DE60033555T2

DE60033555T2 - Verfahren und zusammestellungen zum nachweis und behandlung von brustkrebs, beruhend auf brustkrebs-assoziierten polypeptiden

Info

Publication number: DE60033555T2
Application number: DE60033555T
Authority: DE
Inventors: Brynmor Waltham WATKINS; Robert P. Franklin SZARO
Original assignee: Matritech Inc
Current assignee: Matritech Inc
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2020-11-17
Also published as: WO2001036470A2; EP1240521A2; WO2001036977A8; EP1232177A2; US20060160154A1; EP1232177B1; WO2001036977A3; WO2001036977A2; ATE354588T1; AU1615201A; DE60033555D1; CA2390607A1; US6936424B1; AU1658901A; CA2391212A1; JP2003528296A; JP2004500056A; WO2001036470A3; ES2282149T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder zum Nachweis von Brustkrebs. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Brustkrebs-assoziierte Proteine und Nucleinsäuren, die solche Proteine codieren, die Zellmarker zur Brustkrebs-Erkennung darstellen, und molekulare Ziele für die Brustkrebstherapie.
Hintergrund der Erfindung
Brustkrebs ist die Haupttodesursache bei Frauen. Während die Pathogenese von Brustkrebs unklar ist, kann die Transformation von normalem Brustepithel zu einem malignen Phänotyp das Ergebnis genetischer Faktoren sein, insbesondere bei Frauen unter 30 Jahren (Miki et al. (1994) Science 266: 66-71). Jedoch ist es möglich, dass andere, nicht genetische Faktoren einen signifikanten Einfluss auf die Entstehungsgeschichte der Krankheit haben. Unabhängig von seinem Ursprung nimmt die Morbidität von Brustkrebs signifikant zu, wenn er nicht frühzeitig während seiner Progression entdeckt wird. Deshalb sind beträchtliche Anstrengungen unternommen worden, um die frühen zellulären Vorgänge bei der Transformation von Brustgewebe aufzuklären. Diese Anstrengungen haben zur Identifizierung von verschiedenen potentiellen Brustkrebs-Markern geführt. Zum Beispiel wurden Allele der BRCA1- und BRCA2-Gene mit erblichem und früh auftretendem Brustkrebs in Verbindung gebracht (Wooster et al. (1994) Science 265: 088-2090). Das Wildtyp-Allel von BRCA1 codiert ein Tumorsuppressor-Protein. Deletionen und/oder andere Veränderungen in diesem Allel wurden mit der Transformation von Brustepithel in Verbindung gebracht. Dementsprechend wurde das Erkennen von mutierten BRCA1-Allelen oder von deren Genprodukten als Mittel zur Erkennung von Brust- und auch von Eierstock-Krebs vorgeschlagen (Miki et al., supra). Allerdings ist BRCA1 als Krebsmarker begrenzt einsetzbar, da BRCA1-Mutationen für die Mehrzahl der Brustkrebsfälle nicht verantwortlich sind. (Ford et al. (1995) British J. Cancer 72:805-812). Gleichermaßen ist das BRCA2 Gen, das mit Formen von erblich bedingtem Brustkrebs in Verbindung gebracht wird, nur für einen kleinen Teil aller Brustkrebsfälle verantwortlich (Ford et al., supra)
Etliche andere Gene sind mit Brustkrebs in Verbindung gebracht worden und können, entweder direkt oder über ihre Genprodukte, als Marker für die Erkrankung dienen. Zu diesen potentiellen Markern zählen das TP53-Gen und seine Genprodukte, das p53-Tumorsuppressorprotein (Malkin et al. (1990) Science 250: 1233-1238). Der Verlust der Heterozygotie bei Genen, wie das Ataxia telangiectasia-Gen, wurde ebenfalls mit einem hohen Risiko für die Entwicklung von Brustkrebs in Verbindung gebracht (Swift et al. (1991) N. Engl. J. Med. 325: 1831-1836). Eine Schwierigkeit bei den bis jetzt vorgeschlagenen Markern besteht darin, dass der onkogene Phänotyp oft eine Folge einer Gendeletion ist und es daher notwendig ist, das Nichtvorliegen einer Wildform als Vorhersage einer Transformation zu erkennen.
Deshalb bedarf es auf diesem Gebiet spezifischer, zuverlässiger Marker, die in normalem und transformiertem Brustgewebe unterschiedlich exprimiert werden und die bei der Diagnose von Brustkrebs, bei der Vorhersage des Beginns oder bei der Behandlung von Brustkrebs geeignet sind. Derartige Marker und Verfahren für ihre Anwendung werden hier bereitgestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt eine Vielfalt von Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis des Vorliegens von Brustkrebs bei Säugern, zum Beispiel beim Menschen, und für die Behandlung von Brustkrebs bei Säugern, bei denen die Krankheit diagnostiziert wurde, bereit. Die Erfindung beruht zum einen auf der Entdeckung einer Familie von Proteinen, von denen jedes Mitglied in einer höheren Konzentration im Serum aus einem Säuger, zum Beispiel einem Menschen mit Brustkrebs, in Relation zu dem Serum aus einem normalen Säuger, d. h. ein Säuger ohne Brustkrebs, auftritt. Dementsprechend können diese Proteine, ebenso wie die Nucleinsäuresequenzen, die diese Proteine codieren, oder die dazu komplementären Sequenzen als Brustkrebsmarker bei der Diagnose von Brustkrebs sowie bei der Dokumentation der Wirksamkeit einer Brustkrebstherapie und/oder als Ziele für eine solche Therapie verwendet werden.
Bei einem Aspekt stellt die Erfindung isolierte Brustkrebs-assoziierte Proteinmarker bereit. Die Proteinmarker sind so definiert, dass sie in einer höheren Konzentration im Serum von Säugern, vor allem vom Menschen, mit Brustkrebs nachgewiesen werden können als im Serum von Säugern ohne Brustkrebs. Diese Proteinmarker entsprechen den Sequenzen SEQ ID NO: 1-5, wie auf Seite 200 dargestellt
Zudem sind die zuvor erwähnten Brustkrebs-assoziierten Proteine weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie Nicht-Immunoglobulin- und/oder Nicht-Albuminproteine sind. Weiterhin können die Brustkrebs-assoziierten Proteine eine antigenische Region oder ein Epitop definieren, das spezifisch an eine Bindungseinheit binden kann, zum Beispiel ein Antikörper, zum Beispiel ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein Antikörperfragment davon oder eine biosynthetische Antikörper-Bindungsstelle, die gegen die antigenische Region oder das Epitop gerichtet ist. Zusätzlich ermöglicht die Erfindung einem Fachmann die Isolierung von Nucleinsäuren, die die zuvor erwähnten Brustkrebs-assoziierten Proteinen oder Nucleinsäuren codieren, die unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisieren, die die Brustkrebs-assoziierten Proteine codiert. Weiterhin kann der Fachmann Nucleinsäuresequenzen herstellen, die das gesamte isolierte Markerprotein oder Fragmente davon codieren, indem die derzeit gebräuchlichen Verfahren verwendet werden (zum Beispiel in Sambrook et al., Hrsg. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, " Cold Spring Harbor Press). Zum Beispiel kann das erfindungsgemäße Brustkrebs-assoziierte Protein nach der Isolierung sequenziert werden, indem übliche Peptid-Sequenzierungsprotokolle angewandt werden. Auf der Grundlage der Peptidsequenz, ist es möglich, Oligonucleotid-Hybridisierungssonden zu erzeugen, die für das Screening einer cDNA-Bibliothek geeignet sind.
Die cDNA-Bibliothek kann sodann mit dem erzeugten Oligonucleotid gescreent werden, um Voll- oder Teillängen-cDNA-Sequenzen zu isolieren, die das isolierte Protein codieren.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Vielzahl von Verfahren bereit, zum Beispiel auf Protein oder Nucleinsäure basierende Verfahren, um das Vorliegen von Brustkrebs in einem Säuger nachzuweisen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können bei jedem relevantem Gewebe oder jeder relevanten Körperflüssigkeit angewandt werden. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verfahren auf Brustgewebe, stärker bevorzugt Brustbiopsie-Gewebe, angewandt werden. Alternativ können die erfindungsgemäßen Verfahren auf eine Probe von menschlicher Körperflüssigkeit angewandt werden, die aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Blut; Serum; Plasma; Feces; Urin; Vaginalsekreten; Zerebrospinalflüssigkeit; Speichel; Aszitesflüssigkeit; Peritonealflüssigkeit; Sputum; und Brust-Exudat. Es wird davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren auch beim Nachweis von metastasierenden Brustkrebszellen in anderen Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben geeignet sind. Der Nachweis des Vorliegens von Brustkrebs kann unter Verwendung von einem aus einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten und eingesetzten Assay-Verfahren erreicht werden.
Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Krebdiagnose in einem Individuum das Zusammenbringen einer Probe des Individuums mit einer ersten Bindungseinheit, die spezifisch an ein Brustkrebs-assoziiertes Protein bindet, um einen ersten Komplex aus Bindungseinheit-krebsassoziiertem Protein zu bilden. Die erste bindende Einheit ist in der Lage, spezifisch an mindestens eines der Brustkrebs-assoziierten Marker-Proteine, wie vorstehend identifiziert, zu binden, um einen Komplex zu erzeugen. Danach kann die Gegenwart und/oder die Menge an Markerprotein im Komplex nachgewiesen werden, zum Beispiel durch die erste bindende Einheit, wenn sie mit einer nachweisbaren Einheit markiert ist, zum Beispiel einer radioaktiv oder fluoreszierenden Markierung oder mit einer zweiten bindenden Einheit, die mit einer erkennbaren Markierung markiert ist, die spezifisch an die erste bindenden Einheit bindet, indem auf dem Fachgebiet bekannte Methoden angewandt werden. Die Gegenwart oder Menge des Markerproteins kann somit ein Indiz für das Vorliegen von Brustkrebs in dem Individuum sein. Zum Beispiel kann die Menge des Markerproteins in der Probe mit einem Schwellenwert verglichen werden, der zuvor geeicht wurde, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Brustkrebs anzugeben, wobei die Menge des Komplexes in der Probe in Relation zum Schwellenwert als Indiz für das Vorliegen oder die Abwesenheit von Krebs in dem Individuum gelten kann. Obwohl solch ein Verfahren an Gewebe durchgeführt werden kann, zum Beispiel an Brustgewebe oder an Körperflüssigkeit, zum Beispiel an Serum, wird derzeit Körperflüssigkeit als Untersuchungsprobe bevorzugt. Die Bindungseinheiten, die bei der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, wurden aus Antikörpern, Antikörper-Fragmenten und Antikörper-Bindungsstellen gewählt.
Der Nachweis der oben erwähnten Nucleinsäure-Moleküle kann auch als Indikator für das Auftreten von Brustkrebs und/oder metastasierenden Brustkrebs in einem Individuum dienen. Demnach stellt die Erfindung nach einem weiteren Aspekt noch ein Verfahren zum Nachweis von Brustkrebs bei einem Menschen bereit. Das Verfahren umfasst den Schritt des Nachweises des Vorliegens eines Nucleinsäure-Moleküls in einer Gewebeprobe oder in einer Probe von Körperflüssigkeit und damit des Vorliegens von Brustkrebs in einem Individuum. Das Nucleinsäure-Molekül wird aus einer Gruppe ausgewählt, die besteht aus: (i) einem Nucleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die ein Brustkrebs-assoziiertes Protein erkennen kann und die spezifisch von ihm gebunden wird, und (ii) einem Nucleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die mindestens einen Abschnitt von einem oder mehreren der hier beschriebenen Brustkrebs-assoziierten Proteine codiert
Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Exposition einer Probe aus einem Individuums unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen gegenüber einer Nucleinsäuresonde, die zum Beispiel mehr als 10 und stärker bevorzugt mehr als 15 Nucleotide lang ist, die zur Hybridisierung mit einer Ziel-Nucleinsäure in der Lage ist, welche eines der hier genannten Brustkrebs-assoziierten Proteine codiert, um einen Doppelstrang zu bilden. Danach kann die Gegenwart eines Doppelstrangs durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden, die auf dem Fachgebiet bekannt und gebräuchlich sind. Es wird davon ausgegangen, dass die Ziel-Nucleinsäure amplifiziert werden kann, zum Beispiel durch die herkömmlichen Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder der Reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), bevor sie mit der Nucleinsäuresonde hybridisiert wird.
Bei einer Ausführungsform ist die Ziel-Nucleinsäure (zum Beispiel ein Messenger-RNA (mRNA)-Molekül) länger als 15 Nucleotide, stärker bevorzugt länger als 50 Moleküle und am meisten bevorzugt länger als 100 Nucleotide und codiert eine Aminosäuresequenz, die in einem der hier beschriebenen Brustkrebs-assoziierten Proteine vorhanden ist. Eine derartige Ziel-mRNA kann dann nachgewiesen werden, zum Beispiel durch Northern Blot-Analyse, indem die Probe mit einer markierten Hybridisierungssonde umgesetzt wird, zum Beispiel einer ³²P-markierten Oligonucleotidsonde, die in der Lage ist, spezifisch mit mindestens einem Teil des Nucleinsäuremoleküls, das das Markerprotein codiert, zu hybridisieren. Der Nachweis eines Nucleinsäuremoleküls, das entweder ein Brustkrebs-assoziiertes Protein codiert oder spezifisch von einem Brustkrebs-assoziierten Protein gebunden werden kann, kann somit als Indikator für das Vorliegen von Brustkrebs in dem untersuchten Individuum dienen.
Nach einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Kit zum Nachweis des Vorliegens von Brustkrebs oder zur Evaluierung der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung von Brustkrebs bereit. Solche Kits können in Kombination folgendes umfassen: (i) ein Aufnahmegefäß zum Aufnehmen einer menschlichen Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe von dem zu untersuchendem Individuum, (ii) einen Bindungspartner, der spezifisch entweder an ein Epitop auf einem Brustkrebs-assoziierten Markerprotein oder an eine Nucleinsäuresequenz, die mindestens einen Teil des Brustkrebs-assoziierten Proteins codiert, oder an die Nucleinsäuresequenz, die mindestens einen Teil des Brustkrebs-assoziierten Proteins codiert, bindet, und (iii) eine Referenzprobe. Bei einer Ausführungsform kann die Referenzprobe eine negative und/oder positive Kontrollprobe umfassen. Bei dieser Ausführungsform würde die negative Kontrollprobe auf einen normalen Brustzelltyp hinweisen, und die positive Kontrollprobe würde Brustkrebs anzeigen.
Demnach stellt die Erfindung einen breiten Bereich von Verfahren und Zusammensetzungen bereit, mit denen Brustkrebs bei einem Individuum nachgewiesen werden kann. Insbesondere stellt die Erfindung Brustkrebs-assoziierte Proteine zur Verfügung, die es erlauben, Brustkrebs spezifisch und frühzeitig, bevorzugt, bevor Metastasen auftreten, in einem Individuum nachzuweisen. Zusätzlich stellt die Erfindung Kits bereit, die beim Nachweis von Brustkrebs bei einem Individuum geeignet sind. Zusätzlich stellt die Erfindung in vitro Verfahren bereit, die die Brustkrebs-assoziierten Proteine als Ziele und Indikator verwenden. Diese und weitere zahlreiche zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden Figuren, der ausführlichen Beschreibung und der Patentansprüche deutlich.
Beschreibung der Figuren
Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Abbildungen umfassender verstanden werden. Es zeigen:
1A–1C Spektren, die aus der Charakterisierung über Massenspektrometrie von 28 kD Proteinen, mit denen ein Trypsin-Verdau durchgeführt wurde und die aus einem Polyacrylamidgel herausgelöst wurden, resultieren. 1 ist ein Spektrum des schwersten 28 kD Protein, das aus dem Gel isoliert wurde, 1B ist ein Spektrum des mittleren 28 kD Proteins, das aus dem Gel isoliert wurde, und 1C ist ein Spektrum des leichtesten 28kd Proteins, das aus dem Gel isoliert wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Behandlung von Brustkrebs bereit. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung von Brustkrebs-assoziierten Proteinen, die im Allgemeinen in nachweisbar höherer Konzentration im Serum von Menschen mit Brustkrebs vorkommen, verglichen mit dem Serum von Menschen ohne Brustkrebs.
Die Brustkrebs-assoziierten Proteine oder die Nucleinsäuren, die solche Proteine codieren, können als Marker für den Nachweis von Brustkrebs oder als Ziele für die Therapie von Brustkrebs dienen. Zum Beispiel wird davon ausgegangen, dass die Markerproteine und Bindungseinheiten, zum Beispiel Antikörper, die an Markerproteine binden, oder Nucleinsäuresonden, die mit Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, welche Markerproteine codieren, dazu verwendet werden können, das Vorliegen von Brustkrebs in einem Individuum nachzuweisen. Weiterhin wird davon ausgegangen, dass der Fachmann neue Therapeutika entwickeln kann, um Brustkrebs zu behandeln, die beispielsweise einschließen: Antikörper, die einem Individuum verabreicht werden können, die in vivo an das Zielprotein binden und die dessen biologische Aktivität vermindern oder ausschalten; Nucleinsäure- oder Peptidyl-Nucleinsäuresequenzen, die mit Genen oder Gentranscripten, welche die Zielproteine codieren, hybridisieren und dabei die Expression der Zielproteine in vivo vermindern; oder kleine Moleküle, zum Beispiel organische Moleküle, die mit den Zielproteinen oder mit anderen zellulären bindenden Einheiten wechselwirken, zum Beispiel Rezeptoren für die Zielproteine, um dadurch die biologische Aktivität der Zielproteine zu reduzieren oder auszuschalten.
Nachstehend angeführt sind Verfahren zur Isolierung von Brustkrebs-assoziierten Proteinen, Verfahren zum Nachweis von Brustkrebs durch Brustkrebs-assoziierte Proteine als Marker und Verfahren zur Behandlung von an Brustkrebs erkrankten Individuen unter Verwendung von Brustkrebs-assoziierten Proteinen als Ziele der Krebstherapie.
I. Verfahren zum Nachweis von Brustkrebs-assoziierten Markerproteinen
Erfindungsgemäße Markerproteine, wie hier offenbart, werden identifiziert, indem die Proteinzusammensetzung des Serums eines mit Brustkrebs diagnostizierten Menschen mit dem Serum eines nicht an Brustkrebs erkrankten Menschen verglichen wird. Wie hier verwendet, wird der Begriff "Brustkrebs-asoziiertes Protein" so verstanden, dass damit jedes Protein gemeint ist, das in einer höheren Konzentration im Gewebe oder in der Körperflüssigkeit eines mit Brustkrebs diagnostizierten Individuums vorkommt, im Vergleich zu dem entsprechenden Gewebe oder der Körperflüssigkeit eines Brustkrebsfreien Individuums, und schließt auch artbezogene und allelische Varianten desselben und Fragmente davon ein. Wie hier verwendet, wird der Begriff "Brustkrebs" so verstanden, dass damit jede Art von Krebs oder krebsartige Läsion, die in Brustgewebe oder Brustgewebszellen auftritt und Vorläufer von Brustkrebs einschließt, zum Beispiel typische ductale Hyperplasie oder atypische ductale Hyperplasie, gemeint ist. Es ist nicht notwendig, dass das Markerprotein oder Zielmolekül auf eine Brustkrebszelle oder für die Körperflüssigkeit eines an Brustkrebserkrankten Individuums spezifisch ist, vielmehr sollte das Markerprotein oder das Markermolekül ein Signal-Rausch- Verhältnis aufweisen, das deutlich genug ist, um zwischen den Proben zu unterscheiden, die von einem Brustkrebsgewebe oder -flüssigkeit stammen, im Vergleich zu Proben aus normalem Brustgewebe oder -flüssigkeit.
Wie hier verwendet, wird ein "Teil" oder ein "Fragment" eines Proteins oder einer Aminosäuresequenz so verstanden, dass damit ein zusammenhängendes Peptid bezeichnet wird, das, in Sequenz, mindestens 10 Aminosäuren aus dem Protein oder der Aminosäuresequenz umfasst (z. B. Aminosäuren 1-10, 34-43 oder 127-136 des Proteins oder der Sequenz). Bevorzugt umfassen die Peptide, in Sequenz, mindestens 20 Aminosäuren des Proteins oder der Aminosäuresequenz. Stärker bevorzugt ist es, wenn das Peptid in Sequenz mindestens 40 Aminosäuren aus dem Protein oder der Aminosäuresequenz umfasst.
Die erfindungsgemäßen Brustkrebs-assoziierten Markerproteine wurden durch den Vergleich von Proteinen nachgewiesen, die im Serum von an Brustkrebs erkrankten Individuen vorhanden sind, mit den Proteinen, die im Serum von Individuen vorhanden sind, die nicht an Brustkrebs erkrankt sind. Albumin- und Immunoglobulin-Proteine werden aus dem Serum entfernt, und die Proteine werden durch Anionenaustauscherchromatographie in 12 Fraktionen aufgetrennt. Kurz gesagt, werden die Proteine auf eine starke Anionenaustauschersäule, in Gegenwart von 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, geladen und mit einem schrittweisen Gradienten von Natriumchlorid in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, eluiert. Die dabei gewonnen 12 Fraktionen schließen eine Durchfluss-Fraktion, eine Fraktion, die in 25 mM Natriumchlorid eluiert, eine 50 mM Fraktion, eine 75 mM Fraktion, eine 100 mM Fraktion, eine 125 mM Fraktion, eine 150 mM Fraktion, eine 200 mM Fraktion, eine 250 mM Fraktion, eine 300 mM Fraktion, eine 400 mM Fraktion und eine 2 M Fraktion ein.
Jede Fraktion wurde mittels SELDI (Oberflächen-verstärkte Laser Desorptions und Ionisation)-Massenspektrometrie ausgewertet. Proben aus jeder der 12 Fraktionen werden auf eine der 4 verschiedenen SELDI-Chip-Oberflächen aufgebracht. Eine Kupfer- oder Nickel-SELDI-Oberfläche kann erzeugt werden, indem Kupfer- oder Nickelsalzlösung einem Chip zugesetzt wird, der Ethylendiamintetraessigsäure umfasst. Andere SELDI-Chipoberflächen können sein: WCX-2, das Carboxylat-Einheiten umfasst und SAX-2, das quarternäre Ammonium-Einheiten umfasst. Die erfindungsgemäßen Brustkrebs-assoziierten Proteine können demnach charakterisiert werden durch ihre erhöhte Gegenwart im Serum von an Brustkrebs erkrankten Individuen, im Vergleich zu Individuen ohne Brustkrebs, durch ihr Molekulargewicht, ihre Bindungs- und Elutionsmerkmale auf einem Anionenaustauscherharz und durch ihre Affinität gegenüber einem bestimmten SELDI-Chip. Zum Beispiel soll der Begriff "Affinität" zu einem bestimmten SELDI-Chip, wie hier verwendet, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Brustkrebs-assoziierten Proteine bevorzugt an einen Typ eines SELDI-Chips binden (z. B. einen Kupfer-SELDI-Chip), im Vergleich zu einem oder mehreren anderen hier angeführten SELDI-Chips (z. B. Nickel-, SAX-2- und WCX-2-Chips). Wie in Beispiel 1 ausführlich besprochen, – zeigte der Vergleich der Seren von erkrankten und gesunden Individuen eine Anzahl von Proteinen, die häufig in nachweisbaren Konzentrationen in den Seren erkrankter Individuen vorkommen, jedoch selten in vergleichbaren Konzentrationen in den Seren gesunder Individuen auftreten.
Wurden die Brustkrebs-assoziierten Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert, können die identifizierten Proteine durch Standard-Proteinisolierungsverfahren isoliert und durch auf dem Fachgebiet bekannte und gebräuchliche Verfahren sequenziert werden. Siehe hierzu zum Beispiel, Beispiel 5 und 6. Wurde die Aminosäuresequenz identifiziert, können die Nucleinsäuren, die die Markerproteine codieren, oder Teile davon durch herkömmliche rekombinante DNA-Techniken entschlüsselt werden. Vergleiche hierzu zum Beispiel Sambrook et al. Hrsg. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press. Zum Beispiel kann ein isoliertes Brustkrebs-assoziiertes Protein sequenziert werden, indem übliche Peptid-Sequenzierungsprotokolle sowie Oligonucleotid-Hybridisierungssonden verwendet werden, die zur Sequenzierung einer cDNA-Bibliothek hergestellt wurden. Die cDNA-Bibliothek kann anschließend mit den erzeugten Hybridisierungssonden gescreent werden, um Volllängen- oder Teilllängen-cDNA-Sequenzen zu erhalten, die die isolierten Markerproteine codieren.
Markerproteine, die bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen nicht nur die spezifischen Sequenzen, die hier identifiziert wurden, sondern auch allelische Varianten davon sowie verwandte Proteine, die ebenfalls als Markerproteine fungieren. Deshalb sind bei der vorliegenden Erfindung zum Beispiel jeweils auch Sequenzen, die aus alternativen Spleiß-Formen herrühren, posttranslationale Modifikationen oder Genduplikationen eingeschlossen. Auch artgemäße Varianten sind bei dieser Erfindung mit eingeschlossen, wobei der Patient ein nichtmenschlicher Säuger ist. Auch andere homologe Proteine, die als Markerproteine dienen können, werden betrachtet.
Bevorzugt sind Sequenzvarianten zu mindesten 80 % ähnlich oder zu 70 % identisch zu mindestens einem Teil einer der hier offenbarten Sequenzen, mehr bevorzugt sind sie zu 90 % ähnlich oder zu 80 % identisch, und am meisten bevorzugt sind sie zu 95 % ähnlich oder zu 90 % identisch.
Um zu bestimmen, ob eine betrachtete Peptidregion den erforderlichen Anteil an Ähnlichkeit oder Identität mit einem Referenz-Polypeptid oder Peptid-Oligomer aufweist, werden die ausgewählte Aminosäuresequenz und die Referenz-Aminosäuresequenz zuerst mittels eines Algorithmus zur dynamischen Programmmierung abgeglichen, so wie bei Smith und Waterman (19819; J.Mol.Biol 147:195-197 beschrieben, in Kombination mit der BLOSUM62 Substitutions Matrix, wie in 2 von Henikoff und Henikoff (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks", PNAS (Nov. 1992), 89:10915-10919 beschrieben. Für die vorliegende Erfindung ist ein passender Wert für die Insertions-Gap-Penalty –12, und ein passender Wert für die Extensions-Gap-Penalty –4. Computer Programme, die Alignments mittels des Smith-Waterman Algorithmus und der BLOSUM62 Matrix durchführen, sind im Handel erhältlich und werden von Fachleuten breit eingesetzt.
Sobald das Alignment zwischen betrachteter Sequenz und Referenz-Sequenz durchgeführt wurde, kann der Ähnlichkeits-Prozentsatz errechnet werden. Die einzelnen Aminosäuren jeder Sequenz werden sequentiell auf ihrer Ähnlichkeit zueinander verglichen. Wenn der Wert in der BLOSUM62 Matrix, der den zwei abgeglichenen Aminosäuren entspricht, Null oder negativ ist, ist der paarweise Ähnlichkeitswert gleich Null; andernfalls beträgt der paarweise Ähnlichkeitswert 1.0. Der Ähnlichkeits-Rohwert ist die Summe der Ähnlichkeitswertepaare für die abgeglichenen Aminosäuren. Der Rohwert wird daraufhin normalisiert, indem er durch die Anzahl der Aminosäuren des kleineren der ausgewählten oder Referenzsequenz geteilt wird. Der normalisierte Rohwert ist der Prozentsatz an Ähnlichkeit. Alternativ dazu werden bei der Berechnung der Identitätsprozent die abgeglichenen Aminosäuren jeder Sequenz wieder sequentiell verglichen. Wenn die Aminosäuren nicht identisch sind, beträgt der paarweise Identitätswert Null; im anderen Fall ist der paarweise Identitätswert gleich 1.0. Der Identitäts-Rohwert ist die Summe der identisch abgeglichenen Aminosäuren. Der Rohwert wird dann normalisiert, indem er durch die Anzahl der Aminosäuren der kleineren der Auswahl- oder Referenz Sequenz geteilt wird. Der normalisierte Rohwert ist der Prozentsatz an Identität. Insertionen und Deletionen werden zum Zweck der Berechnung von prozentualer Ähnlichkeit und Identität außer Acht gelassen. Dementsprechend werden Gap-Penalties bei dieser Berechnung nicht verwendet, obwohl sie im Ausgangs-Alignment verwendet werden.
In allen Fällen müssen Varianten der natürlich vorkommenden Sequenzen, wie oben beschrieben, auf ihre Funktion als Markerproteine überprüft werden. Insbesondere muss ihre Gegenwart oder Abwesenheit in einer bestimmten Form oder in einem bestimmten biologischen Kompartiment ein Indiz für das Vorhandensein oder das Nicht-Vorhandensein von Krebs in einem Individuum sein. Diese Routineuntersuchung kann mittels der hier im Folgenden beschriebenen Verfahren oder durch andere übliche Verfahren des Fachgebietes durchgeführt werden.
Markerproteine in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe können über Bindungstests nachgewiesen werden, wobei ein Bindungspartner für das Markerproteine in eine Probe eingeführt wird, von der vermutet wir, das sie das Markerprotein enthält. Bei einem solchen Test kann der Bindungspartner nachweisbar markiert sein, zum Beispiel mit einem Radioisotop- oder Fluoreszenz-Marker. Auch markierte Antikörper können verwendet werden, um ausgewählte Markerproteine zu isolieren. Nucleinsäuren, die Markerproteine codieren, können dadurch nachgewiesen werden, dass Nucleinsäuresonden verwendet werden, die eine Komplementärsequenz zu mindestens einem Teil der das Markerprotein codierenden Sequenz aufweisen. Verfahren, wie PCR oder insbesondere reverse Transkriptase-PCR, sind geeignete Mittel, um Markerproteine codierenden Nucleinsäuren zu isolieren. Die folgenden Beispiele stellen Einzelheiten hinsichtlich Isolierung und Charakterisierung von Brustkrebs-assoziierten Proteinen und hinsichtlich Verfahren zu ihrer Verwendung zum Nachweis und zur Behandlung von Brustkrebs bereit.
2. Nachweis von Brustkrebs
Wurden Brustkrebs-assoziierte Proteine identifiziert, können die Proteine oder Nucleinsäuren, die die Proteine codieren, als Marker verwendet werden, um zu bestimmten, ob ein Individuum an Brustkrebs leidet, und wenn dies der Fall ist, können geeignete Nachweisverfahren verwendet werden, um den Status der Erkrankung zu dokumentieren.
Durch die Verwendung von Markerproteinen oder Nucleinsäuren, die diese Proteine codieren, kann der Fachmann eine Vielzahl von Nachweisverfahren für Brustkrebs bei einem Menschen entwickeln. Typischerweise umfassen die Verfahren die Schritte des Nachweises, durch beliebige Mittel, des Vorliegens von einem oder mehreren Brustkrebs-assoziierten Proteinen oder von Nucleinsäuren, die solche Proteine codieren, in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe des Menschen. Die Genauigkeit und/oder Zuverlässigkeit des Nachweisverfahrens für Brustkrebs bei einem Menschen kann durch den Nachweis einer Vielzahl von Brustkrebs-assoziierten Proteinen und/oder Nucleinsäuren in einer ausgewählten Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe weiter verstärkt werden. Die Nachweis-Assays können einen oder mehrere der nachfolgend beschriebenen Protokolle umfassen.
2.A. Proteinbasierter Assay
Das Markerprotein in einer Probe kann zum Beispiel dadurch nachgewiesen werden, indem das Markerprotein mit einer bindenden Einheit, die das Markerprotein spezifisch zu binden vermag, kombiniert wird. Die bindende Einheit kann zum Beispiel einen Teil eines Liganden-Rezeptor-Paares, d. h. ein Molekülpaar, das eine spezifische Bindungswechselwirkung aufweist, umfassen. Die bindende Einheit kann zum Beispiel ein Element eines spezifischen Bindungspaares sein, wie Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, Nucleinsäure-Nucleinsäure, Protein-Nucleinsäure, Protein-Protein oder andere auf dem Fachgebiet bekannte spezifische Bindungspaare. Es können Bindungsproteine konstruiert werden, die eine verbesserte Affinität gegenüber dem Zielprotein besitzen. Gegebenenfalls kann die bindende Einheit mit einer nachweisbaren Markierung verknüpft werden, wie einer enzymatischen, fluoreszierenden, radioaktiven, phosphoreszierenden oder Farbpartikel-Markierung. Der markierte Komplex kann zum Beispiel visuell oder mit Hilfe eines Spektralphotometers oder eines anderen Detektors nachgewiesen werden.
Markerproteine können auch mittels der auf dem Fachgebiet zur Verfügung stehenden Gelelektrophoreseverfahren nachgewiesen werden. In einer zweidimensionalen Gelelektrophorese werden die Proteine zuerst entlang eines pH-Gradienten nach ihrem isoelektrischem Punkt aufgetrennt. Das dabei entstehende Gel wird dann auf ein zweites Polyacrylamidgel aufgetragen und die Proteine nach dem Molekulargewicht aufgetrennt (Vergleiche, zum Beispiel, O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250:4007-4021)
Ein oder mehrere Markerproteine können nachgewiesen werden, indem zuerst Proteine aus einer Probe isoliert werden, die von einem Individuum mit Verdacht auf Brustkrebs genommen wird, und dann die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt werden, um ein charakteristisches zweidimensionales Gelelektrophoresemuster zu erzeugen. Das Muster kann dann mit einem Standard-Gelmuster verglichen werden, das erzeugt wurde, indem unter den gleichen oder ähnlichen Bedingungen, Proteine aus normalen oder aus Krebszellen isoliert wurden. Das Standard-Gelmuster kann in einer elektronischen Datenbank gespeichert und von dort abgerufen werden. Die Gegenwart von Brustkrebs-assoziierten Proteinen im zweidimensionalen Gel stellt ein Indiz dafür bereit, ob die getestete Probe von einer Person mit Brustkrebs genommen wurde. Ebenso wie bei den anderen hier beschriebenen Nachweisverfahren, verbessert der Nachweis von zwei oder mehreren Proteinen, zum Beispiel in dem zweidimenisonalen Gelelektrophoresemuster, die Genauigkeit des Assays weiter. Das Vorliegen einer Vielzahl, zum Beispiel zwei oder fünf, Brustkrebs-assoziierter Proteine auf dem zweidimenisonalen Gel stellt ein noch stärkeres Indiz für das Vorliegen von Brustkrebs in einem Individuum bereit. Das Assay erlaubt daher eine Früherkennung und Behandlung von Brustkrebs.
Ein Brustkrebs-assoziiertes Markerprotein kann auch mittels einer großen Auswahl von Immunoassay-Techniken, die auf dem Fachgebiet gebräuchlich sind, nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann der Fachmann das Sandwich-Immunoassay verwenden, um Brustkrebs in einer Probe einer Körperflüssigkeit nachzuweisen. Alternativ dazu kann der Fachmann konventionelle immuno-histologische Verfahrensweisen einsetzen, um das Vorhandensein von Brustkrebs-assoziierten Proteinen in einer Gewebeprobe nachzuweisen, indem eine oder mehrere markierte Bindungsproteine verwendet werden.
Bei einem Sandwich-Immunoassay werde zwei Antikörper verwendet, die im Allgemeinen in der Lage sind, das Markerprotein zu binden, zum Beispiel eines davon immobilisiert auf einem festen Träger und das andere frei in Lösung und mit einer nachweisbaren chemischen Verbindung markiert. Beispiele von chemischen Markierungen, die für den zweiten Antikörper verwendet werden können, umfassen Radioisotope, fluoreszierenden Verbindungen und Enzyme oder andere Moleküle, die farbige oder elektrochemisch aktive Produkte erzeugen, wenn sie einem Reaktionspartner oder Enzymsubstrat ausgesetzt werden. Wird eine Probe, die das Markerprotein enthält, in dieses System eingeführt, bindet das Markerprotein sowohl an den immobilisierten Antikörper als auch an den markierten Antikörper und bildet dabei einen "Sandwich"-Immunkomplex auf der Trägeroberfläche. Das komplexierte Protein wird nachgewiesen, indem die nicht gebundenen Komponenten der Probe und überschüssige markierte Antikörper abgewaschen werden und die Menge an markiertem Antikörper, der an das Protein auf der Trägeroberfläche komplexgebunden ist, gemessen wird. Alternativ dazu können die frei in Lösung befindlichen Antikörper, die mit einer chemischen Einheit, zum Beispiel einem Hapten, markiert werden können, durch einen dritten Antikörper nachgewiesen werden, der mit einer nachweisbaren Einheit markiert ist, die an den freien Antikörper oder, zum Beispiel, an das daran gekoppelte Hapten bindet.
Sowohl das Sandwich-Immunoassay als auch das Gewebe-immunhistochemische Verfahren sind hoch spezifisch und sehr empfindlich, mit der Maßgabe, dass Marker mit guten Nachweisgrenzen verwendet werden. Eine detaillierte Übersicht über Aufbau, Theorie und Protokolle von immunologischen Verfahren sind in zahlreichen Fachtexten zu finden, einschließlich "Practical Immunology", Butt, W.R., Hrsg., (1984) Marcel Dekker, New York und "Antibodies. A Laboratory Approach", Harlow et al. Hrsg. (1988) Cold Spring Harbor Laboratory.
Allgemein umfassen Überlegungen zum Aufbau von Immunoassays die Präparation von Antikörpern (z. B. monoklonalen oder polyklonalen Antikörper), die eine genügend hohe Bindungsspezifität gegenüber dem Zielprotein aufweisen, um einen Komplex zu bilden, der zuverlässig von Produkten unspezifischer Reaktionen unterschieden werden kann. Wie hier verwendet, wird der Begriff "Antikörper" als bindende Proteine verstanden, zum Beispiel Antikörper oder andere Proteine, die eine Bindungsdomäne in der Art einer Immunoglobulin-variablen-Region umfassen, die die entsprechenden Bindungsaffinitäten und -spezifitäten für das Zielprotein aufweisen. Je höher die Antikörper-bindende Spezifität, desto niedriger kann die Konzentration des nachzuweisenden Zielproteins sein. Wie hier verwendet, werden die Begriffe "spezifische Bindung" und "Bindungsspezifität" so verstanden, dass die Bindungseinheit, zum Beispiel ein bindendes Protein, eine Bindungsaffinität gegenüber dem Zielprotein aufweist, die größer als etwa 10⁵ M^–1, stärker bevorzugt größer als etwa 10⁷ M^–1 ist.
Antikörper für ein isoliertes Brustkrebs-assoziiertes Protein, die bei Assays zum Nachweis von Brustkrebs in einem Individuum geeignet sind, können mittels standardmäßigen immunologischen Verfahrensweisen erzeugt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt und beschrieben sind. Siehe dazu, zum Beispiel Practical Immunology, Butt N.R. ed. Marcel Dekker, NY, 1984. Kurz gesagt, wird ein isoliertes Zielprotein dazu verwendet, Antikörper in einem artfremden Wirt, wie eine Maus, Ziege oder ein anderer passender Säuger, zu züchten. Das Markerprotein wird mit einem passenden Hilfsmittel kombiniert, das die Antikörper-Produktion im Wirt verstärkt, und es wird dem Wirt, zum Beispiel durch intraperitoneale Verabreichung, injiziert. Jedes Hilfsmittel, das die Immunreaktion des Wirtes stimuliert, kann verwendet werden. Ein gebräuchliches Adjuvans ist Freund's Komplettadjuvans (eine Emulsion, die aus abgetöteten und getrockneten mikrobiellen Zellen besteht und zum Beispiel bei Calbiochem Corp., San Diego, oder bei Gibco, Grand Island, NY erhältlich ist). Wo mehrfache Antigen-Injektionen gewünscht werden, können die nachfolgenden Injektionen die Antikörper in Kombination mit einem Inkomplettadjuvans (z. B. zellfreie Emulsion) enthalten. Polyklonale Antikörper können aus dem Antikörper produzierenden Wirt isoliert werden, indem Serum, das Antikörper gegen das Protein von Interesse enthält, extrahiert wird. Monoklonale Antikörper können produziert werden, indem Wirtszellen isoliert werden, die die gewünschten Antikörper produzieren, indem diese Zellen mit Myelomzellen unter Verwendung von immunologischen auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren fusioniert werden und indem auf Hybridzellen (Hybridome) gescreent wird, die spezifisch mit dem Zielprotein reagieren und die gewünschte Bindungsaffinität aufweisen.
Auch Antikörper-bindende Domänen können biosynthetisch hergestellt werden, und die Aminosäurensequenz der Bindungsdomäne kann verändert werden, um die Bindungsaffinität gegenüber einem bevorzugten Epitop auf dem Zielprotein zu verstärken. Spezifische Antikörper-Verfahren sind hinreichend bekannt und in der Literatur beschrieben. Eine ausführlichere Beschreibung ihrer Herstellung findet man zum Beispiel in "Practical Immunology" (1984) (supra).
Zusätzlich können gentechnisch erzeugte biosynthetische Bindungsstellen, auf dem Fachgebiet auch als BABS oder sFV's bekannt, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von BABS umfassen (i) nicht-kovalent assoziierte oder Disulfid-gebundene synthetische V_H- und V_L-Dimere, (ii) kovalent verknüpfte V_H-V_L-Einzelketten-Bindungsstellen, (iii) individuelle V_H- oder V_L-Domänen oder (iv) Einzelketten-Antikörper-Bindungsstellen und sind zum Beispiel in den U.S.-Patentschriften Nrn.: 5,091,513; 5,132,405; 4,704,692 und 4,946,778 offenbart. Darüber hinaus können BABS mit der erforderlichen Spezifität für Brustkrebs-assoziierte Proteine durch Phagen-Antikörper-Klonierung aus kombinatorischen Genbibliotheken abgeleitet werden (siehe beispielsweise Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628). Kurz gesagt, werden Phagen, die jeweils auf ihrer Oberfläche BABS zeigen, die Immunglobulin-variable Regionen aufweisen, die von Gensequenzen für variable Regionen codiert werden, die wiederum von mit isolierten Brustkrebs-assoziierten Proteinen oder deren Fragmenten vorimmunisierten Mäusen stammen, auf Bindungsaktivität gegenüber immobilisierten Brustkrebs-assoziierten Proteinen gescreent. Phagen, die an die immobilisierten Brustkrebs-assoziierten Proteine binden, werden gewonnen und das Gen, das das BABS codiert, wird sequenziert. Die daraus resultierende Nucleinsäuresequenz, die das BABS von Interesse codiert, kann daraufhin in gebräuchlichen Expressionssystemen exprimiert werden, um das BABS Protein zu erzeugen.
Das isolierte Brustkrebs-assoziierte Protein kann auch zur Entwicklung von diagnostischen oder anderen Gewebeevaluierungskits und -assays verwendet werden, um den Spiegel der in einer Gewebe- oder Fluidprobe aufzuzeichnen. Zum Beispiel, kann das Kit Antikörper oder andere spezifische Bindungsproteine umfassen, die spezifisch an Brustkrebs-assoziierte Proteine binden und die es erlauben, das Vorliegen und/oder die Konzentration der Brustkrebs-assoziierten Proteinen in einer Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen.
Geeignete Kits zum Nachweis von Brustkrebs-assoziierten Proteinen sollen zum Beispiel ein Aufnahmegefäß oder andere Mittel zur Aufnahme von Proben zur Auswertung und Mittel zum Nachweis des Vorkommens und/oder der Menge in der Probe eines oder mehrerer Brustkrebs-assoziierter Proteinen, wie hier beschrieben, umfassen. Wie hier verwendet, umfassen "Mittel zum Nachweis" bei einer Ausführungsform eine oder mehrere Antikörper, die für diese Proteine spezifisch sind, und Mittel zum Nachweis der Bindung der Antikörper an diese Proteine durch z. B. einen standardmäßigen Sandwich-Immunoassay, wie hier beschrieben. Wo das Vorliegen eines Proteins in einer Zelle nachgewiesen werden soll, z. B. wie aus einer Gewebeprobe, kann das Kit auch Mittel zum Aufbrechen der Zellstrukturen umfassen, um die intrazellulären Proteine zu exponieren.
2.B. Auf Nucleinsäure basierende Assays
Das Vorliegen von Brustkrebs in einem Individuum kann auch dadurch festgestellt werden, dass in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe ein Nucleinsäuremolekül nachgewiesen wird, das ein Brustkrebs-assoziiertes Protein codiert. Durch die Verwendung von allgemein auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren können die erfindungsgemäßen Brustkrebs-assoziierte Proteine sequenziert werden, und dann können, auf der Grundlage der festgestellten Sequenz, Oligonucleotid-Sonden zum Screening einer cDNA-Bibliothek hergestellt werden. (siehe, zum Beispiel, Sambrook et al. (1989) supra).
Eine Ziel-Nucleinsäuremolekül, das ein Marker-Brustkrebs-assoziiertes Protein codiert, kann unter Verwendung einer markierten Bindungseinheit nachgewiesen werden, die in der Lage ist, spezifisch an die Ziel-Nucleinsäure zu binden. Die Bindungseinheit kann zum Beispiel ein Protein, eine Nucleinsäure oder eine Peptid-Nucleinsäure umfassen. Zudem kann eine Ziel-Nucleinsäure, wie eine mRNA, die ein Brustkrebs-assoziiertes Protein codiert, nachgewiesen werden, indem zum Beispiel eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von markierten Oligonucleotiden, z. B. Nucleinsäurefragmente, die komplementär zu mindestens einem Teil der Ziel-Nucleinsäure sind und damit spezifisch hybridisieren können, durchgeführt wird.
Noch spezifischer können Gensonden, die Komplementär-RNA oder, bevorzugt, Komplementär-DNA zu Brustkrebs-assozierten Nucleinsäuresequenzen oder mRNA Sequenzen, die Brustkrebs-assozierte Proteine codieren, enthalten, unter Verwendung bewährter rekombinanter Verfahren oder Oligonucleotid-Synthesen hergestellt werden. Die Sonden hybridisieren mit komplementären Nucleinsäuresequenzen, die der Testprobe zugesetzt wurden, und kann eine hervorragende Spezifität liefern. Eine kurze, gut definierte Sonde, die eine einzige spezifische Sequenz codiert, ist äußerst präzise und bevorzugt. Größere Sonden sind im Allgemeinen weniger spezifisch. Während ein Oligonucleotid beliebiger Länge mit einem mRNA-Transkript hybridisieren kann, werden Oligonucleotide, die typischerweise im Bereich von 8-100 Nucleotiden, bevorzugt in einem Bereich von 15-50 Nucleotiden liegen, als bei Standard-Hybridisierungs-Assays besonders geeignet angesehen. Die Auswahl von Sondenlänge und -sequenz erlaubt es, den Grad der gewünschten Spezifität zu wählen. Die Hybridisierung wird bei 50 ° bis 65 °C in einer starken Puffer-Salzlösung, in Formamid oder einem anderen Agens durchgeführt, um den Komplementaritätsgrad einzustellen. Außerdem ist der Stand der Technik so, dass Sonden hergestellt werden können, die praktisch jede DNA- oder RN-Sequenz erkennen. Für weitere Einzelheiten, siehe zum Beispiel, Guide to Molecular Techniques, Berger et al., Methods of Enzymology, Vol. 152, 1987.
Eine breite Vielzahl von verschiedenen Markierungen, die an die Sonden oder Antikörper angefügt werden, können bei den Assays verwendet werden. Das markierte Reagens kann in Lösung oder gekoppelt an einen unlöslichen Träger bereitgestellt werden, je nach Aufbau des Assays. Die verschiedenen Konjugate können kovalent oder nicht-kovalent, direkt oder indirekt verknüpft werden. Werden sie kovalent gebunden, hängt die spezifische Kopplungsgruppe von der Art der zwei zu bindenden Einheiten ab. Eine große Anzahl von Verknüpfungsgruppen und Verfahren zur Verknüpfung wird in der Literatur besprochen. Allgemein können die Markierungen in die folgenden Gruppen unterteilt werden: Chromogene; katalysierte Reaktionen; Chemoluminiszenz; radioaktive Markierungen und farbige Partikel in Kolloidgröße. Die Chromogene schließen Verbindungen ein, die Licht innerhalb eines bestimmten Bereiches absorbieren, so dass ein bestimmte Farbe beobachtet werden kann, oder sie senden Licht aus, wenn sie mit Licht einer bestimmten Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereiches, z. B. Fluoreszierer, bestrahlt werden. Sowohl enzymatische wie nicht enzymatische Katalysatoren können verwendet werden. Bei der Wahl eines Enzyms, muß vieles bedacht werden, einschließlich Stabilität des Enzyms, ob es normalerweise in Proben des Typs zu finden ist, für die das Assay gedacht ist, Natur des Substrates und Effekt, wenn überhaupt, der Konjugation auf die Eigenschaften des Enzyms. Potentiell geeignete Enzymmarkierungen schließen Oxiodoreductasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen oder Synthetasen ein. In Wechselbeziehung stehende Enzymsysteme können ebenso verwendet werden. Eine chemoluminiszente Markierung umfasst eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und die dann Licht aussendet, das als Nachweissignal dient, oder die Energie an einen Fluoreszenz-Akzeptor sendet. Radioaktive Markierungen umfassen verschiedene, allgemein gebräuchliche Radioisotope, wie die instabilen Formen von Wasserstoff, Jod, Phosphor oder ähnlichem. Farbpartikel von Kolloidgröße schließen Materialen ein, wie kolloidales Gold, das in aggregierter Form als deutlicher Fleck an der Stelle der nachzuweisenden Substanz sichtbar ist. Zusätzliche Informationen zu Markierungsverfahren sind zum Beispiel in der U.S. Patentschrift Nr. 4,366,241 offenbart.
Ein gebräuchliches Verfahren zur in vitro Markierung von Nucleotidsonden umfasst die nick Translation, bei der die unmarkierte DNA Sonde mit Hilfe einer Endonuclease mit einem Strangbruch versehen wird, um freie 3'-Hydroxylenden in einem Strang des Doppelstrang-Fragments zu erzeugen. Gleichzeitig entfernt eine Exonuclease die Nucleotidreste vom 5'-Phosphorylende des Strangbruchs. Die Sequenz der Ersatz-Nucleotide wird von der Sequenz des gegenüberliegenden Stranges des Doppelstranges bestimmt. Auf diese Weise füllt DNA-Polymerase, wenn markierte Nucleotide zur Verfügung gestellt werden, den Strangbruch mit markierten Nucleotiden auf. Unter Verwendung dieser allgemein bekannten Technik können bis zu 50 % der Moleküle markiert werden. Bei kleineren Sonden können gebräuchliche Verfahren der 3'-Enden-Markierung angewandt werden. Außerdem gib es heute kommerziell erhältliche Verfahren zur Markierung von DNA mit fluoreszierenden Molekülen, Katalysatoren, Enzymen oder Chemoluminiszenz-Materialien. Biotin-Markierungskits sind im Handel unter dem Handelsnamen Bio-Probe erhältlich (Enzo Biochem Inc.). Dieses System erlaubt es, die Sonde mit Avidin zu verbinden, das wiederum markiert ist, zum Beispiel mit einem fluoreszierenden Molekül, einem Enzym, Antikörper etc. Zur weiteren Erörterung von Sondenkonstruktion und -techniken siehe, zum Beispiel, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).
Das Oligonucleotid, das für die Hybridisierung mit der Ziel-Nucleinsäure, gleich ob chemisch oder durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt, ausgewählt wird, wird unter Verwendung von Standardtechniken isoliert und gereinigt und dann vorzugsweise markiert (z. B. mit ³⁵S oder ³²P) unter Verwendung von Standard-Markierungsprotokollen. Eine Probe mit der Ziel-Nucleinsäure läuft dann auf einem Elektrophoresegel, die aufgetrennten Nucleinsäuren werden auf ein Nitrocellulosefilter aufgebracht und die markierten Oligonucleotide dem Filter unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, z. B. 50 % Formamid, 5 X SSPE, 2 X Denhardt's Lösung, 0,1 % SDS bei 42°C, wie bei Sambrook et al. (1989) supra beschrieben, ausgesetzt. Das Filter wird daraufhin unter Verwendung von 2 X SSPE, 0,1 % SDS bei 68 °C gewaschen, stärker bevorzugt unter Verwendung von 0,1 X SSPE, 0,1 % SDS bei 68 °C. Andere geeignete, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahrensweisen schließen Lösungs-Hybridisierung und dot- und slot-RNA-Hybridisierung ein. Gegebenenfalls kann die Menge an Ziel-Nucleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, quantifiziert werden, indem die Radioaktivität der hybridisierten Fragmente unter Verwendung der Standard-Verfahrensweisen auf dem Fachgebiet gemessen wird.
Zusätzlich können Oligonucleotide verwendet werden, um andere Sequenzen zu bestimmen, die Mitglieder der Zielprotein-Familie codieren. Das Verfahren kann auch dazu verwendet werden, Sequenzen zu identifizieren, die mit den Nucleinsäuresequenzen assoziiert sind, die die hier beschriebenen Proteine codieren, zum Beispiel um nicht-codierende Sequenzen zu bestimmen, die stromaufwärts oder stromabwärts der proteincodierenden Sequenz liegen und die eine bei der Expression dieser Gene eine funktionelle Rolle spielen. Weiterhin können Bindungs-Assays durchgeführt werden, um Proteine zu identifizieren und nachzuweisen, die zu einer spezifischen Bindungsreaktion mit einer Nucleinsäure in der Lage sind, die ein Brustkrebs-assoziiertes Protein codiert, das zum Beispiel bei der Genregulierung oder Genexpression des Proteins eine Rolle spielt. Bei einer weiteren Ausführungsform können die hier beschriebenen Assays verwendet werden, um Nucleinsäure-Moleküle zu identifizieren und nachzuweisen, die eine Sequenz umfassen, die in der Lage ist, ein Brustkrebs-assoziertes Protein zu erkennen und spezifisch daran zu binden.
Zusätzlich wird vermutet, dass unter Verwendung einer Kombination von entsprechenden Oligonucleotid-Primern, d. h. von mehr als einem Primer, der Fachmann den Grad der Expression eines Zielgens in vivo mittels des Standard-Polymerasekettenreaktions (PCR)-Verfahrens, zum Beispiel durch quantitative PCR, bestimmen kann. Konventionelle PCR-basierende Assays werden zum Beispiel bei Innes et al. (1990) "PCR Protocols: A guide to methods an Applications", Academic Press and Innes et al. (1995) "PCR Strategies" Academic Press, San Diego, CA, erörtert.
3. Identifizierung von Proteinen die in vivo mit Brustkrebs-assoziierten Proteinen wechselwirken
Weiterhin wird davon ausgegangen, dass der Fachmann bei der Verwendung von Verfahren, wie sie hier beschrieben wurden, weitere Moleküle identifizieren kann, die in vivo mit den hier beschrieben Brustkrebs-assoziierten Proteinen reagieren. Derartige Moleküle können ebenfalls mögliche Ziele für eine Chemotherapiebereit stellen.
Als Beispiel können cDNA-codierende Proteine und Peptide, die fähig sind, mit Brustkrebs-assoziierten Proteinen zu reagieren, bestimmt werden, indem ein Zwei-Hybrid-Assay verwendet wird, wie bei Durfee et al. (1993) Genes and Develop. 7:555-559 beschrieben. Das Prinzip des Zwei-Hybrid-Assays besteht darin, dass die nicht-kovalente Reaktion zweier Proteine einen Prozess (Transkription) anstößt, wobei dieses Proteine durch ihre kovalente Verbindung zu Domänen, die bei diesem Vorgang eine Funktion haben, normalerweise keine Rolle spielen. Zum Beispiel tritt bei einem Zwei-Hybrid-Assay eine nachweisbare Expression eines Reportergens auf, wenn zwei Fusionsproteine miteinander reagieren, eines mit einer DNA-bindenden Domäne und eines mit einer Domäne, die die Transkription initiert.
Der Fachmann kann eine Wirtszelle verwenden, die eines oder mehrere Reportergene enthält, wie den Hefestamm Y153, beschrieben bei Durfee et al. (1993) supra. Dieser Stamm trägt zwei chromosomal lokalisierte Reportergene, deren Expression von Gal4 reguliert wird. Ein erstes Reportergen ist das E. coli lacZ-Gen unter der Kontrolle des Gal4 Promoters. Ein zweites Reportergen ist das selektierbare HIS3-Gen. Andere geeignete Reportergene können zum Beispiel das Luciferase-Gen, das LEU2-Gen und das GFP (Grün Fluoreszierendes Protein)-Gen einschließen.
Zwei Serien von Plasmiden werden in den zwei Hybridsystemen verwendet. Eine Plasmid-Serie enthält DNA, die eine Gal4 DNA-bindende Domäne kodiert, die im Raster mit einer DNA fusionert ist, die ein Brustkrebs-assoziiertes Protein kodiert. Die andere Plasmid-Serie enthält DNA, die eine Gal4-Aktivierungsdomäne kodiert, die mit Teilen einer menschlichen cDNA-Bibliothek fusioniert ist, die aus menschlichen Lymphozyten hergestellt wurde. Die Expression aus der ersten Plasmid-Serie führt zu einem Fusionsprotein, welches die Gal4 DNA-bindende Domäne und ein Brustkrebs-assoziiertes Protein umfasst. Die Expression aus der zweiten Plasmid-Serie erzeugt ein Transkriptions-Aktivierungsprotein, das mit einem Expressionsprodukt aus der Lymphozyten cDNA-Bibliothek fusioniert wird. Wenn die beiden Plasmide in eine Gal4-Mangel-Wirtszelle, wie die oben beschriebenen Hefe Y153-Zellen, transformiert werden, reagieren die Gal4 DNA-bindende Domäne und die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne nur dann, wenn das mit der DNA-bindenden Domäne fusionierte Brustkrebs-assoziierte Protein an ein Protein bindet, das aus der Lymphozyten-cDNA-Bibliothek exprimiert wurde und mit der Transkriptions-Aktivierungs-Domäne fusioniert ist. Als Folge der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen dem Brustkrebs-assoziierten Protein und seinem in vivo Bindungspartner entstehen nachweisbare Reportergen-Expressionsniveaus.
Des weiteren screent der Fachmann, um Moleküle zu erkennen, die in vivo mit Brustkrebs-assoziierten Proteinen reagieren, auf Moleküle, zum Beispiel kleine Moleküle, die spezifische Reaktionen zwischen Brustkrebs-assoziierten Proteinen und ihren in vivo Bindungspartnern verändern oder unterbinden.
Zum Beispiel kann eine Wirtszelle mit DNA transfektiert sein, die ein geeignetes Hybrid aus DNA-Bindungsdomäne/Brustkrebs-assoziiertem Protein sowie einen Bindungspartner für Translations-Aktivierungs-Domäne/mögliches Brustkrebs-assoziiertes Protein kodiert, wie vorstehend offenbart. Die Wirtszelle enthält auch ein geeignetes Reportergen in operativer Vernüpfung mit einem einem cis-agierenden Transkriptions-Aktivierungs-Element, das von der Transkriptionsfaktor-DNA-bindenden Domäne erkannt wird. Die Menge an exprimierten Reportergenen im System wird ermittelt. Daraufhin wird die Wirtszelle mit einem Kandidaten-Molekül zusammengebracht, und die Menge an exprimiertem Reportergen wird gemessen. Eine Reduzierung in der Reportergen-Exprimierung ist ein Hinweis auf die Fähigkeit des Kandidaten, die Bildung des Komplexes zu oder die Stabilität im Hinblick zum Brustkrebs-assoziierten Protein und seinem in vivo Bindungspartner zu beeinflussen. Als Kontrolle wird die Fähigkeit des Kandidaten-Moleküls getestet, mit anderen nicht damit zusammenhängenden Protein-Protein-Komplexen zu reagieren. Moleküle, die zur spezifischen Beeinflussung von Brustkrebs-assoziierten Protein/Bindungspartner- Verbindungen, jedoch nicht von anderen Protein-Protein-Verbindungen in der Lage sind, werden als Kandidaten zur Herstellung und weiteren Analyse identifiziert. Wurde ein potentieller Kandidat ermittelt, kann seine Wirksamkeit bei der Modulation des Zellzyklus und der Zellreplikation in einem standardisierten Zellzyklus-Modell getestet werden.
Kandidaten-Moleküle können wie nachfolgend beschrieben hergestellt werden. Zum Beispiel kann DNA, die ein Kandidaten-Molekül kodiert, in einen aus einer Auswahl von Expressionsvektoren unter Verwendung der auf dem Fachgebiet üblichen Verfahren eingebracht und eine geeignete Wirtszelle transfektiert werden, um rekombinante Proteine herzustellen, einschließlich Volllängen und verkürzte Formen. Geeignete Wirtzellen sind E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, das Insekten/Baculovirus-Zellsystem, Myelomzellen und verschiedene andere Säugerzellen. Die Volllängen Formen solcher Proteine werden bevorzugt in Säugerzellen exprimiert, wie hier offenbart. Die Nukleotidsequenzen schließen bevorzugt eine Sequenz zum Ausrichten der translatierten Sequenz auf den Kern ein, unter Verwendung zum Beispiel einer Sequenz, die die Acht-Aminosäure-Kern-Zielsequenz des großen T Antigens kodiert, welches auf dem Fachgebiet gut charakterisiert ist. Der Vektor kann außerdem verschiedene Sequenzen umfassen, die die korrekte Expression des rekombinanten Proteins steuern, einschließlich Transkriptionspomotor und Terminierungssequenzen, Enhancersequenzen, Sequenzen für bevorzugte Ribosomen-Bindungsstellen, bevorzugte mRNA-Leadersequenzen, bevorzugte Protein-Verarbeitungssequenzen, bevorzugte Signalsequenzen für die Proteinsekretion und ähnliche. Die DNA-Sequenz, die das Gen von Interesse kodiert, kann ebenfalls verändert werden, um mögliche Inhibierungssequenzen zu entfernen oder um die Bildung unerwünschte Sekundärstruktur zu minimieren. Wie der Praktiker auf dem Fachgebiet erkennt, kann das rekombinante Protein auch als Fusionsprotein exprimiert werden.
Nach der Translation kann das Protein aus den Zellen an sich gereinigt oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Die DNA kann auch Sequenzen umfassen, die die Expression und/oder Reinigung des rekombinanten Proteins unterstützen. Die DNA kann direkt oder als Teil eines Fusionsproteins exprimiert werden, das eine leicht abspaltbare Fusionsverbindungsstelle besitzt.
Die DNA kann auch in einem geeigneten Säuger-Wirt exprimiert werden. Geeignete Wirte sind unter anderem Fibroblasten-3T3-Zellen, (z. B. NIH 3T3 von CLR 1658) COS (Affen Niere ATCC, CLR-1650) oder CH0 (Chinesische Hamster Eierstock)Zellen (CHO-DXB11aus Chasin (1980) Proc. Nat'l. Acad.Sci. USA 77:4216-4222), Nerz-Lungenepithelzellen, menschliche Vorhaut-Fibroblastenzellen, menschliche Glioblastomzellen und Teratokarzinomzellen. Andere geeignete eukaryotische Zellsysteme schließen Hefezellen, das Insekten/Baculovirus-System und Myelomzellen ein.
Um ein Kandidatenmolekül zu exprimieren, wird die DNA in eine Insertionsstelle eines geeigneten kommerziell erhältlichen Vektors zusammen mit geeigneten Promotor/Enhancer-Sequenzen und 3'-Terminierungssequenzen subkloniert. Geeignete Promotor/Enhancer-Sequenzkombinationen sind unter anderem der CMV-Promotor (humaner Cytomegalovirus (MIE) Promotor), der zum Beispiel auf pCDM8 vorhanden ist, sowie der Mammae Tumor Virus-Promotor (MMTV), verstärkt durch die Rous Sarkom Virus LTR-Enhancersequenz (z. B. von Clontech, Inc. Palo Alto). Ein Geeigneter induzierbarer Promotor schließt zum Beispiel einen Zn²⁺-induzierbaren Promotor, wie den Zn²⁺-Methallothionein-Promotor (Wrana et al. (1992) Cell 71:1003-1014) ein. Andere induzierbare Promotoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können mit ähnlichem Erfolg eingesetzt werden. Die Expression kann durch transaktivierte Enhancersequenzen weiter verstärkt werden. Das Plasimd enthält bevorzugt auch einen amplifizierbaren Marker, wie DHFR, unter geeigneter Promotorkontrolle, z. B. SV40 früher Promotor (ATCC Nr. 37148). Bedingungen für Transfektion, Zellkultur, Gen-Amplifizierung und Proteinexpression sind Standardbedingungen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben bei Ausubel et al., ed. (1989) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Son, NY beschrieben. Kurz gesagt, werden transfektierte Zellen in einem Medium kultiviert, das 5-10 % dialysiertes fötales Kalbsserum (dFCS) enthält, und stabile, transfektierte Zelllinien hoher Expression werden durch Amplifizierung und Subklonierung gewonnen und durch standardmäßige Western- und Northern-Blot-Analyse ausgewertet. Southern-Blots können ebenfalls verwendet werden, um den Status integrierter Sequenzen und das Ausmaß ihrer Kopien bei der Amplifizierung zu bewerten.
Das exprimierte Kandidatenprotein wird dann unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt. Ein derzeit bevorzugtes Verfahren verwendet eine Affinitätssäule, wie eine Liganden-Affinitätssäule oder eine Antikörper-Affinitätssäule. Die Säule wird anschließend gewaschen und die Kandidatenmoleküle in einem Gradienten mit zunehmender Ionenstärke, wechselndem pH oder durch Zusatz eines milden Detergens selektiv eluiert. Es wird davon ausgegangen, dass zusätzlich zu den Kandidatenmolekülen, die an die Brustkrebs-assoziierten Moleküle binden, die Brustkrebs-assoziierten Moleküle selbst durch derartige DNA-Technologien erzeugt werden können.
Beispiel I – Identifizierung von Brustkrebsmarkern
Um Brustkrebsmarker zu identifizieren, werden die Seren von Individuen mit Brustkrebs mit den Seren von normalen Individuen durch Oberflächen-verstärkte Laser Desorption und Ionisation (SELDI) Massenspektrometrie verglichen. Kurz gesagt, wurden 0,5-ml-Aliquote von Seren der Individuen aufgetaut. Dann wurde jedem Aliquot 1 μl einer 1mg/ml Lösung eines Soja-Trypsin-Inhibitors (SBTI) und 1 μl einer 1 mg/ml Leupeptin-Lösung zugesetzt. Um Lipide zu entfernen, wurden jeder Probe 350 μl 1,1,2-Trifluorotrichlorethan hinzugefügt. Die Proben wurden daraufhin 5 Minuten verwirbelt und in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C 5 Minuten lang zentrifugiert. Der dabei entstehende Überstand wurde auf eine 1-ml-Agarosesäule, gekoppelt an Protein G (Hitrap Protein G-Säule, Pharmacia and Upjohn, Peapack, NJ) aufgetragen, um Immunoglobin-Proteine zu entfernen. Die Säule wurde anschließend mit 3 ml 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, mit SBTI und Leupeptin ("Bindungspuffer") gespült, und der resultierende Durchfluss wurde direkt auf eine 5-ml-Säule von 6 % Sepharose, gekoppelt an Cibacron Blau (Hitrap blue-Säule, Pharmacia and Upjohn, Peapack, NJ), aufgetragen, um Albuminproteine zu entfernen. Die Hitrap blue-Säule wurde mit 20 ml Bindungspuffer gespült. Der resultierende Durchfluss wurde unter Verwendung von vier Konzentrationseinheiten auf Zentrifugationsbasis mit einer 10-D-Ausschlussgrenze (Centricon 10, Millipore Corporation, Bedford, MA) auf ein Endvolumen von etwa 0,7 ml konzentriert.
Das resultierende Serum (im Wesentlichen frei von Immunoglobulinen und Albuminen) wurde durch Ionenaustauscherchromatographie in 12 Fraktionen unterteil, die etwa die gleichen Mengen an Proteinen enthielten. Im Besonderen wurde das Serum auf eine Mono Q (Pharmacia and Upjohn, Peapack, NJ)-Ionenaustauschersäule (ein starker Anionenaustauscher mit quaternären Ammoniumgruppen) in einem 50 mM Natriumphosphat Puffer, pH 7,0 aufgetragen, und die Proteine wurden von der Säule eluiert, indem die Konzentration von Natriumchlorid schrittweise erhöht wurde. Somit wurde das Serum in 12 Fraktionen unterteilt, je nach Konzentration des bei der Elution verwendeten Natriumchlorids. Diese Fraktionen wurden entsprechend als Durchfluss benannt, 25 mM, 50mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM und 2 M Natriumchlorid. Nach der Elution wurde jede Fraktion auf ungefähr 100 μg/ml konzentriert und der Puffer mit Bindungspuffer ausgetauscht.
Dann wurden 4-10 μl von jeder Fraktion auf jeweils eine von vier SELDI-Chip-Oberflächen binden gelassen, wobei jede Oberfläche bis zu 8 Proben hielt. Die beabsichtigte Lokation jeder Probe auf dem Chip wurde mit einem Kreis markiert, der mit einem wasserabweisenden Marker gezogen wurde, wie diejenigen, die auch bei Pap-Abstrichen verwendet werden. Die hier verwendeten SELDI-Chips wurden von Ciphergen Biosystems, Inc. Palo Alto, Kalifornien bezogen und wie nachstehend beschrieben verwendet.
Für Kupfer- oder Nickel-Oberflächen wurde ein Chip, der Ethylendiamintetraessigsäure-Einheiten (IMAC, Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto CA) enthielt, mit zwei 5-min-Applikationen von 5 μl eines Kupfersalzes oder Nickelsalzes behandelt und mit deionisiertem Wasser gewaschen. Nach einer 5-min-Behandlung mit 5 μl des Bindungspuffers, wurden zwei bis drei μl der Probe für 30 bis 60 min auf die Oberfläche aufgetragen. Weitere zwei bis drei μl an Probe wurden dann für weitere 30 bis 60 min aufgetragen. Dann wurden die Chips zweimal mit Bindungspuffer gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. 0,5 μl Sinapinsäure (12,5 mg/ml) wurde zweimal hinzugefügt und jedes Mal trocknen gelassen. Die Gegenwart von Sinapinsäure verstärkt die Verdampfung und Ionisation der gebundenen Proteine bei der Massenspektrometrie.
Für Chipoberflächen, die Carboxyl-Einheiten enthalten (WCX-2, Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA), wurde vor der Verwendung des wasserunlöslichen Stifts die Oberfläche 30 min mit 10 mM HCl gewaschen und fünfmal mit deionisiertem Wasser gespült. Nach der Verwendung des Stifts wurde die Oberfläche fünfmal mit 5 μl des Bindungspuffers und einmal mit deionisiertem Wasser gewaschen. 2 bis 3 μl der Probe wurde in zwei Applikationen von jeweils 30 bis 60 min aufgetragen. Die Oberfläche wurde zweimal mit 5 μl des Bindungspuffers gewaschen, und 0,5 μl Sinapinsäure wurden zweimal aufgetragen.
Für Chipoberflächen, die quaternäre Ammonium-Einheiten enthielten (SAX-2, Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA), wurden die Oberflächen nach Verwendung des Stifts fünfmal mit 5 μl Bindungspuffer und einmal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Probenapplikaton, Waschen, Sinapinsäureapplikation wurden vorgenommen, wie oben beschrieben.
Die Chips wurden dann einer Massenspektrometrie unterzogen, unter Verwendung von Ciphergen SELDI PBS One (Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA), in dem die das Software-Programm "SELDI v. 20.0) lief. Für alle Chips wurden wurde "hohe Masse" bei 200.000 Daltons eingestellt, der "Beginn der Detektor-Empfindlichkeit" wurde auf 9 (bei einer Bandbreite von 1-10, mit 10 als der höchsten Empfindlichkeit) eingestellt. NDF (Neutrale Dichte Filter) wurde auf "Aus" gestellt, die Daten-Aquisitionsmethode wurde auf "SELDI Quantifizierung" eingestellt. Die SELDI-Aquisitionsparameter wurden auf 20 eingestellt, mit Inkrementen von 5, und ein Aufwärmen mit zwei Schüssen bei Intensität 50 (von 100) wurde mit einbezogen. Für IMAC-Chips wurde die Masse von 3000 Daltons bis 3001 Daltons optimiert, die Laser-Anfangsintensität wurde auf 80 (von 100) und Übergänge auf 5 (d. h. 5 Laser Schüsse pro Stelle) eingestellt. Die Peaks wurden automatisch vom Computer erfasst. Für WCX-2 Chips wurde die Masse von 3000 Daltons bis 50.000 Daltons optimiert, die Laser-Anfangsintensität wurde auf 80 und die Übergänge auf 8 eingestellt. Die Peaks wurden automatisch vom Computer erfasst. Für SAX-2 Chips wurde die Masse von 3000 Daltons bis 50.000 Daltons optimiert, die Laser-Anfangsintensität wurde auf 85 und der Übergang auf 8 eingestellt. Die Peaks wurden automatisch vom Computer erfasst.
Zehn Serumproben (von fünf normalen Individuen und fünf von Individuen mit Brustkrebs) wurden durch Massenspektrometrie analysiert, um die Proteine zu identifizieren, die in den 60 oben beschriebenen Fraktionen auftreten. Die resultierenden Peaks in der massenspektrometrischen Spur wurden miteinander verglichen, um diejenigen Peaks zu identifizieren, die im Serum von Individuum mit Brustkrebs, aber nicht in normalen Proben auftreten. Wenn Die Peaks in verschiedenen Proben eine Massendifferenz von nicht mehr als 1 Prozent aufwiesen, wurden sie als gleich vermutet. Elf massenspektrometrische Peaks im Größenbereich von gerade über 11.000 Da bis etwa 103.000 Da wurden in allen fünf Serumproben von Individuen mit Brustkrebs und in keiner der Proben der normalen Individuen nachgewiesen. Die Gegenwart oder Abwesenheit dieser Peaks wurde daraufhin für weitere 30 Serumproben bestimmt (15 von normalen Individuen und 15 von Individuen mit Brustkrebs). Sieben weitere Peaks, die in vier der ursprünglich fünf Brustkrebs-Serumproben, aber in keiner der normalen Proben vorhanden waren, wurden ebenso analysiert, da sie in der gleichen Fraktion und auf der gleichen SELDI-Oberfläche vorhanden waren wie ein oder mehrere der elf Peaks, die bereits bewertet wurden.
Die Ergebnisse der obigen Analyse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die in der Tabelle aufgelisteten Massen werden als exakt innerhalb von 1 Prozent angenommen.
Tabelle 1.
Beispiel 2 – Sequenzieren von Brustkrebs-Markerproteinen
Brustkrebs-assoziierte Proteine, die auf den oben zur Verfügung gestellten biochemischen und massenspektrometrischen Daten basieren, können besser unter Verwendung gut bekannter Techniken charakterisiert werden. Zum Beispiel können Proben des Serums fraktioniert werden, zum Beispiel unter Verwendung Säulenchromatographie und/oder Elektrophorese, um gereinigte Proteinproben herzustellen, entsprechend jeweils den Proteinen, die in Tabelle 1 benannt wurden. Die Sequenzen der isolierten Proteine können dann mit Hilfe konventioneller Peptidsequenzierungsverfahren (siehe Beispiel 5 und 6) bestimmt werden. Es wird angenommen, dass der Fachmann, in Anbetracht der obigen Offenbarung, in der Lage ist, einen Antikörper herzustellen, der gegen jedes der Brustkrebs-assoziierten Proteine gerichtet ist, das mit den hier beschriebenen Verfahren identifiziert wurde. Darüber hinaus kann der Fachmann in Anbetracht der obigen Offenbarung Nukleinsäuresequenzen herstellen, die die oben beschriebenen Fragmente sowie dazu komplementäre Nukleinsäuren kodieren. Weiterhin kann der Fachmann mit den konventionellen rekombinanten DNA-Verfahren, zum Beispiel durch Screenen einer cDNA-Bibliothek mit derartigen Nukleinsäuresequenzen Volllängen-Nukleinsäuresequenzen isolieren, die die Brustkrebs-assoziierten Zielproteine kodieren. Solche Volllängen-Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon, können dazu verwendet werden, Nachweissysteme oder Therapeutika auf Nukleinsäurebasis zu erzeugen.
Beispiel 3 Produktion von Antikörpern, die spezifisch an Brustkrebs-assoziierte Proteine binden
Nach der Identifizierung kann ein Brustkrebs-assoziiertes Protein in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe unter Verwendung m einer Vielzahl von Bindungsassays, die den Fachleuten gut bekannt sind, nachgewiesen werden. Beispielsweise kann, wie oben besprochen, ein Brustkrebs-assoziiertes Protein sowohl in einer Gewebe- als auch in einer Körperflüssigkeitsprobe unter Verwendung eines Antikörpers, zum Beispiel eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an ein Epitop bindet, das sich auf einem Brustkrebs-assoziierten Protein befindet, nachgewiesen werden. Bei derartigen Nachweissystemen ist der Antikörper bevorzugt mit einer nachweisbaren Einheit markiert.
Nachfolgend wird ein beispielhaftes Protokoll zur Produktion eines Brustkrebs-assoziierten monoklonalen Antikörpers bereitgestellt. Auch andere Protokolle sind vorstellbar. Demnach wird das besondere Verfahren zur Produktion von Antikörpern für Zielproteine nicht als ein Aspekt der Erfindung angesehen.
Balc/c by J Mäusen (Jackson Laboratory. Bar Harbor, ME) wird intraperitoneal das Zielprotein alle 2 Wochen injiziert, bis die immunisierten Mäuse den entsprechenden Serumtiter erreichen. Danach erhalten die Mäuse drei aufeinanderfolgende intravenöse Boosterinjektionen. Freund's Komplettadjuvans (Gibco, Grand Island) wird für die erste Injektion verwendet, Freund's Inklompettadjuvans für die zweite Injektion; und Kochsalzlösung wird für die folgenden intravenösen Injektionen verwendet. Das Tier wird sodann getötet und die Milz entfernt. Milzzellen (oder Lymphknotenzellen) werden dann mit einer Mäuse-Myelomlinie fusioniert, z.B. unter Verwendung des Verfahrens von Kohler et al. (1975) Nature 256:495. Hybridome, die Antikörper produzieren, die mit den Zielproteinen reagieren, werden daraufhin kloniert und als Asziten kultiviert. Hybridome werden gemäß ihrer Reaktivität gegenüber dem Immunogen durch einen beliebigen gewünschten Assay gescreent. Eine ausführliche Beschreibung von Screening-Protokollen, Asziten-Produktion und Immunoasays ist auch in PCT/AS92/09220, veröffentlicht am 13. Mai 1993, offenbart.
Beispiel 4 – Antikörperbasiertes Assay zum Nachweis von Brustkrebs in einem Individuum
Das folgende Assay wurde für Gewebeproben entwickelt; jedoch wird davon ausgegangen, dass ähnliche Assays zum Testen von Flüssigkeitsproben ohne allzu großen experimentellen Aufwand entwickelt werden können. Ein typisches Assay kann einen im Handel erhältlichen Immunodetection Kit verwenden, beispielsweise den ABC Elite Kit von Vector Laboratories, Inc.
Eine Biopsieprobe wird dem zu untersuchenden Patienten unter Befolgung der entsprechenden medizinischen Richtlinien entnommen. Die Probe wird daraufhin auf einen Glas-Objektträger aufgebracht und die Probe 10 Minuten in kaltem Aceton fixiert. Anschließend wird der Objektträger mit destilliertem Wasser gespült und mit einer Wasserstoffperoxidlösung (2 ml 30 % H₂O₂ und 30 ml kaltes Methanol)vorbehandelt. Der Objektträger wird dann mit einer Pufferlösung A, umfassend Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween und 0,1 Brij, gespült. Ein Mäuse-Anti-Brustkrebs-assoziiertes-Protein-monoklonaler Antikörper in Pufferlösung A wird dem Objektträger zugefügt, und der Objektträger wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird der Objektträger mit Pufferlösung A gewaschen und dem Objektträger ein sekundärer Antikörper (ABC Elite Kit, Vector Labs, Inc.) in Pufferlösung A zugefügt. Daraufhin wird der Objektträger 15 min bei 37 °C in einem Brutschrank inkubiert. Die Objektträger werden nochmals mit Pufferlösung A gewaschen und sodann das ABC Reagens (ABC Elite Kit, Vector Labs, Inc.) zur Verstärkung des Signals dem Objektträger zugesetzt. Anschließend wird der Objektträger für weitere 15 min bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
Der Objektträger wird dann mit destilliertem Wasser gewaschen, und ein Diaminobenzedinsubstrat (DAB) wird dem Objektträger 4-5 min zugesetzt. Dann wird der Objektträger mit destilliertem Wasser gespült, mit Hämatoxylin kontrastgefärbt, mit 95% Ethanol, mit 100 % Ethanol und dann mit Xylol gespült. Dann wird ein Deckgläschen auf den Objektträger gelegt und das Ergebnis unter dem Lichtmikroskop betrachtet.
Beispiel 5 – Reinigung und Charakterisierung des 28,3 kD Brustkrebs Proteins
Das in Beispiel 1 identifizierte 28,3 kD Brustkrebs-Protein wurde isoliert und folgendermaßen weiter charakterisiert.
Etwa 30 ml Serum (vereinigt von mehreren Brustkrebspatienten) wurden unter Verwendung der Protein G-Chromatographie bzw. Cibacron Blue Agarose-Chromatographie unter Verwendung von Standardmethoden, wie in Beispiel 1 beschrieben, an Immunoglobulin G und Serumalbumin abgereichert. Die Albumin- und Immunoglobulin-abgereicherten Seren wurden mittels Mono Q Ionenaustauscher-Affinitätschromatographie fraktioniert. Kurz gesagt, wurden die Serumproteine auf eine 5-ml-Mono Q-Säule (Pharmacia and Upjohn, Peapack, NJ) in einem 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, aufgetragen und die Durchflussfraktion gesammelt. Anschließend wurden die Serumproteine unter Verwendung eines 50 mM Natriumphophatpuffers, pH 7,0, der zunehmende Konzentrationen an Natriumchlorid enthält, schrittweise von der Säule eluiert. Auf diese Weise wurden 12 Fraktionen erhalten, von denen jede eine unterschiedliche Menge Natriumchlorid enthält. Die Fraktionen umfassten Durchfluss- und Elutionspufferlösungen, die 50mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, die 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM und 2 M Natriumchlorid enthalten.
Die 50 mM Natriumchlorid-Fraktion mit dem Protein von Interesse wurde später in eine 50 mM Natriumphosphat-Pufferlösung, pH 7,0 zurück versetzt und mittels eines Centricon 10 (Millipore) nach den Angaben des Herstellers konzentriert. Die resultierende Probe wurde daraufhin durch Größenausschlußchromatographie auf einer SephacrylS-200 Säule (Pharmacia) unter Verwendung einer isokratischen Pufferlösung mit 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4, fraktioniert. Fraktionen, die aus der Säule eluierten, wurden auf das Vorliegen des 28,3 kD Proteins unter Verwendung der Ciphergen SELDI-Masenspektrometrie, wie in Beispiel 1 beschrieben, evaluiert. Die Fraktionen, die das 28,3 kD Protein enthielten, wurden vereinigt und auf eine IMAC-Säule (Sigma) aufgetragen, die durch eine vorherige Inkubation mit 50 mM NiCl₂ mit Ni²⁺-Ionen aufgeladen wurde. Die IMAC-Säule wurde anschließend mit 6 Bettvolumina einer Lösung gewaschen, die 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4 enthielt, und die gebundene Proteinfraktion wurde mit der gleichen Lösung, die 100 mM Imidazol enthielt, eluiert. Die eluierte Fraktion wurde daraufhin mittels eines Minicon 10 (Millipore) konzentriert und dann durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf einem 12 % Tris-Glycin SDS-PAGE-Gel fraktioniert. Proben aus der Proteinfraktion wurden auf zwei getrennte Bahnen des Gels aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant Blue-Farbstoff gefärbt und entfärbt, um das Vorliegen des Proteins aufzudecken. Drei Banden von etwa 28,3 kD (gekennzeichnet als das Protein mit höchstem Molekulargewicht, das Protein mit mittlerem Molekulargewicht und das Protein mit dem geringsten Molekulargewicht) wurden aus einer der zwei Bahnen herausgeschnitten und von den Acrylamid-Scheiben eluiert.
Die Proteine wurden wie folgt aus dem Gel eluiert. Kurz gesagt, wurden die Gelscheiben fünfmal mit HPLC-reinem Wasser unter kräftigem Verwirbeln gewaschen. Die gewaschenen Scheiben wurden in 120 μl einer 100 mM Natriumacetatlösung, pH 8,5, 0,1 % SDS, in kleine Stücke geschnitten und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen dekantiert und in einem Speedvac getrocknet. Das resultierende Pellet wurde dann in 37 μl HPLC-reinem Wasser rekonstituiert. Etwa 1480 μl kaltes Ethanol wurden dann dazugegeben, und die resulitierende Mischung über Nacht bei –20 °C inkubiert. Die Probe wurde 15 min bei 4 °C und 11.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das resultierende Pellet in 5 μl Wasser rekonstituiert. Die resultierende Proteinlösung wurde auf dem SELDI laufen gelassen und das 28,3 kD Protein in einem der drei Präparationen identifiziert (siehe 1A, die dem schwersten 28kD Protein entspricht). Die entsprechende Bande wurde anschließend aus der zweiten der beiden Bahnen auf dem Gel herausgeschnitten. Nach Proteolyse mit Trypsin wurden die Trypsinfragmente aus dem Gel eluiert und der Mikrosequenzanalyse über Massenspektrometrie unterzogen.
Vier individuelle Massen wurden durch Massenspektrometrie nachgewiesen. Wurden die die vier Massen zur Durchsuchung der Swiss Protein Database verwendet, wurde Übereinstimmung der Aminosäurensequenzen gefunden, die in dem Protein vorhanden waren, das auf dem Fachgebiet als U2 kleines nukleäres Ribonucleoprotein B'' (U2 snRNP B'') bezeichnet wird (Habets et al. (1987) supra, Swiss Protein Database Zugangsnummer 4507123 und Proc. Nat'l. Acad. Sci USA, 84:2421-2425 (1987)). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Die Aminosäurensequenz, in N- nach C-terminaler Richtung, des U2 snRNP B''-Proteins im Einaminosäure-Code lautet:
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro Verfahren, umfassend die Schritte: (a) Erhalten einer aus einem Säuger isolierten Probe, und (b) Nachweisen in der Probe die Gegenwart eines Proteins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, die, sofern vorhanden, ein Zeichen für das Vorliegen von Brustkrebs in dem Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe Brustgewebe oder eine Körperflüssigkeit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Körperflüssigkeit aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Blut, Serum, Plasma, Schweiß, Tränen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Lymphe, Vaginalsekreten, Samen, Zerebrospinalflüssigkeit, Aszitesflüssigkeit, Saliva, Sputum und Brust-Exudat.
In vitro Verfahren, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer aus einem Säuger stammenden Probe mit einer bindenden Einheit, die spezifisch an ein Krebs-assoziiertes Protein bindet, um einen Komplex aus bindender Einheit-Krebs-assoziiertem Protein zu erzeugen, wobei die bindende Einheit aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment und einer biosynthetischen Antikörper-bindenden Stelle, und die spezifisch an ein Protein bindet, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst; und (b) Nachweisen der Gegenwart des Komplexes, der, sofern vorhanden, ein Zeichen auf das Vorliegen von Brustkrebs in dem Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei gegebenenfalls (i) die bindende Einheit mit einer nachweisbaren Einheit markiert ist; (ii) die bindende Einheit ein Antikörper ist oder (iii) die bindende Einheit ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Fehlen einer nachweisbaren Menge des Proteins ein Zeichen für die Abwesenheit von Krebs ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 4, 5 oder 6, das weiterhin die zusätzlichen Schritte umfasst: (a) Messen einer Menge des Komplexes in der Probe; und (b) Vergleichen der Menge des Komplexes in der Probe mit einem Schwellenwert, der ein Zeichen für Brustkrebs in einem Säuger ist, wobei eine Menge des Komplexes in der Probe, die größer oder gleich dem Schwellenwert ist, ein Zeichen für das Vorliegen des Brustkrebses in dem Säuger ist.
In vitro Verfahren, umfassend: Nachweisen des Vorliegens eines Nucleinsäuremoleküls in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe aus einem Säuger, um dadurch das Vorliegen von Brustkrebs in dem Säuger anzuzeigen, wobei das Nucleinsäuremolekül eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die in SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 ausgeführte Aminosäuresequenz codiert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Nachweisschritt das Zusammenbringen der Probe mit einer markierten Hybridisierungssonde umfasst, die zur spezifischen Hybridisierung mit dem Nucleinsäuremolekül in der Lage ist.
In vitro Verfahren, umfassend die Schritte: (a) Zusammenbringen einer Probe aus einem Säuger unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen mit einer Nucleinsäuresonde, die zur spezifischen Hybridisierung mit einer Ziel-Nucleinsäure in der Lage ist, die die in SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 ausgeführte Aminosäuresequenz codiert; und (b) Nachweisen des Vorliegens eines Doppelstrangs, der die Nucleinsäuresonde umfasst, wobei das Vorliegen des Doppelstrangs ein Zeichen für das Vorliegen von Brustkrebs in dem Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 10, das weiterhin den Schritt des Amplifizierens der Ziel-Nucleinsäure in der Probe vor dem Zusammenbringen der Probe mit der Nucleinsäuresonde umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Nucleinsäuresonde mit einer nachweisbaren Einheit markiert ist und wobei die nachweisbare Einheit gegebenenfalls ein Element umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer radioaktiven Markierung, einer Haptenmarkierung, einer fluoreszierenden Markierung und einer enzymatischen Markierung.
Bindende Einheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment und einer biosynthetischen Antikörper-bindenden Stelle, die spezifisch an ein Protein bindet, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, zur Verwendung als diagnostisches Mittel beim in vitro Nachweis von Brustkrebs.
Verwendung einer bindende Einheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment und einer biosynthetischen Antikörper-bindenden Stelle, die spezifisch an ein Protein bindet, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis von Brustkrebs.
Nucleinsäuresonde, die zur spezifischen Hybridisierung an eine Ziel-Nucleinsäure in der Lage ist, die die in SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 ausgeführte Aminosäursequenz codiert, zur Verwendung als diagnostisches Mittel zum in vitro Nachweis von Brustkrebs.
Verwendung einer Nucleinsäuresonde, die zur spezifischen Hybridisierung an eine Ziel-Nucleinsäure in der Lage ist, die die in SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 ausgeführte Aminosäuresequenz codiert, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis von Brustkrebs.
Testsatz zur Verwendung bei einem in vitro Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von Brustkrebs oder zur Evaluierung der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung eines Brustkrebses, wobei der Testsatz in Kombination folgendes umfasst: ein Aufnahmegefäß zum Aufnehmen einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe aus einem Säuger; eine bindende Einheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment und einer biosynthetischen Antikörper-bindenden Stelle, die spezifisch an ein Brustkrebs-assoziiertes Protein bindet, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5; und ein Mittel zum Nachweis der bindenden Einheit, die an das Brustkrebs-assoziierte Protein gebunden ist.
Testsatz nach Anspruch 17, der weiterhin eine Referenzprobe umfasst, wobei die Referenzprobe gegebenenfalls ein Zeichen für eine normale Brustprobe ist.