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Technischer Bereich
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Zusammensetzungen
für die
Verstärkung
der Immunisierungskraft eines vorgewählten Protein- oder Peptidantigens
in einem Säugetier.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen,
die für
Fusionsproteine kodierende Nucleinsäuren und die Fusionsproteine
definierende Aminosäuresequenzen
umfassen, wobei die Fusionsproteine eine konstante Region der schweren
Immunglobulinkette und ein vorgewähltes Antigen enthalten, wobei
das vorgewählte
Antigen im dem Fusionsprotein in der Lage ist, bezogen auf das vorgewählte Antigen
allein eine stärkere
Immunantwort in dem Säugetier
hervorzurufen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Impfstoffentwicklung hat sich traditionell auf die Erzeugung von
schützenden
Antikörpern
konzentriert, die Krankheitserreger neutralisieren können. Bis
heute umfassen die als Impfstoffe verwendeten Mittel typischerweise
inaktivierte oder abgeschwächte
Mikroorganismen (zum Beispiel Bakterien oder Viren), deren Produkte
(zum Beispiel Toxine) oder gereinigte Antigene. Mit dem Aufkommen
der modernen Molekularbiologie und den Methoden des Genklonens wurde
es möglich,
reinere und offensichtlich spezifischere Impfstoffe herzustellen.
Darüber
hinaus hat die Kenntnis des Immunsystems auf einem molekularen Niveau
die Isolierung und Charakterisierung von Immunantworten ermöglicht,
die durch Krankheitserreger stimuliert werden. Zwei Komponenten
des Immunsystems, von denen angenommen wird, dass sie für die erfolgreiche
Erzeugung von Immunantworten von zentraler Bedeutung sind, umfassen:
die Schlüsselrollen
der regulatorischen und cytotoxischen T-Zellen; und die Art, durch
die ein Antigen diesen Zellen durch eine antigenpräsentierende Zelle
(APC) präsentiert
wird. Siehe, zum Beispiel, W. E. Paul, Hrg. (1993) FUNDAMENTALS
OF IMMUNOLOGY, Raven Press, Ltd., New York.
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Typischerweise
wird ein Protein- oder Peptidantigen, das von außerhalb einer APC (exogenes
Antigen) empfangen wird, innerhalb eines endozytischen Vesikels
oder Endosoms der APC abgebaut, worauf die resultierenden Peptidfragmente
einen Komplex mit Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes
(MHC) Klasse II bilden. Der resultierende Komplex wird an die Zelloberfläche gebracht,
wo er den Immunzellen in der Nachbarschaft der APC präsentiert
wird. Das Peptidfragment passt in eine Furche, die durch das MHC-Molekül definiert
wird, und der Komplex kann durch eine T-Zelle, die einen T-Zellrezeptor
mit Bindungsspezifizität
für den
Komplex exprimiert, erkannt werden. Wechselwirkung zwischen einem
Peptid-beladenen MHC-Klasse-II-Molekül und einer T-Helferzelle,
die im Fachgebiet als eine CD4-T-Zelle bezeichnet wird, wird weiter durch
eine weitere Wechselwirkung zwischen dem MHC-Klasse-II-Molekül selbst
und einem CD4+-Rezeptor auf der Oberfläche der
T-Zelle stabilisiert. So wird exogenes Antigen, das innerhalb von
APC-Zellen prozessiert wird, auf der Zelloberfläche über ein xxx xxx MHC-Klasse-II-Molekül präsentiert.
Der MHC-Klasse-II-Komplex, wenn er den CD4+-T-Zellen
präsentiert
wird, führt
dazu, dass CD4+-Helferzellen Cytokine sezernieren, die
B-Zellen dazu stimulieren, Antikörper
gegen das Peptid zu produzieren. Siehe, Paul, supra.
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Impfung
mit exogenem Antigen führt
typischerweise zu einer CD4-Zell-vermittelten T-Zellantwort, die im Allgemeinen zu Antikörperproduktion
führt.
Cytotoxische T-Zellen (CTL) werden durch einen solchen Weg typischerweise
nicht stimuliert. Offensichtlich werden CTL in Situationen stimuliert,
in denen das Antigen von innerhalb der APC selbst stammt (endogenes
Antigen), zum Beispiel, über
Produktion von viralen Proteinen in einer viral infizierten Zelle
oder krebs-spezifische Proteinen in einer Krebszelle. Tatsächlich nimmt
man an, dass bei vielen viralen Erkrankungen die Erzeugung von CTL
für die
Eliminierung von virus-infizierten Zellen und so für die Erholung
von der Infektion kritisch ist.
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Studien
deuten darauf hin, dass endogene und exogene Antigene unterschiedlich
prozessiert werden. Während
der Synthese von naszierenden Polypeptiden wird ein Teil des Polypeptids
durch eine intrazelluläre Struktur
abgebaut, die ein Proteosom genannt wird. Fragmente aus diesem Prozess
komplexieren eher mit neu synthetisierten MHC-Klasse-I- als mit
MHC-Klasse-II-Molekülen, worauf
die resultierenden, Antigen enthaltenden MHC-Klasse-I-Komplexe an die Zelloberfläche transportiert
werden. Wiederum binden T-Zellen mit Spezifizität für das spezifische Peptidfragment
T-Zellen, aber in diesem Fall tritt die erforderliche Corezeptor-Wechselwirkung
zwischen MHC-Klasse-I-Molekül
und einem CD8-Molekül
auf. Demzufolge wird endogenes Antigen auf der Oberfläche der
APC CD8-T-Zellen präsentiert.
Obwohl es einige Arten von CD8+-T-Zellen gibt,
die nicht cytotoxisch sind, machen die CD8-T-Zellen die Mehrheit
der CTL aus.
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Demzufolge
scheint der Entwurf eines Impfstoffes, der starke CTL-Antworten
induzieren kann, zu erfordern, dass das Antigenmolekül (im Allgemeinen
ein Protein) entweder innerhalb der Zelle erzeugt wird oder in das
entsprechende Zellkompartiment geliefert wird, so dass es in den
MHC-Klasse-I-Verarbeitungsweg gelangen kann. Eine Strategie ist
der Einbau eines Gens, das für
ein Protein oder Peptid von Interesse kodiert, in einen Virus und
die anschließende
Verwendung des gentechnisch veränderten
Virus als ein Impfstoff (Lorenz et al. (1999) HUM. GENE THER. 10:623-631).
Eine weitere Strategie ist, einen für ein Protein kodierenden DNA-Vektor
in eine Zelle zu injizieren, und die Zelle dann dem Tier oder Patienten
zu verabreichen, wo es von innerhalb der Zelle exprimiert und dann
auf der Zelloberfläche über MHC-Klasse-I-Moleküle präsentiert wird
(Donnelly et al. (1997) ANNU. REV. IMMUNOL. 15:617). Es wurde nachgewiesen,
dass eine einfachere Technik, DNA-Vektoren direkt in den Muskel
oder die Haut zu injizieren, CTL- und/oder Antikörperantworten auf mehrere Antigene
induziert (Lai et al. (1988) CRIT. REV. IMMUNOL. 18:449-84 und
U.S. Patent Nr. 5,589,466 ).
Studien haben gezeigt, dass das Antigen aufgenommen und durch APC
verarbeitet wird, wo es dem Immunsystem präsentiert wird (Lai et al.,
supra).
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Die
Lieferung von exogenen Peptiden oder Proteinen an den MHC-Klasse-I-Weg
war durch die Verwendung von chemischen Hilfsstoffen wie Freundsches
Adjuvans und Mischungen von Squalen und Detergenzien (Hilgers et
al. (1999) VACCINE 17:219-228), und erst kürzlich durch die Verwendung
von kleinen, mit Antigen beschichteten Beads teilweise erfolgreich,
die durch Makrophagen phagozytiert wurden und CTL-Antworten über einen
alternativen MHC-Klasse-I-Weg induzierten (De Bruijn et al. (1995)
EUR. J. IMMUNOL. 25:1274-1285).
Darüber
hinaus können
weitere Verfahren zur Verstärkung
der Immunantworten auf ein Antigen die Verwendung von chemischen
Hilfsstoffen zusammen mit rekombinanten immunstimulierenden Cytokinen,
zum Beispiel, IL-2, IL-12, GM-CSF, und anderen umfassen. Zum Beispiel
setzt ein Verfahren einen Anti-Hapten-Antikörper ein, der an IL-2 fusioniert
ist, als einen Weg dieses Cytokin mit einem Proteinantigen zu verbinden,
das chemisch mit dem Hapten zur Reaktion gebracht wurde (Harvill
et al. (1996) J. IMMUNOL. 157:3165).
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Eine
weitere Technik nutzt Antikörper-„Antigenisierung” aus, wodurch
ein Teil einer variablen Region von Immunglobulin durch ein Peptidantigen
ersetzt wird. Das Peptidantigen des Hybridmoleküls wird einer APC präsentiert,
sobald der rekombinante Antikörper
die APC über
Wechselwirkung mit Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche der APC bindet (Lanza et
al. (1993) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 90:11683-11687). Eine Ausweitung
dieser Vorgehensweise verwendet Injektion von Plasmid-DNA, die für eine „antigenisierte" schwere Immunglobulinkette
kodiert, in die Milz, wonach von der Milz abstammende B-Zellen den rekombinanten
Antikörper
sezernieren, sobald ein Partner für die leichte Immunglobulinkette
geliefert wird.
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Die
Immunisierungskraft des Antigen-Liefersystems ist jedoch eine der
hauptsächlichen
technischen Hürden
bei der Entwicklung von modernen Impfstoffen. Das Ziel einer Impfung
ist das Hervorrufen einer starken Immunantwort. Da das Wirtsimmunsystem
sich auf die Bekämpfung
von Bakterien und Viren hin entwickelt hat, wird jedoch, wenn Bakterien
oder Viren als Vektoren verwendet werden, der Bote typischerweise
zusammen mit der Botschaft zerstört.
Darüber
hinaus schränken
starke Immunantworten auf bestimmte virale Vektoren, zum Beispiel
Vaccinia und Adenovirus, ihre Verwendbarkeit ein, und es wird überlegt,
dass ähnliche
Probleme während
der Verwendung von bakteriellen Toxinen als Proteinvektoren auftreten
können.
Ebenso sind auf Antikörpern
basierende „Proteinvektoren", die variable Regionen
verwenden, die durch gerade ihre Natur durch das Immunsystem nicht
als „eigen" betrachtet werden,
potenziell immunogen. Es wird in Erwägung gezogen, dass multiple
Verwendungen dieser Trägermoleküle anti-idiotypische
Antworten induzieren können, wodurch
ihre wirksame Verwendung ausgeschlossen wird. Demzufolge ist es
ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff zu schaffen,
der eine starke und lang anhaltenden Immunität gegenüber einem vorgewählten Protein-
oder Peptidantigen erzeugt.
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Lo
et al (Protein Engineering 1998, 4, 495-500) beschreibt ein Fusionsprotein,
das aus einem Fc-Teil eines Immunglobulins und einem Zielprotein
(PSMA) besteht. Dieses Fusionsprotein wurde zusammen mit einem Hilfsstoff
in einer nicht-spezifischen, standardmäßigen Immunisierungsvorgehensweise
verwendet.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese
Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass es möglich ist,
die Immunisierungskraft eines vorgewählten Peptid- oder Proteinantigens
in einem Säugetier
zu verstärken,
indem das vorgewählte
Antigen mit einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette
fusioniert wird. Das resultierende Fusionsprotein (hierein auch
als ein „Fc-Antigen-Fusionsprotein" oder ein „Antigen-Fusionsprotein" bezeichnet) kann
dann dem Säugetier
in der Form eines Impfstoffs verabreicht werden, um gegen das vorgewählte Antigen eine
Immunantwort hervorzurufen, wobei die Stärke und die Art der gegen das
vorgewählte
Antigen hervorgerufenen Immunantwort durch die Verabreichung eines
spezifischen Hilfsstoffs zusammen mit dem Fc-Antigen-Fusionsprotein
moduliert werden kann.
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Demzufolge
schafft die Erfindung Zusammensetzungen für die Verstärkung der Immunisierungskraft eines
vorgewählten
Antigens in einem Säugetier.
In einem Aspekt umfasst die Zusammensetzung ein Fc-Antigen-Fusionsprotein,
das eine konstante Region der schweren Immunglobulinkette enthält, die
durch eine Polypeptidbindung an das vorgewählte Antigen gebunden ist,
in einer Menge, die für
das Hervorrufen einer Immunantwort ausreicht. Das vorgewählte Antigen
ist, wenn es Teil eines Fc-Antigen-Fusionsproteins ist, dadurch
gekennzeichnet, dass es eine Immunantwort in dem Säugetier
stimulieren kann, die stärker
ist als eine vergleichbare Menge (z. B. nach Gewicht oder Anzahl
an Molekülen)
des vorgewählten
Antigens allein, d. h. das vorgewählte Antigen, das nicht an
eine konstante Region der schweren Immunglobulinkette fusioniert
ist.
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Darüber hinaus
werden Immunantworten, die gegen das vorgewählte Antigen des Fc-Antigen-Fusionsproteins
hervorgerufen werden, durch die Verabreichung des Fc-Antigen-Fusionsprotein zusammen
mit einem Hilfsstoff verstärkt
oder moduliert. In der Ausführung
der Erfindung umfassen Hilfsstoffe, die mit Fc-Antigen-Fusionsproteinen
verwendet werden sollen, ein zweites Fc-Fusionsprotein (hierin als
ein „Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein" oder ein „Hilfsstoff-Fusionsprotein" bezeichnet). Bevorzugte
Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine enthalten eine konstante Region der
schweren Immunglobulinkette, die durch eine Polypeptidbindung mit
einem Hilfsprotein, zum Beispiel einem Cytokin, verknüpft ist.
Bevorzugte Cytokine, die bei der Konstruktion von Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen
von Nutzen sind, umfassen, zum Beispiel, Interferon-γ (IFN-γ), Interleukin-2 (IL-2),
Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-12 (IL-12), IL-18, Tumornekrosefaktor (TNF),
Granulozyt-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GMCSF). Eine
weitere Klasse von Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein umfasst eine konstante
Region der schweren Immunglobulinkette, die an eine Hilfsstoffeinheit
fusioniert ist, die einer extrazellulären Domäne eines Proteins entspricht,
das üblicherweise
partikulär
oder ausschließlich
membrangebunden ist. Zum Beispiel ist der CD40-Ligand an eine Fc-Einheit fusioniert,
die als ein verstärktes
Hilfsprotein verwendet werden soll.
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Die
Co-Verabreichung der Fc-Antigen- und Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine,
entweder gleichzeitig oder nacheinander (zum Beispiel Fc-Antigen
gefolgt von Fc-Hilfsstoff oder Fc-Hilfsstoff gefolgt von Fc-Antigen), kann
verwendet werden, um die Art der Immunantwort, die gegen das vorgewählte Antigen
stimuliert wird, zu modulieren. Es werden zwei Klassen von Immunantworten,
bezeichnet mit Th1 und Th2, als Reaktion auf unterschiedliche Stimuli
initiiert und umfassen unterschiedliche Cytokine. Th1-vermittelte
Immunantworten sind von ihrer Art typischerweise zellulär, während Th2-vermittelte
Immunantworten typischerweise von ihrer Art humoral sind. Demzufolge
kann eine Th1-Antwort beim Angriff von veränderten Zellen, wie z. B. Krebszellen
oder virus-infizierte Zellen, von Nutzen sein, während eine Th2-Antwort beim
Angriff auf extrazelluläre
Erreger wie z. B. Parasiten von Nutzen sein kann. Oftmals ist die
Verabreichung von Cytokinen, die an die konstanten Regionen der
schweren Immunglobulinkette fusioniert sind, von Nutzen, um entweder
eine allgemeine Immunantwort zu stimulieren, oder um spezifische
Th1- oder Th2-Antworten zu initiieren oder zu modulieren.
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Zum
Beispiel ist ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein, das eine konstante
Region der schweren Immunglobulinkette enthält, die durch eine Peptidbindung
mit GMCSF verknüpft
ist, ein wirksames allgemeines Stimulans für Immunantworten, die sowohl
Th1- als auch Th2-Antworten
umfassen. Ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein, das IL-12 oder IFN-γ enthält, kann
co-verabreicht werden, um eine vorwiegend zelluläre oder Th1-vermittelte Immunantwort
zu stimulieren. Alternativ kann ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein,
das IL-4 enthält,
verabreicht werden, um eine vorwiegend humorale oder Th2-vermittelte
Immunantwort zu stimulieren.
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Darüber hinaus
kann die Wahl eines bestimmten Cytokins, das in einem Fc-Hilfsstoff- Fusionsprotein vorkommt,
die Antikörperklasse
beeinflussen, die gegen das vorgewählte Antigen des Fc-Antigen-Fusionsproteins
produziert wird. Zum Beispiel kann ein IL-12 enthaltendes Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein
T-Helferzellen und die Produktion von Antikörpern der IgG2a-Klasse stimulieren.
Alternativ kann ein IL-4 enthaltendes Hilfsstoff-Fusionsprotein die Produktion von Antikörpern der
IgE-Klasse stimulieren.
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Wie
vorher diskutiert, umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen das Fc-Antigen-Fusionsprotein
in Kombination mit einem Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein. Durch Verwendung
von zwei Fusionsproteinen, von denen jedes eine konstante Region
der schweren Immunglobulinkette enthält, ist es möglich, sowohl das
vorgewählte
Antigen als auch das Hilfsprotein (zum Beispiel ein Cytokin) an
gleichen oder ähnlichen
Zellarten in dem Säugetier
zu co-lokalisieren. Zum Beispiel exprimieren Makrophagen, B-Zellen,
Granulozyten und dendritische Zellen Fc-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche. Demzufolge
ist es durch gleichzeitige Verabreichung von Fc-Antigen- und Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen,
die Fc-Rezeptoren binden können,
möglich,
das Antigen des Antigen-Fusionsproteins und den Hilfsstoff des Hilfsstoff-Fusionsproteins
an den gleichen Zellarten zu co-lokalisieren. Der Hilfsstoff kann
dann die Immunantwort in der Nachbarschaft des vorgewählten Antigens
stimulieren, verstärken
oder auf andere Weise modulieren.
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Die
Erfindung verwendet zwei unterschiedliche Formen der Lokalisierung
oder Anreicherung. Erstens verwendet die Erfindung eine gemeinsame
Einheit, die sowohl an das Antigen wie auch an den Hilfsstoff fusioniert
ist, der in bestimmten Körperregionen
angereichert wird. Auf diese Weise wird die wirksame lokale Anreicherung
des Antigens in der Nachbarschaft des Hilfsstoffs erhöht. Zweitens
lenkt die Erfindung das Antigen zur Antigen verarbeitenden und präsentierenden
Maschinerie des Immunsystems. Der erste Anreicherungsschritt kann
durch Fusionieren der Antigen- und Hilfsstoffproteine an eine Einheit
durchgeführt
werden, die in einigen Körperteilen
zu einer Anreicherung führt,
die für
das Immunsystem zugänglich
ist. Der zweite Lenkungsschritt kann durch Fusionieren des Antigenproteins
an eine beliebige Einheit durchgeführt werden, die die Lieferung
an oder das Verarbeiten durch das antigenpräsentierende System verstärkt.
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Demzufolge
erreicht die Erfindung diese Anreicherungswirkungen durch zwei alternative Verfahren. Ein
Verfahren ist die Konstruktion und Verabreichung von zwei unterschiedlichen
Fusionsproteinen, einer Antigen-lokalisierenden Proteinfusion und
einer Hilfsstoff-lokalisierenden Proteinfusion. Ein zweites Verfahren
ist die Konstruktion und Verabreichung einer Fusion, die das Antigen,
den Hilfsstoff und das lokalisierende Protein enthält. Eine
Fc-Einheit ist ein
Beispiel für
ein lokalisierendes Protein.
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Ein
wichtiges Merkmal der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette
ist, dass sie im Gegensatz zum vorgewählten Antigen im Fc-Antigen-Fusionsprotein
in dem beabsichtigten Empfänger
vorzugsweise nicht immunogen oder nur schwach immunogen ist. Mit
anderen Worten ist das vorgewählte
Antigen im Fc-Antigen-Fusionsprotein so entworfen, dass es in dem
Empfänger
stärker
immunogen ist als die konstante Region der schweren Immunglobulinkette.
Ebenso wird in Erwägung
gezogen, dass das Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein in dem beabsichtigten
Empfänger
ebenfalls nicht oder nur schwach immunogen sein sollte. Die Immunisierungskraft
einer konstanten Region der schweren Immunglobulinkette kann vermindert,
und in bestimmten Fällen
eliminiert werden, indem Sequenzen der konstanten Immunglobulinregion
verwendet werden, die von denen in der gleichen Spezies wie dem
beabsichtigten Empfänger
vorkommenden abstammen oder ihnen ähnlich sind. Zum Beispiel werden
konstante Regionen der schweren Immunglobulinkette vorzugsweise
humanen Ursprungs verwendet, um Fusionsproteine zu erzeugen, die
Menschen verabreicht werden sollen. Ebenso ist, wenn der beabsichtigte
Empfänger
ein Mensch ist, das Hilfsprotein in dem Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein
ebenfalls vorzugsweise humanen Ursprungs. Durch die Wahl von geeigneten
Aminosäuresequenzen, die
konstante Regionen der schweren Immunglobulinkette und Hilfsproteine
definieren, ist es möglich,
eine Immunantwort direkt vorwiegend gegen das vorgewählte Antigen
zu optimieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die konstante Region der schweren Immunglobulinkette des
Fc-Antigen-Fusionsproteins eine Gelenk-Region von Immunglobulin
und gegebenenfalls eine konstante Regionsdomäne des Immunglobulins, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus einer CH2-Domäne, einer CH3-Domäne und einer
CH4-Domäne
oder Kombinationen daraus. Der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette
fehlt jedoch vorzugsweise mindestens eine CH1-Domäne. Darüber hinaus
fehlt den erfindungsgemäßen Fc-Fusionsproteinen
die variable Regionsdomäne
der schweren Immunglobulin kette (VH). Wenn
das Fusionsprotein einem Menschen verabreicht werden soll, enthält die konstante
Region der schweren Immunglobulinkette vorzugsweise eine Gelenk-Region
und eine CH2-Domäne
oder eine CH3-Domäne und
am meisten bevorzugt enthält
sie eine Gelenk-Region und sowohl eine CH2-Domäne wie auch eine CH3-Domäne. Es wird
in Betracht gezogen, dass die für
die Ausführung
der Erfindung nützlichen
konstanten Regionen der schweren Immunglobulinkette von Immunglobulinen
abgeleitet werden können,
die einer beliebigen der fünf
Immunglobulinklassen angehören,
die mit IgA (Igα),
IgD (Igδ),
IgE (Igε),
IgG (Igγ)
und IgM (Igμ) bezeichnet
werden. Die konstanten Regionen der schweren Immunglobulinkette
aus der IgG-Klasse sind jedoch bevorzugt.
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Es
wird in Erwägung
gezogen, das jegliches vorgewählte
Antigen von Interesse in dem erfindungsgemäßen Fc-Antigen-Fusionsprotein
eingeschlossen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das vorgewählte
Antigen ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Prostata-spezifischem Membranantigen,
einer Ektodomäne
eines Cytokinrezeptors, einem viralen Protein und einem Krebs- oder
Tumor-spezifischen Antigen.
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Fc-Antigen-Fusionsproteine
mit einer Vielfalt an Konfigurationen können bei der Ausführung der
Erfindung von Nutzen sein. Zum Beispiel kann der N-Terminus des
vorgewählten
Antigens mittels einer Polypeptidbindung an den C-Terminus der konstanten
Region der schweren Immunglobulinkette verknüpft werden. Alternativ kann
der C-Terminus des vorgewählten
Antigens mittels einer Polypeptidbindung an den N-Terminus der konstanten
Region der schweren Immunglobulinkette verknüpft werden. Darüber hinaus
wird in Erwägung gezogen,
dass die Fc-Antigen-Fusionsproteine eine Vielzahl von einem oder
mehreren vorgewählten
Antigenen enthalten können,
von denen eines oder mehrere direkt oder über einen Polypeptidlinker
miteinander oder mit der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette
verknüpft
sein können.
Darüber
hinaus können zwei
oder mehr Fc-Antigen-Fusionsproteine
miteinander verbunden sein, entweder nicht-kovalent oder kovalent,
zum Beispiel über
eine oder mehrere Disulfidbindungen, um dimere oder multimere Zusammensetzungen herzustellen.
Es wird in Erwägung
gezogen, dass die Fc-Antigen-Fusionsproteine in den dimeren Konstrukten die
gleichen sein können
oder voneinander verschieden. Obwohl zum Beispiel beide Fc-Antigen-Fusionsproteine
die gleiche konstante Region der schweren Immunglobulinkette enthalten
können,
können
sich die vorgewählten
Antigene unterscheiden. Es wird in Erwägung gezogen, dass ähnliche
Konfigurationen auch bei den Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen eingesetzt
werden können.
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Darüber hinaus
kann eine Vielzahl an Nucleinsäuresequenzen,
die für
Fc-Fusionsprotein kodieren, bei der Ausführung der Erfindung von Nutzen
sein. Zum Beispiel können
die Nucleinsäuresequenzen
in einer 5'- nach
3'-Richtung entweder
für die
konstante Region der schweren Immunglobulinkette und das vorgewählte Antigen
oder für
das vorgewählte
Antigen und die konstante Region der schweren Immunglobulinkette
kodieren. Darüber
hinaus können
die Nucleinsäuresequenzen
gegebenenfalls auch eine „Leader"- oder „Signal"-Sequenz umfassen, die, zum Beispiel,
auf einer Sequenz der leichten Immunglobulinkette basiert, die direkt
an eine Gelenk-Region der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette
fusioniert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn die Fc-Region
auf IgG-Sequenzen basiert, kodiert die Fc-Region in einer 5'- nach 3'-Richtung mindestens
für eine
Immunglobulin-Gelenk-Region (d. h. eine Gelenk-Region, die mindestens
eine Cystein-Aminosäure enthält, die
mit einer zweiten Sequenz für
eine Immunglobulin-Gelenk-Region eine Disulfidbindung bilden kann),
eine Immunglobulin-CH2-Domäne
und eine CH3-Domäne. Darüber hinaus kann
auch eine für
die Fc-Antigen-Fusionsproteine kodierende Nucleinsäuresequenz
innerhalb eines replizierbaren Expressionsvektors eingebaut sein,
der das Fc-Fusionsprotein zum Beispiel entweder in einem bakteriellen
Wirt, in dem beabsichtigten Empfänger
oder in beiden exprimieren kann.
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Es
wird in Erwägung
gezogen, dass die Injektion von für das Fc-Antigen-Fusionsprotein
kodierenden Nucleinsäuresequenzen,
entweder allein oder in Kombination mit für das Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein kodierenden
Nucleinsäuresequenzen
zur Erzeugung einer zellulären
Immunantwort, einer humoralen Immunantwort oder beiden führen kann.
Kombinationen aus Nucleinsäure-
und Protein-basierten Immunisierungen (z. B. Verabreichung eines
Fc-Antigen-Fusionsproteins
vor, während
oder nach Verabreichung einer für
das Fc-Antigen-Fusionsprotein
kodierenden Nucleinsäure)
können
synergistisch miteinander wirken, um stärkere Immunantworten gegen
das vorgewählte
Antigen hervorzurufen, bezogen auf die Immunisierung mit entweder der
Nucleinsäure
oder dem Protein allein.
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Die
vorstehenden und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, den
Abbildungen und Ansprüchen
noch deutlicher.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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Die
vorhergehenden und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile
der vorliegenden Erfindung sowie die Erfindung selbst können aus
der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen in Zusammenhang
mit den beigefügten
Abbildungen genauer verstanden werden, in denen:
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1A-1G schematische
Darstellungen von beispielhaften Fc-Fusionsproteinen sind, die bei
der Ausführung
der Erfindung von Nutzen sind. 1A stellt
ein Fc-Antigen- oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein
dar, bei dem die konstante Region der schweren Immunglobulinkette
1 an das N-terminale Ende des Antigens oder Hilfsstoffes 2 geknüpft ist. 1B stellt
ein Fc-Antigen- oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein dar, bei dem die
konstante. Region der schweren Immunglobulinkette 1 an das C-terminale
Ende des Antigens oder Hilfsstoffes 2 geknüpft ist. 1C und 1D stellen
ein dimeres Protein dar, bei dem eine oder beide der Polypeptidketten ein
Fc-Antigen- oder ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein enthalten. In 1C,
ist in mindestens einer Polypeptidkette die konstante Region der
schweren Immunglobulinkette 1 an das N-terminale Ende des Antigens
oder Hilfsstoffes 2 geknüpft
und in 1D ist die konstante Region
der schweren Immunglobulinkette 1 an das C-terminale Ende des Antigens
oder Hilfsstoffes 2 geknüpft. 1E stellt
ein dimeres Protein dar, bei dem eine oder beide der Polypeptidketten
ein Fc-Antigen-Antigen-, Fc-Hilfsstoff-Hilfsstoff-, Fc-Hilfsstoff-Antigen-
oder ein Fc-Antigen-Hilfsstoff-Fusionsprotein enthalten. 1F stellt
ein dimeres Fusionsprotein dar, bei dem eine oder beide der Polypeptidketten
ein Antigen-Fc-Hilfsstoff-, oder ein Hilfsstoff-Fc-Antigen-Fusionsprotein
enthalten. 1G stellt ein dimeres Fusionsprotein
dar, bei dem eine oder beide der Polypeptidketten ein Antigen-Hilfsstoff-Fc-,
oder ein Hilfsstoff-Antigen-Fc-Fusionsprotein enthalten.
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2A-2B sind
schematische Darstellungen von DNA-Sequenzen, die bei der Ausführung der Erfindung
von Nutzen sind. 2A stellt einen Expressionsvektor
für ein
humanes Fc-Fusionsprotein dar. 2B stellt
eine Genfusion für
die Expression eines IgG2a-Fc-Fusionsproteins der Maus dar.
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3A-3F sind
Diagramme, die die Wirkung der chemischen und Fc-Cytokin- Hilfsstoffe auf die Antikörperproduktion
in Mäusen
zeigen, die mit dem Fc-Antigen-Fusionsprotein,
Maus-Fc-humanes-IL-4-Rezeptorektodomäne-Fusionsprotein (Fc-IL-4R)
immunisiert wurden. In 3A wurden die Mäuse mit
Fc-IL-4R und Fc-IL-2 in vollständigem
Freundschem Adjuvans (CFA) immunisiert. In 3B wurden
die Mäuse
mit Fc-IL-4R in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) immunisiert. In 3C wurden
die Mäuse
mit Fc-IL-4R in CFA immunisiert. In 3D wurden
die Mäuse
mit Fc-IL-4R und Fc-IL-2 in PBS immunisiert. In 3E wurden
die Mäuse
mit Fc-IL-4R und Fc-GMCSF in CFA immunisiert. In 3F wurden
die Mäuse
mit Fc-IL-4R und Fc-GMCSF in PBS immunisiert. In den 3A-3F stellen
die Quadrate, Rauten und Dreiecke von drei einzelnen Mäusen abstammende
Daten dar. Die Antikörperspiegel
für ein
Antigen wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische
Dichte der ELISA-Anzeigewerte an.
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4A–4D sind
Diagramme, die die Wirkung der Immunisierung von Mäusen mit
einem humanem Krebsantigen, PSMA, in der Form eines Fc-Antigen-Fusionsproteins
unter Verwendung variierender Mengen an Fc-GMCSF als einen Hilfsstoff
zeigen. In 4A wurden die Mäuse mit
50 μg Fc-PSMA-Fusionsprotein
allein immunisiert. In 4B wurden die Mäuse mit
50 μg Fc-PSMA
und 0,05 μg
Fc-GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert. In 4C wurden
die Mäuse
mit 50 μg
Fc-PSMA und 0,5 μg
Fc-GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert. In 4D wurden
die Mäuse
mit 50 μg
Fc-PSMA und 5 μg
Fc-GMCSF immunisiert. In den 4A-4D stellen
die Quadrate, Rauten und Dreiecke von drei einzelnen Mäusen abstammende
Daten dar.
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5A-5F sind
Diagramme, die die spezifischen Antikörperantworten auf das PSMA-Antigen vergleichen,
das entweder als ein natives Protein (5A-5C) oder als ein Maus-Fc-PSMA-Fusionsprotein
(5D-5F) verabreicht wurde. In 5A wurden
Mäuse mit
50 μg PSMA
als ein Antigen immunisiert. In 5B wurden Mäuse mit
50 μg PSMA
als ein Antigen und 0,2 μg
GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert. In 5C wurden Mäuse mit
50 μg PSMA
als ein Antigen und 0,5 μg
Fc-GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert. In 5D wurden
Mäuse mit
50 μg Fc-PSMA
als ein Antigen immunisiert. In 5E wurden
Mäuse mit
50 μg Fc-PSMA
als ein Antigen und 0,2 μg
GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert. In 5F wurden
Mäuse mit
50 μg Fc-PSMA als
ein Antigen und 0,5 μg
Fc-GMCSF als einem
Hilfsstoff immunisiert. In den 5A – 5F stellen
die Quadrate, Rauten und Dreiecke von drei einzelnen Mäusen abstammende
Daten dar. Die Antikörperspiegel
für ein Antigen
wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische Dichte
der ELISA-Anzeigewerte an.
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6 ist
eine Grafik, die die helfende Wirkung von Fc-GMCSF oder Fc-F3L,
die gemeinsam mit Fc-PSMA verabreicht wurden, auf die Antikörperproduktion
gegen humanes PSMA vergleicht. Alle Tiere erhielten 50 μg Fc-PSMA
entweder allein oder in Kombination mit dem angegebenen Fc-Cytokin
als einem Hilfsstoff. Pro Experiment wurden drei Mäuse getestet.
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7A-7B sind
Diagramme, die die Immunisierungskraft des Fc-EpCAM-Fusionsproteins,
entweder allein oder in Kombination mit einem Fc-GMCSF-Hilfsstoff
bei einzelnen Mäusen
zeigen. 7A und 7B stellen
Antikörpertiter
dar, die 7 bzw. 14 Tage nach einer Auffrischimpfung gemessen wurden.
Die Auffrischimpfung wurde drei Wochen nach der ersten Immunisierung
gegeben. In beiden Figuren stellen die offenen Rauten Mäuse dar,
die subkutan mit 10 μg
Fc-EpCAM allein immunisiert wurden, und die ausgefüllten Dreiecke
stellen Mäuse
dar, die subkutan mit 10 μg
Fc-EpCAM und 1 μg
Fc-GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel
für ein
Antigen wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische
Dichte der ELISA-Anzeigewerte an.
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8A-8B sind
Diagramme, die die Immunisierungskraft des EpCAM-Fc (umgekehrte
Orientierung der Fc-Region und des Antigens), entweder allein oder
in Kombination mit einem Fc-GMCSF-Hilfsstoff-Fusionsprotein bei
Mäuse zeigt. 8A und 8B stellen
Antikörpertiter
dar, die 14 bzw. 21 Tage (d. h. 7 Tage nach der Auffrischimpfung)
nach Immunisierung gemessen wurden. In beiden Figuren stellen die
offenen Rauten mittlere Titer von drei Mäusen dar, die mit 25 μg EpCAM-Fc-Fusionsproteinen
allein immunisiert wurden, und die ausgefüllten Dreiecke stellen Mäuse dar,
die mit 25 μg
EpCAM-Fc und 2,5 μg
Fc-GMCSF als einem
Hilfsstoff immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel für ein Antigen
wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische Dichte
der ELISA-Anzeigewerte
an.
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9 zeigte
eine Grafik für
die Konstruktion eines Plasmidvektors, der für ein EpCAM-Fc- GMCSF-Fusionsprotein
kodiert. In diesem Fall ist das Antigen EpCAM an das aminoterminale
Ende der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette (Fc-Region)
und der Hilfsstoff GMCSF ist an das carboxyterminale Ende der Fc-Region
fusioniert.
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10A-10D sind Diagramme, die Antikörpertiter
in Mäusen
zeigen, denen die für
das Fc-EpCAM-Fusionsprotein kodierenden Plasmidvektoren unter Verwendung
von entweder PBS oder einer Saccharoselösung mit 25 Gew.-% als einem
Trägervehikel
injiziert wurden. 10A-10D stellen
Antikörpertiter dar,
die 14 Tage, 27 Tage, 55 Tage bzw. 69 Tage nach der ersten Injektion
gemessen wurden. In allen Figuren stellen die offenen Rauten Titer
für einzelne
Mäuse dar,
denen für
das Fc-EpCAM kodierendes Plasmid in PBS injiziert wurde, und die
gefüllten
Dreiecke stellen Titer für
individuelle Mäuse
dar, denen für
Fc-EpCAM kodierendes
Plasmid in Saccharose injiziert wurde. Die Antikörperspiegel für ein Antigen
wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische Dichte
der ELISA-Anzeigewerte
an.
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11A-11B sind Diagramme, die die
Stimulierung des 3H-Thymidineinbaus als
Reaktion auf in-vitro-Stimulierung mit Antigen in Splenozyten zeigen,
die aus durch DNA-Impfung
oder durch Proteinimpfung immunisierten Mäusen isoliert wurden. 11B zeigt eine vergrößerte Ansicht der Daten im
unteren Teil von 11A. In allen Figuren stellen
die ausgefüllten
Rauten Splenozyten dar, die von Mäusen geerntet wurden, die mit
100 μg einer
für das
CMV-Fc-EpCAM-Fusionsprotein kodierenden Plasmid-DNA immunisiert
wurden, die offenen Kreise stellen Splenozyten dar, die von Mäusen geerntet
wurden, die mit 100 μg
einer für
das CMV-EpCAM-Fc-Fusionsprotein kodierenden Plasmid-DNA immunisiert
wurden, und die Kreuze stellen Splenozyten dar, die von Mäusen geerntet
wurden, die mit 10 μg
Fc-EpCAM-Protein immunisiert wurden. Die Milzen wurden an Tag 70
nach der ersten Injektion von Plasmid-DNA oder Protein und zwei
Auffrischinjektionen in einem dreiwöchigen Intervall entfernt.
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12A-B sind Diagramme, die ein Cytotoxische-T-Lymphozyten-(CTL-)Killing-Assay unter Verwendung
von Splenozyten aus mit Plasmid-DNA oder Fc-EpCAM-Protein immunisierten
Mäusen
zeigen. 12A zeigt die Aktivität von Splenozyten
gegen CT26-Tumorzellen
der Maus, die das humane EpCAM-Protein exprimieren. 12B zeigt die Aktivität von Splenozyten gegen parenterale
CT26-Tumorzellen der Maus. In beiden Figuren stellen die offenen
Rauten Splenozyten dar, die mit einer (CMV-Promoter)-EpCAM-Konstrukt tragenden
DNA immunisiert wurden, offene Quadrate stellen Splenozyten aus
Mäusen
dar, die mit einer ein (CMV-Promoter)-Fc-EpCAM-Fusionskonstrukt
tragenden DNA immunisiert wurden, offene Dreiecke stellen Splenozyten
von Mäusen
dar, die mit einer ein (CMV-Promoter)-EpCAM-Fc-Fusionskonstrukt
tragenden DNA immunisiert wurden, und Kreuze stellen Splenozyten
von Mäusen
dar, die mit Fc-EpCAM-Fusionsprotein immunisiert wurden. Das CTL-Assay
verwendete Splenozyten aus den immunisierten Mäusen, die für fünf Tage mit 10 U/ml IL-2 kultiviert
wurden. Markierte Zielzellen wurden mit den angegebenen Effektoren
vermischt und für
vier Stunden inkubiert. Die Freisetzung von Radioaktivität wurde
verwendet, um den Prozentsatz an spezifischer Lyse zu berechnen.
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13 ist
ein Diagram, das Antikörpertiter
in Mäusen
zeigt, die subkutan mit 50 μg
Fc-MCSP-Fusionsprotein
in PBS entweder allein oder in Kombination mit 5 μg Fc-GMCSF
als einem Hilfsstoff immunisiert wurden. Die gefüllten Rauten stellen Antikörpertiter
in normalem Serum dar, die offenen Quadrate stellen Antikörpertiter
im Serum von Mäusen
dar, die mit Fc-MCSP-Fusionsprotein allein immunisiert wurden, und
die gefüllten
Dreiecke stellen Antikörpertiter
im Serum von Mäusen
dar, die mit Fc-MCSP-Fusionsprotein in Kombination mit einem Fc-GMCSF-Hilfsstoff
immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel
für ein
Antigen wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische
Dichte der ELISA-Anzeigewerte an.
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14A–B
sind Diagramme, die Antikörpertiter
in Mäusen
zeigen, die mit Fc-gp41-pep-626-Fusionsprotein
entweder allein oder in Kombination mit einem Fc-Cytokin-Hilfsstoff immunisiert
wurden. 14A und 14B stellen
Antikörpertiter
dar, die 7 bzw. 33 Tage nach einer zweiten Auffrischimpfung erreicht
wurden. In allen Figuren stellen die offenen Rauten Antikörpertiter
in Mäusen
dar, die mittels intradermaler Injektion mit 25 μg Fc-gp41-pep-626-Antigen allein
immunisiert wurden, offene Quadrate stellen Titer in Mäusen dar,
die mittels intradermaler Injektion von 25 μg Fc-gp41-pep-626-Antigen in
Kombination mit 2,5 μg
Fc-GMCSF-Hilfsstoff immunisiert wurden, und ausgefüllte Dreiecke
stellen Antikörpertiter
in Mäusen
dar, die mittels intradermaler Injektion von 25 μg Fc-gp41-pep-626-Antigen in Kombination mit 2,5 μg Fc-IL2-Hilfsstoff
immunisiert wurden. Die Antikörperspiegel
für ein
Antigen wurden mittels ELISA gemessen; die Y-Achse gibt die optische Dichte
der ELISA-Anzeigewerte an.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Offenbarung betrifft die effiziente Lieferung von Protein-
oder Peptidantigenen in vivo zur Induzierung von humoralen (d. h.
antikörper-basierten)
oder Th2-Zellvermittelten Immunantworten, zellulären oder Th1-Zell-vermittelten
Immunantworten und in einigen Fällen
von beiden Arten von Immunantworten in einem Säugetier. Es wurde nun gefunden,
dass es möglich
ist, die Immunisierungskraft eines vorgewählten Peptid- oder Proteinantigens
in einem Säugetier
zu verstärken,
indem das vorgewählte
Antigen mit einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette
fusioniert wird, um ein Fc-Antigen-Fusionsprotein zu erzeugen. Das resultierende
Fc-Antigen-Fusionsprotein, oder die für Fc-Antigen-Fusionsproteine kodierenden Nucleinsäuresequenzen
können
dann dem Säugetier,
zum Beispiel einem Menschen, in der Form eines Impfstoffs verabreicht
werden, um gegen das vorgewählte
Antigen eine Immunantwort hervorzurufen.
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Das
Fc-Antigen-Fusionsprotein liefert das Antigen selektiv an antigenpräsentierende
Zellen (APCs). Wir möchten
uns nicht auf eine Theorie festlegen, aber wir glauben, dass die
Bindung des Fc-Antigen-Fusionsproteins an die APCs durch Fc-Rezeptoren
vermittelt wird, die auf einer Vielzahl von Immunzellarten exprimiert
werden, einschließlich,
zum Beispiel: dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen und Granulozyten. Das
Fc-Antigen-Fusionsprotein bindet, wenn es dem Säugetier verabreicht wird, Fc-Rezeptoren,
wonach das Fc-Antigen-Fusionsprotein
durch die APCs endozytosiert wird. Das endozytosierte Fusionsprotein,
einschließlich
des vorgewählten
Antigens, wird dann vermutlich zu kleineren Peptiden abgebaut, die
anschließend
auf der Zelloberfläche
präsentiert
werden. Die präsentierten
Peptide vermitteln dann eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort.
Die bestimmte Art von stimulierter Immunantwort kann moduliert werden,
indem das Fc-Antigen-Fusionsprotein
gemeinsam mit einem Hilfsstoff, zum Beispiel einem Hilfsstoff-Fusionsprotein, verabreicht
wird.
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In
einer Ausführung
der Verabreichung wird dem Empfänger
das Fc-Antigen-Fusionsprotein verabreicht. In einer weiteren Ausführung der
Verabreichung wird dem Empfänger
eine für
das Fc-Antigen-Fusionsprotein kodierende Nucleinsäuresequenz
verabreicht. Das vorgewählte
Antigen, entweder im verabreichten Fc-Antigen-Protein oder exprimiert
von der verabreichten Nucleinsäure,
ist immunogener als das Antigen allein, d. h. nicht durch eine Polypeptidbindung
an eine konstante Region der schweren Immunglobulinkette fusioniertes
Antigen. Darüber
hinaus kann, unter bestimmten Umständen, eine aufeinander folgende
Verabreichung von Fusionsprotein gefolgt von Verabreichung der für das gleiche
Fusionsprotein kodierenden Nucleinsäure, oder alternativ Verabreichung
von für
das Fusionsprotein kodierender Nucleinsäure gefolgt von Verabreichung
des gleichen Fusionsproteins verwendet werden, um die Immunisierungskraft
des vorgewählten
Antigens zu maximieren. Es ist bekannt, dass eine optimale Immunantwort
hervorgerufen wird, wenn beide Komponenten der Fc-Antigen-Fusionsproteine
aktiv sind. Mit anderen Worten ist das vorgewählte Antigen in dem Fc-Antigen-Fusionsprotein
in der Lage, eine Immunantwort hervorzurufen und die konstante Region
der schweren Immunglobulinkette ist in der Lage, einen Fc-Rezeptor
auf der Oberfläche
von APCs zu binden.
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Des
Weiteren kann, wie diskutiert, die Stärke und Art der gegen das vorgewählte Antigen
hervorgerufenen Immunantwort moduliert werden, indem spezifische
Hilfsstoffe gemeinsam mit dem Fc-Antigen-Fusionsprotein verabreicht
werden. Bei der Ausführung
der vorliegenden Erfindung enthalten die Hilfsstoffe ein zweites Fc-Fusionsprotein,
wobei eine konstante Region der schweren Immunglobulinkette an ein
Hilfsprotein fusioniert ist, um ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein herzustellen.
Wie bei den Fc-Antigen-Fusionsproteinen versteht es sich, dass eine
optimale Immunantwort hervorgerufen wird, wenn beide Komponenten
eines Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteins aktiv sind. Mit anderen Worten
ist der Hilfsstoff in dem Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein
in der Lage, eine Immunantwort zu modulieren und die konstante Region
der schweren Immunglobulinkette ist in der Lage, einen Fc-Rezeptor
auf der Oberfläche
von APCs zu binden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden sowohl das Antigen als auch der Hilfsstoff als
Fc-Fusionsproteine verabreicht. Mit anderen Worten wird das Antigen
als ein Fc-Antigen-Fusionsprotein
verabreicht und der Hilfsstoff wird als ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein
verabreicht. Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung nützlichen
Fc-Fusionsproteine sind in 1A-1G dargestellt.
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1A stellt
ein beispielhaftes Fc-Fusionsprotein dar, in dem der C-Terminus
der kon stanten Region der schweren Immunglobulinkette 1,
entweder direkt oder mittels eines Polypeptidlinkers, mit dem N-Terminus des
vorgewählten
Antigens oder Hilfsstoffes 2 verbunden ist. Wie hier verwendet,
ist der Begriff „Polypeptidlinker" so zu verstehen,
dass eine Sequenz aus einem oder mehreren Aminosäureresten gemeint ist, die
zwei Proteine miteinander koppeln. Der Polypeptidlinker ist oftmals
eine Reihe von Aminosäuren
mit einer Länge von
etwa 10-15 Resten, die zum Beispiel sich wiederholende Glycin- und/oder
Serinreste enthalten. 1B stellt ein beispielhaftes
Fc-Fusionsprotein dar, in dem der C-Terminus des vorgewählten Antigens oder Hilfsstoffes 2,
entweder direkt oder mittels eines Polypeptidlinkers, mit dem N-Terminus
der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette 1 verbunden
ist.
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1C zeigt
ein dimeres Konstrukt, das zwei Fc-Fusionsproteine enthält, die
kovalent mittels zweier Disulfidbindungen verknüpft sind. Das dimere Konstrukt
enthält
zwei Fc-Fusionsproteine,
in denen der C-Terminus von jeder konstanten Region der schweren
Immunglobulinkette 1 mit dem N-Terminus eines vorgewählten Antigens
oder Hilfsstoffes 2 verbunden ist. Ebenso zeigt 1D ein
dimeres Konstrukt, das zwei Fc-Fusionsproteine enthält, die
kovalent mittels zweier Disulfidbindungen verknüpft sind. Das dimere Konstrukt
enthält zwei
Fc-Fusionsproteine, in denen der C-Terminus von jedem vorgewählten Antigen
oder Hilfsstoff 2 mit dem N-Terminus der konstanten Region
der schweren Immunglobulinkette 1 verbunden ist.
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1E zeigt
ein dimeres Konstrukt, das zwei Fc-Fusionsproteine enthält, die
kovalent mittels zweier Disulfidbindungen verknüpft sind. Das dimere Konstrukt
enthält
zwei Fc-Fusionsproteine,
in denen der C-Terminus von jeder konstanten Region der schweren
Immunglobulinkette 1, entweder direkt oder über einen
Polypeptidlinker, mit dem N-Terminus
eines vorgewählten
Antigens oder Hilfsstoffes 2 verbunden ist, dessen C-Terminus,
entweder direkt oder über
einen Polypeptidlinker, mit einem zweiten Antigen oder Hilfsstoff 2' verbunden ist.
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1F zeigt
ein dimeres Konstrukt, das zwei Fc-Fusionsproteine enthält, die
ebenfalls mittels zweier Disulfidbindungen verknüpft sind. Das dimere Konstrukt
enthält
zwei Fc-Fusionsproteine,
in denen der C-Terminus des Antigens oder Hilfsstoffes 2,
entweder direkt oder über
einen Polypeptidlinker, mit dem N-Terminus der konstanten Region
der schweren Immunglobulinkette 1 verbunden ist, deren
C-Terminus, entweder direkt oder über einen Polypeptidlinker,
mit dem N-Terminus eines unterschiedlichen Hilfsstoffes oder Antigens 2' verbunden ist.
Zum Beispiel können
derartige Fusionsproteine, in einer N- nach C-terminalen Richtung,
vorgewähltes
Antigen – konstante
Region der schweren Immunglobulinkette – Hilfsstoff umfassen.
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1G zeigt
ein dimeres Konstrukt, das zwei Fc-Fusionsproteine enthält, die
ebenfalls mittels zweier Disulfidbindungen verknüpft sind. Das dimere Konstrukt
enthält
zwei Fc-Fusionsproteine,
in denen der C-Terminus des Antigens oder Hilfsstoffes 2,
entweder direkt oder über
einen Polypeptidlinker, mit dem N-Terminus eines unterschiedlichen
Hilfsstoffes oder Antigens 2' verbunden
ist, dessen C-Terminus, entweder direkt oder über einen Polypeptidlinker,
mit dem N-Terminus der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette 1 verbunden
ist. Zum Beispiel können
derartige Fusionsproteine, in einer N- nach C-terminalen Richtung, vorgewähltes Antigen – Hilfsstoff – konstante
Region der schweren Immunglobulinkette umfassen.
-
Bei
der Ausführung
der Erfindung ist es im Allgemeinen bevorzugt, die Fc-Einheit bezogen
auf die Hilfsstoffeinheit in einer N-terminale Position zu platzieren.
Wenn die Hilfsstoffeinheit N-terminal zur Fc-Einheit platziert wird,
dann kann die Hilfsstoff-Fc-Fusion an einen Hilfsstoffrezeptor auf
einer Immunzelle binden und die Fc-Einheit wird in der gleichen
Orientierung vorliegen, die bei der Bindung eines Antikörpers an
eine Zelloberfläche
eingenommen wird. ADCC oder Komplementfixierung können eine
Folge sein. Wenn die Fc-Einheit
jedoch N-terminal zur Hilfsstoffeinheit platziert wird, scheint
dies keine ADCC und Komplementfixierung zur Folge zu haben.
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Die
in den 1C–1G dargestellten
Konstrukte werden als Dimere, die durch ein Paar an Disulfidbindungen
zwischen Cysteinen an benachbarten Gelenk-Regionen vernetzt sind,
beschrieben. In den Zeichnungen werden die Disulfidbindungen so
dargestellt, dass sie die Teile zweier konstanter Regionen der schweren
Immunglobulinkette über
die Eigenschaften der Gelenk-Region der nativen Formen dieser Moleküle miteinander
verknüpfen.
Während
Konstrukte, die Gelenk-Regionen von Immunglobulin einschließen, bevorzugt
sind, zieht die Erfindung auch in Erwägung, dass wie gewünscht Vernetzung
an anderen Positionen gewählt
werden können.
Darüber
hinaus können,
in einigen Fällen,
zwei oder mehr Monomere nicht-kovalent
assoziieren, um für
die Ausführung
der Erfindung nützliche
Dimere oder Multimere zu erzeugen.
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Wie
hierin verwendet, wird der Begriff „konstante Region der schweren
Immunglobulinkette" austauschbar
mit dem Begriff „Fc-Region" verwendet, und ist
so zu verstehen, dass der carboxylterminale Teil einer konstanten
Region der schweren Immunglobulinkette gemeint ist, oder ein Analogon
oder ein Teil davon, der in der Lage ist, einen Fc-Rezeptor zu binden.
Wie bekannt ist, enthält
jede konstante Region der schweren Immunglobulinkette vier oder
fünf Domänen. Die
Domänen
werden nacheinander wie folgt bezeichnet: CH1-Gelenk-CH2-CH3(-CH4). CH4 kommt in IgM
vor, das keine Gelenk-Region aufweist. Die bei der Ausführung der
Erfindung nützliche
konstante Region der schweren Immunglobulinkette enthält vorzugsweise
eine Gelenk-Region des Immunglobulins und umfasst vorzugsweise auch
eine CH3-Domäne.
Die konstante Region der schweren Immunglobulinkette enthält am meisten
bevorzugt eine Gelenk-Region des Immunglobulins, eine CH2-Domäne und eine
CH3-Domäne.
Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Gelenk-Region" des Immunglobulins
so zu verstehen, dass eine vollständige Gelenk-Region eines Immunglobulins
oder zumindest ein Teil der Gelenk-Region eines Immunglobulins gemeint
ist, der ausreicht, um eine oder mehrere Disulfidbindungen mit einer
zweiten Gelenk-Region von Immunglobulin zu bilden.
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Es
wird in Betracht gezogen, dass geeignete konstante Regionen der
schweren Immunglobulinkette von Antikörpern abgeleitet werden können, die
einer beliebigen der fünf
Immunglobulinklassen angehören,
die mit IgA, IgD, IgE, IgG und IgM bezeichnet werden, jedoch sind
konstante Regionen der schweren Immunglobulinkette der IgG-Klasse
bevorzugt. Darüber
hinaus wird in Betracht gezogen, dass konstante Regionen der schweren
Immunglobulinkette von einer beliebigen der IgG-Antikörper-Unterklassen
abgeleitet werden können,
die im Fachgebiet mit IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 bezeichnet werden.
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Konstante
Regionsdomänen
der schweren Immunglobulinkette haben eine Kreuzhomologie unter
den Immunglobulinklassen. Zum Beispiel ist die CH2-Domäne von IgG
homolog zur CH2-Domäne
von IgA und IgD, und zur CH3-Domäne
von IgM und IgE. Bevorzugte konstante Regionen der schweren Immunglobulinkette umfassen
Proteindomänen,
die einer CH2-Region und einer CH3-Region von IgG oder funktionalen
Teilen oder Derivaten davon entsprechen. Den konstanten Regionen
der schweren Immunglobulinkette fehlt jedoch vorzugsweise mindestens
die CH1-Domäne.
Darüber
hinaus fehlt den Fc-Antigen- oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen eine variable
Region von Immunglobulin. In einer bevorzugteren Ausführungsform
enthält
die konstante Region der schweren Immunglobulinkette, in einer N- nach C-terminalen
Richtung, eine Gelenk-Region des Immunglobulins, eine CH2-Domäne und eine
CH3-Domäne,
die alle auf Sequenzen aus einem IgG-Molekül beruhen. Die Wahl von geeigneten
konstanten Regionen der schweren Immunglobulinkette wird im Detail in
den
US-Patenten Nr. 5,541,087 und
5,726,044 diskutiert. Die
Wahl von bestimmten Sequenzen für
die konstante Region der schweren Immunglobulinkette von bestimmten
Immunglobulinklassen und -unterklassen, um ein bestimmtes Ergebnis
zu erzielen, gilt als innerhalb des Niveaus eines Fachmanns liegend.
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Es
kann, unter bestimmten Umständen,
von Nutzen sein, die konstante Region der schweren Immunglobulinkette
zu modifizieren, zum Beispiel durch Mutation, Deletion oder andere
Veränderungen,
die durch Gentechnik oder andere Vorgehensweisen vermittelt werden,
so dass bestimmte Aktivitäten,
wie z. B. Komplementfixierung oder die Stimulierung der antikörperabhängigen,
zellvermittelten Cytotoxizität
(ADCC) vermindert oder beseitigt werden. Es wird jedoch als notwendig
erachtet, dass die Fähigkeit
der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette, an Fc-Rezeptor
zu binden, aufrecht erhalten wird.
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Bei
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung ist die konstante Regionskomponente der
schweren Immunglobulinkette des Fc-Antigen- oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteins
in dem beabsichtigten Empfänger
vorzugsweise nicht immunogen oder nur schwach immunogen. Die Fc-Region
wird als nicht oder schwach immunogen betrachtet, wenn die konstante
Region der schweren Immunglobulinkette keine nachweisbare Antikörperantwort
erzeugt, die gegen die konstante Region der schweren Immunglobulinkette
gerichtet ist. Demzufolge sollte die konstante Region der schweren
Immunglobulinkette von Immunglobulinen abgeleitet werden oder sollte
auf Aminosäuresequenzen
entsprechend von Immunglobulinen beruhen, die in der gleichen Spezies
wie der beabsichtigte Empfänger
des Fusionsproteins vorkommen. Mit anderen Worten sollten Sequenzen
der humanen konstanten Region der schweren Immunglobulinkette verwendet
werden, wenn das Fc-Fusionskonstrukt (das Fc-Antigen- und/oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein)
einem Menschen verabreicht werden soll. Nucleotide und Aminosäuresequenzen
von humanem Fc-IgG werden, zum Beispiel, in Ellison et al. (1982)
NUCLEIC ACIDS RES. 10:4071-4079 beschrieben. Desgleichen sollten
murine Fc-Sequenzen verwendet werden, wenn die Fc-Fusion Mäusen verabreicht
werden soll. Nucleotide und Aminosäuresequenzen von murinem Fc-IgG2a werden,
zum Beispiel, in Bourgois et al. (1974) EUR. J. BIOCHEM. 43:423-435
beschrieben. Die gleiche Logik würde
angewandt, wenn die Fc-Fusionsproteine anderen Tieren verabreicht
werden sollten, einschließlich Haustieren,
zum Beispiel Katzen und Hunden, sowie Nutztieren, zum Beispiel Kühen und
Pferden.
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Wie
hierin verwendet, ist der Begriff „vorgewähltes Antigen" so zu verstehen,
das ein beliebiges Protein oder Fragment davon, oder Polypeptid
gemeint ist, das, entweder allein oder in Kombination mit anderen Reagenzien,
eine Immunantwort in einem Säugetier
induzieren kann. Es wird in Erwägung
gezogen, das jegliches vorgewählte
Antigen von Interesse in dem erfindungsgemäßen Fc-Antigen-Fusionsprotein
eingeschlossen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das vorgewählte
Antigen ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einem Prostata-spezifischem Membranantigen
(PSMA), einer Ektodomäne
eines Cytokinrezeptors, zum Beispiel einer Ektodomäne des humanen
IL-4-Rezeptors;
einem Tumor-spezifischen Antigen (zum Beispiel einem Antigen, das
hochreguliert ist oder auf andere Weise in einer Tumorzelle in erhöhten Spiegeln
bezogen auf eine normale Zelle vorkommt); und einem viralen Protein,
zum Beispiel einem durch das Genom des humanen Immundefizienz-Virus
(HIV) kodierten Proteins.
-
Wie
hierin verwendet, ist der Begriff „Hilfsstoff" so zu verstehen,
das jegliche Substanz gemeint ist, die als ein Immunmodulator wirken
kann, indem sie, zum Beispiel, eine Immunantwort (entweder humoral
oder zellulär)
gegenüber
dem vorgewählten
Antigen verstärken
kann. Wie hierin verwendet, ist der Begriff „humorale" Immunität so zu verstehen, dass eine
Immunität
gemeint ist, die durch in Körperflüssigkeiten,
zum Beispiel Plasma oder Lymphe, verteilten Antikörper vermittelt
wird, während
der Begriff „zelluläre" Immunität, der auf dem
Fachgebiet auch als „zell-vermittelte
Immunität" bezeichnet wird,
so zu verstehen ist, dass immunologische Reaktionen gemeint sind,
die durch T-Lymphozyten initiiert und durch Effektor-T-Lymphozyten
und/oder Makrophagen vermittelt werden.
-
Wie
bereits früher
diskutiert, kann eine Vielzahl an chemischen Hilfsstoffen, z. B.
vollständiges
Freundsches Adjuvans, bei der Immunisierung von nicht-menschlichen
Säugetieren
von Nutzen sein. Obwohl es bei Tieren weit verbreitet verwendet
wird, um hohe Antikörpertiter
oder deutliche cytotoxische T-Lymphozyt-(CTL-)Antworten zu erzeugen,
machen seine Nebenwirkungen, zum Beispiel Gewebevernarbung, es für Verwendung
beim Menschen ungeeignet. Daher besteht ein Bedarf, starke Immunantworten
ohne die begleitende Entzündung
an der Injektionsstelle zu induzieren. Ein deutlicher Vorteil der
Verwendung von erfindungsgemäßen Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen
ist die Fähigkeit,
eine starke Immunantwort ohne die Notwendigkeit von chemischen Hilfsstoffen
wie dem Freundschen Adjuvans hervorzurufen.
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Bevorzugte
Hilfsstoffe, die bei der Ausführung
der Erfindung von Nutzen sind, umfassen ein Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein
oder eine dieses kodierende Nucleinsäure. Bevorzugte Hilfsproteine
für den
Einbau in die Fc-Fusionsproteine umfassen Cytokine. Wie hierin verwendet,
ist der Begriff „Cytokin" so zu verstehen,
dass jegliches Protein oder Peptidanalogon oder funktionales Fragment
davon gemeint ist, das die Aktivität der Immunzellen, zum Beispiel:
T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Basophile,
dendritische Zellen und deren Vorläufer in einem Säugetier
modulieren kann. Bevorzugte Cytokine umfassen, zum Beispiel, IFN-γ, IL-2, IL-4,
IL-12, IL-18, TNF und GMCSF. Die extrazelluläre Domäne des CD40-Liganden ist ebenfalls ein
bevorzugtes Protein für
die Fusion an Fc zur Bildung eines Fc-Hilfsstoffs. Wenn es mit Fc-Hilfsstoff
verabreicht wird, kann das Antigen in dem Fc-Antigen-Fusionsprotein
eine Immunantwort hervorrufen, die stärker ist als wenn das Fc-Antigen-Fusionsprotein
ohne das Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein verabreicht wird. In einigen
Fällen
ist der Antikörperspiegel,
der nach nur zwei Immunisierungen von Fc-Antigen mit Fc-Hilfsstoff erreicht
wird, genauso hoch oder höher
als der, der mit Freundschem Adjuvans erreicht wird, und zwar ohne
nachweisbare Hautreaktionen.
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Wie
auch bei den konstanten Regionen der schweren Immunglobulinkette
des Fc-Antigen- oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteins
ist das Hilfsstoffprotein in dem beabsichtigten Empfänger vorzugsweise
nicht oder nur schwach immunogen. Dies kann erreicht werden, indem
in die Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine Cytokine, die durch Aminosäuresequenzen
definiert werden, die den aus den gleichen Spezies wie dem beabsichtigen Empfänger isolierbaren
Cytokinen entsprechen, eingebaut werden. Zum Beispiel ist, wenn
das Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein einem Menschen verabreicht werden
soll, das Hilfsprotein (zum Beispiel Cytokin) vorzugsweise humanen
Ursprungs.
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Die
Co-Verabreichung der Fc-Antigen- und Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine,
entweder gleichzeitig oder nacheinander, kann verwendet werden,
um die Art der Immunantwort, die gegen das vorgewählte Antigen
stimuliert wird, zu modulieren. Es werden zwei Klassen von Immunantworten,
bezeichnet mit Th1 und Th2, als Reaktion auf unterschiedliche Infektionsarten
stimuliert und umfassen unterschiedliche Cytokine. Th1-vermittelte
Immunantworten sind von ihrer Art typischerweise zellulär, während Th2-vermittelte
Immunantworten typischerweise von ihrer Art humoral sind. Demzufolge
kann eine Th1-Antwort beim Angriff von veränderten Zellen, wie z. B. Tumorzellen
oder virus-infizierte Zellen, von Nutzen sein, während eine Th2-Antwort beim
Angriff auf extrazelluläre
Erreger wie z. B. Parasiten von Nutzen sein kann. Oftmals ist die
Verabreichung von Cytokinen, die an die konstanten Regionen der
schweren Immunglobulinkette fusioniert sind, von Nutzen, um entweder
eine allgemeine Immunantwort zu stimulieren, oder um spezifische
Th1- oder Th2-Antworten zu initiieren oder zu modulieren.
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Darüber hinaus
kann die Wahl eines bestimmten Cytokins, das in einem Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein vorkommt,
die Antikörperklasse
beeinflusst, die gegen das vorgewählte Antigen des Fc-Antigen-Fusionsprotein
produziert wird. Zum Beispiel stimuliert Fc-IL12 eine T-Helferzell-Antwort
durch Stimulierung der Produktion von was als Th1-Cytokine bekannt
ist, zum Beispiel IFN-γ,
IL-2 und TNF, die wirksame zelluläre Immunität sowie die Produktion der
IgG2a-Antikörperklasse
fördern.
Umgekehrt stimuliert Fc-IL-4 die Produktion von Th2-Cytokinen, zum
Beispiel, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-4, die humorale Immunität fördern.
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Wie
vorher diskutiert, umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen das Fc-Antigen-Fusionsprotein
in Kombination mit einem Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein. Durch Verwendung
von zwei Fusionsproteinen, von denen jedes eine konstante Region
der schweren Immunglobulinkette enthält, ist es möglich, sowohl das
vorgewählte
Antigen als auch das Hilfsprotein (zum Beispiel ein Cytokin) an
gleichen oder ähnlichen
Zellarten in dem Säugetier
zu co-lokalisieren. Zum Beispiel exprimieren Makrophagen, B-Zellen,
Granulozyten und dendritische Zellen Fc-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche. Demzufolge
ist es durch gleichzeitige Verabreichung von Fc-Antigen- und Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen,
die Fc-Rezeptoren binden können,
möglich,
das Antigen des Antigen-Fusionsproteins und den Hilfsstoff des Hilfsstoff-Fusionsproteins
am gleichen Zellkompartiment der APCs zu co-lokalisieren. Der Hilfsstoff kann dann
die Immunantwort in der Nachbarschaft des vorgewählten Antigens verstärken oder
auf andere Weise modulieren.
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Kombinationen
aus Fc-Cytokinen können
auch auf eine synergistische Weise verwendet werden, um eine allgemeine
Antwort zu stimulieren und dann zu beeinflussen, ob eine zelluläre (Th1)
oder humorale (Th2) Antwort auftritt. Zum Beispiel ist Fc-GMCSF
ein wirksames allgemeines Stimulans von Immunantworten. Um die Antwort
jedoch weiter in Richtung zellulärerer
oder Th1-vermittelteter Immunität
zu modulieren, kann ein Fc-IL12 oder Fc-IFNγ-Hilfsprotein, zum Beispiel,
gemeinsam mit Fc-GMCSF verabreicht werden. Um eine mehr humorale
oder Th2-vermittelte Antwort zu fördern, kann ein Fc-IL4-Hilfsprotein,
zum Beispiel, gemeinsam mit Fc-GMCSF verabreicht werden, um die
Antwort in Richtung der Erzeugung von Th2-Zellen zu modulieren.
Andere Th1- oder Th2-fördernde
Cytokine, die als Fusionen an Fc verwendet werden, können auch
in Abhängigkeit
von der genauen Art der gewünschten
physiologischen Reaktion eingesetzt werden. Es wird in Erwägung gezogen,
dass diese allgemeinen Vorgehensweise auch verwendet werden kann,
um bestehende pathogene Reaktionen wie z. B. Autoimmunität (eine
Th1-vermittelte Erkrankung) und Allergie (eine Th2-vermittelte Erkrankung)
durch Verschieben der Antwort in Richtung eines bestimmten Antigens
und weg von einer schädlichen
Antwort zu modulieren, indem für
eine neue Antwort des entgegengesetzten Th-Typs immunisiert wird.
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Unter
bestimmten Umständen,
wenn ein Tier mit einem Fc-Antigen-Fusionsprotein immunisiert wird, ist
es nützlich,
Nucleinsäuren
als Hilfsstoffe zu verwenden. Nucleinsäuren, zum Beispiel Oligonucleotide,
die eine Sequenz enthalten, die mit Cytosin-Phosphatdiester verknüpftem Guanosin
(CpG) angereichert ist, können
eine Immunantwort in Richtung einer Th1-Antwort beeinflussen und
können
gegebenenfalls in Kombination mit anderen Hilfsstoffen wie z. B.
Cytokinen verwendet werden (siehe, zum Beispiel, Brazolot et al.
(1998) PROC NATL ACAD SCI U. S. A. 95:15553-8; Liu et al. (1998)
BLOOD 92:3730-6; und Klinman et al. (1997) IMMUNOL. 158:3635-3639).
Demzufolge wird in Erwägung
gezogen, dass Oligonucleotide, die CpG enthalten, mit einem Fc-Antigen-Fusionsprotein
gemeinsam verabreicht werden können,
um eine verstärkte
und auf geeignete Weise modulierte Immunantwort zu erreichen. Derartige
Nucleinsäuremoleküle können eine
beliebige Länge
aufweisen, jedoch sind Nucleotide mit einer Länge von mehr als 8 Nucleotiden
bevorzugt. Die Nucleinsäuresequenzen
enthalten vorzugsweise die Sequenz CpG und mehr bevorzugt die Sequenz
Purin-Purin-C-G-Pyrimidin-Pyrimidin, in denen Cytosine im zentralen
CpG unmethyliert sind. Die Frequenz der CpG-Dinucleotide in der
Hilfsstoff-DNA beträgt
vorzugsweise mindestens etwa 5% und mehr bevorzugt etwa 10%. Zum
Beispiel kann eine doppelsträngige
Form des Oligodesoxynucleotids TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO:
22) als ein Hilfsstoff verwendet werden. In Abhängigkeit von der Art der gesuchten
Immunantwort kann es von Nutzen sein, die Nucleinsäure mit
Alum zu kombinieren.
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Die
vorliegende Erfindung nutzt herkömmliche
DNA-Rekombinationsmethoden zur Erzeugung von Fc-Fusionsproteinen,
die für
die Ausführung
der Erfindung von Nutzen sind. Die Fc-Fusionskonstrukte werden vorzugsweise
auf dem DNA-Niveau erzeugt und die resultierenden DNAs werden in
Expressionsvektoren integriert und exprimiert, um das erfindungsgemäße Fc-Antigen-
oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein zu produzieren. Wie hierin verwendet,
ist der Begriff „Vektor" so zu verstehen,
dass eine beliebige Nucleinsäure
gemein ist, die eine Nucleotidsequenz enthält, die für den Einbau in eine Wirtszelle
und die Rekombination mit dem Wirtszellgenom und Integration darin
kompetent ist, oder autonom als ein Episom replizieren kann. Derartige Vektoren
umfassen lineare Nucleinsäuren,
Plasmide, Phagemide, Cosmide, RNA-Vektoren, virale Vektoren und
dergleichen. Nichteinschränkende
Beispiele für
einen viralen Vektor umfassen einen Retrovirus, einen Adenovirus
und einen adenassoziierten Virus. Wie hierin verwendet, ist der
Begriff „Genexpression" oder „Expression" eines Fc-Fusionsproteins
so zu verstehen, dass die Transkription einer DNA-Sequenz, Translation des
mRNA-Transkripts und Sekretion eines Fc-Fusionsproteinprodukts gemeint
ist. Fc-Fusionsproteine, die jeweils IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2,
bIG-H3, IgE-Rezeptor,
PSMA oder gp120 enthalten, wurden unter Verwendung von Expressionssystemen vom
hier diskutierten Typ exprimiert. Die gleichen oder ähnliche
Expressionskonstrukte werden in den
U.S.
Patenten Nr. 5,541,087 und
5,726,044 beschrieben.
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Als
eine Alternative zur Fusion von Proteinen mittels gentechnischer
Verfahren kann chemische Konjugation unter Verwendung von herkömmlichen
chemischen Vernetzungsmitteln verwendet werden, um Proteineinheiten
zu fusionieren.
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Grundlegende
Vektoren, die für
die Ausführung
der Erfindung von Nutzen sind, umfassen einen selektierbaren Marker,
zum Beispiel ein für
Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodierendes Gen, das durch transkriptionelle
regulatorische Sequenzen gesteuert wird, die, zum Beispiel, vom
SV40-Virus abstammen, und bakterielle Plasmidsequenzen für Selektion
und Aufrechterhaltung des Plasmids in E. coli. Expression der Fc-Fusionsproteinsequenzen
werden durch Promotor- und gegebenenfalls Enhancer-Sequenzen, zum
Beispiel der Promotor- und Enhancer-Sequenzen vom Cytomegalovirus
(CMV) angetrieben.
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Wenn
das Fc-Fusionsprotein Menschen verabreicht werden soll, beginnen
die für
das Fc-Fusionsprotein
kodierenden Sequenzen vorzugsweise in einer 5'- nach 3'-Richtung mit einer „Leadersequenz", die zum Beispiel
von einer leichten Antikörperkette
(L) abstammt, die mit mindestens einem Teil einer schweren Immunglobulinkette
oder einer mutierten Form davon im Rahmen fusioniert ist, vorzugsweise
von der Fcy1-Region des humanen Immunglobulin g1-Gens. Die Fcy1-Region
des Immunglobulin Fcy1-Gens umfasst vorzugsweise mindestens einen
Teil der Gelenk-Domäne
und eine CH3-Domäne
und mehr bevorzugt umfasst sie mindestens eine Gelenk-Domäne, eine
CH2-Domäne
und eine CH3-Domäne.
Wenn das Fc-Fusionsprotein
Mäusen verabreicht
werden soll, umfassen bevorzugte Nucleinsäuresequenzen, die für die konstante
Region der schweren Immunglobulinkette kodieren, eine Nucleinsäuresequenz,
die in einer 5'-
nach 3'-Richtung
für eine Gelenk-Region,
eine CH2-Domäne und eine
CH3-Domäne
aus einem IgG2a-Antikörper
der Maus kodiert. Der Carboxylterminus der konstanten Region der
schweren Immunglobulinkette wird, sofern erforderlich, auf Nucleinsäure-Niveau
für Ligation,
im Rahmen, mit Sequenzen modifiziert, die entweder für das vorgewählte Antigen
(im Falle von Fc-Antigen) oder einem immunstimulierenden Cytokin
(im Falle eines Fc-Hilfsstoff Cytokins) kodiert. DNA, die für die Sekretionskassette
kodiert, kann in ihrer genomischen Konfiguration oder in ihrer cDNA- Konfiguration vorliegen.
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Der
Teil der DNA, der für
die Signalsequenz kodiert, kodiert vorzugsweise für ein Peptidsegment,
das die Sekretion des Fc-Fusionsproteins steuert und anschließend vom
Rest des Fc-Fusionsproteins
abgespalten wird. Die erfindungsgemäße Signalsequenz ist ein Polynucleotid,
das für
eine Aminosäuresequenz
kodiert, die den Transport eines Proteins durch die Membran des
endoplasmatischen Retikulums initiiert. Signalsequenzen, die in
der Erfindung von Nutzen sind, umfassen Signalsequenzen der leichten
Antikörperkette,
z. B. Antikörper
14.18 (Gillies et al. (1989) J. OF IMMUNO. METH., 125:191), Signalsequenzen
der schweren Antikörperkette,
z. B. die Signalsequenz der schweren Kette des MOPC141-Antikörpers (Sakano
et al. (1980) NATURE 286:5774), und beliebige andere Signalsequenzen,
die im Fachgebiet bekannt sind (siehe, zum Beispiel, Watson (1984)
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12:5145).
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Signalsequenzen
wurden im Fachgebiet gut charakterisiert und es ist bekannt, dass
sie typischerweise 16 bis 30 Aminosäurereste enthalten und mehr
oder weniger Aminosäurereste
enthalten können.
Ein typisches Signalpeptid besteht aus drei Regionen, einer basischen
N-terminalen Region,
einer zentralen hydrophoben Region und einer polareren C-terminalen
Region. Die zentrale hydrophobe Region enthält 4 bis 12 hydrophobe Reste,
die das Signalpeptid während
des Transport des naszierenden Polypeptids durch die Lipiddoppelschicht
der Membran verankern. Im Anschluss an die Initiierung wird das
Signalpeptid gewöhnlich
innerhalb des Lumens des endoplasmatischen Retikulums durch zelluläre Enzyme,
die als Signalpeptidasen bekannt sind, abgespalten. Mögliche Spaltungsstellen
des Signalpeptids folgen im Allgemeinen der „(–3, –1)-Regel". So hat ein typisches Signalpeptid
kleine, neutrale Aminosäurereste
in den Positionen –1
und –3
und es fehlen Prolinreste in dieser Region. Die Signalpeptidase
wird ein derartiges Signalpeptid zwischen den Aminosäuren –1 und +1
spalten. So kann die Signalsequenz während der Sekretion vom Amino-Terminus
des Fusionsproteins abgespalten werden. Dies führt zu der Sekretion eines
Fc-Fusionsproteins. Signalpeptidsequenzen, die für die Ausführung der Erfindung von Nutzen
sind, sind im Fachgebiet wohlbekannt. Siehe, zum Beispiel, von Heijne
(1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14:4683.
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Wie
einem Fachmann offensichtlich wäre,
kann die Eignung einer bestimmten Signalsequenz für die Verwendung
in der Sekretionskassette einige Routineexperimente erfordern. Derartige
Experimente können die
Bestimmung der Fähigkeit
der Signalsequenz, die Sekretion eines Fc-Fusionsproteins zu steuern, und/oder
die Bestimmung einer optimalen Konfiguration, genomisch oder cDNA,
der zu verwendenden Sequenz umfassen, um eine effiziente Sekretion
von Fc-Fusionsproteinen zu erreichen. Zusätzlich ist ein Fachmann in
der Lage, ein synthetisches Signalpeptid zu erschaffen, indem er
den von von Heijne vorgestellten Regeln folgt, die oben zitiert
wurden, und auf die Effizienz einer derartigen synthetischen Signalsequenz
mittels Routineexperimenten testet. Die Begriffe „Signalsequenz", „Signalpeptid", „Leadersequenz" oder „Leaderpeptide" werden hierin austauschbar
verwendet.
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Es
wird in Betracht gezogen, dass eine Anzahl an unterschiedlichen
Ausführungen
der Verabreichung der Fc-Fusionsproteine verwendet werden kann,
um einen Empfänger
gegen ein vorgewähltes
Antigen zu immunisieren. Es können
zwei unterschiedliche Anwendungen der vorliegenden Offenbarung verwendet
werden, um CTL-Antworten zu erzeugen, wobei eine auf der Injektion
von für
ein Fc-Antigen-Fusionsprotein kodierender DNA beruht und eine zweite
auf der Verabreichung des Fc-Antigen-Fusionsproteins beruht, das
ein Protein dem MHC-Klasse-I-Weg zuführen kann.
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Die
Injektion der Proteinantigene wird typischerweise verwendet, um
in Säugetieren
Immunantworten hervorzurufen. Verfahren, Antigen den APCs durch
DNA-Injektion zuzuführen,
können
ebenfalls verwendet werden. Eine allgemein angewandte Technik ist,
DNA-Expressionsvektoren,
die für
ein antigenes Protein kodieren, in Muskel zu injizieren. Berichte
deuten darauf hin, dass das Proteinantigen durch Muskelzellen exprimiert
wird, aber dass das Antigen durch diese Zellen nicht dem Immunsystem
präsentiert
wird. Stattdessen nimmt man an, dass spezialisierte APCs, zum Beispiel
Makrophagen und dendritische Zellen, an die Injektionsstelle wandern,
das Antigen aufnehmen und durch einen bisher noch nicht aufgeklärten Prozess
präsentieren.
Die Verwendung von Fc-Antigen-Fusionsprotein-Expressionsvektoren
macht diesen Prozess effizienter, da das sezernierte Fusionsprotein
effizienter als natives Antigenprotein an APCs bindet.
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Eine
Folge der DNA-Injektionsvorgehensweise ist, dass sie oftmals zur
Erzeugung von sowohl humoralen als auch zellulären Antworten führen kann.
Typischerweise haben es exogen verabreichte Proteine schwerer, auf
den Weg zur Präsentation
auf MHC-Klasse-I-Molekülen zu gelangen.
Dennoch verstärkt
die Verabreichung der erfindungsgemäßen Fc-Fusionsproteine die Erzeugung von cytotoxischen
Zellen, vermutlich durch MHC-Klasse-I-Präsentation
des vorgewählten
exogenen Antigens. Kombinationen von DNA-Immunisierung und Proteinimmunisierung
können
ebenfalls synergistisch arbeiten, um zunächst das Immunsystem zu aktivieren
und dann den Antwortspiegel in der Form von sowohl Antikörperproduktion
wie auch cytotoxischen zellulären
Antworten zu verstärken.
Die Co-Verabreichung von Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein, zum Beispiel Fc-IL-2,
Fc-28-GMCSF, Fc-IL-12 und Fc-F1t3-Ligand, zusammen mit dem Fc-Antigen-Fusionsprotein
gewährleistet
die Co-Lokalisierung
der Fusionsproteine am gleichen Zellkompartiment der APCs, wodurch
eine wirksamere Immunantwort gegen das vorgewählte Antigen stimuliert wird.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (d. h. Fc-Antigen-
und/oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein)
können
einem Tier mittels jeglichem geeigneten Mittel gegeben werden, direkt
(z. B. lokal wie durch Injektion, Implantation oder topische Verabreichung
auf einen Gewebeort) oder systemisch (z. B. parenteral oder oral).
Wenn die Zusammensetzung parenteral gegeben werden soll, wie z.
B. durch intravenöse, subkutane,
ophthalmische, intraperitoneale, intramuskuläre, buccale, rektale, vaginale,
intraorbitale, transdermale, intrazerebrale, intrakranielle, intraspinale,
intraventrikuläre,
intrathekale, intrazisternale, intrakapsuläre, intranasale Verabreichung
oder über
Aerosol, enthält
die Zusammensetzung vorzugsweise Teile einer wässrigen oder physiologisch
verträglichen
Flüssigsuspension
oder Lösung.
So ist der Träger
oder das Vehikel physiologisch unbedenklich, so dass dieser zusätzlich zur
Lieferung der gewünschten
Zusammensetzung an den Patienten keine ansonsten gegensätzliche
Wirkung auf das Elektrolyt- und/oder Volumengleichgewicht des Patient
hat. Das flüssige
Medium für
das Mittel kann so normale physiologische Kochsalzlösung enthalten
(z. B., 9,85%ige wässrige
NaCl, 0,15M, pH 7-7,4).
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Bevorzugte
Dosierungen des Fc-Antigen-Fusionsproteins pro Verabreichung liegen
in dem Bereich von 50 ng/m2 bis 1 g/m2, mehr bevorzugt 5 μg/m2 bis
200 mg/m2 und am meisten bevorzugt 0,1 mg/m2 bis 50 mg/m2. Bevorzugte
Dosierungen des Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteins pro Verabreichung
liegen in dem Bereich von 1 ng/m2 bis 0,1
g/m2, mehr bevorzugt 0,5 μg/m2 bis 20 mg/m2 und
am meisten bevorzugt 10 μg/m2 bis 5 mg/m2. Bevorzugte
Dosierungen der für
die Fc-Antigen- oder Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine kodierenden Nucleinsäuren pro
Verabreichung liegen in dem Bereich von 1 μg/m2 bis
100 g/m2, mehr bevorzugt 20 μg/m2 bis 10 mg/m2 und
am meisten bevorzugt 400 μg/m2 bis 4 mg/m2.
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Es
wird in Betracht gezogen, dass eine maximale Immunisierung durch
Ausführen
zahlreicher einzelner Immunisierungen, zum Beispiel eine bis drei
Inokulationen im Abstand von etwa 3 Wochen bis sechs Monaten erreicht
werden kann. Darüber
hinaus können,
wie oben diskutiert, maximale Immunantworten unter bestimmten Umständen durch
Alternieren zwischen der Verabreichung von Fc-Fusionsproteinen und
für solche Fc-Fusionsproteine
kodierende Nucleinsäuren
erreicht werden. Es wird in Erwägung
gezogen, dass das Fc-Antigen-Fusionsprotein
vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteins oder
der für
das Fc-Hilfsstoff-Fusionsprotein kodierenden Nucleinsäure an das
Säugetier
verabreicht werden kann. Es ist jedoch zu erwägen, dass die optimalen Arten
der Verabreichung, Dosierungen und Auffrischschemata durch Routineexperimente
ermittelt werden können,
die gut innerhalb des Wissens des Fachgebiets liegen.
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Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden nichteinschränkenden
Beispiele erläutert.
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BEISPIELE
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Beispiel I. Konstruktion von Fc Antigen-
und Fc-Hilfsstoff-Expressionsvektoren
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Um
die Immunisierungskraft der Fc-Fusionsproteine in einem Mausmodel
auf geeignete Weise zu untersuchen, wurden Expressionsvektoren unter
Verwendung von Nucleinsäuresequenzen,
die für
IgG2a-Fc-Regionen der Maus kodieren, konstruiert. Dies vermindert
das Risiko, das die Fc-Region von jedem Fusionsprotein in dem Säugetier
eine Immunantwort induziert. Darüber
hinaus wurden Maus-Cytokine als Fusionspartner für Fc-Hilfsstoff-Fusionskonstrukte
verwendet, da deren biologische Aktivitäten hoch speziesspezifisch
sein können.
Daher wurden Vektoren, über
die früher
berichtet wurde (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 15 11:495-500)
modifiziert (siehe
2), indem die humane
IgG1-Fc-Sequenz
durch Sequenzen aus für IgG2a-Fc
der Maus kodierender cDNA (
U.S.
Patent Nr. 5,726,044 ) ersetzt wurden.
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Die
IgG2a-Fc-Sequenz der Maus wurde aus einer Maus-Milzzellen-Bibliothek
mittels Amplifizierung durch Polymerasekettenreaktion (PCR) kloniert.
Die PCR-Primer enthielten Adaptersequenzen für das Anfügen einer Leadersequenz am
5'-Ende und einer
einmal vorhandenen Sma I/Xma I-Restriktionsstelle am 3'-Ende für Ligation
mit Sequenzen, die entweder für
Antigene oder Hilfsstoff-Cytokine kodieren. Die Antigen- und Hilfsstoff-(Cytokin-)Sequenzen
wurden mit einer 5'-Sma
I-Stelle hergestellt und unter Beibehaltung der Leserahmen zwischen
Fc und Antigen- oder Hilfsproteinen und eine einmal vorhandene Xho
I-Stelle wurde direkt hinter das Translationsstoppsignal positioniert.
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Das
resultierende DNA-Konstrukt kodierte für eine Leadersequenz der leichten
Kette, die direkt an die Gelenk-Region der H-Kette des Maus-IgG2a
fusioniert war und sich mit den CH2- und CH3-Exons des Maus-IgG2a
und dem Fusionspartner (entweder dem Antigen oder dem Hilfsstoff
Cytokin) fortsetzte. Transkription wurde durch den CMV-Promotor/Enhancer
angetrieben, der sich als von Nutzen für Expression in den meisten
Zelltypen in Kultur sowie für
die Expression in Muskel- oder anderen Zellarten nach einer DNA-Injektion
in vivo erwies. Ein selektierbares Dihydrofolatreduktase-(DHFR)Markergen
wurde in jeden Vektor eingeschlossen, um die Selektion von stabil
transfizierten Klonen zu erleichtern, und es wurden auch Sequenzen eingeschlossen,
die für
die Aufrechterhaltung der Plasmid-DNA in E. coli notwendig ist.
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Die
folgenden beispielhaften Fc-Antigenkonstrukte wurden durch Einführen von
auf geeignete Weise angepasste Sequenzen zwischen der einmal vorhandenen
Sma I- bis Xho I-Stellen
in den pdCs-muFc bezeichneten Vektor geschaffen, wobei „mu" darauf hindeutet,
dass das Fc aus der Maus stammt:
Die Ektodomäne (der
extrazelluläre
Teil) des humanen IL4-Rezeptors (IL-4R) wurde aus humanen peripheren mononuklearen
Blutzellen (PBMC) mittels PCR-Amplifizierung kloniert. Die verwendeten
Primer waren 5' GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC
(SEQ ID NO: 1) und 5' CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG
(SEQ ID NO: 2), die die Sma I- bzw. Xho I-Stellen für die Insertion
in den pdCs-muFc-Vektor enthielten. Die hierfür und die folgenden Klonierungen
verwendeten PCR-Reaktionsbedingungen, waren wie folgt. Es wurden
Advantage KlenTaq und Polymerase Mix (Clontech, Palo Alto, CA) sowie
spezifische Primer für
die Amplifizierung der/des Gen(s/e) von Interesse verwendet. Die
Reaktionsmischungen enthielten 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 0,01 Gew.-% Gelatine, jeweils
0,2 mM dNTPs und 1,25 Einheiten KlenTaq in einem Gesamtvolumen von
100 ml. Es wurden dreißig
PCR-Zyklen durchgeführt,
wobei jeder Zyklus aus einer Hitzedenaturierung bei 94°C für 1 min,
Hybridisieren bei 42°C
für 45
sec, und Primerverlängerung
bei 72°C
für 1 min
bestand. Das amplifizierte Produkt wurde dann in einen SK-Vektor
(Stratagene, San Diego, CA) subkloniert und seine DNA-Sequenz mittels
standardmäßiger Sequenzierungsmethoden
verifiziert.
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Die
Ektodomäne
des humanen Prostata-spezifischen Membranantigens (PSMA) wurde aus
der Prostatakarzinom-Zelllinie LnCAP (ATCC CRL1740) mittels PCR
unter Verwendung der Primer 5' AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC
(SEQ ID NO: 3) und 5' CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG
(SEQ ID NO: 4), für
den Sense- bzw. Antisensestrang kloniert. Die DNA-Sequenz wurde
verifiziert und das PCR-Fragment in den pdCs-muFc-Vektor insertiert,
um ein pdCs-muFc-PSMA-Fusionskonstrukt herzustellen.
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Die
Ektodomäne
von humanem EpCAM (auch als KS-Antigen bekannt), einem Epithelialzelloberflächenprotein,
das in den meisten Karzinomzellen hochreguliert ist, wurde aus LnCAP-Zellen
mittels PCR unter Verwendung der Primer 5' CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG (SEQ
ID NO: 5) und 5' CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG
(SEQ ID NO: 6) für
den Sense- bzw. den Antisensestrang kloniert. Die DNA-Sequenz wurde
mittels standardmäßiger Sequenzierungsmethoden
verifiziert und das PCR-Fragment in den pdCs-muFc-Vektor insertiert,
um ein pdCs-muFc-EpCAM-Fusionskonstrukt herzustellen. Ein weiterer Vektor
wurde unter Verwendung der EpCAM-Ektodomäne als der N-terminale Fusionspartner
konstruiert, und in diesem Fall umfasste das PCR-Produkt den natürlichen
Leader der EpCAM-cDNA und die reife Ektodomänensequenz zur Grenze der membran-überspannenden
Domäne.
Das 3'-Ende dieses
PCR-Produkts enthielt eine gentechnisch hergestellte Afl II-Stelle
für Ligation
an die 5'-Afl II-Stelle
des murinen Fc-Fragments. Die verwendeten PCR-Primer umfassten 5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC
(SEQ ID NO: 7) und 5' CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG
(SEQ ID NO: 8). In diesem Fall fehlte dem murinen Fc eine 3'-Insertionsstelle
für die
Insertion eines Fusionsproteins, enthielt aber ein Translationsstoppsignal
am Ende der für Fc
kodierenden Sequenz.
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Ein
relativ konservierter Teil der membran-proximalen Region von HIV
gp41, die sich von einer Hind III-Stelle bis zum der membran-überspannenden
Region benachbarten Lysinrest erstreckt, wurde als ein Fc-Fusionsprotein
als ein Beispiel für
eine kurze Polypeptidantigensequenz exprimiert. Obwohl die Proteinsequenz
aus dem HIV-IIIB-Stamm verwendet wurde, wurde die kodierende Sequenz
für eine
optimale Expression durch Eukaryotenzellen unter Verwendung einer
Codonbevorzugung mit hohem GC-Gehalt optimiert. Eine DNA-Sequenz,
die für
die Aminosäurereste
626 bis 669 mit der folgenden Sequenz kodiert: C CCG GGA TCC CTG
ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG
CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC
AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATC AAG TGA CTCGAG (SEQ ID NO: 9),
wurde chemisch synthetisiert und in den pdCs-muFc-Vektor ligiert.
Die Aminosäuresequenz
des fusionierten Polypeptids war:
SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK
(SEQ ID NO: 10).
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Weitere
HIV-Protein kodierende Sequenzen wurden verwendet, um Fc-Antigen-Fusionsproteine
wie früher
beschrieben (
U.S. Patent Nr.
5,541,087 und
5,726,044 )
unter Verwendung eher des Maus-IgG2a-Fc als des originalen humanen
IgG1-Fc konstruiert. Diese Konstrukte stellen weitere Ausführungsformen
der Erfindung dar.
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Eine
Reihe von Fc-Hilfsstoff-(Cytokin-)Fusionsproteinen, die das IgG2a-Fc
der Maus und einige Cytokine der Maus enthalten, wurde auf die gleiche
Weise wie die Fc-Antigen-Fusionsproteine
konstruiert. Die spezifischen Cytokine und die Klonierungsprimer
werden unten diskutiert.
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Maus-IL-2
wurde aus murinen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mittels
PCR unter Verwendung der PCR-Primer (Sense) 5' GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (SEQ
ID NO: 11) und (Antisense) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG
(SEQ ID NO: 12) kloniert.
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Maus-GMCSF
wurde aus murinen PBMCs mittels PCR unter Verwendung der PCR-Primer
(Sense) 5' CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC
(SEQ ID NO: 13) und (Antisense) 5' CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC (SEQ
ID NO: 14) kloniert.
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Maus-F1t3-Ligand
wurde aus murinem Thymus mittels PCR unter Verwendung der PCR-Primer (Sense) 5' CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC
(SEQ ID NO: 15) und (Antisense) 5' CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC (SEQ
ID NO: 16) kloniert.
-
Maus-IL-12p35
wurde aus murinen PBMCs mittels PCR unter Verwendung der PCR-Primer
(Sense) 5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG
(SEQ ID NO: 17) und (Antisense) 5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID
NO: 18) kloniert.
-
Maus-IL12p40
wurde aus murinen PBMCs mittels PCR unter Verwendung der PCR-Primer
(Sense) 5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC
(SEQ ID NO: 19) und (Antisense) 5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO:
20) kloniert.
-
Alle
PCR-Produkte, außer
dem für
Maus-IL-12p40, wurden als Sma I- bis Xho I-Fragmente kloniert, mittels
standardmäßiger DNA-Sequenzierungsmethoden
analysiert und in den pdCs-muFc-Vektor,
der murines Fc von IgG2a als seine Fc-Region enthält, ligiert.
Das Maus-IL-12p40-PCR-Produkt
wurde separat exprimiert (nicht als ein Fc-Fusionsprotein) in einem
Vektor, der den gleichen CMV-Promotor-Enhancer, eine Leadersequenz
der leichten Kette, die direkt an die reife p40-Unterheit der Maus-IL-12
fusioniert ist, und ein Neomycinresistzenzgen an Stelle des DHFR-selektiebaren
Markergens in dem pdCs-muFc-Vektor enthielt. Der resultierende Vektor
wurde pNC-mp40 genannt, wobei „N" ein Neomycin-Selektionsgen bezeichnet.
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Alle
Plasmidkonstrukte induzierten Synthese und Sekretion der spezifischen
Fusionsproteine durch transiente Expression in humanen Nieren-293-Zellen.
Kurz gesagt, wurden Plasmide in humane Monolager-Nieren-293-Zellen
mittels Co-Fällung
mit Calciumphosphat eingeführt
(Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING – A LABORATORY MANUAL, Cold Spring
Harbor, N. Y.). Die Zellen wurden über Nacht (16 h) stehen gelassen,
mit PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium gefüttert (DMEM,
enthaltend 10% fötales
Rinderserum (FBS)).
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Nach
weiteren 2-3 Tagen wurde das Kulturmedium auf sezernierte Fusionsproteine
mittels eines Fc-spezifischen ELISA (Gillies et al. (1989) J. IMMUNOL.
METHODS 125:191) unter Verwendung von für Maus-IgG-Fc-Protein spezifischen
Antikörpern
untersucht. Im Falle von Maus-Fc-IL12, wurden sowohl Fc-p35- als
auch p40-Expressionsplasmid-DNAs in der gleichen Zellkultur transient
exprimiert, so dass das heterodimere Cytokin-Fusionsprotein sich
vor Sekretion aus der Zelle anordnete (Gillies et al. (1998) J.
IMMUNOL. 160:6195).
-
Anschließend wurden
stabil transfizierte Zellen, die die verschiedenen Fc-Fusionsproteine
exprimieren, mittels Einführung
von linearisierter DNA in Maus-NS/0-Myelomzellen mittels standardmäßiger Elektroporationstechniken
erzeugt. Kurz gesagt, wurden Zellen in einer Gene Pulser Küvette (BioRad)
mit 10 Zellen/ml und 0,5 ml der Suspension mit 10 μg der DNA
vermischt und die Mischung wurde für 10 Minuten auf Eis gekühlt. Elektroporation
wurde unter Verwendung eines Gene Pulser (BioRad) mit Einstellungen
bei 0,25 V und 500 μF
ausgeführt.
Die Zellen durften sich 10 Minuten auf Eis erholen, dann wurden
sie in Wachstumsmedium resuspendiert und auf 96-Well-Platten ausplattiert.
Die Zellen wurden alle 2-3 Tage, beginnend 2 Tage nach der Elektroporation,
mit 0,1 μM
Methotrexat enthaltendem Selektionsmedium gefüttert. Wirkstoff-resistente
Kolonien, die auf den 96-Well-Platten
wuchsen, wurden durch das Fc-ELISA-Protokoll auf Expression untersucht.
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Für Expression
des Maus-Fc-IL12-Fusionsproteins wurde eine transfizierte Zelllinie
von NS/0, die bereits die p40-Untereinheit der Maus-IL-12 exprimiert,
wie oben beschrieben mit dem Maus-Fc-p35-Unterheitsexpressionsvektor
transfiziert. Die p40 exprimierende Linie wurde mittels Elektroporation
von NS/0-Zellen mit dem pNC-mp40-Vektor, wie oben beschrieben, und
Selektion in das Neomycin-Analogon G418 (Life Sciences Technologies)
enthaltendem Medium erhalten. Nach der zweiten Transfektion wurden überlebende
Zellklone mittels eines Fc-ELISAs und eines Maus-IL-12-ELISA (Genzyme,
Cambridge, MA) gescreent.
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Die
strukturelle Integrität
der resultierenden Fusionsproteine wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) untersucht. Zunächst
wurden die Fusionsproteine an ein kleines Volumen (10-20 μl pro ml
Medium) Protein A Sepharose (Repligen, Needham, MA) gebunden. Das
gebundene Material wurde mit Tween-20 (0,01%) enthaltender PBS gewaschen,
dann in SDS enthaltendem Gelpuffer eluiert und anschließend für 2 Minuten
in der Gegenwart von 5% 2-Mercaptoethanol gekocht. Die reduzierten
Proteine wurden auf vorgegossenen SDS-PAGE-Gelen getrennt und mit
Coomassie-Blau gefärbt.
Reinigungen in großem Maßstab aus
stabilen Zellklonen wurden unter Verwendung von Protein A Sepharose-Säulen (Repligen,
Needham, MA) gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
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Beispiel 2. Immunisierungskraft eines
Fc Antigens und die Wirkung von chemischen oder Fc-Cytokin-Hilfsstoffen
auf die Antikörperproduktion
-
Das
in Beispiel 1 hergestellte Maus-Fc-huIL-4R-alpha-Untereinheitskonstrukt
wurde als ein Antigen verwendet, um die mögliche APC-ansteuernde Wirkung
dieser Proteine in einem Tiermodell zu untersuchen. Die Ektodomäne der IL-4R-alpha-Untereinheit
stellt ein recht konserviertes Molekül zwischen Spezies dar, das eine
mehr als 50%ige Sequenzidentität
zwischen Menschen und Mäusen
aufweist.
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Gruppen
von Mäusen
wurden subkutan 50 μg
des Fc-Antigen-Fusionsproteins (Fc-IL-4R) in entweder PBS oder emulgiert
in vollständigem
Freundschen Adjuvans (CFA) injiziert. Einige Gruppen erhielten auch eine
Dosis von 5 μg
(vermischt mit dem Fc-IL-4R) eines Fc-Hilfsproteins von entweder
Fc-IL2 oder Fc-GMCSF. Zwei Wochen später wurde den Mäusen die
gleiche Mischung injiziert, aber die Verabreichung erfolgt in die Peritonialhöhle. Die
CFA-Formulierung
erzeugt Mizellen, die dazu dienen, eine Quelle eines langsam freigesetzten
Antigens zu bilden, was eine kontinuierliche Stimulierung des Immunsystems
ermöglicht.
Mykobakterielle Proteine in dem CFA induzieren auch eine starke
entzündliche
Reaktion durch Cytokinstimulierung, wodurch eine Immunantwort weiter
verstärkt
wird. CFA verursacht jedoch schwere Nebenwirkungen, einschließlich Hautschäden, was
es für
Menschen unbrauchbar macht. Die Mischungen mit den Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen
in PBS schienen jedoch keinerlei sichtbare Hautreaktion oder keinerlei
andere offensichtliche Zeichen für Toxizität in irgendeinem
der Tiere hervorzurufen.
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Zwei
Wochen nach der Auffrischung (d. h. Tag 28 nach der ersten Injektion)
wurde den Tieren Blut abgenommen und Seren hergestellt, indem man
Vollblut in Microfuge-Röhrchen
gerinnen ließ,
Zellen und geronnenes Material mit hoher Geschwindigkeit von 12000
U/min für
5 Minuten auszentrifugierte und den Überstand gewann. Die resultierenden
Seren wurden mit Assaypuffer (PBS, enthaltend 0,01% Tween-20) verdünnt und auf
Antikörper
untersucht, die auf humanes IL-4R reagieren. Ein Antigen-spezifisches
ELISA wurde unter Verwendung von 96-Well-Platten durchgeführt, die
mit humanem Fc-huIL-4R beschichtet waren (100 μl von 5 μg/ml in PBS wurden zu jedem
Well gegeben und bei 4°C
(über Nacht)
inkubiert. Die mit Antigen beschichteten Platten wurden dann gewaschen
und vor der Verwendung mit Blockierungspuffer blockiert (1% BSA,
0,01% Tween-20 in PBS). Verdünnungen
der Testseren wurden in den Wells für 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert, und dann wurden die Wells achtmal mit Assaypuffer gewaschen.
Sekundärer
Fc-spezifischer, mit Meerrettichperoxidase konjugierter Antikörper der
Maus (1:2000 Verdünnung,
Jackson Immuno-Research) wurde
zugegeben und die Platten wurden für eine weitere Stunde inkubiert.
Nach achtmaligem zusätzlichem Waschen
mit Assaypuffer wurde eine Lösung
aus o-Phenylendiamin-dihydrochlorid (OPD), die 25 mM Zitronensäure, 50
mM Na2HPO4, pH 5
und 0,03% frisch zugegebenes H2O2 enthielt, zugegeben. Die Reaktion wurde
nach etwa 30 Minuten durch Zugabe von 100 μL 4N H2SO4 gestoppt. Die resultierenden Platten wurden
bei 490 nm in einem Plattenleser ausgelesen, der die Untergrundauslesung
bei 650 nm automatisch abzog. Die Ergebnisse wurden als optische
Dichte gegen Verdünnung
des Antiserums aufgetragen. Relative Antikörpertiter wurden durch die
Menge bestimmt, mit der Serum verdünnt werden musste, bevor die
optische Dichte unterhalb eines willkürlichen Werts fiel, von zum
Beispiel 1 O. D.-Einheit.
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Die
Ergebnisse der Immunisierungsprotokolle sind in 3 dargestellt.
Injektion des Maus-Fc-IL-4R-Fusionsproteins
allein in PBS durch dieses Protokoll induzierte nur in einer Maus
(3B) eine Antikörperantwort.
Der Zusatz von CFA führte
jedoch dazu, dass mehr Mäuse
antworteten, aber die Titer waren annähernd die gleichen wie bei
der antwortenden Maus, der Fc-IL4R-Fusionsprotein allein in PBS
injiziert wurde (3C). Co-Verabreichung von Maus-Fc-IL2-Hilfsstoff
mit Fc-IL4R in PBS induzierte Antworten in allen Tieren, jedoch
variierte die Menge an produziertem Antikörper in jedem Fall (3D).
Die Kombination aus CFA und dem Maus-Fc-IL2-Hilfsstoff zusammen
(3A) führte
zu höheren
Antikörpertitern
als jedes Mittel allein (3C und 3D).
Co-Verabreichung des Maus-Fc-GMCSF-Hilfsstoffs
in PBS induzierte die stärkste
Immunantwort von allen Gruppen (3E), einschließlich der
Gruppe, die mit der Kombination von sowohl dem Fc-GMCSF-Hilfsstoffs als auch
CFA (3F) immunisiert wurde. Mit anderen Worten vermeidet der
Maus-Fc-GMCSF-Hilfsstoff in PBS, wenn er mit dem Maus-Fc-IL4R-Antigen
co-verabreicht wird, die Notwendigkeit, CFA zu verwenden. Es wird
in Erwägung
gezogen, dass ein solches Verfahren für die Verwendung bei Menschen
besser geeignet wäre.
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Beispiel 3. Wirkung einer Fc-GMCSF Hilfsstoffdosis
auf Antikörper,
die Regen das Krebsantigen PSMA in dem Fc-PSMA-Fusionsprotein produziert
werden.
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PSMA
stellt gegenwärtig
ein attraktives humanes, mit Tumor einhergehendes Zielantigen dar,
aufgrund seiner eingeschränkten
Verteilung in normalem Gewebe. PMSA wird derzeit in klinischen Studien
als ein Kandidat für
einen Tumorimpfstoff untersucht. In diesem Beispiel wurden die Immunisierungskraft
des PMSA-Antigens in einem Fc-PMSA-Fusionsprotein untersucht.
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Das
Maus-Fc-PSMA-Fusionsprotein wurde wie in Beispiel 1 diskutiert hergestellt.
Gruppen von Mäusen
wurden subkutan 50 μg
Maus-Fc-PSMA in PBS, zusammen mit variierenden Konzentrationen des Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteins
Fc-GMCSF, injiziert und dann 14 Tage später mittels intraperitonealer
Injektion reimmunisiert. Antikörpertiter
wurden mittels Fc-PSMA-Antigen-Capture-ELISA,
wie in Beispiel 2 für
das Fc-IL4R-Fusionsprotein beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse
wurden in 4 als Antikörpertiter
(Verdünnung,
bei der die OD auf 1 vermindert ist) gegen die Zeit nach der ersten
Injektion aufgetragen.
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In
der Abwesenheit von Fc-GMCSF wiesen Mäuse Antikörpertiter gegen PSMA im Bereich
von 1000 bis ungefähr
20.000 (4A) auf. Co-Verabreichung von
kaum mehr als 0,05 μg
Fc-GMCSF führte
jedoch zu Titern im Bereich von 30.000 bis 140.000 (4B).
Eine zehnfache Erhöhung
von Fc-GMCSF stimulierte Antikörpertiter
gegen dieses Krebsantigen noch weiter (4C und 4D).
Die höchste
gegebene Dosis (5 μg des
Fc-GMCSF- Fusionsprotein
pro Maus) stellt noch immer nur etwa 2 μg GMCSF pro Injektion dar – eine Dosis
ohne offensichtliche Wirkung auf die Maushaut oder irgendwelche
systemische Zeichen, dass das Tier immunisiert wurde (siehe, 4D).
Darüber
hinaus gab es, anders als mit CFA, keine offensichtliche Vergrößerung der
Milz.
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Beispiel 4. Wirkung des Fc-vermittelten
Transports von PSMA au die Antikörperantwort
auf Immunisierung.
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Die
spezifischen Wirkungen der Fc-Komponente der Fc-Antigen- und Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine wurde
untersucht, indem die induzierten Immunantworten in Mäusen, denen
die Fusionsproteine, das nicht fusionierte Antigen oder Hilfsproteine
oder Mischungen der vorhergehenden injiziert wurden, verglichen
wurden. Für
diesen Zweck wurde das humane PSMA-System verwendet.
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Unfusioniertes
PSMA wurde durch proteolytischen Verdau von humanem Fc-PSMA-Fusionsprotein (Lo
et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11:495-500) mit Plasmin gemäß den Anweisungen
des Herstellers hergestellt. Freigesetztes Fc und unverdautes Fc-PSMA
wurde mittels Adsorption an Protein A Sepharose (Repligen, Needham,
MA) entfernt.
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Gruppen
von Mäusen
(n = 3) wurden eine einzelne subkutane Dosis von 50 μg PSMA entweder
allein (5A), oder in Komnbination mit
0,2 μg freiem
GMCSF (5B) oder mit 0,5 μg Fc-GMCSF
(5C) (0,5 μg
Fc-GMCSF enthält
etwa 0,2 μg
GMCSF) injiziert. In einem weiteren Satz an Mäusen wurde jeder Maus eine subkutan
Dosis von 50 μg
Maus-Fc-PSMA-Fusionsprotein
allein (5D), oder zusammen mit 0,2 μg freiem GMCSF
(5E) oder mit 0,5 μg Fc-GMCSF (5F)
injiziert. Alle Injektionsformulierungen waren in PBS ohne chemischen
Hilfsstoff. Antikörper,
die mit Maus-Fc-PSMA reagieren, wurden an Tag 14 nach Immunisierung
gemessen.
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Die
Bedeutung der Fc-Komponente des Fc-Antigen-Fusionsprotein in dem
Fc-PSMA-Fusionsprotein für die Immunisierungskraft
von PSMA war auffallend, wenn Tieren PBS-Formulierungen ohne chemische Hilfsstoffe
injiziert wurden. Es gab im Wesentlichen keine primäre Immunantwort
auf das PSMA, das in PBS verabreicht wurde (5A). Der
Zusatz von GMCSF oder Fc-GMCSF bei der Immunisierung hatte sehr
geringe Wirkung (5B und 5C), außer einer
schwachen Reaktion in einem Tier (5B). Im
Gegensatz dazu zeigten Tiere, denen Fc-PSMA allein injiziert wurde,
in allen Fällen
starke primäre
Immunantworten (5D). Der Zusatz von freiem GMCSF
zu Fc-PMSA erhöhte
die Wirkung geringfügig
(5E), die Co-Verabreichung von sowohl Antigen als
auch Cytokin als Fc-Fusionsproteine
ergab jedoch den höchsten
Spiegel an Antwort (5F).
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Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination aus Fc-Antigen
und Fc-Hilfsstoff insbesondere bei der Erzeugung einer Immunantwort
von Nutzen ist und zeigt den offensichtlichen Nutzen der Co-Lokalisierung
von Antigen und stimulierendem Cytokin in vivo, vermutlich auf den
APCs.
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Beispiel 5. Vergleich der Hilfsstoffwirkungen
der Fusionsproteine Fc-GMCSF oder Fc-Flt3L
-
Es
wurde gezeigt, dass der Ligand für
Flt3, der im Fachgebiet auch als Flt3-Ligand (Flt3L) bezeichnet wird,
eine kritische Rolle bei der Erzeugung und Reifung von dendritischen
Zellen spielt (Soligo et al. (1998) BR. J. HAEMATOL. 101:352-63).
Man nimmt an, dass dendritische Zellen, zusammen mit Makrophagenzellen des
Gewebes, die wichtigsten APC sind. Studien an Mäusen haben gezeigt, dass tägliche Injektionen über 10 Tage
die Anzahl und APC-Aktivität
von dendritischen Zellen, die aus Lymphgewebe und Milz gewonnen
werden können,
erhöht
und dass diese Zellen bei der Präsentation
von Antigen gegenüber
CD4+- und CD8+-T-Zellen äußerst wirkungsvoll
sind. Man nimmt an, dass die Langerhans-Zellen der Haut eine Art der dendritischen Zelle
darstellen, die nach Aufnahme und Wanderung zu den lokalen Lymphknoten
Antigen präsentieren
können.
Da man annimmt, dass die meisten dendritischen Zellen nicht die
Bandbreite an Fc-Rezeptoren exprimiert, die typischerweise auf Makrophagen
gefunden werden (z. B. FcγRI),
konnte nicht vorhergesagt werden, ob die co-lokalisierunde Wirkung
der Fc-Fusionsproteine diese APC-Linie betreffen würde.
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Um
zu untersuchen, ob Flt-3L als ein Hilfsstoff wirken könnte, wurden
Gruppen von Mäusen Maus-Fc-PSMA
und Maus-Fc-FLt3L anstelle der Verwendung von Maus-Fc-GMCSF- Fusionsprotein (einem potenten
Stimulator von Makrophagen und Granulozyten) injiziert. In diesem
Fall wurde erwartet, dass jegliche Hilfswirkung über Aktivierung und Aufnahme
durch dendritische Zellen vermittelt würde, die schließlich zu
einer Antikörperantwort
auf PMSA führen
würde.
Die Ergebnisse sind in 6 zusammengefasst.
-
Diese
Untersuchung deutet darauf hin, dass Maus-Fc-Flt3L ein wirkungsvoller
Hilfsstoff ist, der anti-PSMA-Antikörper genauso gut, wenn nicht
sogar besser als die gleiche Dosis Fc-GMCSF stimuliert. Die Ergebnisse unterstützen die
Beobachtung, dass eine Kombination aus Fc-Antigen und einem Fc-Hilfsstoff
bei der Induzierung einer Immunantwort besonders wirksam sein kann.
Die Ergebnisse zeigen auch, dass sowohl dendritische APC als auch
Makrophagen-APC offensichtlich mit Fc-Antigen und Fc-Cytokin angesteuert
werden können,
was darauf hindeutet, dass mindestens eine Form des Fc-Rezeptors
auf diesen Zellen vorkommt.
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Beispiel 6. Immunantworten auf Fc-EpCAM
und EpCAM--Fc-Fusionsproteine
-
Ein
weiteres möglicherweise
wichtiges, humanes Krebsantigen, EpCAM (das auch KSA und 17-1A-Antigen
genannt wird) wurde als ein Fusionsprotein mit einer Maus-IgG2a-Fc-Region
unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Plasmide und Verfahren
hergestellt und wurde entweder allein oder in Kombination mit Fc-GMCSF
als ein Hilfsstoff verabreicht. Mäusen wurde subkutan 10 μg Fc-EpCAM
und 1 μg Fc-GMCSF
in PBS injiziert und sie wurden nach 3 Wochen damit reimmunisiert.
Kontrollmäuse
erhielten kein Fc-GMCSF. Gegen EpCAM gerichtete Antikörpertiter
wurden 7 Tage (7A) und 14 Tage (7B)
nach der Reimmunisierung gemessen. Die Ergebnisse deuten darauf
hin, dass Fc-EpCAM, wenn es allein verabreicht wird, ein wirksames
Immungen ist (offen Rauten), und dass Fc-GMCSF die Antwort auf dieses Antigen
weiter verstärken
kann (ausgefüllte
Dreiecke).
-
Zusätzlich wurde
EpCAM-Antigen in umgekehrter Orientierung bezogen auf das Fc-Fragment als EpCAM-muFc
exprimiert (siehe Beispiel 1, 1B). Dieses
Molekül
wurde verwendet, um Ba1b/c-Mäuse
mittels subkutaner Injektion zu immunisieren. Höhere Dosen an EpCAM-Fc-Fusionsprotein
wurden verwendet (25 μg pro
Dosis) und die Menge an Hilfsstoff (2,5 μg Fc-GMCSF) wurde ebenfalls
erhöht.
Gegen EpCAM gerichtete Anti körpertiter
wurden 14 Tage (8A) und 21 Tage (8B)
nach der Reimmunisierung gemessen. Das EpCAM-Fc-Fusionsprotein allein
war in der Abwesenheit von Fc-GMCSF recht immunogen (8A und 8B,
(offene Rauten)). Der Zusatz von Fc-Cytokin verbesserte Antikörpertiter
um das 3fache (8A und 8B, (ausgefüllte Dreiecke)).
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Um
zu untersuchen, ob die Immunantwort gegen EpCAM Säugetiere
vor Tumorzellen, die dieses Antigen exprimieren, schützen könnte, wurde
nicht-immunisierten oder mit EpCAM-Fc-Fusionsprotein (und in einigen Fällen Fc-Cytokinen)
immunisierten Mäusen
105 CT26-Maus-Kolonkarzinomzellen,
die mit humanem EpCAM transfiziert waren (Gillies et al.
-
(1998)
J. IMMUNOL. 160:6195), in die Schwanzvene injiziert. Einundzwanzig
Tage später
wurden die Tiere geopfert und das Ausmaß an Lungenmetastasen wurde
abgeschätzt
durch (1) Stadienbestimmung bezüglich
der Bedeckung der Lungenoberfläche;
und (2) durch Wiegen der Lungen und deren Vergleich mit normalen
Tierlungen, um den differentiellen Gewichtszuwachs, der der Tumormasse
zugeschrieben werden kann, zu bestimmen. In Tabelle 1 zusammengefasste
Ergebnisse zeigen, dass alle immunisierten Mäuse verglichen mit Kontrollmäusen eine
statistisch signifikante Verminderungen bei Tumormetastasen zeigten,
einschließlich von
Tieren, die mit dem EpCAM-Fc-Fusionsprotein allein immunisiert wurden. Ähnliche
Ergebnisse wurden unter Verwendung des Fc-EpCAM-Fusionsproteins
als dem Antigen erreicht. TABELLE 1
Behandlungsgruppe | metastatische
Bewertung | mittl.
Lungengewicht (mg) |
Kontrolle | 4,
4, 4, 1, 1 | 412+/–130 |
EpCAM-Fc | 0,
0, 0, 0, 0 | 210+/–21 |
EpCAM-Fc
+ Fc-GM | 0,
0, 0, 0, 0 | 240+/–19 |
EpCAM-Fc
+ Fc-IL2 | 0,
0, 0, 0, 0 | 230+/–19 |
-
Metastatische
Bewertungen basierten auf der Oberflächenbedeckung der Lungen unter
Verwendung der folgenden Einstufungen: 1 = 1 – 25% Bedeckung; 2 = 26 – 50% Bedeckung;
3 = 51 – 75%
Bedeckung; und 4 = 76 – 100%
Bedeckung.
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Beispiel 7. Kombination von Antigen-Fc
und Cytokin-Hilfsstoff in einem Einzelfusionsprotein
-
Das
in Beispiel 6 beschriebene Protein EpCAM-Fc, stellt beispielhaft
ein N-terminales Antigen dar, das als die Carboxylproteindomäne an eine
Fc-Immunglobulinregion geknüpft
ist. Dieses Protein, und andere wie dieses, können mit Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteinen,
z. B. Fc-Cytokinen, co-verabreicht werden, um die Immunantwort auf
das Antigen zu verstärken.
Alternativ können
das Antigen, die konstante Region der schweren Immunglobulinkette
und das Hilfsprotein (zum Beispiel Cytokin) als ein Einzelfusionsprotein,
zum Beispiel als ein EpCAM-Fc-GMCSF-Fusionsprotein hergestellt werden.
-
Das
Expressionsplasmid für
dieses Protein wurde unter Verwendung der murinen IgG2a-Fc und GM-CSF-Sequenzen
konstruiert, so dass das Konstrukt in einem Mausmodell evaluiert
werden konnte. Ein kleines Xba I- nach Sma I-Fragment, das die kodierenden
Sequenzen Leader-EpCAM-Fc enthielt, wurde aus dem ursprünglichen
EpCAM-Fc-Expressionsvektor (Beispiel 1) erhalten und in das große Sma I-
nach Xba I-Fragment des Fc-GMCSF-Expressionsvektors
(9) ligiert.
-
Der
resultierende Vektor pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF wurde für transiente Expression unter
Verwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahrens
in 293-Zellen und für
stabile Expression mittels Elektroporation in NS/0-Zellen eingeführt. Stabile
Transfektanten wurden durch Kultivieren der Zellen in Methotrexat-haltigem
Medium (0,1 μM)
selektiert. Exprimierende Klone wurden mittels Fc-ELISA (siehe Beispiel
1) identifiziert und Produzenten mit hohen Spiegeln wurden in Kultur
vermehrt. Das EpCAM-Fc-GMCSF-Protein wurde aus konditioniertem Medium
durch Binden an und Elution von Protein A Sepharose (Repligen, Needham,
MA) gereinigt und strukturelle Integrität wurde mittels SDS-PAGE gefolgt
von Reduktion mit 2-Mercaptoethanol analysiert. Die Ergebnisse deuten
darauf hin, dass das Protein ein Molekulargewicht von etwa 90 kD
aufwies, wie es für
eine einkettige Fusion von EpCAM, Fc und GMCSF erwartet wurde.
-
Um
die relative Immunisierungskraft des kombinierten Fusionsproteins
zu vergleichen, wurden Mäusen
subkutan äquivalente
Dosen von EpCAM-Fc-GMCSF und den einzelnen Fusionsproteinen in Kombination:
EpCAM-Fc und Fc-GMCSF injiziert. Die gleichen Injektionen wurden
14 Tage später
gegeben und Serumproben wurden auf spezifische Antikörperreaktivität auf humanes
EpCAM 7 Tage nach der Reimmunisierung untersucht. Die gleiche Vorgehensweise
kann für
andere Protein- oder Peptidantigene sowie für andere stimulatorische Cytokine
wie IL-2, IL-12 und Flt3L verwendet werden.
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Beispiel B. Immunisierung mit Fc Antigen
mittels DNA-Injektion.
-
Die
gleichen Expressionsvektoren, die für Transfektion und Produktion
von Maus-Fc-EpCAM
und EpCAM-Fc in Säugetierzellen
(siehe Beispiel 1) verwendet wurden, wurden als „nackte" Plasmid-DNA in den Muskel des Hinterlaufs
von Ba1b/c-Mäusen
injiziert. DNA wurde in einer Konzentration von 0,5 mg/ml injiziert und
es wurde eine Gesamtmenge von 100 μg entweder in PBS oder in einer
Saccharoselösung
mit 25 Gew.-% verabreicht. Injektionen wurden alle 3 Wochen für insgesamt
3 Injektionen wiederholt. Antikörperantworten wurden
zu verschiedenen Zeiten gemessen und mittels ELISA unter Verwendung
von mit humanem Fc-EpCAM beschichteten 96-Well-Platten für den Einfang
und unter Verwendung eines HRP-konjugierten Fc-spezifischen polyklonalen
anti-Maus-Antikörpers
(Jackson ImmunoResearch) zum Nachweis quantifiziert. Die in 10 vorgestellten Daten stellen Antikörpertiter
dar, die 14 Tage (10A), 27 Tage (10B), 55 Tage (10C)
und 69 Tage (10D) nach Injektion gemessen
wurden.
-
Die
in 10 vorgestellten Ergebnisse deuten
darauf hin, das während
des ersten Monats unter Verwendung beider Formulierungen geringe
Titer an spezifischen anti-EpCAM-Antikörpern induziert
wurden (10A und 10B).
Bis zum Tag 55 wurden viel höhere
Titer erhalten (10C) und noch höhere Spiegel bis
zum Tag 69 (10D). Ähnliche Ergebnisse wurden unter
Verwendung von DNA-Injektion eines EpCAM-Fc exprimierenden Vektors
erhalten, obwohl die Titer niedriger waren. Diese Daten zeigen,
dass ein Antigen, das als ein Fusionsmolekül, das ein Proteinantigen und
eine Immunglobulin-Fc-Region enthält, exprimiert wird, eine Immunantwort
induzieren kann, wenn es durch Injektion von nackter DNA eingeführt wird,
und dass anhaltende Antigenexposition bei den meisten Tieren zu
verzögerten
Antworten führt.
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Zelluläre Immunantworten
wurden untersucht, indem Splenozyten von Mäusen, die mit DNA geimpft oder
mit Protein immunisiert wurden, (70 Tage nach Injektion) mit unterschiedlichen
Konzentrationen von Fc-EpCAM-Protein in vitro stimuliert wurden.
Die in 11 vorgestellten Daten (oberes
Panel) deuten auf eine proliferative Antwort (gemessen durch 3H-Thymidineinbau)
auf Antigen in Tieren hin, die entweder mit Fc-EpCAM-Protein (Kreuze)
oder DNA-Impfung mit CMV-Promotor-EpCAM-Fc-(offene Kreise) oder
CMV-Promotor-Fc-EpCAM-(gefüllte Rauten)Expressionsvektoren
immunisiert wurden. Die mit Protein immunisierten Tieren zeigten
eine viel größere Antwort
auf Antigen, sogar bei sehr geringen Dosen. Die Antworten von mit
DNA geimpften Tieren (auch mit einer anderen Skala im unteren Panel
der 11 gezeigt) waren Dosis-abhängig, aber
von geringerer Größenordnung
als die mit Protein injizierten Mäuse. Diese Antworten waren
für MHC-Klasse
II beschränkte
CD4+-T-Zellantworten charakteristisch.
-
Um
auf cytotoxische Aktivität
zu untersuchen (im Allgemeinen ein Indiz für auf MHC-Klasse I beschränkte T-Zellantworten) wurden
Splenozytenkulturen aus mit DNA oder Protein immunisierten Mäusen für 5 Tage
in der Gegenwart von etwa 10 U/ml IL-2 kultiviert. Die Effektorzellen
waren die kultivierten Splenozyten und die Zielzellen waren entweder
markierte humane EpCAM-exprimierende CT26-Kolonkarzinomzellen (syngeneisch
für Ba1b/c-Mäuse) oder
markierte parenterale (nicht transfizierte CT26-Zellen). Die Effektor- und Zielzellen wurden
in verschiedenen Verhältnissen
vermischt und das Ausmaß der
Lyse bestimmt. Der Wert von 100% Lyse wurde erreicht, indem die
markierten Zielzellen in der Gegenwart von Detergens inkubiert wurden und
die Menge an freigesetztem Marker gemessen wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in 12 dargestellt,
wobei 12A die Aktivität von Splenozyten
gegen humanes EpCAM exprimierende CT26-Zellen zeigt, während 12B die Aktivität von Splenozyten gegen parenterale
CT26-Zellen zeigt. In beiden Figuren stellen die offenen Rauten
Splenozyten dar, die aus Mäusen
isoliert wurden, die mit ein EpCAM-Konstrukt tragender DNA immunisiert
wurden, offene Quadrate stellen Splenozyten dar, die aus Mäusen isoliert
wurden, die mit ein Fc-EpCAM-Fusionskonstrukt tragender DNA immunisiert
wurden, offene Dreiecke stellen Splenozyten dar, die aus Mäusen isoliert wurden,
die mit ein EpCAM-Fc-Fusionskonstrukt tragender DNA immunisiert
wurden, und Kreuze stellen Splenozyten dar, die aus Mäusen isoliert
wurden, die mit Fc-EpCAM-Fusionsprotein immunisiert wurden.
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12 zeigt, dass, obwohl DNA-Impfung schwache
cytotoxische Antworten gegen beide Zielzellen erzeugte, in den mit
Protein immunisierten Mäusen
eine deutlich höhere
Cytotoxizität
gesehen wurde. Sowohl die parenteralen CT26-Tumorzellen als auch
die EpCAM exprimierenden CT26-Tumorzellen wurden in dem Assay getötet. Die
gegen parenterale CT26-Zellen beobachtete Cytotoxizität tritt
vielleicht auf, weil diese Zellen hohe Spiegel des EpCAM-Homologen
der Maus exprimieren können,
das auf dem Aminosäureniveau
zu 81% mit dem humanen Protein identisch ist. Dennoch erzeugte Immunisierung
mit Fc-EpCAM-Protein
tatsächlich
eine deutliche cytotoxische Aktivität gegen humanes EpCAM exprimierende
CT26-Tumorzellen, wodurch die in Beispiel 6 beschriebene, wirksam
vor Tumor schützende
Aktivität
erklärt
wird.
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Beispiel 9. Immunisierung mit einem Fc-Fusionsprotein,
das eine Unterregion eines Protein-Krebsantigens enthält.
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Obwohl
einige vollständige
Proteine vielleicht nicht als Antigene für eine Immuntherapie von Nutzen sind,
können
kleinere Unterregionen der Proteine sehr viel wirksamer sein. Zum
Beispiel können
Proteine Domänen
enthalten, die posttranslational modifiziert werden, um sie weniger
immunogen zu machen, wodurch Immunreaktivität auf die tatsächlichen
Polypeptidbestandteile vermindert wird. Große Proteine können Antikörper induzieren,
die nur mit Nicht-Polypeptidteilen des Antigens reagieren und die
keine antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC)
vermitteln, ein potenziell wichtiger Bestandteil der Anti-Tumor-Immunantworten. Ein
gutes Beispiel für
diese Situation wird durch das humane Melanomspezifische Chondroitinsulfat-Proteoglykan-(MCSP)Antigen,
das auf nahezu allen Melanomen sowie einigen Arten von Gehirnkrebs
exprimiert wird, beispielhaft erläutert. Dieses Protein ist stark
glykosyliert und wird weiter durch Bindung von mehreren Glukosaminoglykanketten
modifiziert. Ein als 9.2.27 bekannter Antikörper (Bumol et al. (1982) PROC.
NATL. ACAD. SCI. 79:1245-1249) bindet dieses Protein mit hoher Affinität, vermittelt
aber keinerlei Effektorfunktion, entweder ADCC oder Komplement vermittelte
Cytotoxizität (CDC).
Sogar teilweise humanisierte (chimäre) Formen dieses Antikörpers versagen
bei der Vermittlung von derartigen Aktivitäten.
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Um
stärker
fokussierte Antworten hervorzurufen, um Zielregionen dieses großen Moleküls optimaler anzusteuern,
wurden putative Glykanbindungstellen in der Proteinsequenz identifiziert.
(Pluske et al. (1996) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 93:9710-9715).
Es wurde eine Unterregion nicht weit von der Zelloberflächenmembran-überspannenden
Sequenz und in einiger Entfernung von den Glykanbindungsstellen
gewählt.
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Die
Peptidsequenz:
QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFT
QQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD (SEQ ID NO: 21) wurde revers translatiert,
die resultierende DNA-Sequenz chemisch synthetisiert und in den
pdCs-Fc-X-Expressionsvektor unter Verwendung der gleichen Restriktionsstellen,
die in den früheren
Beispielen verwendet wurden, ligiert. Eine Translationsstoppstelle
wurde am 3'-Ende
direkt nach der für
die letzte Aminosäure
kodierenden Sequenz zugefügt,
gefolgt von einer einmal vorhandenen Xho I-Stelle. Das fertige Expressionsplasmid
wurde in NS/0-Myelomzellen elektroporiert und stabile Transfektanten,
die das gewünschte
Protein exprimieren, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten.
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Fc-MCSP-Protein
wurde aus Kulturüberständen unter
Verwendung von Protein A Sepharose-Chromatographie (Repligen, Needham,
MA) gereinigt. Antikörpertiter
wurden in Ba1b/c-Mäusen gemessen,
die subkutan mit 50 μg
Fc-MCSP-Fusionsprotein in PBS entweder allein oder in Kombination
mit 5 μg
Fc-GMCSF als einem Hilfsstoff immunisiert wurden. Die Ergebnisse
sind in 13 dargestellt. Die ausgefüllten Rauten
bedeuten Antikörpertiter
in normalem Serum, die offenen Quadrate bedeuten Antikörpertiter
im Serum von Mäusen,
die mit Fc-MCSP-Fusionsprotein immunisiert wurden, und die ausgefüllten Dreiecke
bedeuten Antikörpertiter
in einem Serum von Mäusen,
die mit Fc-MCSP und einem Fc-GMCSF-Hilfsstoff immunisiert wurden.
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Spezifische
Immunantworten auf diese Unterregion von MCSP wurden bis zum Tag
14 nachgewiesen und stiegen deutlich nach einer Auffrischimmunisierung.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit sowohl Fc-GMCSF als auch
Fc-MCSP immunisierte Mäuse
höhere
Antikörpertiter
gegen MCSP (ausgefüllte
Dreiecke) stimulierten, als allein mit Fc-MCSP immunisierte Mäuse (offene Quadrate).
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Beispiel 10: Immunisierung mit einem Fc-Fusionsprotein,
enthaltend ein virales Antigen
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Entwicklung
eines wirksamen Impfstoffs gegen das humane Immundefizienz-Virus
(HIV), das Virus, das AIDS verursacht, ist eines der wichtigsten
Ziele in der Impfstoffforschung. In letzter Zeit haben einige Berichte
darauf hingedeutet, dass bestimmte Eigenschaften der Virushülle dazu
dienen, die Immunantwort durch einen Trick dazu zu bringen, auf
irrelevante Epitope zu antworten, wodurch die wichtigen und potenziell
neutralisierenden Regionen des Viruspartikels maskiert werden. Diese
umfassen die Gegenwart von hoch immundominanten, antigenen Regionen,
die als Köder
dienen und extensive Glykosylierung, die die Immunisierungskraft
von wichtigen Epitopen physikalisch maskiert und vermindert (Wyatt
et al. (1998) NATURE 393:705-11).
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Ein
möglicher
Weg, den Ködermechanismus
zu umgehen, ist, kleine Regionen des Virushüllgens zu exprimieren, um immundominante
Antworten, die nicht schützen,
zu vermeiden und eine neutralisierende Antwort zu induzieren. Ein
Problem mit kleinen Subunit-Impfstoffen ist die verminderte Immunisierungskraft
entweder als ein synthetisches Peptid oder ein kleines Protein.
Eine Vorgehensweise war, die Proteine oder Peptide an immunogene
Trägerproteine
zu koppeln, wie z. B. Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Dies induziert eine
starke Antwort auch auf KLH, aufgrund des Proteins oder Peptids.
Eine weitere Vorgehensweise ist die Herstellung eines Fusionsproteins
mit Fc wie in Beispiel 1 beschrieben für eine Unterregion von, zum
Beispiel, der Ektodomäne
von gp41 (der Ankerdomäne
der viralen Hülle,
gp160). Anders als andere Träger
wird die Immunglobulinregion als „eigen" gesehen, wodurch jegliche immundominanten
Effekte minimiert werden.
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Das
Fc-gp41pep626-Fusionskonstrukt enthielt ein Polypeptid aus 44 Aminosäuren, fusioniert
an den Carboxylterminus einer Immunglobulin-Fc-Region der Maus.
Die Sequenz des HIV-Stamms
IIIB in dieser Region enthält
ein Signal für
N-verknüpfte
Glykosylierung, so dass das Fc-gp41pep626-Fusionsprotein, das entweder
in 293-Zellen mittels transienter Expres sion oder in NS/0-Myelomzellen
mittels stabiler Transfektion produziert wurde, einen höheren Grad
an Variation bei der Beweglichkeit auf SDS-PAGE-Analyse zeigte,
wodurch auf die Heterogenität
im Ausmaß der
Glykosylierung hingedeutet wurde.
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Trotz
der Tatsache, dass dieses virale Antigen recht klein ist (ein Länge von
44 Aminosäuren)
und heterogen glykosyliert war, war es möglich, eine Immunantwort in
Ba1b/c-Mäusen
(siehe 14) hervorzurufen. In diesem
Fall wurden Gruppen von fünf
Mäusen
intradermal 25 μg
Fc-gp41pep626 an Tag 1 und zwei weitere Male im Abstand von zwei
Wochen, entweder allein (leere Rauten) oder in Kombination mit 2,5 μg des Fc-Hilfsstoff-Fuisonsproteins Fc-GMCSF
(offene Quadrate) oder Fc-IL2 (ausgefüllte Dreiecke), injiziert. 14A und 14B stellen
Antikörpertiter
dar, die 7 bzw. 33 Tage nach einer zweiten Auffrischimpfung erreicht
wurden.
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Die
Immunantworten waren abhängiger
von der Co-Verabreichung der Fc-Cytokine und es dauerte länger, bis
ein hoher Titer erreicht wurde. Es wird in Erwägung gezogen, dass stärkere Immunantworten
unter Verwendung von Modifizierungen dieser Sequenz hervorgerufen
werden könnten,
die das Glykosylierungssignal nicht enthält (tatsächlich kodieren viele Stämme nicht
für diese
Stelle), oder indem die Kohlenhydratseitenketten enzymatisch in
vitro entfernt werden.
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Beispiel 11: Hilfsstoffaktivität eines
Fc-Fusionsproteins, enthaltend die extrazelluläre Domäne eines Zelloberflächenmoleküls
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Um
Fc-Hilfsstoff-Fusionsproteine zu konstruieren, ist es manchmal von
Nutzen, an das Fc der extrazellulären Domäne eines Proteins, das membrangebunden
sein kann, zu fusionieren. Zum Beispiel wird ein CD40-Ligand (CD40L)
an den N-Terminus des C-Terminus von Fc fusioniert. Optional wird
ein Linker verwendet.
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CD40L
ist von Nutzen, da sein Rezeptor, CD40 auf der Oberfläche von
B-Zellen exprimiert wird und an der Stimulierung von B-Zellen durch
T-Zellen beteiligt ist. Wie der Tumornekrosefaktor ist CD40L ein
Trimer, das Dimerisierung oder Trimerisierung seines Rezeptors auf
einer Zelloberfläche
verursacht. Als Folge werden intrazelluläre Rezeptordomäne in Kontakt
gebracht und daraus folgt Signaltransduktion. Ebenso wie TNF kann CD40L
membrangebunden sein, kann aber auch von der Zelloberfläche abgespalten
werden und wie ein Cytokin wirken.
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Ein
Fc-CD40L-Fusionsprotein wird Tieren mit einem Fc-Antigen-Fusionsprotein
gemeinsam verabreicht. In Kontrollexperimenten werden Fc-CD40L-Protein
und das Fc-Antigen-Protein verschiedenen Reihen von Tieren verabreicht.
Es wird in Betracht gezogen, dass Tiere, denen beide Fusionsproteine
injiziert wurden, einen höheren
Antikörpertiter
produzieren als Tiere, denen jedes Fusionsprotein einzeln injiziert
wurde.
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Alternativ
wird ein einzelnes Fc-Fusionsprotein, das sowohl ein Antigen als
auch eine CD40L-Einheit enthält,
mit optionalen Linker (L) zwischen dem Fc, CD40L und den Antigeneinheiten
verwendet. Das Fusionsprotein kann die N-terminale nach C-terminale
Reihenfolge Fc-(L)-Antigen-(L)-CD40L, FC-(L)-CD40L-(L)-Antigen,
Antigen(L)-CD40L-(L)-Fc,
CD40L-(L)-Antigen-(L)-Fc, Antigen-(L)-Fc-(L)-CD40L oder CD40L-Fc-(L)-Antigen-(L) sein.
Das Fusionsprotein, das Fc, das Antigen und CD40L enthält, wird
Tieren injiziert und dann werden Antikörpertiter gemessen. Es wird
in Erwägung
gezogen, dass Antikörpertiter,
die durch Injektion des Fusionsproteins mit sowohl CD40L als auch
Antigen erzeugt wurden, höher
sind als die Titer, die durch Injektion von Fusionsproteinen erhalten
werden, die nur Fc und Antigen oder Fc und CD40L enthalten.
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In
den oben genannten Verabreichungen der Fusionsproteine wird Tieren
die Injektion intravenös,
subkutan oder durch andere geeignete Arten der Verabreichung verabreicht.
Die Zeiten zwischen der ersten Verabreichungen und den Auffrischimpfungen
von Antigenen und/oder Hilfsstoffen und die Messung der Antikörpertiter
sind wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Alternativ werden
Standarddosierungs- und Assayschemata verwendet.
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