DE60029775T2

DE60029775T2 - Glukose-dehydrogenase

Info

Publication number: DE60029775T2
Application number: DE60029775T
Authority: DE
Inventors: Koji Sode
Original assignee: Ultizyme International Ltd
Current assignee: Ultizyme International Ltd
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-05-01
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2020-05-02
Also published as: KR20020010624A; US7049114B1; IL146137A0; US20060019328A1; EP1176202A1; EP1176202A4; WO2000066744A1; DE60029775D1; CN1353759A; EP1176202B1; TWI224136B; CN100410379C; CA2372741A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Glucose-Dehydrogenasen mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym (PQQGDH) und ihre Verwendung in Glucosetests.
FACHLICHER HINTERGRUND
Blutglucose ist ein wichtiger Marker für Diabetes. Bei fermentativen Herstellungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen wird der Glucosespiegel zur Überwachung des Verfahrens getestet. Herkömmliche Glucosetests beruhten auf enzymatische Verfahren, wobei Glucose-Oxidase (GOD) oder Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) verwendet wurden. Allerdings erforderten die GOD-basierten Tests die Zugabe einer Katalase oder Peroxidase zum Testsystem, um das bei der Glucoseoxidationsreaktion entstandene Wasserstoffperoxid zu quantifizieren. G6PDHs sind für spektralphotometrische Glucosetests verwendet worden, wobei in diesem Fall das Coenzym NAD(P) dem Reaktionssystem zugegeben werden musste.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung einer modifizierten, wasserlöslichen PQQGDH mit verbesserter Affinität zu Glucose. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine modifizierte, wasserlösliche PQQGDH mit hoher Selektivität für Glucose bereitzustellen, um die Sensitivität bei der Messung von Blutglucosespiegeln zu erhöhen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Wir fanden, dass PQQGDH mit einer hohen Affinität zu Glucose als neue Enzyme, alternativ zu den bisher in enzymatischen Glucosetests verwendeten Enzymen, nützlich sind.
PQQGDH sind Glucose-Dehydrogenasen mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, die die Reaktion katalysieren, in der Glucose oxidiert wird, um Gluconolacton herzustellen.
Es ist bekannt, dass PQQGDH membrangebundene und wasserlösliche Enzyme einschließen. Membrangebundene PQQGDH sind Einzelpeptid-Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 87 kDa und werden häufig in verschiedenen Gramnegativen Bakterien gefunden. Siehe zum Beispiel A. M. Cleton-Jansen et al., J. Bacteriol. 172 (1990), 6308–6315. Auf der anderen Seite sind wasserlösliche PQQGDH in mehreren Stämmen von Acinetobacter calcoaceticus identifiziert worden (Biosci. Biotech. Biochem. 59(8) (1995), 1548–1555). Um die Aminosäuresequenzen aufzuzeigen wurden ihre Strukturgene cloniert (Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 430–436). Die wasserlösliche, von A. calcoaceticus stammende PQQGDH ist ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von etwa 50 kDa. Sie weist in der Proteinprimärstruktur eine geringe Homologie zu anderen PQQ-Enzymen auf. Kürzlich wurden die Ergebnisse einer Röntgenkristallstrukturanalyse dieses Enzyms veröffentlicht, die die Struktur höherer Ordnung des Enzyms einschließlich dem aktiven Zentrum zeigen (A. Oubrie et al., The cristal structure of the apo form of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus reveals a novel internal conserved sequence repeat, J. Mol. Biol. 289 (1999), 319–333; A. Oubrie et al., Structure and mechanism of soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, The EMBO Journal 18(19) (1999), 5187–5194; A. Oubrie et al., Active-site structure of the soluble quinoprotein glucose dehydrogenase complexed with methylhydrazine: A covalent cofactor-inhibitor complex, PNAS 96(21) (1999), 11787–11791). Diese Veröffentlichungen zeigten, dass die PQQGDH ein β-Propeller-Protein, bestehend aus 6 W-Motiven, ist.
Um eine modifizierte PQQGDH zu entwickeln, die in klinischen Tests oder Nahrungsmittelanalysen eingesetzt werden kann, gelang es uns, als ein Ergebnis sorgfältiger Untersuchungen, durch Verbesserung der herkömmlichen wasserlöslichen PQQGDH, um ihre Affinität zu Glucose erhöhen, ein Enzym mit hoher Affinität zu Glucose zu erhalten, indem ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Region der wasserlöslichen PQQGDH eingeführt wurde.
Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung eine modifizierte, wasserlösliche Glucose-Dehydrogenase mit Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, die dadurch charakterisiert ist, dass mindestens ein Aminosäurerest einer natürlichen, wasserlöslichen Glucose-Dehydrogenase durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist und sie im Vergleich mit der natürlichen, wasserlöslichen Glucose-Dehydrogenase eine verbesserte Affinität zu Glucose aufweist. Die erfindungsgemäße modifizierte PQQGDH hat einen Km-Wert für Glucose, der geringer ist als der Km-Wert der natürlichen PQQGDH, vorzugsweise weniger als 20 mM, stärker bevorzugt weniger als 10 mM.
Vorzugsweise hat die erfindungsgemäße modifizierte Glucose-Dehydrogenase eine erhöhte Affinität zu Glucose, obgleich ihre Affinitäten zu anderen Zuckern unverändert oder herabgesetzt sind, dabei weist sie eine höhere Selektivität für Glucose als die natürliche, wasserlösliche Glucose-Dehydrogenase auf. Besonders die Reaktivität gegenüber Lactose oder Maltose ist vermindert gegenüber der des Wildtyps im Gegensatz zu der Reaktivität gegenüber Glucose. Wenn die Reaktivität gegenüber Glucose mit 100% angesetzt wird, ist die Aktivität gegenüber Lactose oder Maltose vorzugsweise 60% oder weniger, stärker bevorzugt 50% oder weniger und noch stärker bevorzugt 40% oder weniger.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen PQQ-Glucose-Dehydrogenase ist mindestens ein Aminosäurerest in der Region, die den Resten 268–289 oder 448–468 der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entspricht, ersetzt durch einen anderen Aminosäurerest, d.h. einen Aminosäurerest anders als der betreffende Aminosäurerest in der natürlichen PQQ-Glucose-Dehydrogenase. Die Zählung der Aminosäuren beginnt dabei mit dem Initiator-Methionin als Position +1.
Der hier mit Bezug auf Aminosäurereste oder -Regionen verwendete Begriff „entsprechen" bedeutet, dass einige Aminosäurereste oder -Regionen eine äquivalente Funktion in zwei oder mehreren strukturell ähnlichen, aber verschiedenen Proteinen haben. Zum Beispiel gilt jede Region der wasserlöslichen PQQGDHs, die von anderen Organismen als Acinetobacter calcoaceticus stammen, als „der Region entsprechend, die durch die Reste 268–289 der wasserlöslichern, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH definiert ist", wenn die Region eine hohe Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz zu der Region, die durch die Reste 268–289 der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH definiert ist, aufweist. Vernünftigerweise wird davon ausgegangen, dass ausgehend von der Sekundärstruktur des Proteins diese Region in dem anderen Protein die gleiche Funktion besitzt. Außerdem gilt der zehnte Aminosäurerest in dieser Region als „dem 277ten Rest der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entsprechend."
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH ist mindestens ein Aminosäurerest, der Glutamat 277 (Glutamat 253 der SEQ ID NO: 1), Isoleucin 278 (Isoleucin 254 der SEQ ID NO: 1), Asparagin 462 (Asparagin 438 der SEQ ID NO: 1), Asparagin 452 (Asparagin 428 der SEQ ID NO: 1), Lysin 455 (Lysin 431 der SEQ ID NO: 1), Aspartat 456 (Aspartat 432 der SEQ ID NO: 1), Aspartat 457 (Aspartat 433 der SEQ ID NO: 1) oder Aspartat 448 (Aspartat 424 der SEQ ID NO: 1) der Aminosäuresequenz der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entspricht, ersetzt durch einen anderen Aminosäurerest.
In einer stärker bevorzugten erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH ist Glutamat 277 (Glutamat 253 der SEQ ID NO: 1) ersetzt durch einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alanin, Asparagin, Lysin Aspartat, Histidin, Glutamin, Valin und Glycin oder Isoleucin 278 (Isoleucin 254 der SEQ ID NO: 1) der Aminosäuresequenz der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH ist ersetzt durch Phenylalanin, in der Aminosäuresequenz, gezeigt als SEQ ID NO: 1
In einem anderen Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH die Sequenz:
wobei Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 und Xaa8 jeden natürlichen Aminosäurerest darstellen, vorausgesetzt, dass Xaa8 nicht Asp repräsentiert, wenn Xaa1 Asn, Xaa2 Lys, Xaa3 Asp, Xaa4 Asp und Xaa5 Asn darstellen.
In einem anderen Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH die Sequenz:
wobei Xaa6 und Xaa7 jeden natürlichen Aminosäurerest darstellen, vorausgesetzt, dass Xaa7 nicht Ile repräsentiert, wenn Xaa6 Glu darstellt.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Gen, das jede der vorstehend beschriebenen modifizierten Glucose-Dehydrogenasen codiert, einen Vektor, der das Gen enthält, und eine Transformante, die das Gen enthält, sowie einen Glucose-Testkit und einen Glucose-Sensor, der eine erfindungsgemäße modifizierte Glucose-Dehydrogenase umfasst.
Enzymproteine der erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH haben eine hohe Affinität zu Glucose und eine hohe Oxidationsaktivität gegenüber Glucose, so dass sie in hoch sensitiven und hoch selektiven Glucose-Tests eingesetzt werden können.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt die Struktur des Plasmids pGB2, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
2 zeigt ein Schema zur Herstellung eines mutierten Gens, das ein erfindungsgemäßes modifiziertes Enzym codiert.
3 zeigt einen Glucose-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH.
AM MEISTEN BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Struktur der modifizierten PQQGDHs
Durch zu Fehlern neigende PCR führten wir zufällige Mutationen in die codierende Region der Gene ein, welche die wasserlösliche PQQGDH codieren, um eine Genbank von wasserlöslichen PQQGDHs, die Aminosäureaustausche enthalten, herzustellen. Diese Gene wurden in E. coli transformiert und bezüglich der Aktivität der PQQGDH gegenüber Glucose abgesucht, um eine Anzahl von Clonen zu erhalten, die die PQQGDH mit vergleichbaren Aktivitäten für 20 mM und 100 mM Glucose und verbesserter Reaktivität gegenüber niedrigen Mengen von Glucose im Vergleich mit dem Wildtyp-Enzym exprimieren.
Die Analyse der Nucleotidsequenz von einem dieser Clone zeigte, dass Glu 277 geändert wurde in Gly. Wenn dieser Aminosäurerest durch verschiedene andere Aminosäurereste ersetzt wurde, wurden in jedem Fall ausgezeichnete mutierte Enzyme mit verbesserter Affinität zu Glucose im Vergleich mit der wasserlöslichen Wildtyp-PQQGDH erhalten.
Daraufhin wurden bei anderen Resten, nahe des 277tes Restes, ortsgerichtete Mutationen eingeführt und die Affinität zu Glucose bestimmt. Modifizierte Enzyme, die Ile278Phe und Asn279His in der Region, die durch die Reste 268–289 definiert sind, tragen, wurden hergestellt und bezügliche ihrer Aktivität getestet, um zu zeigen, dass diese modifizierten Enzyme eine hohe Affinität zu Glucose aufweisen.
Eine Anzahl von Clonen, wie vorstehend erhalten, wurden weitergehend abgesucht nach Clonen, die PQQGDH mit einer Aktivität gegenüber 20 mM Glucose exprimieren, die vergleichbar ist mit der der Wildtyp-PQQGDH, aber einer Aktivität gegenüber 20 mM Lactose, die geringer ist als die der Wildtyp-PQQGDH.
Die Analyse der Nucleotidsequenz eines dieser Clone zeigte, dass Asn 452 zu Asp geändert war. Wenn dieser Rest durch Threonin, Lysin, Isoleucin, Histidin oder Aspartat ersetzt wurde, wurden in jedem Fall ausgezeichnete mutierte Enzyme erhalten mit, im Vergleich mit der wasserlöslichen Wildtyp-PQQGDH, verbesserter Selektivität für Glucose. In der gleichen Art und Weise wurden auch bei anderen Resten in der Nähe des 452ten Restes Mutationen eingeführt. Mutierte Enzyme, die Lys455Ile, Asp456Asn, Asp457Asn, Asn462Asp, Asp448Asn tragen, wurden hergestellt. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, zeigten die Ergebnisse, dass alle mutierten Enzyme eine verbesserte Selektivität gegenüber Glucose aufweisen.
In den bevorzugten PQQ-Glucose-Dehydrogenasen der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Aminosäurerest in der Region, die den Resten 448–468 der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entspricht, ersetzt durch einen anderen Aminosäurerest. In bevorzugten erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH ist mindestens ein Aminosäurerest, der Asparagin 462 (Asparagin 438 der SEQ ID NO: 1), Asparagin 452 (Asparagin 428 der SEQ ID NO: 1), Lysin 455 (Lysin 431 der SEQ ID NO: 1), Aspartat 456 (Aspartat 432 der SEQ ID NO: 1), Aspartat 457 (Aspartat 433 der SEQ ID NO: 1) oder Aspartat 448 (Aspartat 424 der SEQ ID NO: 1) der Aminosäuresequenz der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entspricht, ersetzt durch einen anderen Aminosäurerest.
In einem anderen Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH die Sequenz:
wobei Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 und Xaa8 jeden natürlichen Aminosäurerest darstellen, vorausgesetzt, dass Xaa8 nicht Asp repräsentiert, wenn Xaa1 Asn, Xaa2 Lys, Xaa3 Asp, Xaa4 Asp und Xaa5 Asn darstellen.
In anderen bevorzugten PQQ-Glucose-Dehydrogenasen der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Aminosäurerest in der Region, die den Resten 268–289 (244–265 der SEQ ID NO: 1) der Aminosäuresequenz der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entspricht, ersetzt durch einen anderen Aminonsäurerest. In besonders bevorzugten erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH ist Glutamat 277 (Glutamat 253 der SEQ ID NO: 1) ersetzt durch einen Aminosäurerest, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Alanin, Asparagin, Lysin, Aspartat, Histidin, Glutamin, Valin und Glycin oder Isoleucin 278 (Isoleucin 254 der SEQ ID NO: 1) der Aminosäuresequenz der wasserlöslichen PQQGDH, die von Acinetobacter calcoaceticus stammt, ist ersetzt durch Phenylalanin.
In einem anderen Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH die Sequenz:
wobei Xaa6 und Xaa7 jeden natürlichen Aminosäurerest darstellen, vorausgesetzt dass Xaa7 nicht Ile repräsentiert, wenn Xaa6 Glu darstellt.
In erfindungsgemäßen modifizierten Glucose-Dehydrogenasen können andere Aminosäurereste teilweise entfernt oder ersetzt werden, oder andere Aminosäurereste können hinzugefügt werden, so lange wie die Glucose-Dehydrogenase-Aktivität erhalten bleibt.
Gemäß dem hier Gelernten, kann der Fachmann ebenso einen Aminosäurerest von wasserlöslichen PQQGDH, die von anderen Bakterien stammen, ersetzen, um modifizierte Glucose-Dehydrogenasen mit verbesserter Affinität zu Glucose zu erhalten. Besonders Aminosäurereste, die Glutamat 277, Isoleucin 278, Asparagin 462, Lysin 452, Aspartat 455, Aspartat 456, Aspartat 457 und Aspartat 448 der wasserlöslichen, von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH entsprechen, können leicht durch den Vergleich der Primärstruktur der Proteine, die aneinander ausgerichtet sind, oder Vergleich der aus den Primärstrukturen vorhergesagten Sekundärstrukturen der Enzyme identifiziert werden. Modifizierte Glucose-Dehydrogenasen mit verbesserter Affinität zum Substrat können durch das erfindungsgemäße Ersetzen derartiger Aminosäurereste erhalten werden. Diese modifizierten Gucose-Dehydrogenasen gehören auch zum Gültigkeitsbereich der vorliegenden Erfindung.
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DER MODIFIZIERTEN PQQGDH
Die Sequenz der Gene, welche die wasserlösliche, von Acinetobacter calcoaceticus stammende Wildtyp-PQQGDH codieren, ist definiert durch die SEQ NO: 2.
Gene, welche die erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH codieren, können durch Ersetzen der Nucleotidsequenz, die einen spezifischen Aminosäurerest in dem Gen, das die wasserlösliche Wildtyp-PQQGDH codiert, durch die Nucleotidsequenz, die einen Aminosäurerest codiert, der eingesetzt werden soll, hergestellt werden. Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Techniken für einen derartigen ortsgerichteten Nucleotidsequenz-Austausch bekannt, wie zum Beispiel in Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, beschrieben.
Ein so erhaltenes mutiertes Gen wird in einen Genexpressionsvektor (zum Beispiel, ein Plasmid) eingesetzt und in einen geeigneten Wirt (zum Beispiel E. coli) transformiert. Eine Anzahl von Vektor/Wirt-Systemen zur Expression eines Fremdproteins sind bekannt und verschiedene Wirte wie Bakterien, Hefen oder kultivierte Zellen sind geeignet.
Zufallsmutationen werden für Fehleranfällige PCR in eine Zielregion eingeführt, um eine Genbank von modifizierten wasserlöslichen PQQGDH, die Mutationen in der Zielregion tragen, herzustellen. Diese Gene werden in E. coli transformiert, um jeden Clon bezüglich der Affinität der PQQGDH zu Glucose abzusuchen. Wasserlösliche PQQGDH werden, wenn sie in E. coli exprimiert werden, in den periplasmatischen Raum sezerniert, so dass sie leicht unter Verwendung der E. coli-Zellen hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität getestet werden können. Um optisch die PQQGDH-Aktivität zu bestimmen, wird diese Genbank in der Anwesenheit von 20 mM Glucose mit einem PMS-DCIP-Farbstoff kombiniert, so dass Clone, die eine Aktivität vergleichbar zu der gegenüber 100 mM Glucose zeigen, ausgewählt werden und hinsichtlich der Nucleotidsequenz analysiert werden, um die Mutation zu bestätigen. Um modifizierte PQQGHDs mit verbesserter Selektivität für Glucose zu erhalten, wird zur optischen Bestimmung der PQQGDH-Aktivität diese Genbank mit einem PMS-DCIP-Farbstoff kombiniert, so dass Clone, die gegenüber 20 mM Glucose eine Aktivität vergleichbar mit der Wildtyp-PQQGDH aufweisen, deren Aktivität gegenüber 20 mM Lactose aber geringer ist als die der Wiltyp-PQQGDH ausgewählt werden und hinsichtlich der Nucleotidsequenz analysiert werden, um die Mutation zu bestätigen.
Die so erhaltenen transformierten Zellen, die modifizierte PQQGDHs exprimieren, werden gezüchtet und durch Zentrifugation oder andere Verfahren vom Kulturmedium geerntet und dann mit einer French-Presse aufgeschlossen oder osmotisch geschockt, um die periplasmatischen Enzyme in das Medium abzugeben. Das Enzym kann ultrazentrifugiert werden, um eine Fraktion zu erhalten, die wasserlösliche PQQGDH enthält. Alternativ kann die exprimierte PQQGDH durch die Verwendung eines geeigneten Wirt/Vektor-Systems in das Medium sezerniert werden. Die so erhaltene wasserlösliche Fraktion wird durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, HPLC und Ähnliches gereinigt, um eine erfindungsgemäße modifizierte PQQGDH herzustellen.
VERFAHREN ZUR PRÜFUNG DER ENZYMAKTIVITÄT
Während der Katalyse der Reaktion, bei der Glucose oxidiert wird, um Gluconolacton herzustellen, assoziieren die erfindungsgemäßen PQQGDHs mit PQQ als Coenzym. Die Enzymaktivität kann durch Verwendung der Farbentwicklungsreaktion von Redox-Färbemitteln getestet werden, um die Menge von PQQ, das bei der von PQQGDH katalysierten Oxidation der Glucose reduziert wird, zu messen. Geeignete Farbentwicklungsreagenzien umfassen zum Beispiel PMS (Phenazinmethosulfat)-DCIP (2,6-Dichlorphenolindophenol), Kaliumferricyanid und Ferrocen.
AFFINITÄT ZU GLUCOSE
Die erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDHs weisen im Vergleich mit dem Wildtyp eine außerordentlich verbesserte Affinität zu Glucose auf. Daher haben modifizierte PQQGDHs einen Km-Wert für Glucose, der beträchtlich geringer ist als der Km-Wert für Glucose dem Wildtyp-PQQGDH. Unter den modifizierten PQQGDHs hat die Glu277Lys-Variante einen Km-Wert für Glucose von 8,8 mM und ein Aktivitätsmaximum vergleichbar zu dem des Wildtyp-Enzyms, so dass sie eine verbesserte Reaktivität gegenüber geringen Mengen Glucose besitzt.
Daher haben Testkits oder Enzymsensoren, die mit den erfindungsgemäßen modifizierten Enzymen hergestellt wurden, den außerordentlichen Vorteil, dass sie, wegen der hohen Sensitivität der Glucosetests, Glucose in geringen Mengen nachweisen können.
VERFAHREN ZUR BEWERTUNGS DER SELEKTIVITÄT
Die Selektivität der erfindungsgemäßen PQQGDHs für Glucose können durch Testen der Enzymaktivität, wie vorstehend beschrieben, bewertet werden. Dafür werden verschiedene Zucker wie 2-Desoxy-D-glucose, Mannose, Allose, 3-o-Methy-D-glucose, Galachose, Xylose, Lactose und Maltose als Substrate verwendet und die relative Aktivität zur Aktivität gegenüber Glucose bestimmt.
GLUCOSE-TESTKIT
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Glucose-Testkit, der eine erfindungsgemäße modifizierte PQQGDH umfasst. Der erfindungsgemäße Glucose-Testkit umfasst eine modifizierte PQQGDH gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Menge, die für mindestens einen Durchlauf des Test ausreicht. Zusätzlich zur erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH umfasst der Kit normalerweise einen für den Test notwendigen Puffer, einen Mediator, Standardglucoselösungen zur Herstellung einer Eichkurve und eine Gebrauchsanweisung. Erfindungsgemäße modifizierte PQQGDHs können in verschiedenen Formen wie zum Beispiel gefriergetrocknete Reagenzien oder Lösungen in geeigneten Konservierungslösungen bereitgestellt werden. Erfindungsgemäße modifizierte PQQGDHs werden vorzugsweise in Form eines Holoenzyms bereitgestellt, obwohl sie auch als Apoenzym geliefert werden können und vor dem Gebrauch in ein Holoenzym überführt werden können.
GLUCOSE-SENSOR
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Glulcose-Sensor unter Verwendung einer erfindungsgemäßen modifizierten PQQGDH. Geeignete Elektroden schließen Kohle, Gold, Platin und ähnliche Elektroden ein, auf denen ein Enzym der vorliegenden Erfindung mittels quervernetzendem Agens immobilisiert wird; Einbettung in eine Polymermatrix; Ummanteln mit einer Dialysemembran; Verwendung eines photovernetzbaren Polymers, eines elektrisch leitfähigen Polymers oder eines Redoxpolymerisats; Fixieren des Enzyms in einem Polymer oder Adsorbieren auf der Elektrode mit einem Elektronenvermitter einschließlich Ferrocen oder dessen Abkömmlinge; oder eine beliebige Kombination davon. Erfindungsgemäß modifizierte PQQGDHs werden vorzugsweise in Form eines Holoenzyms auf der Elektrode immobilisiert, obwohl sie auch als Apoenzym immobilisiert werden können und PQQ als eine separate Schicht oder in einer Lösung bereitgestellt wird. Üblicherweise werden erfindungsgemäße modifizierte PQQGDHs auf einer Kohleelektrode mit Glutaraldehyd immobilisiert und dann mit einem aminhaltigen Reagens behandelt, um das Glutaraldehyd zu blockieren.
Die Glucosemengen können folgendermaßen gemessen werden: PQQ, CaCl₂ und ein Mediator werden in eine Thermostatzelle, die einen Puffer enthält, gegeben und bei einer konstanten Temperatur belassen. Geeignete Mediatoren schließen zum Beispiel Kaliumferricyanid und Phenazinmethosulfat ein. Eine Elektrode, auf der eine erfindungsgemäße modifizierte PQQGDH immobilisiert worden ist, wird als Arbeitselektrode in Kombination mit einer Gegenelektrode (z.B. eine Platinelektrode) und einer Referenzelektrode (z.B. Ag/AgCl-Elektrode) verwendet. Nachdem zum Aufbau eines stationären Stroms an die Kohleelektrode eine konstante Spannung angelegt worden ist, wird eine glucosehaltige Probe zugegeben, um das Ansteigen der Stromsstärke zu messen. Die Glucosemenge der Probe kann von einer Eichkurve, die mit Glucoselösungen in Standardkonzentrationen erstellt wurde, abgelesen werden.
Die Offenbarungen aller hier zitierten Patente und Dokumente sind vollständig durch Bezugnahme eingebunden. Die vorliegende Anmeldung beansprucht Priorität, beruhend auf den japanischen Patentanmeldungen Nrn. 1999-124285 und 2000-9137, deren Offenbarung hierin vollständig durch Bezugnahme eingebunden sind.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter, ohne dieselbe jedoch darauf einzuschränken.
Beispiel 1
Erstellen und Absuchen einer mutierten PQQGDH-Genbank:

Das Plasmid pGB2 wurde durch das Einfügen des Strukturgens, welches die von Acinetobacter calcoaceticus stammende PQQGDH codiert, in die multiple Clonierungsstelle des Vektors pTrc99A (Pharmacia) erhalten (1). Dieses Plasmid wurde als eine Matrize verwendet, um durch für Fehler anfällige PCR in verschiedene Regionen Zufallsmutationen einzufügen. Die PCR-Reaktion wurde in einer Lösung, deren Zusammensetzung in Tabelle 1 aufgeführt ist, unter den Bedingungen: 94°C für die Dauer von 3 Minuten, 30 Zyklen 94°C für die Dauer von 3 Minuten, 50°C für die Dauer von 2 Minuten und 72°C für die Dauer von 2 Minuten und schließlich 72°C für die Dauer von 10 Minuten, durchgeführt. Tabelle 1

TaqDNA-Polymerase (5 U/μl)	0.5 μl
Matrizen-DNA	1.0 μl
Vorwärts-Primer ABF	4.0 μl
Rückwärts-Primer ABR	4.0 μl
10 × Taq-Polymerasepuffer	10.0 μl
1 M β-Mercaptoethanol	1.0 μl
DMSO	10.0 μl
5 mM MnCl₂	10.0 μl
10 mM dGTP	2.0 μl
2 mM dATP	2.0 μl
10 mM dCTP	2.0 μl
10 mM dTTP	2.0 μl
H₂O	51.5 μl
	100.0 μl

Die so erhaltene mutierte wasserlösliche PQQGDH-Genbank wurde in E. coli transformiert und jede entstandene Kolonie wurde in eine Mikrotiterplatte überführt. Die Kolonie wurde ferner auf einer ersten Platte, die 10 mM Glucose und PMS-DCIP enthielt, und einer zweiten Platte, die 100 mM Glucose und PMS-DCIP enthielt, replika-plattiert und beide wurden hinsichtlich der PQQGDH-Aktivität optisch bewertet. Eine Anzahl von Clonen, die auf beiden Platten eine vergleichbare PQQGDH-Aktivitäten zeigten, wurden erhalten.
Einer diese Clone wurde zufällig ausgewählt und bezüglich seiner Nucleotidsequenz analysiert, um zu zeigen, dass das Glutamat 277 in Glycin abgeändert wurde.
Beispiel 2
Jede Kolonie, die im Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in eine Mikrotiterplatte überführt. Die Kolonie wurde auf einer ersten Platte, die 20 mM Glucose und PMS-DCIP enthielt, und einer zweiten Platte, die 20 mM Lactose und PMS-DCIP enthielt, replika-plattiert und beide wurden hinsichtlich der PQQGDH-Aktivität optisch bewertet. Auf beiden Platten wurde eine Anzahl von Clonen erhalten, die eine beträchtlich geringere Aktivität gegenüber Lactose als Glucose zeigten.
Einer diese Clone wurde zufällig ausgewählt und bezüglich seiner Nucleotidsequenz analysiert, um zu zeigen, dass das Asparagin 452 in Aspartat abgeändert wurde.
Beispiel 3
Herstellung von modifizierten PQQGDH-Genen:
Ausgehend von dem Strukturgen der von Acinetobacter calcoaceticus stammenden PQQGDH, aufgelistet in SEQ ID NO: 2, wurde die Nucleotidsequenz, die Glutamat 277 oder Isoleucin 278 codiert, durch die Nucleotidsequenzen ersetzt, welche die gegebenen Aminosäurereste codieren. Dies erfolgte durch ortsgerichtete Mutagenese gemäß eines Standardverfahrens, wie in 2 gezeigt, unter Verwendung des Plasmids pGB2. In Tabelle 2 sind die Sequenzen der synthetischen Oligonucleotid-Zielprimer, die für die Mutagenese verwendet wurden, aufgeführt. Dabei bedeutet in Tabelle 2 zum Beispiel „E277A", dass das Glutamat 277 durch Aspartat ersetzt wurde.
Tabelle 2
Ein KpnI-HindIII-Fragment, das einen Teil des Gens enthält, welches die von Acinetobacter calcoaceticus stammende PQQGDH codiert, wurde in das Vektorplasmid pKF18k (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebaut und als Matrize verwendet. 50 fMol dieser Matrize, 5 pMol des dem Mutan^TM-Express Km Kit (Takara Shuzo Co., Ltd) beigefügten Selektions-Primers und 50 pMol des phosphorylierten Ziel-Primers wurden mit dem im Kit beigefügten Anelierungspuffer, in einer Menge, die 1/10 des Gesamtvolumens (20 μl) entspricht, gemischt, und das Gemisch wurde für die Dauer von 3 Minuten auf 100°C erhitzt, um das Plasmid in Einzelstränge zu denaturieren. Der Selektions-Primer dient zur Umkehrung von doppelten Amber-Mutationen auf dem Kanamycin-Resistenzgen von pKF18k. Das Gemisch wurde für die Dauer von 5 Minuten auf Eis gestellt, um die Primer anlagern zu lassen. Zu diesem Gemisch wurden 3 μl des dem Kit beigefügten Extensionspuffers, 1 μl T4-DNA-Ligase, 1 μl T4-DNA-Polymerase und 5 μl sterilisiertes Wasser gegeben, um einen komplementären Strang zu synthetisieren.
Der synthetische Strang wurde in einen Fehlpaarungsreparatur-defizienten Stamm von E. coli BMH71-18muts transformiert und über Nacht auf dem Schüttler kultiviert, um das Plasmid zu vervielfältigen.
Dann wurden die Plasmidkopien von den Kulturen extrahiert und in E. coli MV1184 transformiert und dann von den Kolonien extrahiert. Diese Plasmide wurden sequenziert, um die Einführung der beabsichtigten Mutationen zu bestätigen. Diese Fragmente wurden für das KpnI-HindIII-Fragment des Gens eingesetzt, welches auf dem Plasmid pGB2A die Wildtyp-PQQGDH codiert, um Gene für die modifizierten PQQGDHs herzustellen.
Ein Oligonucleotid-Ziel-Primer der Sequenz:
wurde in der gleichen Art und Weise synthetisiert, um Histidin für Asparagin 452 einzusetzen. Ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des Plasmids pGB2 mittels des in 2 gezeigten Verfahrens durchgeführt. Ebenso wurden Gene für modifizierte PQQGDHs hergestellt, welche die Mutationen Asp448Asn, Asn452Asp, Asn452His, Asn452Lys, Asn452Thr, Asn452Ile, Lys455Ile, Asp456Asn, Asp457Asn und Asn462Asp tragen.
Beispiel 4
Herstellung der modifizierten Enzyme
Das Gen, welches die Wildtyp- oder jede modifizierte PQQGDH codiert, wurde in die multiple Clonierungsstelle des E. coli-Expressionsvektor pTrc99A (Pharmacia) eingesetzt, und das so entstandene Plasmid wurde in den E. coli Stamm DH5α transformiert. Die Transformante wurde über Nacht im Schüttler bei 37°C in 450 ml L-Medium (das 50 μg/ml Ampicillin enthält) in einer Sakaguchi-Flasche kultiviert und 7 l L-Medium, welches 1 mM CaCl₂ und 500 μM PQQ enthält, wurden damit beimpft. Etwa 3 Stunden nach Beginn der Züchtung wurde Isopropylthiogalactosid in einer Endkonzentration von 0,3 mM zugegeben, und die Züchtung wurde für weitere 1,5 Stunden fortgesetzt. Die gezüchteten Zellen wurden durch Zentrifugation (5 000 × g, 10 min, 4°C) vom Medium geerntet und zweimal mit einer 0,85% NaCl-Lösung gewaschen. Die gesammelten Zellen wurden mit einer French-Presse aufgeschlossen und zentrifugiert (10 000 × g, 15 min, 4°C), um unaufgeschlossene Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde ultrazentrifugiert (160 500 × g (40 000 UpM), 90 min, 4°C), um eine wasserlösliche Fraktion zu erhalten, welche in den folgenden Beispielen als Rohenzymprobe verwendet wurde.
Die auf diese Weise erhaltene wasserlösliche Fraktion wurde ferner über Nacht gegen 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert. Die dialysierte Probe wurde an eine Kationen-Chromatographiesäule TSKgel CM-TOYOPEARL 650M (Tosoh Corp.) adsorbiert, die mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert wurde. Diese Säule wurde mit 750 ml eines 10 mM Phosphatpuffers, pH 7,0, gewaschen und dann wurde das Enzym mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0–0,2 M NaCl enthielt, bei einer Flussrate von 5 ml/min eluiert. Fraktionen, die GDH-Aktivität aufwiesen, wurden gesammelt und über Nacht gegen 10 mM MOPS-NaOH-Puffer, pH 7,0, dialysiert. Auf diese Weise wurde ein elektrophoretisch homogenes modifiziertes PQQGDH-Protein erhalten. Dieses wurde in den folgenden Beispielen als gereinigte Enzymprobe verwendet.
Beispiel 5
Test der Enzymaktivität:
Die Enzymaktivität wurde unter Verwendung von PMS (Phenazinmethosulfat)-DCIP (2,6-Dichlorphenolindophenol) in 10 mM MOPS-NaOH-Puffer (pH 7,0) getestet, um mit einem Spektrophotometer Änderungen der Extinktion von DCIP bei 600 nm zu verfolgen, wobei die Umsatzrate des Enzyms als die Rate der Extinktionsabnahme ausgedruckt wurde. Die Enzymaktivität zur Reduktion von 1 μMol DCIP in 1 Minute betrug 1 E. Der molare Extinktionskoeffizient von DCIP bei einem pH-Wert von 7,0 betrug 16,3 mM^–1.
Beispiel 6
Bewertung der Affinität von Rohenzymproben zu Glucose:
Jede der Rohenzymproben der Wildtyp- und modifizierten PQQGDHs, die in Beispiel 4 erhalten wurden, wurde in Anwesenheit von 1 μM PQQ und 1 mM CaCl₂ für die Dauer von 1 Stunde oder mehr in ein Holoenzym überführt. Ein 187 μl-Aliquot wurde mit 3 μl eines Aktivierungsreagens (hergestellt aus 48 μl 6 mM DCIP, 8 μl 600 mM PMS und 16 μl 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) und 10 μl einer D-Glucoselösung in verschiedenen Konzentrationen vereinigt und hinsichtlich der Enzymaktivität bei Raumtemperatur mit Hilfe des in Beispiel 5 gezeigten Verfahrens getestet. Der Km-Wert wurde durch Auftragen der Substratkonzentration gegen die Enzymaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
Der Km-Wert der Wildtyp-PQQGDH für Glucose wurde bisher mit etwa 25 mM angegeben. Im Gegensatz dazu hatten alle hier hergestellten Enzyme, die Mutationen im Glutamat 277 und Ile278Phe trugen, einen Km-Wert für Glucose von weniger als 10 mM. Die Ergebnisse zeigen, dass erfindungsgemäß modifizierte PQQGDHs eine hohe Affinität zu Glucose aufweisen.
Beispiel 7
Bewertung der Affinität von gereinigten Enzymproben zu Glucose:
Jede der in Beispiel 4 erhaltenen gereinigten Proben des Wildtyp-Enzyms und des modifizierten Enzyms Glu277Lys wurde in Anwesenheit von 1 μM PQQ und 1 mM CaCl₂ für die Dauer von einer Stunde oder länger in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 6 in ein Holoenzym überführt. Ein 187 μl-Aliquot wurde mit 3 μl eines Aktivierungsreagens (hergestellt aus 48 μl 6 mM DCIP, 8 μl 600 mM PMS und 16 μl 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) und 10 μl einer D-Glucoselösung in verschiedenen Konzentrationen vereinigt und hinsichtlich der Enzymaktivität bei Raumtemperatur mit Hilfe des in Beispiel 5 gezeigten Verfahrens getestet. Der Km-Wert und V_max wurden durch Auftragen der Substratkonzentration gegen die Enzymaktivität bestimmt. Die Glu277Lys-Variante besaß einen Km-Wert für Glucose von etwa 8,8 mM und einen V_max-Wert von 3668 U/mg. Der Km-Wert der Wildtyp-PQQGDH für Glucose wurde bisher mit etwa 25 mM angegeben, wobei V_max abhängig von den Messbedingungen bei 2500–7000 U/mg liegt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die modifizierte PQQGDH Glu277Lys ein Enzym ist, das eine bemerkenswert verbesserte Affinität zu Glucose und eine hohe Aktivität, vergleichbar mit der der Wildtyp-PQQGDH, aufweist.
Beispiel 8
Bewertung der Substratspezifität:
Rohenzymproben von verschiedenen modifizierten Enzymen wurden hinsichtlich ihrer Substratspezifität getestet. Jede der Rohenzymproben der Wildtyp- und der verschiedenen modifizierten PQQGDHs wurde in Anwesenheit von 1 μM PQQ und 1 mM CaCl₂ für die Dauer von einer Stunde oder länger in ein Holoenzym überführt. Ein 187 μl-Aliquot wurde mit 3 μl eines Aktivierungsreagens (das 6 mM DCIP, 600 mM PMS und 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0 enthält) und einem Substrat vereinigt. Die getesteten Substrate waren 400 mM Glucose, Lactose und Maltose in einer Endkonzentration von 20 mM. Jede Probe wurde mit 10 μl eines jeden Substrats bei Raumtemperatur für die Dauer von 30 Minuten inkubiert und in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 5, hinsichtlich der Enzymaktivität getestet, um die relative Aktivität, ausgedrückt als prozentualer Anteil der Aktivität gegenüber Glucose, zu bestimmen. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, zeigten alle erfindungsgemäßen modifizierten Enzyme eine höhere Selektivität für Glucose als das Wildtyp-Enzym.
Tabelle 4
Beispiel 9
Glucose-Test:
Modifizierte PQQGDHs wurden verwendet, um Glucose zu testen. Jedes der modifizierten Enzyme Glu277Lys und Asn452Thr wurden in Anwesenheit von 1 μM PQQ und 1 mM CaCl₂ für die Dauer von 1 Stunde oder mehr in ein Holoenzym überführt und hinsichtlich ihrer Enzymaktivität in Anwesenheit verschiedener Glucose-Konzentrationen sowie 5 μM PQQ und 10 mM CaCl₂ durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren, welches auf Änderungen der Extinktion von DCIP bei 600 nm beruht, getestet. Wie in 3 gezeigt, kann die modifizierte PQQGDH Asn452Thr verwendet werden, um Glucose im Bereich von 0,1–20 mM zu testen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der modifizierten PQQGDH Glu277Lys erhalten.
Beispiel 10
Herstellung und Bewertung eines Enzym-Sensors:
Von jedem der modifizierten Enzymen Glu277Lys und Asn452 wurden fünf Einheiten mit 20 mg Kohlepaste gefriergetrocknet. Nach sorgfältigem Mischen wurde das Gemisch einzig auf die Oberfläche einer Kohlepaste-Elektrode, die zuvor mit etwa 40 mg Kohlepaste gefüllt und auf einem Filterpapier geglättet wurde, aufgetragen. Diese Elektrode wurde mit 10 mM MOPS-Puffer (pH 7,0), der 1% Glutaraldehyd enthielt, bei Raumtemperatur für die Dauer von 30 Minuten, gefolgt von 10 mM MOPS-Puffer (pH 7,0), der 20 mM Lysin enthielt, bei Raumtemperatur für die Dauer von 20 Minuten behandelt, um das Glutaraldehyd zu blockieren. Die Elektrode wurde mit 10 mM MOPS-Puffer (pH 7,0) bei Raumtemperatur für die Dauer von einer Stunde oder länger äquilibriert und dann bei 4°C aufbewahrt.
Der so hergestellte Enzym-Sensor wurde verwendet, um Glucosemengen zu messen. Der Enzym-Sensor mit einer auf ihm immobilisierten erfindungsgemäßen modifizierte PQQGDH kann verwendet werden, um Glucose im Bereich von 0,1 mM–5 mM zu testen.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Erfindungsgemäße modifizierte PQQGDHs besitzen eine hohe Affinität zu Glucose. Daher wird erwartet, dass Testkits oder Enzym-Sensoren, die mit solchen Enzymen hergestellt wurden, den Vorteil bieten, Glucose in geringeren Mengen mit einer im Vergleich zu den herkömmlichen, natürlichen PQQGDHs außerordentlich verbesserten Sensitivität messen zu können.
Sequenzprotokoll

Claims

Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Glutamat 253 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch einen anderen Aminosäurerest.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Asparagin 428 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch einen anderen Aminosäurerest.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Asparagin 438 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch einen polaren Aminosäurerest.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Isoleucin 254 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Phenylalanin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Asparagin 255 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Histidin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Aspartat 424 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Asparagin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Valin 429 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Phenylalanin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Lysin 431 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Isoleucin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Aspartat 432 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Asparagin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Aspartat 433 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Asparagin.
Modifizierte Glucose-Dehydrogenase mit einem Pyrrolchinolinchinon als Coenzym, wobei Glutamin 430 der SEQ ID NR: 1 ersetzt ist durch Prolin oder Lysin.
PQQ-Glucose-Dehydrogenase, umfassend die Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei Xaa1 einen natürlichen Aminosäurerest außer Asn darstellt;
wobei Xaa5 einen polaren Aminosäurerest außer Asn darstellt; und
PQQ-Glucose-Dehydrogenase, umfassend die Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei Xaa6 einen natürlichen Aminosäurerest außer Glu darstellt; und
Gen, das die modifizierte Glucose-Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 13 codiert.
Vektor, umfassend das Gen nach Anspruch 14.
Transformante, umfassend das Gen nach Anspruch 14.
Transformante nach Anspruch 16, wobei das Gen nach Anspruch 14 in das Hauptchromosom integriert ist.
Glucose-Testkit, umfassend die modifizierte Glucose-Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Glucose-Sensor, umfassend die modifizierte Glucose-Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 13.