DE60102327T3 - Polymerabsorbentien und zugehöriges Herstellungsverfahren - Google Patents

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Marlin Kenneth Kinzey
John Joseph Maikner
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Description

  • Diese Erfindung betrifft neue makroporöse Polymere, die ausgewählte Porositäts- und Permeabilitätseigenschaften aufweisen, die harte Polymermatrices liefern, die zur Verwendung in der Mittel- und Hochdruck-Reversphasen-Flüssigchromatographie (RPC) geeignet sind. Die Polymere sind besonders nützlich als stationäre Phasen in Chromatographiesäulen in großem Maßstab, ohne dass sich bei andauernder Verwendung erhöhte Drücke entwickeln.
  • Stationäre Phasen, die nützlich sind bei der RPC, insbesondere im präparativen Modus mit hoher Leistung (wie demjenigen, der zur Trennung und Reinigung von Biomolekülen benötigt wird), müssen mechanisch steif sein, um den hohen Betriebsdrücken, die sich innerhalb der Chromatographiesäulen ausbauen, standzuhalten. Silica-Matrices, die für diese Anwendungen in der Vergangenheit breite Verwendung gefunden haben, weisen eine zufrieden stellende mechanische Steilheit auf; allerdings können Silica-Matrices nicht bei hohem pH betrieben werden, was ihre Verwendung in einer breiten Palette von Trennverfahren für Biomoleküle stark einschränkt. Dieser Faktor schränkt die Reinigungsmöglichkeiten, die demjenigen, der die Chromatographie durchführt, zur Verfügung stehen, ein und beeinträchtigt die Produktionslebensdauer von Silica-Medien (sie werden schneller abgebaut, weil sie nicht unter aggressiven Bedingungen gereinigt werden können), was zu einer schlechteren Gesamtwirtschaftlichkeit von kommerziellen Herstellungsprozessen führt.
  • Stationäre Phasen, die auf organischen Polymeren beruhen, können andererseits typischerweise über einen großen pH-Bereich betrieben werden, was eine stärkere Anwendbarkeit in Trennverfahren für Biomoleküle bedingt. Derjenige, der eine Chromatographie durchführt, hat die Möglichkeit, ein Verfahren bei hohem pH zu entwickeln, was Vorteile wie verbesserte Löslichkeits-, Selektivitäts- und Kapazitätseigenschaften des Trennmediums für bestimmte Moleküle bieten kann. Ferner können die polymeren Harze unter hohen pH-Bedingungen aggressiv gereinigt werden, was die Lebensdauer der Säule und dadurch auch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens verbessert. Allerdings sind heutige polymere stationäre Phasen komprimierbar bei Bedingungen mit mittlerem bis hohem Druck, wie sie in Hochleistungs-Biomolekül-Trennverfahren verwendet werden. Diese Komprimierbarkeit ist nachteilig für Trennverfahren, da sie die Spanne der möglichen Fließgeschwindigkeiten einschränkt, und der Integrität des Polymerbetts in der Säule abträglich ist. Zum Beispiel offenbaren die folgenden Referenzen Polymere, die bei Säulenbedingungen verwendet werden, die repräsentativ für einen analytischen Betrieb bei hohem Druck sind (Säulen mit einem inneren Durchmesser von weniger als 0,5 cm), wo ”Wandeffekte” dafür bekannt sind, dass sie die Komprimierbarkeit des Polymers minimieren; allerdings offenbaren diese Referenzen nicht den Betrieb in kommerziellen Chromatographiesäulen in größerem Maßstab und bei hohem Druck, bei denen man erwarten würde, dass sich aus der Polymerkomprimierbarkeit aufgrund der Abwesenheit von Wandeffekten ein zusätzlicher Druck aufbaut: Lloyd, L. L. und Warner, F. P., Preparative High Performance Liquid Chromatography on a Unique High-Speed Macroporous Resin, J. Chromatography, Band 512, S. 365–76 (1990); und Lloyd, L. L., Rigid Macroporous Copolymers as Stationary Phases in High Performance Liquid Chromatography, Review, J. Chromatography, Band 544, S. 201–217 (1991).
  • Herkömmliche makroporöse Copolymere, die durch Suspensionspolymerisierung von Divinylbenzol(DVB)-enthaltenden Monomergemischen in der Gegenwart eines Nicht-Lösungsmittels hergestellt wurden, stellen Polymere dar, die eine breite Spanne der Porengrößenverteilung und Oberfläche aufweisen. Zum Beispiel offenbart US-Patent Nr. 4,686,269 ein Verfahren zur Herstellung von Polymeren zur Verwendung in Flüssigchromatographiesäulen im analytischen Maßstab (innerer Durchmesser von 0,8 Zentimeter), die durchschnittliche Teilchendurchmesser von 0,5 bis 50 Mikrometer aufweisen und mindestens 60% polyvinylaromatisches Monomer enthalten, durch Polymerisierung der Monomere mit 50 bis 300% organischen Hilfslösungsmitteln, bezogen auf das Gesamtgewicht des Monomers; die Referenz offenbart kein Verfahren zur Herstellung von Polymeren, die ausgewählte Porositäts- und Permeabilitätseigenschaften aufweisen, die steife Polymermatrices liefern, die unter den Hochdruck-Verwendungsbedingungen, die in Chromatographiesäulen im Produktionsmaßstab, d. h. denjenigen, die einen inneren Durchmesser von 2 bis 100 Zentimetern, typischerweise von 5 bis 80 Zentimetern aufweisen, verbreitet sind.
  • Die Polymerkomprimierbarkeit übersetzt sich in gehemmten Fluss durch die Trennmedien, was zusätzlichen Gegendruck im Chromatographiesystem aufbaut und schließlich längere Zykluszeiten bewirkt. Es besteht ein Bedarf für eine polymere stationäre Phase, die ohne signifikante Kompression den mittleren bis hohen Betriebsdrücken, die unter typischen RPC-Verfahrensbedingungen aufgebaut werden, standhalten kann. Ferner ist es essentiell, dass die stationäre Phase auch zufrieden stellende Massentransfer- und Kapazitätseigenschaften für bestimmte Zielklassen von Biomolekülen aufweist, um die gewünschte Chromatographie-Leistung zu erhalten.
  • Das Problem, das von der vorliegenden Erfindung angegangen wurde, ist, eine makroporöse polymere stationäre Phase bereitzustellen, die für die Trennung und Aufreinigung von Biomolekülen geeignet ist und die gleichzeitig zufriedenstellende Druck- und Fließeigenschaften während der RPC liefert.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein makroporöses Polymer umfassend polymerisierte Monomereinheiten von (a) 50 bis 100 Gew.-% von einem oder mehreren polyvinylaromatischen Monomeren, und (b) Null bis 50 Gew.-% von einem oder mehreren einfach ungesättigten vinylaromatischen Monomeren; wobei das Polymer aufweist (i) eine Gesamtporosität von 0,7 bis 2 Kubikzentimeter pro Gramm; (ii) eine operative Mesoporosität von 0,7 bis 1,9 Kubikzentimeter pro Gramm; (iii) einen durchschnittlichen Teilchengrößedurchmesser von 2 bis 600 Mikrometer; (iv) eine Oberfläche von 200 bis 1500 Quadratmeter pro Gramm; (v) einen Strömungswiderstandswert von 700 bis weniger als 1.800 bei einem Druck von 10 bar und von 1.500 bis weniger als 7.000 bei einem Druck von 60 bar; und (vi) eine Gesamtinsulinkapazität von 75 bis 150 Gramm Insulin/Liter Polymer und eine dynamische Insulinkapazität von 60 bis 150 Gramm Insulin/Liter Polymer.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung das vorher erwähnte makroporöse Polymer, das aufweist (a) eine Oberfläche von 400 bis 1000 Quadratmeter pro Gramm; (b) eine operative Mesoporosität von 0,9 bis 1,4 Kubikzentimeter pro Gramm; (c) einen durchschnittlichen Teilchengrößedurchmesser von 10 bis 75 Mikrometer; (d) einen Strömungswiderstandswert von 700 bis weniger als 1.500 bei einem Druck von 10 bar und von 1.500 bis weniger als 5.000 bei einem Druck von 60 bar; und (e) eine Gesamtinsulinkapazität von 90 bis 150 Gramm Insulin/Liter Polymer und eine dynamische Insulinkapazität von 75 bis 150 Gramm Insulin/Liter Polymer.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines makroporösen Polymers wie in Anspruch 1 dargelegt, umfassend das Polymerisieren von Null bis 50 Prozent monovinylaromatischem Monomer und 50 bis 100 Prozent polyvinylaromatischem Monomer in der Gegenwart von 100 bis 170 Prozent eines Porogengemisches umfassend ein hydrophobes Porogen und ein hydrophiles Porogen, und 0,5 bis 10 Prozent Radikal-Polymerisierungsinitiator, in einer wässrigen Suspension; worin alle Prozentmengen sich auf das Gesamtgewicht des Monomers beziehen; und worin: (a) das hydrophile Porogen in einem Gewichtsverhältnis zum hydropohoben Porogen von größer als 1,2/1 bis 3/1 vorliegt; und (b) das hydrophile Porogen ausgewählt ist aus einem oder mehreren (C4-C10) Alkanolen und das hydrophobe Porogen ausgewählt ist aus einem oder mehreren (C7-C10) aromatischen Kohlenwasserstoffen und (C6-C12) gesättigten Kohlenwasserstoffen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zum Reinigen wässriger Lösungen von gemischten Biomolekülen, umfassend das in Kontakt bringen der wässrigen Lösung mit dem vorgenannten makroporösen Polymer in einer Flüssigchromatographiesäule mit einem inneren Durchmesser von 2 bis 100 Zentimetern, wobei die Säule bei einem Druck von 10 bis 100 bar betrieben wird.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Wir haben herausgefunden, dass neue makroporöse Polymere, die nützlich sind für die Trennung und Reinigung von Biomolekülen in großem Maßstab durch Hochdruck-Reversphasen-Flüssigchromatographie und die ausgewählte Porositäts- und Permeabilitätseigenschaften aufweisen, hergestellt werden können. Insbesondere haben wir herausgefunden, dass die Verwendung von spezifischen porogenen Lösungsmitteln in spezifischen Verhältnissen zu der Monomerphase unter spezifischen Polymerisierungsbedingungen unerwarteterweise die steifen Polymermatrices der vorliegenden Erfindung liefert. Die neuen makroporösen Polymere können ohne signifikante Komprimierbarkeit und ohne signifikanten Druckaufbau in der Hochdruck-RPC verwendet werden, wobei ein guter Durchsatz und gute Kapazitäten (dynamisch und im Gleichgewicht) für die Zielbiomoleküle aufrechterhalten werden.
  • Die folgenden Bezeichnungen, wie sie in der Beschreibung verwendet werden, sollen die folgenden Bedeutungen haben, es sei denn der Kontext weist eindeutig auf etwas anderes hin.
  • Der Begriff ”Alkyl(meth)acrylat” bezieht sich auf entweder den entsprechenden Acrylat- oder Methacrylatester; in ähnlicher Weise bezieht sich der Begriff ”(Meth)acryl-” auf entweder Acryl- oder Methacrylsäure und die entsprechenden Derivate, wie etwa Ester oder Amide. Alle Prozentzahlen, auf die Bezug genommen wird, werden, wenn nicht anders angegeben, in Gewichtsprozent (%) bezogen auf das Gesamtgewicht des beteiligten Polymers oder der beteiligten Zusammensetzung, ausgedrückt. Der Begriff ”Copolymer” bezieht sich auf Polymerzusammensetzungen, die Einheiten von zwei oder mehr verschiedenen Monomeren, einschließlich Positionsisomeren, enthalten. Die folgenden Abkürzungen werden hier verwendet: = Gramm, ppm = Teile pro Million in Gewicht/Volumen, cm = Zentimeter, mm = Millimeter, ml = Milliliter, L = Liter. Wenn nicht anders angegeben, sind die angegebenen Bereiche als einschließlich und kombinierbar zu lesen und Temperaturen sind in Grad Celcius (°C) angegeben.
  • Die makroporösen Polymere, die nützlich sind als stationäre Phasen in der RPC, weisen eine erhöhte strukturelle Stefheit verglichen mit existierenden Materialien auf, was die Polymere nützlich für die Verwendung in Herstellungsverfahren im kommerziellen Maßstab macht. Die erhöhte strukturelle Steifheit wurde erreicht durch Modifikation der Struktur der Polymermatrix durch die Verwendung von ausgewählten Polymerisierungsbedingungen.
  • Das Modifizieren der Porosität der Polymermatrix ist bedeutend für die Herstellung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung. Um bei der Trennung von großen Biomolekülen wirksam zu sein, weist eine stationäre Phase bevorzugt eine offene, poröse Struktur auf, die die rasche Diffusion von Molekülen in die Matrix hinein und aus der Matrix heraus ermöglicht. Zusätzlich bietet ein hohes Maß an Porosität eine große Oberfläche, die wiederum eine hohe Kapazität der Matrix für das Zielmolekül liefert. Die modernsten kommerziellen polymeren stationären Phasen für die RPC scheinen im Hinblick auf diese Kriterien entwickelt zu sein, und werden bei Bedingungen mit geringerem Druck verwendet (typischerweise von 1 bar bis weniger als 10 bar und bevorzugt von 1 bis 5 bar; 1 bar Druck = 105 Pascal oder 105 Pa). Allerdings sind diese Matrizen bei Bedingungen mit höherem Druck (typischerweise von 10 bar bis 100 bar) komprimierbar. Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung weisen eine erhöhte Polymersteifheit und gleichzeitig eine beibehaltene hohe Kapazität und eine rasche intrapartikuläre Diffusion für die Zielmoleküle auf.
  • Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Reinigung von Biomolekülgemischen, die in wässrigen Lösungen gelöst sind, durch in Kontakt bringen der Lösung mit dem makroporösen Polymer in einer Flüssigchromatographiesäule mit einem inneren Durchmesser von 2 bis 100, bevorzugt von 5 bis 80 und besonders bevorzugt von 10 bis 50 Zentimetern, wobei die Säule bei einem Druck von 10 bis 100 und bevorzugt von 20 bis 80 bar betrieben wird. Typischerweise wird die RPC im präparativen Maßstab in 10 bis 50 Zentimeter Chromatographiesäulen bei einem Druck von 20 bis 80 bar betrieben.
  • Ausgewählte Polymerisierungsbedingungen stellen einen wichtigen Faktor für die Herstellung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung dar. Ausgewählte Verhältnisse von gemischtem Porogen zur Monomerphase, ebenso wie das Verhältnis von hydrophilem Porogen zum hydrophoben Porogen sind die Schlüsselparameter, von denen angenommen wird, dass sie die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung liefern.
  • Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, glauben wir, dass im Falle der vorliegenden Erfindung die Dichte der Polymermatrix verändert ist, um mehr festes Polymer pro Volumeneinheit des Gesamtpolymers zu erlauben, wodurch die Matrixsteifheit erhöht wird, mit einer folglicherweise erhöhten Kapazität für Zielmoleküle. Es wird angenommen, dass die bestimmte Auswahl der Menge des Porogens im Verhältnis zum Monomer und das Gleichgewicht von hydrophoben und hydrophilen Porogentypen die Porengrößenverteilung in einer Weise beeinflusst, die günstig für das Binden der Zielmoleküle (in diesem Falle Biomoleküle) ist, während gleichzeitig eine verbesserte Matrixsteifheit geliefert wird.
  • Quervernetzte makroporöse Copolymere der vorliegenden Erfindung sind typischerweise sphärische Copolymerkügelchen, die durchschnittliche Teilchengrößedurchmesser von 2 bis 600 Mikrometer (μm) aufweisen. Polymere, die nützlich für die Trennung und Reinigung von Biomolekülen durch Hochleistungs-Reversphasen-Flüssigchromatographie sind (wie etwa in Säulen mit einem Durchmesser von 2 bis 100 cm) weisen typischerweise durchschnittliche Teilchengrößedurchmesser von 2 bis 150, bevorzugt von 5 bis 100, besonders bevorzugt von 10 bis 75 und am meisten bevorzugt von 10 bis 30 μm auf. Polymere, die nützlich sind für die Trennung und Isolierung von Biomolekülen durch Absorptionsprozesse im großen Maßstab (wie solche in Säulen mit einem Durchmesser von bis zu mehreren Metern oder in Fermentationsbrühen) weisen typischerweise durchschnittliche Teilchengrößedurchmesser von mehr als 150 bis zu 600, bevorzugt von 200 bis 500 und besonders bevorzugt von 250 bis 400 μm auf.
  • Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung werden typischerweise durch Suspensionspolymerisierung hergestellt und besitzen Oberflächen von 200 bis 1500, bevorzugt von 300 bis 1200 und besonders bevorzugt von 400 bis 1000 Quadratmetern pro Gramm (m2/g). Die makroporösen Polymere sind bevorzugt von dem Typ, der zum Beispiel in US Patent-Nr. 4,382,124 beschrieben wird, in dem die Porosität in die Copolymerkügelchen eingeführt wird durch Suspensionspolymerisierung in Gegenwart eines Porogens (auch bekannt als ”Phasenausweiter” oder ”Präzipitationsmittel”), d. h. einem Lösungsmittel für das Monomer, aber einem Nichtlösungsmittel für das Polymer. Herkömmliche makroporöse Polymere, wie die, die nach US Patent-Nr. 4,382,124 hergestellt werden, umfassen typischerweise die Verwendung einer großen Auswahl von Porogentypen, Porogenkonzentrationen im Verhältnis zu der Monomerphase, Monomertypen, Quervernetzungsmonomertypen, Quervernetzermengen, Polymerisierungsinitiatoren und Initiatorkonzentrationen. Dagegen beruht die vorliegende Erfindung auf dem Befund, dass makroporöse Polymere, die unter Verwendung von bestimmten ausgewählten Porogentypen, die in spezifischen Konzentrationen im Verhältnis zur Monomerphase eingesetzt wurden, mit spezifischen Monomeren und ausgewählten Graden der Quervernetzung, zusammen mit ausgewählten Polymerisierungsinitiator-Konzentrationen, hergestellt wurden, unerwartet steife Polymerstrukturen aufweisen, die mit einer verbesserten Leistung in der Trennung und Reinigung von Biomolekülen durch Hochleistungs-Reversphasen-Flüssigchromatographie einhergehen.
  • Geeignete polyvinylaromatische Monomere, die verwendet werden können in der Herstellung der makroporösen Polymere, die nützlich sind in der vorliegenden Erfindung, schließen zum Beispiel ein eines oder mehrere Monomere ausgewählt aus Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Divinyltoluol, Divinylnaphthalen, Divinylanthracen und Divinylxylol; es versteht sich, dass jedes der verschiedenen Positionsisomere von jedem der vorher erwähnten Quervernetzer geeignet ist; bevorzugt handelt es sich bei dem polyvinylaromatischen Monomer um Divinylbenzol. Typischerweise umfasst das makroporöse Polymer 50 bis 100%, bevorzugt 65 bis 100% und besonders bevorzugt 75 bis 100% polyvinylaromatische Monomereinheiten.
  • Gegebenenfalls können zusätzlich zum polyvinylaromatischen Quervernetzer aliphatische quervernetzende Monomere, wie etwa Ethylenglycoldiacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Trimethylolpropantriacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Glyzidylmethacrylat, Diethylenglykoldivinylether und Trivinylcyclohexan verwendet werden. Wenn sie verwendet werden, umfassen die aliphatischen quervernetzenden Monomere typischerweise als polymerisierte Einheiten von 0 bis 20%, bevorzugt von 0 bis 10% und besonders bevorzugt von 0 bis 5% des makroporösen Polymers, bezogen auf das Gesamtgewicht des Monomers, das verwendet wird, um das makroporöse Copolymer zu bilden.
  • Geeignete einfach ungesättigte vinylaromatische Monomere, die zur Herstellung der makroporösen Copolymere verwendet werden können, die nützlich sind in der vorliegenden Erfindung, schließen zum Beispiel ein Styrol, α-Methylstyrol, (C1-C4)alkyl-substituierte Styrole, Halo-substituierte Styrole (wie etwa Dibromostyrol und Tribromostyrol), Vinylnaphthalen und Vinylanthracen; bevorzugt ist das einfach ungesättigte vinylaromatische Monomer ausgewählt aus einem oder mehreren von Styrol und (C1-C4)alkyl-substituierten Styrolen. Eingeschlossen in die geeigneten (C1-C4)alkyl-substituierten Styrole sind zum Beispiel Ethylvinylbenzole, Vinyltoluole, Diethylstyrole, Ethylmethylstyrole und Dimethylstyrole; es versteht sich, dass jedes der verschiedenen Positionsisomere von jedem der vorher erwähnten vinylaromatischen Monomere geeignet ist; bevorzugt handelt es sich bei dem einfach ungesättigten vinylaromatischen Monomer um Ethylvinylbenzol. Typischerweise umfasst das makroporöse Polymer 0 bis 50%, bevorzugt 0 bis 35% und besonders bevorzugt 0 bis 25% einfach ungesättigte vinylaromatische Monomereinheiten.
  • Gegebenenfalls können zusätzlich zum vinylaromatischen Monomer nicht-aromatische Vinyl-Monomere, wie etwa aliphatische ungesättigte Monomere, zum Beispiel Vinylchlorid, Acrylonitril, (Meth)acrylsäure und Alkylester von (Meth)acrylsäuren (Alkyl(meth)acrylate) verwendet werden. Wenn sie verwendet werden, umfassen die nicht-aromatischen Vinylmonomere typischerweise als polymerisierte Einheiten von 0 bis 20%, bevorzugt von 0 bis 10% und besonders bevorzugt von 0 bis 5% des makroporösen Copolymers, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomere, die verwendet wurden, um das makroporöse Copolymer zu bilden.
  • Bevorzugte makroporöse Polymere sind ausgewählt aus einem oder mehreren von Divinylbenzol-Copolymer, Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, Divinylbenzol-Ethylvinylbenzol-Copolymer und Styrol-Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol-Copolymer; besonders bevorzugt sind Divinylbenzol-Ethylvinylbenzol- und Styrol-Ethylvinylbenzol-Divinylbenzol-Polymere.
  • Porogene, die nützlich sind für die Herstellung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung schließen ein hydrophobe Porogene, wie etwa (C7-C10) aromatische Kohlenwasserstoffe und (C6-C12) gesättigte Kohlenwasserstoffe; und hydrophile Porogene, wie etwa (C4-C10) Alkanole und Polyalkylenglykole. Geeignete (C7-C10) aromatische Kohlenwasserstoffe schließen zum Beispiel ein eines oder mehrere von Toluol, Ethylbenzol, Ortho-Xylol, Meta-Xylol und Para-Xylol; es versteht sich, das jedes der verschiedenen Positionsisomere von jedem der vorher erwähnten Kohlenwasserstoffe geeignet ist. Bevorzugt ist der aromatische Kohlenwasserstoff Toluol oder Xylol oder ein Gemisch von Xylolen oder ein Gemisch von Toluol und Xylol. Geeignete (C6-C12) gesättigte Kohlenwasserstoffe schließen zum Beispiel ein eines oder mehrere von Hexan, Heptan und Isooctan; bevorzugt ist der gesättigte Kohlenwasserstoff Isooctan. Geeignete (C4-C10) Alkanole schließen zum Beispiel ein eines oder mehrere von Isobutylalkohol, tert-Amylalkohol, N-Amylalkohol, Isoamylalkohol, Methylisobutylcarbinol (4-Methyl-2-Pentanol), Hexanole und Oktanole; bevorzugt ist das Alkanol ausgewählt aus einem oder mehreren (C5-C8) Alkanolen, wie etwa Methylisobutylcarbinol und Octanol. Bevorzugt umfasst das Porogengemisch ein hydrophiles Porogen ausgewählt aus einem oder mehreren (C5-C8) Alkanolen und ein hydrophobes Porogen ausgewählt aus einem oder mehreren (C7-C10) aromatischen Kohlenwasserstoffen.
  • Typischerweise liegt die Gesamtmenge des Porogens, das verwendet wird, um die Polymere der vorliegenden Erfindung herzustellen, bei 100 bis 170%, bevorzugt von 110 bis 160%, besonders bevorzugt von 115% bis 150% und am meisten bevorzugt von 120 bis 140%, bezogen auf das Gewicht der Monomere. Bei Porogenmengen über 170% weisen die Polymere geringe Strömungswiderstandswerte (hohe Komprimierbarkeit) bei Hochdruckbedingungen in gepackten Säulen auf; bei Porogenmengen unter 100% weisen die Polymere schlechte chromatographische Eigenschaften auf (wie gemessen durch die Insulinkapazität in Säulen-Durchflusstests). Ferner beruhen die Porogene, die verwendet werden, um die Polymere der vorliegenden Erfindung herzustellen, auf einem gemischten Lösungsmittelsystem, umfassend ein hydrophobes Lösungsmittel (”hydrophobes” Porogen) und ein weniger hydrophobes Lösungsmittel (”hydrophiles” Porogen). Es versteht sich, dass das hydrophile Porogen eine etwas eingeschränkte Wasserlöslichkeit aufweist (z. B. 0,5 bis 5%) und wasserlöslicher ist als das hydrophobe Porogen (typische Wasserlöslichkeit von 10 bis 100 ppm oder weniger).
  • Typischerweise liegt das Verhältnis von hydrophilem Porogen zu hydrophobem Porogen von größer als 1,2/1 bis 3/1, bevorzugt von 1,3/1 bis 2,7/1, besonders bevorzugt von 1,4/1 bis 2,5/1 und am meisten bevorzugt von 1,6/1 bis 2,4/1. Bei Verhältnissen von hydrophilem zu hydrophobem Porogen von etwa 1,2/1 und weniger weisen die Polymere, die eine akzeptable Strömungswiderstandsleistung aufweisen, auch eine geringere chromatographische Leistung auf (gemessen durch einen eingeschränkten Stoffaustauschzugang im Insulinkapazitätstest). Bei Verhältnissen von hydrophilem zu hydrophobem Porogen über 3/1 würden die Polymere eine verringerte Gesamtkapazitätsleistung aufweisen (gemessen durch verringerte Mengen von Insulin, die während des Säulenflusstests sorbiert werden). Typischerweise umfassen die gemischten Porogene einen (C7-C10) aromatischen Kohlenwasserstoff und ein (C4-C10) Alkanol; bevorzugt umfassen die gemischten Porogene Xylole und Methylisobutylcarbinol.
  • Polymerisierungsinitiatoren, die nützlich sind in der Herstellung von Polymeren der vorliegenden Erfindung, schließen ein Monomer-lösliche Initiatoren wie etwa Peroxide, Hydroperoxide und verwandte Initiatoren; z. B. Benzoylperoxid, tert-Butylhydroperoxid, Cumolperoxid, Tetralinperoxid, Acetylperoxid, Caproylperoxid, tert-Butylperoctoat (auch bekannt als tert-Butylperoxy-2-ethylhexanoat), tert-Amylperoctoat, tert-Butylperbenzoat, tert-Butyldiperphthalat, Dicyclohexylperoxydicarbonat, Di(4-tert-butylcyclohexyl)-peroxydicarbonat und Methylethylketonperoxid. Auch nützlich sind Azo-Initiatoren wie etwa Azodiisobutyronitril, Azodiisobutyramid, 2,2'-Azo-bis(2,4-dimethylvaleronitril), Azo-bis-(α-methylbutyronitril) und Dimethyl-, Diethyl- oder Dibutyl-azo-bis(methylvalerat). Bevorzugte Peroxid-Initiatoren sind Diacylperoxide wie etwa Benzoylperoxid und Peroxyester wie etwa tert-Butylperoctoat und tert-Butylperbenzoat; besonders bevorzugt ist der Initiator Benzoylperoxid. Geeignete Verwendungsmengen des Peroxid-Initiators sind 0,5% bis 10%, bevorzugt von 1 bis 9%, besonders bevorzugt von 2 bis 7% und am meisten bevorzugt von 3 bis 5%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Vinylmonomere. Am meisten bevorzugt liegt der Radikalinitiator in Mengen von 2 bis 7% vor, bezogen auf das Gesamtgewicht des Monomers, und ist ausgewählt aus einem oder mehreren Diacylperoxiden und Peroxyestern.
  • Dispersions- und Suspensionsmittel, die nützlich sind für die Herstellung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung sind nichtionische Oberflächen-aktive Mittel, die ein Hydroxyalkylzellulose-Grundgerüst, eine hydrophobe Alkylseitenkette, die von 1 bis 24 Kohlenstoffatome enthält, und im Durchschnitt von 1 bis 8, bevorzugt von 1 bis 5, Ethylenoxidgruppen, die jede sich wiederholende Einheit des Hydroxyalkylzellulose-Grundgerüsts substituieren, aufweisen, wobei die Alkylseitenketten in einer Menge von 0,1 bis 10 Alkylgruppen pro 100 sich wiederholende Einheiten in dem Hydroxyalkylzellulose-Grundgerüst vorliegen. Die Alkylgruppe in der Hydroxyalkylzellulose kann von 1 bis 24 Kohlenstoffe enthalten und kann linear, verzweigt oder zyklisch sein. Besonders bevorzugt ist eine Hydroxyethylzellulose, die von 0,1 bis 10 (C16)Alkylseitenketten pro 100 AnhydroglukoseEinheiten und von etwa 2,5 bis 4 Ethylenoxidgruppen, die jede Anhydroglukose-Einheit substituieren, enthält. Typische Verwendungsmengen der Dispersionsmittel liegen bei etwa 0,01 bis etwa 4%, bezogen auf das Gesamtgewicht der wässrigen Phase.
  • Andere Dispersions- und Suspensionsmittel, die nützlich sind für die Herstellung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung, sind Polymere, die hydrophile Grundgerüste enthalten, die ihre lipophilen Anteile zu der Monomerphase und ihre hydrophilen Anteile zu der wässrigen Phase an der Trennfläche der beiden Phasen orientieren können. Diese polymeren Dispersionsmittel schließen ein Zellulosen, Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylalkohole, Stärken u. ä. Es können auch Gemische von Dispersionsmitteln verwendet werden. Diese anderen Dispersionsmittel werden eher nicht bevorzugt, da sie dazu neigen, eine etwas größere Menge von agglomeriertem oder anderweitig unerwünschtem Material zu produzieren.
  • Eine typische Herstellung eines makroporösen Copolymers kann z. B. einschließen Herstellung einer kontinuierlichen wässrigen Phaselösung enthaltend Suspensionsmittel (wie etwa Dispersionsmittel, Schutzkolloide und Puffer) gefolgt von Mischen mit einem Monomergemisch, das 50 bis 100% polyvinylaromatisches Monomer, Radikalinitiator und 1 bis 1,7 Teile gemischtes Porogen (hydrophobes und hydrophiles Porogen) pro Teil Monomergemisch enthält. Die Kombination aus Monomer und gemischtem Porogen wird dann bei erhöhter Temperatur polymerisiert (typischerweise bei 40 bis 120°C, bevorzugt 60 bis 100°C; zum Beispiel für 1 bis 20 Stunden, bevorzugt 3 bis 15 Stunden) und die Porogene werden anschließend aus den sich bildenden Polymerkügelchen durch verschiedene Methoden entfernt; z. B. können Toluol, Xylol und (C4-C10)-Alkohole durch Destillation oder Waschen mit Lösungsmittel und Polyalkylenglykole durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Das sich bildende makroporöse Copolymer wird dann auf herkömmliche Weise, wie etwa durch Entwässern gefolgt von Trocknen, isoliert.
  • Gegebenenfalls kann die Herstellung der makroporösen Polymere eine Enzymbehandlung einschließen, um die Polymeroberfläche von Rückständen der Dispersions- und Suspensionsmittel, die während der Polymerisierung verwendet wurden, zu reinigen. Die Enzymbehandlung umfasst typischerweise das in Kontakt bringen des makroporösen Polymers mit dem enzymatischen Material (ausgewählt aus einem oder mehreren von Zelluloseabbauendem Enzym und proteolytischem Enzym) während oder nach der Polymerisierung oder nach der Isolierung des Polymers. Die japanischen Patentanmeldungen Nr. 61-141704 und Nr. 57-98504 können für weitere allgemeine und spezifische Details zur Verwendung von Enzymen während der Herstellung von Polymerharzen hinzugezogen werden. Geeignete Enzyme schließen z. B. ein Zellulose-abbauende Enzyme, wie etwa β-1,4-Glucan-4-glucanohydrase, β-1,4-Glucan-4-glucanhydrolase, β-1,4-Glucan-4-Glucohydrase und β-1,4-Glucan-4-Cellobiohydrase für Dispersionssysteme, die auf Zellulose beruhen; und proteolytische Enzyme, wie etwa Urokinase, Elastase und Enterokinase, für Dispersionssysteme, die auf Gelatine beruhen. Typischerweise beträgt die Menge des verwendeten Enzyms im Verhältnis zum Polymer von 2 bis 35%, bevorzugt von 5 bis 25% und besonders bevorzugt von 10 bis 20%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Polymers.
  • Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich in gepackten Chromatographiesäulen-Anwendungen, wo die Porosität und mechanische Stärke des Polymers eine Hochleistungstrennung und -reinigung von Biomolekülen bei hohen Durchsatzraten erlaubt, ohne dass sich bei andauernder Verwendung Druck aufbaut.
  • Gegebenenfalls können die makroporösen Polymere durch bekannte Verfahren, wie etwa herkömmliche Sulfonierung, Chloromethylierung und Aminierung, mit verschiedenen herkömmlichen ionisierbaren funktionellen Gruppen (schwach saure funktionelle Gruppe, wie etwa eine Carbonsäuregruppe; schwach basische funktionelle Gruppe, wie etwa eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amin-funktionelle Gruppe; stark saure funktionelle Gruppe, wie eine Sulfonsäuregruppe; eine stark basische funktionelle Gruppe, wie etwa quaternäres Ammoniumchlorid oder Hydroxylgruppe) beschichtet oder nachfunktionalisiert werden.
  • Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung sind gekennzeichnet durch eine verbesserte Permeabilität (geringer Strömungswiderstand), was das Ergebnis einer verstärkt steifen Polymerstruktur und der ausgewählten Porosität ist, die während der Polymerisierung in das Polymer eingeführt wurden. Die Permeabilität (K) verhält sich zum Rückdruck, der in einer Säule aufgebaut wird, durch Darcys Gesetz (Gleichung 1): ΔP = μV/[K(dp)2] Gleichung 1 wobei:
    • μ
    = Viskosität (Millipascal·Sekunde oder Centipoise)
    V
    = lineare Geschwindigkeit (cm/hr)
    ΔP
    = Druckabfall (bar)
    dp
    = mittlere Teilchengröße des Polymers (Mikrometer)
  • Die Einheiten der oben angegebenen Variablen werden in ihrer üblichen Form angegeben; es versteht sich, dass eine Einheiten-Umwandlung erforderlich ist, um die Gleichung 1 dimensionslos zu machen. Je steifer (d. h. je weniger komprimierbar) das Polymer ist, desto größer ist die Permeabilität des Polymers, was sich umsetzt in einen geringeren Rückdruck für jede Kombination aus Lösungsmittelviskosität, linearer Geschwindigkeit und Teilchengröße. Unter laminaren Flussbedingungen, die typisch für chromatographische Trenn- und Reinigungsanwendungen sind, kann der Rückdruck in einer Säule auch ausgedrückt werden durch die Carman-Kozeny-Gleichung (Gleichung 2): ΔP = 150·[(1 – ε)2/ε3]·μV/(dp)2 Gleichung 2 wobei ε = interpartikuläres Hohlraumvolumen (cm3/cm3)
  • Verweise, wie etwa Fundamentals of Preparative and Nonlinear Chromatography, G. Guiochon, S. Goshan Shirazi und A. Katti; Academic Press (1994) und Unit Operations in Chemical Engingeering, W. L. McCabe, J. C. Smith und P. Harriott; McGraw Hill (1985), können für weitere allgemeine und spezifische Details zu Darcy's Gesetz und zur Carman-Kozeny-Gleichung (Gleichungen 1 und 2) hinzugezogen werden.
  • Durch die Kombination der Gleichungen 1 und 2 kann erkannt werden, dass die Permeabilität (oder Strömungswiderstand) in der Chromatographiesäule mit dem interpartikulären Hohlraumvolumen des Polymerharzbettes (d. h. dem Volumen zwischen den Polymerteilchen) zusammenhängt; e wird ausgedrückt als Hohlraumvolumen pro Volumeneinheit des Polymerbettes. Diese Beziehung wird ausgedrückt durch Gleichung 3: 1/K = 150·[(1 – ε)2/ε3] Gleichung 3
  • Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung definieren wir, dass der charakteristische ”Strömungswiderstands”-Wert eines Polymers der Kehrwert der Permeabilität ist. Der charakteristische ”Strömungswiderstands”-Wert ist ein Indiz dafür, wie sich das Polymer unter mittleren bis Hochdruckbedingungen verhalten wird: Geringe Strömungswiderstands-Werte stellen geringe Komprimierbarkeit und hohe Strömungswiderstands-Werte stellen unzulängliche Komprimierbarkeit dar.
  • Ferner schließen nach Darcy's Gesetz die Ausdrücke entweder für die Permeabilität oder für den Strömungswiderstand üblicherweise den Teilchengrößeeffekt ein (dp in Gleichung 1). Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen verbesserten Strömungswiderstand durch eine erhöhte Polymersteüheit zu liefern, unabhängig von Teilchengröße-Effekten. Es versteht sich, dass eine verringerte Teilchengröße alleine für ein bestimmtes Polymer höhere Gegendrücke aufbauen würde, wie in Gleichungen 1 und 2 angegeben.
  • Typischerweise weisen die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung Strömungswiderstandswerte (d. h. 1/K) von 700 bis weniger als 1.800, bevorzugt von 700 bis weniger als 1.500 und besonders bevorzugt weniger als 1.300 bei Betriebsdrücken von 10 bar (mittlerer Druck) auf. Beim Hochdruckbetrieb (dargestellt durch 60 bar) weisen die makroporösen Polymere Strömungswiderstandswerte von 1.500 bis weniger als 7.000, bevorzugt von 1.500 bis weniger als 5.000 und besonders bevorzugt weniger als 4.500 auf. Makroporöse Polymere, die geeignet sind für die Verwendung in RPC, weisen Strömungswiderstandswerte von (i) weniger als 1.800 bei einem Druck von 10 bar und (ii) weniger als 7.000 bei einem Druck von 60 bar auf. Polymere, die höhere Strömungswiderstandswerte als die oben angegebenen Grenzen aufweisen, liefern keinen ausreichenden Komprimierungswiderstand bei mittleren bis hohen Drücken, wie sie in kommerziellen RPC-Säulen vorkommen und leiden daher unter verringertem Durchsatz und dem Aufbau von Säulendruck während des Betriebs.
  • Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung sind gekennzeichnet durch ausgewählte Porositäten und Porengrößenverteilungen, die zustande kommen durch die Porogenarten und -verhältnisse, die verwendet werden, um die Polymere herzustellen. Die Porositäten wurden bestimmt unter Verwendung eines MicromereticsTM ASAP-2400 Stickstoff-Porosimeters. Porositäten nach der IUPAC-Nomenklatur sind wie folgt:
    Mikroporosität = Poren kleiner als 20 Ångstrom-Einheiten
    Mesoporosität = Poren zwischen 20 und 500 Ångstrom-Einheiten
    Makroporosität = Poren größer als 500 Ångstrom-Einheiten
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die ”operative” Mikroporosität definiert als Poren, die einen Durchmesser von weniger als 50 Ångstrom-Einheiten aufweisen und die ”operative” Mesoporosität wird definiert als Poren, die einen Durchmesser zwischen 50 und 500 Ångstrom-Einheiten aufweisen. Der geringfügige Unterschied zwischen ”operativer” Porosität, wie es hier verwendet wird, und der Porosität, die nach der IUPAC-Nomenklatur definiert ist, beruht auf der Tatsache, dass 50 Ångstrom-Einheiten (verglichen mit 20 Ångstrom-Einheiten) eine besser geeignete und angemessenere Grenze sind, um die Sorption der Biomoleküle von Interesse in die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung anzupassen.
  • Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise eine Gesamtporosität von 0,7 bis 2, bevorzugt von 0,9 bis 1,8 und besonders bevorzugt von 1,0 bis 1,7 cm3/g auf. Typischerweise weisen die makroporösen Polymere eine operative-Mesoporosität von 0,7 bis 1,9, bevorzugt von 0,8 bis 1,7 und besonders bevorzugt von 0,9 bis 1,4 cm3/g auf. Typischerweise weisen die makroporösen Polymere eine operative Mikroporosität von Null bis 0,5, bevorzugt von Null bis 0,3, besonders bevorzugt von Null bis 0,2 und am meisten bevorzugt von Null bis weniger als 0,1 cm3/g auf. Typischerweise weisen die makroporösen Polymere eine Makroporosität von Null bis 0,6, bevorzugt von Null bis 0,5 und besonders bevorzugt von Null bis 0,3 cm3/g auf. Makroporositätswerte über etwa 0,6 cm3/g verringern die Arbeitsleistung des Polymers für Biomoleküle mit der angestrebten molekularen Größe und Form bezogen auf die Gesamtleistung.
  • Die Insulinkapazität wird verwendet als Indikator für die Eignung einer Polymermatrix als geeignetes Medium zur Trennung und Reinigung von Biomolekülen mit ähnlicher Größe und molekularer Konfiguration im großen Maßstab. Die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise eine dynamische Insulinkapazität von 60 bis 150 g/l, bevorzugt von 70 bis 150 g/l und besonders bevorzugt von 75 bis 150 g/l auf. Typischerweise weisen die makroporösen Polymere eine Gesamtinsulinkapazität von 75 bis 150 g/l, bevorzugt von 80 bis 150 g/l und besonders bevorzugt von 90 bis 150 g/l auf. Die dynamische Kapazität ist ein Maßstab dafür, wie schnell die Polymermatrix in der Lage ist, das Biomolekül aufzunehmen und ist definiert als die Insulinkapazität am Durchbruchspunkt, bei dem 1% Verlust (im Verhältnis zum gesamten Insulin, das an das Polymer sorbiert ist) auftritt. Die Insulinkapazität ist definiert in g/l, d. h. Gramm Insulin pro Liter Polymerharz. Makroporöse Polymere der vorliegenden Erfindung, die geeignet sind zur Verwendung in der präparativen Hochleistungs-Chromatographie von Biomolekülen in großem Maßstab weisen typischerweise eine Kombination von dynamischen und Gesamtinsulinkapazitätswerten von 60 bzw. 75 g/l auf; bevorzugt 70 bzw. 80 g/l; und besonders bevorzugt 75 bzw. 90 g/l.
  • Die Gesamtkapazität des Polymerharzes für ein bestimmtes Biomolekül (z. B. Insulin) ist entscheidend, da sie zu der Masse des bestimmten Moleküls, die während des Reinigungsvorgangs auf die Säule geladen werden kann, im Verhältnis steht. Die primären wirtschaftlichen Faktoren, die für das Reinigungsverfahren bedeutend sind (Säulendurchsatz, Lösungsmittelverwendung, Arbeitsaufwand oder Zeitzyklus) stehen im direkten Verhältnis zur Menge der Masse, die auf die Säule geladen wird.
  • Die dynamische Kapazität des Polymerharzes ist bedeutend, da sie im Verhältnis zur Massenübertragungseffizienz des Polymers für das bestimmte Molekül steht und den Zeitrahmen vorgibt, in dem die Reinigung stattfinden kann. Eine geringe dynamische Kapazität weist darauf hin, dass die Polymermatrix nicht geeignet ist für Hochgeschwindigkeitsreinigungsverfahren.
  • Manche Ausführungsformen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen detailliert beschrieben. Alle Verhältnisse, Teile und Prozentangaben sind, wenn nicht anders angegeben, ausgedrückt als Gewichtsangaben, und alle Reagenzien sind von guter kommerzieller Qualität, wenn nicht anders angegeben. Abkürzungen, die in den Beispielen und Tabellen verwendet werden, sind im Folgenden mit den jeweiligen Beschreibungen angegeben:
    • MIBC
    = Methylisobutylcarbinol (4-Methyl-2-pentanol)
    DVB
    = Divinylbenzol (Gemisch von Meta-/Paraisomeren)
    EVB
    = Ethylvinylbenzol (Gemisch von Meta-/Paraisomeren)
    BPO
    = Benzoylperoxid
    rpm
    = Umdrehungen pro Minute
    v/v
    = Volumen/Volumen
    w/v
    = Gewicht/Volumen
    μm
    = Mikrometer
    nm
    = Nanometer
    g/l
    = Gramm/Liter
    cm3/g
    = Kubikzentimeter pro Gramm
    μl
    = Mikroliter
    NA
    = nicht analysiert
  • BEISPIEL 1
  • Dieses Beispiel stellt die Herstellung eines makroporösen Polymers der vorliegenden Erfindung dar.
  • In einem 1-Liter Becherglas wurde eine organische Monomerphase durch die Kombination der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt: 180 g Divinylbenzol-Gemisch (80% DVB/20% EVB), 73 g Ortho-Xylol, 147 g MIBC und 10,6 g BPO (75% Reinheit, 25% Wasser). Diese Mengen entsprechen 122% gemischtem Porogen (bezogen auf das Gesamtmonomer), einem Verhältnis von hydrophilem Porogen zu hydrophobem Porogen von 2,0, und 4,5% Radikalinitiator, BPO (bezogen auf das Gesamtmonomer). Dieses Gemisch wurde für 20 Minuten in einer Stickstoff-Atmosphäre gerührt.
  • In einem 2-Liter 4-Hals-Reaktionskolben ausgestattet mit einem Kondensator, einem mechanischen Rührer, Thermoelement und Stickstoff-Einlass wurde eine wässrige Lösung hergestellt durch Zusammenmischen der Folgenden: 783 g deionisiertes Wasser, 5,0 g CulminalTM MHEC-8000 (Methylhydroxyethylzellulose, erhältlich von Hercules Chemical Company, Viskosität von 8.000 milliPascal·Sekunde (mPa·s = Centipoise, cP) für eine 2% wässrige Lösung bei 20°C), 0,158 g Natriumlaurylsulfat, 2,94 g 50% Natriumhydroxid (wässrig) und 3,13 g Borsäure. Die Lösung wurde bei 250 rpm gerührt, während die Temperatur schnell auf 80°C erhöht wurde, wo sie für eine Stunde gehalten wurde. Die Lösung wurde dann über einen Zeitraum von 30 Minuten durch Luftkühlung des Reaktionsgefäßes auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Nachdem die festen Reaktionspartner vollständig aufgelöst waren, wurde das Rühren gestoppt und dem Reaktionskolben eine organische Phase (oben hergestellt) zugegeben.
  • Das Reaktionsgemisch (kombinierte organische und wässrige Phasen) wurde bei 300 rpm bei Raumtemperatur für 20 Minuten gerührt und dann über 47 Minuten auf 80°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde für 12 Stunden bei 80°C gehalten, um die Reaktionspartner zu polymerisieren. Das Reaktionsgemisch wurde dann in ein Druckgefäß, das ausgestattet war für das Rühren, überführt und für 5 Stunden auf 100°C erwärmt, um die restlichen Reaktionspartner umzusetzen und die Polymerisierung abzuschließen.
  • Nachdem die Polymerisierungsreaktion abgeschlossen war, wurde die Temperatur des Reaktionsgemisches unter Rühren auf 50°C eingestellt. Der pH der wässrigen Phase des wässrigen/Polymer-Gemisches wurde auf 5,0 eingestellt durch Zugabe von etwa 3 g Borsäure gefolgt von einer langsamen Zugabe von 10% Schwefelsäure (wässrig), bis der End-pH erreicht wurde. Insgesamt 25,0 g β-1,4-Glucan-4-glucanhydrolase (CellulaseTM 4000, erhältlich von Valley Research, Inc.) wurden in vier Partien mit jeweils gleichem Gewicht über 24 Stunden zu dem wässrigen/Polymer-Gemisch durch Spritzen des Enzympulvers in den Reaktor zugegeben. Die Temperatur wurde während der Enzymbehandlung bei 50°C gehalten. Der pH der wässrigen Phase des wässrigen/Polymer-Gemisches wurde dann mit 50% Natriumhydroxid (wässrig) auf 12,0 eingestellt und die Temperatur wurde auf 90°C erhöht, wo sie für 2 Stunden gehalten wurde. Das wässrige/Polymer-Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter-Chromatographiesäule überführt. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefiltert und dann das gepackte Polymerbett mit 2 Litern deionisiertem Wasser gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C, unter 2,5 mm (0,1 Inch) Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet.
  • Polymere 1-4 bis 1-11 wurden nach der oben angegebenen Beschreibung hergestellt, außer dass der Anteil an Porogen, das MIBC/Xylol-Verhältnis und % BPO wie in Tabelle 1 zusammengefasst variiert wurden; Polymerprobe 1-6 entspricht der oben angegebenen Beschreibung. Alle Polymere, die in Tabelle 1 mit der Nachsilbe ”C” angegeben sind, sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Vergleichspolymere anzusehen. Die Polymerproben 1-5 bis 1-9 sind als repräsentativ für die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung anzusehen. Polymerproben 1-12 C, 1-13 C und 1-14 C sind kommerziell erhältliche polyvinylaromatische Polymere von Chromatographie-Güte, die zusammen mit den Polymerproben, die nach der oben angegebenen Beschreibung hergestellt wurden, ausgewertet wurden.
  • Das kommerzielle Polymer 1-12 C ist ein Poly(styrol-divinylbenzol)-Material mit einer Teilchengröße von 30 μm, erhältlich als SourceTM 30RPC-Harzvon Amersham Pharmacia Company, Uppsala, Little Chalfont, Großbritannien. Das kommerzielle Polymer 1-13 C ist ein Poly(styrol-divinylbenzol)-Material mit einer Teilchengröße von 15 μm, erhältlich als SourceTM 15 RPC von Amersham Pharmacia Company, Uppsala, Little Chalfont, Großbritannien. Das kommerzielle Polymer 1-14 C ist ein Poly(styrol-divinylbenzol)-Material mit einer Teilchengröße von 15 μm, erhältlich als PLRP-S 300-Harz von Polymer Labs Ltd., Shropshire, Großbritannien.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel beschreibt die Auswertung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung bezüglich der Insulinbindungskapazität. Proben mit einem Volumen von etwa 5 ml wurden in Testsäulen in kleinem Maßstab (1,0 cm innerer Durchmesser × 6,3 cm Länge) gepackt und im Hinblick auf die frontale Adsorption von Rinder-Insulin aus wässriger Lösung ausgewertet; dieser Test wurde entwickelt, um zu bestimmen, ob die Polymermatrix unter typischen Gebrauchsbedingungen einen schnellen, effizienten Massentransfer und eine hohe Kapazität für ein Zielprobenmolekül (z. B. Insulin) erlaubt. Zusätzlich wurden Proben von etwa 20 ml in Testsäulen mit größerem Maßstab (1,0 cm innerer Durchmesser × 25 cm Länge) gepackt und eine Fraktionierung/Trennung von Insulin wurde durchgeführt; dieser Test wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Polymermatrix eine befriedigende Leistung unter typischen Verfahrensbedingungen lieferte.
  • Fünf Gramm des getrockneten Polymerharzes (hergestellt nach Beispiel 1, wenn nicht anders angegeben) wurden mit 35 ml 20% Ethanol/Wasser (v/v) gemischt und für mindestens 2 Stunden bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Der Polymerschlamm wurde dann gepackt in eine OmnifitTM-Glassäule (Dimensionen: 6,3 cm Länge auf 10 mm innerer Durchmesser, erhältlich von Millipore Corp.) durch Fließpacken (flow packing) in 20% v/v Ethanol/Wasser-Lösung bei einer linearen Geschwindigkeit von 150 cm/h. Die Qualität der Säulenpackung wurde bestätigt durch Injektion eines 50 μl-Pulses einer 1% Natriumchloridlösung in deionisiertem Wasser in die Säule, während das Elutionsmittel aus 20% v/v Ethanol/Wasser bei einer linearen Geschwindigkeit von 40 cm/h floss. Die Effizienz (Platten(plates)/Meter) und Asymmetrie der Säule wurde berechnet mit der Hewlett Packard ChemstationTM-Software. Die Zielwerte für akzeptable Säulenpackparameter waren eine Effizienz von minimal 5.000 Platten/Meter mit einer Asymmetrie von 0,8 bis 1,8.
  • Eine Lösung von Rinder-Insulin (erhältlich von Sigma Chemical Co.) mit einer Konzentration von 5 g pro Liter Wasser wurde hergestellt. Insgesamt 200 ml dieser Lösung wurden mit einer linearen Geschwindigkeit von 150 cm/h in die Säule gepumpt und ein UV-spektrophotometrischer Detektor (SpectraflowTM 783, erhältlich von ABI Analytical, Kratos Division), eingestellt auf eine Wellenlänge von 291 nm, wurde verwendet, um das Rinder-Insulin im Ausfluss zu überwachen.
  • Die dynamische Kapazität (g/l) des Polymerharzes wurde erhalten durch Aufzeichnen der Menge des Insulins, die an dem Punkt des 1% Insulindurchbruchs (im Verhältnis zur Gesamtmenge des Insulins, das an das Polymerharz sorbiert war) an das Polymerharz sorbiert war, in der UV-Antwort-Kurve. Die Gesamtkapazität des Harzes (g/l) wurde bestimmt durch Messung der Insulin-Konzentrationen in den Einfluss- und Ausfluss-Lösungen durch UV-Spektrophotometrie und anschließende Durchführung einer Mengenbilanz. Die Ergebnisse sind in der Diskussion unter Beispiel 3 zusammengefasst.
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel beschreibt, wie die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung bezüglich ihrer Permeabilitätseigenschaften, d. h. des Druckwiderstands, ausgewertet wurden. Die Polymere sind gekennzeichnet durch ihren ”Strömungswiderstand” oder 1/K-Werte (siehe Gleichung 3).
  • In der industriellen Hochdruck-Flüssigchromatographie ist es üblich, Säulen zu verwenden, die mit einem Kolben ausgestattet sind, der eine Kraft (Druck) direkt auf das Harz ausübt. Es ist bevorzugt, den Kolben das Bett aktiv zusammendrücken zu lassen bei einem Druck, der gleich oder größer ist als der maximale angenommene Fließdruck während des chromatographischen Zyklus. Um die Permeabilitätseigenschaften der Polymere der vorliegenden Erfindung zu testen, wurde Polymerharz in eine ProchromTM Dynamic Axial Compression-Säule (Modell LC50) gepackt und mit einem Kolben, der zunächst auf einen Kompressionsdruck von 10 und dann von 60 bar eingestellt war, zusammengedrückt. Der Zweck dieses Tests war, die Permeabilitätseigenschaften (Widerstand gegenüber der Kompression) jeder Probe zu charakterisieren. Eine detaillierte Beschreibung folgt: Etwa 100 g trockenes Polymerharz (entsprechend etwa 500 ml feuchtem Harz) wurden zu 700 ml einer Lösung von 20% Ethanol/Wasser (v/v) zugegeben und bei Umgebungstemperatur für mindestens 2 Stunden stehen gelassen. Diese Polymerprobe wurde geschüttelt, bis sie eine Schlamm-ähnliche Beschaffenheit annahm und in eine 5 cm (innerer Durchmesser) × 54 cm (Länge) ProchromTM Dynamic Axial Compression L.C.50 316-Säule aus rostfreiem Stahl (hergestellt von Prochrom S. A, Frankreich) gegossen. Eine Kolben-Baueinheit (angetrieben durch äußeren Luftdruck, der in hydraulischen Öldruck umgewandelt wird) wurde aktiviert, um einen variablen Druck auf das Polymerharzbett auszuüben. Der Kolben wurde zunächst so eingestellt, dass er etwa 10 bar hydraulischen Druck ausübte; das Harzbett wurde als gepackt betrachtet, wenn sich der Kolben nicht mehr bewegte. Die Höhe des Bettes wurde dann gemessen. Ein Fluss von 10 ml einer Lösung von 20% Ethanol/Wasser (v/v) wurde für 30 Minuten durch das Harzbett hindurchgeleitet, um das Bett zu äquilibrieren.
  • Um das interpartikuläre Hohlraumvolumen (bzw. Permeabilität) des polyvinylaromatischen Polymerbettes zu bestimmen, müssen die mobilen Phasen hinsichtlich der Kompatibilität mit dem Probenmolekül im Allgemeinen so ausgewählt werden, dass sie die Wechselwirkung des Probenmoleküls mit der hydrophoben Oberfläche des polyvinylaromatischen Polymers eliminieren oder verringern. Herkömmliche Probenmoleküle, wie etwa lineares Polystyrol, blaues Dextran und Polyethylenglykol können verwendet werden, benötigen allerdings die Verwendung von unpolaren mobilen Phasen (wie etwa Tetrahydrofuran und Toluol). Die Probenmoleküle, die in dem unten beschriebenen Verfahren verwendet wurden, benötigen jedoch nicht die Verwendung von unpolaren Lösungsmitteln und können in jedem wässrigenorganischen Lösungsmittelsystem, z. B. 20% Ethanol, verwendet werden.
  • Um das gesamte Hohlraumvolumen in der Säule (sowohl intrapartikulär als auch interpartikulär) zu bestimmen, wurden 2 ml 1% Natriumchlorid (w/v in 20% wässrigem Ethanol) in das System injiziert. Das Salz wurde mit einem Leitfähigkeitsmessgerät nachgewiesen. Um ausschließlich das interpartikuläre Hohlraumvolumen zu bestimmen, wurde eine Lösung von 20% Ethanol (wässrig), die 1% (w/v) eines 0,1–0,9 μm ionisch geladenen Emulsionspolymers oder eines fein zerkleinerten ionisch geladenen Polymers (z. B. quervernetztes Polystyrol mit ionisierbaren funktionellen Gruppen, wie etwa schwach sauren funktionellen Gruppen (Carboxylatgruppe), stark sauren funktionellen Gruppen (Sulfonat), oder einer quaternären Ammoniumchloridgruppe) enthielt, in einen Strom von 20% Ethanol (wässrig), der durch das Bett floss, injiziert. Die Teilchen wurden mit einem UV-Detektor, der auf 280 nm eingestellt war, nachgewiesen. Aufgrund der Größe der ionisch geladenen Polymerprobenteilchen durchdrangen die Teilchen die Poren des Polymerharzes dieser Erfindung nicht. Aufgrund der Oberflächenbeschaffenheit der ionisch geladenen Polymerprobenteilchen (diese Teilchen hatten eine aromatische Struktur und eine hohe Konzentration von ionogenen Gruppen, die über die Oberfläche verteilt waren) wurde die hydrophobe Anziehung/Zurückhalten am Polymerharz dieser Erfindung verhindert.
  • Das gesamte Hohlraumvolumen des Polymerbettes (Salzprobenelutionsvolumen) wurde bestimmt und mit dem Hohlraumvolumen außerhalb der Polymerteilchen (Elutionsvolumen der ionisch geladenen Emulsion oder des zerkleinerten Polymers) kombiniert. Diese Werte wurden zusammen mit dem gemessenen Bettvolumen verwendet, um ε in den Gleichungen 2 und 3 zu berechnen. Nach dem Test bei 10 bar wurde die gleiche Auswertung bei 60 bar durchgeführt.
  • Tabelle 1 fasst die Strömungswiderstands- und Insulinkapazitätseigenschaften der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung (Polymere 1-5 bis 1-9) und verschiedener Vergleichspolymere (Polymere mit Nachsilbe C) zusammen. Siehe Diskussion unter Beispiel 1 für eine detaillierte Beschreibung der Polymere und ihre entsprechende Identifizierung in den Tabellen. Einträge in Tabelle 1 schließen ein Anteil Porogen (bezogen auf das Gesamtmonomer), Verhältnis hydrophiles Porogen/hydrophobes Porogen (MIBC/Xylol) und % Radikalinitiator (bezogen auf das Gesamtmonomer), die verwendet wurden, um die Polymere herzustellen; Insulinkapazitäten in g/l und Strömungswiderstandswerte bei mittlerem und hohem Druck; Einträge in Klammern nach den jeweiligen Werten für die Insulinkapazität und den Strömungswiderstand für eine bestimmte Polymerprobe geben die Zahl der verschiedenen Polymere an, die nach dem gleichen Verfahren hergestellt wurden (gleicher Anteil Porogen, gleiches Verhältnis hydrophiles Porogen/hydrophobes Porogen und % BPO), die zusammen getestet und gemittelt wurden, um die Insulinkapazitäts- und Strömungswiderstandswerte, die in Tabelle 1 gezeigt sind, zu bilden. Tabelle 2 liefert zusätzliche Polymereigenschaften (Oberfläche, Porosität) von ausgewählten Proben.
  • Vergleichspolymer 1-1C veranschaulicht, dass eine zu hohe Porogenmenge eine unbefriedigende Komprimierbarkeit bei hohem Druck liefert, während die Polymere 1-10C und 1-11C zeigen, dass eine zu geringe Porogenmenge extrem geringe Insulinkapazitäten produziert, während sie eine befriedigende Komprimierbarkeit (geringer Strömungswiderstand) liefert. Vergleichspolymere 1-1C, 1-2C und 1-3C zeigen, dass eine Verringerung des Anteils an Porogen dazu neigt, die Strömungswiderstandseigenschaften zu verbessern; allerdings bleibt die Strömungswiderstandsleistung beim Hochdruckbetrieb unbefriedigend. Ferner wird die dynamische Insulinkapazität bei einer Kombination von kleinem Anteil an Porogen und geringem Verhältnis MIBC/Xylol (Vergleichspolymer 1-4C) unbefriedigend.
  • Die Polymere 1-5 bis 1-9 sind repräsentativ für die unerwartete Kombination von hoher Insulinkapazität und geringer Strömungswiderstandsleistung (bei hohem Druck), die geliefert wird durch Angleichen der Parameter Porogenanteil und Verhältnis hydrophiles Porogen/hydrophobes Porogen, die verwendet wurden, um die Polymere der vorliegenden Erfindung herzustellen.
  • Die kommerziellen Polymerproben 1-12C und 1-13C zeigen beide unakzeptable Komprimierbarkeitseigenschaften, obwohl Polymer 1-12C eine adäquate Insulinkapazitätsleistung liefert. Obwohl das kommerzielle Polymer 1-14C eine gerade noch akzeptable Komprimierbarkeitsleistung liefert, liegt die Insulinkapazität deutlich unter den akzeptablen Werten. Tabelle 1 Strömungswiderstands- und Insulinkapazitätseigenschaften
    Polymer Anteil Porogen MIBC/Xylol % BPO Insulinkapazität: Dynamisch/Gesamt 1/K bei 10/60 bar
    1-1 C 178 1,2 1,5 86/92 1,870/17,300
    1-2 C 144 1,2 1,5 86/108 (3) 1,870/10,100 (3)
    1-3 C 144 1,2 4,5 86/121 1,050/7,300
    1-4 C 122 1,2 4,5 42/108 NA
    1-5 122 1,6 4,5 71/113 NA
    1-6 122 2,0 4,5 82/103 (4) 890/4,060 (2)
    1-7 122 2,0 8,2 63/105 760/3,100
    1-8 122 2,4 4,5 81/93 NA
    1-9 122 2,7 4,5 79/91 1,050/3,500
    1-10 C 100 1,2 1,5 7/52 NA
    1-11 C 67 1,2 1,5 5/15 1,320/3,100
    1-12 C - - - 86/91 1,180/12,000
    1-13 C - - - NA 1,600/8,570
    1-14 C - - - 53/57 1,660/6,270
    Tabelle 2 Zusätzliche Polymereigenschaften
    Polymer ID Oberfläche (m2/g) Gesamtporösität (cm3/g) Operative Mesoporosität (cm3/g) Operative Mikroporosität (cm3/g) Makroporosität (cm3/g)
    1-1 C 743 2,3 0,76 0,3 1,2
    1-3 C 621 1,8 1,3 0,2 0,3
    1-6 528 1,6 1,24 0,2 0,16
    1-8 549 1,55 1,14 0,2 0,2
    1-9 524 1,6 1,0 0,2 0,4
    1-12 C 611 2,8 0,8 0,2 1,8
    1-13 C 481 1,6 0,5 0,2 0,9
    1-14 C 299 1,3 0,7 0,1 0,5
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung der Herstellung der makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung mit oder ohne Enzymbehandlung. Die Enzymbehandlung minimiert die Verklumpung oder Agglomerierung der Polymerharze, die manchmal während der Verwendung aufgrund von unerwünschten Anziehungskräften zwischen dem Kügelchen, die durch Oberflächenkontamination (z. B. ionische oder geladene Materialien) des Polymers entstehen, auftritt. Ein besonderer Vorteil der Verwendung der Enzymbehandlung ist, dass die resultierenden sphärischen Polymerteilchen nicht agglomerieren, d. h. die Teilchen adhärieren nicht aneinander, um Klumpen zu bilden. Es wird angenommen, dass die Enzymbehandlung die Oberfläche reinigt und Spuren von Dispersions- und Suspensionsmitteln (die während des Polymerisierungsprozesses verwendet werden) von der Oberfläche der Polymerkügelchen entfernt, wodurch Polymerkügelchen geliefert werden, die frei fließen und einheitlich in Säulen packen, was zu minimalen Bettvolumina und geringen Druckabfallseigenschaften während der Verwendung führt.
  • Fünf verschiedene Proben eines makroporösen Polymers, das in ähnlicher Weise wie das in Beispiel 1 beschriebene hergestellt wurde, wurden wie folgt behandelt: 4 Teile (4A–4D) wurden mit Cellulase (nachfolgend beschrieben) behandelt und eine Probe (4E) wurde nicht mit Cellulase behandelt; die Proben wurden bezüglich ihrer Sinkeigenschaften ausgewertet. Proben von jedem Polymerharz (3,5 g trockenes, entsprechend etwa 25 ml feuchtem dispergiertem Volumen) wurden in 25 ml Messzylinder eingewogen. Zu jedem Zylinder wurden 20 ml 20% Ethanol (wässrig) zugegeben. Die Zylinder wurden dann mit einem Glasstab gerührt, um einen Brei zu liefern, und die Gemische ließ man für etwa 16 Stunden oder über Nacht absetzen. Die Testproben wurden dann wiederum mit einem Glasstab gerührt, bis sie vollständig gemischt waren. Nach dem Mischen der Probe wurde der Glasstab entfernt und mit 20% Ethanol (wässrig) gewaschen und das Gesamtvolumen in den Zylindern auf 25,0 ml eingestellt (etwa 0,5 ml 120% Ethanol wurden zum Waschen und zum Einstellen jeder Probe verwendet). Die Proben wurden dann für 4 Tage beobachtet und die abgesetzten Bettvolumina (Harz) wurden als eine Funktion der Zeit aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
  • Enzymbehandlung von Polymer A (vor dem Härten bei hoher Temperatur): Etwa 250 ml aufgeschlämmtes Harz (enthaltend 150 ml Harz) wurden zu einem 2 Liter 4-Hals-Kolben, der ausgestattet war mit einem Kondensator, einem mechanischen Rührer, einem Thermoelement und einem Stickstoffeinlass, zugegeben. Zu dem Brei wurden 100 ml deionisiertes Wasser zugegeben, der pH wurde mit Borsäure auf 5,0 eingestellt und 28 g CellulaseTM 4000 (19%, bezogen auf das Polymer) wurden dann dem Brei zugegeben. Das Gemisch wurde auf 37°C erwärmt und für 3 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in ein Druckgefäß, das für das Rühren ausgestattet war, überführt und bei 100°C für 5 Stunden erwärmt. Das wässrige/Polymer-Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter-Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde dann aus dem Polymer filtriert und das gepackte Polymerbett wurde mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich 7 Litern deionisiertem Wasser. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C unter 2,5 mm Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet.
  • Enzymbehandlung von Polymer 4B (nach dem Härten bei hoher Temperatur, vor dem Waschen mit Lösungsmittel): Etwa 250 ml aufgeschlämmtes Harz (enthaltend 150 ml Harz) wurden in ein Druckgefäß, das für das Rühren ausgestattet war, überführt und bei 100°C für 5 Stunden erwärmt. Das wässrige/Polymer-Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und in einen 2-Liter, 4-Hals-Kolben, der ausgestattet war mit einem Kondensator, mechanischem Rührer, Thermoelement und Stickstoffeinlass, überführt. Zu dem Brei wurden 100 ml deionisiertes Wasser zugegeben, der pH wurde mit Borsäure auf 5,0 eingestellt und dann 28 g CellulaseTM 4000 (19%, bezogen auf das Polymer) zu dem Brei zugegeben. Das Gemisch wurde auf 37°C erwärmt und für 3 Stunden gerührt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter-Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefiltert und das gepackte Polymerbett mit 7 Liter deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich 7 Litern deionisiertem Wasser. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C unter 2,5 mm Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet.
  • Enzymbehandlung des Polymers 4C (nach dem Härten bei hoher Temperatur, nach dem Waschen mit Lösungsmittel, vor dem erneuten Waschen mit Lösungsmittel): Etwa 250 ml aufgeschlämmtes Harz (enthaltend 150 ml Harz) wurden in ein Druckgefäß, das für das Rühren ausgestattet war, überführ und bei 100°C für 5 Stunden erwärmt. Das wässrige/Polymer-Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter-Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefiltert und das gepackte Polymerbett wurde mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich 7 Litern deionisiertem Wasser. Das Gemisch wurde überführt in einen 2 Liter 4-Hals-Kolben, der ausgestattet war mit einem Kondensator, mechanischem Rührer, Thermoelement und Stickstoffeinlass. Zu dem Brei wurden 100 ml deionisiertes Wasser zugegeben, der pH wurde mit Borsäure auf 5,0 eingestellt und 28 g CellulaseTM 4000 (19%, bezogen auf das Polymer) wurden dann dem Brei zugegeben. Das Gemisch wurde auf 37°C erwärmt und für 3 Stunden gerührt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter-Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefiltert und das gepackte Polymerbett wurde mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich mit 7 Litern deionisiertem Wasser. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C unter 2,5 mm Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet.
  • Enzymbehandlung des Polymers 4D (nach dem Härten bei hoher Temperatur, nach dem Waschen mit Lösungsmittel, nach dem Trocknen des Polymers, vor dem erneuten Waschen mit Lösungsmittel). Etwa 250 ml aufgeschlämmtes Harz (enthaltend 150 ml Harz) wurden in ein Druckgefäß, das für das Rühren ausgestattet war, überführt und bei 100°C für 5 Stunden erwärmt. Das wässrige/Polymer-Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter-Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefilter und das gepackte Polymerbett wurde mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich mit 7 Litern deionisiertem Wasser. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C unter 2,5 mm Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet. Die getrocknete Probe wurde überführt in einen 2 Liter 4-Hals-Kolben, der ausgestattet war mit einem Kondensator, mechanischem Rührer, Thermoelement und Stickstoffeinlass. Zu dem Brei wurden 100 ml deionisiertes Wasser zugegeben, der pH wurde mit Borsäure auf 5,0 eingestellt und 28 g CellulaseTM 4000 (19%, bezogen auf das Polymer) wurden dann dem Brei zugegeben. Das Gemisch wurde auf 37°C erwärmt und für 3 Stunden gerührt, aus dem Kolben entfernt und in eine 1-Liter Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefiltert und das gepackte Polymerbett wurde mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich mit 7 Litern deionisiertem Wasser. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C unter 2,5 mm Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet.
  • Behandlung des Polymers 4E (ohne Enzym): Etwa 250 ml aufgeschlämmtes Harz (enthaltend 150 ml Harz) wurden in ein Druckgefäß, das ausgestattet war für das Rühren, überführt und für 5 Stunden auf 100°C erwärmt. Das wässrige/Polymer-Gemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, aus dem Gefäß entfernt und in eine 1-Liter Chromatographiesäule eingebracht. Die wässrige Phase wurde aus dem Polymer gefiltert und das gepackte Polymerbett wurde mit 7 Litern deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von 3,5 Litern Aceton und schließlich mit 7 Litern deionisiertem Wasser. Das wasserfeuchte Polymer wurde dann bei einer Temperatur von 100°C unter 2,5 mm Quecksilbervakuum für einen Zeitraum von 16 Stunden getrocknet.
  • Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass die makroporösen Polymere der vorliegenden Erfindung auf vielerlei Weise enzymbehandelt werden können, um das Klumpen oder die Agglomerierung der Polymerteilchen zu minimieren. Dies wird gezeigt durch das verdichtete Volumen der behandelten Polymere (4A–4D) nach nur 18 Stunden des Absetzens, was 60% des ursprünglich dispergierten Volumens jeder Probe entspricht, im Verhältnis zu dem unbehandelten Polymer mit 94% seines ursprünglich dispergierten Volumens.

Claims (10)

  1. Ein makroporöses Polymer umfassend polymerisierte Monomereinheiten von: (a) 50 bis 100 Gewichtsprozent von einem oder mehreren polyvinylaromatischen Monomeren, und (b) Null bis 50 Gewichtsprozent von einem oder mehreren einfach ungesättigten vinylaromatischen Monomeren; worin das Polymer aufweist: (i) eine Gesamtporosität von 0,7 bis 2 Kubikzentimeter pro Gramm; (ii) eine operative Mesoporosität von 0,7 bis 1,9 Kubikzentimeter pro Gramm; (iii) einen durchschnittlichen Teilchengrößedurchmesser von 2 bis 600 Mikrometer; (iv) eine Oberfläche von 200 bis 1500 Quadratmeter pro Gramm; (v) einen Strömungswiderstandswert von 700 bis weniger als 1.800 bei einem Druck von 10 bar und von 1.500 bis weniger als 7.000 bei einem Druck von 60 bar; und (vi) eine Gesamtinsulinkapazität von 75 to 150 Gramm Insulin pro Liter Polymer und eine dynamische Insulinkapazität von 60 bis 150 Gramm Insulin pro Liter Polymer.
  2. Das Polymer nach Anspruch 1, wobei das polyvinylaromatische Monomer ausgewählt ist aus einem oder mehreren von Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Divinyltoluol, Divinylnaphthalen, Divinylanthracen und Divinylxylol.
  3. Das Polymer nach Anspruch 1, wobei das einfach ungesättigte vinylaromatische Monomer ausgewählt ist aus einem oder mehreren von Styrol und (C1-C4)Alkyl-substituierten Styrolen.
  4. Das Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer aufweist: (a) eine Oberfläche von 400 bis 1.000 Quadratmeter pro Gramm; (b) eine operative Mesoporosität von 0,9 bis 1,4 Kubikzentimeter pro Gramm; (c) einen durchschnittlichen Teilchengrößedurchmesser von 10 bis 75 Mikrometer; (d) einen Strömungswiderstandswert von 700 bis weniger als 1.500 bei einem Druck von 10 bar und von 1.500 bis weniger als 5.000 bei einem Druck von 60 bar; und (e) eine Gesamtinsulinkapazität von 90 bis 150 Gramm Insulin pro Liter Polymer und eine dynamische Insulinkapazität von 75 bis 150 Gramm Insulin pro Liter Polymer.
  5. Das Polymer nach Anspruch 1 umfassend polymerisierte Monomereinheiten von: (a) 75 bis 100 Gewichtsprozent von einem oder mehreren polyvinylaromatischen Monomeren, und (b) Null bis 25 Gewichtsprozent von einem oder mehreren einfach ungesättigten vinylaromatischen Monomeren.
  6. Das Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer ausgewählt ist aus einem oder mehreren von Divinylbenzolcopolymer, Styrol-divinylbenzolcopolymer, Divinylbenzolethylvinylbenzolcopolymer und Styrol-ethylvinylbenzol-divinylbenzolcopolymer.
  7. Ein Verfahren zur Herstellung eines makroporösen Polymers nach Anspruch 1, umfassend das Polymerisieren von Null bis 50 Prozent monovinylaromatischem Monomer und 50 bis 100 Prozent polyvinylaromatischem Monomer in der Gegenwart von 100 bis 170 Prozent eines Porogengemisches umfassend ein hydrophobes Porogen und ein hydrophiles Porogen, und 0,5 bis 10 Prozent Radikalpolymerisierungsinitiator, in einer wässrigen Suspension; worin alle Prozentmengen sich auf das Gesamtgewicht des Monomers beziehen; und wobei: (a) das hydrophile Porogen in einem Gewichtsverhältnis zum hydrophoben Porogen von größer als 1,2:1 bis 3:1 vorliegt; und (b) das hydrophile Porogen ausgewählt ist aus einem oder mehreren (C4-C10)Alkanolen und das hydrophobe Porogen ausgewählt ist aus einem oder mehreren (C7-C10) aromatischen Kohlenwasserstoffen und (C6-C12) gesättigten Kohlenwasserstoffen.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das hydrophile Porogen ausgewählt ist aus einem oder mehreren (C5-C8)Alkanolen und das hydrophobe Porogen ausgewählt ist aus einem oder mehreren (C7-C10) aromatischen Kohlenwasserstoffen.
  9. Das Verfahren nach Anspruch 7 weiter umfassend das Behandeln des makroporösen Polymers mit einem Enzym ausgewählt aus einem oder mehreren von Cellulose-abbauendem Enzymen und proteolytischen Enzymen, wobei das Enzym während der Polymerisierung, nach der Polymerisierung oder nach der Isolierung des Polymers mit dem makroporösen Polymer in Kontakt gebracht wird.
  10. Ein Verfahren zum Reinigen wässriger Lösungen von gemischten Biomolekülen, umfassend das Inkontaktbringen der wässrigen Lösung mit dem makroporösen Polymer nach Anspruch 1 in einer Flüssigchromatographiesäule mit einem inneren Durchmesser von 2 bis 100 Zentimetern, wobei die Säule bei einem Druck von 10 bis 100 bar betrieben wird.
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