DE60035871T2

DE60035871T2 - Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine

Info

Publication number: DE60035871T2
Application number: DE60035871T
Authority: DE
Inventors: Kin-Ming Lexington LO; Yaping Acton SUN; Stephen D. Carlisle GILLIES
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1999-05-19
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2020-05-20
Also published as: HUP0201474A2; ZA200109227B; WO2000069913A1; US20020081664A1; US20050042729A1; PL352332A1; CA2372400C; RU2262510C2; ES2291205T3; HUP0201474A3; CN1361793A; NO20015587D0; RU2262510C9; DE60035871D1; AU5031800A; DK1187852T3; HK1046694A1; PT1187852E; NO20015587L; EP1187852B1

Description

Technischer Bereich
Die Erfindung betrifft die Expression und Sekretion von Fc-Fusionsproteinen mit der biologischen Aktivität von Interferon-alpha in hohen Spiegeln in Säugetierzellen und die verschiedenen strukturellen Formen und Verwendungen davon, insbesondere ihre Fähigkeit, Interferon-alpha in der Leber anzureichern.
Hintergrund der Erfindung
Die Interferon-alpha-(IFN-alpha-)Proteinfamilie hat sich als nützlich bei der Behandlung einer Vielzahl an Erkrankungen erwiesen. Zum Beispiel wurden Interferone alpha 2a und 2b (Handelsbezeichnungen Roferon bzw. Intron A) bei der Behandlung von chronischer Hepatitis B, C und D (lebensbedrohliche virale Erkrankung der Leber), Condylomata acuminata (genitale Warzen), mit AIDS einhergehendem Kaposi-Sarkom, Haarzell-Leukämie, malignen Melanomen, Basalzellkarzinom, multiplem Myelom, Nierenzell-Karzinom, Herpes I und II, Varizellen/Herpes zoster und Mycosis fungoides verwendet. Die Wirksamkeit von Interferonalpha umfassenden Behandlungsplänen bei Prostatakarzinom und chronischer erythrämischer Myelose, wurde ebenfalls untersucht.
Die humane Interferon-alpha-Familie ist die größte und komplexeste Familie der Interferone. Mitglieder der Interferon-alpha-Familie haben ähnliche Aminosäuresequenzen, die sie als eine Gruppe definieren, die sich von anderen Interferonen unterscheiden; d. h. diese Proteine haben in einem typischen Proteinsequenz-Alignment typischerweise eine Aminosäure-Identität von mindestens 35 %. Die SwissProt-Datenbank enthält eine Vielzahl humaner Interferon-alpha-Proteine, einschließlich der alternativ benannten Interferon-delta- und Interferon-omega-Proteine. Diese Proteine werden typischerweise mit einer Leader-Sequenz von etwa 23 Aminosäuren synthetisiert und die reifen Proteine haben typischerweise ein Molekulargewicht von etwa 19 kD. Da diese Proteine so ähnlich sind, wird oftmals, wenn Interferon-alpha aus einer menschlichen oder anderen Säugetierquelle erhalten und umfassend gereinigt wird, eine Mischung von Isospezies mit variierenden biologischen Aktivitäten erhalten [Georgiadis et al., US Patentschrift 4,732,683 ]. Ebenso haben die für diese Proteine kodierenden cDNAS ausreichend ähnliche Größen und Eigenschaften, so dass ein einziger Satz an Verfahren verwendet werden kann, um sie für die Zwecke einer Plasmidkonstruktion zu manipulieren. Demzufolge wäre es von Nutzen, über ein Verfahren zur effizienten Produk tion und Reinigung einer einzelnen Spezies von Interferon-alpha aus einer Säugetierquelle zu verfügen.
Aufgrund seiner relativ geringen Größe von etwa 19 kD (Lawn et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 5435), kann Interferon-alpha durch die Niere gefiltert werden. Wenn filtriert, wird das Interferon-alpha jedoch typischerweise durch die Tubuluszellen der Niere absorbiert und metabolisiert und üblicherweise daher nicht ausgeschieden. Gemäß laufender klinischer Praxis wird formuliertes Interferon-alpha über intramuskuläre Injektion verabreicht, nach der sein Spiegel im Serum mit einer Halbwertszeit von etwa 5 Stunden für Interferon-alpha 2a und 2–3 Stunden für Interferon-alpha 2b abnimmt (Physicians Desk Reference, 50. Auflage, 1996:2145–2147 und 2364–2373).
Aufgrund ihrer geringen Größe sind darüber hinaus multiple, regelmäßige Injektionen von Interferon-alpha erforderlich (gewöhnlich täglich oder 3 Mal/Woche) und es können deutliche Variationen des Interferon-alpha-Spiegels im Patienten auftreten. Außerdem sind die injizierten Dosen groß und liegen in einem Bereich von 50 Mikrogramm pro Dosis für Haarzell-Leukämie bis 300 Mikrogramm pro Dosis für mit AIDS einhergehendem Kaposi-Sarkom. Hohe Spiegel von Interferon-alpha im Kreislauf können zu deutlichen Nebenwirkungen, einschließlich Haut-, neurologischen, Immun- und endokrinen Toxizitäten führen. Man glaubt, dass die geringe Größe von Interferon-alpha ihm ermöglicht, durch die Blut-Hirn-Schranke zu gelangen und in das zentrale Nervensystem einzudringen, was einige der neurologischen Nebenwirkungen erklärt. Demzufolge wäre es von Nutzen, die Wirksamkeit und wirksame Halbwertszeit im Serum in Patienten, die mit Interferon-alpha behandelt werden, zu erhöhen und dabei gleichzeitig die Nebenwirkungen zu minimieren.
WO 97/24137 beschreibt ein Fusionsprotein, in dem Interferon-alpha an den N-Terminus eines Fc-Teils eines Antikörpers fusioniert ist. Dieses Molekül wird für die Behandlung von Hepatitis als geeignet erachtet, da es verglichen mit nichtfusioniertem Interferon-alpha eine längere Verweildauer im Gefäßsystem aufweist. In der Regel vermittelt ein solches Konstrukt jedoch ADCC oder Komplementfixierung und es wird daher erwartet, dass es in der Leber in relativ geringer Konzentration vorliegt.
Im Anbetracht der hohen Dosierung, geringen Wirksamkeit, kurzen Halbwertszeit im Serum, Schwierigkeiten bei der Reinigung und den Nebenwirkungen von Interferon-alpha oder unerwünschten Wirkungen von Interferon-alpha-Fc-Konstrukten, besteht auf dem Fachgebiet Bedarf nach Verfahren zu einer verstärkten Produktion und Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften dieses therapeutischen Mittels.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet Verfahren und Zusammensetzungen, die für die Herstellung und Verwendung von Interferon-alpha enthaltenden Fusionsproteinen von Nutzen sind. Insbesondere bietet die Erfindung Nucleinsäuren, zum Beispiel DNA- oder RNA-Sequenzen, die für ein Immunglobulin-Fc-Interferon-alpha-Fusionsprotein kodieren, sowie Verfahren zur Expression der Nucleinsäure zur Produktion solcher Fusionsproteine. Die Fusionsproteine können die Expression von biologisch aktivem Interferon-alpha in hohen Spiegeln erleichtern. Die Fusionsproteine können Interferon-alpha in der Leber anreichern. Das Fusionsprotein kann vor der Verabreichung an ein Säugetier, zum Beispiel einen Menschen, mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle bereit, zum Beispiel DNA- oder RNA-Moleküle, die für ein Immunglobulin-Fc-Region-Interferon-alpha-Fusionsprotein kodieren. Das Nucleinsäuremolekül kodiert aufeinanderfolgend in einer 5'- nach 3'-Richtung für eine Signalsequenz, eine Fc-Region eines Immunglobulins und mindestens ein Zielprotein, wobei das Zielprotein Interferon-alpha umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Fc-Region eines Immunglobulins eine Gelenk-Region des Immunglobulins und umfasst vorzugsweise mindestens eine konstante schwere Regionsdomäne des Immunglobulins, zum Beispiel eine konstante schwere Domäne 2 (CH2) des Immunglobulins, eine konstante schwere Domäne 3 (CH3) des Immunglobulins, und in Abhängigkeit von der Art des für die Erzeugung der Fc-Region verwendeten Immunglobulins gegebenenfalls eine konstante schwere Kette-Domäne 4 (CH4).
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform fehlt der Fc-Region des Immunglobulins mindestens eine konstante schwere Domäne 1 (CH1) des Immunglobulins. Obwohl die Fc-Regionen der Immunglobuline auf jeglicher Immunglobulin-Klasse basieren kann, zum Beispiel IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, sind Fc-Regionen vom Immunglobulin basierend auf IgG bevorzugt.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann in wirksamer Verbindung in einen replizierbaren Expressionsvektor eingebaut werden, der dann in eine kompetente Säugetierwirtszelle eingeführt werden kann, um das auf Interferon-alpha basierende Fusionsprotein zu produzieren. Das resultierende auf Interferon-alpha basierende Fusionsprotein wird von der Säugetierwirtszelle effizient produziert und sezerniert. Das sezernierte, auf Interferon-alpha basierende Fusionsprotein kann aus dem Kulturmedium ohne Lysieren der Säugetierwirtszelle gesammelt werden. Das Proteinprodukt kann wie gewünscht auf Aktivität untersucht und/oder gereinigt werden unter Verwendung von üblichen Reagenzien, und/oder vom Fusionspartner abgespalten werden, alles unter Verwendung von herkömmlichen Techniken.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine zeigen verbesserte biologische Eigenschaften gegenüber nativem Interferon-alpha wie z. B. eine erhöhte Löslichkeit, verlängerte Halbwertszeit im Serum und erhöhte Bindung an seinen Rezeptor. Diese Eigenschaften können die klinische Wirksamkeit von Interferon-alpha deutlich verbessern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein in einer N- nach C-terminalen Richtung eine Fc-Region eines Immunglobulins und Interferon-alpha mit anderen Einheiten, zum Beispiel einer proteolytischen Spaltungsstelle, die optional zwischen die Fc-Region des Immunglobulins und dem Interferon-alpha eingeschoben wurde. Das resultierende Fusionsprotein wird vorzugsweise in einer Zelle synthetisiert, die die Fc-Region an normalen Glykosylierungsstellen glykosyliert, d. h. die gewöhnlich in Templat-Antikörpern vorkommen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsprotein ein zweites Zielprotein enthalten, zum Beispiel ein reifes Volllängen-Interferon-alpha oder ein biologisch aktives Fragment davon. In dieser Art von Konstrukt können das erste und zweite Zielprotein die gleichen oder unterschiedliche Proteine sein. Das erste und zweite Zielprotein können miteinander verbunden sein, entweder direkt oder mittels eines Polypeptidlinkers. Alternativ können beide Proteine entweder direkt oder über einen Polypeptidlinker an die Fc-Region von Immunglobulin gebunden sein. Im letzteren Fall kann das erste Zielprotein mit dem N-terminalen Ende der Fc-Region des Immunglobulins und das zweite Zielprotein kann mit einem C-terminalen Ende der Fc-Region des Immunglobulins verbunden sein.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins bereit, das eine Fc-Region eines Immunglobulins und das Zielprotein enthält. Das Verfahren umfasst die Schritte, (a) eine Säugetierzelle zu schaffen, die ein für ein solches Fusionsprotein kodierendes DNA-Molekül, entweder mit oder ohne Signalsequenz, enthält, und (b) die Säugetierzelle zur Produktion des Fusionsproteins zu kultivieren. Das resultierende Fusionsprotein kann dann geerntet, erneut gefaltet, wenn notwendig, und unter Verwendung von herkömmlichen Reinigungstechniken, die im Fachgebiet wohlbekannt sind und verwendet werden, gereinigt werden.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Zuständen bereit, die durch Interferon-alpha oder aktiven Varianten davon durch Verabreichen einer wirksamen Menge von durch ein erfindungsgemäßes Fusionskonstrukt produziertem Interferon-alpha an ein Säugetier gelindert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Konstrukte bei der Behandlung einer Leberstörung verwendet werden, wobei das Interferon-alpha wegen der Fc-Region des Immunglobulins innerhalb der Leber lokalisiert wird. Die erfindungsgemäßen Konstrukte können insbesondere bei der Behandlung von Leberstörungen von Nutzen sein, die umfassen, aber nicht beschränkt sind auf, virale Erkrankungen wie Hepatitis B, Hepatitis C oder Hepatitis D, Leberkrebs sowie andere Arten von Krebs, die in der Leber lokalisierte Metastasen umfassen.
Die vorstehenden und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung, den Abbildungen und Ansprüchen offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1A–1C sind schematische Darstellung von nicht-einschränkenden Beispielen von Fusionsproteinen, die gemäß der Erfindung konstruiert wurden.
2 ist ein Diagramm, das die Überlebenskurven für Gruppen von SCID-Mäusen zeigt, denen Suspensionen von Daudi-Zellen injiziert wurden, und die dann mit huFc-huIFN-alpha behandelt wurden. An Tag 0 wurden den Mäusen Daudi-Zellen injiziert. An Tagen 3–8 wurde Gruppen von acht Mäusen PBS (Rauten), 30 μg huFc-huIFN-alpha (Kreuze) oder 60 μg huFc-huIFN-alpha (Dreiecke) injiziert.
3 ist ein Diagramm, das die Wachstumsraten von subkutanen Tumoren von Daudi-Zellen in mit huFc-huIFN-alpha behandelten SCID-Mäusen zeigt. Etwa vier Wochen vor der Behandlung wurden den Mäusen subkutan Daudi-Zellen injiziert. Waren die injizierten Daudi-Zellen bis zur Bildung von Tumoren mit 200–400 mm³ gewachsen, wurden die Mäuse in Gruppen von jeweils acht aufgeteilt und sechs Tage mit einer Injektion von PBS (Rauten), 30 μg huFc-huIFN-alpha in PBS (Quadrate), oder 60 μg huFc-huIFN-alpha in PBS (Dreiecke) behandelt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Viele Zustände können durch Verabreichung von Interferon-alpha gelindert werden. Zum Beispiel, wie vorher schon diskutiert, sind Interferone alpha 2a und 2b (Handelsbezeichnungen Roferon bzw. Intron A) bei der Behandlung von chronischer Hepatitis B, C und D, Condylomata acuminata (genitale Warzen), mit AIDS einhergehendem Kaposi-Sarkom, Haarzell-Leukämie, malignen Melanomen, Basalzellkarzinom, multiplem Myelom, Nierenzell-Karzinom, Herpes I und II, Varizellen/Herpes zoster und Mycosis fungoides von Nutzen. Darüber hinaus wurden Studien durchgeführt, um die Wirksamkeit von Interferon-alpha bei der Behandlung von Prostatakarzinom und chronischer erythrämischer Myelose zu untersuchen.
Für die Behandlung von Hepatitis, zum Beispiel, kann es insbesondere von Nutzen sein, über eine Form von Interferon-alpha zu verfügen, die sich in der Leber anreichert. Auf diese Weise kann die Konzentration von Interferon-alpha in anderen Geweben minimiert werden, wodurch Nebenwirkungen verringert werden. Lebergewebe ist die primäre Stelle für die Entfernung von löslichen Immunkomplexen und Fc-Rezeptoren sind auf Lebermakrophagen (Kupffer-Zellen) reichlich vorhanden (Benacerraf, B. et al. (1959) J. Immunol. 82: 131; Paul, W. E. (1993) Fundamentals of Immunology, 3. Aufl. Kap. 5:113–116). Demzufolge kann durch Fusionieren von Interferon-alpha an eine Fc-Region eines Immunglobulins das Interferon-alpha-Molekül vorzugsweise zu Lebergewebe transportiert werden, bezogen auf das gleiche Interferon-alpha-Molekül, dem die Fc-Region des Immunglobulins fehlt. Der Antikörper vom IgG-Typ, der die höchste Affinität für die Fc-Rezeptoren aufweist, ist IgG1. Im Gegensatz dazu hat IgG4, zum Beispiel, eine ungefähr 10fach geringere Affinität für den Fc-gamma-Rezeptor I (Anderson und Abraham (1980) J. Immunol. 125: 2735; Woof et al. (1986) Mol. Immunol. 23: 319). Fc-gamma1 aus IgG1 kann, wenn es am C-Terminus eines Liganden platziert ist, antikörperabhängige zellvermittelt Cytotoxizität (ADCC) gegen Zellen vermitteln, die einen Rezeptor für diesen Liganden exprimieren. Außerdem kann Fc-gamma1, wenn es am C-Terminus eines Liganden vorkommt, C1q-Bindung und Komplementfixierung vermitteln, die gegen Zellen gerichtet sind, die einen Rezeptor für diesen Liganden exprimieren.
Im Gegensatz zu IgG1, fixiert IgG4 das Komplement nicht effizient. Dies hat zu dem Vorschlag geführt, das ein N-terminales Interferon-alpha an eine C-terminale Fc-Region von IgG4 fusioniert werden könnte (Chang, T. W. et al, US Patentschrift 5,723,125 ). Wenn die Fc-Region von IgG4 jedoch von der Fab-Region getrennt wird, fixiert das Fc von IgG4 Komplement genauso gut wie die Fc-Region von IgG1 (Isenman, D. E. et al. (1975) J. Immunol. 114: 1726). Basierend auf diesem Ergebnis und der Tatsache, dass die Fc-Sequenzen von IgG1 und IgG4 recht ähnlich sind, wird in Erwägung gezogen, ohne dass wir durch Theorie gebunden sein wollen, dass die Fab-Region von IgG4 C1q-Bindung und Komplementfixierung sterisch blockiert, da die Gelenk-Region, die die Fab- und Fc-Regionen von IgG4 verbindet, kürzer ist als die Gelenk-Region von IgG1. Wird die große, voluminöse Fab-Region von IgG4 durch ein kleines Molekül ersetzt, wie z. B. Interferon-alpha, und das Interferon-alpha und die Fc-Region durch einen flexiblen Linker verbunden, wird in Betracht gezogen, dass eine solche Interferon-alpha-Fc-gamma4-Fusion das Komplement fixieren würde, wenn es an Interferon-alpha-Rezeptoren tragende Zellen gebunden würde.
Die cytotoxische Wirkung aufgrund der Fusion eines N-terminalen Cytokins und einer C-terminalen Fc-Region ist wohlbekannt. Zum Beispiel erzeugt die Fusion des Cytokins Interleukin-2 (IL-2) an eine Fc-Region ein Molekül, das das Komplement fixieren kann und eine Lyse der den IL-2-Rezeptor tragenden Zellen verursacht (Landolfi, N. F., US Patentschrift 5,349,053 ).
Fusionen, bei denen eine Fc-Region an den N-Terminus eines Liganden platziert werden (mit „Immunfusine" oder "Fc-X"-Fusionen bezeichnet, wobei X ein Ligand wie z. B. Interferonalpha ist), haben eine Anzahl charakteristischer, vorteilhafter biologischer Eigenschaften (Lo et al., US Patentschriften 5,726,044 und 5,541,087 ; Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495). Insbesondere können derartige Fusionsproteine noch immer an die relevanten Fc-Rezeptoren auf Zelloberflächen binden. Wenn der Ligand an seinen Rezeptor auf einer Zelloberfläche gebunden ist, ist die Orientierung der Fc-Region jedoch verändert und die ADCC und Komplementfixierung vermittelnden Sequenzen scheinen verdeckt zu sein. Als Folge vermittelt die Fc-Region in einem Fc-X-Molekül ADCC oder Komplementfixierung nicht wirkungsvoll. So wird erwartet, dass Fc-X-Fusionen die Vorteile einer erhöhten Halbwertszeit im Serum und eine relative Anreicherung in der Leber mit geringen schädlichen Wirkungen von ADCC und Komplementfixierung aufweisen.
Ein Merkmal der erfindungsgemäßen Fc-X-Konstrukte ist die Anreicherung des Zielproteins, in diesem Fall Interferon-alpha, in der Leber. Die Fc-Region der gamma1- und gamma3-Ketten zeigt die höchste Affinität für den Fc-Rezeptor, wobei die gamma4-Kette eine verminderte Affinität zeigt und die gamma2-Kette eine extrem geringe Affinität für den Fc-Rezeptor zeigt. Demzufolge werden von gamma1- oder gamma3-Ketten abgeleitete Fc-Regionen bevorzugt in den erfindungsgemäßen Fc-X-Konstrukten verwendet, da sie die höchsten Affinitäten für Fc-Rezeptoren haben und so das Interferon-alpha bevorzugt an Lebergewebe liefern können. Dies steht im Gegensatz zu einen X-Fc-Protein, zum Beispiel einem Interferon-alpha-Fc-Fusionsprotein, bei dem der mögliche Vorteil einer Anreicherung in der Leber durch die Tatsache ausgeglichen werden muss, dass dieses Fusionsprotein Effektorfunktionen vermitteln kann, nämlich Komplementfixierung und ADCC, die gegen Rezeptoren für Interferon-alpha tragende Zellen gerichtet sind.
Die Erfindung liefert so Nucleinsäuresequenzen, die für Fusionsproteine kodieren, sowie Aminosäuresequenzen, die diese Fusionsproteine definieren, die eine Fc-Region eines Immunglobulins und mindestens ein Zielprotein enthalten, das hierin als Interferon-alpha bezeichnet wird. Drei beispielhafte Ausführungsformen der die Erfindung verkörpernden Proteinkonstrukte werden in der Abbildung als 1A–1C erläutert. Da dimere Konstrukte bevorzugt sind, sind alle als Dimere dargestellt, die durch ein Paar von Disulfidbindungen zwischen Cysteinen in benachbarten Untereinheiten vernetzt sind. In den Abbildungen sind die Disulfidbindungen so dargestellt, dass sie zwei Fc-Regionen der schweren Immunglobulinkette über eine Gelenk-Region eines Immunglobulins innerhalb jeder schweren Kette miteinander verbinden, und sind so charakteristisch für native Formen dieser Moleküle. Während Konstrukte einschließlich der Gelenk-Region von Fc bevorzugt sind und sich als vielversprechende therapeutische Mittel gezeigt haben, zieht die vorliegende Erfindung in Erwägung, dass die Vernetzung an anderen Positionen, wie gewünscht, ausgewählt werden kann. Des Weiteren können, unter einigen Umständen, für die Ausführung der Erfin dung nützliche Dimere oder Multimere durch nichtkovalente Verbindung, zum Beispiel hydrophobe Wechselwirkung hergestellt werden. Da homodimere Konstrukte wichtige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, veranschaulichen die Abbildungen solche Konstrukte. Selbstverständlich sind jedoch auch heterodimere Strukturen für die Ausführung der Erfindung von Nutzen.
1A veranschaulicht ein dimeres Konstrukt, das gemäß den hier dargelegten Prinzipien hergestellt wurde (siehe, zum Beispiel, Beispiel 1). Jedes Monomer des Homodimers enthält eine Fc-Region 1 eines Immunglobulins, einschließlich einer Gelenk-Region, einer CH2-Domäne und einer CH3-Domäne. Direkt, d. h. über eine Polypeptidbindung, an den C-Terminus der Fc-Region ist Interferon-alpha 2 gebunden. Es versteht sich, dass die Fc-Region an ein Zielprotein über einen Polypeptidlinker (nicht dargestellt) gebunden sein kann.
1B und 1C zeigen erfindungsgemäße Proteinkonstrukte, die als ein Zielprotein eine Vielzahl von Interferon-alpha-Proteinen umfassen, die tandemartig angeordnet und mittels eines Linkers verbunden sind. In 1B enthält das Zielprotein Volllängen-Interferon-alpha 2, einen Polypeptidlinker bestehend aus Glycin- und Serinresten 4 und eine aktive Variante von Interferon-alpha 3. 1C unterscheidet sich vom Konstrukt der 1B dadurch, dass die C-terminale Proteindomäne hauptsächlich eine zweite Volllängenkopie von Interferon-alpha 2 enthält. Obwohl 1A–1C Fc-X-Konstrukte darstellen, in denen X das Zielprotein ist, wird in Erwägung gezogen, dass nützliche erfindungsgemäße Proteine auch durch die Formel X-Fc-X dargestellt werden können, wobei die X das gleiche oder unterschiedliche Zielproteine darstellen können.
Wie hierin verwendet wird der Begriff „Polypeptidlinker" so verstanden, dass eine Polypeptidsequenz gemeint ist, die zwei Proteine, die in der Natur nicht natürlich miteinander verbunden sind, miteinander verbinden kann. Der Polypeptidlinker enthält vorzugsweise eine Vielzahl an Aminosäuren wie zum Beispiel Alanin, Glycin und Serin oder Kombinationen solcher Aminosäuren. Vorzugsweise enthält der Polypeptidlinker eine Reihe von Glycin- und Serinpeptiden mit einer Länge von etwa 10–15 Resten. Siehe, zum Beispiel, US Patentschrift 5,258,698 . Es wird jedoch in Erwägung gezogen, dass die optimale Linkerlänge und Aminosäurezusammensetzung mittels Routineexperimenten bestimmt werden kann.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „mehrwertig" auf ein rekombinantes Molekül, das zwei oder mehr biologisch aktive Segmente einbaut hat. Die das mehrwertige Molekül bildenden Proteinfragmente können gegebenenfalls durch einen Polypeptidlinker verbunden werden, der die Bestandteile verknüpft und jedem ein unabhängiges Arbeiten ermöglicht.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „zweiwertig" auf ein mehrwertiges rekombinantes Molekül mit der Konfiguration Fc-X oder X-Fc, wobei X das Zielmolekül ist. Die Fc-Regionen des Immunglobulins können, zum Beispiel über interkettige Disulfidbindungen, verbunden sein, um die in 1A dargestellte Art von Konstrukten herzustellen. Wenn das erfindungsgemäße Fusionskonstrukt die Konfiguration Fc-X-X hat, ist das resultierende Fc-Molekül in 1C dargestellt. Die beiden Zielproteine können über einen Peptidlinker miteinander verbunden sein. Konstrukte der in 1A gezeigten Art können die scheinbare Bindungsaffinität zwischen dem Zielmolekül und seinem Rezeptor erhöhen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „multimer" auf die stabile Verbindung, entweder kovalent, zum Beispiel mittels einer kovalenten Wechselwirkung, zum Beispiel einer Disulfidbindung, oder nichtkovalent, zum Beispiel durch hydrophobe Wechselwirkung, von zwei oder mehr Polypeptid-Ketten. Der Begriff multimer soll sowohl Homomultimere, in denen die Untereinheiten die gleichen sind, als auch Heteromultimere umfassen, in denen die Untereinheiten unterschiedlich sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „dimer" auf ein spezifisches multimeres Molekül, bei dem zwei Polypeptidketten stabil durch kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen verbunden sind. Derartige Konstrukte sind schematisch in 1A dargestellt. Es versteht sich, dass die Fc-Region des Immunglobulins, die mindestens einen Teil der Gelenk-Region, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne umfasst, typischerweise ein Dimer bildet. Von vielen Proteinliganden ist bekannt, dass sie als Dimere an ihre Rezeptoren binden. Wenn ein Proteinligand X natürlich dimerisiert, wird die X-Einheit in einem Fc-X-Molekül in einem viel größeren Ausmaß dimerisieren, da der Dimerisierungsprozess konzentrationsabhängig ist. Die physikalische Nähe der beiden durch Fc verbundenen X-Einheiten würde die Dimerisierung zu einem intramolekularen Prozess machen, was das Gleichgewicht deutlich zu Gunsten des Dimers verschiebt und seine Bindung an den Rezeptor verstärkt.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Interferon-alpha" so verstanden, dass nicht nur das reife Volllängen-Interferon-alpha gemeint ist, zum Beispiel humanes Interferon-alpha 1 (SEQ ID NO: 8), humanes Interferon-alpha 2 (SEQ ID NO: 9), humanes Interferon-alpha 4 (SEQ ID NO: 10), humanes Interferon-alpha 5 (SEQ ID NO: 11), humanes Interferon-alpha 6 (SEQ ID NO: 12), humanes Interferon-alpha 7 (SEQ ID NO: 13), humanes Interferon-alpha 8 (SEQ ID NO: 14), humanes Interferon-alpha 10 (SEQ ID NO: 15), humanes Interferon-alpha 14 (SEQ ID NO: 16), humanes Interferon-alpha 16 (SEQ ID NO: 17), humanes Interferonalpha 17 (SEQ ID NO: 18), humanes Interferon-alpha 21 (SEQ ID NO: 19), Interferon-delta-1 (SEQ ID NO: 20), II-1 (Interferon-Omega-1) (SEQ ID NO: 21); und Maus-Interferon-alpha 1 (SEQ ID NO: 22), Maus-Interferon-alpha 2 (SEQ ID NO: 23), Maus-Interferon-alpha 4 (SEQ ID NO: 24), Maus-Interferon-alpha 5 (SEQ ID NO: 25), Maus-Interferon-alpha 6 (SEQ ID NO: 26), Maus-Interferon-alpha 7 (SEQ ID NO: 27), Maus-Interferon-alpha 8 (SEQ ID NO 28), und Maus-Interferon-alpha 9 (SEQ ID NO: 29), sondern auch Varianten und bioaktive Fragmente davon. Bekannte Sequenzen von Interferon-alpha können in GenBank gefunden werden.
Der Begriff bioaktives Fragment bezieht sich auf ein beliebiges Interferon-alpha-Proteinfragment, das mindestens 50 %, mehr bevorzugt mindestens 70 % und am meisten bevorzugt mindestens 90 % der biologischen Aktivität der Matrize des humanen Interferon-alpha-Proteins von SEQ ID NO: 2 aufweist, wie unter Verwendung des Zellproliferationsinhibierungsassays von Beispiel 4 bestimmt. Der Begriff Varianten umfasst Spezies- und Allelvarianten, sowie andere natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende Varianten, zum Beispiel durch gentechnische Veränderungen erzeugte, die mindestens zu 70 % ähnlich oder 60 % identisch, mehr bevorzugt mindestens zu 75 % ähnlich oder 65 % identisch und am meisten bevorzugt mindestens zu 80 % ähnlich oder 70 % identisch zu dem in SEQ ID NO: 2 offenbarten reifen, humanen Interferon-alpha-Protein sind.
Um zu bestimmen, ob ein Kandidatenpolypeptid die erforderliche Prozentähnlichkeit oder -identität mit einem Referenzpolypeptid aufweist, wird mit der Aminosäuresequenz des Kandidaten und der Aminosäuresequenz der Referenz zunächst ein Alignment durchgeführt, unter Verwendung des dynamischen Programmierungsalgorithmus, der in Smith und Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195–197 beschrieben wird, in Kombination mit der BLOSUM62-Substitutionsmatrix, die in 2 bei Henikoff und Henikoff (1992), "Amino acid substitution matrices from Protein blocks", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915–10919 beschrieben wird. Für die vorliegende Erfindung ist ein geeigneter Wert für die Lückeneinführungsstrafe –12, und ein geeigneter Wert für die Lückenerweiterungsstrafe ist –4. Computerprogramme, die Alignments unter Verwendung des Algorithmus von Smith-Waterman und der BLOSUM62-Matrix durchführen, wie zum Beispiel die GCG-Programmgruppe (Oxford Molecular Group, Oxford, England), sind kommerziell erhältlich und werden von Fachleuten weitverbreitet eingesetzt.
Sobald das Alignment zwischen der Kandidaten- und der Referenzsequenz durchgeführt wurde, kann eine Prozentähnlichkeitspunktzahl berechnet werden. Die individuellen Aminosäuren von jeder Sequenz werden nacheinander verglichen, gemäß ihrer Ähnlichkeit zueinander. Wenn der zu den beiden angeordneten Aminosäuren gehörende Wert in der BLOSUM62-Matrix Null oder eine negative Zahl ist, ist die paarweise Ähnlichkeitspunktzahl Null; ansonsten ist die paarweise Ähnlichkeitspunktzahl 1,0. Die rohe Ähnlichkeitspunktzahl ist die Summe der paarweisen Ähnlichkeitspunktzahlen der angeordneten Aminosäuren. Die Rohpunktzahl wird dann normiert, indem sie durch die Anzahl an Aminosäuren in der kleineren der Kandidaten- oder Referenzsequenz geteilt wird. Die normalisierte Rohpunktzahl ist die Prozentähnlichkeit. Alternativ werden, um eine Prozentidentität zu berechnen, die angeordneten Aminosäuren von jeder Sequenz nacheinander wieder verglichen. Wenn die Aminosäuren nicht identisch sind, ist die paarweise Identitätspunktzahl Null; ansonsten ist die paarweise Identitätspunktzahl 1,0. Die Rohidentitätspunktzahl ist die Summe der identischen angeordneten Aminosäuren. Die Rohpunktzahl wird dann normiert, indem sie durch die Anzahl an Aminosäuren in der kleineren der Kandidaten- oder Referenzsequenz geteilt wird. Die normalisierte Rohpunktzahl ist die Prozentidentität. Insertionen und Deletionen werden für Zwecke der Berechnung der Prozentähnlichkeit und -identität nicht berücksichtigt. Demzufolge werden in dieser Berechnung Lückenstrafen nicht verwendet, obwohl sie im anfänglichen Alignment verwendet wurden.
Varianten können auch andere mutierte Interferon-alpha-Proteine mit einer Interferon-alpha-ähnlichen Aktivität umfassen. Spezies- und Allelvarianten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf humane und Maus-Interferon-alpha-Sequenzen. Humane Interferon-alpha-Varianten sind in SEQ ID NOS: 8–21 gezeigt, und Maus-Interferon-alpha-Varianten sind in SEQ ID NOS: 22–29 gezeigt.
Darüber hinaus kann die Interferon-alpha-Sequenz einen Teil oder die gesamte in SEQ ID NO: 7 dargelegte Konsensussequenz enthalten, wobei das Interferon-alpha mindestens 50 %, mehr bevorzugt mindestens 70 % und am meisten bevorzugt mindestens 90 % der biologischen Aktivität des reifen, humanen Interferon-alphas von SEQ ID NO: 2 aufweist, wie unter Verwendung des Zellproliferationsinhibierungsassays aus Beispiel 4 bestimmt.
Diese Proteine haben sehr ähnliche Reinigungseigenschaften und andere biologische Eigenschaften. Insbesondere sind die DNA-Manipulation, Fusionsproteinexpression und Fusionsprotein-Reinigungseigeschaften der Fc-Interferon-alpha-Proteine äußerst ähnlich. Zum Beispiel unterscheiden sich humanes Interferon-alpha 2a und humanes Interferon-alpha 2b durch nur eine Aminosäure, wobei das Interferon-alpha 2a einen Lysinrest an der gleichen Position aufweist, in der Interferon-alpha 2b einen Argininrest aufweist. Humanes Interferonalpha 2a und humanes Interferon-alpha 2b haben äußerst ähnliche Eigenschaften und sind für alle bekannten Zwecke austauschbar.
Die dreidimensionale Struktur von Interferon-alpha wurde mittels Röntgenkristallographie gelöst (Ramaswamy et al. (1986) Structure 4: 1453). Die Sequenzen der Interferon-alpha-Proteine sind so ähnlich, dass die bestimmte Struktur als eine Struktur für die gesamte Proteinfamilie betrachtet wird. Die dreidimensionale Struktur von Interferon-alpha ist, wie die von Interferon-beta, ein Dimer mit einem Zinkion an der Dimerverbindungsstelle. In Lösung verhält sich Interferon-alpha jedoch wie ein Monomer. Es wurde vorgeschlagen, durch Analogie mit dem Cytokin IL-6 und anderen Proteinliganden, dass Interferon-alpha bei Rezeptorbindung dimerisieren kann (Radhakrishnan, R. et al. (1996) Structure 4:1453; Karpusas, M. et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 11813).
Dimerisierung eines Liganden kann die scheinbare Bindungsaffinität zwischen dem Liganden und seinem Rezeptor erhöhen. Zum Beispiel, wenn eine Interferon-alpha-Einheit eines Fc-Interferon-alpha-Fusionsproteins an einen Rezeptor auf einer Zelle mit einer bestimmten Affinität binden kann, kann die zweite Interferon-alpha-Einheit des gleichen Fc-Interferon-alpha-Fusionsproteins mit einer viel höheren Avidität (scheinbaren Affinität) binden. Dies kann aufgrund der physikalischen Nähe der zweiten Interferon-alpha-Einheit zum Rezeptor auftreten, nachdem die erste Interferon-alpha-Einheit bereits gebunden ist. Im Fall einer Bindung eines Antikörpers an ein Antigen kann die scheinbare Affinität um mindestens das zehntausendfache, d. h. 10⁴ erhöht werden. Jede Proteinuntereinheit, d. h. „X", besitzt ihre eigene unabhängige Funktion, so dass in einem mehrwertigen Molekül die Funktionen der Proteinuntereinheiten additiv oder synergistisch sein können. So kann die Fusion von normalerweise dimerem Fc-Molekül an Interferon-alpha die Aktivität von Interferon-alpha erhöhen. Demzufolge können Konstrukte der in 1A gezeigten Art die scheinbare Bindungsaffinität zwischen dem Interferon-alpha und seinem Rezeptor erhöhen.
Die hier beschriebenen Zielproteine werden als Fusionsproteine mit einer Fc-Region eines Immunglobulins exprimiert. Jede konstante Region der schweren Immunglobulinkette enthält bekanntermaßen vier oder fünf Domänen. Die Domänen werden der Reihe nach wie folgt benannt: CH1-Gelenk-CH2-CH3-(-CH4). Die DNA-Sequenzen der Schwere-Kette-Domänen weisen eine Kreuzhomologie unter den Immunglobulinklassen auf, z. B. ist die CH2-Domäne von IgG homolog zur CH2-Domäne von IgA und IgD, und zur CH3-Domäne von IgM und IgE.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Fc-Region eines Immunglobulins" so verstanden, dass der carboxylterminale Teil einer konstanten Region einer Immunglobulinkette gemeint ist, vorzugsweise einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette oder eines Teils davon. Zum Beispiel kann eine Fc-Region eines Immunglobulins umfassen 1) eine CH1-Domäne, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne, 2) eine CH1-Domäne und eine CH2-Domäne, 3) eine CH1-Domäne und eine CH3-Domäne, 4) eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne oder 5) eine Kombination aus zwei oder mehr Domänen und einer Gelenk-Region eines Immunglobulins. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Fc-Region des Immunglobulins mindestens eine Gelenk-Region eines Immunglobulins, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne, und vorzugsweise fehlt die CH1-Domäne.
Die derzeit bevorzugte Immunglobulinklasse, von der die konstante Region der schweren Kette abgeleitet wird, ist IgG (Igγ) (γ Unterklassen 1, 2, 3 oder 4). Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von humanem Fcγ-1 sind in SEQ ID NOs: 3 und 4 dargestellt. Andere Immunglobulinklassen IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) und IgM (Igμ) können verwendet werden. Die Wahl von geeigneten konstanten Regionen von schweren Immunglobulinketten werden im Detail in den U.S. Patenten Nr. 5,541,087 und 5,726,044 diskutiert. Die Wahl von bestimmten Sequenzen der konstanten Region der schweren Immunglobulinkette von bestimmten Immunglobulinklassen und Unterklassen, um ein bestimmtes Ergebnis zu erreichen, gilt als im Niveau eines Fachmanns liegend. Der Teil des DNA-Konstrukts, der für die Fc-Region des Immunglobulins kodiert, enthält vorzugsweise mindestens einen Teil einer Gelenk-Region und vorzugsweise mindestens einen Teil einer CH3-Domäne von Fcγ oder die homologen Domänen von einem beliebigen von IgA, IgD, IgE oder IgM.
In Abhängigkeit von der Anwendung können Gene für die konstante Region von anderen Spezies als Menschen, zum Beispiel der Maus oder Ratte, verwendet werden. Die als ein Fusionspartner im DNA-Konstrukt verwendete Fc-Region des Immunglobulins kann im Allgemeinen von einer beliebigen Säugetierspezies stammen. Wenn das Hervorrufen einer Immunantwort in der Wirtszelle oder dem Tier gegen die Fc-Region unerwünscht ist, kann die Fc-Region von der gleichen Spezies gewonnen werden, wie die Wirtszelle oder das Tier. Zum Beispiel kann eine humane Fc-Region eines Immunglobulins verwendet werden, wenn das Wirtstier oder die Zelle menschlich ist; ebenso kann eine murine Fc-Region eines Immunglobulins verwendet werden, wenn das Wirtstier oder die Zelle eine Maus ist.
Nucleinsäuresequenzen, die für eine humane Fc-Region eines Immunglobulins kodieren, und diese definierende Aminosäuresequenzen, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sind in SEQ ID NOS: 3 und 4 dargelegt. Jedoch wird in Erwägung gezogen, dass andere Fc-Regionssequenzen von Immunglobulin, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, in solchen gefunden werden können, zum Beispiel, die durch die in der Genbank- und/oder der EMBL-Datenbank beschriebenen Nucleotidsequenzen kodiert werden, zum Beispiel AF045536.1 (Macaca fuscicularis), AF045537.1 (Macaca mulatto), AB016710 (Felix catus), K00752 (Oryctolagus cuniculus), U03780 (Sus scrofa), 248947 (Camelus dromedarius), X62916 (Bos taurus), L07789 (Mustela vison), X69797 (Ovis aries), U17166 (Cricetulus migratorius), X07189 (Rattus rattus), AF57619.1 (Trichosurus vulpecula, oder AF035195 (Monodelphis domestica), wobei diese Beschreibungen hier durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Darüber hinaus wird in Erwägung gezogen, dass Substitution oder Deletion von Aminosäuren innerhalb der konstanten Regionen der schweren Immunglobulinkette für die Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein können. Ein Beispiel kann die Einführung von Aminosäuresubstitutionen in die obere CH2-Region umfassen, um eine Fc-Variante mit verminderter Affinität für Fc-Rezeptoren zu schaffen (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613). Ein durchschnittlicher Fachmann kann derartige Konstrukte unter Verwendung von wohlbekannten molekularbiologischen Techniken herstellen.
Die Verwendung des humanen Fcγ1 als die Fc-Regionssequenz hat mehrere Vorteile. Zum Beispiel kann, wenn das Fc-Fusionsprotein als ein Biopharmazeutikum verwendet werden soll, die Fcγ1-Domäne Effektorfunktionsaktivitäten auf das Fusionsprotein übertragen. Die Effektorfunktionsaktivitäten umfassen die biologischen Aktivitäten wie beispielsweise Plazentadurchtritt und eine längere Halbwertszeit im Serum. Die Fc-Region eines Immunglobulins ermöglicht auch den Nachweis durch anti-Fc-ELISA und Reinigung durch Bindung an das Protein A von Staphylococcus aureus ("Protein A"). In bestimmten Anwendungen kann es jedoch wünschenswert sein, spezifische Effektorfunktionen aus der Fc-Region des Immunglobulins zu deletieren, wie beispielsweise Fc-Rezeptorbindung und/oder Komplementfixierung.
Es ist bekannt, dass die vorliegende Erfindung herkömmliche Verfahren für rekombinante DNA zur Erzeugung der Fc-Fusionsproteine einsetzt, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind. Die Fc-Fusionskonstrukte werden vorzugsweise auf dem DNA-Niveau erzeugt und die resultierenden DNAs werden in Expressionsvektoren integriert und exprimiert, um die erfindungsgemäßen Fusionsproteine zu produzieren. Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Vektor" so verstanden, dass jegliche Nucleinsäure gemeint ist, die eine Nucleotidsequenz enthält, die für einen Einbau in eine Wirtszelle und für eine Rekombination mit und Integration in das Wirtszellengenom kompetent ist, oder für eine autonome Replikation als ein Episom. Derartige Vektoren umfassen lineare Nucleinsäuren, Plasmide, Phagemide, Cosmide, RNA-Vektoren, virale Vektoren und dergleichen. Nicht-einschränkende Beispiele eines viralen Vektors umfassen einen Retrovirus, einen Adenovirus und einen adenoassoziierten Virus. Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Genexpression" oder „Expression eines Zielproteins" so verstanden, dass die Transkription der DNA-Sequenz, Translation des mRNA-Transkripts und Sekretion eines Fc-Fusionsproteinprodukts gemeint ist.
Ein nützlicher Expressionsvektor ist pdCs (Lo et al. (1988) PROTEIN ENGINEERING 11:495, in dem die Transkription des Fc-X-Gens den Enhancer/Promotor des humanen Cytomegalovirus und das SV40-Polyadenylierungssignal verwendet. Die Enhancer- und Promotersequenz des verwendeten humanen Cytomegalovirus wurde von den Nucleotiden –601 bis +7 der Sequenz abgeleitet, die in Boshart et al., (1985), Cell 41:521 dargestellt wurde. Der Vektor enthält auch das mutierte Dihydrofolatreduktase-Gen als einen Selektionsmarker (Simonsen und Levinson (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:2495).
Eine geeignete Wirtszelle kann mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz transformiert oder transfiziert werden und für die Expression und/oder Sekretion des Zielproteins genutzt werden. Derzeit bevorzugte Wirtszellen für die Verwendung in der Erfindung umfassen unsterbliche Hybridom-Zellen, NS/O-Myelom-Zellen, 293-Zellen, Chinese hamster ovary-Zellen, HELA-Zellen und COS-Zellen.
Ein Expressionssystem, das für die Herstellung einer Expression der Fusionsproteine in Säugetierzellen in hohen Spiegeln verwendet wurde, ist ein DNA-Konstrukt, das in der 5'- nach 3'-Richtung für eine Sekretionskassette kodiert, die eine Signalsequenz und eine Fc-Region eines Immunglobulins und ein Zielprotein umfasst. Mehrere Zielproteine wurden in einem solchen System erfolgreich exprimiert und umfassen, zum Beispiel, IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, βIG-H3, IgE-Rezeptor, PSMA und gp120. Diese Expressionskonstrukte werden in den U.S. Patenten Nr. 5,541,087 und 5,726,044 an Lo et al. beschrieben.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Signalsequenz" so verstanden, das ein Segment gemeint ist, das die Sekretion des Interferon-alpha-Fusionsproteins steuert und danach im Anschluss an die Translation in der Wirtszelle abgespalten wird. Die erfindungsgemäße Signalsequenz ist ein Polynucleotid, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die den Transport eines Proteins durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums initiiert. Signalsequenzen, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, umfassen Signalsequenzen von leichten Ketten von Antikörpern, z. B. Antikörper 14.18 (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth., 125:191), Signalsequenzen von schweren Ketten von Antikörpern, z. B. der Signalsequenz der schweren Kette des Antikörpers MOPC141 (Sakano et al. (1980) Nature 286:5774), und beliebige andere Signalsequenzen, die auf dem Gebiet bekannt sind (siehe z. B., Watson (1984) Nucleic Acids Research 12:5145).
Signalsequenzen wurden auf dem Gebiet gut charakterisiert und es ist bekannt, dass sie typischerweise 16 bis 30 Aminosäurereste enthalten und mehr oder weniger Aminosäurereste enthalten können. Ein typisches Signalpeptid besteht aus drei Regionen, einer basischen N-terminalen Region, einer zentralen hydrophoben Region und einer polareren C-terminalen Region. Die zentrale hydrophobe Region enthält 4 bis 12 hydrophobe Reste, die das Signalpeptid durch die Membran-Lipiddoppelschicht während des Transports des naszierenden Polypeptids verankern. Im Anschluss an die Initiierung wird das Signalpeptid gewöhnlich durch zelluläre Enzyme, die als Signalpeptidasen bekannt sind, innerhalb des Lumens des endoplasmatischen Retikulums abgespalten. Mögliche Spaltungsstellen des Signalpeptids folgen im Allgemeinen der „(–3, –1)-Regel". So hat ein typisches Signalpeptid kleine, neutrale Aminosäurereste in den Positionen –1 und –3 und es fehlen Prolinreste in dieser Region. Die Signalpeptidase wird ein derartiges Signalpeptid zwischen den Aminosäuren –1 und +1 spalten. So kann die Signalsequenz während der Sekretion vom Amino-Terminus des Fusionsproteins abgespalten werden. Dies führt zu der Sekretion eines Fc-Fusionsproteins, bestehend aus der Fc-Region des Immunglobulins und dem Zielprotein. Eine detaillierte Diskussion von Signalpeptidsequenzen wird dargestellt von von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14:4683.
Wie einem Fachmann offensichtlich wäre, kann die Eignung einer bestimmten Signalsequenz für die Verwendung in der Sekretionskassette einige Routineexperimente erfordern. Derartige Experimente werden die Bestimmung der Fähigkeit der Signalsequenz umfassen, die Sekretion eines Fc-Fusionsproteins zu steuern, und auch die Bestimmung einer optimalen Konfiguration, genomisch oder cDNA, der zu verwendenden Sequenz, um eine effiziente Sekretion von Fc-Fusionsproteinen zu erreichen. Zusätzlich ist ein Fachmann in der Lage, ein synthetisches Signalpeptid zu erschaffen, indem er den von von Heijne vorgestellten Regeln folgt, die oben zitiert wurden, und auf die Effizienz einer derartigen synthetischen Signalsequenz durch Routineexperimente zu testen. Eine Signalsequenz kann auch als ein „Signalpeptid", eine „Leader-Sequenz" oder als „Leader-Peptid" bezeichnet werden.
Die Fusion der Signalsequenz und der Fc-Region des Immunglobulins wird manchmal hierin als Sekretionskassette bezeichnet. Eine für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nützliche, beispielhafte Sekretionskassette ist ein Polynucleotid, das in seiner 5'- nach 3'- Richtung für eine Signalsequenz eines Gens einer leichten Immunglobulinkette und die Fcγ1-Region des Gens von humanem Immunglobulin γ1 kodiert. Die Fcγ1-Region des Gens für Immunglobulin Fcγ1 umfasst vorzugsweise mindestens einen Teil der Gelenk-Domäne des Immunglobulins und mindestens die CH3-Domäne oder mehr bevorzugt mindestens einen Teil der Gelenk-Domäne, die CH2-Domäne und die CH3-Domäne. Wie hierin verwendet wird „Teil" der Gelenk-Region des Immunglobulins so verstanden, das ein Teil des Immunglobulingelenks gemeint ist, der mindestens einen, vorzugsweise zwei Cysteinreste enthält, die zwischen den Ketten Disulfidbindungen bilden können. Die für die Sekretionskassette kodierende DNA kann in ihrer genomischen Konfiguration oder in ihrer cDNA-Konfiguration vorliegen. Unter bestimmten Umständen kann es von Vorteil sein, die Fc-Region aus den Sequenzen der humanen schweren Kette von Fcγ2-Immunglobulin herzustellen. Obwohl Fc-Fusionen, die auf humanen Immunglobulin γ1 und γ2-Sequenzen beruhen, sich in Mäusen ähnlich verhalten, können auf den γ2-Sequenzen beruhende Fc-Fusionen überlegene Pharmakokinetik in Menschen zeigen.
Des Weiteren wären Substitution oder Deletion von Konstrukten dieser konstanten Regionen, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste der konstanten Regionsdomäne substituiert oder deletiert sind, ebenfalls von Nutzen. Ein Beispiel wäre die Einführung von Aminosäure-Substitutionen in die obere CH2-Region, um eine Fc-Variante mit verminderter Affinität für Fc-Rezeptoren zu schaffen (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613). Ein durchschnittlicher Fachmann kann derartige Konstrukte unter Verwendung von wohlbekannten molekularbiologischen Techniken herstellen.
In den hierin beschriebenen Beispielen wurden hohe Spiegel von Fc-Interferon-alpha erzeugt. Die ersten Klone erzeugten etwa 50 μg/ml an Fc-Interferon-alpha, das ohne weiteres mittels Protein A-Affinitätschromatographie bis zur Homogenität gereinigt werden konnte. Expressionsspiegel können oftmals um ein Mehrfaches durch Subklonieren erhöht werden. Wie oben dargelegt, wurde gefunden, dass wenn Interferon-alpha als Fc-Fusionsmoleküle exprimiert wird, hohe Expressionsspiegel erhalten werden, vermutlich weil der Fc-Teil als ein Träger fungiert, was eine korrekte Faltung des Polypeptids am C-Terminus und eine effiziente Sekretion unterstützt. Darüber hinaus wird die Fc-Region glykosyliert und bei physiologischem pH-Wert hoch geladen, so dass die Fc-Region das Lösen von hydrophoben Proteinen unterstützen kann.
Zusätzlich zu den hohen Expressionsspiegeln zeigen Interferon-alpha-Fusionsproteine längere Halbwertszeiten im Serum verglichen mit Interferon-alpha allein, aufgrund ihrer größeren Molekülgrößen. Zum Beispiel hat Fc-Interferon-alpha eine Halbwertszeit im Blutkreislauf von 19,3 Stunden in der Maus (siehe Beispiel 6), verglichen mit 2–5 Stunden für Interferonalpha (Physicians Desk Reference, 50. Aufl., 1996:2156–2147 und 2364–2373). Interferonalpha, mit einem Molekulargewicht von etwa 19 kD, ist klein genug, um effizient mittels renaler Filtration ausgeschieden zu werden. Im Gegensatz dazu hat Fc-Interferon-alpha ein Molekulargewicht von etwa 100 kD, da dort zwei Interferon-alpha-Einheiten an jedes Fc-Molekül geknüpft sind (d. h. zwei Interferon-alphas, da Fc in seiner dimeren Form vorliegt). Eine derartige dimere Struktur kann eine höhere Bindungsaffinität an den Interferon-alpha-Rezeptor aufweisen. Da die Interferon-alpha-Aktivität rezeptorvermittelt ist, werden die zweiwertigen Interferon-alpha-Fusionsproteine potenziell wirksamer sein als Interferon-alpha selbst.
Außerdem ist von vielen Proteinliganden bekannt, dass sie als Dimere an ihre Rezeptoren binden. Da Interferon-alpha zu einer Klasse von Proteinliganden mit schwachen Dimerisierungskonstanten gehört, würde der durch das Fc auf das Interferon-alpha auferlegte physikalische Zwang die Dimerisierung zu einem intramolekularen Prozess machen und so das Gleichgewicht zu Gunsten des Dimers verschieben und seine Bindung an die Rezeptoren verstärken. Cysteinreste können auch mittels standardmäßiger rekombinanter DNA-Techniken in das Monomer an geeigneten Stellen eingeführt werden, um das Dimer durch kovalente Disulfidbindungsbildung zu stabilisieren.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine bieten mehrere wichtige klinische Vorteile. Wie in Untersuchungen der biologischen Aktivität in der Daudi-Zelle und Assays zur cytopathischen Wirkung (Beispiel 4) nachgewiesen wurde, ist die biologische Aktivität von Fc-Interferon-alpha deutlich höher als die von Interferon-alpha.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass die Sequenzen und Eigenschaften von verschiedenen Interferon-alpha-Proteinen und kodierenden DNAs recht ähnlich sind. Im Rahmen der Fc-X-Fusionen sind die Eigenschaften von Interferon-alpha-Proteinen und kodierenden DNAs im Wesentlichen identisch, so dass ein allgemeiner Satz an Techniken verwendet werden kann, um eine beliebige Fc-Interferon-alpha-DNA-Fusion zu erzeugen, um die Fusion zu exprimieren, das Fusionsprotein zu reinigen und das Fusionsprotein für therapeutische Zwecke zu verabreichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung von Interferon-alpha von nicht-menschlichen Spezies als Fc-Fusionsproteine bereit. Nicht-menschliche Interferon-alpha-Fusionsproteine sind für vorklinische Studien von Interferon-alpha von Nutzen, da vor der Untersuchung in Menschen Wirkungs- und Toxizitätsstudien eines Proteinwirkstoffs in Tiermodellsystemen durchgeführt werden müssen. Ein humanes Protein arbeitet vielleicht nicht in einem Mausmodell, da das Protein vielleicht eine Immunantwort hervorruft und/oder eine andere Pharmakokinetik aufweist, was die Testergebnisse verfälscht. Daher ist ein äquivalentes Mausprotein der beste Ersatz für das humane Protein, um es in einem Mausmodell zu untersuchen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung von verschiedenen Karzinomen, viralen Erkrankungen, anderen Erkrankungen, damit verbundenen Zuständen und Ursachen davon bereit, indem die erfindungsgemäße DNA, RNA oder erfindungsgemäßen Proteine einem einen solchen Zustand aufweisenden Säugetier verabreicht werden. Damit verbundene Zustände können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, genitale Warzen, Haarzell-Leukämie, mit AIDS einhergehendes Kaposi-Sarkom, Melanome, Prostatakarzinom sowie andere Formen von viralen Erkrankungen und Karzinomen. Angesichts der vielfältigen Rollen, die Interferon-alpha bei der Modulierung von Immunantworten spielt, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Behandlung von Zuständen bereit, die durch die Verabreichung von Interferon-alpha gemildert werden. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an ein Säugetier mit diesem Zustand, der direkt mit einer viralen Infektion oder einem Karzinom einhergehen kann oder nicht.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind nicht nur als therapeutische Mittel von Nutzen, sondern ein Fachmann erkennt, dass die Proteine bei der Herstellung von Antikörpern für eine diagnostische Verwendung von Nutzen sind. Ebenso ist die geeignete Verabreichung der DNA oder RNA, z. B. in einen Vektor oder einem anderen Transportsystem für derartige Verwendungen, in die erfindungsgemäßen Verfahren zur Verwendung eingeschlossen.
Als ein Fusionsprotein mit dem Fc eines Immunglobulins, kann Fc-Interferon-alpha eine sehr günstige Gewebeverteilung und eine geringfügig andere Wirkungsweise zum Erreichen klinischer Wirksamkeit aufweisen, insbesondere angesichts seiner langen Halbwertszeit im Serum und der hohen Dosis an löslichem Protein, die verabreicht werden kann. Insbesondere gibt es einen hohen Spiegel an Fc-gamma-Rezeptor in der Leber, die der Infektionsort durch Hepatitis B und Hepatitis D verursachende Viren ist. Es wird angenommen, dass neurologische Nebenwirkungen von Interferon-alpha auftreten, weil die geringe Größe von Interferon-alpha ihm ermöglicht, durch die Blut-Hirn-Schrank zu gelangen. Die viel größere Größe von Fc-Interferon-alpha vermindert das Ausmaß, mit dem dieses Protein die Blut-Hirn-Schranke überwindet, deutlich.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können über jeglichen Weg verabreicht werden, der mit den bestimmten Molekülen verträglich ist. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einem Tier mittels einem beliebigen geeigneten Mittel gegeben werden können, direkt (z. B. lokal wie durch Injektion, Implantation oder topische Verabreichung auf einen Gewebeort) oder systemisch (z. B. parenteral oder oral). Wenn die Zusammensetzung parenteral gegeben werden soll, wie z. B. durch intravenöse, subkutane, ophthalmische, intraperitoneale, intramuskuläre, buccale, rektale, vaginale, intraorbitale, intrazerebrale, intrakranielle, intraspinale, intraventrikuläre, intrathekale, intrazisternale, intrakapsuläre, intranasale Verabreichung oder über Aerosol, enthält die Zusammensetzung vorzugsweise Teile einer wässrigen oder physiologisch verträglichen Flüssigsuspension oder Lösung. So ist der Träger oder das Vehikel physiologisch unbedenklich, so dass dieser zusätzlich zur Gabe der gewünschten Zusammensetzung an den Patienten keine ansonsten gegensätzliche Wirkung auf das Elektrolyt- und/oder Volumengleichgewicht des Patient hat. Das flüssige Medium für das Mittel kann so normale physiologische Kochsalzlösung enthalten.
Die Erfindung weist Expressionsvektoren für Transfektion und Expression eines Fusionsproteinkonstrukts von Interferon-alpha in vivo in bestimmten Zellarten auf, so dass die Funktion von Interferon-alpha wiederhergestellt oder ergänzt wird. Expressionskonstrukte von Fusionsproteinkonstrukten von Interferon-alpha können in einem beliebigen biologisch wirksamen Träger verabreicht werden, z. B. eine beliebige Formulierung oder Zusammen setzung, die das Fusionsproteinkonstrukt von Interferon-alpha Zellen in vivo effizient liefern kann. Ansätze umfassen Insertion des Subjektgens in virale Vektoren, einschließlich rekombinanter Retroviren, Adenovirus, adenoassoziiertem Virus und Herpes simplex-Virus 1 oder in rekombinante bakterielle oder eukaryotische Plasmide.
Bevorzugte Dosierungen des Fusionsproteins pro Verabreichung liegen in einem Bereich von 0,1 mg/m²–100 mg/m², mehr bevorzugt 1 mg/m²–20 mg/m² und am meisten bevorzugt 2 mg/m²–6 mg/m². Es wird in Erwägung gezogen, dass die optimale Dosierung jedoch auch von der behandelten Krankheit und von der Existenz von Nebenwirkungen abhängt. Optimale Dosierungen können jedoch unter Verwendung von Routineexperimenten bestimmt werden. Verabreichung des Fusionsproteins kann über periodische Bolusinjektionen oder über kontinuierliche intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung aus einem externen (zum Beispiel aus einem Infusionsbeutel) oder internen Vorrat (zum Beispiel aus einem biologisch abbaubaren Implantat) erfolgen. Weiterhin wird erwogen, dass die erfindungsgemäßen Fusionsproteine dem beabsichtigten Empfänger auch zusammen mit einer Vielzahl an verschiedenen biologisch aktiven Molekülen verabreicht werden kann. Es ist jedoch zu erwägen, dass die optimale Kombination aus Fusionsprotein und anderen Molekülen, Arten der Verabreichung, Dosierungen mittels Routineexperimenten ermittelt werden können, die gut innerhalb des Wissens des Fachgebiets liegen.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert.
BEISPIELE
Beispiel 1. Expression von huFc-huInterferon-alpha (huFc-IFN-alpha)
mRNA wurde aus humanen peripheren mononuklearen Blutzellen präpariert und mit Reverser Transkriptase revers transkribiert. Die resultierende cDNA wurde als Matrize für die Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendet, um die humane Interferon-alpha-cDNA für Expression als ein huFc-Interferon-alpha-(huFc-IFN-alpha-)Fusionsprotein zu klonen und anzupassen. Der Vorwärts-Primer war 5' C CCG GGT AAA TGT GAT CTG CCT CAG AC (SEQ ID NO: 5), wobei die Sequenz CCCGGG (XmaI-Restriktionsstelle) TAAA für den Carboxyterminus der schweren Immunglobulinkette kodiert, gefolgt von der Sequenz (fett), die für den N-Terminus von Interferon-alpha kodiert. Der Rückwärts-Primer war 5' CTC GAG TCA ATC CTT CCT CCT TAA TC (SEQ ID NO: 6), der für die carboxyterminale Sequenz (Antisense) von Interferon-alpha mit seinem Translationsstoppcodon (Anticodon, TCA) kodiert, und auf dieses folgte eine XhoI-Stelle (CTCGAG). Ein PCR-Produkt mit 517 Basenpaaren wurde kloniert und sequenziert. Eine Sequenzanalyse bestätigte, dass das PCR-Produkt für das reife, humane, für die Expression adaptierte Interferon-alpha kodiert, d. h. mit einer XmaI- am 5'-Ende und einer XhoI-Stelle am 3'-Ende.
Der Expressionsvektor pdCs-huFc-IFN-alpha wurde wie folgt konstruiert. Das XmaI-XhoI-Restriktionsfragment, das die humane Interferon-alpha-cDNA enthielt, wurde an das XmaI-XhoI-Fragment des pdCs-huFc-Vektors gemäß Lo et al. (1998) Protein Engineering 11: 495 ligiert. huFc ist das humane Fc-Fragment von humanem Immunglobulin gamma1. Der resultierende Vektor, pdCs-huFc-IFN-alpha, wurde verwendet, um Säugetierzellen für die Expression von huFc-IFN-alpha zu transfizieren.
Beispiel 2. Transfektion und Expression von Protein
Für eine transiente Transfektion wurde das Plasmid pdCs-huFc-IFN-alpha mittels Cofällung von Plasmid-DNA mit Calciumphosphat in humane 293-Nierenzellen eingeführt (Sambrook et al. Hrsg. (1989) "Molecular Cloning-A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press, NY), oder durch Lipofektion unter Verwendung von Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß den Angaben des Herstellers.
Um stabil transfizierte Klone zu erhalten, wurde die Plasmid-DNA in Maus-Myelom-NS/0-Zellen mittels Elektroporation eingeführt. Kurz gesagt, wurden die NS/0-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und Penicillin/Streptomycin, gezüchtet. Etwa 5 × 10⁶ Zellen wurden einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in 0,5 ml PBS resuspendiert. Zehn μg linearisierter Plasmid-DNA wurden dann mit den Zellen in einer Gene Pulser Küvette (0,4 cm Elektrodenlücke, BioRad) auf Eis für 10 min inkubiert. Elektroporation wurde unter Verwendung eines Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) mit Einstellungen bei 0,25 V und 500 μF ausgeführt. Die Zellen durften sich 10 min auf Eis erholen, dann wurden sie im Wachstumsmedium resuspendiert und auf zwei 96-Well-Platten ausplattiert. Stabil transfizierte Klone wurden durch Wachstum in Gegenwart von 100 nM Methotrexat (MTX) selektiert, das zwei Tage nach der Transfektion eingeführt wurde. Die Zellen wurden alle 3 Tage zwei oder drei weitere Male gefüttert und die MTX-resistenten Klone erschienen nach 2 bis 3 Wochen. Überstände von Klonen wurden durch anti-Fc-ELISA untersucht (siehe Beispiel 3), um starke Produzenten zu identifizieren. Stark produzierende Klone wurden isoliert und in 100 nM MTX enthaltendem Wachstumsmedium vermehrt.
Für Routinecharakterisierung durch Gelelektrophorese wurden Fc-Fusionsproteine in den konditionierten Medien auf Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA) gefangen und dann durch Kochen in einem Standardproteinprobenpuffer mit oder ohne 2-Mercaptoethanol von der Protein A-Sepharose eluiert. Nach Elektrophorese auf einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden die Proteinbanden mittels Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht. Durch SDS-PAGE wies das huFc-huInterferon-alpha ein scheinbares MW von etwa 52 kD auf.
Zur Reinigung wurden die auf Protein A Sepharose gebundenen Fusionsproteine in einen Natriumphosphatpuffer (100 mM NaH₂PO₄, pH 3, und 150 mM NaCl) eluiert. Das Eluat wurde dann sofort mit 0,1 Volumen 2 M Tris-Hydrochlorid, pH 8, neutralisiert.
Beispiel 3. ELISA-Verfahren
Die Konzentration an humanes Fc enthaltenden Proteinprodukten in den Überständen der MTX-resistenten Klone und anderen Testproben wurde mittels anti-huFc-ELISA bestimmt. Die Verfahren werden im Folgenden genauer beschrieben.
A. Beschichtung der Platten.
ELISA-Platten wurden mit AffiniPure Ziegen-Anti-Human-IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) bei 5 μg/ml in PBS and 100 μl/Loch in 96-Lochplatten (Nunc-Immuno plate Maxisorp) beschichtet. Beschichtete Platten wurden bedeckt und bei 4 °C über Nacht inkubiert. Platten wurden dann 4 Mal mit 0,05 % Tween (Tween 20) in PBS gewaschen und mit 1 % BSA/1 % Ziegenserum in PBS, 200 μl/Loch blockiert. Nach Inkubation mit dem Blockierungspuffer bei 37 °C für 2 Std. wurden die Platten 4 Mal mit 0,05 % Tween in PBS gewaschen und auf Papiertüchern trocken geklopft.
B. Inkubation mit Testproben und sekundärem Antikörper
Testproben wurden soweit erforderlich in Probenpuffer (1 % BSA/1 % Ziegenserum/0,05 % Tween in PBS) verdünnt. Es wurde eine Standardkurve unter Verwendung eines chimären Antikörpers (mit einem humanen Fc) hergestellt, dessen Konzentration bekannt war. Um eine Standardkurve herzustellen, wurden im Probenpuffer Reihenverdünnungen gemacht, um eine Standardkurve im Bereich von 125 ng/ml bis 3,9 ng/ml zu ergeben. Die verdünnten Proben und Standards wurden zu der Platte gegeben, 100 μl/Well, und die Platte wurde bei 37 °C für 2 h inkubiert. Nach Inkubation wurde die Platte 8 Mal mit 0,05 % Tween in PBS gewaschen. Zu jedem Well wurden dann 100 μl des sekundären Antikörpers, das mit Meerrettichperoxidase konjugierte Anti-humane IgG, (Jackson Immuno Research) verdünnt auf etwa 1:120.000 in dem Probenpuffer, gegeben. Die genaue Verdünnung des sekundären Antikörpers muss für jede Charge des HPR-konjugierten anti-humanen IgG bestimmt werden. Nach Inkubation bei 37 °C für 2 h wurde die Platte 8 Mal mit 0,05 % Tween in PBS gewaschen.
C. Entwicklung
Die Substratlösung wurde zu der Platte mit 100 μl/Loch gegeben. Die Substratlösung wurde hergestellt durch Lösen von 30 mg OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD), 1 Tablette) in 15 ml 0,025 M Zitronensäure/0,05 M Na₂HPO₄-Puffer, pH 5, der 0,03 % frisch zugegebenem Wasserstoffperoxid enthielt. Die Farbe durfte sich 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln entwickeln. Die Entwicklungszeit unterliegt Veränderungen, in Abhängigkeit von der Charge-zu-Charge-Variabilität der beschichteten Platten, des sekundären Antikörpers, usw. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4N Schwefelsäure, 100 μl/Loch gestoppt. Die Platte wurde durch einen Plattenleser ausgelesen, der sowohl auf 490 wie auch auf 650 nm eingestellt und darauf programmiert war, die Hintergrund-OD bei 650 nm von der OD bei 490 nm zu subtrahieren.
Beispiel 4. Bioassavs
Die Bioaktivität von huFc-huIFN-alpha wurde mit der von humanem Interferon-alpha (hu-IFN-alpha) humanem Leukozyten-Interferon von Sigma, St. Louis, MO) unter Verwendung zweier unterschiedlicher Assays verglichen. Das erste Assay bestimmt die Inhibierung der Proliferation der humanen Daudi-Lymphoblastoid-20B-Zelllinie (ATCC CCL 213). Das zweite Assay misst die Inhibierung der cytopathischen Wirkung des Enzephalomyokarditisvirus (EMCV) auf die humane Lungenkarzinom-Zelllinie A549 (ATCC CCL 185).
Interferon-alpha inhibiert die Proliferation von Daudi-Zellen (humanes Burkitt-Lymphom). Daudi-Zellen wurden zweimal mit serumfreien RPMI 1640 gewaschen und in Wachstumsmedium, bestehend aus RPMI 1640 und 20 % hitzeinaktiviertem (56 °C) fötalem Rinderserum resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit 1 × 10⁵ Zellen/ml/Well auf einer 24-Well-Platte in der Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an α-IFH (2,1 × 10⁶ International units/mg) und huFc-huIFN-alpha ausplattiert. Nach 3–4 Tagen wurde gefunden, dass 50 pg/ml IFN-alpha in der Form von huFc-huIFN-alpha so wirksam waren wie 750 pg/ml huIFN-alpha um eine 50–100 %ige Inhibierung des Wachstums von Daudi-Zellen zu erreichen. Als eine Kontrolle zeigte Interferon-gamma (Pharmingen, San Diego, CA) bei 100 ng/ml in diesem Assay keine Aktivität. Dies zeigt, dass die Inhibierung für Interferonalpha spezifisch ist.
Beispiel 5. Messung der antiviralen Aktivität
Virale Replikation in Zellkultur führt oftmals zu Cytotoxizität, eine Wirkung, die als cytopathischer Effekt (CPE) bekannt ist. Interferone können in Zellkulturen einen antiviralen Zustand induzieren und Zellen vor einem solchen CPE schützen. Die antivirale Aktivität von IFN-alpha kann mittels Assays zur Verminderung des cytopathischen Effekts (CPER) quantifiziert werden, wie beschrieben in "Lymphokines and Interferons: A Practical Approach," herausgegeben von M.J. Clemens, A.G. Morris und A.J.H. Genring, I.R.L. Press, Oxford, 1987. Die antiviralen Aktivitäten von huFc-huIFN-alpha und huIFN-alpha wurden unter Verwendung der humanen Lungenkarzinomzelllinien A549 (ATCC CCL 185) und dem Enzephalomyokarditisvirus (ATCC VR 129B) gemäß dem in der oben genannten Referenz beschriebenen CPER-Protokoll verglichen. Es wurde gefunden, dass die wirksamen Dosen zum Erreichen von 50 % CPER (d. h. 50 %iger Schutz) für huFc-huIFN-alpha 570 pg/ml (basierend auf der Menge an IFN-alpha) und für huIFN-alpha 500 pg/ml betrugen. Demzufolge weisen das IFN-alpha in huFc-huIFN-alpha und huIFN-alpha im Wesentlichen die gleiche antivirale Aktivität auf.
Beispiel 6. Pharmakokinetik
Die Pharmakokinetik von huFc-huIFN-alpha wurde in einer Gruppe von 4 Balb/c-Mäusen bestimmt. Fünfundzwanzig Milligramm huFc-huIFN-alpha wurden in die Schwanzvene jeder Maus injiziert. Mittels retroorbitalem Aderlass wurde direkt nach der Injektion (d. h. bei t = 0 min), und bei 0,5, 1, 2, 4, 8 und 24 h nach der Injektion Blut entnommen. Die Blutproben wurden in heparinhaltigen Röhrchen gesammelt, um eine Gerinnung zu verhindern. Zellen wurden mittels Zentrifugieren in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge von Eppendorf für 4 min erhalten. Die Konzentration von huFc-huIFN-alpha im Plasma wurde mittels anti-huFc-ELISA und Western Blot-Analyse mit anti-huFc-Antikörper gemessen, was auch zeigte, dass huFc-huIFN-alpha im Kreislauf intakt blieb (52 kD-Bande für huFc-huIFN-alpha). Es konnten keine Abbauprodukte (32 kD-Bande für huFc) nachgewiesen werden. Die Halbwerts zeit im Blutkreislauf von huFc-huIFN-alpha wurde mit 19,3 h bestimmt, was deutlich länger ist, als die berichtete Halbwertszeit im Blutkreislauf von humanem IFN-alpha von etwa 2 bis 5 h (Physicians Desk Reference, 50. Aufl. 1996:2145–2147 und 2364–2373).
Beispiel 7. Behandlung von diffusem Wachstum von humanem Burkitt-Lymphom in SCID-Mäusen
Daudi-Zellen (humanes Burkitt-Lymphom) wurden in den C.B-17-SCID-(Schweres kombiniertes Immunmangelsyndrom)Mäusen als diffuse Tumore gezüchtet (Ghetie et al. (1990) Intl. J. Cancer: 45:481). Es wurden etwa 5 × 10⁶ Daudi-Zellen einer Einzelzellsuspension in 0,2 ml PBSB intravenös in 6–8 Wochen alte SCID-Mäuse injiziert. Drei Tage später wurden die Mäuse willkürlich in drei Gruppen zu acht Mäusen aufgeteilt und erhielten täglich intraperitoneale Injektionen von 0,2 ml PBS, 30 μg huFc-huIFN-alpha (enthaltend etwa 12 μg IFN-alpha) in PBS oder 60 μg huFc-huIFN-alpha in PBS. Die Mäuse wurden täglich überwacht. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
An Tag 28 nach der Daudi-Zelleninjektion hatten alle Mäuse in der Kontrollgruppe mit PBS (Rauten) eine Lähmung der Hinterbeine entwickelt. Die Mäuse in dieser PBS-Kontrollgruppe begannen an Tag 38 zu sterben und bis Tag 61 waren alle Mäuse der Kontrollgruppe gestorben. Im Gegensatz dazu überlebten die Mäuse in den Behandlungsgruppen viel länger und auf eine dosisabhängige Weise. Bei der Gruppe, die 30 μg huFc-huIFN-alpha erhielt (Kreuze), trat der erste Tod an Tag 70 auf und bis Tag 134 waren alle Mäuse gestorben. Bei der Gruppe, die 60 μg huFc-huIFN-alpha erhielt (Dreiecke), trat der erste Tod erst an Tag 126 auf und bis Tag 153 starben vier weitere. Der Rest der Mäuse war krank und wurde eingeschläfert.
Beispiel 8. Behandlung von lokalisiertem Wachstum von humanem Burkitt-Lymphom in SCID-Mäusen
In diesem Modell wurden Daudi-Zellen in den C.B-17 SCID-Mäusen als subkutane Tumore gezogen (Ghetie et al. (1990) Int. J. Cancer: 45–481). Es wurden etwa 6 × 10⁶ Daudi-Zellen einer Einzelzellsuspension in 0,1 ml PBS subkutan in 6–8 Wochen alte SCID-Mäuse injiziert. Die Behandlung begann, wenn die Tumore 200–400 mm³ erreicht hatten, was etwa 4 Wochen dauerte. Die Mäuse wurden willkürlich in 3 Gruppen zu 8 Mäusen aufgeteilt und jede Gruppe erhielt 6 tägliche intraperitoneale Injektionen von 0,2 ml PBS, 30 μg huFc-huIFN-alpha in PBS oder 60 μg huFc-huIFN-alpha in PBS. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die Größe der Tumore wurde zweimal wöchentlich gemessen.
Die Tumore in den Kontrollgruppen-Mäusen (Rauten) wuchsen rasch zu einem mittleren Volumen von 5602 mm³ (Bereich: 4343–6566 mm³) bis Tag 35, danach wurden alle Mäuse in der Gruppe eingeschläfert. Im Gegensatz dazu wurde das Tumorwachstum in den Mäusen der Behandlungsgruppen auf eine dosisabhängige Weise unterdrückt. Die Gruppen, die 30 μg und 60 μg huFc-huIFN-alpha erhielten, wiesen an Tag 35 mittlere Tumorvolumina von 214 bzw. 170 mm³ auf, was viel kleiner war als die 268 und 267 mm³ vor der Behandlung. Tatsächlich schrumpften die subkutanen Tumore in 5 von 8 Mäusen in der 30 μg huFc-huIFN-alpha erhaltenden Gruppe und bei 4 von 8 Mäusen in der 60 μg huFc-huIFN-alpha erhaltenden Gruppe vollständig. Ohne weitere Behandlung kamen einige der Tumore jedoch zurück und wuchsen. Nichtsdestotrotz blieben zwei Mäuse in der Gruppe bis zum Tag 205, an dem das Experiment beendet wurde, tumorfrei.
Beispiel 9. Behandlung einer Lebererkrankung mit Fc-Interferon-alpha.
Es wird in Erwägung gezogen, dass eine Lebererkrankung, zum Beispiel Hepatitis oder Lebermetastasen, wirksamer mit Fc-Interferon-alpha als mit Interferon-alpha oder Interferon-alpha-Fc behandelt werden können.
Zum Beispiel wird in Erwägung gezogen, dass Fc-Interferon-alpha bei der Behandlung eines Mausmodells, bei dem Tumorzellen in die Leber metastasieren, wirksam sein kann. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in 0,2 ml PBS etwa 5 Minuten vor der Operation betäubt. Die folgenden Schritte wurden dann in einer Sterilbank durchgeführt, um Sterilität zu gewährleisten. Die Haut von jeder Maus wird mit Betadine und Ethanol gereinigt Tumorzellen wie z. B. Daudi-Zellen wurden in 100 Mikrolitern RPMI 1640-Medium ohne Zusatz über einen Zeitraum von etwa einer Minute unter Verwendung einer 27-gauge Nadel unter die Milzkapsel injiziert. Nach zwei Minuten wurde der Milzstiel mit einem 4,0 Seidenfaden abgebunden und die Milz entfernt.
Einige Zellen wurden von der Injektionsstelle in die Leber getragen, wo sie metastatische Tumore bilden können. Mäuse mit metastatischen Lebertumoren wurden anschließend mit Fc-Interferon-alpha behandelt. Es wird in Erwägung gezogen, dass mit Fc-Interferon-alpha behandelte Mäuse eine deutliche Verminderung des Tumorwachstums zeigen, bezogen auf Mäuse, die mit einer äquimolaren Menge an Interferon-alpha oder Interferon-alpha-Fc-Fusionsprotein behandelt wurden.
Darüber hinaus wird in Erwägung gezogen, dass die spezifische Wirkung von Fc-Interferon-alpha bei der Behandlung von Lebererkrankung deutlicher ist als bei der Behandlung von Störungen, die in anderen Geweben lokalisiert sind, wo Fc-Interferon-alpha nicht angereichert wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fusionsprotein mit der biologischen Aktivität von Interferon alpha, das Interferon alpha in der Leber anreichern kann, wobei dieses Fusionsprotein in Richtung vom N- zum C-Terminus eine Immunglobulin-Fc-Region, die von IgG1 oder IgG3 abstammt, und ein Zielprotein, enthaltend Interferon alpha, enthält.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Fc-Region mindestens eine Gelenk-Region des Immunglobulins, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne enthält.
Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zielprotein ein zweites Volllängen-Interferon-alpha oder ein biologisch aktives Fragment davon enthält.
Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei das erste und das zweite Interferon-alpha-Protein direkt oder mittels eines Polypeptidlinkers miteinander verbunden sind.
Fusionsprotein nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Fc-Region und das Zielprotein direkt oder mittels eines Polypeptidlinkers miteinander verbunden sind.
Multimeres Fusionsprotein, enthaltend schließlich zwei Fusionsproteine wie in den Ansprüchen 1 bis 5 spezifiziert, verknüpft mittels einer kovalenten Bindung.
DNA-Molekül, kodierend für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei das Fusionsprotein eine Signalsequenz enthält, wobei diese Signalsequenz, diese Fc-Region und dieses Zielprotein nacheinander in einer Richtung von 5' nach 3' kodiert werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger.
Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Lebererkrankungen.
Verwendung eines Fusionsproteins nach Anspruch 10, wobei die Lebererkrankung Hepatitis ist.