DE60038124T2 - Direktes screeningverfahren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Gruppen von Polypeptiden, wobei die Polypeptide in großer Nähe zu einem Zielmolekül oder zu Zielmolekülen translatiert werden, sodass Mitglieder der Gruppe, die mit dem Zielmolekül oder mit den Zielmolekülen interagieren, identifiziert werden können. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Expression einer Gruppe von Polypeptiden in situ in Form eines Arrays und den Nachweis der Interaktion derselben mit immobilisierten Zielmolekülen.
  • Einleitung
  • Das Screening von Antikörperfragmenten in großen Mengen auf eine Antigenbindung wurde zunächst unter Verwendung von lytischen Plaques beschrieben (Huse et al., 1989; Mullinax et al., 1990). Diese Bibliotheken wurden ausgehend von immunisierten Mäusen oder immunaufgefrischten (immune-boosted) Individuen hergestellt, was den Nachteil hat, dass für jedes Zielantigen eine neue Bibliothek erstellt werden muss und keine reproduzierbaren Duplikatfilter erzeugt werden können. Aus diesem Grunde sind Phagendisplay-Bibliotheken aus Antikörperfragmenten hergestellt worden, wobei von naiven (nicht-immunisierten Donoren ausgegangen wurde (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581: Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309; Sheets, M. D., Amersdorfer, P., Finnern, R., Sargent, T., Lindqvist, E., Schier, R., Hemingsen, G., Wong, C., Gerhart, J. C. & Marks, J. D. (1998). Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to Protein antigens. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6157-62) oder von klonierten Genen für die variable (V) Region mit synthetisch eingebrachten komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions; CDRs) (Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245), die eine große Vielfalt von Antikörpern enthalten sollten. Tatsächlich sind nach wiederholten Runden aus Selektion und Affi nitätsreinigung mit Antigen Antikörperfragmente gegen mehrere Antigene isoliert worden, bei denen dies zuvor als schwierig angesehen wurde, wie beispielsweise Selbst-Antigene (Griffiths, A. D., Malmqvist, M., Marks, J. D., Bye, J. M., Embleton, M. J., McCafferty, J., Baier, M., Holliger, K. P., Gorick, B. D., Hughes Jones, N. C. & et al. (1993). Human anti-self antibodies with high specificity from phage display libraries. EMBO J, 12, 725-734; Griffiths et al., 1994; De Wildt, R. M. T., Finnern, R., Ouwehand, W. H., Griffiths, A. D., Van Venrooij, W. J. & Hoet, R. M. A. (1996). Characterization of human variable domain antibody fragments against the U1 RNA-associated A Protein, selected from a synthetic and a Patient-derived combinatorial V gene library. Eur. J. Immunol. 26, 629-639) und MHC-Peptidkomplexe (Andersen et al., 1996).
  • Das experimentelle Vorgehen beim Phagendisplay umfasst wiederholte Runden aus Phagenanzucht, Panning und Infektion, wobei dies oftmals zu einer Neigung zu immundominanten Epitopen und dominanten Proteinen (in Proteinmischungen) führt. Es ist daher nützlich, Klone so früh wie möglich zu analysieren, um den größten Teil der Diversität bezüglich potentiell bindender Klone zu erhalten.
  • Dies erfordert ein Screening auf eine Antikörperbindung an ein Antigen im großen Maßstab. Während dies durch Anzüchten und Induktion von rekombinanten Antikörpern in einem Format mit 96 Vertiefungen und anschließender Durchführung eines herkömmlichen ELISA durch Transferieren der exprimierten Antikörper auf eine andere Platte, die mit Antigen beschichtet ist, erreicht werden kann, ist es nicht möglich, mehr als 1000 verschiedene Antikörper auf diese Weise in einem Screening zu untersuchen. Umfangreichere Screenings können durch robotergestütztes Pipettieren von einzelnen exprimierten Antikörpern erreicht werden; dennoch müssten die Antikörper während der Induktion kompartimentiert werden, was die Anzahl von Antikör pern einschränkt, die mit einem bestehendem Plattenformat und den gegenwärtigen Beschränkungen hinsichtlich der Geschwindigkeit der Verarbeitung von Flüssigkeit in einem Screening untersucht werden können. Um größere Screenings im Bereich von 103 bis 105 zu ermöglichen, können Antikörper-enthaltende Bakterien in situ exprimiert werden und anschließend auf Filtern eingefangen werden, um diese anschließend mit markiertem Antigen als Sonde zu untersuchen. Skerra et al., Anal. Biochem. 196. 151-155 verwendeten einen Ansatz mit zwei Filtern, um exprimierte Antikörperfragmente einzufangen und somit zwischen bindenden und nicht-bindenden Antikörpern zu unterscheiden, wobei die Verwendung eines zweiten Filters den durch bakterielle Zelltrümmer verursachten Hintergrund verringerte. Einfang-Reagenzien sind darüber hinaus verwendet worden, um Antikörperfragmente einzufangen, die in Plaques von λ-Phagen exprimiert wurden, (Watkins, J. D., Beuerlein, G., Wu, H., McFadden, P. R., Pancook, J. D. & Huse, W. D. (1998). Discovery of human antibodies to cell surface antigens by capture lift screening of phage-expressed antibody libraries. Anal Biochem 256, 169-77). Beide Methoden basieren auf dem wahllosen Einfangen von Antikörpern, gefolgt von der Verwendung eines markierten Antigens zum Detektieren von Antigen-spezifischen Klonen. Dies erfordert nicht nur die Markierung jedes Antigens, das im Screening untersucht werden soll, sondern die Verwendung von generischen Einfang-Reagenzien mit geringer Affinität könnte auch bedeuten, dass die Antikörper von dem Filter entfernt werden, bevor die spezifische Interaktion nachgewiesen werden kann. Um diesen Problemen zu begegnen, haben wir einen neuen Ansatz entwickelt, bei dem das Zielmolekül selbst auf einen festen Träger immobilisiert wird, und die Polypeptidgruppe in großer Nähe exprimiert wird, sodass die bindenden Polypeptide unmittelbar auf dem festen Träger, der die Zielmoleküle enthält, eingefangen werden können. Darüber hinaus haben wir ein System entwickelt, bei dem Duplikat-Filter, die dieselbe Gruppe von Polypeptiden enthalten, hergestellt werden können und mit zwei oder mehr verschiedenen Zielmolekülen in einem Screening untersucht werden können, sodass Polypeptide identifiziert werden können, die mit einzelnen Zielmolekülen, mit einigen jedoch nicht allen Zielmolekülen, mit allen Zielmolekülen oder mit keinem der Zielmoleküle interagieren. Neben der Verwendung beim Screening auf Bindungsinteraktionen kann dieser direkte Expression/Interaktionsassay verwendet werden, um beliebige biologische Screenings durchzuführen, die Polypeptide mit einer biologischen Funktion betreffen. In unserem Ansatz werden Nukleinsäuremoleküle, die für die Polypeptidgruppe kodieren, und die immobilisierten Zielmoleküle vor der Expression der Nukleinsäuremoleküle und der anschließenden Detektion der Polypeptid-Zielinteraktionen zueinander gebracht. Andere existierende, Hochdichte-Screeningverfahren wie beispielsweise WO 99/39210 beschreiben die Expression der Nukleinsäuremoleküle, nachdem der Bioliothek-Array gebildet wurde.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Wir haben eine Methode entwickelt, durch die eine Gruppe von Polypeptiden, einschließlich Antikörperpolypeptiden, verwendet werden kann, um ein Screening auf Reaktivität mit einem oder mit mehreren Zielmolekülen durchzuführen. Wir haben Polypeptidexpression und Interaktionsscreening kombiniert und einen Array von Polypeptiden erzeugt, der als Array angeordneten Nukleinsäuren entspricht, welche für die Polypeptide kodieren. Dies hat gegenüber herkömmlichen Verfahren den Vorteil, dass das exprimierte Polypeptid in der Lage ist, direkt mit dem Zielmolekül zu interagieren und nicht für ein späteres Screening mit dem Zielmolekül exprimiert und gelagert oder eingefangen werden muss. Die Herstellung von solchen Arrays ermöglicht ferner das parallele Screening derselben Gruppenmitglieder gegen verschiedene Zielmoleküle.
  • In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird somit ein Verfahren zum Screening einer Gruppe von Polypeptiden bereitgestellt, um ein oder mehrere Mitglieder daraus, die mit einem oder mehreren Zielmolekülen interagieren, zu identifizieren, bei dem man:
    • a) das (die) Zielmolekül(e) auf einem Träger immobilisiert;
    • b) eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, als Array anordnet;
    • c) das (die) Zielmolekül(e) und die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander bringt;
    • d) die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um die Polypeptide zu erzeugen, sodass die Polypeptide in Kontakt mit dem (den) Zielmolekül(en) auf dem Träger kommen und eine Teilmenge der Polypeptide mit dem (den) Zielmolekül(en) interagiert; und
    • e) die Interaktion der Polypeptide mit den Zielmolekülen auf dem Träger detektiert,
    wobei die Nukleinsäuremoleküle, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, und die immobilisierten Zielmoleküle als Array angeordnet sind, und die Träger vor der Expression der als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander gebracht werden.
  • Die Erfindung umfasst den wesentlichen Vorteil des Phagen-Displays und anderer Expressionsdisplay-Verfahren, nämlich dass die Nukleinsäuren, die für die Mitglieder der Polypeptidgruppe kodieren, mit dem einzelnen von diesen kodierten Polypeptid assoziiert sind, und daher auf Basis der funktionellen Eigenschaften des einzelnen Polypeptids selektiert werden kön nen. Im Gegensatz zum Phagendisplay jedoch, bei dem diese Assoziation durch Verknüpfung der Nukleinsäuren und der Polypeptide unter Verwendung eines Bakteriophagen erreicht wird, welcher die Polypeptide auf der Außenseite präsentiert und die entsprechenden Nukleotidvorläufer im Inneren enthält, nutzt die vorliegende Erfindung eine neue Array-Technik, um diese Assoziation bereitzustellen. Durch Eliminieren des Erfordernisses, wonach die Nukleinsäuren und die Polypeptide in oder auf den bakteriellen Zellen beibehalten werden oder während der Expression kompartimentiert werden müssen (beispielsweise in Platten mit 96 Vertiefungen oder unter Verwendung anderer Strategien zur Kompartimentierung), ermöglicht die vorliegende Erfindung, dass eine große Anzahl von Polypeptiden gleichzeitig in einem Screening untersucht werden können. Somit befinden sich die Nukleinsäure, das entsprechende Polypeptid-Produkt und die Interaktion des Polypeptid-Produkts mit (einem) Zielmolekül(en) alle in großer Nähe zueinander. Wenn eine bestimmte Interaktion beobachtet wird, kann somit das entsprechende Nukleinsäuremitglied problemlos identifiziert werden. Folglich kann die Erfindung auf Bereiche jenseits der Selektion von Bindungsaktivitäten erweitert werden, um eine beliebige Polypeptidgruppe auf Basis einer beliebigen funktionellen Eigenschaft der Polypeptide zu selektieren, einschließlich enzymatischer Aktivität, Konformation und anderer nachweisbarer Eigenschaften.
  • Die Zielmoleküle werden auf einem Festphasen-Träger, wie beispielsweise auf einem Membranfilter-Träger, immobilisiert und zu dem Array aus Nukleinsäuremolekülen gebracht. Dies kann die Anordnung lediglich der Zielmoleküle als Array umfassen, beispielsweise wenn der Träger mit einem gereinigten Protein beschichtet wird oder mit einem Zielmolekül in einer komplexen Mischung mit anderen Molekülen, beispielsweise ganzen Zellen oder Zellextrakten. Für einige Screening-Untersuchungen kann die genaue Art des Zielmoleküls unbekannt sein, wobei in die sem Fall ein beliebiges Polypeptid, das eine Interaktion während des Screenings erzeugt, verwendet werden kann, um das Zielmolekül weiter zu charakterisieren. Da die Polypeptide, die durch Expression der Nukleinsäuremoleküle erzeugt wurden, zu den Zielmolekülen gebracht werden, haben sie die Möglichkeit, mit diesen zu interagieren. Die Interaktion kann unter Verwendung geeigneter Detektionssysteme, die auf Basis der zu detektierenden Interaktion ausgewählt werden, nachgewiesen werden.
  • Die Detektion der Interaktion zwischen den Polypeptiden der Gruppe und den Zielmolekülen kann auf vielfältige Weise erfolgen, abhängig von der Art der Interaktion selbst. Wenn beispielsweise die Polypeptidgruppe eine Antikörper-Molekül-Gruppe ist, und die Zielmoleküle Antigene sind, kann die Bindung zwischen den Antikörpern und den Antigenen detektiert werden, indem der Zielmolekül-Träger unter Verwendung eines geeignet markierten Anti-Immunglobulins, oder eines markierten Superantigens, wie beispielsweise Protein A oder Protein L, als Sonde untersucht wird. In einer alternativen Ausführungsform können die Zielmoleküle, die verwendet werden, um die Polypeptidgruppe zu selektieren, in der Lage sein, eine generische Interaktion mit korrekt gefalteten und exprimierten Polypeptiden durchzuführen. Wenn beispielsweise das Zielmolekül Protein A oder Protein L ist, würde die Untergruppe aller funktionellen Immunglobulinmoleküle aus einer Immunglobulinmolekülgruppe selektiert werden. Alternativ dazu kann die Interaktion zwischen den Polypeptiden der Gruppe und den Zielmoleküllen durch einige physikalische Änderungen in der Art des Zielmoleküls oder anderer Moleküle, mit denen diese interagieren können, detektiert werden. Wenn beispielsweise das Zielmolekül ein Rezeptor ist, der die Apoptose fördert, und Zellen, die das Zielmolekül enthalten, auf dem festen Träger immobilisiert wurden, kann ein interagierendes Mitglied der Polypeptidgruppe die Zelle abtöten, was unter einem Mikroskop oder durch Verwendung einiger anderer molekularen Marker der Apoptose detektiert werden kann. Alternativ dazu könnte das interagierende Mitglied der Polypeptidgruppe eine Farbveränderung im Zielmolekül verursachen.
  • In einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein wie oben definiertes Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 18 zum Screening einer Gruppe von Antikörperpolypeptiden, um ein oder mehrere Mitglieder daraus, die an ein oder mehrere Zielmoleküle binden, zu identifizieren, bei dem man:
    • a) das (die) Zielmolekül(e) auf einem ersten Träger immobilisiert;
    • b) eine Vielzahl von Zellen mit Nukleinsäuremolekülen, die für die Gruppe von Antikörper-Polypeptiden kodieren, transformiert und die bakteriellen Zellen auf einem zweiten Träger als Array anordnet;
    • c) den ersten und den zweiten Träger zueinander bringt;
    • d) die Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um die Antikörper Polypeptide zu erzeugen, sodass die Polypeptide aus den Zellen auf dem zweiten Träger ausgeschieden werden und in Kontakt mit dem (den) Zielmolekül(en) auf dem ersten Träger kommen, und eine Teilmenge der Polypeptide an die Zielmoleküle bindet; und
    • e) die Bindung der Antikörper-Polypeptide mit den Zielmolekülen auf dem ersten Träger detektiert.
  • Die Zellen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein, einschließlich bakterieller Zellen, wie beispielsweise E. coli, niederer eukaryontischer Zellen, wie beispielsweise Hefezellen, und höherer eukaryontischer Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das Anordnen als Array vorteilhafterweise durch robotergestütztes Kolonie-Picking in Kulturplatten durchgeführt, von denen zahlreiche Duplikatfilter hergestellt werden können. Obwohl der erste und der zweite Filter gleich sein können, sodass ein Zielmolekül zunächst an den Filter angeheftet wird und anschließend die Bakterien als Array angeordnet, angezüchtet und auf einem Zielmolekülfilter exprimiert werden, ist es vorteilhaft, den zweiten Filter, welcher die in Array angeordneten Kolonien aufweist, auf einen ersten Filter zu legen, der die Zielmoleküle darauf immobilisiert aufweist, sodass der erste Filter in Kontakt mit der Unterseite des zweiten Filters steht und nicht in Kontakt mit den Kolonien selbst.
  • Demgemäß ist es vorteilhaft, dass der erste und der zweite Träger, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, Filter sind. Mindestens der zweite Filter ist vorteilhafterweise ein poröser oder mikroporöser Filter, was es den von den Zellen ausgeschiedenen Polypeptiden ermöglicht, durch diesen zu treten und Kontakt mit dem ersten Filter herzustellen. Bevorzugte Filtermaterialien umfassen Nitrocellulose, PVDF und andere künstliche Membranen, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • Den Polypeptiden, die von den Zellen exprimiert und ausgeschieden werden, wird es erlaubt, durch den zweiten Filter zu treten, und mit den immobilisierten Zielmolekülen auf dem ersten Filter zu interagieren, indem sie an diese binden. Gebundene Immunglobuline können unter Verwendung von Anti-Immunglobulin-Reagenzien, wie beispielsweise markierten Superantigenen, detektiert werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Beschreibung eines Verfahrens zum Screening bakteriell exprimierter scFvs.
  • (A) Bakterien, die klonierte Antikörpergene enthalten, werden auf einem Filter in einen Array eingeteilt und über Nacht in Abwesenheit einer scFv-Produktion angezüchtet. Ein Filter, der mit dem Zielantigen beschichtet ist, wird vorbereitet und auf eine zweite Platte gelegt, die IPTG für die Induktion von scFv umfasst, und dieser wird anschließend mit dem Filter, der die gerasterten Bakterien enthält, bedeckt. Während der Induktion werden die Antikörper durch den oberen Filter treten und bei Antigenspezifität das Antigen auf dem unteren Filter binden. Nach mehreren Stunden Induktion wird der untere Filter entfernt und gebundenes scFvs wird unter Verwendung eines sekundären Reagenzes detektiert. (B) Durch robotergestütztes Picking und Rastern (gridding) können geordnete Duplikat-Arrays hergestellt werden, die dann gegen zwei oder mehrere verschiedene Zielmoleküle in einem Screening untersucht werden können, um Mitglieder der Gruppe zu identifizieren, die (in diesem Beispiel) Antigen 1 und Antigen 2 (schwarze Kreise), Antigen 1 jedoch nicht Antigen 2 (schattierte Kreise), Antigen 2 jedoch nicht Antigen 1 (schraffierte Kreise), kein Antigen (weiße Kreise) binden.
  • 2. Analyse von BSA-spezifischen scFvs auf einem Makro-Array.
  • (A) Sandwich-Detektion von funktionellem scFvs unter Verwendung von Protein L als Zielmolekül und Protein A-HRP als Detektionsreagenz. (B) Screening auf BSA-bindende scFvs unter Verwendung von immobilisiertem BSA zur Bindung von BSA-bindenden scFvs. (C) Screening auf HSA-bindende scFvs unter Verwendung von immobilisiertem HSA zur Bindung von HSA-bindenden scFvs. Das hier dargestellte Bild besteht aus 6144 Klonen. Die Klone wurden in einem 4 × 4 Muster aus dupli zierten Klonen von 8 Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (384 × 8 × 2) in einen Array eingeteilt.
  • 3. Filter-Screening auf interagierende Proteinpaare
  • (A) Detektion eines Anti-M-scFv-Antigen M-Paars und eines Anti-T-scFv-Antigen M-Paars (B) Detektion eines FRB-FKBP12-Paars. Interagierende Paare werden durch Einfangen exprimierter GST-Fusionen mit einem Anti-GST-Antikörper nachgewiesen, und der interagierende Ligand wird unter Verwendung des Proteins L HRP detektiert. Die FRB-FKBP12-Interaktion wurde nur beobachtet, wenn Rapamycin vorhanden war.
  • 4. ELISA-Detektion eines interagierenden Proteinpaars
  • (A) Detektion eines scFv-Antigen M-Paars und eines scFv-Antigen T-Paars (B) Detektion eines FRB-FKBP12-Paars. Interagierende Paare werden durch Einfangen der exprimierten GST-Fusionen mit einem Anti-GST-Antikörper nachgewiesen, und der interagierende Ligand wird unter Verwendung des Proteins L-HRP nachgewiesen. Die FRB-FKBP12-Interaktion wurde nur beobachtet, wenn Rapamycin vorhanden war.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Array: Wie vorliegend verwendet ist ein Array eine räumliche Anordnung von Nukleinsäuremitgliedern einer Gruppe, bei der verschiedene Nukleinsäuremitglieder an einzelnen und vorbestimmten Positionen auf einem festen Träger angeordnet werden. Solche geordneten Arrays können unter Verwendung einer Raster-Methode (gridding) erzeugt werden, beispielsweise durch robotergestütztes Picking, um die Mitglieder an den gewünschten Positionen anzuordnen. Arrays dieser Art haben den Vorteil, dass jeder Klon seine eigene Position aufweist und mehrere Duplikatfilter erzeugt und gegen verschiedene Zielmoleküle in einem Screening untersucht werden können. Weitere bevorzugte Methoden für Arrays sind nachfolgend beschrieben.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in beliebiger Form als Array angeordnet werden. Beispielsweise können sie als nackte Nukleinsäuren als Array angeordnet werden, entweder als RNA, DNA oder eine beliebige andere Form von Nukleinsäure. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung jedoch werden sie in Form von Zellen oder Aggregaten aus Zellen, die mit Nukleinsäuren transformiert sind, als Array angeordnet. Geeignete Zellen umfassen bakterielle Zellen, eukaryontische Zellen und höhere eukaryontische Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen.
  • Vorzugsweise liegen die Nukleinsäuremoleküle in Form von Expressionsvektoren vor, welche für die Mitglieder der Gruppe von Polypeptiden kodieren, und die in funktionsfähiger Weise mit Kontrollsequenzen verknüpft sind, die ausreichen, um ihre Transkription und/oder Translation zu steuern. Beispielsweise können solche Kontrollsequenzen Promotorsequenzen und Enhancer umfassen, die dem Fachmann bekannt sind, und die für die Transkription von DNA-Molekülen notwendig sind.
  • Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle in Form von Plasmiden, Viren, als Bakteriophage oder als lineare Nukleinsäuremoleküle vorliegen, entweder in nackter oder in komplexierter Form. Sie werden anschließend transkribiert (sofern sie auf DNA basieren) und/oder translatiert, um die Polypeptide in situ auf dem Array zu erzeugen.
  • Ein Array kann eine beliebige geeignete Anzahl von Mitgliedern umfassen, beispielsweise 10, 100 oder 500 Mitglieder. Vorzugsweise umfasst ein im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendeter Array mindestens 1000 Mitglieder, vorteilhafter weise 104, 105, 106 oder mehr Mitglieder.
  • Generischer Ligand: Ein generischer Ligand ist ein Ligand, der einen wesentlichen Teil der funktionellen Mitglieder in einer gegebenen Gruppe von Polypeptiden bindet. Somit kann der gleiche generische Ligand zahlreiche Mitglieder einer Gruppe binden, unabhängig von deren Spezifitäten und für den Zielliganden (siehe unten). Im Allgemeinen weist das Vorhandensein einer Bindungsstelle für einen funktionellen generischen Liganden darauf hin, dass das Mitglied der Gruppe exprimiert und korrekt gefaltet wird. Somit stellt die Bindung des generischen Liganden an seine Bindungsstelle ein Verfahren zur Vorselektion funktioneller Polypeptide aus einer Gruppe von Polypeptiden bereit. Zielmmoleküle können ebenfalls generische Liganden aufweisen, die verwendet werden können, um die Funktionalität der Zielmoleküle zu zeigen.
  • Interaktion: Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich "interagieren" auf eine beliebige nachweisbare Interaktion zwischen den Polypeptiden und den Zielmolekülen. Beispielsweise kann im Falle von Antikörperpolypeptiden, wie beispielsweise scFv, die Interaktion eine Bindungsinteraktion sein und die Zielpolypeptide können Antigene sein. Alternativ dazu kann die Interaktion eine enzymatisch katalysierte Reaktion sein, bei der die Polypeptide Enzyme sein können, und die Zielmoleküle Substrate für diese. Oftmals umfasst die Bindung von Polypeptiden, wie beispielsweise Enzymen oder Molekülen, die an der Zellsignalübertragung beteiligt sind, ein Bindungsereignis und eine Veränderung in einer messbaren biochemischen Aktivität, wie beispielsweise einer Kinaseaktivität oder einer Phosphataseaktivität. Solche Aktivitäten werden unter Verwendung von Standardassayverfahren gemessen, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • Zueinander bringen (juxtaposition): Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst "zueinander bringen" den physi kalischen Kontakt, ist jedoch nicht auf diesen beschränkt. Die Gruppe und die Zielmoleküle werden zueinander gebracht, sodass die Polypeptide, die auf dem Array exprimiert werden, in der Lage sind, so mit den Zielmolekülen auf dem Träger zu interagieren, dass die Stelle der Interaktion von jedem einzelnen Mitglied der Gruppe mit dem Zielmolekül mit seiner Position auf dem Array korreliert werden kann. In einem bevorzugten Aspekt wird der Träger, der die Zielmoleküle immobilisiert darauf aufweist, in Kontakt mit dem Träger gebracht, auf dem die Nukleinsäuren, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, als Array angeordnet sind.
  • Polypeptid: Der Begriff "Polypeptid" bezieht sich auf jede Art von Polypeptid, wie beispielsweise Peptide, humane Proteine, Fragmente von humanen Proteinen, Proteine oder Fragmente von Proteinen von nicht-humanen Quellen, bearbeitete Versionen von Proteinen oder Fragmenten von Proteinen, Enzyme, Antigene, Wirkstoffe, Moleküle die an der Signalübertragung in der Zelle beteiligt sind, wie beispielsweise Rezeptormoleküle, Antikörper, einschließlich Polypeptide der Immunglobulin-Superfamilie, wie beispielsweise Antikörperpolypeptide oder T-Zellrezeptorpolypeptide. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind alle diese "Polypeptide" in der Lage (oder potentiell in der Lage) eine Interaktion mit einem Zielmolekül einzugehen, das im Falle einer Bindungsinteraktion ein Zielligand sein würde.
  • Die Antikörperpolypeptide können vorteilhafterweise sowohl Polypeptide der schweren Kette (VH) als auch der leichten Kette (VL) oder Einzeldomänen-Antikörpergruppen umfassen, die entweder Polypeptide der schweren Kette (VH) oder Polypeptide der leichten Kette (VL) umfassen. Ein Antikörperpolypeptid ist wie vorliegend verwendet ein Polypeptid, das entweder ein Antikörper oder ein Teil eines Antikörpers ist, modifiziert oder unmodifiziert. Somit umfasst der Begriff Antikörper-Polypeptid eine schwere Kette, eine leichte Kette, ein Dimer aus schwerer und leichter Kette, ein Fab-Fragment, ein F(ab')2-Fragment, eine Einzeldomäne einer schweren Kette, eine Einzeldomäne einer leichten Kette, ein Dab-Fragment und ein Fv-Fragment, einschließlich eines Einzelketten-Fv (svFv). Verfahren zur Konstruktion solcher Antikörpermoleküle und Nukleinsäuren, die für diese kodieren, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
  • Gruppe (repertoire): Eine "Gruppe" ist eine Population von verschiedenen Varianten, beispielsweise Nukleinsäurevarianten, die sich in ihrer Nukleotidsequenz unterscheiden, oder Polypeptidvarianten, die sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden. Im Allgemeinen umfasst eine Gruppe eine große Anzahl von Varianten, manchmal 1010, 1011, 1012 oder mehr. Große Gruppen umfassen die größte Anzahl von möglichen Varianten für die Selektion. Kleinere Gruppen können konstruiert werden und sind extrem nützlich, insbesondere wenn sie vorselektiert wurden, um unerwünschte Mitglieder zu entfernen, wie beispielsweise solche, die Stoppkodons umfassen, nicht in der Lage sind, sich korrekt zu falten oder die auf andere Weise inaktiv sind. Solche kleineren Gruppen können 10, 102, 103, 104, 105, 106 oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptide umfassen. Zweckmäßigerweise umfassen kleinere Gruppen zwischen 102 und 105 Nukleinsäuren oder Polypeptide. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Gruppe von Nukleotiden vorzugsweise so gestaltet, dass sie für eine entsprechende Gruppe von Polypeptiden kodiert.
  • Teilmenge: Eine "Teilmenge" ist ein Teil der Gruppe. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist lediglich eine Teilmenge der Gruppe in der Lage, mit dem Zielmolekül zu interagieren, und somit wird lediglich eine Teilmenge der Gruppe zu einer nachweisbaren Interaktion auf dem Array führen. Wenn beispielsweise das Zielmolekül ein spezifischer Ligand für einen Antikörper ist, wird eine Teilmenge von Antikörpern isoliert, die in der Lage ist, an den Zielliganden zu binden.
  • Zielmolekül: Ein Zielmolekül ist ein Molekül, für das eine Interaktion mit einen oder mehreren Mitgliedern der Gruppe vorgesehen ist. Somit umfasst der Begriff „Zielmolekül" Antigene, Antikörper, Enzyme, Substrate für Enzyme, Lipide, ein beliebiges Molekül, das in oder auf einer beliebigen Zelle oder einem zellulären Organismus exprimiert wird, beliebige organische oder anorganische kleine Moleküle und beliebige andere Moleküle, die in der Lage sind, mit einem Mitglied der Polypeptidgruppe zu interagieren. Diese Zielmoleküle können selbst Polypeptide sein, wobei dann sowohl die Gruppe als auch die Ziele Polypeptide sind. In einem solchen Fall kann die Gruppe eine Gruppe von Antigenen, oder Substraten von Enzymen sein, die gegen ein oder mehrere Antikörper oder Enzymmoleküle gescreent werden sollen; oder umgekehrt. Wenn die Interaktion eine Bindungsinteraktion ist, kann das Zielmolekül ein Zielligand sein (siehe unten).
  • Zielligand: Der Zielligand ist ein Molekül, für das Mitglieder der Polypeptidgruppe, die eine spezifische Bindungsaktivität aufweisen, identifiziert werden sollen. Wenn die Mitglieder der Polypeptidgruppe Antikörpermoleküle sind, kann der Zielligand ein Antigen sein, und wenn die Mitglieder der Gruppe Enzyme sind, kann der Zielligand ein Substrat sein. Wenn die Mitglieder der Polypeptidgruppe exprimierte cDNAs sind, können die Zielliganden selbst Antikörper oder andere Polypeptidmoleküle sein.
  • Konstruktion von Nukleinsäuren, die für Polypeptidgruppen kodieren
  • Im Allgemeinen können Nukleinsäurebibliotheken, die für die erfindungsgemäßen Gruppen von Polypeptiden kodieren, unter Verwendung von Verfahren konstruiert werden, die analog zu denjenigen sind, die bei der Konstruktion von Bibliotheken für das Phagendisplay verwendet werden. Solche Verfahren sind im Stand der Technik hinreichend bekannt (McCafferty et al. (1990). Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry. 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom el al. (1991). Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610, Breitling et al. (1991) Gene; 104: 147, Marks et al. (1991) oben; Barbas et al. (1992) oben: Hawkins und Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313.
  • Ein besonders vorteilhafter Ansatz ist die Konstruktion von scFv-Phagen-Bibliotheken gewesen (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) oben; Clackson et al. (1991) supra; Marks et al. (1991) oben; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) oben).
  • Bibliotheken gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise so ausgestaltet sein, dass sie auf einer vorbestimmten Konformation der Hauptkette basieren. Solche Bibliotheken können beispielsweise konstruiert werden, wie es in der internationalen Patentanmeldung WO 99/20749 beschrieben ist.
  • Entgegen den beim Phagendisplay verwendeten Ansätzen werden die Nukleinsäurebibliotheken gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch nicht als Fusionen mit einem Gen für ein Phagen-Hüllprotein konstruiert, und sie werden nicht notwendigerweise in Bakteriophagenvektoren konstruiert. Wenn ein Phage oder ein Phagemidvektor verwendet wird, wird das Polypeptid vorteilhafterweise nicht mit dem Hüllprotein fusioniert, sondern getrennt von diesem. Beispielsweise kann ein Stoppkodon in die Sequenz eingebracht werden, um sicherzustellen, dass die Poly peptide nicht als Fusion exprimiert werden. Jeder Vektor, der in der Lage ist, ein rekombinantes Polypeptid darin zu exprimieren ist geeignet. Die Polypeptide werden in vorteilhafter Weise von den Wirtszellen ausgeschieden.
  • Im Allgemeinen sind die Nukleinsäuremoleküle und Vektorkonstrukte, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, im Stand der Technik verfügbar und können konstruiert und manipuliert werden, wie es in Standardlaborhandbüchern beschrieben wird, wie beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA.
  • Die Manipulation von Nukleinsäuren wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung üblicherweise in rekombinanten Vektoren ausgeführt. Wie vorliegend verwendet, bezieht sich ein Vektor auf ein einzelnes Element, das verwendet wird, um heterologe DNA in Zellen für die Expression und/oder die Replikation derselben einzubringen. Verfahren, durch die solche Vektoren ausgewählt oder konstruiert und anschließend verwendet werden, sind dem Durchschnittsfachmann hinreichend bekannt. Zahlreiche Vektoren sind öffentlich verfügbar, einschließlich bakterieller Plasmide, Bakteriophagen, artifizieller Chromosomen und episomaler Vektoren. Solche Vektoren können für eine einfache Klonierung und Mutagenese verwendet werden; alternativ dazu wird ein Genexpressionsvektor verwendet, wie es bei Vektoren üblich ist, in denen erfindungsgemäße Mitglieder einer Gruppe (oder einer Vorgruppe) enthalten sind. Ein Vektor zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung kann so ausgewählt sein, dass er eine für ein Polypeptid kodierende Sequenz einer gewünschten Größe aufnimmt, üblicherweise mit einer Länge von 0,25 Kilobasen (kb) bis 40 kb. Eine geeignete Wirtszelle wird mit dem Vektor nach in vitro Klonierungsmanipulationen transformiert. Jeder Vektor umfasst verschiedene funktionelle Komponenten, die im Allgemeinen eine Klonierungs- (oder "Polylin ker-")Stelle, einen Replikationsursprung und mindestens ein selektierbares Markergen umfassen. Wenn der jeweilige Vektor ein Expressionsvektor ist, besitzt er darüber hinaus eine oder mehrere der folgenden Elemente: Enhancer-Element, Promotor, Transkriptionsterminationssequenzen und Signalsequenzen, wobei alle in der Nähe der Klonierungsstelle liegen, sodass sie in funktionsfähiger Weise mit dem Gen verknüpft sind, das für ein erfindungsgemäßes Mitglied der Polypeptidgruppe kodiert.
  • Sowohl die Klonierungsvektoren als auch die Expressionsvektoren enthalten im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen, die es dem Vektor ermöglichen, sich in einer oder in mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Typischerweise ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich autonom von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und die Replikationsursprünge und autonom replizierende Sequenzen umfasst. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung des Plasmids pBR322 ist für die meisten Gramnegativen Bakterien geeignet, der Replikationsursprung des 2 μ-Plasmids ist für Hefe geeignet, und zahlreiche virale Replikationsursprünge (z. B. SV 40, Adenovirus) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist der Replikationsursprung für Säugetierexpressionsvektoren nicht notwendig, außer wenn diese in Säugetierzellen verwendet werden, die in der Lage sind, hohe Menge von DNA zu replizieren, wie beispielsweise COS-Zellen.
  • Ein Klonierungsvektor oder Expressionsvektor kann zweckmäßigerweise ein Selektionsgen enthalten, das auch als Selektionsmarker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum von transfomierten Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium angezüchtet werden, notwendig ist. Wirtszellen, die nicht mit einem Vektor transformiert sind, der das Selektionsgen enthält, werden da her in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die resistent gegen Antibiotika und andere Toxinen vermitteln (z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat und Tetracyclin), die auxotrophe Mängel komplementieren oder entscheidende Nährstoffe liefern, die nicht im Wachstumsmedium enthalten sind.
  • Da die Replikation von Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung praktischerweise in E. coli durchgeführt wird, ist ein in E. coli selektierbarer Marker nützlich, wie beispielsweise das Gen für die β-Lactamase, welches Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vermittelt. Dies kann aus E. coli-Plasmiden, wie beispielsweise pBR322, oder aus einem pUC-Plasmid, wie beispielsweise pIC18 oder pUC19, erhalten werden.
  • Expressionsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und der in funktionsfähiger Weise mit der kodierenden Sequenz von Interesse verknüpft ist. Ein solcher Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Der Begriff "in funktionsfähiger Weise verknüpft" bezieht sich auf eine nebeneinander erfolgende Anordnung, wobei die beschriebenen Bestandteile in einem Zusammenhang stehen, der es ihnen erlaubt, in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die "in funktionsfähiger Weise" mit einer kodierenden Sequenz verknüpft ist, ist auf solche Weise ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die kompatibel mit den Kontrollsequenzen sind.
  • Promotoren, die für die Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignet sind, umfassen beispielsweise die β-Lactamase und die Lactose-Promotorsysteme, alkalische Phosphatase, das Tryptophan (trp)-Promotorsystem und Hybridpromotoren, wie beispielsweise den tac-Promotor. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden ferner im Allgemeinen eine Shine- Delgarno-Sequenz enthalten, die in funktionsfähiger Weise mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
  • In der Bibliothek von Nukleinsäurenmolekülen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind bevorzugte Vektoren Expressionsvektoren, die die Expression einer Nukleotidsequenz, welche für ein Mitglied einer Polypeptidgruppe kodiert, ermöglichen. Die Konstruktion solcher Vektoren umfasst herkömmliche Ligationsverfahren. Isolierte Vektoren oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der Form wieder ligiert, die gewünscht ist, um den benötigten Vektor zu erzeugen. Sofern dies gewünscht ist, kann eine Analyse in bekannter Weise durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die korrekten Sequenzen in dem konstruierten Vektor vorliegen. Geeignete Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, zur Herstellung von in vitro-Transkripten, zur Einbringung von DNA in Wirtszellen und zur Durchführung von Analysen zur Bestimmung der Expression und der Funktion sind dem Fachmann bekannt. Das Vorhandensein einer Gensequenz in einer Probe wird detektiert, oder seine Amplifikation und/oder Expression wird durch herkömmliche Verfahren quantifiziert, wie beispielsweise durch Southern- oder Northern-Analyse, Western-Blot, Dot-Blot von DNA, RNA oder Protein, in situ-Hybridisierung, Immunzytochemie oder Sequenzanalyse von Nukleinsäure oder Proteinmolekülen. Der Fachmann wird problemlos erkennen, wie diese Verfahren modifiziert werden können, sofern dies gewünscht ist.
  • Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR)
  • Sobald ein Vektorsystem ausgewählt ist und eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für Mitglieder der Polypeptidgruppe kodieren, in den Vektor kloniert sind, kann die Diversität innerhalb der klonierten Moleküle erzeugt werden, indem vor der Expression eine Mutagenese durchgeführt wird. Die Mutagenese von Nukleinsäurensequenzen, die für Polypeptidgruppen kodie ren, wird durch molekulare Standardverfahren durchgeführt. Von besonderer Verwendung ist die Polymerasekettenreaktion oder PCR (Mullis und Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335. Die PCR, die mehrere Zyklen einer DNA-Replikation, welche durch eine thermostabile, DNA-abhängige DNA-Polymerase katalysiert werden, zur Amplifikation der Zielsequenz von Interesse verwendet, ist im Stand der Technik bekannt.
  • Bei den Oligonukleotidprimern, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, handelt es sich um einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die an eine Nukleinsäurematrize hybridisieren, um die enzymatische Synthese eines zweiten Nukleinsäurestrangs zu starten. Der Primer ist komplementär zu einem Teil eines Zielmoleküls, das in einem Pool von Nukleinsäuremolekülen vorliegt, der bei der Herstellung von Gruppen von erfindungsgemäßen Arrays verwendet werden. Es wird vorgeschlagen, dass ein solches Molekül durch synthetische Verfahren hergestellt wird, entweder chemisch oder enzymatisch. Alternativ dazu tritt ein solches Molekül oder ein Fragment davon natürlich auf, und es wird aus seiner natürlichen Quelle isoliert oder von einem kommerziellen Anbieter bezogen. Mutagene Oligonukleotidprimer sind 15 bis 100 Nukleotide lang, idealerweise 20 bis 40 Nukleotiden, obwohl Oligonukleotide unterschiedlicher Länge verwendet werden können.
  • Üblicherweise tritt eine selektive Hybridisierung auf, wenn zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen komplementär sind (mindestens etwa 65% Komplementarität über einen Abschnitt von mindestens 14 bis 25 Nukleotide, vorzugsweise mindestens etwa 75%, stärker bevorzugt mindestens etwa 90% Komplementarität). Siehe Kanehisa (1984) Nucleic Acids Res. 12: 203. Es wird daher erwartet, dass ein bestimmtes Ausmaß an Fehlpaarung an der Primingstelle toleriert wird. Eine solche Fehlpaarung kann klein sein, wie beispielsweise ein Mono-, Di- oder Trinukleotid. Alternativ dazu kann sie Nukleotidschleifen umfassen, die von uns als Regionen definiert werden, in denen die Fehlpaarung eine ununterbrochene Folge von 4 oder mehr Nukleotiden umfasst.
  • Insgesamt beeinflussen fünf Faktoren die Wirksamkeit und Selektivität der Hybridisierung des Primers an ein zweites Nukleinsäuremolekül. Diese Faktoren, bei denen es sich um die folgenden handelt: (i) Primerlänge, (ii) die Nukleotidsequenz und/oder -Zusammensetzung, (iii) die Hybridisierungstemperatur, (iv) Pufferchemie und (v) die Möglichkeit einer sterischen Behinderung in der Region, an die der Primer hybridisieren muss, sind wichtige Erwägungen, wenn nicht zufällige Primingsequenzen erstellt werden.
  • Es gibt eine positive Korrelation zwischen Primerlänge und der Effizienz und Genauigkeit, mit der sich ein Primer an eine Zielsequenz anlagern wird; längere Sequenzen haben eine höhere Schmelztemperatur (TM) als kürzere, und es ist weniger wahrscheinlich, dass sie innerhalb einer gegebenen Zielsequenz wiederholt werden, wodurch eine gemischte Hybridisierung minimiert wird. Primersequenzen mit einem hohen G-C-Gehalt oder diejenigen, die palindromische Sequenz umfassen, neigen zur Hybridisierung mit sich selbst, wie auch ihre beabsichtigten Zielstellen, da unimolekulare Hybridisierungskinetiken in Lösung allgemein gegenüber bimolekularen bevorzugt werden; gleichzeitig ist es wichtig, einen Primer zu erstellen, der eine ausreichende Anzahl von G-C Nukleotidpaarungen aufweist, um die Zielsequenz fest zu binden, da jedes dieser Paare durch 3 Wasserstoffbindungen verbunden ist, und nicht durch die zwei, die in A-T Basenpaaren gefunden werden. Die Hybridisierungstemperatur verändert sich invers mit der Primeranlagerungseffizienz, wie auch die Konzentration an organischen Lösungsmitteln, z. B. Formamid, das in eine Hybridisierungsmischung zugegeben werden kann, wohingegen Erhöhungen der Salzkonzentration die Bindung erleichtern. Unter stringenten Hy bridisierungsbedingungen hybridisieren längere Sonden effizienter als kürzere, die unter freizügigeren Bedingungen ausreichend sind. Stringente Hybridisierungsbedingungen umfassen üblicherweise Salzkonzentrationen von weniger als etwa 1 M, wobei weniger als etwa 500 mM üblicher sind, und vorzugsweise weniger als etwa 200 mM. Die Hybridisierungstemperatur reicht von 0°C bis zu mehr als 22°C, mehr als etwa 30°C und (in den häufigsten Fällen) bis zu mehr als etwa 37°C. Längere Fragmente können höhere Hybridisierungstemperaturen für eine spezifischen Hybridisierung erfordern. Da mehrere Faktoren die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen, ist die Kombination der Parameter wichtiger als die absolute Messung jedes einzelnen allein.
  • Vor dem Hintergrund dieser Erwägungen werden die Primer gestaltet. Während Einschätzungen bezüglich der relativen Werts zahlreicher Sequenzen mental vom Fachmann durchgeführt werden können, sind Computerprogramme entwickelt worden, um bei der Bewertung dieser zahlreichen Parameter und bei der Optimierung der Primersequenzen zu helfen. Beispiele für solche Programme sind "PrimerSelect" aus dem DNAStarTM-Softwarepaket (DNAStar, Inc.; Madison, WI) und OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.). Sobald sie konzipiert sind, werden geeignete Oligonukleotide durch ein geeignetes Verfahren hergestellt, z. B. durch das von Beaucage und Carruthers (1981) Tetrahedron Lett., 22: 1859) beschriebene Phosphoramiditverfahren oder das Triesterverfahren nach Matteucci und Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, oder durch andere chemische Verfahren, entweder unter Verwendung eines kommerziellen, automatisierten Oligonukleotid-Synthesegeräts oder unter Verwendung der VLSIPSTM-Technologie.
  • Die PCR wird unter Verwendung von Matrizen-DNA (mindestens 1 fg; üblicherweise 1–1000 ng) und mit mindestens 25 pmol der Oligonukleotidprimer durchgeführt; es kann zweckmäßig sein, größere Mengen des Primers zu verwenden, wenn der Primerpool stark heterogen ist, da jede Sequenz lediglich in einem geringen Anteil unter den Molekülen des Pools vertreten ist, und die Mengen in späteren Amplifikationszyklen beschränkend werden können. Eine typische Reaktionsmischung umfasst: 2 μl DNA, 25 pmol Oligonukleotidprimer, 2,5 μl 10 × PCR-Puffer 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0,4 μl 1,25 μM dNTP, 0,15 μl (oder 2,5 Einheiten) Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) und deionisiertes Wasser in einem Gesamtvolumen von 25 μl. Es wird mit Mineralöl überschichtet, und die PCR wird unter Verwendung eines programmierbaren Thermocyclers durchgeführt.
  • Die Länge und Temperatur jedes Schritts eines PCR-Zyklus sowie auch die Anzahl der Zyklen wird gemäß den tatsächlichen Stringenzerfordernisse angepasst. Die Anlagerungstemperatur und das Timing werden sowohl durch die Effizienz bestimmt, die man bei Anlagerung des Primers an eine Matrize erwartet, als auch vom Ausmaß der Fehlpaarung, die toleriert werden muss; wenn Nukleinsäuremoleküle gleichzeitig amplifiziert und mutagenisiert werden, ist offensichtlich eine Fehlpaarung erforderlich, zumindest in der ersten Runde des Synthese. Beim Versuch der Amplifikation einer Population von Molekülen unter Verwendung eines gemischten Pools aus mutagenen Primern wird unter stringenten (hohe Temperatur) Anlagerungsbedingungen der Verlust von potentiell mutierten Produkten, die lediglich von niedrigschmelzenden Temperaturen resultieren würden, gegen die gemischte Anlagerung von Primern an Sequenzen gewichtet, welche nicht der Zielstelle entsprechen. Die Fähigkeit zur Optimierung der Stringenz der Primeranlagerungsbedingungen liegt im Bereich des durchschnittlichen Könnens des Fachmanns. Eine Anlagerungstemperatur von zwischen 30°C und 72°C wird verwendet. Die anfängliche Denaturierung der Matrizenmoleküle tritt normalerweise bei zwischen 92°C und 99°C für 4 Minuten auf, gefolgt von 20 bis 40 Zyklen, die aus Denaturierung (94–99°C für 15 Sekunden bis 1 Minute), Anlagerung (Temperatur wie oben beschrieben bestimmt; 1–2 Minuten) und Extension (72°C für 1–5 Minuten bestehen, abhängig von der Länge des zu amplifizierenden Produkts). Die finale Extension wird üblicherweise für 4 Minuten bei 72°C durchgeführt, und es kann eine unbestimmter (0–24 Stunden) Schritt bei 4°C gefolgt werden.
  • Expression der Nukleinsäuren
  • Nukleinsäuremoleküle, die für eine Gruppe von Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, können nach mehreren Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, exprimiert werden. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Expression" die Transkription und/oder Translation von Nukleinsäuren in Proteine.
  • Wenn die Nukleinsäuren in Form von nackter Nukleinsäure oder in Form von komplexierter Nukleinsäure außerhalb der Umgebung einer Zelle als Array angeordnet werden, sind Bestandteile eines biologischen in vitro Systems erforderlich, um die Nukleinsäuren zu exprimieren. Diese werden anhand der Erfordernisse eines spezifischen Systems nach folgenden Merkmalen ausgewählt: ein geeigneter Puffer, ein in vitro-Transkriptions-/Replikationssystem und/oder ein in vitro-Translationssystem, das alle notwendigen Inhaltsstoffe, Enzyme und Co-Faktoren, RNA-Polymerase, Nukleotide, Nukleinsäuren (natürlich oder synthetisch), Transfer-RNAs, Ribosomen und Aminosäuren und die Substrate der Reaktion von Interesse umfasst, um die Selektion des modifizierten Genprodukts zu ermöglichen.
  • Ein geeigneter Puffer wird ein solcher sein, in dem alle gewünschten Bestandteile des biologischen Systems aktiv sind und somit von den Erfordernissen jedes spezifischen Reaktionssystems abhängen wird. Puffer, die für die biologische Reaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt und Protokolle werden in verschiedenen Laborbüchern bereitgestellt, wie beispielsweise Sambrook et al, 1989.
  • Das in vitro-Translationssystem wird üblicherweise einen Zellextrakt umfassen, typischerweise von Bakterien (Zubay, 1973: Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), Kaninchen-Retikulozyten (Pelham und Jackson, 1976) oder Weizenkeimen (Anderson et al., 1983). Zahlreiche geeignete Systeme sind kommerziell verfügbar (beispielsweise von Promega) einschließlich solcher, die eine gekoppelte Transkription/Translation erlauben werden (alle bakteriellen Systeme und das Retikulozytensystem und das Weizenkeim-TNTTM-Extraktsystem von Promega). Die verwendete Mischung von Aminosäuren kann synthetische Aminosäuren umfassen, sofern dies gewünscht ist, um die mögliche Anzahl oder Vielfalt von Proteinen, die in der Bibliothek produziert werden, zu erhöhen. Dies kann erreicht werden, indem tRNAs mit künstlichen Aminosäuren beladen werden und diese tRNAs für die in vitro-Translation der zu selektierenden Proteine verwendet wird (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et a. 1995).
  • Wenn die Nukleinsäuren in Form von Zellen oder Zellkolonien als Array angeordnet werden, findet die Expression in der Zelle selbst statt. Geeignete Wirtszellen sind im Stand der Technik bekannt. Wirtszellen, wie beispielsweise prokaryontische Zellen, Hefezellen oder höhere eukaryontische Zellen können verwendet werden, um die DNA zu replizieren und die Polypeptidgruppe zu produzieren. Geeignete Prokaryonten umfassen Eubakterien, wie beispielsweise Gram-negative oder Gram-positive Organismen, wie beispielsweise E. coli, wie beispielsweise E. coli K-12-Stämme, DH5α und HB101, oder Bacilli. Weitere Wirte, die für die Vektoren geeignet sind, welche für die Polypeptidgruppe kodieren, umfassen eukaryontische Mikroben, wie beispielsweise filamentöse Pilze oder Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Höhere eukaryontische Zellen umfassen Insekten- und Vertebratenzellen, insbesondere Säugetierzellen, einschließlich humaner Zellen oder kernhaltiger Zellen von ande ren multizellulären Organismen. Die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist ein Routineverfahren. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien sind epitheliale oder fibroblastische Zelllinien, wie beispielsweise Chinese hamster ovary (CHO)-Zellen, NIH 3T3-Zellen, HeLa-Zellen oder 293T-Zellen. Die Wirtszellen, die in dieser Offenbarung erwähnt werden, umfassen Zellen in in vitro-Kultur sowie auch Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstieres befinden.
  • DNA kann stabil in Zellen eingebracht werden, oder sie kann transient unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren exprimiert werden. Stabil transfizierte Säugetierzellen können hergestellt werden, indem Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der ein selektierbares Markergen umfasst, und die transfizierten Zellen unter Bedingungen angezüchtet werden, die selektiv für Zellen sind, die das Markergen exprimieren. Um transiente Transfektanten zu produzieren, werden Säugetierzellen mit einem Reportergen transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu verfolgen.
  • Um solche stabil oder transient transfizierten Zellen herzustellen, sollten die Zellen mit einer ausreichenden Menge der Nukleinsäure transfiziert werden. Die präzisen Mengen der DNA, die für die Mitglieder der Polypeptidgruppe kodiert, welche erforderlich sind, kann empirisch bestimmt und für eine bestimmte Zelle und für einen bestimmten Assay optimiert werden.
  • Wirtszellen werden mit den obigen Expressions- oder Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die soweit erforderlich modifiziert wurden, um Promotoren zu induzieren, Transformanten zu selektieren und die Gene zu amplifizieren, die für die gewünschten Sequenzen kodieren. Heterologe DNA kann durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren in eine Wirtszelle eingebracht werden, wie bei spielsweise Transfektion mit einem Vektor, der für eine heterologe DNA kodiert, durch das Calciumphosphat-Co-Präzipitationsverfahren oder durch Elektroporation. Zahlreiche Verfahren der Transfektion sind dem Fachmann bekannt. Eine erfolgreiche Transfektion wird üblicherweise daran erkannt, dass ein beliebiges Anzeichen für das Funktionieren des Vektors in der Wirtszelle auftritt. Eine Transformation wird unter Standardmethoden erreicht, die sich für die jeweils verwendete Wirtszellen eignen.
  • Die Einbringung von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder eine Kombination von Plasmidvektoren, wobei jeder für ein oder mehrere verschiedene Gene kodiert, oder mit linearer DNA sowie die Selektion von transfizierten Zellen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt (siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • Transfizierte oder transformierte Zellen werden unter Verwendung von Medien und Kultivierungsverfahren kultiviert, die im Stand der Technik bekannt sind, vorzugsweise unter Bedingungen, bei denen die Polypeptidgruppe, die von den Nukleinsäuremolekülen kodiert wird, exprimiert wird. Die Zusammensetzung von geeigneten Medien ist im Stand der Technik bekannt, sodass diese problemlos hergestellt werden können. Geeignete Kultivierungsmedien sind darüber hinaus kommerziell verfügbar.
  • Anordnen von Nukleinsäuren als Array
  • Nukleinsäuren können als Array angeordnet werden, indem eines von einer Vielzahl von verschiedenen Verfahren verwendet wird, abhängig davon, ob die Nukleinsäuren als solche oder als Bestandteil innerhalb von Zellen als Array angeordnet werden.
  • (a) Synthese von Nukleinsäurearrays
  • Arrays aus Nukleinsäuren können durch direkte chemische Synthese von Nukleinsäuremolekülen hergestellt werden. Die chemische Synthese umfasst die Synthese von Arrays aus Nukleinsäuren auf einer Oberfläche in einer Weise, bei der jede unterschiedliche Nukleinsäure (z. B. einzeln vorkommende Nukleinsäuresequenz) an einem getrennten, vorbestimmten Ort in dem Array platziert wird. Die Identität jeder Nukleinsäure wird durch die räumliche Lokalisierung im Array identifiziert. Diese Verfahren sind ausgehend von denjenigen angepasst, die in US-Patent Nr. 5,143,854 ; WO 90/15070 und WO 92/10092 ; Fodor et al. (1991) Science, 251: 767; Dower und Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271 beschrieben sind.
  • (b) Anordnen von Zellen als Array
  • In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung können Arrays aus Nukleinsäuren durch Anordnen von Zellen als Array hergestellt werden. Obwohl Zellen problemlos auf einem Filter ausgestrichen und angezüchtet werden können, der auf einem bakteriellen Wachstumsmedium platziert ist, ist es vorteilhaft, Zellen durch robotergestütztes Picking als Array anzuordnen, da robotergestützte Verfahren die genaueste und dichteste Raster aus Zellkolonien ermöglichen; es sind jedoch beliebige Verfahren, einschließlich manueller Verfahren, verwendbar, die für die Lokalisierung von Zellen oder Kolonien von Zellen an getrennten Orten auf einem Träger geeignet sind.
  • Das Rastern von Zellen kann regulär sein, sodass jede Kolonie sich in einem bestimmten Abstand von der nächsten befindet, oder es kann zufällig verteilt ist. Wenn die Kolonien auf Zufallsbasis voneinander beabstandet werden, kann ihre Dichte angepasst werden, um die Wahrscheinlichkeit von Kolonien, die auf dem gewählten Träger überlappen, statistisch zu verringern oder zu eliminieren.
  • Verfahren zur Arraybildung mit Zellkolonien sind ausführlich in US-Patent Nr. 5,326,691 beschrieben.
  • (c) Anordnen von Antikörpern als Array
  • Antikörper können durch robotergestütztes Rastern als Array angeordnet werden, wobei eine kommerzielle Technologie verwendet wird, wie sie allgemein im Stand der Technik verfügbar ist, oder sie können in situ von als Array angeordneten Antikörper-produzierenden Zellen exprimiert werden, die beispielsweise wie oben beschrieben als Array angeordnet wurden. Die robotergestützte Arraybildung ist im Stand der Technik hinreichend bekannt, und Geräte sind von Firmen wie Genetix, Genetic MicroSystems und BioRobotics verfügbar, wobei diese in der Lage sind, mit einer hohen Geschwindigkeit und einer großen Genauigkeit Arrays über eine kleine oder über eine große Oberfläche zu bilden. Solche Geräte sind in der Lage, gereinigtes Protein, Überstand oder Zellen auf poröse oder nicht-poröse Oberflächen aufzutropfen, sodass diese anschließend auf diesen befestigt werden können, sofern dies notwendig ist, um stabile Arrays zu bilden. Die Arrays können falls erforderlich repliziert werden, um das gleichzeitige Screening mit mehreren Zielliganden zu ermöglichen. Auf Zellen basierende Arrays können lysiert werden, um die Polypeptide in situ freizusetzen und/oder exprimierte Polypeptide können an den festen Träger nach bekannten Verfahren fixiert werden.
  • Selektion von Polypeptiden, die an Zielmoleküle gebunden haben
  • Wie oben aufgeführt können die Zielmoleküle in der Lage sein, mit Mitgliedern einer Polypeptidgruppe spezifisch zu interagieren, oder sie können zu einer generischen Interaktion in der Lage sein. Zielmoleküle, die in der Lage sind, spezifisch zu interagieren, werden lediglich mit denjenigen Polypeptiden interagieren, die eine erwünschte, aus der Gruppe zu selektierende Aktivität aufweisen. Solche Zielmoleküle umfassen spezifische Antigene für Antikörper oder Substrate für Enzyme.
  • Zielmoleküle, die in der Lage sind, eine generische Interaktion einzugehen, werden im allgemeinen mit einer vergleichsweise größeren Teilmenge der Gruppe, welche eine erwünschte Eigenschaft hat, interagieren, beispielsweise mit funktionellen Mitgliedern, die korrekt gefaltet sind oder auf andere Weise theoretisch in der Lage sind, eine Funktion auszuüben. Insbesondere Verwendung von spezifischen und generischen Liganden für Antikörperpolypeptide ist ausführlich in der internationalen Patentanmeldung WO 99/20749 beschrieben.
  • Sobald die Antikörper-Polypeptide die Zielmoleküle gebunden haben, können sie unter Verwendung von verschiedenen generischen Liganden, die von der Art der verwendeten Zielmoleküle abhängen, detektiert werden. Wenn somit das Zielmolekül ein Antigen ist, kann markiertes Protein L für die Detektion von spezifischen bindenden Mitgliedern der Gruppe verwendet werden, wohingegen markiertes Protein A zur Detektion von funktionellen Mitgliedern der Gruppe verwendet werden kann, wenn das Zielmolekül Protein L ist.
  • Generische Liganden können die Form von Superantigenen annehmen, wie beispielsweise Protein A oder Protein L oder geeignete Antikörpermoleküle. Wenn ein geeigneter Antikörper nicht öffentlich verfügbar ist, kann er durch Phagendisplayverfahren oder wie nachfolgend erläutert hergestellt werden.
  • Rekombinante Proteine oder Proteine, die von natürlichen Quellen stammen, können verwendet werden, um Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind, zu erzeugen. Beispielsweise wird das Protein (oder "Immunogen") verabreicht, um in einem Säugetier, wie beispielsweise in einem Affen, einer Ziege, einem Kaninchen oder einer Maus eine Reaktion auszulösen. Die resultierenden Antikörper können als polyklonale Seren oder als Antikörper-produzierende Zellen von dem Tier, in dem die Reaktion ausgelöst wurde, eingesammelt und immortalisiert werden (z. B. durch Fusion mit einem immortalisierten Fusionspartner, wobei ein Hybridom gebildet wird), wobei die Zellen anschließend monoklonale Antikörper produzieren.
  • (a) Polyklonale Antikörper
  • Das Antigen-Protein wird entweder allein verwendet oder an einen herkömmlichen Träger konjugiert, um seine Immunigenizität zu erhöhen, und ein Antiserum gegen das Peptid-Träger-Konjugat wird wie oben beschrieben in einem Tier erzeugt. Die Kopplung eines Peptids an ein Trägerprotein und die Immunisierungen können wie beschrieben durchgeführt werden ((Dymecki et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 4815). Das Serum wird gegen das Protein-Antigen in einem ELISA oder alternativ mittels Dot-Blot oder Spot-Blut titriert (Boersma und Van Leeuwen (1994) J. Neurosci. Methods. 51: 317). Es zeigt sich, dass das Serum stark mit geeigneten Peptiden in einem ELISA reagiert, beispielsweise nach dem Verfahren von Green et al. (1982) Cell. 28: 477.
  • (b) Monoklonale Antikörper
  • Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind hinreichend bekannt, und monoklonale Antikörper können unter Verwendung von beliebigen Kandidaten-Antigenen hergestellt werden, vorzugsweise gebunden an einen Träger, wie es beispielsweise von Arnheiter et al. (1981) Nature, 294, 278, beschrieben wird. Monoklonale Antikörper werden üblicherweise von Hybridom-Gewebekulturen oder von Aszitesflüssigkeit erhalten, die von Tieren erhalten wird, in die das Hybridomgewebe eingebracht wurde. Dennoch können monoklonale Antikörper dadurch beschrieben werden, dass sie "gegen ein Protein erzeugt" oder "von einem Protein induziert" wurden.
  • Nach ihrer Erzeugung werden monoklonale Antikörper durch ein beliebiges von mehreren Mitteln auf ihre Funktion und Spezifi tät getestet. Ähnliche Vorgehensweisen können auch verwendet werden, um rekombinante Antikörper zu testen, die durch Phagendisplay oder durch andere in vitro Selektionsverfahren produziert wurden. Hybridome, die monoklonale Antikörper (oder polyklonale Seren) produzieren, können ebenfalls in einem Screening auf einer Antikörperbindung an das Immunogen untersucht werden. Besonders bevorzugte immunologische Tests umfassen Enzym-gebundene Immunassays (ELISA), Immunblot und Immunpräzipitation (siehe Voller, (1978) Diagnostic Horizons, 2: 1, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller et al. (1978) J. Clin. Pathol., 31: 507; US-Reissue Pat. Nr. 31,006 ; GB-Patent 2,019,408 ; Butler (1981) Methods Enzymol., 73: 482; Maggio, E. (Hrsg.), (1980) Enzyme Immunoassay., CRC Press, Boca Raton, FL) oder Radioimmunassays (RIA) (Weintraub, B., Principles of radioimmunoassays, Seventh Training Course an Radioligand Assay Techniques; The Endocrine Society, März 1986, Seiten 1-5, 46-49 und 68-78), wobei alle der Detektion einer Bindung des Antikörpers an das Immunogen dienen, gegen das dieser erzeugt wurde. Es wird dem Fachmann ersichtlich sein, dass entweder das Antikörpermolekül oder das Immunogen markiert sein müssen, um eine solche Detektion zu ermöglichen. Techniken zur Markierung von Antikörpermolekülen sind dem Fachmann hinreichend bekannt (siehe Harlour und Lane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 1-726).
  • Alternativ dazu können andere Verfahren verwendet werden, um die Bindung an das Immunogen zu detektieren, wobei die Integrität des Antikörpers bestätigt wird. Diese umfassen chromatographische Verfahren, wie beispielsweise SDS-PAGE, isoelektrische Fokussierung, Western-Blot, HPLC und Kapillarelektrophorese.
  • "Antikörper" werden vorliegend als Konstruktionen definiert, welche die bindende (variable) Region eines solchen Antikör pers und weitere Antikörpermodifikationen verwenden. Somit kann ein im Rahmen der Erfindung nützlicher Antikörper vollständige Antikörper, Antikörperfragmente, polyfunktionelle Antikörperaggregate oder allgemein eine beliebige Substanz umfassen, die ein oder mehrere spezifische Bindungsstellen von einem Antikörper umfasst. Die Antikörperfragmente können Fragmente sein, wie beispielsweise Fv-, Fab- und F(ab')2-Fragmente oder beliebige Derivate davon, wie beispielsweise ein einzelkettiges Fv-Fragment. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können nicht-rekombinant, rekombinant oder humanisiert sein. Der Antikörper kann von jedem Immunglobulin-Isotyp sein, z. B. IgG, IgM, usw. Darüber hinaus können Aggregate, Polymere, Derivate und Konjugate von Immunglobulin oder deren Fragmenten verwendet werden, sofern dies geeignet erscheint.
  • Sonden für die Detektion von gebundenem Immunglobulin können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren markiert werden, wobei diese entweder generische Liganden oder spezifische Antigene sein können. Verfahren zur Markierung von Sonden werden beispielsweise in Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.) oder Ausubel, et al., Hrsg. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Inc., beschrieben.
  • Verwendung von Polypeptiden die gemäß der vorliegenden Erfindung selektiert werden
  • Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren selektierte Polypeptide können im Wesentlichen in einem beliebigen Verfahren verwendet werden. Wenn die Polypeptide Antikörper-Polypeptide sind, können sie in einem beliebigen Verfahren verwendet werden, das eine Liganden-Polypeptid-Bindung umfasst, einschließlich therapeutischer und prophylaktischer Anwendungen in vivo, diagnostischen Anwendungen in vitro und in vivo, in einem in vitro-Assay und in Reagenzapplikationen und Ähnlichen. Beispielswei se können im Falle von Antikörpern Antikörpermoleküle in auf Antikörpern basierenden Assay-Verfahren verwendet werden, z. B. als ELISA-Methoden, nach den im Stand der Technik bekannten Verfahren.
  • Wie oben erwähnt sind die Moleküle, die gemäß der vorliegenden Erfindung selektiert werden, bei diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verfahren nützlich. Beispielsweise können Enzymvarianten, die durch diese Verfahren erzeugt und selektiert werden, auf ihre Aktivität untersucht werden, entweder in vitro oder in vivo unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, bei denen sie mit Kandidatensubstratmolekülen inkubiert werden, und die Umsetzung des Substrats zum Produkt analysiert wird. Selektierte Zelloberflächenrezeptoren oder Adhäsionsmoleküle können in kultivierten Zellen exprimiert werden, die anschließend auf ihre Fähigkeit untersucht werden, auf biochemische Stimuli zu reagieren, oder auf ihre Affinität mit anderen Zelltypen, welche Zelloberflächenmoleküle exprimieren, von denen angenommen wird, dass das unveränderte Adhäsionsmolekül daran binden würde. Antikörperpolypeptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung selektiert werden, sind in Western-Analysen und bei der in situ-Proteindetektion durch immunhistochemische Standardverfahren diagnostisch nützlich; für die Verwendung in diesen Anwendungen können die Antikörper einer ausgewählten Gruppe mit im Stand der Technik bekannten Verfahren markiert werden. Darüber hinaus können solche Antikörperpolypeptide in präparativen Affinitätschromatographieverfahren verwendet werden, wenn sie an einen chromatographischen Träger komplexiert werden, wie beispielsweise an eine Säule. All diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
  • Therapeutische und prophylaktische Verwendungen von Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren selektiert wurden, umfassen die Verabreichung von erfindungsgemäß selektierten Polypeptiden an einen Empfängersäugetier, wie beispielsweise einen Menschen. Von besonderer Verwendung in dieser Hinsicht sind Antikörper, andere Rezeptoren (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf T-Zellrezeptoren) und in dem Falle, dass ein Antikörper oder ein Rezeptor entweder als generischer Ligand oder als Zielligand verwendet wurde, Proteine, die an diese binden.
  • Im Wesentlichen reine Antikörper oder bindende Proteine davon mit mindestens 90 bis 95% Homogenität sind für die Verabreichung an ein Säugetier bevorzugt, und 98 bis 99% oder mehr Homogenität ist für pharmazeutische Verwendungen am meisten bevorzugt, insbesondere wenn das Säugetier ein Mensch ist. Sobald die selektierten Polypeptide aufgereinigt sind (je nach Wunsch partiell oder bis zur Homogenität), können diese diagnostisch oder therapeutisch (einschließlich extrakorporal) oder bei der Entwicklung und Durchführung von Assayverfahren, Immunfluoreszenzfärbung und Ähnlichem verwendet werden (Lefkovite und Pernis (1979 und 1981) Immunological Methods, Bände I und II, Academic Press, NY).
  • Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren selektierten Antikörper oder bindenden Proteine davon werden typischerweise Verwendung bei der Vorbeugung, Suppression oder Behandlung von inflammatorischen Zuständen, allergischer Hypersensitivität, Krebs, bakteriellen und viralen Infektionen und Autoimmunerkrankungen (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Diabetes Typ I, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Morbus Crohn und Myasthenia gravis).
  • Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung umfasst der Begriff "Vorbeugung" die Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung vor der Induktion der Erkrankung. "Suppression" bezieht sich auf die Verabreichung einer Zusammensetzung nach dem indukti ven Ereignis, jedoch vor dem klinischen Auftreten der Erkrankung. "Behandlung" betrifft die Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung, nachdem die Krankheitssymptome offensichtlich geworden sind.
  • Tiermodellsysteme können verwendet werden, um die Wirksamkeit der Antikörper oder der bindenden Proteine davon beim Schutz vor der Erkrankung oder bei der Behandlung der Erkrankung verwendet werden. Verfahren zur Untersuchung von systemischem Lupus erythematosus (SLE) in empfindlichen Mäusen sind im Stand der Technik bekannt (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). Myasthenia gravis (MG) wird in weiblichen SJL/J Mäusen durch Induzieren der Erkrankung mit löslichem AchR-Protein aus anderen Spezies untersucht (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). Arthritis wird in einem empfindlichen Mäusestamm durch Injektion von Kollagen Typ II induziert (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Es ist ein Modell beschrieben worden, durch das eine adjuvante Arthritis in empfindlichen Ratten durch Injektion von Hitzeschockprotein aus Mycobakterien induziert wird (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Thyroiditis wird in Mäusen durch Verabreichung von Thyreoglobulin induziert, wie es beschrieben ist (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). Insulin-abhängige Diabetes mellitus (IDDM) tritt natürlicherweise auf oder kann in bestimmten Mäusestämmen induziert werden, wie beispielsweise in denjenigen, die von Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113 beschrieben wurden. EAE in Mäusen und Ratten dient als Modell für MS in Menschen. In diesem Modell wird die demyelinisierende Erkrankung durch Verabreichung von Myelin-Basisprotein (siehe Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., Hrsg., Grune und Stratton, New York, Seiten 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179, 478; und Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179) induziert.
  • Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren selektierten Antikörper, Rezeptoren (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf T-Zellrezeptoren) oder bindenden Proteine davon können in Kombination mit anderen Antikörpern, insbesondere mit monoklonalen Antikörpern (mAbs), verwendet werden, die reaktiv mit anderen Markern auf humanen Zellen sind, welche für die Erkrankung verantwortlich sind. Beispielsweise können geeignete T-Zellmarker diejenigen umfassen, die in die sogenannten "Clusters of Differentiation" gruppiert wurden, wie sie durch den ersten internationalen Workshop der Leukozyten-Differenzierung benannt wurden (Bernhard et al. (1984) Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY).
  • Im Allgemeinen werden die vorliegend selektierten Antikörper, Rezeptoren oder bindenden Proteine in aufgereinigter Form zusammen mit pharmakologisch geeigneten Trägern verwendet werden. Üblicherweise umfassen diese Träger wässrige oder alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, von denen jede Salzlösungen und/oder gepufferte Medien enthält. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid und mit Laktat versetzte Ringerlösung. Geeignete physiologisch akzeptable Adjuvantien (sofern diese notwendig sind um den Polypeptidkomplex in Suspension zu halten) können aus Verdickern wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und Alginaten ausgewählt werden.
  • Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeit und Nährstoff-Ergänzungslösungen und Elektrolyt-Ergänzungslösungen, wie beispielsweise diejenigen, die auf Ringer-Dextrose basieren. Konservierungsstoffe und andere Zusätze, wie beispielsweise antimikrobielle Substanzen, Antioxidantien, chelatierende Mittel und inerte Gase können ebenfalls vorhanden sein (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage).
  • Die selektierten Polypeptide können als separat verabreichte Zusammensetzungen oder in Zusammenhang mit anderen Mitteln verwendet werden. Diese können verschiedene immuntherapeutische Wirkstoffe, wie beispielsweise Cyclosporin, Methotrexat, Adriamycin oder Cisplatin und Immunotoxine umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen können "Cocktails" aus verschiedenen zytotoxischen Mitteln oder anderen Mitteln in Kombination mit den erfindungsgemäß selektierten Antikörpern, Rezeptoren oder bindenden Proteinen davon umfassen, oder sogar Kombinationen aus erfindungsgemäß selektierten Polypeptiden mit verschiedenen Spezifitäten, wie beispielsweise Polypeptiden, die unter Verwendung verschiedener Zielliganden selektiert wurden, unabhängig davon, ob sie vor der Verabreichung vereinigt werden.
  • Die Verabreichungsart der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann eine beliebige der Verabreichungsarten sein, die dem Fachmann bekannt sind. Für die Therapie (die ohne Einschränkung eine Immuntherapie einschließt) können die selektierten erfindungsgemäßen Antikörper, Rezeptoren oder bindenden Proteine davon nach Standardverfahren an einen beliebigen Patienten verabreicht werden. Die Verabreichung kann nach einer beliebigen, geeigneten Methode erfolgen, einschließlich parenteral, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, transdermal, pulmonal oder auch (sofern geeignet) durch direkte Infusion mit einem Katheter. Die Dosierung und Frequenz der Verabreichung wird vom Alter, Geschlecht und Zustand des Patienten abhängen, von einer gleichzeitigen Verabreichung anderer Wirkstoffe, von Gegenindikationen und anderen Parametern, die vom Arzt in Betracht gezogen werden müssen.
  • Die selektierten Polypeptide können für die Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Es hat sich gezeigt, dass diese Methode bei herkömmlichen Immunglobulinen wirksam ist, und es können im Stand der Technik bekannte Verfahren der Lyophilisation und Rekonstitution verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Lyophilisation und Rekonstitution zu unterschiedlichen Ausmaßen von Aktivitätsverlust in Bezug auf den Antikörper führen können (beispielsweise tendieren bei herkömmlichen Immunglobulinen IgM-Antikörper zu einem größeren Aktivitätsverlust als IgG-Antikörper), und dass die verwendeten Mengen nach oben angepasst werden müssen, um dies auszugleichen.
  • Die Zusammensetzungen, welche die vorliegend selektierten Polypeptide oder einen Cocktail davon umfassen, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. In bestimmten therapeutischen Applikationen ist eine geeignete Menge zur Erreichung einer mindestens partiellen Inhibierung, Suppression, Modulation, Abtötung oder weiterer anderer messbarer Parameter einer Population von selektierten Zellen als eine "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die benötigt werden, um diese Dosierung zu erreichen, werden von der Schwere der Erkrankung und vom allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten abhängen; sie werden jedoch im Allgemeinen von 0,005 bis 5,0 mg des selektierten Antikörpers, Rezeptors (z. B. ein T-Zellrezeptor) oder der bindenden Proteinen davon pro Kilogramm Körpergewicht betragen, wobei Dosen von 0,05 bis 2,0 mg/kg/Dosis häufiger Verwendung finden werden. Für prophylaktische Applikationen können die Zusammensetzungen, welche die vorliegend selektierten Polypeptide oder Cocktails davon umfassen ferner in ähnlichen oder geringfügig niedrigeren Dosierungen verabreicht werden.
  • Eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid umfasst, welches nach einem Verfahren der vorliegenden Erfindung selektiert wurde, kann unter prophylaktischen und therapeutischen Bedingungen verwendet werden, um bei der Veränderung, Inaktivierung, Abtötung oder Entfernung einer ausgewählten Zielzellpopulation in einem Säugetier zu helfen. Darüber hinaus können die vorlie gend beschriebenen selektierten Gruppen von Polypeptiden extrakorporal oder in vitro selektiv verwendet werden, um eine Zielzellpopulation aus einer heterogenen Sammlung von Zellen abzutöten, zu entreichern oder in anderer Weise wirksam zu entfernen. Blut aus einem Säugetier kann extrakorporal mit selektierten Antikörpern, Zell-Oberflächenrezeptoren oder bindenden Proteinen davon kombiniert werden, wodurch die unerwünschten Zellen abgetötet oder in anderer Weise aus dem Blut entfernt werden, wobei das Blut dem Säugetier gemäß Standardverfahren zurückgeführt wird.
  • Die Erfindung wird lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung in den folgenden Beispielen weiter beschrieben.
  • Beispiel 1:
  • Selektion von scFv-Polypeptiden
  • Wir haben eine scFv-Bibliothek verwendet, die auf einer einzelnen Ansammlung (fold) beruhte, welche hinsichtlich der Bindung an den Zielliganden durch eine Runde Phagenselektion entweder mit BSA, einer Mischung von ungereinigten rekombinanten Proteinen oder einem HeLa-Gesamtzelllysat angereichert wurde. Diese Antikörperansammlung bindet an beide generischen Liganden, die Proteine L und A. Wir haben ein Zweifilterverfahren verwendet, in dem Bakterien auf einem Filter angezüchtet werden, und die ausgeschiedenen scFvs auf einem anderen Filter eingefangen werden. Das Zielmolekül auf dem Filter war entweder das Antigen, das für die Selektion verwendet wurde, ein anderes (möglicherweise verwandtes) Antigen oder Protein L. Somit richtet sich das Screening entweder auf spezifische Ziel-bindende Antikörper (in diesem Fall verwendete die Detektion von gebundenem Antikörper Protein L-HRP) oder im letztgenannten Fall auf funktionelle und gut exprimierte Antikörper (in diesem Fall verwendete die Detektion von gebundenem Antikörper Protein A-HRP). Spezifische Antigen-bindende Moleküle, die 0,1 bis 1% der Bibliothek ausmachen, wurden in allen Fällen identifiziert, wobei zwischen 5–50% als funktionell und hinreichend exprimiert detektiert wurden, was unter Verwendung des generischen Liganden als Zielmolekül bestimmt wurde.
  • Verfahren
  • Proteine
  • Fünf Klone, von denen zwei keine bekannte Funktion aufwiesen (C und M), ein humanes Chloridionenstrominduktionsprotein (D) und α-2-Globin (H) und Ubiquitin (T) wurden aus der humanen cDNA-Bibliothek des Gehirns hEXI (Bussow et al., 1998) genommen und wie beschrieben exprimiert (Lueking et al., 1999). Ungereinigte Zelllysate wurden gesammelt und für die Selektion verwendet. Die Expressionsmengen jedes Klons wurden durch Transfer von seriellen Verdünnungen jedes Lysats in ein Dot-Blot-Gerät und Immobilisierung auf einer Nitrocellulosemembran bestimmt. Dieser Filter wurde in 2% Magermilchpulver PBS (MPBS) für 30 Minuten geblockt und dreimal mit PBS gewaschen. Rekombinantes Protein wurde mit Anti-RGS-His-Antikörper (Qiagen: 1/2000 in 2% MPBS) gefolgt von Anti-Maus-HRP-Antikörper (Dako: 1/2000 in 2% MPBS) detektiert und mit chemilumineszenten Detektionsreagenz (ECL, Amersham) entwickelt. Äquimolare Mengen jedes Proteins wurden bei jeder Selektion gemischt und 10- 100- und 1000-fache Verdünnungen davon wurden erzeugt.
  • Phagenbibliothek
  • Die Bibliothek, die wir verwendet haben, basiert auf einem einzelnen humanen Grundgerüst für VH (V3-23/DP-47 und JH4b) und Vκ (O12/O2(DPK9 und Jκ1) mit einer Seitenkettendiversität (kodierend für NNK oder DVT), welche an Positionen der Antigenbindungsstelle eingebaut ist, die anhand von bekannten Strukturen zu dem Antigen Kontakt aufnehmen und in der reifen Gruppe stark divers sind. Die Ansammlung, die verwendet wird, wird häufig in vivo exprimiert und bindet an die generischen Bin dungsliganden Protein L und A, die das Einfangen oder die Detektion der scFvs ermöglichen und nicht mit der antigenen Bindungsstelle interferieren. Die Bibliotheken sind im Phagemid/scFv-Format auf die Bindung an Protein A und Protein L in einem Vorscreening untersucht worden, sodass die Mehrzahl der Klone in den unselektierten Bibliotheken funktionell sind (Tomlinson et al. unveröffentlichte Ergebnisse). Diese Bibliothek wurde im Wesentlichen ausgewählt, wie es beschrieben worden ist (Marks et al., 1991), außer dass KM13-Helferphage (der das Gen 3-Protein mit Proteasespaltstelle enthält) verwendet wurde, und die Phagen mit Trypsin eluiert wurden. Dies spaltet alle Gen 3-Proteine, die keine scFv-Fusionen aufweisen, was dazu führt, dass der Hintergrund der Phageninfektion entfernt wird, und die Phagen mit scFv-Fusion durch proteolytische Spaltung im c-myc-tag (Kristensen & Winter, 1998) eluiert werden. Eine Runde Selektion wurde auf Immunröhrchen (Nunc, Maxisorp) durchgeführt, die mit BSA beschichtet waren (10 μg/ml PBS), mit einer Mischung aus fünf ungereinigten rekombinanten Proteinen (C, D, H, M oder T, jedes bei 100 μg/ml oder bei einer 10-fachen Verdünnungen davon) oder mit einem Lysat aus HeLa-Zellen (100 μg/ml) (Verheijen et al., 1990).
  • Rastern/Picking
  • Die selektierte Bibliothek wurde auf eine große rechteckige Platte (230 × 230 mm, Nunc Platten, die TYE, 100 μg/ml Ampicillin, 1% Glucose enthielten) mit 104-Kolonien/Platte ausplattiert und o/n bei 30°C angezüchtet. Die Kolonien wurden in Platten mit 384 Vertiefungen (Genetix, enthaltend 2 × TY, 100 μg/ml Ampicillin, 1% Glucose, 8% Glycerol) gepickt (Bio-Robotics Kolonie-Picker) und über Nacht bei 37°C angezüchtet. Die Platten wurden entweder direkt verwendet oder eingefroren und bei –70°C gelagert. Die Platten mit 384 Vertiefungen wurden auf einer großen rechteckigen Platte (Genetix Q-tray, enthaltend TYE, 100 μg/ml Ampicillin, 1% Glucose), die mit einem Nitrocellulosefilter bedeckt war (Schleicher & Schuell), in ein 4 × 4 Muster aus Duplikat-Klonen gerastert (gridding) (Genetix, Q-bot). Vor dem Transfer auf die Platte wurde dieser Filter in 2% Magermilchpulver PBS (MPBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) geblockt, kurz in PBS gewaschen und in 2 × TY getränkt. Die gerasterten Platten wurden über Nacht bei 37°C angezüchtet. In der Zwischenzeit wurden weitere Nitrocellulosefilter mit 0,5 μg/ml Protein L (Actigen), 100 μg/ml bovinem Serumalbumin (BSA), humanem Serumalbumin (HSA), den bakteriellen Proteinen C, D, H, M oder T oder mit HeLa-Zellprotein (von 107-Zellen, (Verheijen et al., 1990)) in 100 ml PBS über Nacht bei 4°C beschichtet. Dieser Filter wurde in 2% MPBS für 1 Stunde bei RT geblockt, 3 × in PBS gewaschen, in 2 × PY getränkt und anschließend auf eine große rechteckige Platte (230 × 230 mm, Nunc Platten, enthaltend TYE, 100 μg/ml Ampicillin, 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG)) überführt. Der zweite Filter, der die Kolonien enthielt, wurde auf die Platte überführt, welche mit dem ersten Zielmolekülfilter bedeckt war. Diese Platten wurden für drei Stunden bei 30°C inkubiert. Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist gezeigt (1).
  • Untersuchungen der Filter mit einer Sonde
  • Der obere Filter wird entfernt, und der untere Filter wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween (PEST) gewaschen und mit 2% MPBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur geblockt. Die Filter wurden dreimal mit PEST gewaschen. Im Falle einer spezifischen Antigenbindung wurden die Filter mit Protein-L-HRP-Konjugat (Actigen 1/4000) in 2% MPBS für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Im Falle des generischen Assays wurden die Filter wie oben beschrieben verarbeitet, mit der Ausnahme, dass nach dem Blocken die Filter mit Protein A-HRP-Konjugat (Amersham 1/5000) inkubiert wurden. Die Filter wurden dreimal mit PEST gewaschen und mit Streptavidin-HRP (Pierce) 1/5000 in PEST für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Filter wurden ge waschen und mit ECL-Reagenz entwickelt. Alle Inkubationen wurden in 50 ml Puffer auf einem sich leicht bewegenden Schüttler durchgeführt.
  • ELISA
  • Um zu bestimmen, ob Klone, die unter Verwendung des direkten Capture-Screenings identifiziert wurden, in einem herkömmlichen ELISA an BSA binden, wurde 2 × TY, das 100 μg/ml Ampicillin und 0,1% Glucose enthielt, mit 1/100 Volumen einer Übernacht-Kultur inokuliert. Diese wurde bei 37°C angezüchtet, bis eine OD600 von ungefähr 0,9 erreicht wurde. Es wurde 1 mM IPTG zugesetzt, und die Kulturen wurden bei 30°C über Nacht geschüttelt. Die Kulturen wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden in einem ELISA verwendet. Eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit 10 μg/ml BSA über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 2% Tween/PBS für zwei Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, und 50 μl Überstand wurden mit 50 μl mit 2% Tween/PBS für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal mit PEST gewaschen und mit Protein-L-HRP-Konjugat (1/4000 in 2% Tween/PBS) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal mit PEST gewaschen, und die Reaktionen wurden mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin entwickelt und mit Schwefelsäure abgestoppt.
  • Sequenzierung
  • PCR-Produkte, die mit LMB3 (CAG GAA ACA GCT ATG AC) und pHEN seq (CTA TGC GGC CCC ATT CA) amplifiziert wurden und unter Verwendung von PCR-Aufreinigungssäulen (Qiagen, CA) gereinigt wurden, wurden als Matrize für die Sequenzierung verwendet. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit den Primern LMB3 für die schweren Ketten und pHEN seq für die leichten Ketten durchgeführt, wobei ein "ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle"-Sequenzierungskit (Perkin Elmer, CA) verwendet wurde. Die Reaktionen wurden auf einem automatischen Sequenziergerät durchgeführt (Applied Biosystems 373A, Perkin Elmer).
  • Ergebnisse
  • Um eine scFv Phagemid-Bibliothek zu erhalten, die im Hinblick auf bindende Moleküle gegen den Zielliganden durch eine Runde Phagenselektion angereichert war, wurde eine Bibliothek verwendet, die mit einem gereinigten Antigen (BSA) selektiert war. Unter Verwendung von Robotergeräten wurden 8448 Klone (22 Platten mit 384 Vertiefungen) gepickt und gerastert (gridding), eine Zahl, die fast alle erhaltenen Klone umfaßte, welche nach einer Runde Selektion vorhanden waren (ungefähr 104 Phagen wurden eluiert). Um den Anteil von Klonen zu bestimmen, die funktionelle scFvs exprimieren, wurden scFvs mit einem mit Protein L beschichteten Filter eingefangen und mit Protein A-HRP-Konjugat detektiert. Dies zeigte, dass etwa 50% der Klone funktionell waren und gut exprimiert wurden (2). Um spezifisch bindende Klone sowie auch kreuzreaktive Klone zu identifizieren, wurde ein Screening mit BSA, HSA und einer Mischung von irrelevanten Proteinen (HeLa-Zellproteine) durchgeführt. BSA, HSA oder HeLa-Zellproteine wurden auf den Filter geschichtet und bindende scFvs wurden mit Protein-L-Konjugat detektiert. Eine typische Gruppe von scFvs, die als Array angeordnet sind, und ihre Reaktivität mit BSA und HSA ist in 2B bzw. 2C gezeigt. Wir haben herausgefunden, dass 50 der 8448 als Array angeordneten Klone BSA erkennen. Es wurde herausgefunden, dass einer dieser 50 auch HSA erkennt und ein Klon mit einem Protein in HeLa-Zellen reagierte (Daten nicht gezeigt). Eine große Anzahl von Klonen, die BSA oder HSA nicht erkannten, erkannte Proteine, die in einem Extrakt von HeLa-Zellen vorhanden sind (Daten nicht gezeigt), was auf die Selektion von "klebrigen" Klonen hinweist. Somit ermöglichte die Verwendung eines parallelen direkten Screenings auf verschiedene Zielmoleküle die Identifizierung von BSA-spezifischen Antikörpern, Antikörpern, die sowohl BSA als auch HSA binden und nicht stark kreuzreaktiv sind, kreuzreaktiven (klebrigen) Antikörpern und Antikörpern, die keines der Zielmoleküle binden.
  • Um ferner zu bestätigen, ob die BSA-positiven Klone spezifisch waren, wurden sie in einem ELISA auf die Bindung an BSA untersucht. Die meisten dieser Klone waren tatsächlich positiv im ELISA, und von diesen Klonen wurden 16 weitere durch Sequenzierung charakterisiert. Klone, die BSA im ELISA nicht erkannten, exprimierten scFv in geringen Mengen oder hatten kein Insert vollständiger Länge. Die positive Identifizierung von Einzeldomänen exprimierenden Klonen im anfänglichen Screening ist vermutlich auf die hydrophoben Reste zurückzuführen, die normalerweise an der VH/VL Schnittstelle verdeckt sind. Die Sequenzierung der VH- und VL-Gene von 16 BSA-spezifischen Klonen zeigte, dass fünf verschiedene Klone vorhanden waren (Tabelle 1). Zwei Klone waren mehrere Male vorhanden. Klon 29IJ11 wurde zweimal gefunden, und Klon 29IJ7 wurde elfmal gefunden. Drei weitere Klone wurden einmal gefunden. Die Sequenz der VH-CD3-Region dieser Anti-BSA-scFvs zeigte einen Konsensus an den randomisierten Resten. Dies bestätigt, dass diese Klone spezifisch sind, da Konsensus-CDR-Reste üblicherweise in spezifischen Antikörpern gegen andere Antigene gefunden werden (Clackson et al., 1991, De Wildt et al., 1997).
  • Als nächstes haben wir eine scFv-Bibliothek, die mit einer Mischung von fünf ungereinigten rekombinanten Proteinen C, D, H, M oder T oder 10-fachen Verdünnungen davon selektiert war, in einem Screening untersucht. 12288 Klone (32 × 384) wurden gerastert und mehrere Kopien dieser Bibliothek wurden einzeln in einem Screening auf die Bindung an die fünf rekombinanten Proteine untersucht. Potentiell spezifische scFv-Klone aus dem ersten Screening wurden im ELISA auf eine Bindung an die re kombinanten Proteine untersucht. Spezifische scFvs wurden für D (15 Klone), M (12 Klone) und T (20 Klone) identifiziert, und einige dieser scFvs wurden unter Verwendung von 1000-fachen Verdünnung der Proteinmischung isoliert. Die Sequenzen dieser Klone sind in der Tabelle 1 dargestellt, und der Hauptteil der Anti-Ubiquitin-Klone zeigte eine Konsensussequenz in ihren VH-CDR3-Resten. Einige Klone wiesen unterschiedliche Nukleotidsequenzen auf, obwohl sie für die gleichen CDR3-Aminosäurereste kodierten.
  • Als letztes haben wir eine scFv-Bibliothek, die mit einem Lysat von HeLa-Zellen selektiert war, in einem Screening untersucht. 18342 Klone wurden gerastert und auf die Bindung an Filter untersucht, die mit HeLa-Zelllysat, Hefezelllysat oder mit einem irrelevanten Protein (FITC-BSA) beschichtet waren. Mehrere potentielle scFv-Klone wurden auf einem Western-Blot von HeLa-Zellen oder Hefezellen untersucht. Es wurde herausgefunden, dass fünf Klone ein Protein in HeLa-Zellen erkennen, jedoch nicht in Hefezellen.
  • Figure 00500001
  • Tabelle 1: VH und VL-CDR-Sequenzen von Klonen, die aus einer Bibliothek selektiert wurden, welche auf einem einzelnen humanen Grundgerüst basiert. Unterstrichene Reste sind in der Bibliothek randomisiert. 1Bibliothek (NNK/DVT Diversität), von der die Klone erhalten wurden. 2Zahl, die angibt, wie oft die gleiche Sequenz beobachtet wurde. 3Alle Nukleotid-(Aminosäure-)Änderungen, die sich von VH (V3-23/DP-47 und JH4b) und Vκ (O12/02/DPK9 und Jκ1) Keimlinien-Genen unterscheiden, und die nicht an spezifisch randomisierten Positionen vorliegen.
  • Im vorhergehenden Beispiel ist gezeigt, dass rekombinante Antikörper für ein direktes Array-Screening verwendet werden können. Wir haben zwei Ansätze verwendet: Im ersten Ansatz hat das Beschichten des Antigens auf den Filter und die direkte Detektion von ausschließlich spezifisch bindenden scFvs den Vorteil, dass eine Biotinylierung des Zielmoleküls oder eine Modifizierung mit einem Anhängsel (tagging) nicht erforderlich sind. Dieses Format führt zu einer erhöhten Sensitivität, weil es lediglich zwei Inkubationsschritte umfaßt (Blocken und Detektion), und weil scFvs zur Dimerisierung neigen, was in der Bindung von mehreren Protein-L-Konjugaten resultiert. Dieser Ansatz bietet ferner die Möglichkeit, eine große Anzahl von scFvs gleichzeitig mit einem oder mit mehreren Antigenen in einem Screening zu untersuchen, da die Bakterien, welche die entsprechende Nukleinsäuresequenzen beinhalten, in Duplikaten auf den gleichen oder auf verschiedene Filter aufgetropft werden können: gegenwärtig werden 18342 Kolonien doppelt auf einem Makroarray aufgetragen, der äquivalent zu 384 ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen ist. Sie erlauben ferner die Identifizierung von verschiedenen spezifischen scFvs und kreuzreaktiven scFvs, was durch die Klone gezeigt ist, die lediglich BSA, oder sowohl BSA als auch HSA erkennen, und die Klone, die Proteine in HeLa-Zellen, jedoch nicht in Hefe erkennen. BSA und HSA sind mehr als 75% homolog, und es ist daher nicht überraschend, dass einige Antikörper Epitope erkennen, die in beiden Proteinen vorkommen. Ferner können diese Arrays verwendet werden, um unreine Antigene in einem Screening zu untersuchen, was dadurch gezeigt wird, dass die Identifizierung von scFv spezifisch für die rekombinanten Proteine D, M und T ist. Im Gegensatz zu anderen Protein-Arrays (Bussow et al., 1998), erfordern diese Antikörper-Arrays keine Denaturierungsschritte, um die Proteine zu immobilisieren. Das Zielmolekül kann tatsächlich nativ, denaturiert, proteolysiert und auf andere Weise vorbehandelt sein, bevor es auf den unteren Filter geschichtet wird.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • Vergleich mit herkömmlichen Phagen-Display
  • Der Vergleich unserer Ergebnisse mit denjenigen, die durch mehrere Runden einer herkömmlichen Phagen-Display-Selektion erhalten wurden, zeigt, dass drei der vorliegend identifizierten scFvs auch nach 3–4 Runden Phagenselektion isoliert wurden. Bei Verwenden des direkten Array-Screenings wurden jedoch bereits nach einer Runde Phagenselektion zwei zusätzliche Klone (Klon 29IJ11 und 29IJ12) gefunden, die nach einem ausführlichen Screening der r3- und r4-Selektion nicht beobachtet wurden. Dies zeigt, dass diese durch Kompetition zwischen den verschiedenen Klonen während der multiplen Infektion, dem Anzüchten und des Phagen-Herstellungsschritts, die an 3 oder 3 Runden der Phagenselektion beteiligt sind, verloren werden. Da lediglich 16 von 50 positiven Klonen sequenziert wurden, ist es wahrscheinlich, dass mehr einzigartige BSA-spezifische scFvs unter den 50 positiven Klonen vorhanden waren. Die ECL-Signale dieser zwei einzigartigen Klone auf dem Array sind von vergleichbarer Intensität wie beispielsweise Klon 29IJ1, der eine nanomolare Affinität aufweist. Dies zeigt, dass potentiell nützliche scFvs bei Anwendung mehrerer Runden Phagendisplay verloren werden, und somit Hochdurchsatz-Screenings vom vorliegend beschriebenen Typ essentiell für die Isolierung der am stärksten diversen Sammlung von bindenden Klonen ist.
  • Duplikat-Arrays aus Antikörpern können verwendet werden, um ein Screening nach Antikörpern vorzunehmen, die geeignete Modifikationen eines gegebenen Proteins erkennen (wie beispielsweise Einzelmutationen von Aminosäuren oder post-translationale Modifikationen), oder um ein Screening nach bindenden Molekülen gegen unreine Antigene durchzuführen, wie beispielsweise mit Molekülen, die auf zellulären Oberflächen exprimiert werden. Mehrere Runden Phagenselektion führen oftmals zu bindenden Molekülen gegen andere immundominante Epitope oder andere Zelloberflächenmoleküle (Hoogenboom et al., 1999). Um dies zu verhindern, wurden die Selektionen gegen unreine Antigene unter Verwendung von Entreicherungs- oder Subtraktionsstrategien durchgeführt (De Kruif et al., 1995: Cai & Garen. 1996), oder es wurde eine ligandengestützte Technik angewendet, die "Pathfinder" genannt wird (Osbourn et al., 1998). Das direkte Hochdurchsatz-Screening, das vorliegend beschrieben ist, kann auf zahlreiche dieser Verfahren angewendet werden. Die Screening-Verfahren können ferner unter Verwendung mehrerer Zielliganden durchgeführt werden. Die Zielliganden können aus unterschiedlichen Proteinen bestehen, die miteinander vermischt sind, oder es kann sich um einen Extrakt von zellulären Proteinen handeln. Vorausgesetzt, dass jedes Zielprotein in der Mischung vorhanden und im ausreichenden Maß immobilisiert ist, sollte dies die Detektion von spezifischen scFvs ermöglichen.
  • Das Screening kann verwendet werden, um bindende Moleküle mit höherer Affinität aus der Bibliothek von Mutanten eines gegebenen Antikörpers zu identifizieren, die entweder durch Ketten-Vermischung (Marks et al., 1992) oder durch CDR-Diversifizierung (Shier et al., 1996) erzeugt wurden. Um Antikörperfragmente zu humanisieren oder Antikörperfragmente mit höherer Affinität zu erzeugen, können Bibliotheken aus Antikörperfragmenten durch direkte oder zufällige Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden oder fehleranfälligen Polymerasen erzeugt werden. Diese Bibliotheken oder Teile dieser Bibliotheken können problemlos angezüchtet und in einem Arrayformat exprimiert werden und anschließend in einem Screening auf eine Bindung oder eine verbesserte Bindung an ihre Zielliganden untersucht werden.
  • Arrays aus rekombinanten Antikörpern haben nützliche Applikationen bei der Charakterisierung einer Proteinexpression einschließlich von Modifikationen dieser Proteine, einem Gebiet das auch als Proteomik bekannt ist. Im Gegensatz zur Genomik, die mRNA-Expessionsmengen durch cDNA-Arrays untersucht, liefern Proteomics einen direkten Hinweis auf die Proteinfunktionalität. Dieses Gebiet wird gegenwärtig durch die 2D-Elektrophorese dominiert. Arrays aus rekombinanten Antikörpern können verwendet werden, um die bestehenden Technologien zu komplimentieren, um die Expression von einem oder von mehreren Proteinen in einer Mischung von Proteinen (z. B. in einem Zellextrakt) zu analysieren.
  • Im allgemeinen ermöglicht dieses Verfahren die Hochdurchsatzanalyse für eine Ligandenbindung von rekombinanten Antikörpern oder anderen rekombinanten Proteinen, die in einem bakteriellen Periplasma exprimiert werden. Insbesondere diejenigen Fälle, in denen die Trefferrate zu gering ist, um mit einem herkömmlichen ELISA zu detektieren, jedoch hoch genug ist, um mit Arrays zu identifizieren (> 10–4), und wenn wiederholte Runden der Phagenselektion nicht vorteilhaft sind. Dieser Ansatz ist jedoch nicht auf Antikörper-Antigen-Interaktionen beschränkt, und er kann verwendet werden, um andere funktionelle Protein-Liganden-Interaktionen zu untersuchen, einschließlich bei einem Screening auf aktive Enzyme. Beispielsweise kann eine Bibliothek von Transkriptionsfaktor-Varianten oder anderer DNA- bindender Enzyme auf ihre Fähigkeit untersucht werden, an eine bestimmte DNA-Sequenz zu binden. Zinkfinger sind beispielsweise kleine DNA-bindende Moleküle, von denen bekannt ist, dass sie in einer großen Anzahl von eukaryontischen Transkriptionsfaktoren auftreten, und sie binden eine bestimmte Anzahl von DNA-Sequenzen. In der Vergangenheit sind Zinkfinger erstellt worden, die spezifisch an eine einzigartige 9-Basenpaar-Region des BCR-ABL Fusionsonkogens binden, und es führt zur Blockade der Transkription dieses Onkogens (Choo et al., 1994). Das Array-Screening kann nützlich sein, um solche sequenzspezifischen DNA-bindenden Peptide oder Proteine zu identifizieren, welche die Produktion von Faktoren, die für das Tumorwachstum essentiell sind, inhibieren können.
  • Eine Strategie für die Selektion von aktiven Katalysatoren umfaßt das Anzüchten und die Expression einer Bibliothek von Enzymen im Arrayformat auf einem Filter, in großer Nähe zu einem Zielliganden, der auf einem anderen Filter immobilisiert ist. Als nächstes wird umgewandeltes Substrat detektiert, wobei spezifische Anti-Produkt-Affinitätsreagenzien auf dem Zielligandenfilter detektiert werden. Da die Enzyme und ihre Substrate für einige Stunden in großer Nähe sind, hofft man, dass dies die Detektion von Enzymen mit hohen Turnover-Raten ermöglicht, jedoch auch von solchen mit geringeren Turnover-Raten. Auf diesem Weg können wir bestehende Phagenselektionsmethoden für Katalysatoren, die auf einer Produktbindung beruhen, verbessern, wie beispielsweise eine Selektion von Aldolasen (Barbas et al., 1997).
  • Vollständige Zellen können als Zielligand in einem Array-Screening verwendet werden. Eine eukaryontische Zelllinie, wie beispielsweise HeLa, kann auf Filtern angezüchtet und immobilisiert werden. Eine Bibliothek von Adhesionsmolekülen kann dann in einem Screening auf eine funktionelle Interaktion untersucht werden, wie beispielsweise auf die Induktion einer Apoptose über die Zelloberflächenmoleküle CD95 (APO-1, FAS). Die ausgelesenen Ergebnisse können ein nachgelagertes Ereignis darstellen, wie beispielsweise die Translokation von Phosphatidylserin oder die Expression von p53. Eine randomisierte Bibliothek aus CD95-Liganden, die den CD95-Rezeptor erkennen, kann in einem Screening untersucht und in einem Assay durch Annexin-V-Detektion von Zelloberflächen-Phosphatidylserin (Boehringer Mannheim) oder durch p53-Detektion (Boehringer Mannheim) getestet werden.
  • Beispiel 3
  • Detektion interagierender Proteinpaare
  • Um zu bestimmen, ob das Filter-Screening verwendet werden kann, um zwei interagierende Proteine zu detektieren, haben wir Paare von Proteinen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie interagieren. Protein M und ein Anti-M-scFv M12, Protein T und ein Anti-T-scFv-T15 und die FKBP12-Rapamycin-Bindungsdomäne (FRB) des FKBP-Rapamycin-assoziierten Proteins (FRAP) und humanes Immunophilin FKBP12 (FK506-Bindungsdomäne von 12 kD). Die FRB-FKBP12-Interaktion hängt vom Vorhandensein des kleinen Moleküls Rapamycin ab. Gene, die für M, T oder FKBP12 kodieren, wurden als C-terminale Fusion an eine Glutathion-S-Transferase (GST) in pACYC (resistent gegen Chloramphenicol) kloniert. M12 (Anti-M-scFv) und T15 (Anti-T-scFv) werden in das pHEN-Derivat pIT2 (resistent gegen Ampicillin) kloniert. FRB und FKBP12 wurden als C-terminale Fusion an eine V-Kappa-Einzeldomäne in pIT2 kloniert.
  • Einzelne Kolonien wurden ausgehend von einer frischen Agarplatte gepickt und o/n bei 37°C in Flüssigkultur (TYE, 100 μg/ml Ampicillin oder 10 μg/ml Chloramphenicol, 1% Glucose) angezüchtet. Mehrere Kombinationen dieser Kulturen wurden zusammengemischt (interagierende Partner oder Kontrollen) und auf eine Agarplatte aufgetropft (TYE, 1% Glucose), die mit ei nem Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) bedeckt war. Vor dem Transfer auf die Platte wurde dieser Filter in 2% Magermilchpulver PBS (MPBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) geblockt, kurz in PBS gewaschen und in 2 × TY getränkt. Die gerasterten Platten wurden über Nacht bei 37°C angezüchtet. In der Zwischenzeit wurde ein weiterer Nitrozellulosefilter mit 2 μg/ml Anti-GST-Antikörper (Pharmacia Biotech) in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet. Dieser Filter wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur in 2% MPBS geblockt, 3 × in PBS gewaschen, in 2 × TY getränkt und anschließend auf eine Agarplatte (TYE, 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG)) überführt. Für die Detektion der FRB-FKBP12-Interaktion wurde 0,1 ng/ml Rapamycin oder kein Rapamycin zu den Platten gegeben. Der zweite Filter, der die Bakterien-Klone enthielt, wurde auf die Platte überführt, die mit dem Anti-GST-beschichteten Filter bedeckt war. Diese Platten wurden für fünf Stunden bei 30°C inkubiert.
  • Untersuchung der Filter mit einer Sonde
  • Der obere Filter wird entfernt und der untere Filter wurde dreimal mit PBS/0,05% Tween (PEST) gewaschen und mit 2% MPBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur geblockt. Die Filter wurden dreimal mit PEST gewaschen und mit Protein-L-HRP-Konjugat (Actigen, 1/4000) in 2% MPBS für eine Stunde bei Raumtemperatur gewaschen. Die Filter wurden gewaschen und mit ECL-Reagenz (Amersham) entwickelt. Alle Inkubationen wurden auf einem sich leicht bewegenden Schüttler durchgeführt.
  • ELISA
  • Um zu bestätigen, dass Klone, die unter Verwendung des direkten Capture-Screenings identifiziert wurden, auch im ELISA binden, wurde 2 × TY, welches 100 μg/ml Ampicillin oder 10 μg/ml Chloramphenicol und 0,1% Glucose enthielt, mit 1/100 Volumen einer Übernachtkultur inokuliert. Diese wurden bei 37°C angezüchtet, bis eine OD600 von ungefähr 0,9 erreicht wurde. Es wurde 1 mM IPTG zugesetzt, und die Kulturen wurden bei 25°C oder 30°C (scFvs) über Nacht geschüttelt. Die Kulturen wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden im ELISA verwendet. Eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde über Nacht bei 4°C mit Anti-GST, 2 μg/ml in PBS beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 2% Tween/PBS (für die scFv-Antigen-Paare) oder mit 2% BSA/PBS (für das FRB-FKBP12-Paar) geblockt. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. 50 μl Überstand der pACYC-GST-Klone und 50 μl Überstand der pIT2-Klon wurden mit 50 μl 2% Tween/PBS oder mit 2% BSA/PBS gemischt und für 1,5 Stunden bei RT inkubiert. Für die Detektion des FRB-FKBP12-Paars wurde der Assay in Gegenwart von entweder 0,1 ng/ml Rapamycin oder in Abwesenheit von Rapamycin durchgeführt. Die Platten wurden fünfmal mit PEST gewaschen und mit Protein-L-HRP-Konjugat (1/4000) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal mit PEST gewaschen und die Reaktionen wurden mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin entwickelt und mit Schwefelsäure abgestoppt.
  • Ergebnisse
  • Die direkte Screening-Strategie zeigt deutlich die spezifische Bindung von M an Anti-M und von T an Anti-T (3) und die spezifische Bindung von FRB-FKBP12 in Gegenwart von Rapamycin (4).
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Claims (25)

  1. Verfahren zum Screening einer Gruppe von Polypeptiden, um ein oder mehrere Mitglieder daraus, die mit einem oder mehreren Zielmolekülen interagieren, zu identifizieren, bei dem man: a) das (die) Zielmolekül(e) auf einem Träger immobilisiert, b) eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, als Array anordnet, c) das (die) Zielmolekül(e) und die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander bringt, d) die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um die Polypeptide zu erzeugen, sodass die Polypeptide in Kontakt mit dem (den) Zielmolekül(en) auf dem Träger kommen und eine Teilmenge der Polypeptide mit dem (den) Zielmolekül(en) interagiert, und e) die Interaktion der Polypeptide mit dem (den) Zielmolekül(en) auf dem Träger detektiert, wobei die Nukleinsäuremoleküle, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, und die immobilisierten Zielmoleküle als Array angeordnet sind, und die Träger vor der Expression der als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander gebracht werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuremoleküle in Form von Expressionsvektoren vorliegen, die für Mitglieder der Gruppe von Polypeptiden kodieren, wobei sie in funktionsfähiger Weise mit Kontrollsequenzen verbunden sind, die ausreichen, um ihre Transkription zu steuern.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor ein Bakteriophage ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor ein Plasmid ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor ein lineares Nukleinsäuremolekül ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Interaktion aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: eine Bindungsinteraktion, ein Signalereignis, eine katalytische Reaktion, eine enzymatische Reaktion, ein Phosphorylierungsereignis, ein Glycosylierungsereignis, proteolytische Spaltung und eine chemische Reaktion.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gruppe von Polypeptiden eine Gruppe von Immunglobulinmolekülen ist.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuren in Zellen enthalten sind und in diesen exprimiert werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen Zellen, niederen eukaryontischen Zellen und höheren eukaryontischen Zellen.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleinsäuremoleküle in Form von nackter oder komplexierter Nukleinsäure immobilisiert werden.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuremoleküle, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, als Array auf einem anderen Träger als demjenigen Träger angeordnet sind, der das (die) Zielmolekül(e) enthält.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Träger, der das Array von Nukleinsäuremolekülen enthält, welche für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, für die Gruppe von Polypeptiden permeabel ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Nukleinsäuremoleküle, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, auf demselben Träger als Array angeordnet sind, der das (die) immobilisierte(n) Zielmolekül(e) enthält.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Träger Filtermembranen sind.
  15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das (die) Zielmolekül(e) aus der Gruppe ausgewählt ist (sind), die aus folgendem besteht: einem gereinigten Protein, einem rekombinanten Protein, einem Polypeptid, einem Enzym, einem Substrat für ein Enzym, einer Aminosäure, ganzen Zellen, einem Zellextrakt, einem kleinen organischen Molekül und einem Metallion.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gruppe von Polypeptiden separat gegen zwei oder mehr Zielmoleküle in einem Screening untersucht wird.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwei oder mehrere Duplikat-Arrays von Nukleinsäuremolekülen erzeugt werden, wobei jedes mit (einem) anderen Zielmolekül(en) zueinander gebracht wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 1 zum Screening einer Gruppe von Antikörper-Polypeptiden, um ein oder mehrere Mitglieder daraus zu identifizieren, die an ein oder mehrere Zielmoleküle binden, bei dem man: a) das (die) Zielmolekül(e) auf einem ersten Träger immobilisiert, b) eine Vielzahl von Zellen mit Nukleinsäuremolekülen, die für die Gruppe von Antikörper-Polypeptiden kodieren, transformiert und die bakteriellen Zellen auf einem zweiten Träger als Array anordnet, c) den ersten und den zweiten Träger zueinander bringt, d) die Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um die Antikörper-Polypeptide zu erzeugen, sodass die Polypeptide von den Zellen auf dem zweiten Träger ausgeschieden werden und in Kontakt mit dem (den) Zielmolekül(en) auf dem ersten Träger kommen, und eine Teilmenge der Polypeptide an die Zielmoleküle bindet, und e) die Bindung der Antikörper-Polypeptide mit den Zielmolekülen auf dem ersten Träger detektiert.
  19. Verfahren zum Screening von zwei Gruppen von Polypeptiden gegeneinander auf isolierte spezifische Bindungspaare, bei dem man: a) einen ersten generischen Liganden auf einem Träger immobilisiert, der in der Lage ist, an alle oder im Wesentlichen an alle Mitglieder der ersten Gruppe zu binden, b) eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen als Array anordnet, wodurch jeder Punkt des Arrays ein Mitglied der ersten Gruppe und ein Mitglied der zweiten Gruppe enthält, die für Polypeptide der ersten bzw. zweiten Gruppe kodieren, c) den ersten generischen Liganden und die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander bringt, d) die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um einen Array von Polypeptiden zu erzeugen, sodass das Polypeptid der ersten Gruppe an den ersten generischen Liganden bindet, und eine Teilmenge der Polypeptide der zweiten Gruppe an die Polypeptide der ersten Gruppe bindet, und e) die Interaktion des zweiten Polypeptids mit dem ersten Polypeptid auf dem Träger unter Verwendung eines zweiten generischen Liganden detektiert, der in der Lage ist, an im Wesentlichen alle Mitglieder der zweiten Gruppe zu binden, wobei die Nukleinsäuremoleküle, die für die Gruppe von Polypeptiden kodieren, und die immobilisierten Zielmoleküle als Array angeordnet sind und die Träger vor der Expression der als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander gebracht werden.
  20. Verfahren zum Screening einer Gruppe von Enzymen, um ein oder mehrere Mitglieder daraus zu identifizieren, die ein Substratmolekül in ein Produktmolekül umwandeln, bei dem man: a) einen Liganden, der in der Lage ist, nur an Produktmoleküle zu binden, auf einem ersten Träger immobilisiert; b) eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen auf einem zweiten Träger als Array anordnet, sodass jeder Punkt des Arrays ein Nukleinsäuremitglied der Enzymgruppe und das Substratmolekül enthält, c) den ersten und zweiten Träger zueinander bringt, d) die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um einen Array aus Enzympolypeptiden zu erzeugen, sodass die Enzympolypeptide das Substratmolekül in ein Produktmolekül umwandeln, sodass das Produktmolekül in der Lage ist, den spezifischen Liganden zu binden, der auf dem ersten Träger immobilisiert ist, und e) das Vorhandensein des Produktmoleküls auf dem ersten Träger detektiert.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Substratmoleküle auch von einer Gruppe von Polypeptiden kodiert werden, und jeder Punkt des Arrays verschiedene Kombinationen aus Mitgliedern der Enzymgruppe und der Substratgruppe enthält.
  22. Verfahren zum Screening einer Gruppe von Substraten, um ein oder mehrere Mitglieder daraus zu identifizieren, die durch ein Enzymmolekül umgewandelt werden, wobei Produktpolypeptide gebildet werden, bei dem man: a) einen Liganden auf einem ersten Träger immobilisiert, der in der Lage ist, nur an die Produktpolypeptide zu binden, b) eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen auf einem zweiten Träger als Array anordnet, sodass jeder Punkt des Arrays ein Nukleinsäuremitglied der Substratgruppe und das Enzymmolekül enthält, c) den ersten und den zweiten Träger zueinander bringt, d) die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um einen Array von Substratpolypeptiden zu erzeugen, sodass das Enzymmolekül die Substratpolypeptide umwandelt, wobei Produktpolypeptide gebildet werden, sodass die Produktpolypeptide in der Lage sind, den auf dem ersten Träger immobilisierten spezifischen Liganden zu binden, und e) das Vorhandensein der Produktpolypeptide auf dem ersten Träger detektiert.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Enzymmoleküle auch von einer Gruppe von Polypeptiden kodiert werden, und jeder Punkt des Arrays verschiedene Kombinationen von Mitgliedern der Substratgruppe und der Enzymgruppe enthält.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei der auf dem ersten Träger immobilisierte Ligand sowohl an Substrat- als auch an Produktmoleküle bindet, und dann eine produktspezifische und/oder substratspezifische Detektion verwendet wird, um zwischen dem Vorhandensein von Substrat oder Produkt zu unterscheiden.
  25. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man ferner: f) eine Nukleinsäure isoliert, die für ein Polypeptid kodiert, welches mit einem oder mehreren Zielen interagiert, g) das Polypeptid exprimiert, und h) das exprimierte Polypeptid isoliert.
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