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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Äquivalent der Altershaut, ein
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie das Äquivalent der Epidermis und
das Äquivalent
der Alters-Dermis, die in diesem Äquivalent der Altershaut enthalten
sind, und ihre Verwendung in vitro.
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Seit
vielen Jahren wird versucht, Modelle rekonstruierter Haut zu entwickeln,
die es erlauben, Untersuchungen durchzuführen, die zum besseren Verständnis der
Rolle der Haut sowohl im mechanischen Bereich als auch im physiologischen
Bereich erforderlich sind.
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So
konnten Modelle entwickelt werden, die der menschlichen Haut mehr
oder weniger nahekommen. Als Beispiele hierfür sind die Modelle zu nennen,
die beschrieben sind in den Patentanmeldungen
EP-A-285 471 ,
EP-A-285 474 ,
EP-A-789 074 ,
EP-A-502 172 ,
EP-A-418 035 ,
WO-A-9116010 ,
EP-A-197 090 ,
EP-A-20 753 ,
FR-A-2 665 175 und
FR-A-2 689 904 .
Ferner erstreckten sich Untersuchungen auf die Ermittlung des Allergenpotentials
der Bestandteile eines Äquivalents
der menschlichen Haut (Nemecek, G., et al., Toxicology Pathology,
Band 27, Nr. 1, Januar 1999, Seiten 101-103), auf die Wiederbesiedlung
eines einer Maus implantierten Haut-Äquivalents durch Langerhans-Zellen
(Demarchez, M., et al., Journal of Investigative Dermatology, Band
100, Nr. 5, 1993, Seiten 648-652) und auf die differentielle Expression
von Markern der Differenzierung wie der Integrine in den suprabasalen
Schichten der Epidermis ausgehend von einem Äquivalent der Epidermis (Font
et al., Cell Biology and Toxicology, Band 10, Nr. 5-6, 1994, Seiten
353-359) oder einem Äquivalent der
menschlichen Haut, das UV-Strahlung
ausgesetzt war (Hendrix, S.W., et al., Archives of Dermatological Research,
Band 290, Nr. 8, 1998, Seiten 420-424). Sehr allgemein enthalten
die in diesen Dokumenten beschriebenen Modelle rekonstruierter Haut
menschliche Keratinocyten, die gegebenenfalls mit anderen Zellen der
Haut kombiniert sind, wie zum Beispiel mit Melanocyten und/oder
Langerhans-Zellen, die auf einem Träger abgeschieden sind, oft
einem Dermis-Äquivalent,
und die unter Bedingungen kultiviert werden, wie sie bei einem Programm
zur Differenzierung angewandt werden, das auf die Erzeugung eines Äquivalents
der Epidermis hinausläuft.
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Bisher
beschriebene Äquivalente
der Dermis sind entweder künstliche
Membranen, wie z.B. Filter der Marke Millipore, Substitute der Unterhaut
auf der Basis von Collagen, eines Kunststoffs oder eines beliebigen anderen
Trägers,
der mit der Lebensfähigkeit
der Zellen verträglich
ist, komplizierter ausgearbeitete Träger, um sie der natürlichen
Dermis ähnlicher
zu machen, wie etwa zuvor von der Epidermis befreite Dermis oder gemischte
Collagen-/Fibroblasten-Gerüste.
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Bei
den gemischten Collagen-/Fibroblasten-Gerüsten führt die Kombination von nativem
Collagen mit isolierten menschlichen Fibroblasten zur Erzielung
eines Äquivalents
der Dermis, das eine Dermis nachbildet, die noch keiner Zeiteinwirkung
unterlag.
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Bei
den zur Herstellung der genannten Gerüste angewandten Protokollen
wird Collagen verwendet, das allgemein von jungen Geweben stammt,
also ein Collagen, das doch bereits erhebliche post-translationale Modifizierungen
durchmachte, die bei den komplexen, aber dennoch normalen Prozessen
seiner Biosynthese vorkommen, das aber alle diejenigen Modifizierungen,
die insbesondere im Laufe des Alterns vorkommen können, nicht
durchgemacht hat.
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Man
weiß insbesondere,
dass im Verlauf des Alterns sowie im Verlauf bestimmter Erkrankungen
wie Diabetes nicht-enzymatische Prozesse ablaufen, bei denen eine
Ose (Glucose oder Ribose) beteiligt ist, die in einer Maillard-Reaktion
mit einer Aminogruppe (zum Beispiel einem Lysin-Rest) des Collagens
reagiert und eine Schiffsche Base bildet. Diese kann, nach einer
Molekülumlagerung,
die als Amadori-Umlagerung
bezeichnet wird, durch eine Abfolge von Reaktionen zu einer intramolekularen
Brückenbildung
führen,
beispielsweise vom Pentosidin-Typ. Dieses Phänomen, das als Glycation des
Collagens bezeichnet wird, nimmt regelmäßig mit dem Alter zu und führt zu einer
regelmäßigen Erhöhung des
Gehaltes der Haut an Glycationsprodukten. Diese Glycationsprodukte
sind zum Beispiel Pyrralin, Carboxymethyllysin, Pentosidin, Crosslines, Nε-(2-Carboxyethyl)-lysin
(CEL), Glyoxal-Lysin-Dimer (GOLD), Methylglyoxal-Lysin-Dimer (MOLD), 3DG-ARG-Imidazolon,
die Vesperlysine A, B und C, Threosidin oder auch die Endprodukte
der fortgeschrittenen Glycosylierung (advanced glycosylation end
products oder AGEs). Reiser, M., et al. (Journal of Biochemistry,
Band 267, Nr. 4, 1992, Seiten 24207-24216) wiesen insbesondere das
Vorliegen von bevorzugten Glycationsstellen an den Collagenketten
nach, die im Laufe der Alterung erhalten bleiben.
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Dieses
Phänomen
ist bei bestimmten Erkrankungen wie beispielsweise Diabetes verstärkt.
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Ohne
irgendeine Theorie der Alterung der Haut einzuführen, ist festzustellen, dass
weitere Eigenschaften, die ebenfalls eine Konsequenz dieser Phänomene der
Glycation sein könnten,
im Verlauf der Alterung der Haut nachgewiesen werden konnten, wie
etwa eine Verringerung der Wärme-Denaturierung,
eine Erhöhung
der Beständigkeit
gegen enzymatischen Abbau und eine Erhöhung der intermolekularen Verbrückungen
(Tanaka, S., et col., 1988, J. Mol. Biol. 203, 495-505; Takahashi,
M., et col., 1995 Analytical Biochemistry, 232, 158-162). Darüber hinaus
konnten Modifizierungen nachgewiesen werden, die durch die Glycation
bestimmter Bestandteile der Basalmembran, wie etwa des Collagens
IV, des Laminins und des Fibronectins, bedingt sind (Tarsio, JF.,
et col., 1985, Diabetes, 34, 477-484; Tarsio, JF., et col., 1988,
Diabetes, 37, 532-539; Sternberg, M., et col., 1995, C. R. Soc.
Biol., 189, 967-985).
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Es
wird so verständlich,
dass im Laufe der Alterung der Haut eine Modifizierung der physikalisch-chemischen
Eigenschaften des Collagens auftritt und das Collagen schwieriger
löslich
und schwieriger abbaubar wird.
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Somit
scheint das glykierte Collagen einer der Bestandteile der Altershaut
zu sein.
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Es
ist sehr gut bekannt, dass die Haut aus einer engen Verbindung zwischen
mindestens zwei Compartimenten resultiert, aus denen sie aufgebaut
ist, nämlich
der Epidermis und der Dermis. Die Wechselwirkungen zwischen der
Dermis und der Epidermis sind so, dass vernünftigerweise angenommen werden
kann, dass eine Modifizierung des einen Konsequenzen auf das andere
haben kann. Es ist zu vermuten, dass die Alterung der Dermis, insbesondere
mit ihren Phänomenen
der Glycation, nur Konsequenzen für die Epidermis haben kann,
mit der sie verbunden ist. So kann im Laufe der Hautalterung die
Glycation des Collagens Modifizierungen der Epidermis zur Folge
haben, die notwendigerweise an der Alterung der Epidermis teilhaben.
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Diesbezüglich konnte
von der Anmelderin nunmehr gezeigt werden, dass ein Protein, das
einen Bestandteil der normalen Epidermis darstellt, nämlich das
Integrin vom Typ 131, das ein Rezeptor der extrazellulären Matrix
ist (vgl. Ruoslahti, E., 1991, Cell Biology of Extracellular Matrix,
Plenum Press New York, 343363) in der gealterten Epidermis eine
Verteilung seiner Expression aufweist, die sich von ihrer Expressionsverteilung
in einer jungen Epidermis sehr unterscheidet. Wenn dieses Protein
in einer jungen Epidermis, das heißt im Sinne der Anmelderin
in einer Epidermis einer jungen Person, in den sehr tiefen Schichten
der Epidermis, das heißt
maximal bis zur zweiten suprabasalen Schicht, exprimiert wird, ist
dies in der Tat in einer gealterten Epidermis, d.h. im Sinne der
Anmelderin in einer Epidermis einer alten Person, vollkommen anders, da
dort dieses Protein in den meisten Schichten der Epidermis bis hin
zu den letzten suprabasalen Schichten unter der Hornschicht exprimiert
wird.
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Bis
jetzt ist kein Modell einer in vitro rekonstruierten Haut in der
Lage, entweder wegen der angewandten Präparationsprotokolle oder aufgrund
der einfachen Tatsache, dass es, wenn es einmal rekonstituiert ist, keiner
Modifizierung unterliegt, ein Äquivalent
der Haut zu liefern, bei dem mindestens einer der Bestandteile eine
der Komponenten der Hautalterung darstellt. So weist kein Modell
einer in vitro rekonstituierten Haut die Eigenschaften einer Altershaut
auf, und kein Modell erlaubt die Untersuchung der Prozesse, die
dazu führen, und
auch nicht die Untersuchung von Verbindungen und/oder Zusammensetzungen,
die zumindest eine Verlangsamung dieses Prozesses oder dieser Prozesse
erlaubten. Die einzigen bekannten Untersuchungen dieser Phänomene beruhen
auf Untersuchungen in vivo entweder am Tier oder am Menschen. Ganz
besonders aus ethischen Gründen
wird das Interesse verständlich, über ein
solches Modell zu verfügen.
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Untersuchungen
zur Glycation sind im Stand der Technik bekannt. So ist zum Beispiel
ein Verfahren zum Erhalt eines Äquivalents
von Bindegewebe in Form eines Gerüsts von glykiertem Collagen
und Fibroblasten bekannt (vgl. hierzu Frey et col., 1992, C. R.
Soc. Biol., 187, 223-231). Allerdings haben Frey et col. niemals untersucht
und auch keinen Hinweis darauf gegeben, dass es möglich sein
könnte,
aus ihrem Gerüst
ein Äquivalent
der Haut herzustellen; darüber
hinaus wurde es von ihnen auch nie mit irgendeinem Dermis-Äquivalent verglichen. Ferner
ist auch bei aller Anerkennung der Gültigkeit des Bindgewebsmodells
von Frey et col. sehr wohl festzustellen, dass das von diesen Autoren
angewandte Protokoll nicht zu den Zielsetzungen führen kann,
die sich die Anmelderin gesetzt hat, das heißt, eine Haut in vitro zu reproduzieren
und damit als Konsequenz eine Epidermis und eine Dermis zu reproduzieren,
die sämtliche
Eigenschaften oder einen Teil der Eigenschaften einer Altershaut
aufweisen. Durch Inkubieren von Collagen und Zucker während 9
Tagen bei einer Temperatur von 4 °C
initiierten Frey et col. die Reaktion der Glycation von Collagen,
eine Reaktion, die sich dann in dem Gerüst fortsetzt, in dem das Collagen
so vorglykiert wurde. Wenn man einen ausreichenden Glycationsgrad
erzielen möchte,
um eine Altershaut nachzubilden, ist es aber erforderlich, die Glycationsreaktion in
dem so erzeugten Gerüst
weiter ablaufen zu lassen, das heißt im Verlauf der Kontraktion
während
einer weiteren Zeit, die ausreicht, um den angestrebten Reaktionsgrad
zu erzielen. Fachleute wissen, dass zur Erzielung eines Äquivalents
der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält, auf einem Äquivalent
der Dermis vom Typ eines Collagen-/Fibroblasten-Gerüsts das
Einsäen
der Keratinocyten auf einem Gerüst
erfolgen muss, das ein Stadium einer festgelegten Kontraktion nicht überschritten
haben darf. Daraus folgt daher, dass es nicht möglich ist, nach dem Protokoll
von Frey ein Äquivalent
der Dermis zu erhalten, das eine alte, sogar sehr alte, das heißt, eine
stark oder sogar sehr stark glykierte Dermis nachbildet.
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Somit
wurde nach Kenntnis der Anmelderin bisher noch keine Herstellung
eines Haut-Äquivalents
beschrieben, das ein Äquivalent
der Epidermis aufweist, das auf einem Äquivalent einer gealterten
Dermis erhalten ist, insbesondere auf einem Gerüst, das mindestens glykiertes
Collagen und Fibroblasten enthält.
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Ferner
wird das große
Interesse daran verständlich, über ein
Modell einer rekonstruierten Haut zu verfügen, bei dem mindestens einer
der Bestandteile einen der Aspekte einer Altershaut aufweist.
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Die
Anmelderin, die sich seit langem mit der Realisierung von Modellen
in vitro rekonstruierter Haut beschäftigt, hat ein neues Modell
einer rekonstruierten Haut entwickelt, das ein Äquivalent der Epidermis und ein Äquivalent
der Dermis enthält
und dadurch gekennzeichnet ist, dass das Äquivalent der Dermis ein Äquivalent
der Alters-Dermis umfasst, insbesondere ein Gerüst, das zumindest glykiertes
Collagen und Fibroblasten enthält.
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Daher
ist ein erster Gegenstand der Erfindung ein neues Äquivalent
der Alters-Dermis, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten
aufweist, und wie in Anspruch 1 definiert ist.
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Im
Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Überwachung
der Bildung von Produkten der Glycation beschrieben. Diesbezüglich können zum
Beispiel die Methoden genannt werden, die beschrieben wurden von
Cefalu, W.T., et col. (Journal of Gerontology; Biological Sciences,
1995, Band 50 A, Nr. 6, 13337-13341), Sell., D.R. (Diabetes/Metabolism,
1991, Band 7, Nr. 4, 239-251), Miyata, T., et col. (Journal of the
American Society of Nephrology, 1996, Band 7, Nr. 8, 1198-1206),
oder von Furth, A.J. (Analytical Biochemistry, 1991, 192, 109-111).
Es ist somit möglich,
den Mengenanteil der am Collagen gebundenen glykierenden Verbindung
und/oder die Menge der nach der Reaktion verbleibenden glykierenden
Verbindung zu messen. Wie oben beschrieben wurde, führt die
Glycation des Collagens zur Bildung von Glycationsprodukten wie beispielsweise
von Pyrralin, Carboxymethyllysin, Pentosidin, Crosslines, Nε-(2-Carboxyethyl)-lysin
(CEL), Glyoxal-Lysin-Dimer (GOLD), Methylglyoxal-Lysin-Dimer (MOLD),
3DG-ARG-Imidazolon, Vesperlysinen A, B und C, Threosidin oder auch
von Endprodukten der fortgeschrittenen Glycosylierung (advanced
glycosylation end products oder AGEs). Bestimmte dieser Glycationsprodukte
weisen die Besonderheit auf, dass sie nach Anregung eine messbare
Fluoreszenz emittieren. So emittiert zum Beispiel Pentosidin nach Anregung
mit einer Wellenlänge
(λex) von
328 nm eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge (λem) von 378 nm. Ebenso emittieren die
AGEs nach Anregung mit einer Wellenlänge (λex) von 370 nm eine Fluoreszenz
bei einer Wellenlänge (λem) von 440
nm. Das Verhältnis
der von einem gegebenen Glycationsprodukt im Dermis-Äquivalent,
das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, emittierten
Fluoreszenz zu der Fluoreszenz, die vom gleichen Glycationsprodukt
in einem Vergleichs-Dermis-Äquivalent,
das mindestens nicht-glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, emittiert
wird, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen gemessen
wird, erlaubt die Charakterisierung des Glycationsgrades des Äquivalents
der Alters-Dermis.
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Gemäß der Erfindung
wird insbesondere die Fluoreszenz von Pentosidin und/oder die Fluoreszenz der
AGEs sowohl in einem Äquivalent
der Alters-Dermis, das glykiertes Collagen enthält, als auch in einem Vergleichs-Äquivalent
gemessen, das nicht-glykiertes Collagen enthält.
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Gemäß der Erfindung
weist das Äquivalent
der Alters-Dermis so einen Glycationsgrad von 2 bis 30 und insbesondere
von 8 bis 18 auf.
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Gemäß der Erfindung
kann das Collagen von beliebigem Typ und beliebigen Ursprungs sein.
Diesbezüglich
kann auf die verschiedenen Typen von Collagen Bezug genommen werden,
die in den Artikeln von Van der Rest und Garonne in Biochem., Band
72, 1990, 473-484, oder in Faseb Journal, Band 5, 1991, 2814-2823, angegeben
sind. Gemäß der Erfindung
wird das Collagen somit vorzugsweise unter den fibrillären Collagenen vom
Typ I, III oder V ausgewählt.
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Gemäß der Erfindung
wird vorzugsweise Collagen tierischen Ursprungs verwendet, insbesondere
Collagen, das vom Rind stammt.
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Das
gemäß der Erfindung
bevorzugt verwendete Collagen ist Collagen vom Typ I. Gemäß der Erfindung
besonders bevorzugt wird Rinder-Collagen
vom Typ I eingesetzt.
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Gemäß der Erfindung
kann selbstverständlich
auch ein Gemisch von Collagenen verschiedener Typen in beliebigem
Mengenverhältnis
und/oder von unterschiedlicher Herkunft Verwendung finden.
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Gemäß der Erfindung
können
die Fibroblasten aus beliebiger Quelle stammen, sind jedoch bevorzugt Fibroblasten
menschlichen Ursprungs. Sie können
nach einer beliebigen, im Stand der Technik bekannten Methode präpariert
werden, beispielsweise durch mechanische und/oder enzymatische Dissoziation
der Makromoleküle
der extrazellulären
Matrix der Dermis oder durch Wachsenlassen von Fibroblasten ausgehend
von Explantaten.
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Das Äquivalent
der Dermis gemäß der Erfindung
enthält
mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten, kann jedoch auch
einen beliebigen weiteren Bestandteil enthalten, dessen Einführung von
Interesse sein könnte,
wie zum Beispiel Endothelzellen, Makrophagen oder auch Nervenzellen.
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Ein
zweiter Gegenstand der Erfindung ist ein Äquivalent der Epidermis wie
in Anspruch 8 definiert, das zumindest Keratinocyten enthält und dadurch
gekennzeichnet ist, dass es erhältlich
ist durch Einsäen
zumindest von Keratinocyten auf ein Äquivalent der Dermis, das mindestens
glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält.
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Aus
dem vorstehenden Text ist ersichtlich, dass bestimmte Marker der
Epidermis in Abhängigkeit
vom Alter hinsichtlich ihrer Menge oder auch hinsichtlich der Lokalisation
ihrer Expression Modifizierungen unterliegen können. So wurde von der Anmelderin
insbesondere gezeigt, dass die Expression von Integrin β1 in der Epidermis
in Abhängigkeit
vom Alter der Epidermis in seiner Lokalisation modifiziert ist.
Während
dieses Protein in einer jungen Epidermis strikt in höchstens
den beiden ersten suprabasalen Schichten exprimiert wird, tritt
mit dem Altern diese Expression, unter Aufrechterhaltung ihrer Lokalisation
in den beiden ersten suprabasalen Schichten, in immer höheren Schichten
auf, bis sie in der Gesamtheit der suprabasalen Schichten einschließlich der
letzten Schichten, die dem Stratum corneum benachbart sind, auftritt.
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Das Äquivalent
der Epidermis ist somit gemäß der Erfindung
dadurch gekennzeichnet, dass es eine modifizierte Expression von
Integrin β1
aufweist, insbesondere eine Expression von Integrin β1 in den
Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten.
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Gemäß der Erfindung
besonders bevorzugt ist das Äquivalent
der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält, dadurch gekennzeichnet,
dass es eine modifizierte Expression von Integrin β1 aufweist,
insbesondere eine Expression von Integrin β1 in den Zellen zumindest der
drei ersten suprabasalen Schichten, sowie dadurch, dass es durch
Einsäen
zumindest von Keratinocyten auf ein Äquivalent der Dermis erhalten
ist, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält.
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Zur
Charakterisierung der Epidermis der Erfindung kann selbstverständlich jedes
Verfahren Verwendung finden, das den Nachweis der Expression von
Integrin β1
erlaubt. Als Beispiel hierfür
kann die Markierung mit Hilfe von Anti-Integrin β1-Antikörpern genannt werden.
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Die
gemäß der Erfindung
verwendeten Keratinocyten können
aus beliebigen Quellen stammen, sind jedoch bevorzugt Keratinocyten
menschlichen Ursprungs. Sie können
nach einem beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren
hergestellt werden. Hierzu kann zum Beispiel die Kultivierung ausgehend
von dissoziierter Epidermis, die aus entnommener normaler Haut stammt,
oder die Kultivierung von Keratinocyten, die aus der Haarfollikelscheide
stammen, genannt werden.
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Vorzugsweise
werden gemäß der Erfindung
Keratinocyten von normaler menschlicher Haut verwendet.
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Gemäß der Erfindung
werden die verwendeten Keratinocyten bevorzugt aus dissoziierter
menschlicher Epidermis, die aus entnommener normaler menschlicher
Haut stammt, nach dem Verfahren hergestellt, das beschrieben ist
in Régnier
et col., Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4-35 (Karger, Basel
1981).
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Das Äquivalent
der Epidermis der Erfindung enthält
zumindest Keratinocyten, kann jedoch auch einen beliebigen anderen
Typ von Zellen enthalten, die darin eingebracht werden können, wie
zum Beispiel Langerhans-Zellen und/oder Vorläufer von Langerhans-Zellen und/oder Melanocyten.
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Es
ist festzuhalten, dass das Haut-Äquivalent,
das die größte Ähnlichkeit
mit normaler Haut aufweist, das Haut-Äquivalent ist, das die drei
wesentlichen Zelltypen enthält,
die in der normalen Haut vorliegen.
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So
enthält
das Modell rekonstruierter Haut gemäß der Erfindung vorteilhaft
ferner Melanocyten und/oder Langerhans-Zellen und/oder Vorläufer von
Langerhans-Zellen.
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Die
gemäß der Erfindung
verwendeten Melanocyten können
aus einem beliebigen Organ isoliert werden, in dem sie enthalten
sind, wie zum Beispiel aus normaler Haut oder dem Haarfollikel.
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Vorzugsweise
werden Melanocyten verwendet, die aus normaler Haut isoliert wurden.
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Gemäß der Erfindung
kann ein beliebiges Verfahren zur Präparation der Melanocyten verwendet
werden, das im Stand der Technik bekannt ist. Hier kann beispielsweise
das Verfahren genannt werden, das in Olsson et col., Acta Derm.
Venereol., 1994, 74, 226-268, beschrieben ist.
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Die
Langerhans-Zellen und/oder die Vorläufer von Langerhans-Zellen, die gemäß der Erfindung
verwendbar sind, können
Zellen sein, wie sie von der Anmelderin in ihrer unter
EP-A-789 074 veröffentlichten
europäischen
Patentanmeldung beschrieben sind.
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Ein
dritter Gegenstand der Erfindung ist ein Äquivalent der Altershaut, wie
es in Anspruch 11 definiert ist, und das dadurch gekennzeichnet
ist, dass es mindestens ein Äquivalent
der Epidermis und ein Äquivalent der
Alters-Dermis umfasst.
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Ein Äquivalent
der Altershaut, das gemäß der Erfindung
sehr bevorzugt ist, umfasst ein Äquivalent
der Epidermis, das zumindest Keratinocyten enthält und eine modifizerte Expression
von Integrin β1
aufweist, insbesondere eine Expression von Integrin β1 in den
Zellen zumindest der drei ersten suprabasalen Schichten, und ist
dadurch gekennzeichnet, dass es erhältlich ist durch Einsäen zumindest
von Keratinocyten auf ein Äquivalent
der Alters-Dermis, das mindestens glykiertes Collagen und Fibroblasten
enthält,
wobei das Äquivalent
der Alters-Dermis einen Glycationsgrad von 2 bis 30 und insbesondere
von 8 bis 18 aufweist.
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Ein
vierter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines Äquivalents
der Altershaut, wie es in Anspruch 13 definiert ist und das ein Äquivalent
der Epidermis und ein Äquivalent
der Dermis umfasst, das seinerseits ein Gerüst aufweist, das zumindest
glykiertes Collagen und Fibroblasten aufweist, und das dadurch gekennzeichnet
ist, dass in einem ersten Schritt ein Gerüst hergestellt wird, das zumindest glykiertes
Collagen und Fibroblasten enthält,
und in einem zweiten Schritt auf dem im ersten Schritt erhaltenen Gerüst ein Äquivalent
der Epidermis aufgebaut wird, das zumindest Keratinocyten enthält.
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Der
erste Schritt kann nach einem beliebigen im Stand der Technik bekannten
Verfahren durchgeführt werden,
sofern nur das verwendete Collagen entweder vor oder während oder
nach der Erzeugung des Gerüsts
glykiert werden kann. Bevorzugt wird gemäß der Erfindung ein Gerüst hergestellt,
in dem entweder vor der Erzeugung des Gerüsts glykiertes Collagen verwendet
wird, oder es wird dem verwendeten Gemisch von Collagen und Fibroblasten
ein Glycationsmittel zugegeben, um die Glycation entweder während der
Erzeugung des Gerüsts
oder nach der Erzeugung des Gerüsts
hervorzurufen.
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Gemäß der Erfindung
wird das Gerüst
vorzugsweise unter Verwendung eines zuvor glykierten Collagens hergestellt.
Gemäß der Erfindung
wird das Gerüst
bevorzugt nach dem Verfahren hergestellt, das von Asselineau et
col., 1987 (Models in Dermato., Band III, Hrsg. Lowe & Maibach, 1-7)
beschrieben wurde, wobei zuvor glykiertes Collagen eingesetzt wird.
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Zur
Herstellung des glykierten Collagens kann ein beliebiges bekanntes
Glycationsverfahren herangezogen werden. Hierzu sind zum Beispiel
die Verfahren zu nennen, die beschrieben wurden von Tanaka et col.
(J. Mol. Biol., 1988, 203, 495-505), Tarsio, JF., et col. (1985,
Diabetes, 34, 477-484), Tarsio, JF., et col. (1988, Diabetes, 37,
532-539) oder Frey, J., et col. (1992, C. R. Soc. Biol., 187, 223-231).
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Die
Glycation kann gemäß der Erfindung
vorzugsweise durch Inkontaktbringen einer Lösung mindestens eines Collagens
mit einer Lösung
mindestens eines Glycationsmittels erhalten werden, um so die Glycationsreaktion
des Collagens in vitro bei Abwesenheit von Zellen zu induzieren.
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Wie
oben angegeben, kann das verwendete Collagen ein beliebiger Typ
von Collagen beliebigen Ursprungs sein und allein oder in einem
Gemisch vorliegen.
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Gemäß der Erfindung
wird vorzugsweise Collagen tierischen Ursprungs verwendet, insbesondere
Collagen vom Rind. Das gemäß der Erfindung
bevorzugt verwendete Collagen ist Collagen vom Typ I. Gemäß der Erfindung
besonders bevorzugt wird Collagen vom Typ I vom Rind verwendet.
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Die
Lösung
des Collagens kann eine Konzentration von 2 bis 6 mg/ml und bevorzugt
von 3 bis 5 mg/ml aufweisen.
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Das
Glycationsmittel kann ein beliebiges Mittel sein, das die Glycation
erlaubt, das heißt,
das befähigt ist,
nach der Maillard-Reaktion
mit einer Aminogruppe des Collagens unter Bildung einer Schiffschen
Base zu reagieren. Diesbezüglich
können
zum Beispiel bestimmte Zwischenprodukte der Maillard-Reaktion genannt werden,
wie zum Beispiel Glucoson, 3-Desoxyglucoson, Glyoxal, Methylglyoxal
oder auch die Zucker.
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Gemäß der Erfindung
ist jeder Zuckertyp verwendbar, unabhängig davon, ob er in monomerer
Form oder in polymerer Form vorliegt. Gemäß der Erfindung wird bevorzugt
ein monomerer Zucker verwendet.
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Unter
Zuckern werden gemäß der Erfindung
Produkte verstanden, die mehrere Alkoholfunktionen zusammen mit
mindestens einer Aldehydfunktion besitzen. Hierzu sind insbesondere
die Osen zu nennen.
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Von
den gemäß der Erfindung
verwendbaren Zuckern sind, unter anderen, Ribose, Fructose oder
Glucose zu nennen. Gemäß der Erfindung
wird bevorzugt Ribose oder Glucose verwendet.
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Der
Zucker kann in rechtsdrehender oder linksdrehender Konformation
vorliegen. Gemäß der Erfindung
wird bevorzugt ein Zucker in rechtsdrehender Konformation eingesetzt.
Gemäß der Erfindung
wird insbesondere D-Fructose, D-Ribose oder D-Glucose verwendet.
Bevorzugt wird D-Ribose oder D-Glucose verwendet.
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Selbstverständlich kann
das Glycationsmittel allein oder in Form eines Gemisches eingesetzt
werden.
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Die
Menge an Glycationsmittel, die gemäß der Erfindung einzusetzen
ist, muss ausreichend sein, um die Auslösung der nicht-enzymatischen Reaktionen
zu erlauben, die zur Bildung der Schiffschen Base führen. Es
ist klar, dass es die Variation dieser Menge erlaubt, ein Endprodukt,
also das glykierte Collagen, zu erhalten, dessen Glycationsgrad
von einer sehr geringen Glycation bis zu einer sehr hohen Glycation
variiert. Dementsprechend kann die Menge des Glycationsmittels im
Bereich von 0,5 bis 20 Gew.-% und bevorzugt im Bereich von 1 bis
10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenlösung, liegen.
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Die
Glycationsreaktion erfolgt bei einer Temperatur in der Nähe der Umgebungstemperatur.
So erfolgt die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis
30 °C und
bevorzugt von 20 bis 25 °C.
Die Dauer der Glycationsreaktion hängt vom angestrebten Glycationsgrad
ab. Es ist klar, dass der Glycationsgrad umso höher ist, je länger die
Reaktionsdauer ist. Dementsprechend liegt die Dauer der Glycationsreaktion
im Bereich von 15 Tagen bis 2 Monaten und bevorzugt im Bereich von
25 bis 35 Tagen.
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Wenn
die Wahl getroffen wird, die Glycation vor der Erzeugung des Gerüsts durchzuführen, ist
es möglich,
mit dem glykierten Collagen alle nachfolgenden Stufen durchzuführen, die
zur Erzielung eines Produkts mit höchstmöglicher Reinheit erforderlich
sind. So ist es möglich,
zu versuchen, jede Spur des Glycationsmittels, das im Verlauf der
Reaktion nicht reagierte, zu eliminieren. Hierfür kann jedes bekannte Verfahren herangezogen
werden. So kann beispielsweise die Lösung des vorher glykierten
Collagens einer Reihe von Dialysen gegen Wasser und/oder Essigsäure unterzogen
werden.
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Nach
einer Variante der Erfindung kann die erhaltene Lösung des "vorglykierten" Collagens vor der Verwendung
zur Herstellung des Dermis-Äquivalents
mit nativem Collagen gemischt werden. In diesem Fall kann das Verhältnis von
glykiertem Collagen zu nicht-glykiertem
Collagen im Bereich von 25 bis 75 und bevorzugt im Bereich von 45
bis 55 liegen. Die Variation dieses Verhältnisses erlaubt eine Modulation
des Glycationsgrades des Gerüsts.
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Gemäß der Erfindung
wird bevorzugt ein Gemisch von glykiertem Collagen und nicht-glykiertem
Collagen verwendet, noch bevorzugter ein Gemisch von glykiertem
Collagen und nicht-glykiertem Collagen im Verhältnis 50/50.
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Die
zweite Stufe des Verfahrens der Erfindung kann nach einem beliebigen
im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden.
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In
dieser Hinsicht können
beispielsweise die Verfahren genannt werden, die beschrieben sind
in den Patentanmeldungen
EP-A-285
471 ,
EP-A-285
474 ,
EP-A-789
074 ,
EP-A-502
172 ,
EP-A-418
035 ,
WO-A-9116010 ,
EP-A-197 090 ,
EP-A-20 753 ,
FR-A-2 665 175 und
FR-A-2 689 904 oder
auch von Asselineau et col. in Exp. Cel. Res., 1985, 536-539, sowie
in Models in Dermato., Band III, 1987, Hrsg. Lowe & Maibach, 1-7.
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Gemäß der Erfindung
wird bevorzugt die von Asselineau et col. beschriebene Verfahrensweise
angewandt.
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Die
gemäß der Erfindung
verwendeten Keratinocyten können
aus beliebigen Quellen stammen, sind jedoch bevorzugt Keratinocyten
menschlichen Ursprungs. Sie können
nach einem beliebigen, im Stand der Technik bekannten Verfahren
hergestellt werden. Hierzu kann zum Beispiel die Kultivierung ausgehend
von dissoziierter Epidermis, die aus entnommener normaler Haut stammt,
oder die Kultivierung von Keratinocyten, die aus der Haarfollikelscheide
stammen, genannt werden.
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Gemäß der Erfindung
werden die verwendeten Keratinocyten bevorzugt aus dissoziierter
menschlicher Epidermis, die aus entnommener normaler menschlicher
Haut stammt, nach dem Verfahren hergestellt, das beschrieben ist
in Régnier
et col., Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4-35 (Karger, Basel
1981). Nach dem Einsäen
der Keratinocyten auf den Träger
kann die Kultur vorteilhaft in ein Nährmedium eingetaucht gehalten werden,
bei dem es sich zum Beispiel um das von Rheinwald und Green, 1975
(Cell, 6, (3), 317-330) beschriebene Medium handelt, das die Vermehrung
der Keratinocyten erlaubt (im Text auch als Medium 3F bezeichnet).
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Nach
einer Inkubationszeit von 3 bis 15 Tagen und vorzugsweise 7 bis
9 Tagen wird das Haut-Äquivalent
an der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten,
zum Beispiel durch Auflegen auf ein Metallgitter. Die Flüssigkeit
besteht dann vorzugsweise aus dem gleichen Nährmedium wie zuvor.
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Die
Inkubation wird dann durchgeführt,
bis ein Äquivalent
der Haut erhalten wird, das die Eigenschaften einer Haut aufweist,
das heißt,
den Träger,
auf dem sich ein Äquivalent
der Epidermis befindet, das die vier Typen von klassischen Zellschichten
aufweist, nämlich
die Basalschicht, die Suprabasalschicht, die Körnerschicht und die Hornschicht.
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Die
Inkubation erfolgt so während
einer Dauer von 5 bis 30 Tagen und bevorzugt von 7 bis 10 Tagen.
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Das
so realisierte Modell der rekonstruierten Haut umfasst zwei Einheiten,
den Träger
und das Äquivalent
der Epidermis, die physikalisch voneinander getrennt werden können.
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Das Äquivalent
der Epidermis kann dann getrennt vom Träger verwendet werden.
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Aus
dem obigen Text geht hervor, dass bisher kein Modell in vitro rekonstruierter
Haut die Eigenschaften einer Altershaut aufweist und die Untersuchung
der Prozesse, die dazu führen,
erlaubt, und auch nicht die Untersuchung der Verbindungen und/oder
Zusammensetzungen, die zumindest eine Modifizierung des Prozesses
erlauben. Das gemäß der Erfindung
erhaltene Äquivalent
der Haut löst
diese Probleme, da es mindestens eine der Eigenschaften der Altershaut
aufweist, nämlich
ein glykiertes Collagen. Diese wichtige Eigenschaft, die bei dem
Modell und seinem Herstellungsverfahren in jedem Verhältnis variiert
werden kann, erlaubt die Untersuchung des Phänomens der Glycation selbst
sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) dieses Phänomens,
die Untersuchung von mit der Altershaut in Verbindung stehenden
Phänomenen
wie zum Beispiel die Falten, die Untersuchung von Modulatoren (isolierte
Verbindungen und/oder Zusammensetzungen) des Auftretens von Falten
(insbesondere Inhibitoren), die Untersuchung der Lichtalterung und
der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Haut sowie von Modulatoren
dieser Wirkungen (Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zum Schutz,
Filter, etc.), die Untersuchung des Einflusses der Glycation auf
die Bestandteile der Haut (Körperhaare
und/oder Kopfhaare, Blutgefäße, Nervenfasern,
etc.) sowie auf therapeutischem Gebiet die Untersuchung von durch
Diabetes hervorgerufenen Komplikationen über die Glycation.
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Die
Erfindung betrifft somit ferner auch die In-vitro-Verwendung eines Äquivalents
der Altershaut und/oder der Alters-Dermis und/oder eines Äquivalents
der Alters-Epidermis, wie oben beschrieben, zur Untersuchung des
Phänomens
der Glycation selbst sowie von Modulatoren (Inhibitoren oder Aktivatoren)
dieses Phänomens,
zur Untersuchung der mit der Altershaut und/oder Alters-Epidermis
in Verbindung stehenden Phänomene
wie zum Beispiel Falten, zur Untersuchung von Modulatoren (isolierte
Verbindungen und/oder Zusammensetzungen) des Auftretens von Falten
(insbesondere Inhibitoren), zur Untersuchung der Lichtalterung und
der Wirkung ultravioletter Strahlung auf die Haut und/oder die Dermis
und/oder die Epidermis sowie von Modulatoren dieser Wirkungen (Verbindungen
und/oder Zusammensetzungen zum Schutz, Filter, etc.), zur Untersuchung
des Einflusses der Glycation auf die Bestandteile der Haut und/oder
der Dermis und/oder der Epidermis (Körperhaare und/oder Kopfhaare,
Blutgefäße, Nervenfasern,
etc.) sowie auf therapeutischem Gebiet zur Untersuchung von durch
Diabetes hervorgerufenen Komplikationen über die Glycation.
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Es
wurde ferner gezeigt, dass gemäß der Erfindung
das auf dem Äquivalent
der Dermis, das zumindest glykiertes Collagen und Fibroblasten enthält, rekonstruierte Äquivalent
der Epidermis eine modifizierte Verteilung der Expression von Integrin β1 aufweisen
kann. Wenn in diesem Fall die Variation der Verteilung dieses Markers
mit dem Alter der Epidermis verknüpft ist, kann in Betracht gezogen
werden, das Äquivalent der
Altershaut gemäß der Erfindung
zur Bewertung von Produkten zu verwenden, die sich zur Behandlung
der Altershaut eignen, indem ihre Wirkung durch diejenige Wirkung
gemessen wird, die hinsichtlich der Modifizierung der Verteilung
der Expression von Integrin β1
im Äquivalent
der Epidermis auftritt.
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1 erlaubt
eine bessere Veranschaulichung der Erfindung, ohne jedoch ihren
Umfang einzuschränken.
In dieser Abbildung zeigen die Photos Schnitte durch Äquivalente
der Haut nach Immunmarkierung mit einem Anti-Integrin β1-Antikörper. Photo
1 zeigt die Immunmarkierung eines Äquivalents der Haut, das ein rekonstruiertes Äquivalent
der Epidermis auf einem Äquivalent
der Dermis zeigt, das mit nicht-glykiertem Collagen hergestellt
wurde. Photo 2 zeigt die Immunmarkierung eines Äquivalents der Haut, das ein
rekonstruiertes Äquivalent
der Epidermis auf einem Äquivalent
der Dermis zeigt, das mit gemäß der Erfindung
glykiertem Collagen hergestellt wurde.
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Im
Folgenden werden Beispiele angegeben, welche die Erfindung erläutern, ohne
sie jedoch in irgendeiner Weise einzuschränken.
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Beispiele:
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Medien
und Puffer: Wenn nichts Anderes angegeben ist, sind sämtliche
in den Beispielen verwendeten Medien und Puffer beschrieben in Bell
et col., 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau und Prunieras,
1984 (British Journal of Derm., 111, 219-222) oder Asselineau et col., 1987 (Models
in Dermato., Band III, Hrsg. Lowe & Maibach, 1-7).
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Beispiel 1: Herstellung von glykiertem
Rindercollagen Typ I:
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In
ein 50 ml-Falcon-Röhrchen
werden 10 ml einer Lösung
von Rindercollagen Typ I einer Konzentration von 3 mg/ml, 0,8 ml
0,5 N Natriumhydroxidlösung
zur Neutralisation der sauren Collagenlösung und 100 μl einer 1M
Lösung
von D-Ribose in Wasser gegeben. Das für Licht opak gemachte Röhrchen wird
waagrecht angeordnet und bei Umgebungstemperatur (25 °C) 1 Monat
mäßig bewegt.
Am Ende der "Vorglycation" wird die Lösung in
einen Dialyseschlauch gegeben (Spectra/Poly labo 32 mm n° 132655/85716)
und einer Reihe aufeinanderfolgender Dialysen unterzogen:
24
h gegen entmineralisiertes Wasser bei 4 °C zur Abtrennung des nichtgebundenen
Zuckers oder von Abbauprodukten des Collagens; 7 Tage gegen 0,5
N Essigsäure,
um das Collagen wieder in Lösung
zu bringen, in 2 Bädern
von dreieinhalb Tagen;
3 × 24
h gegen 0,017 N Essigsäure
mit täglichem
Badwechsel.
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Nach
der letzten Dialyse wird der Inhalt des Dialyseschlauchs in einem
sterilen Becherglas aufgefangen, und die Lösung wird in ein steriles,
gegen Licht opak gemachtes 50 ml-Falcon-Röhrchen übertragen.
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Die
Lösung
des "vorglykierten" Collagens ist dann
anwendungsfertig. Sie kann bei 4 °C
aufbewahrt werden.
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Beispiel 2: Herstellung eines Äquivalents
der Alters-Dermis:
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In
ein steriles Falcon-Röhrchen
werden 3,22 ml MEM-Medium 1,76 X 0,63 ml fötales Kälberserum, 0,35 ml 0,1 N Natrium hydroxidlösung und
0,20 ml eines Gemischs der Medien MEM/HEPES mit einem Gehalt von
10 % fötalem
Kälberserum
(MEM/HEPES/FCS10) gegeben.
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Dann
wird 0,5 ml MEM/HEPES/FCS10-Medium zugegeben, das von menschlichen
Brustplastik-Operationen stammende Fibroblasten in einer Konzentration
von 1 × 106 Zellen auf 0,5 ml Kulturmedium enthält, die
zuvor nach dem Verfahren hergestellt worden waren, das beschrieben
wurde von Bell et col., 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau
und Prunieras, 1984 (British J. of Derm., 111, 219-222) oder Asselineau
et col., 1987 (Models in Dermato., Band III, Hrsg. Lowe & Maibach, 1-7).
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Dann
werden langsam an der Wand des Röhrchens
entlang, um das Auftreten einer weißlichen Wolkigkeit zu beobachten,
2 ml eines Gemisches gleicher Volumina von vorglykiertem Collagen
von Beispiel 1 und nicht-glykiertem Collagen, das zur Herstellung
des vorglykierten Collagens von Beispiel 1 diente, in einer Konzentration
von 3 mg/ml in Essigsäure
1/1000 zugegeben. Das Ganze wird dann vorsichtig gemischt und in
eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm (Typ Falcon 60
mm, Artikel Nr. 1016) gegeben. Die Petrischale wird dann in einen
auf 37 °C
gehaltenen Wärmeschrank
gegeben und etwa 2 h 30 min darin belassen. Wenn das Auftreten von
2 Phasen (Gel + Medium) beobachtet wird, wird das Gerüst vorsichtig
von seinem Träger getrennt,
und das so von seinem Träger
getrennte Gerüst
wird 4 Tage lang im Wärmeschrank
belassen.
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Beispiel 3: Messung des Glycationsgrades
des Äquivalents
der Alters-Dermis
von Beispiel 2:
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Parallel
zur Herstellung des Äquivalents
der Alters-Dermis von Beispiel 2 wird ein Äquivalent der Dermis ohne glykiertes
Collagen (aber mit nicht-glykiertem Collagen) hergestellt. Dieses Äquivalent
dient als Vergleichsmaterial bei der Ermittlung des Glycationsgrades
des Äquivalents
der glykierten Dermis von Beispiel 2.
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2
Gerüste
(Alters-Dermis, Vergleichsmaterial), die nach Beispiel 2 hergestellt
wurden, werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gespült
und dann getrocknet. Die Gerüste
werden dann in ein Eppendorf-Röhrchen
gegeben und bei 37 °C
in einem Wasserbad über
Nacht (12 Stunden) einem Verdau mit Pepsin (Sigma P-6887) bei einer
Menge von 500 μg
Pepsin pro Gerüst
in 0,5 ml 0,5 N Essigsäure
unterzogen.
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Dann
werden in jedes Röhrchen
515 μl 0,5
N Natriumhydroxidlösung
gegeben, worauf der Inhalt jedes Röhrchens mit einem Zentrifugenfilter × 0,22 μm (Sigma)
filtriert wird.
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Dann
wird die Fluoreszenz mit einem Spektrofluorimeter der Marke Hitachi,
Modell F2000, gemessen.
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Auf
diese Weise wird nach Anregung bei λex = 328 nm die bei λem = 378
nm von Pentosidin emittierte Fluoreszenz und nach Anregung bei λex = 370
nm die bei λem
= 440 nm von den AGEs emittierte Fluoreszenz gemessen.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
| Pentosidin | AGEs |
Vergleichsmaterial | 650 | 430 |
glykiertes
Gerüst | 6100 | 1820 |
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In
diesem Beispiel ergibt sich der Glycationsgrad des Äquivalents
der Alters-Dermis zu 9,4 für
Pentosidin und zu 4 für
die AGEs.
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Beispiel 4: Herstellung eines Äquivalents
der Altershaut:
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Ein Äquivalent
der Alters-Dermis, wie es in Beispiel 2 hergestellt wurde, wird
gut ausgebreitet in einer Kulturschale vom Typ Corning mit einem
Durchmesser von 60 mm auf einem Tropfen Collagen (0,6 ml) als "Kleber" befestigt und dann
in einem Wärmeschrank
20 bis 30 Minuten auf 37 °C
gehalten.
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Ein
steriler Ring aus Stahl wird auf das Gerüst aufgelegt, und 0,5 ml einer
Zellsuspension von menschlichen Keratinocyten, die von Brustplastik-Operationen
stammten und nach Régnier
et col. (Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4-35, Karger, Basel,
1981) hergestellt wurden, werden in einer Konzentration von 100
000 Zellen/ml in MEM-Medium mit 10 % FCS + 3F in das Innere des
Rings gebracht.
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Etwa
6 ml Medium (MEM 10 % FCS + 3F) werden um den Ring herum gegeben,
und die Schale wird für
2 Stunden in einen auf 37 °C
gehaltenen Wärmeschrank
gebracht. Der Ring wird dann weggenommen, und die Schale wird wieder
in den Wärmeschrank
verbracht.
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Nach
8 Tagen wird die Kultur dann an die Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche gebracht, wobei die Flüssigkeit dann
aus dem gleichen Medium wie vorher besteht.
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Die
Kultivierung wird anschließend
während
1 Woche bis zur Erzielung eines histologisch zufriedenstellenden Äquivalents
der Epidermis fortgesetzt, das heißt, eines Äquivalents der Epidermis, das
die klassichen vier Zellschichten aufweist, nämlich die Basalschicht, die
Suprabasalschicht, die Körnerschicht
und die Hornschicht.
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Beispiel 5: Charakterisierung der Expression
von Integrin β1
in dem in Beispiel 4 erhaltenen Äquivalent
der Epidermis:
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Die
Expression von Integrin β1
in dem in Beispiel 4 erhaltenen Äquivalent
der Epidermis wird nach Immunmarkierung mit einem monoklonalen,
gegen Integrin β1
gerichteten Mäuse-Antikörper (Immunotech,
Marseille, Frankreich, Cat. 1151) beobachtet:
Nach Einfrieren
werden die in Beispiel 4 erhaltenen Haut-Äquivalente mit einem Kryostaten-Mikrotom
(Marke/Modell) zu Lamellen von 5 μm
Dicke geschnitten. Die Schnitte werden dann zweimal mit PBS gespült, und 25 μl 1/50 verdünnter Anti-Integrin β1-Antikörper (Immunotech,
Marseille, Frankreich, Cat. 1151) werden auf jeden Schnitt aufgebracht
und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur (25 °C) darauf belassen. Die Schnitte werden
dann zweimal mit PBS gespült,
worauf 25 μl
mit FITC konjugierte Antikörper
(Rabbit anti mouse FITC, Dako F232) auf jeden Schnitt aufgebracht
und bei Umgebungstemperatur (25 °C)
30 Minuten darauf belassen werden. Die Schnitte werden dann zweimal
mit PBS gespült
und nach Montage mit einem Fluoreszenzmikroskop der Marke LEICA,
Modell LEITZ DMRB, untersucht.
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Die
Untersuchung zeigt, dass im Vergleichsmaterial das Integrin β1 in der
Basalschicht der auf dem nicht-glykierten Äquivalent der Dermis rekonstruierten
Epidermis sowie in ihrer ersten suprabasalen Schicht exprimiert
wird (1, Photo 1), während
das Integrin β1
in der auf dem Äquivalent
der Alters-Dermis rekonstruierten Epidermis in sämtlichen suprabasalen Schichten
bis zum Stratum corneum exprimiert wird (1, Photo
2).
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Diese
Ergebnisse stehen mit der Feststellung in Einklang, dass in vivo
die Verteilung der Expression von Integrin β1 in einer Haut einer jungen
Person in der Basalschicht und der ersten suprabasalen Schicht und in
der Haut einer alten Person in der Basalschicht und in mindestens
den drei ersten suprabasalen Schichten vorliegt.