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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf neue Verfahren zum Erfassen von biologischen
und biologisch abstammenden Materialien unter Verwendung mikromechanischer
Vorrichtungen als Erfassungseinrichtung. Die Messung kleiner Änderungen
in der Verbiegung einer mikromechanischen Vorrichtung, wie beispielsweise
einem freitragenden Federelement, das mit einem Element eines spezifischen
Bindungspartners beschichtet wurde, stellt qualitative und quantitative
Bestimmung der Anwesenheit des anderen spezifischen Bindungspartners
bereit. Ein spezifischer Bindungspartner ist ein Element eines Paares biochemischer
Einheiten, die spezifisches Binden aufweisen, d.h. eine hohe intrinsische
Affinität
oder hohe totale Avidität
aufweisen (siehe auch Kabat, E.A., Structural Concepts in Immunology
and Immuno Chemiestry, 2. Auflage, New York; Holt Rinehart & Winston, 1976).
Nicht einschränkende
Beispiele sind Ag-Ab (Antigen-Antikörper) Komplexe, Nukleinsäurefühler und
-ziele, Steroidhormon-Peptid Bindungspaare, etc.
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Hintergrund
der Erfindung
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Mikroarme
können
in biophysikalischen und biochemischen Studien verwendet werden,
um Energieänderungen
als Hinweise auf biochemische Reaktionen in einem Medium zu bestimmen.
Es besteht ein großes
Interesse an der Entwicklung von ultrakleinen Fühlern und an Analysenmethoden,
die sehr kleine Volumina von Probemedien für genaue qualitative und quantitative
Analysen von biochemischen Reaktionen benötigen und diese Untersuchungen können unter
Verwendung eines Substrats durchgeführt werden, das an einen freitragenden
Mikroarm gebunden ist.
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In
Thundat et al., U.S. Patent Nr. 5,719,324 wird ein piezoelektrischer
Transduktor offenbart, der mit einem freitragenden Arm hergestellt
ist, welcher ein Federelement aufweist, das mit einer Chemikalie behandelt
ist, die mit einer spezifischen Dampfphasenchemikalie reagiert.
Ein Oszillatormittel erhält eine
Schwingungsresonanzfrequenz während
des Erfassens der Chemikalie aufrecht, wobei Änderungen der Resonanzfrequenz
angeben, dass Mengen der Zielchemikalie in der überwachten Atmosphäre erfasst
wurden. Alternativ wird der Grad der Verbiegung des freitragenden
Arms überwacht,
um die Zielchemikalienkonzentration anzugeben.
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In
Wachter et al. U.S. Patent Nr. 5,445,008 wird ein Massemikrosensor
offenbart, der mit einem freitragenden Mikroarm hergestellt ist,
der auf Grund eines piezoelektrischen Transduktors oszilliert, mit einer
chemischen Beschichtung auf dem freitragenden Mikroarm die eine
Zielchemikalie aus der überwachten
Atmosphäre
absorbiert. Die Resonanzfrequenz des freitragenden Mikroarms wird
analysiert, um Änderungen
zu bestimmen, die Mengen der Zielchemikalie angeben, welche in der überwachten
Atmosphäre
erfasst wurden.
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In
Marcus et al. US Patent Nr. 5,475,318 wird ein Mikrofühler offenbart
der einen freitragenden Mikroarm, eine Basis, eine Fühlerspitze,
die sich von der Basis aus erstreckt und ein Heizelement beinhaltet,
das die Fühlerspitze
erhitzt, welche in Kontakt mit dem zu untersuchenden Material kommt.
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In
Hafeman, U.S. patent Nr. 4,963,815 werden eine Vorrichtung und ein
Verfahren zum Erfassen eines Analyten durch Messen eines Redoxportential-modulierten
photoinduzierten elektrischen Signals aus einer elektronisch leitenden
Schicht auf einer Halbleitervorrichtung bereitgestellt.
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In
Kolesar, U.S. Patent Nr. 4,549,427 wird ein Detektor für chemischen
Nervenkampfstoff offenbart, der einen Transduktor mit zwei freitragenden
Mikroarm-Oszillatoren
beinhaltet. Der aktive freitragende Mikroarm der zwei freitragenden
Mikroarme weist eine chemisch selektive Substanz auf, die chemische Nervenkampfstoffe
aus der Atmosphäre
absorbieren, mit Modifikationen im Oszillieren des aktiven freitragenden
Mikroarms und Vergleiche zwischen der Frequenz des aktiven freitragenden
Mikroarms und des freitragenden Referenzmikroarm werden durchgeführt.
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US-A-5
807 758 beschreibt einen Immunsenor, der auf einem freitragenden
Arm basiert. Ein oder mehrere freitragende Arme mit anheftenden
Antikörpern
werden verwendet, um ein Antigen aus einer Probelösung einzufangen,
wobei magnetische Partikel, die einen zweiten Antikörper tragen,
an das eingefangene Antigen gebunden werden. Die Verbiegung der
freitragenden Mikroarme wird durch Messen von Änderungen der magnetischen
oder piezoresistiven Eigenschaften überwacht.
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WO97/16699
offenbart eine integrale Vorrichtung zum Messen piezoelektrischer
Kraft, umfassend ein freitragendes piezoelektrisches Arm-Bimorph
auf dem Bindungspartner von Zielmolekülen anheften. Die Verbiegung
der freitragenden Arme wird eine piezoelektrische Kraftmessung gemessen.
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WO98/50773
offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erfassen spezifischer
Wechselwirkungen zwischen verwandten Bindungspartnern, basierend
auf dem Erfassen von Spannungs- oder Masseänderungen in einem freitragenden
Mikroarm bei Wechselwirkung der Bindungspartner. Auch in dieser
Quellenangabe wird die Verbiegung des freitragenden Mikroarms durch
eine piezoelektrische Kraftmessung gemessen.
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Die
oben beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen zum Messen chemischer
und mikromechanischer Parameter sind nicht auf Immununtersuchungen
gerichtet, welche die Bindung weniger Moleküle auf einem Substrat erfassen
können.
Die vorliegende Erfindung beschreibet ein neues und empfindliches
Verfahren, das adsorptionsinduzierte Kräfte zum Erfassen von Proteinen,
anderen Biopolymeren, Nukleinsäuresequenzen
und Mikrooranismen in einem Gas oder flüssigen Medium unter Verwendung von
einem bzw. mehreren freitragenden Mikroarm(en) misst.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe dieser Erfindung ein Erfassungs- und Quantifizierungsverfahren
für Antikörper-Antigen-Bindungsreaktionen
bereitzustellen, die in der Lage sind geringe Grade chemischer Bindung zu
erfassen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung eine freitragende Mikroarmanordnung
zum Erfassen von Reaktionen bereitzustellen, die Biomoleküle umfasst,
welche an den freitragenden Mikroarm gebunden sind, was in einer
spannungsinduzierten Verbiegung des freitragenden Arms resultiert.
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Es
ist eine zusätzliche
Aufgabe dieser Erfindung eine ultrakleine Anordnungsvorlage bereitzustellen,
die zum Betrieb reduzierte Probenvolumina benötigt.
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Es
ist eine weitere und ganz besondere Aufgabe dieser Erfindung, einen
ultrakleinen freitragenden Mikroarm bereitzustellen, der eine Empfindlichkeit
bereitstellt, die hinreichend ist um einen einzelnen Mikroorganismus
aus einer Probe zu erfassen.
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Diese
und andere Aufgaben der Erfindung werden durch ein Verfahren zum
Erfassen und Messen hochspezifischer Bindungsreaktionen in einem Probemedium
gelöst,
wie in den beigefügten
Patentansprüchen
definiert. Die vorliegende Erfindung verwendet einen freitragenden
Arm, wobei eine seiner Oberflächen
mit spezifischen Bindungspartnern, wie beispielsweise Antikörper- oder
Antigenmolekülen, oder
mit spezifischen Bindungspeptiden, welche aus Auslagebibliotheken
identifiziert wurden, beschichtet ist, während die andere Oberfläche mit
einem anderen, möglicherweise
inerten, Material bedeckt ist. Solange sich die Menge der Adsorption
auf den gegenüberliegenden
Oberflächen
unterscheidet oder unterschiedliche Wechselwirkungen überwachter
Moleküle
auf gegenüberliegenden
Oberflächen
vorliegen, wird eine Spannungsdifferenz vorliegen. Da die Dicke
des freitragenden Mikroarms sehr klein ist, manifestiert sich eine
Wechselwirkung vom Antikörper-Antigen
(Ab-Ag) Typ als Änderungen
in der Oberflächenspannungsdifferenz
der Oberfläche
des freitragenden Mikroarms. Diese Oberflächenspannung kann beispielsweise von Änderungen
in Volumen oder Ladung oder Polarisation oder induzierter Polarisation
auf Grund der Bildung chemischer Wechselwirkungen stammen. Wenn
eine spezifische Wechselwirkung nicht stattfindet, wird keinerlei Änderung der
Oberflächenspannung
im Vergleich zu einem freitragenden Referenzmikroarm stattfinden.
Diese Änderungen
in der Oberflächenspannungsdifferenz
manifestieren sich als Änderungen
in der Verbiegung des freitragenden Arms, die mit einer Subangstöm-Empfindlichkeit
gemessen werden können. Das
freitragende Mikroarmverfahren bietet mehr Einfachheit und größere Empfindlichkeit
als jedes derzeit verwendete Verfahren.
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Bei
Wechselwirkung mit spezifischen Agentien wird eine Spannung verursacht,
welche das Federelement verbiegt. Die Vorrichtung und das Verfahren
stellen ein Mittel zum Erfassen der Änderungen in der Verbiegung
des freitragenden Federelements bereit, die durch die physikalische
Bindung oder biochemische Wechselwirkungsspannung erzeugt werden. Die
Verbiegung wird gemessen und stellt eine Basis für quantitative und qualitative
Analyse bereit. Die Untersuchungen mit freitragendem Mikroarm stellen Empfindlichkeiten
im Subnanometerbereich für
Verbiegungen als Antwort auf Spannungen des Federelements bereit.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch Lesen der folgenden
detaillierten Beschreibung offensichtlich werden, welche mit Bezügen auf
die verschiedenen Figuren der Zeichnungen versehen sind, worin
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1 ein
piktographisches Schema einer ersten Ausführungsform des freitragenden
Mikroarmaufbaus und des Verbiegungserfassungsaufbaus ist, die in
der vorliegenden Erfindung verwendet werden;
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2 eine
perspektivische Ansicht des freitragenden Mikroarms ist, der in
der vorliegenden Erfindung verwendet wird und eine Probe in Kontakt
mit dem freitragenden Mikroarm aufweist;
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3 eine
Querschnittseitenansicht einer anderen Ausführungsform des freitragenden
Mikroarms ist, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird
und der zwei beschichtete Oberflächen aufweist;
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4 eine
perspektivische Seitenansicht einer anderen Ausführungsform des freitragenden
Mikroarms ist, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird
und eine beschichtete Region am distalen Ende des freitragenden
Mikroarms aufweist.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Gemäß dieser
Erfindung wurde gefunden, dass ein Erfassungsverfahren und eine
Vorrichtung bereitgestellt werden können, die extrem empfindlich gegenüber kleinsten Änderungen
in der strukturellen Spannung sind, die mit einer chemischen Bindung
an ein, an einen freitragenden Mikroarm gebundenes Substrat, in
Zusammenhang steht. Die Erfindung ist in der Lage die Verbiegung
im freitragenden Mikroarm-Federelement zu messen, die durch die
spezifische chemische Bindung verursacht wurde. Die Erfindung verwendet
eine Biomaterialbeschichtung, wie beispielsweise polyklonale oder
monoklonale Antikörper,
ein Antigen, eine Nukleinsäuresequenz,
ein Lektin oder andere Moleküle,
welche eine hohe spezifische Affinität für ein Zielmolekül aufweisen.
Ein Verfahren zum Erfassen und Quantifizieren der spezifischen Wechselwirkungen
durch Messen der Bewegung eines freitragenden Mikroarm-Federelements
wird offenbart. Die Bewegung des freitragenden Mikroarm-Federelements
wird unter Verwendung eines Erfassungsmittels erfasst, das Erfassungsempfindlichkeit
im Subnanometerbereich zur Verbiegungsmessung bereitstellt. Die
geringe Größe des Federelements
und die hohe Selektivität
des Erfassungsmittels erlauben sehr kleine Proben zu untersuchen.
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Gemäß 1-4 sind
bevorzugte Ausführungsformen
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine Sensorvorrichtung 1,
umfassend eine Basis 2, die mindestens ein freitragendes
Mikroarm-Federelement 3 (auf das auch als freitragender
Mikroarm Bezug genommen wird) mit oder ohne einen separaten freitragenden
Referenzmikroarm- Federelement 15 aufweist.
Das Federelement 3 kann die Abmessungen von ungefähr 1,0 bis
ungefähr
200 μm lang,
ungefähr
1,0 bis 50 μm
breit und ungefähr
0,1 μm bis
3,0 μm dick
haben. Die anderen Abmessungen sind ungefähr 50 μm bis ungefähr 200 μm lang, ungefähr 10 μm bis 30 μm breit und
ungefähr
0,3 μm bis
3,0 μm Dicke.
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Jede
der vorigen Abmessungen kann variiert werden, um das Federelement 3 in
einer Vielzahl von gewünschten
Formen anzupassen. Die Größe und Form
des Federelements sind keine kritische Einschränkung.
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Das
Federelement 3 erstreckt sich von der Basis 2 nach
außen,
wie in 1 gezeigt. Die Sensorvorrichtung 1 kann
aus einer Vielzahl von freitragenden Mikroarm-Federelementen 3 bestehen,
die an die Sensorvorrichtung 1 angebracht sind. Ein freitragender
Referenzmikroarm 15, wenn verwendet, befindet sich in große Nähe zum Federelement 3.
Jeder freitragende Mikroarm ist bevorzugt aus Materialien, wie beispielsweise
Silizium oder Siliziumoxid, hergestellt, welche ein brauchbares
Substrat für
die Anbindung von Antikörpern
bereitstellen. Während freitragende
Mikroarme aus eine Vielzahl von Materialien bereitgestellt werden
können,
profitiert die vorliegende Erfindung von Materialien, welche die
Bindung eines Antikörpers
(Beschichtung) fördern
und als Antwort auf folgende Antikörper-Antigen-Bindung antwortet
(sich verbiegt).
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ELISA
Verfahren zum Beschichten von Glas unter Verwendung verschiedener
Verknüpfer
sind auf Silizium anwendbar. Der gewählte Verknüpfer ist aus jenen ausgewählt, die
mit dem verwendeten Erfassungsmolekül kompatibel sind. Verbinder,
wie beispielsweise Poly-L-lysin, sind bevorzugt, die auch als Spannungsüberträger dienen.
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Das
Federelement 3 kann von ungefähr rechteckigem Querschnitt
sein, wie in 1-4 gezeigt.
Die Oberfläche 5 kann
mit einer Beschichtung von „Detektor"-Molekülen versehen
sein, d.h. einem Element eines Bindungspaars. Die beschichtete Region 5 kann
sich an verschiedenen Orten befinden und von verschiedenen Größen sein
und die Beschichtung kann auf jeder Oberfläche 7 oder 9 platziert
sein, sofern sich die Beschichtung auf der einen oder anderen Seite
befindet.
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Die
Federkonstante des freitragenden Mikroarm-Federelements 3 ist
ausgelegt, um eine Verbiegung des freitragenden Arms im Nanometerbereich
zu verursachen. Die geringe Federkonstante des Federlements 3 mit
einer Beschichtung 5 erlaubt es dem Federelement, sich
als Antwort auf die Bindung eines Zielmoleküls an das Detektor-Molekül, während Reaktionen,
die stattfinden, wenn die Probe 13 auf einer Seite des
Federelements 3 platziert wird oder einen Unterschied in
der Anzahl von Molekülen, die
auf einer Seite adsorbiert sind, im Vergleich zur anderen Seite,
aufweist, zu verbiegen.
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Die
Oberflächenbeschichtung 5 kann
Enzyme, Peptide, Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate,
Antikörper-
oder Antigenmoleküle,
pharmakologische Wirkstoffe (d.h. Medikamente, beinhaltend kleine
organische Moleküle,
wie beispielsweise Aspirin) und andere Biopolymere und jede Klasse
biochemischer Verbindungen, die mit einem oder mehreren Analyten
oder anderen Biopolymeren in einer Probe 13 reagieren,
die auf der Beschichtung 5 platziert ist. Die chemischen
Reaktionen von ein oder mehr Biomolekülen in der Probe 13 erzeugen
eine spannungsinduzierte Verbiegung des Federelements 3.
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Die
spannungsinduzierten Verbiegungen können durch Volumenänderungen
auf Grund der Bildung chemischer Wechselwirkungen erzeugt werden.
Zudem ist die vorliegende Untersuchung extrem empfindlich gegenüber adsorptionsinduzierten
Kräften.
Als Ergebnis ist das System gut geeignet, um Proteine, andere Biopolymere
und Mikroorganismen in einem Gas oder flüssigen Medium unter Verwendung
der kleinen Natur eines freitragenden Mikroarms zu erfassen.
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Diese
freitragenden Mikroarme haben eine Antwortzeit im Bereich von Mikrosekunden
bis Millisekunden. Da die Dicke des freitragenden Mikroarms sehr
klein ist, kann sich eine Wechselwirkung vom Antikörper-Antigen
Typ als Änderungen
in der Oberflächenspannungsdifferenz
manifestieren. Wenn die spezifische Wechselwirkung nicht stattfindet,
wird keinerlei Änderung
der Oberflächenspannung
im Vergleich zu Kontrollwerten stattfinden. Diese Änderungen
der Oberflächenspannungsdifferenz
manifestieren sich als Änderungen
der Verbiegung des freitragenden Arms, die mit einer Subangströmempfindlichkeit
gemessen werden kann. Das freitragende Armverfahren bietet mehr
Einfachheit und höhere Selektivität als alle
derzeit verwendeten Verfahren.
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Antworten
auf Kräfte,
die so klein wie ungefähr
einige Piconewton sind, sind für
die freitragenden Mikroarme der vorliegenden Erfindung möglich, was
einen Vorteil in der Empfindlichkeit gegenüber vorherigen Colorimetervorrichtungen
bietet. Freitragende Mikroarme mit Kraftkonstanten so klein wie 0,08
Newton/Meter sind kommerziell erhältlich von Park Instruments,
Sunnyvale, Kalifornien. Die meisten gebräuchlichen freitragenden Mikroarme
basieren auf Silizium, aber andere Materialien, wie beispielsweise
GaAs sind ebenfalls brauchbar.
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Wenn
die Detektormoleküle
auf der ersten Oberfläche 5 Wechselwirkungen
mit Zielmolekülen eingehen,
die in der Probe 13 anwesend sind, führen die resultierenden Reaktionen
in einer strukturellen Änderung
in der Form der Feder 3, die durch eine Änderung
der Oberflächenspannung
verursacht wird. Die Verbiegung des freitragenden Mikroarms 3 kann, selbst
wenn sie extrem klein ist, mit bekannten laseroptischen Verfahren
mit Subnanometer-Empfindlichkeiten erfasst werden. Wenn Lasererfassung
verwendet wird, muss mindestens eine Schicht auf einer Oberfläche oder
ein Ende einer Oberfläche
des freitragenden Mess-Mikroarms in der Lage sein, Laserlicht zu
reflektieren. Die laseroptischen Messmittel beinhalten einen Photodiodengenerator 17 für Laserlicht,
das auf die erste Oberfläche 7 oder
die zweite Oberfläche 9 des
freitragenden Mess-Mikroarms 3 fokussiert ist bzw. wird,
mit einem Photodetektor 19 der positioniert ist, um das
reflektierte Laserlicht zu empfangen, mit Analyse der Verbiegung
des freitragenden Mess-Mikroarms 3 durch Mikroprozessoren.
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Alternative
Erfassungsmittel sind möglich. Diese
beinhalten ein piezoresistives Erfassungsmittel, ein kapazitives
Erfassungsmittel und ein Elektronentunnelerfassungsmittel, die alle
gemeinhin bekannt sind. Jedes Erfassungsmittel bestimmt Änderungen
in der Verbiegung des freitragenden Mikroarms 3 mit Empfindlichkeiten
vergleichbar zur Subnanometerempfindlichkeit des Lasermessmittels.
Eine allgemeine Diskussion von Verbiegungserfassungsverfahren wird
bereitgestellt in Gimzewski et al. („Observations of a chemical
reaction using a micromechnanical sensor," 217 Chem. Phys. Lett. 589, at 593 (1994)).
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Für eine Einzelschichtbeschichtung
ist das Ausmaß der
Verbiegung direkt proportional zur Menge der Zielmoleküle, die
an den Sensor binden. Die Einschränkung der Wechselwirkung vom
Antikörper-Antigen-Typ
auf eine Seite des freitragenden Arms verursacht eine tangentiale
Spannung im gesamten freitragenden Arm. Eine der einzigartigen Eigenschaften
freitragender Mikroarme besteht darin, dass sie angefertigt werden
können,
um Verbiegung auf Grund von Änderungen
in der Oberflächenspannungsdifferenz
durch Adsorption auf einer Seite des dünnen freitragenden Arms einzugehen.
Unter Verwendung der Stoney'schen
Formel kann der Krümmungsradius
der Verbiegung des freitragenden Arms aufgrund von Adsorption geschrieben
werden als:
wobei R der Krümmungsradius
für den
freitragenden Mikroarm ist, ν und
E Poisson-Raten bzw. Young-Module für das Substrat sind, t die
Dicke des freitragenden Arms und δs
die Schichtspannung ist. Der Krümmungsradius
auf Grund von Verbiegung eines freitragenden Mikroarms ist gegeben
durch
wobei z die Auslenkung des
trägerlosen
Endes des freitragenden Arms ist und L die Länge des Arms des freitragenden
Arms. Unter Verwendung von (1) und (2) wird eine Beziehung zwischen
der Auslenkung des freitragenden Arms und der Oberflächenspannungsdifferenz
erhalten:
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Diese
Verbiegung kann durch Reflexion von Licht von einem Diodenlaser
am Ende eines freitragenden Arms einen positionssensitiven Detektor
mit einer Subnanometerauflösung
gemessen werden.
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Das
hier beschriebene Verfahren ist ein Gleichstromverfahren. Wenn der
freitragende Arm mit einem spannungsempfindlichen Material beschichtet
ist, oder ein solches umfasst, kann die Formsteifigkeit durch Verbiegen
des freitragenden Arms geändert
werden. Das spannungsempfindliche Material kann vorzugsweise ausgewählt sein
aus, aber nicht beschränkt
auf die Gruppe bestehend aus Metallen, Metalllegierungen, dielektrischen
Materialien, polymeren Materialien und Kombinationen daraus. Spezifische
Beispiele solcher polymerer Materialien beinhalten, aber sind nicht
beschränkt
auf, solche Polymere wie Polycarbonate von Bisphenol, Poly[N,N-(p,p'-oxydiphenylen)pyromellitimid],
Polyvinychlorid und dergleichen. Viele andere Polymere sind dem
Fachmann bekannt, die sich, wie hierin beschrieben, verhalten.
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Ein
anderer Weg, um die Federkonstante des freitragenden Arms zu beeinflussen
besteht in der Verwendung eines inhomogenen Kraftfeldes. Beispielsweise
kann der freitragende Arm in einem inhomogenen elektrischen Feld
platziert werden. Wenn der freitragende Arm sich verbiegt, variiert
die Federkonstante als eine Funktion der Verbiegung, was in unterschiedlicher
Resonanzfrequenz resultiert. Allerdings kann dies in einer Wechselstromtechnik
gemacht werden, durch Beschichten der inerten Seite des freitragenden
Arms mit einer spannungsempfindlichen Schicht. Die Spannungsdifferenz
kann eine Änderung
der Resonanzfrequenz verursachen. Thundat US Patent Nummer 5,719,324:
Die Änderung
der Resonanzfrequenz kann durch Auftragen einer spannungsempfindlichen
Schicht auf einer Seite verstärkt
werden. Die Verbiegung des freitragenden Arms kann nun durch Erfassen
der Änderung
der Resonanzfrequenz des freitragenden Arms in ein Wechselstromsignal
konvertiert werden. Wenn sich der freitragende Arm verbiegt, ändert sich
die Formsteifigkeit des freitragenden Arms auf Grund der Spannung
im empfindlichen Film. Die Resonanzfrequenz kleiner Amplitude des
freitragenden Arms ändert
sich mit der Verbiegung des freitragenden Arms. Folglich kann die
Gleichstromänderung
im freitragenden Arm in das Wechselstromsignal konvertiert werden.
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Es
ist auch bekannt, dass spannungsinduzierte Änderungen der Federkonstante δk des freitragenden
Arms aus der Verbiegung des freitragenden Arms berechnet werden
können,
wobei δs
1 und
Ss
2 die Spannungsdifferenz auf den Oberflächen des
freitragenden Arms sind und n
1 eine geometrische
Konstante ist. Die Resonanzfrequenz des freitragenden Arms ändert sich
auf Grund von Änderungen
der Resonanzfrequenz, die durch statische Verbiegung des freitragenden
Arms verursacht werden.
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Die
Verbiegung des Federelements 3 kann im Vergleich zu einem
unbehandelten freitragenden Mikroarm 15 gemessen werden.
Auftragen der Verbiegung des unbehandelten freitragenden Referenzmikroarms 15 als
eine Funktion der Verbiegung zwischen Federelement 3 und
freitragendem Mikroarm 15 wird Peaks liefern, die zur Desorption
des Analyten von der Beschichtung 5 des Federelements 3 korrespondieren.
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Verfahren
des Erfassens und Messens
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Die
Schritte des Erfassens und Messens struktureller Änderungen
in einem Sensor, die zu Reaktionen zwischen Zielmolekülen in einer
Probe überwachter
Medien und Detektormolekülen,
die von einer Sensoroberfläche
getragen werden, korrespondieren, umfassen: Bereitstellen einer
Basis; Anbringen von mindestens einem freitragenden Federelement
an der Basis; Beschichten mindestens einer Oberfläche des
Federelements mit einer Substanz, die an ein Detektormolekül angebracht
ist oder sein kann; die beschichteten Region einer flüssigen oder Aerosolprobe
aussetzen; Verbiegen des Federelements im Verhältnis zur Anzahl oder Konzentration der
Zielmoleküle,
die an die Detektormoleküle
binden; und Erfassen der Verbiegung durch einen Detektor, der eine
Laserlichtquelle umfasst, die Licht auf die Oberfläche des
freitragenden Federelements richtet. Das reflektierte Licht von
der Oberfläche
des freitragenden Arms wird von einem Lichtdetektor nahe dem freitragenden
Federelement eingefangen, der Detektor empfängt reflektiertes Licht von
der Oberfläche
des freitragenden Arms vor, während
und nach der Verbiegung des freitragenden Mikroarms. Der Grad der
Verbiegung wird im Vergleich zu einer neutralen Position des freitragenden
Arms oder einem freitragenden Kontrollarm gemessen und ein Mikroprozessor
wird bereitgestellt, um die Verbiegungsinformation aus den Messschritten
zu analysieren. Die Änderungen
der Verbiegung werden gegenüber der
in den Kontrollen beobachteten Verbiegung kompensiert. Freitragende
Kontrollmikroarme können den
Einfluss unspezifischer Bindung durch Zielmoleküle, Verbiegung, die sich aus
Temperaturänderungen,
pH-Änderungen
und anderen Umgebungsänderungen,
die das Federelement 3 beeinflussen können, ergibt. Wohlbekannte
Mikroprozessoren und mathematische Formeln werden verwendet, um
die Verbiegungsänderungen
als Funktion der Bindung spezifischer Ziel- und Detektormoleküle zu berechnen.
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Zusätzliche
Ausführungsformen
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Gemäß Zeichnungen,
die verwendet werden, um Ag-Ab-Wechselwirkungen darzustellen, trägt die Beschichtung 5 einen
Bindungspartner, der durch ein „y" bezeichnet ist und der Analyt in der
Probe ist als ein „Delta" gezeigt.
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Beispiel 1
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Ein
freitragender Mikroarmsensor kann bereitgestellt werden, um den
Grad von Antigenen zu bestimmen, die in einer flüssigen Probe anwesend sind.
Wie aus 1 zu sehen, kann eine Antikörperschicht 5 auf
der Oberfläche
eines Federelements 3 bereitgestellt werden, bevorzugt
nur auf einer Oberfläche.
Bindungsmoleküle
können
verwendet werden, um die Antikörperbindung
einheitlich zu machen und für
ein Antigen zugänglich
zu machen. Die Schicht 5 kann einen polyklonalen Antikörper, einen monoklonalen
Antikörper
oder eine Mischung verschiedener polyklonaler Antikörper, die
auf ein gemeinsames Zielmolekül
gerichtet sind, umfassen. Die Antikörper sind an Element 3 konjugiert,
wie durch Schicht 5 repräsentiert.
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Es
folgen Standardhemmprotokolle unter Verwendung von Rinderserumalbumin
(BSA), um unspezifische Bindungswechselwirkungen zu reduzieren (andere
Proteine, Reinigungsmittel etc. können auch verwendet werden),
eine Lösung,
die einen möglichen
Analyten oder ein Zielmolekül
enthält,
wird verwendet um die Schicht 5 zu inkubieren, unter Verwendung
von Temperaturen, pH-Werten, Zeitintervallen und Puffern, wie sie
im Stand der Technik für Immununtersuchungen
wohlbekannt sind. Während eine
Standardinkubationszeit von 30 Minuten für ein ELISA Protokoll typisch
ist, wird die Empfindlichkeit des vorliegenden Sensors das Eintreten
messbarer Reaktionen innerhalb von Sekunden ermöglichen.
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Die
Verbiegung des Federelements 3 im Vergleich zu einem Kontrollsensor,
der keine Zielmoleküle
aufweist wird die Anwesenheit des Antigens nachweisen. Quantifizierung
der Zielmolekülkonzentration
kann durch Vergleich mit Kontrollen erfolgen, die eine Verdünnungsreihe
mit einer bekannten Quantität
des Zielantigens haben.
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Die
schnelle Reaktionszeit des Sensors erlaubt ein schnelles Screeningprotokoll
für qualitative Messungen.
Beispielsweise kann schnelles Screening monoklonaler Antikörper durch
Verwendung des Antigens (oder Immunogens) als Detektormolekül(e) in
Schicht 5 erreicht werden. Serum, das von monoklonal produzierenden
Hybridomzellkulturen stammt, kann wie oben beschrieben in den Sensor
eingeführt werden.
Eine positive Reaktion weist auf eine spezifische Bindung hin, welche
weitere Untersuchung der untersuchten Hybridomreihe erfordert. Da
es pro Fusion notwendig sein kann, tausende von Zellreihen zu untersuchen,
von denen die große
Mehrheit keine interessanten Antikörper produziert, bietet der
vorliegende Sensor die Fähigkeit
das Screeningverfahren stark zu rationalisieren.
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Ferner
erfordert die geringe Größe des Sensors
nur winzige Konzentrationen an zu verwendendem Antigen als Detektormolekül. Diese
Fähigkeit kann
entscheidend sein, um die Entwicklung von Screeningprotokollen für Antigenene
oder ähnliche Detektormoleküle zu erlauben,
die nur in geringer Menge verfügbar
sind.
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Ein
weiterer Vorteil des vorliegenden Sensors ist, dass die direkte
Wechselwirkung zwischen Molekülen
gemessen wird. Im Gegensatz zu vielen traditionellen Immununtersuchungen
wird kein separater „Visualisierungs"-Schritt benötigt, welcher
zusätzliche
Inkubationsschritte erfordert. Dies resultiert in erhöhten Zeiteinsparungen
und vermeidet den Bedarf an zusätzlichen
Reagenzien. Weil die Bindung zwischen Partnern reversibel ist kann
es durchführbar
sein, das Erfassungssystem umzukehren bzw. wieder zu verwenden,
auch wenn Einwegsensoren für
klinische Anwendungen, wie beispielsweise Serumuntersuchungen, wahrscheinlicher
sind.
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Beispiel 2
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Das
vorliegende Sensorsystem ist auch als ein Detektor und/oder Isolator
für einzelne
lebende Zellen aus einer flüssigen
Probe brauchbar. Die Abmessungen des freitragenden Mikroarm-Federelements 3 sind
so, dass eine einzelne Prokaryontenzelle (1-10 μm Länge), wie beispielsweise ein
Bakterium oder eine einzelne Eukaryontenzelle (10-100 μm Länge) an
die Sensorschicht gebunden werden kann. Gegeben die große Länge jeder
lebenden Zelle im Vergleich zur Größe des freitragenden Arms,
wird eine einzelne Zelle in einer signifikanten und messbaren Verbiegung
des freitragenden Arm-Federelements 3 resultieren.
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Demgemäß kann ein
Sensor bereitgestellt werden, um eine Zielbakterienspezies zu erfassen, unter
Verwendung eines Lecitins oder Antikörpers in Schicht 5 welches
bzw. welcher spezifisch für
das interessierende Bakterium ist. Beispielsweise kann ein Detektor
für Colibakterien,
ein Indikator für
Fäkal- oder
Abwasserverunreinigung, bereitgestellt werden, um die Wasserqualität in Brunnen
bzw. Quellen, Seen oder Becken bzw. Reservoirs bzw. Teichen zu überwachen.
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Zusammenfassend
beschreibt die vorliegende Erfindung ein neues und extrem empfindliches Verfahren
um das oft übersehene
Auftreten von adsorptionsinduzierten Kräften zum Erfassen von Proteinen,
anderen Biopolymeren und Mikroorganismen in einem Gas oder flüssigem Medium,
unter Verwendung der winzigen Natur eines freitragenden Mikroarms,
zu messen. Diese freitragenden Mikroarme haben eine Antwortzeit
im Bereich von Mikrosekunden bis Millisekunden. Da die Dicke des
freitragenden Mikroarms sehr gering ist, manifestiert sich die Wechselwirkung
vom Antikörper-Antigen-Typ
in Änderungen
der Oberflächenspannungsdifferenz
und keine zusätzlichen
Reagenzien oder Schritte sind notwendig. Wenn keine spezifischen
Wechselwirkungen stattfinden, wird keinerlei Änderung der Oberflächenspannung
stattfinden. Diese Änderungen
in der Oberflächenspannungsdifferenz
manifestieren sich als Änderungen
der Verbiegung des freitragenden Arms, die mit Subangströmempfindlichkeit
gemessen werden kann. Das freitragende Armverfahren bietet mehr
Einfachheit und höhere
Empfindlichkeit als jedes derzeit verwendete Verfahren.
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Viele
Variationen werden zweifellos nach Lesen vorangehender Beschreibung
unter Bezug auf die Figuren für
den Fachmann offensichtlich werden.
