DE60036047T3

DE60036047T3 - Äquivalent der Altershaut, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE60036047T3
Application number: DE60036047T
Authority: DE
Inventors: Herve Pageon; Daniel Asselineau; Pierre Tachon
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1999-04-20
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2012-07-26
Anticipated expiration: 2020-04-19
Also published as: CA2306317A1; EP1046402A1; FR2792650A1; US20020058337A1; US6660522B2; FR2792650B1; DE60036047T2; ES2292412T5; ATE370755T1; US6605466B1; JP2000350778A; EP1046402B2; JP3387891B2; DE60036047D1; EP1046402B1; US20040052772A1; US6890754B2; CA2306317C; ES2292412T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Äquivalent der Altershaut, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie das Äquivalent der Epidermis und das Äquivalent der Alters-Dermis, die in diesem Äquivalent der Altershaut enthalten sind, und ihre Verwendung in vitro.
Seit vielen Jahren wird versucht, Modelle rekonstruierter Haut zu entwickeln, die es erlauben, Untersuchungen durchzuführen, die zum besseren Verständnis der Rolle der Haut sowohl im mechanischen Bereich als auch im physiologischen Bereich erforderlich sind.
So konnten Modelle entwickelt werden, die der menschlichen Haut mehr oder weniger nahekommen. Als Beispiele hierfür sind die Modelle zu nennen, die beschrieben sind in den Patentanmeldungen EP-A-285 471 , EP-A-285 474 , EP-A-789 074 , EP-A-502 172 , EP-A-418 035 , WO-A-9116010 , EP-A-197 090 , EP-A-20 753 , FR-A-2 665 175 und FR-A-2 689 904 . Ferner erstreckten sich Untersuchungen auf die Ermittlung des Allergenpotentials der Bestandteile eines Äquivalents der menschlichen Haut (Nemecek, G., et al., Toxicology Pathology, Band 27, Nr. 1, Januar 1999, Seiten 101–103), auf die Wiederbesiedlung eines einer Maus implantierten Haut-Äquivalents durch Langerhans-Zellen (Demarchez, M., et al., Journal of Investigative Dermatology, Band 100, Nr. 5, 1993, Seiten 648–652) und auf die differentielle Expression von Markern der Differenzierung wie der Integrine in den suprabasalen Schichten der Epidermis ausgehend von einem Äquivalent der Epidermis (Font et al., Cell Biology and Toxicology, Band 10, Nr. 5–6, 1994, Seiten 353–359) oder einem Äquivalent der menschlichen Haut, das UV-Strahlung ausgesetzt war (Hendrix, S. W., et al., Archives of Dermatological Research, Band 290, Nr. 8, 1998, Seiten 420–424). Sehr allgemein enthalten die in diesen Dokumenten beschriebenen Modelle rekonstruierter Haut menschliche Keratinocyten, die gegebenenfalls mit anderen Zellen der Haut kombiniert sind, wie zum Beispiel mit Melanocyten und/oder Langerhans-Zellen, die auf einem Träger abgeschieden sind, oft einem Dermis-Äquivalent, und die unter Bedingungen kultiviert werden, wie sie bei einem Programm zur Differenzierung angewandt werden, das auf die Erzeugung eines Äquivalents der Epidermis hinausläuft.
Bisher beschriebene Äquivalente der Dermis sind entweder künstliche Membranen, wie z. B. Filter der Marke Millipore, Substitute der Unterhaut auf der Basis von Collagen, eines Kunststoffs oder eines beliebigen anderen Trägers, der mit der Lebensfähigkeit der Zellen verträglich ist, komplizierter ausgearbeitete Träger, um sie der natürlichen Dermis ähnlicher zu machen, wie etwa zuvor von der Epidermis befreite Dermis oder gemischte Collagen-/Fibroblasten-Gerüste.
Bei den gemischten Collagen-/Fibroblasten-Gerüsten führt die Kombination von nativem Collagen mit isolierten menschlichen Fibroblasten zur Erzielung eines Äquivalents der Dermis, das eine Dermis nachbildet, die noch keiner Zeiteinwirkung unterlag.
Bei den zur Herstellung der genannten Gerüste angewandten Protokollen wird Collagen verwendet, das allgemein von jungen Geweben stammt, also ein Collagen, das doch bereits erhebliche posttranslationale Modifizierungen durchmachte, die bei den komplexen, aber dennoch normalen Prozessen seiner Biosynthese vorkommen, das aber alle diejenigen Modifizierungen, die insbesondere im Laufe des Alterns vorkommen können, nicht durchgemacht hat.
Man weiß insbesondere, dass im Verlauf des Alterns sowie im Verlauf bestimmter Erkrankungen wie Diabetes nicht-enzymatische Prozesse ablaufen, bei denen eine Ose (Glucose oder Ribose) beteiligt ist, die in einer Maillard-Reaktion mit einer Aminogruppe (zum Beispiel einem Lysin-Rest) des Collagens reagiert und eine Schiffsche Base bildet. Diese kann, nach einer Molekülumlagerung, die als Amadori-Umlagerung bezeichnet wird, durch eine Abfolge von Reaktionen zu einer intramolekularen Brückenbildung führen, beispielsweise vom Pentosidin-Typ. Dieses Phänomen, das als Glycation des Collagens bezeichnet wird, nimmt regelmäßig mit dem Alter zu und führt zu einer regelmäßigen Erhöhung des Gehaltes der Haut an Glycationsprodukten. Diese Glycationsprodukte sind zum Beispiel Pyrralin, Carboxymethyllysin, Pentosidin, Crosslines, N^ε-(2-Carboxyethyl)-lysin (CEL), Glyoxal-Lysin-Dimer (GOLD), Methylglyoxal-Lysin-Dimer (MOLD), 3DG-ARG-Imidazolon, die Vesperlysine A, B und C, Threosidin oder auch die Endprodukte der fortgeschrittenen Glycosylierung (advanced glycosylation end products oder AGEs). Reiser, M., et al. (Journal of Biochemistry, Band 267, Nr. 4, 1992, Seiten 24207–24216) wiesen insbesondere das Vorliegen von bevorzugten Glycationsstellen an den Collagenketten nach, die im Laufe der Alterung erhalten bleiben.
Dieses Phänomen ist bei bestimmten Erkrankungen wie beispielsweise Diabetes verstärkt.
Ohne irgendeine Theorie der Alterung der Haut einzuführen, ist festzustellen, dass weitere Eigenschaften, die ebenfalls eine Konsequenz dieser Phänomene der Glycation sein könnten, im Verlauf der Alterung der Haut nachgewiesen werden konnten, wie etwa eine Verringerung der Wärme-Denaturierung, eine Erhöhung der Beständigkeit gegen enzymatischen Abbau und eine Erhöhung der intermolekularen Verbrückungen (Tanaka, S., et col., 1988, J. Mol. Biol. 203, 495–505; Takahashi, M., et col., 1995 Analytical Biochemistry, 232, 158–162). Darüber hinaus konnten Modifizierungen nachgewiesen werden, die durch die Glycation bestimmter Bestandteile der Basalmembran, wie etwa des Collagens IV, des Laminins und des Fibronectins, bedingt sind (Tarsio, JF., et col., 1985, Diabetes, 34, 477–484; Tarsio, JE., et col., 1988, Diabetes, 37, 532–539; Sternberg, M., et col., 1995, C. R. Soc. Biol., 189, 967–985).
Es wird so verständlich, dass im Laufe der Alterung der Haut eine Modifizierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Collagens auftritt und das Collagen schwieriger löslich und schwieriger abbaubar wird.
Somit scheint das glykierte Collagen einer der Bestandteile der Altershaut zu sein.
Es ist sehr gut bekannt, dass die Haut aus einer engen Verbindung zwischen mindestens zwei Compartimenten resultiert, aus denen sie aufgebaut ist, nämlich der Epidermis und der Dermis. Die Wechselwirkungen zwischen der Dermis und der Epidermis sind so, dass vernünftigerweise angenommen werden kann, dass eine Modifizierung des einen Konsequenzen auf das andere haben kann. Es ist zu vermuten, dass die Alterung der Dermis, insbesondere mit ihren Phänomenen der Glycation, nur Konsequenzen für die Epidermis haben kann, mit der sie verbunden ist. So kann im Laufe der Hautalterung die Glycation des Collagens Modifizierungen der Epidermis zur Folge haben, die notwendigerweise an der Alterung der Epidermis teilhaben.
Diesbezüglich konnte von der Anmelderin nunmehr gezeigt werden, dass ein Protein, das einen Bestandteil der normalen Epidermis darstellt, nämlich das Integrin vom Typ β1, das ein Rezeptor der extrazellulären Matrix ist (vgl. Ruoslahti, E., 1991, Cell Biology of Extracellular Matrix, Plenum Press New York, 343363) in der gealterten Epidermis eine Verteilung seiner Expression aufweist, die sich von ihrer Expressionsverteilung in einer jungen Epidermis sehr unterscheidet. Wenn dieses Protein in einer jungen Epidermis, das heißt im Sinne der Anmelderin in einer Epidermis einer jungen Person, in den sehr tiefen Schichten der Epidermis, das heißt maximal bis zur zweiten suprabasalen Schicht, exprimiert wird, ist dies in der Tat in einer gealterten Epidermis, d. h. im Sinne der Anmelderin in einer Epidermis einer alten Person, vollkommen anders, da dort dieses Protein in den meisten Schichten der Epidermis bis hin zu den letzten suprabasalen Schichten unter der Hornschicht exprimiert wird.
Bis jetzt ist kein Modell einer in vitro rekonstruierten Haut in der Lage, entweder wegen der angewandten Präparationsprotokolle oder aufgrund der einfachen Tatsache, dass es, wenn es einmal rekonstituiert ist, keiner Modifizierung unterliegt, ein Äquivalent der Haut zu liefern, bei dem mindestens einer der Bestandteile eine der Komponenten der Hautalterung darstellt. So weist kein Modell einer in vitro rekonstruierten Haut die Eigenschaften einer Altershaut auf, und kein Modell erlaubt die Untersuchung der Prozesse, die dazu führen, und auch nicht die Untersuchung von Verbindungen und/oder Zusammensetzungen, die zumindest eine Verlangsamung dieses Prozesses oder dieser Prozesse erlaubten. Die einzigen bekannten Untersuchungen dieser Phänomene beruhen auf Untersuchungen in vivo entweder am Tier oder am Menschen. Ganz besonders aus ethischen Gründen wird das Interesse verständlich, über ein solches Modell zu verfügen.
Untersuchungen zur Glycation sind im Stand der Technik bekannt. So ist zum Beispiel ein Verfahren zum Erhalt eines Äquivalents von Bindegewebe in Form eines Gerüsts von glykiertem Collagen und Fibroblasten bekannt (vgl. hierzu Frey et col., 1992, C. R. Soc. Biol., 187, 223–231). Allerdings haben Frey et col. niemals untersucht und auch keinen Hinweis darauf gegeben, dass es möglich sein könnte, aus ihrem Gerüst ein Äquivalent der Haut herzustellen; darüber hinaus wurde es von ihnen auch nie mit irgendeinem Dermis-Äquivalent verglichen. Ferner ist auch bei aller Anerkennung der Gültigkeit des Bindegewebsmodells von Frey et col. sehr wohl festzustellen, dass das von diesen Autoren angewandte Protokoll nicht zu den Zielsetzungen führen kann, die sich die Anmelderin gesetzt hat, das heißt, eine Haut in vitro zu reproduzieren und damit als Konsequenz eine Epidermis und eine Dermis zu reproduzieren, die sämtliche Eigenschaften oder einen Teil der Eigenschaften einer Altershaut aufweisen. Durch Inkubieren von Collagen und Zucker während 9 Tagen bei einer Temperatur von 4°C initiierten Frey et col. die Reaktion der Glycation von Collagen, eine Reaktion, die sich dann in dem Gerüst fortsetzt, in dem das Collagen so vorglykiert wurde. Wenn man einen ausreichenden Glycationsgrad erzielen möchte, um eine Altershaut nachzubilden, ist es aber erforderlich, die Glycationsreaktion in dem so erzeugten Gerüst weiter ablaufen zu lassen, das heißt im Verlauf der Kontraktion während einer weiteren Zeit, die ausreicht, um den angestrebten Reaktionsgrad zu erzielen. Fachleute wissen, dass zur Erzielung eines Äquivalents der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält, auf einem Äquivalent der Dermis vom Typ eines Collagen-/Fibroblasten-Gerüsts das Einsäen der Keratinocyten auf einem Gerüst erfolgen muss, das ein Stadium einer festgelegten Kontraktion nicht überschritten haben darf. Daraus folgt daher, dass es nicht möglich ist, nach dem Protokoll von Frey ein Äquivalent der Dermis zu erhalten, das eine alte, sogar sehr alte, das heißt, eine stark oder sogar sehr stark glykierte Dermis nachbildet.
Somit wurde nach Kenntnis der Anmelderin bisher noch keine Herstellung eines Haut-Äquivalents beschrieben, das ein Äquivalent der Epidermis aufweist, das auf einem Äquivalent einer gealterten Dermis erhalten ist, insbesondere auf einem Gerüst, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält.
Ferner wird das große Interesse daran verständlich, über ein Modell einer rekonstruierten Haut zu verfügen, bei dem mindestens einer der Bestandteile einen der Aspekte einer Altershaut aufweist.
Die Anmelderin, die sich seit langem mit der Realisierung von Modellen in vitro rekonstruierter Haut beschäftigt, hat ein neues Modell einer rekonstruierten Haut entwickelt, das ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent der Dermis enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass das Äquivalent der Dermis ein Äquivalent der Alters-Dermis umfasst, insbesondere ein Gerüst, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält.
Daher ist ein erster Gegenstand der Erfindung ein neues Äquivalent der Alters-Dermis, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten aufweist und erhältlich ist durch ein Verfahren zur Herstellung eines Äquivalents der Altershaut, das ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent der Alters-Dermis umfasst, die ein Gerüst aufweist, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt ein Gerüst hergestellt wird, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, wobei das Collagen ein Gemisch aus vorglykiertem Collagen und nichtglykiertem Collagen ist und vor der Erzeugung des Gerüsts glykiert wird, und dadurch, dass in einem zweiten Schritt auf dem im ersten Schritt erhaltenen Gerüst ein Äquivalent der Epidermis aufgebaut wird, das zumindest Keratinocyten enthält, wobei das Äquivalent der Alters-Dermis einen Glycationsgrad von 2 bis 30 aufweist.
Im Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Überwachung der Bildung von Produkten der Glycation beschrieben. Diesbezüglich können zum Beispiel die Methoden genannt werden, die beschrieben wurden von Cefalu, W. T., et col. (Journal of Gerontology; Biological Sciences, 1995, Band 50 A, Nr. 6, 13337–13341), Sell., D. R. (Diabetes/Metabolism, 1991, Band 7, Nr. 4, 239–251), Miyata, T., et col. (Journal of the American Society of Nephrology, 1996, Band 7, Nr. 8, 1198–1206), oder von Furth, A. J. (Analytical Biochemistry, 1991, 192, 109–111). Es ist somit möglich, den Mengenanteil der am Collagen gebundenen glykierenden Verbindung und/oder die Menge der nach der Reaktion verbleibenden glykierenden Verbindung zu messen. Wie oben beschrieben wurde, führt die Glycation des Collagens zur Bildung von Glycationsprodukten wie beispielsweise von Pyrralin, Carboxymethyllysin, Pentosidin, Crosslines, N^ε-(2-Carboxyethyl)-lysin (CEL), Glyoxal-Lysin-Dimer (GOLD), Methylglyoxal-Lysin-Dimer (MOLD), 3DG-ARG-Imidazolon, Vesperlysinen A, B und C, Threosidin oder auch von Endprodukten der fortgeschrittenen Glycosylierung (advanced glycosylation end products oder AGEs). Bestimmte dieser Glycationsprodukte weisen die Besonderheit auf, dass sie nach Anregung eine messbare Fluoreszenz emittieren. So emittiert zum Beispiel Pentosidin nach Anregung mit einer Wellenlänge (λex) von 328 nm eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge (λem) von 378 nm. Ebenso emittieren die AGEs nach Anregung mit einer Wellenlänge (λex) von 370 nm eine Fluoreszenz bei einer Wellenlänge (λem) von 440 nm. Das Verhältnis der von einem gegebenen Glycationsprodukt im Dermis-Äquivalent, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, emittierten Fluoreszenz zu der Fluoreszenz, die vom gleichen Glycationsprodukt in einem Vergleichs-Dermis-Äquivalent, das mindestens nicht-glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, emittiert wird, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen gemessen wird, erlaubt die Charakterisierung des Glycationsgrades des Äquivalents der Alters-Dermis.
Gemäß der Erfindung wird insbesondere die Fluoreszenz von Pentosidin und/oder die Fluoreszenz der AGEs sowohl in einem Äquivalent der Alters-Dermis, das glykiertes Collagen enthält, als auch in einem Vergleichs-Äquivalent gemessen, das nicht-glykiertes Collagen enthält.
Gemäß der Erfindung weist das Äquivalent der Alters-Dermis so einen Glycationsgrad von 2 bis 30 und insbesondere von 8 bis 18 auf.
Gemäß der Erfindung kann das Collagen von beliebigem Typ und beliebigen Ursprungs sein. Diesbezüglich kann auf die verschiedenen Typen von Collagen Bezug genommen werden, die in den Artikeln von Van der Rest und Garonne in Biochem., Band 72, 1990, 473–484, oder in Faseb Journal, Band 5, 1991, 2814–2823, angegeben sind. Gemäß der Erfindung wird das Collagen somit vorzugsweise unter den fibrillären Collagenen vom Typ I, III oder V ausgewählt.
Gemäß der Erfindung wird vorzugsweise Collagen tierischen Ursprungs verwendet, insbesondere Collagen, das vom Rind stammt. Das gemäß der Erfindung bevorzugt verwendete Collagen ist Collagen vom Typ I. Gemäß der Erfindung besonders bevorzugt wird Rinder-Collagen vom Typ I eingesetzt.
Gemäß der Erfindung kann selbstverständlich auch ein Gemisch von Collagenen verschiedener Typen in beliebigem Mengenverhältnis und/oder von unterschiedlicher Herkunft Verwendung finden.
Gemäß der Erfindung können die Fibroblasten aus beliebiger Quelle stammen, sind jedoch bevorzugt Fibroblasten menschlichen Ursprungs. Sie können nach einer beliebigen, im Stand der Technik bekannten Methode präpariert werden, beispielsweise durch mechanische und/oder enzymatische Dissoziation der Makromoleküle der extrazellulären Matrix der Dermis oder durch Wachsenlassen von Fibroblasten ausgehend von Explantaten.
Das Äquivalent der Dermis gemäß der Erfindung enthält mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten, kann jedoch auch einen beliebigen weiteren Bestandteil enthalten, dessen Einführung von Interesse sein könnte, wie zum Beispiel Endothelzellen, Makrophagen oder auch Nervenzellen.
Ein zweiter Gegenstand der Erfindung ist ein Äquivalent der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass es erhältlich ist durch Einsäen zumindest von Keratinocyten auf ein wie oben definiertes Äquivalent der Alters-Dermis, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält und in den Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten Integrin β1 exprimiert.
Aus dem vorstehenden Text ist ersichtlich, dass bestimmte Marker der Epidermis in Abhängigkeit vom Alter hinsichtlich ihrer Menge oder auch hinsichtlich der Lokalisation ihrer Expression Modifizierungen unterliegen können. So wurde von der Anmelderin insbesondere gezeigt, dass die Expression von Integrin β1 in der Epidermis in Abhängigkeit vom Alter der Epidermis in seiner Lokalisation modifiziert ist. Während dieses Protein in einer jungen Epidermis strikt in höchstens den beiden ersten suprabasalen Schichten exprimiert wird, tritt mit dem Altern diese Expression, unter Aufrechterhaltung ihrer Lokalisation in den beiden ersten suprabasalen Schichten, in immer höheren Schichten auf, bis sie in der Gesamtheit der suprabasalen Schichten einschließlich der letzten Schichten, die dem Stratum corneum benachbart sind, auftritt.
Das Äquivalent der Epidermis ist somit gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es eine modifizierte Expression von Integrin β1 aufweist, insbesondere eine Expression von Integrin β1 in den Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten.
Gemäß der Erfindung besonders bevorzugt ist das Äquivalent der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es eine modifizierte Expression von Integrin β1 aufweist, insbesondere eine Expression von Integrin β1 in den Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten, sowie dadurch, dass es durch Einsäen zumindest von Keratinocyten auf ein Äquivalent der Dermis erhalten ist, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält.
Zur Charakterisierung der Epidermis der Erfindung kann selbstverständlich jedes Verfahren Verwendung finden, das den Nachweis der Expression von Integrin β1 erlaubt. Als Beispiel hierfür kann die Markierung mit Hilfe von Anti-Integrin β1-Antikörpern genannt werden.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Keratinocyten können aus beliebigen Quellen stammen, sind jedoch bevorzugt Keratinocyten menschlichen Ursprungs. Sie können nach einem beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Hierzu kann zum Beispiel die Kultivierung ausgehend von dissoziierter Epidermis, die aus entnommener normaler Haut stammt, oder die Kultivierung von Keratinocyten, die aus der Haarfollikelscheide stammen, genannt werden.
Vorzugsweise werden gemäß der Erfindung Keratinocyten von normaler menschlicher Haut verwendet.
Gemäß der Erfindung werden die verwendeten Keratinocyten bevorzugt aus dissoziierter menschlicher Epidermis, die aus entnommener normaler menschlicher Haut stammt, nach dem Verfahren hergestellt, das beschrieben ist in Régnier et col., Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4–35 (Karger, Basel 1981).
Das Äquivalent der Epidermis der Erfindung enthält zumindest Keratinocyten, kann jedoch auch einen beliebigen anderen Typ von Zellen enthalten, die darin eingebracht werden können, wie zum Beispiel Langerhans-Zellen und/oder Vorläufer von Langerhans-Zellen und/oder Melanocyten.
Es ist festzuhalten, dass das Haut-Äquivalent, das die größte Ähnlichkeit mit normaler Haut aufweist, das Haut-Äquivalent ist, das die drei wesentlichen Zelltypen enthält, die in der normalen Haut vorliegen.
So enthält das Modell rekonstruierter Haut gemäß der Erfindung vorteilhaft ferner Melanocyten und/oder Langerhans-Zellen und/oder Vorläufer von Langerhans-Zellen.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Melanocyten können aus einem beliebigen Organ isoliert werden, in dem sie enthalten sind, wie zum Beispiel aus normaler Haut oder dem Haarfollikel.
Vorzugsweise werden Melanocyten verwendet, die aus normaler Haut isoliert wurden.
Gemäß der Erfindung kann ein beliebiges Verfahren zur Präparation der Melanocyten verwendet werden, das im Stand der Technik bekannt ist. Hier kann beispielsweise das Verfahren genannt werden, das in Olsson et col., Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226–268, beschrieben ist.
Die Langerhans-Zellen und/oder die Vorläufer von Langerhans-Zellen, die gemäß der Erfindung verwendbar sind, können Zellen sein, wie sie von der Anmelderin in ihrer unter EP-A-789 074 veröffentlichten europäischen Patentanmeldung beschrieben sind.
Ein dritter Gegenstand der Erfindung ist ein Äquivalent der Altershaut, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mindestens ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent der Alters-Dermis umfasst.
Ein Äquivalent der Altershaut, das gemäß der Erfindung sehr bevorzugt ist, umfasst ein Äquivalent der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält und eine modifizerte Expression von Integrin β1 aufweist, insbesondere eine Expression von Integrin β1 in den Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten, und ist dadurch gekennzeichnet, dass es erhältlich ist durch Einsäen zumindest von Keratinocyten auf ein Äquivalent der Alters-Dermis, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, wobei das Äquivalent der Alters-Dermis einen Glycationsgrad von 2 bis 30 und insbesondere von 8 bis 18 aufweist.
Ein vierter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Äquivalents der Altershaut, das ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent der Dermis umfasst, das seinerseits ein Gerüst aufweist, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten aufweist, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem ersten Schritt ein Gerüst hergestellt wird, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, wobei das Collagen ein Gemisch aus vorglykiertem Collagen und nichtglykiertem Collagen ist und vor der Erzeugung des Gerüsts glykiert wird, und in einem zweiten Schritt auf dem im ersten Schritt erhaltenen Gerüst ein Äquivalent der Epidermis aufgebaut wird, das zumindest Keratinocyten enthält.
Der erste Schritt kann nach einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, sofern nur das verwendete Collagen vorab glykiert werden kann.
Gemäß der Erfindung wird das Gerüst unter Verwendung eines zuvor glykierten Collagens hergestellt.
Gemäß der Erfindung wird das Gerüst bevorzugt nach dem Verfahren hergestellt, das von Asselineau et col., 1987 (Models in Dermato., Band III, Hrsg. Lowe & Maibach, 1–7) beschrieben wurde, wobei zuvor glykiertes Collagen eingesetzt wird.
Zur Herstellung des glykierten Collagens kann ein beliebiges bekanntes Glycationsverfahren herangezogen werden. Hierzu sind zum Beispiel die Verfahren zu nennen, die beschrieben wurden von Tanaka et col. (J. Mol. Biol., 1988, 203, 495–505), Tarsio, JF., et col. (1985, Diabetes, 34, 477–484), Tarsio, JF., et col. (1988, Diabetes, 37, 532–539) oder Frey, J., et col. (1992, C. R. Soc. Biol., 187, 223–231).
Die Glycation kann gemäß der Erfindung vorzugsweise durch Inkontaktbringen einer Lösung mindestens eines Collagens mit einer Lösung mindestens eines Glycationsmittels erhalten werden, um so die Glycationsreaktion des Collagens in vitro bei Abwesenheit von Zellen zu induzieren.
Wie oben angegeben, kann das verwendete Collagen ein beliebiger Typ von Collagen beliebigen Ursprungs sein und allein oder in einem Gemisch vorliegen.
Gemäß der Erfindung wird vorzugsweise Collagen tierischen Ursprungs verwendet, insbesondere Collagen vom Rind. Das gemäß der Erfindung bevorzugt verwendete Collagen ist Collagen vom Typ I. Gemäß der Erfindung besonders bevorzugt wird Collagen vom Typ I vom Rind verwendet.
Die Lösung des Collagens kann eine Konzentration von 2 bis 6 mg/ml und bevorzugt von 3 bis 5 mg/ml aufweisen.
Das Glycationsmittel kann ein beliebiges Mittel sein, das die Glycation erlaubt, das heißt, das befähigt ist, nach der Maillard-Reaktion mit einer Aminogruppe des Collagens unter Bildung einer Schiffschen Base zu reagieren. Diesbezüglich können zum Beispiel bestimmte Zwischenprodukte der Maillard-Reaktion genannt werden, wie zum Beispiel Glucoson, 3-Desoxyglucoson, Glyoxal, Methylglyoxal oder auch die Zucker.
Gemäß der Erfindung ist jeder Zuckertyp verwendbar, unabhängig davon, ob er in monomerer Form oder in polymerer Form vorliegt. Gemäß der Erfindung wird bevorzugt ein monomerer Zucker verwendet.
Unter Zuckern werden gemäß der Erfindung Produkte verstanden, die mehrere Alkoholfunktionen zusammen mit mindestens einer Aldehydfunktion besitzen. Hierzu sind insbesondere die Osen zu nennen.
Von den gemäß der Erfindung verwendbaren Zuckern sind, unter anderen, Ribose, Fructose oder Glucose zu nennen. Gemäß der Erfindung wird bevorzugt Ribose oder Glucose verwendet.
Der Zucker kann in rechtsdrehender oder linksdrehender Konformation vorliegen. Gemäß der Erfindung wird bevorzugt ein Zucker in rechtsdrehender Konformation eingesetzt.
Gemäß der Erfindung wird insbesondere D-Fructose, D-Ribose oder D-Glucose verwendet. Bevorzugt wird D-Ribose oder D-Glucose verwendet.
Selbstverständlich kann das Glycationsmittel allein oder in Form eines Gemisches eingesetzt werden.
Die Menge an Glycationsmittel, die gemäß der Erfindung einzusetzen ist, muss ausreichend sein, um die Auslösung der nicht-enzymatischen Reaktionen zu erlauben, die zur Bildung der Schiffschen Base führen. Es ist klar, dass es die Variation dieser Menge erlaubt, ein Endprodukt, also das glykierte Collagen, zu erhalten, dessen Glycationsgrad von einer sehr geringen Glycation bis zu einer sehr hohen Glycation variiert. Dementsprechend kann die Menge des Glycationsmittels im Bereich von 0,5 bis 20 Gew.-% und bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenlösung, liegen.
Die Glycationsreaktion erfolgt bei einer Temperatur in der Nähe der Umgebungstemperatur. So erfolgt die Reaktion bei einer Temperatur. im Bereich von 15 bis 30°C und bevorzugt von 20 bis 25°C. Die Dauer der Glycationsreaktion hängt vom angestrebten Glycationsgrad ab. Es ist klar, dass der Glycationsgrad umso höher ist, je länger die Reaktionsdauer ist. Dementsprechend liegt die Dauer der Glycationsreaktion im Bereich von 15 Tagen bis 2 Monaten und bevorzugt im Bereich von 25 bis 35 Tagen.
Wenn die Wahl getroffen wird, die Glycation vor der Erzeugung des Gerüsts durchzuführen, ist es möglich, mit dem glykierten Collagen alle nachfolgenden Stufen durchzuführen, die zur Erzielung eines Produkts mit höchstmöglicher Reinheit erforderlich sind. So ist es möglich, zu versuchen, jede Spur des Glycationsmittels, das im Verlauf der Reaktion nicht reagierte, zu eliminieren. Hierfür kann jedes bekannte Verfahren herangezogen werden. So kann beispielsweise die Lösung des vorher glykierten Collagens einer Reihe von Dialysen gegen Wasser und/oder Essigsäure unterzogen werden.
Nach einer Variante der Erfindung kann die erhaltene Lösung des ”vorglykierten” Collagens vor der Verwendung zur Herstellung des Dermis-Äquivalents mit nativem Collagen gemischt werden. In diesem Fall kann das Verhältnis von glykiertem Collagen zu nichtglykiertem Collagen im Bereich von 25 bis 75 und bevorzugt im Bereich von 45 bis 55 liegen. Die Variation dieses Verhältnisses erlaubt eine Modulation des Glycationsgrades des Gerüsts.
Gemäß der Erfindung wird ein Gemisch von glykiertem Collagen und nicht-glykiertem Collagen verwendet, noch bevorzugter ein Gemisch von glykiertem Collagen und nicht-glykiertem Collagen im Verhältnis 50/50.
Die zweite Stufe des Verfahrens der Erfindung kann nach einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
In dieser Hinsicht können beispielsweise die Verfahren genannt werden, die beschrieben sind in den Patentanmeldungen EP-A-285 471 , EP-A-285 474 , EP-A-789 074 , EP-A-502 172 , EP-A-418 035 , WO-A-9116010 , EP-A-197 090 , EP-A-20 753 , FR-A-2 665 175 und FR-A-2 689 904 oder auch von Asselineau et col. in Exp. Cel. Res., 1985, 536–539, sowie in Models in Dermato., Band III, 1987, Hrsg. Lowe & Maibach, 1–7.
Gemäß der Erfindung wird bevorzugt die von Asselineau et col. beschriebene Verfahrensweise angewandt.
Die gemäß der Erfindung verwendeten Keratinocyten können aus beliebigen Quellen stammen, sind jedoch bevorzugt Keratinocyten menschlichen Ursprungs. Sie können nach einem beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Hierzu kann zum Beispiel die Kultivierung ausgehend von dissoziierter Epidermis, die aus entnommener normaler Haut stammt, oder die Kultivierung von Keratinocyten, die aus der Haarfollikelscheide stammen, genannt werden.
Gemäß der Erfindung werden die verwendeten Keratinocyten bevorzugt aus dissoziierter menschlicher Epidermis, die aus entnommener normaler menschlicher Haut stammt, nach dem Verfahren hergestellt, das beschrieben ist in Régnier et col., Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4–35 (Karger, Basel 1981).
Nach dem Einsäen der Keratinocyten auf den Träger kann die Kultur vorteilhaft in ein Nährmedium eingetaucht gehalten werden, bei dem es sich zum Beispiel um das von Rheinwald und Green, 1975 (Cell, 6, (3), 317–330) beschriebene Medium handelt, das die Vermehrung der Keratinocyten erlaubt (im Text auch als Medium 3F bezeichnet).
Nach einer Inkubationszeit von 3 bis 15 Tagen und vorzugsweise 7 bis 9 Tagen wird das Haut-Äquivalent an der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten, zum Beispiel durch Auflegen auf ein Metallgitter. Die Flüssigkeit besteht dann vorzugsweise aus dem gleichen Nährmedium wie zuvor.
Die Inkubation wird dann durchgeführt, bis ein Äquivalent der Haut erhalten wird, das die Eigenschaften einer Haut aufweist, das heißt, den Träger, auf dem sich ein Äquivalent der Epidermis befindet, das die vier Typen von klassischen Zellschichten aufweist, nämlich die Basalschicht, die Suprabasalschicht, die Körnerschicht und die Hornschicht.
Die Inkubation erfolgt so während einer Dauer von 5 bis 30 Tagen und bevorzugt von 7 bis 10 Tagen.
Das so realisierte Modell der rekonstruierten Haut umfasst zwei Einheiten, den Träger und das Äquivalent der Epidermis, die physikalisch voneinander getrennt werden können.
Das Äquivalent der Epidermis kann dann getrennt vom Träger verwendet werden.
Aus dem obigen Text geht hervor, dass bisher kein Modell in vitro rekonstruierter Haut die Eigenschaften einer Altershaut aufweist und die Untersuchung der Prozesse, die dazu führen, erlaubt, und auch nicht die Untersuchung der Verbindungen und/oder Zusammensetzungen, die zumindest eine Modifizierung des Prozesses erlauben. Das gemäß der Erfindung erhaltene Äquivalent der Haut löst diese Probleme, da es mindestens eine der Eigenschaften der Altershaut aufweist, nämlich ein glykiertes Collagen. Diese wichtige Eigenschaft, die bei dem Modell und seinem Herstellungsverfahren in jedem Verhältnis variiert werden kann, erlaubt die Untersuchung des Phänomens der Glycation selbst sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) dieses Phänomens, die Untersuchung von mit der Altershaut in Verbindung stehenden Phänomenen wie zum Beispiel die Falten, die Untersuchung von Modulatoren (isolierte Verbindungen und/oder Zusammensetzungen) des Auftretens von Falten (insbesondere Inhibitoren), die Untersuchung der Lichtalterung und der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Haut sowie von Modulatoren dieser Wirkungen (Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zum Schutz, Filter, etc.), die Untersuchung des Einflusses der Glycation auf die Bestandteile der Haut (Körperhaare und/oder Kopfhaare, Blutgefäße, Nervenfasern, etc.) sowie auf therapeutischem Gebiet die Untersuchung von durch Diabetes hervorgerufenen Komplikationen über die Glycation.
Die Erfindung betrifft somit ferner auch die In-vitro-Verwendung eines Äquivalents der Altershaut und/oder der Alters-Dermis und/oder eines Äquivalents der Alters-Epidermis, wie oben beschrieben, zur Untersuchung des Phänomens der Glycation selbst sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) dieses Phänomens, zur Untersuchung der mit der Altershaut und/oder Alters-Epidermis in Verbindung stehenden Phänomene wie zum Beispiel Falten, zur Untersuchung von Modulatoren (isolierte Verbindungen und/oder Zusammensetzungen) des Auftretens von Falten (insbesondere Inhibitoren), zur Untersuchung der Lichtalterung und der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Haut und/oder die Dermis und/oder die Epidermis sowie von Modulatoren dieser Wirkungen (Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zum Schutz, Filter, etc.), zur Untersuchung des Einflusses der Glycation auf die Bestandteile der Haut und/oder der Dermis und/oder der Epidermis (Körperhaare und/oder Kopfhaare, Blutgefäße, Nervenfasern, etc.) sowie auf therapeutischem Gebiet zur Untersuchung von durch Diabetes hervorgerufenen Komplikationen über die Glycation.
Es wurde ferner gezeigt, dass gemäß der Erfindung das auf dem Äquivalent der Dermis, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, rekonstruierte Äquivalent der Epidermis eine modifizierte Verteilung der Expression von Integrin β1 aufweisen kann. Wenn in diesem Fall die Variation der Verteilung dieses Markers mit dem Alter der Epidermis verknüpft ist, kann in Betracht gezogen werden, das Äquivalent der Altershaut gemäß der Erfindung zur Bewertung von Produkten zu verwenden, die sich zur Behandlung der Altershaut eignen, indem ihre Wirkung durch diejenige Wirkung gemessen wird, die hinsichtlich der Modifizierung der Verteilung der Expression von Integrin β1 im Äquivalent der Epidermis auftritt.
erlaubt eine bessere Veranschaulichung der Erfindung, ohne jedoch ihren Umfang einzuschränken. In dieser Abbildung zeigen die Photos Schnitte durch Äquivalente der Haut nach Immunmarkierung mit einem Anti-Integrin β1-Antikörper. Photo 1 zeigt die Immunmarkierung eines Äquivalents der Haut, das ein rekonstruiertes Äquivalent der Epidermis auf einem Äquivalent der Dermis zeigt, das mit nicht-glykiertem Collagen hergestellt wurde. Photo 2 zeigt die Immunmarkierung eines Äquivalents der Haut, das ein rekonstruiertes Äquivalent der Epidermis auf einem Äquivalent der Dermis zeigt, das mit gemäß der Erfindung glykiertem Collagen hergestellt wurde.
Im Folgenden werden Beispiele angegeben, welche die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele:
Medien und Puffer: Wenn nichts Anderes angegeben ist, sind sämtliche in den Beispielen verwendeten Medien und Puffer beschrieben in Bell et col., 1979 (PNAS USA, 76, 1274–1278), Asselineau und Prunieras, 1984 (British Journal of Derm., 111, 219–222) oder Asselineau et col., 1987 (Models in Dermato., Band III, Hrsg. Lowe & Maibach, 1–7).
Beispiel 1: Herstellung von glykiertem Rindercollagen Typ I:
In ein 50 ml-Falcon-Röhrchen werden 10 ml einer Lösung von Rindercollagen Typ I einer Konzentration von 3 mg/ml, 0,8 ml 0,5 N Natriumhydroxidlösung zur Neutralisation der sauren Collagenlösung und 100 μl einer 1M Lösung von D-Ribose in Wasser gegeben. Das für Licht opak gemachte Röhrchen wird waagrecht angeordnet und bei Umgebungstemperatur (25°C) 1 Monat mäßig bewegt. Am Ende der ”Vorglycation” wird die Lösung in einen Dialyseschlauch gegeben (Spectra/Poly labo 32 mm n° 132655/85716) und einer Reihe aufeinanderfolgender Dialysen unterzogen:
24 h gegen entmineralisiertes Wasser bei 4°C zur Abtrennung des nichtgebundenen Zuckers oder von Abbauprodukten des Collagens;
7 Tage gegen 0,5 N Essigsäure, um das Collagen wieder in Lösung zu bringen, in 2 Bädern von dreieinhalb Tagen;
3 × 24 h gegen 0,017 N Essigsäure mit täglichem Badwechsel.
Nach der letzten Dialyse wird der Inhalt des Dialyseschlauchs in einem sterilen Becherglas aufgefangen, und die Lösung wird in ein steriles, gegen Licht opak gemachtes 50 ml-Falcon-Röhrchen übertragen.
Die Lösung des ”vorglykierten” Collagens ist dann anwendungsfertig. Sie kann bei 4°C aufbewahrt werden.
Beispiel 2: Herstellung eines Äquivalents der Alters-Dermis:
In ein steriles Falcon-Röhrchen werden 3,22 ml MEM-Medium 1,76 × 0,63 ml fötales Kälberserum, 0,35 ml 0,1 N Natriumhydroxidlösung und 0,20 ml eines Gemischs der Medien MEM/HEPES mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum (MEM/HEPES/FCS10) gegeben. Dann wird 0,5 ml MEM/HEPES/FCS10-Medium zugegeben, das von menschlichen Brustplastik-Operationen stammende Fibroblasten in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen auf 0,5 ml Kulturmedium enthält, die zuvor nach dem Verfahren hergestellt worden waren, das beschrieben wurde von Bell et col., 1979 (PNAS USA, 76, 1274–1278), Asselineau und Prunieras, 1984 (British J. of Derm., 111, 219–222) oder Asselineau et col., 1987 (Models in Dermato., Band III, Hrsg. Lowe & Maibach, 1–7).
Dann werden langsam an der Wand des Röhrchens entlang, um das Auftreten einer weißlichen Wolkigkeit zu beobachten, 2 ml eines Gemisches gleicher Volumina von vorglykiertem Collagen von Beispiel 1 und nicht-glykiertem Collagen, das zur Herstellung des vorglykierten Collagens von Beispiel 1 diente, in einer Konzentration von 3 mg/ml in Essigsäure 1/1000 zugegeben. Das Ganze wird dann vorsichtig gemischt und in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm (Typ Falcon 60 mm, Artikel Nr. 1016) gegeben. Die Petrischale wird dann in einen auf 37°C gehaltenen Wärmeschrank gegeben und etwa 2 h 30 min darin belassen. Wenn das Auftreten von 2 Phasen (Gel + Medium) beobachtet wird, wird das Gerüst vorsichtig von seinem Träger getrennt, und das so von seinem Träger getrennte Gerüst wird 4 Tage lang im Wärmeschrank belassen.
Beispiel 3: Messung des Glycationsgrades des Äquivalents der Alters-Dermis von Beispiel 2:
Parallel zur Herstellung des Äquivalents der Alters-Dermis von Beispiel 2 wird ein Äquivalent der Dermis ohne glykiertes Collagen (aber mit nicht-glykiertem Collagen) hergestellt. Dieses Äquivalent dient als Vergleichsmaterial bei der Ermittlung des Glycationsgrades des Äquivalents der glykierten Dermis von Beispiel 2.
2 Gerüste (Alters-Dermis, Vergleichsmaterial), die nach Beispiel 2 hergestellt wurden, werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann getrocknet. Die Gerüste werden dann in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben und bei 37°C in einem Wasserbad über Nacht (12 Stunden) einem Verdau mit Pepsin (Sigma P-6887) bei einer Menge von 500 μg Pepsin pro Gerüst in 0,5 ml 0,5 N Essigsäure unterzogen.
Dann werden in jedes Röhrchen 515 μl 0,5 N Natriumhydroxidlösung gegeben, worauf der Inhalt jedes Röhrchens mit einem Zentrifugenfilter × 0,22 μm (Sigma) filtriert wird.
Dann wird die Fluoreszenz mit einem Spektrofluorimeter der Marke Hitachi, Modell F2000, gemessen.
Auf diese Weise wird nach Anregung bei λex = 328 nm die bei λem = 378 nm von Pentosidin emittierte Fluoreszenz und nach Anregung bei λex = 370 nm die bei λem = 440 nm von den AGEs emittierte Fluoreszenz gemessen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.

Pentosidin AGEs

Vergleichsmaterial 650 430

glykiertes Gerüst 6100 1820
In diesem Beispiel ergibt sich der Glycationsgrad des Äquivalents der Alters-Dermis zu 9,4 für Pentosidin und zu 4 für die AGEs.
Beispiel 4: Herstellung eines Äquivalents der Altershaut:
Ein Äquivalent der Alters-Dermis, wie es in Beispiel 2 hergestellt wurde, wird gut ausgebreitet in einer Kulturschale vom Typ Corning mit einem Durchmesser von 60 mm auf einem Tropfen Collagen (0,6 ml) als ”Kleber” befestigt und dann in einem Wärmeschrank 20 bis 30 Minuten auf 37°C gehalten.
Ein steriler Ring aus Stahl wird auf das Gerüst aufgelegt, und 0,5 ml einer Zellsuspension von menschlichen Keratinocyten, die von Brustplastik-Operationen stammten und nach Régnier et col. (Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4–35, Karger, Basel, 1981) hergestellt wurden, werden in einer Konzentration von 100 000 Zellen/ml in MEM-Medium mit 10% FCS + 3F in das Innere des Rings gebracht. Etwa 6 ml Medium (MEM 10% FCS + 3F) werden um den Ring herum gegeben, und die Schale wird für 2 Stunden in einen auf 37°C gehaltenen Wärmeschrank gebracht. Der Ring wird dann weggenommen, und die Schale wird wieder in den Wärmeschrank verbracht.
Nach 8 Tagen wird die Kultur dann an die Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche gebracht, wobei die Flüssigkeit dann aus dem gleichen Medium wie vorher besteht.
Die Kultivierung wird anschließend während 1 Woche bis zur Erzielung eines histologisch zufriedenstellenden Äquivalents der Epidermis fortgesetzt, das heißt, eines Äquivalents der Epidermis, das die klassichen vier Zellschichten aufweist, nämlich die Basalschicht, die Suprabasalschicht, die Körnerschicht und die Hornschicht.
Beispiel 5: Charakterisierung der Expression von Integrin β1 in dem in Beispiel 4 erhaltenen Äquivalent der Epidermis:
Die Expression von Integrin β1 in dem in Beispiel 4 erhaltenen Äquivalent der Epidermis wird nach Immunmarkierung mit einem monoklonalen, gegen Integrin β1 gerichteten Mäuse-Antikörper (Immunotech, Marseille, Frankreich, Cat. 1151) beobachtet:
Nach Einfrieren werden die in Beispiel 4 erhaltenen Haut-Äquivalente mit einem Kryostaten-Mikrotom (Marke/Modell) zu Lamellen von 5 μm Dicke geschnitten. Die Schnitte werden dann zweimal mit PBS gespült, und 25 μl 1/50 verdünnter Anti-Integrin β1-Antikörper (Immunotech, Marseille, Frankreich, Cat. 1151) werden auf jeden Schnitt aufgebracht und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur (25°C) darauf belassen. Die Schnitte werden dann zweimal mit PBS gespült, worauf 25 μl mit FITC konjugierte Antikörper (Rabbit anti mouse FITC, Dako F232) auf jeden Schnitt aufgebracht und bei Umgebungstemperatur (25°C) 30 Minuten darauf belassen werden. Die Schnitte werden dann zweimal mit PBS gespült und nach Montage mit einem Fluoreszenzmikroskop der Marke LEICA, Modell LEITZ DMRB, untersucht.
Die Untersuchung zeigt, dass im Vergleichsmaterial das Integrin β1 in der Basalschicht der auf dem nicht-glykierten Äquivalent der Dermis rekonstruierten Epidermis sowie in ihrer ersten suprabasalen Schicht exprimiert wird ( , Photo 1), während das Integrin β1 in der auf dem Äquivalent der Alters-Dermis rekonstruierten Epidermis in sämtlichen suprabasalen Schichten bis zum Stratum corneum exprimiert wird ( , Photo 2).
Diese Ergebnisse stehen mit der Feststellung in Einklang, dass in vivo die Verteilung der Expression von Integrin β1 in einer Haut einer jungen Person in der Basalschicht und der ersten suprabasalen Schicht und in der Haut einer alten Person in der Basalschicht und in mindestens den drei ersten suprabasalen Schichten vorliegt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Äquivalents der Altershaut, das ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent der Alters-Dermis umfasst, das ein Gerüst aufweist, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass in einem ersten Schritt ein Gerüst hergestellt wird, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, wobei das Collagen ein Gemisch aus vorglykiertem Collagen und nichtglykiertem Collagen ist und vor der Erzeugung des Gerüsts glykiert wird, und dadurch, dass in einem zweiten Schritt auf dem im ersten Schritt erhaltenen Gerüst ein Äquivalent der Epidermis aufgebaut wird, das zumindest Keratinocyten enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycation durch Inkontaktbringen einer Lösung mindestens eines Collagens mit einer Lösung mindestens eines Glycationsmittels in der Weise erzielt wird, dass die Glycation in vitro in Abwesenheit von Zellen induziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen ein Collagen menschlichen oder tierischen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen ein Collagen tierischen Ursprungs ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen ein Rindercollagen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen unter den Collagenen vom Typ I, III oder V ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen ein Collagen vom Typ I ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen ein Rindercollagen vom Typ I ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Collagen in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 6 mg/ml und bevorzugt im Bereich von 3 bis 5 mg/ml vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycationsmittel ein Mittel ist, das die Glycation erlaubt, d. h., das befähigt ist, nach der Maillard-Reaktion mit einer Aminogruppe des Collagens unter Bildung einer Schiffschen Base zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycationsmittel unter Glucoson, 3-Desoxyclucoson, Glyoxal, und Methylglyoxal oder auch Zuckern ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycationsmittel ein Zucker ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Zucker unter den Osen ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Ose unter Ribose, Fructose oder Glucose ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycationsmittel unter Ribose oder Glucose ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Glycationsmittel im Bereich vom 0,5 bis 20 Gew.-% und bevorzugt im Bereich vom 1 bis 10 Gew.-% liegt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenlösung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Glycationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 30°C und bevorzugt im Bereich von 20 bis 25°C vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Dauer der Glycationsreaktion 15 Tage bis 2 Monate und bevorzugt 25 bis 35 Tage beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von glykiertem Collagen zu nichtglykiertem Collagen im Bereich von 25 bis 75 und bevorzugt im Bereich von 45 bis 55 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die gemäß der Erfindung verwendeten Keratinocyten menschlichen Ursprungs sind.
Äquivalent der Alters-Dermis, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 erhältlich ist und mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Glycationsgrad von 2 bis 30 aufweist.
Äquivalent der Alters-Dermis nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Glycationsgrad von 8 bis 18 aufweist.
Äquivalent der Alters-Dermis nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das glykierte Collagen tierischen oder menschlichen Ursprungs ist.
Äquivalent der Alters-Dermis nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das glykierte Collagen tierischen Ursprungs ist.
Äquivalent der Alters-Dermis nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das glykierte Collagen ein Rindercollagen ist.
Äquivalent der Alters-Dermis nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das glykierte Collagen vom Typ I ist.
Äquivalent der Alters-Dermis nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Fibroblasten menschlichen Ursprungs sind.
Äquivalent der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es erhältlich ist durch Einsäen zumindest von Keratinocyten auf ein Äquivalent der Dermis wie in einem der Ansprüche 21 bis 27 definiert, sowie dadurch, dass es in den Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten Integrin β1 exprimiert.
Äquivalent der Epidermis nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinocyten menschlichen Ursprungs sind.
Äquivalent der Epidermis nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner Melanocyten und/oder Langerhans-Zellen und/oder Vorläufer von Langerhans-Zellen aufweist.
Äquivalent der Altershaut, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent der Alters-Dermis wie in einem der Ansprüche 21 bis 27 beschrieben umfasst.
Äquivalent der Altershaut nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Äquivalent der Epidermis wie in einem der Ansprüche 28 bis 30 beschrieben umfasst.
In-vitro-Verwendung eines Äquivalents der Alters-Dermis wie in einem der Ansprüche 21 bis 27 beschrieben zur Herstellung eines Äquivalents der Epidermis und/oder der Altershaut.
In-vitro-Verwendung eines Äquivalents der Alters-Dermis wie in einem der Ansprüche 21 bis 27 beschrieben zur Untersuchung des Phänomens der Glycation selbst sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) dieses Phänomens, zur Untersuchung der Lichtalterung und der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Dermis sowie von Modulatoren dieser Wirkungen (Verbindungen und/oder Zusammensetzung zum Schutz, Filter, etc.) oder zur Untersuchung des Einflusses der Glycation auf die Bestandteile der Dermis.
In-vitro-Verwendung eines Äquivalents der Epidermis wie in einem der Ansprüche 28 bis 30 beschrieben zur Untersuchung des Phänomens der Glycation selbst sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) dieses Phänomens, zur Untersuchung von mit der Alters-Epidermis in Verbindung stehenden Phänomenen wie z. B. Falten, zur Untersuchung von Modulatoren (isolierte Verbindungen und/oder Zusammensetzungen) des Auftretens von Falten (insbesondere Inhibitoren), zur Untersuchung der Lichtalterung und der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Epidermis sowie von Modulatoren dieser Wirkungen (Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zum Schutz, Filter, etc.) oder zur Untersuchung des Einflusses der Glycation auf die Bestandteile der Epidermis und der Hautanhangsgebilde.
In-vitro-Verwendung eines Äquivalents der Altershaut wie in Anspruch 31 oder 32 beschrieben zur Untersuchung des Phänomens der Glycation selbst sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) dieses Phänomens, zur Untersuchung der mit der Altershaut und/oder der Alters-Epidermis in Verbindung stehenden Phänomene wie z. B. Falten, zur Untersuchung von Modulatoren (isolierte Verbindungen und/oder Zusammensetzungen) des Auftretens von Falten (insbesondere Inhibitoren), zur Untersuchung der Lichtalterung und der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Haut und/oder die Dermis und/oder die Epidermis sowie von Modulatoren dieser Wirkungen (Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zum Schutz, Filter, etc.), zur Untersuchung des Einflusses der Glycation auf die Bestandteile und/oder die Anhangsgebilde der Haut und/oder der Dermis und/oder der Epidermis (Körperhaare und/oder Kopfhaare, Blutgefäße, Nervenfasern, etc.) sowie auf therapeutischem Gebiet zur Untersuchung von durch Diabetes hervorgerufenen Komplikationen über die Glycation.