa 6 Zehnerpotenzen ab, und der Phage konnte nach 24 Stunden bei 10 und 20°C sowie nach 48 Stunden bei 5°C nicht mehr detektiert werden. Um herauszufinden, ob die unterschiedliche Acidität von "Red Delicious" Äpfeln (pH 4.2) und Honigmelonen (pH 5.8) für diesen Unterschied verantwortlich war, bestimmten wir Phagen-Titer in Teilmengen von SCPLX-Präparationen, die bei 4°C und pH 4.2, bzw. 5.8 für 48 Stunden inkubiert wurden. Ungefähr viermal mehr Phagen wurden in den Teilmengen gefunden, die bei pH 5.8 inkubiert waren, als in denen, die bei pH 4.2 inkubiert waren (Daten nicht gezeigt).
  • c. Pathogen-Kontrolle durch die Behandlung mit Phagen
  • Die Bakterienzahl auf Honigmelonen war in den Phagen-Mischungs-behandelten Fällen durchgehend geringer (um etwa 3.5 Zehnerpotenzen) als bei den korrespondierenden Kontroll-Experimenten. Es gab hingegen keinen signifikanten Unterschied zwischen der Zahl an Salmonella auf den Apfelscheiben der Test- und Kontrollgruppen. Im allgemeinen war der Effekt der Phagen-Mischung über die Dauer der Experimente unabhängig von Temperatur und Zeit (siehe Tabelle 1, unten). Der einzige signifikante Effekt, der der Temperatur zugeschrieben werden muss, stellte sich 48 Stunden nach der Inkubation ein, wobei die Phagen-Mischung die S. enteritidis- Populationen auf Honigmelonen bei 10°C stärker unterdrückte als bei 20°C (siehe Tabelle 2, unten). Statistische Analysen der Unterschiede zwischen den Behandlungen bei unterschiedlichen Zeiten und Temperaturen ergaben keinen weiteren Effekt dieser Parameter auf die Phagen-Behandlung von Honigmelonen (siehe Tabelle 3, unten). Die Phagen-Empfindlichkeits-Tests an den Bakterien, die die Phagen-Behandlung überlebten, zeigten an, daß von diesen keine Resistenzen gegenüber Phagen in der SCPLX-Präparation entwickelt wurden.
  • Tabelle 1. Log(CFU) Mittelwert-Vergleich für Honigmelonen
    Figure 00440001
  • Tabelle 2. Vergleich von Behandlungsunterschieden bei unterschiedlichen Temperaturen und einer spezifischen Zeit an Honigmelonen
    Figure 00450001
  • Tabelle 3. Analyse der Varianz
    Figure 00460001
  • Hinterlegungsinformation
  • Sechs Bakteriophagen wurden nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. Diese Hinterlegungen wurden am 5. Januar 2001 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, getätigt. Die Bakteriophagen sind wie folgt identifiziert:
  • Phage
    • SA-36
    • SPT-1
    • MSP-71
    • LIST-3
    • ENT-7
    • ECO-9
  • Zum Zwecke der Klarheit und Verständlichkeit wurde die vorstehende Erfindung in einigen Teilen durch Illustrationen und Beispiele in Kombination mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben, wenngleich andere Aspekte, Vorteile und Modifizierungen einem Fachmann auf dem Gebiet dieser Erfindung offensichtlich sind. Die vorstehenden Beschreibungen und Beispiele wurden zur Illustration gewählt und nicht, um den Schutzbereich der Erfindung einzugrenzen. Modifizierungen der oben beschriebenen Methoden zur Ausführung der Erfindung, die Fachleuten in der Medizin, der Bakteriologie, der Infektionskrankheitskunde, der Pharmakologie und/oder verwandten Disziplinen offensichtlich sind, sollen ebenfalls unter den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen, die nur durch die angehängten Ansprüche limitiert sein soll.
  • Alle Publikationen und Patent-Anmeldungen, die in diesem Schriftstück vermerkt sind, zeigen den Stand der Technik für den Fachmann in dem Gebiet, aus dem die Anmeldung stammt, auf.

Claims (7)

  1. Verfahren zum Verpacken von Lebensmitteln, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: a) Bereitstellen eines Lebensmittels, b) Bereitstellen eines Verpackungsmaterials, welches mindestens einen Bakteriophagen enthält, und c) Verpacken des Lebensmittels mit dem Verpackungsmaterial.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verpackungsmaterial mit dem mindestens einen Bakteriophagen imprägniert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Bereitstellens des Verpackungsmaterials, das mindestens einen Bakteriophagen enthält, das Beschichten des Verpackungsmaterials mit dem mindestens einen Bakteriophagen aufweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verpackungsmaterial durch Besprühen des Verpackungsmaterials mit dem mindestens einem Bakteriophagen beschichtet wird.
  5. Verfahren zum Verpacken von Lebensmittel, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: a) Bereitstellen einer Lebensmittelverpackung, welche ein Lebensmittel enthält; und b) Einfügen einer Matrize, welche mindestens einen Bakteriophagen enthält, in die Verpackung.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Matrize eine biologisch abbaubare Matrize enthält, welche den mindestens einen Bakteriophagen in einem gewünschten Ausmaß freisetzt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Matrize eine Papierauflage oder ein Schwamm ist.
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