DE60029413T2

DE60029413T2 - Enzymatische messung von mycophenolsäure

Info

Publication number: DE60029413T2
Application number: DE60029413T
Authority: DE
Inventors: R. Allan Carmel DORN
Original assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2020-05-12
Also published as: JP2003523730A; ES2267541T3; WO2000075363A3; CA2339821A1; EP1112373B1; EP1112373A2; CA2339821C; WO2000075363A2; DE60029413D1; JP3854864B2; US6107052A; ATE333510T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Messung therapeutischer Arzneistoffe in biologischen Proben. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Messung von Mycophenolsäure in einer biologischen Probe.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Messung von Mycophenolsäure ist von klinischer Signifikanz. Bei der Mycophenolsäure handelt es sich um ein Immunsupressivum, das zur Verhinderung der Abstoßung transplantierter Organe verwendet wird, wobei gesagt wird, daß die Überwachung der Mycophenolsäure die therapeutische Wirksamkeit verbessert und ungünstige Nebenwirkungen des Arzneistoffs minimiert.
Mycophenolsäure wird durch die Fermentation mehrerer Penicillium-Spezies produziert. Sie weist ein breites Spektrum an Aktivitäten sowie einen spezifischen Wirkmodus auf und ist in großen Dosen bei minimalen Nebenwirkungen tolerierbar, Epinette et al, Journal of the American Academy of Dermatology 17 (6): 962–971 (1987). Es konnte gezeigt werden, daß Mycophenolsäure antitumor-, antivirale, antipsoriatrische, immunsuppressive und antiinflammatorische Aktivitäten aufweist, Lee et al., Pharmaceutical Research 7(2): 161–166 (1990), zusammen mit antibakteriellen und Antipilzaktivitäten, Nelson, P.H. et al., Journal of Medicinal Chemistry 33(2): 833–838 (1990). MPA wirkt durch Hemmung von Inosin-5'-monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH), ein Schlüsselenzym in der De-Novo-Synthese von Purinnukleotiden. Da T- und B-Lymphozyten weitgehend von dieser De-Novo-Synthese abhängen, ist Mycophenolsäure in der Lage, die Lymphozytenproliferation, die einen Hauptfaktor der Im munantwort darstellt, zu hemmen.
Inosin-5'-monophosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.205) katalysiert die NAD-abhängige Oxidation von Inosin-5'-monophosphat (IMP) zu Xanthosin-5'-monophosphat (XMP), Magasanik, B. et al., J. Biol Chem. 226: 339–350 (1957) und Jackson et al., Nature 256: 331–333 (1975). Das Enzym folgt dabei einer geordneten Bi-Bi-Reaktionsabfolge von Substrat- und Cofaktorbindung sowie Produktfreisetzung. Zunächst bindet IMP an IMPDH. Anschließend erfolgt die Bindung des Cofaktors NAD. Der reduzierte Cofaktor, NADH, wird dann vom Produkt freigesetzt, worauf das Produkt XMP folgt. Dieser Mechanismus unterscheidet sich von dem der meisten anderen bekannten NAD-abhängigen Dehydrogenasen, bei denen entweder eine zufällige Reihenfolge der Substrataddition erfolgt oder die Bindung von NAD vor der des Substrats erforderlich ist.
Zwei Isoformen menschlicher IMPDH mit der Bezeichnung Typ I bzw. Typ II sind identifiziert und sequenziert worden, Collart et al., J. Biol. Chem. 263: 15769–15772 (1988) und Natsumeda et al., J. Biol. Chem. 265: 5292–5295 (1990). Die Isoformen weisen jeweils 514 Aminosäuren auf und teilen eine Sequenzidentität von 84%. Sowohl IMPDH Typ I als auch Typ II bilden aktive Tetramere in Lösungen, wobei die Untereinheiten Molekulargewichte von jeweils 56 kDa aufweisen, Yamada et al., Biochemistry 27: 2737–2745 (1988).
Der Morpholinoethylester von Mycophenolsäure, E-6-(1,3-Dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-5-isobenzofuranyl)-4-methyl-4-hexensäure (MPA-M), wird in vivo zu Mycophenolsäure hydrolysiert. Die Verabreichung von Mycophenolsäure in Form dieses Esters, auch unter Mycophenolat-mofetil (MMF) bekannt, führt zu einer starken Verbesserung der Bioverfügbarkeit der Mycophenolsäure. MPA-M weist eine Reihe weiterer günstiger pharmazeutischer Eigenschaften auf, einschließlich sei ner Stabilität bei pH 2–5 und seiner guten Löslichkeit bei niedrigem pH, was auf eine schnelle Auflösung im oberen Magen-Darm-Trakt hinweist, Lee, et al., supra.
Bei der Verwendung in der Kombinationstherapie mit Cyclosporin A können MPA-M und Cyclosporin A einen synergistischen Wirkmodus aufweisen. Cyclosporin A hat einen selektiven Effekt auf T-Zellen, unterdrückt jedoch nicht die Antikörperproduktionsaktivität von B-Zellen, während Mycophenolsäure einen antiproliferativen Effekt sowohl auf T- als auch B-Zellen ausübt. Die kombinierte Cyclosporin A/MPA-M-Therapie kann die Überlebenszeit erhöhen und die Verwendung geringerer Dosen Cyclosporin A gestatten, wodurch die mit Cyclosporin A assoziierten Nebenwirkungen, hauptsächlich Nephrotoxizität, verringert würden.
Mycophenolsäure wird durch Konjugation mit Glucoronsäure unter Bildung von Mycophenolsäureglucuronid (MPAG) metabolisiert. Zwei zusätzliche Metabolite der MPA sind bei Schutz, E. et al,. Clinical Chemistry 45(3): 419–422 (1999), beschrieben, und zwar das 7-O-Glucosid der MPA (M-1) und das Acylglucuronid der MPA (M-2). Von Schutz et al. wurde die Hemmung von rekombinanter menschlicher IMPDH-II durch MPA, MPAG, M-1 und M-2 unter Verwendung gereinigter Präparationen der Metabolite gemessen, wobei festgestellt wurde, daß M-2 eine konzentrationsabhängige Hemmung von IMPDH-II ähnlich wie die mit MPA erhaltene zeigt. Allerdings war die Fähigkeit unterschiedlicher Präparationen von M-2 zur Hemmung von IMPDH-II nicht gleichbleibend. Bei dem Metaboliten M-2 handelt es sich wahrscheinlich um ein Isomerengemisch, da bekannt ist, daß Acylglucuronide bei physiologischem pH eine intramolekulare Umlagerung durchmachen. Ebenso können Acylglucuronide zu MPA zurück hydrolysieren. Es ist zu beachten, daß bei einem Isomerengemisch von M-2 alle Isomere gleichermaßen mit einem Antikörper kreuzreagieren, jedoch nicht gleichermaßen bei IMPDH zu hemmen brauchen. Angesichts der Ergebnisse von Schutz braucht es nicht zu überraschen, daß MPA-Messungen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gut mit über HPLC erhaltenen Ergebnissen korrelieren (r = 0,994).
Da es sich bei der Mycophenolsäure um ein potentes biologisch aktives Material handelt, wäre ein effektiver Test zur Überwachung ihrer Bioverfügbarkeit nützlich. Darüber hinaus kann es wichtig sein, therapeutische Arzneistoffspiegel, d.h. für eine angemessene Immunsupression notwendige optimale Arzneistoffspiegel, zu überwachen. Da MPA-M zu Mycophenolsäure hydrolysiert wird, würde ein Test für Mycophenolsäure die Überwachung von MPA-M-Dosierungen gestatten.
Die Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Bestimmung der Konzentration von Mycophenolsäure in menschlichem Plasma ist bei Jones, C.E. et al,. Journal of Chromatography B 708: 229–234 (1998) beschrieben.
Aus Jones et al., J. Chem. Soc. (C) 1725–1737 (1970) sind zahlreiche Transformationen bekannt, die Mycophenolsäure durchläuft, wenn sie mit ausgewählten Mikroorganismen inkubiert wird.
Von Nelson, P.H. et al., US-Patent Nr. 4,753,935 (1988) wird der Morpholinoethylester der Mycophenolsäure, seine pharmazeutischen Verwendungen sowie die nach der Dosierung erfolgende Überwachung der Plasmakonzentration der Mycophenolsäure im Empfänger mittels HPLC beschrieben.
Ein Immuntest für Mycophenolsäure unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen Mycophenolsäure ist bei Alexander, S. et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/02004 (1996) beschrieben.
Spezifitätsprobleme mit dem Immuntest werden bei Tett, S.E. et al., Clinical Chemistry 44(6): A96–A97 (1998) diskutiert. Dabei verglichen die Autoren bei Transplantationspatienten unter Verwendung eines kommerziellen EMIT^®-Immuntests (Behring Diagnostics) erhaltene Ergebnisse mit den mit HPLC-UV erhaltenen Ergebnissen und stellten eine Überschätzung von bis zu 95% bei mittleren Konzentrationen mit dem Immuntest fest.
Die Hemmung von IMPDH durch Mycophenolsäure ist bei Anderson J.H. et al., Journal of Biological Chemistry 243(18): 4762–4768 (1968) beschrieben. Inhibitoren der IMPDH sind auch in den US-Patenten Nr. 5,380,879, 5,444,072 und 5,807,876 sowie in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/01105 und WO 94/12184 beschrieben.
Von Yatscoff, R.W. et al., Clinical Chemistry 44(2): 428–432 (1998) wird über das pharmacodynamische Überwachen von Mycophenolsäure in menschlichem Plasma durch Messen der in den Lymphozyten des Patienten vorhandenen Restniveaus der IMPDH-Aktivität berichtet. Bei diesem Ansatz wird die dem Patienten eigene biologische Reaktion auf den Arzneistoff gemessen. Dabei wird kein Verfahren zur direkten Quantifizierung des Arzneistoffs im Plasma des Patienten bereitgestellt.
Die Klonierung und Expression menschlicher IMPDH in E. coli wurde von Konno Y. et al., J. Biol. Chem 266(1): 506–509 (1991) beschrieben. Von Collart, F.R. et al., US-Patent Nr. 5,665,583 (1997) wird auch die Klonierung und Expression menschlicher IMPDH in E. coli beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der nichtkompetitiven Hemmung des Enzyms Inosin-5'-monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) durch Mycophenolsäure (MPA). Dabei katalysiert IMPDH die folgende Reaktion:
Die Geschwindigkeit der Bildung von NADH (reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) läßt sich durch Verfolgen der Änderung der Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm, d.h. des charakteristischen Absorptionsbereichs von NADH, messen, wobei sich diese Absorptionsänderung dann mit der MPA-Konzentration korrelieren läßt.
Mycophenolsäure bindet an das aktive Zentrum der IMPDH, konkurriert jedoch nicht mit dem Substrat. Einer der Acylglucuronidmetabolite der Mycophenolsäure kann die Reaktion ebenso gut wie Mycophenolsäure hemmen.
In einem Test gemäß der vorliegenden Erfindung wird die obige Reaktion durch in einer Serum- oder Plasmaprobe vorhandene Mycophenolsäure gehemmt, wobei die Messung der Reaktion spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm verfolgt wird. Somit ist die Konzentration von Mycophenolsäure in einer Probe umgekehrt proportional zur Absorption von NADH bei 340 nm.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit zur Ausführung eines Tests zur Bestimmung von Mycophenolsäure, wobei der Kit in abgepackter Kombination eine erste, IMPDH und IMP umfassende Reagenszusammensetzung sowie eine zweite, NAD umfassende Reagenszusammensetzung umfaßt.
Bei dem für die Verwendung bevorzugten IMPDH-Enzym handelt es sich um ein rekombinantes IMPDH-II-Enzym aus menschlichen T-Lymphozyten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In 1 sind die Strukturen von MPA sowie der Glucouronidmetabolite von MPA gezeigt.
In 2 sind die metabolischen Abbauwege für MMF dargestellt. In 2(a) ist der Abbau von MMF zu MPA, MPAG und M1 und in 2(b) der Abbau von MMF zu MPA-, M1- und M2-Metaboliten gezeigt.
Bei 3 handelt es sich um eine graphische Auftragung der Konzentration von Mycophenolsäure gegen die Absorptionsänderung bei 340 nm.
Bei 4 handelt es sich um eine graphische Auftragung des Verfahrensvergleichs von mit Plasmaproben erhaltenen Werten, wobei das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit HPLC als Referenzverfahren verglichen wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die folgenden Definitionen und allgemeinen Parameter sind zur Veranschaulichung und Definition der Bedeutung und des Umfangs der verschiedenen, hier zur Beschreibung der Erfindung verwendeten Begriffe angegeben.
Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält: Eine beliebige Probe, bei der eine relative starke Vermutung besteht, daß sie den Analyten, d.h. Mycophenolsäure oder einen anderen IMPDH-Inhibitor, enthält, läßt sich mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung analysieren. Bei der Probe handelt es sich typischerweise um eine wäßrige Lösung, wie etwa eine Körperflüssigkeit aus einem Wirt, beispielsweise Urin, Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, Samenflüssigkeit, Stuhl, Sputum, Liquor, Tränen, Schleim oder dergleichen, vorzugsweise jedoch um Plasma oder Serum. Die Probe läßt sich gewünschtenfalls vorbehandeln und kann in einem beliebigen zweckmäßigen Medium, das den Test nicht stört, präpariert werden. Dabei ist ein wäßriges Medium bevorzugt.
Messen der Menge an Mycophenolsäure: Quantitative, halbquantitative und qualitative Verfahren ebenso wie alle anderen Verfahren zur Bestimmung von Mycophenolsäure werden als Verfahren zur Messung der Menge an Mycophenolsäure betrachtet. So wird beispielsweise ein Verfahren, das lediglich das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Mycophenolsäure in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Mycophenolsäure enthält, nachweist, als vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt betrachtet. Die Begriffe „nachweisen" und „bestimmen" werden ebenso wie andere allgemeine Synonyme für Messen als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend angesehen.
Die Bestimmung von MPA gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit einem Geschwindigkeitstestverfahren, bei dem die Änderung der Absorption von NADH pro Zeiteinheit gemessen wird, oder mit einem N-Punkt Verfahren, bei dem nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne ein Quenchen der Reaktion erfolgt, ausgeführt werden. Das Verfahren läßt sich leicht auf Analyseautomaten für das Labor oder die klinische Analyse anwenden.
Unter Kalibrierungsmaterial versteht man ein beliebiges Standard- oder Referenzmaterial, das eine bestimmte Menge des zu messenden Analyten enthält. Dabei werden die Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, sowie das Kalibrierungsmaterial unter ähnlichen Bedingungen getestet. Die Analytkonzentration wird dann durch Vergleichen der für die unbekannte Probe erhaltenen Ergebnisse mit für den Standard erhaltenen Ergebnissen berechnet. Dies erfolgt üblicherweise durch Aufstellen einer Kalibrierungskurve, wie etwa in 3.
Hilfsmaterialien: Verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in einem Test im Sinne der vorliegenden Erfindung eingesetzt. So sind beispielsweise normalerweise Puffer im Testmedium ebenso wie Stabilisatoren für das Testmedium und die Testkomponenten vorhanden. Häufig können zusätzlich zu diesen Zusätzen zusätzliche Proteine, wie etwa Albumin, oder Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, oder dergleichen mit enthalten sein.
IMPDH bezieht sich auf das Enzym Inosin-5'-monophosphat-Dehydrogenase, EC 1.1.1.205, das die Bildung von Xanthin-5-monophosphat aus Inosin-5'-monophosphat katalysiert. Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von IMPDH aus natürlichen oder rekombinanten Quellen vor, wobei entweder eine Isoform oder ein Gemisch aus Isoformen verwendet werden kann.
Es versteht sich, daß über die gesamte Beschreibung und die Ansprüche jegliche Bezugnahme auf Mycophenolsäure Mycophenolsäure ebenso wie ihre biologisch aktiven und therapeutisch aktiven Metabolite und Derivate, die sich im biologischen Sinne, d.h. über IMPDH-Hemmung, wie Mycophenolsäure verhalten, abdecken soll.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft zur zweckmäßigen Durchführung der erfindungsgemäßen Testverfahren zur Bestimmung von Mycophenolsäure geeignete Kits. Zur Verbesserung der Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung können bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützliche Reagentien in abgepackter Kombination, und zwar im gleichen oder in getrennten Behältern sowie in flüssiger oder lyophylisierter Form, bereitgestellt werden, so daß das Verhältnis der Reagentien für eine weitgehende Optimierung des Verfahrens und Tests sorgt. Dabei können die Reagentien jeweils in getrennten Behältern vorliegen, oder es können verschiedene Reagentien in einem oder mehreren Behältern je nach Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagentien miteinander kombiniert werden.
Der Kit der vorliegenden Erfindung ist in Anspruch 3 definiert und enthält die Reagentien IMPDH-Enzym, IMP- Substrat und NAD-Substrat sowie ein eine bekannte Menge Mycophenolsäure enthaltendes Kalibrierungsreagens. Die IMPDH, das IMP und das NAD werden allgemein mit einem entsprechenden Puffer und Hilfsmaterialien kombiniert und dann abgepackt. Dabei können die Reagentien in flüssiger Form verbleiben oder lyophylisiert werden.
In den nachfolgenden Beispielen wurden zwei Reagentien hergestellt, wobei das eine IMPDH und das andere NAD enthielt. In den Beispielen wurde IMP mit dem IMPDH-Reagens aufgrund der bekannten Stabilisierungseffekte eines Substrats auf ein Enzym kombiniert; allerdings könnte als Alternative das IMP statt dessen im NAD-Reagens eingebaut werden.
Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden nichtlimitierenden Beispiele erhalten.
BEISPIELE Herstellung des IMPDH-Reagens
100 Milliliter (ml) einer ersten Reagenszusammensetzung wurden wie folgt hergestellt. Ungefähr 80 ml entionisiertes Wasser wurden in einen Behälter gegeben und mit 3,37 g 3-[N-Tris-(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonat, Na (TAPSO) versetzt und vollständig gelöst. Als nächstes wurden 4,91 g Natriumacetat in den Behälter gegeben und gelöst und danach wurde mit 0,037 g Dithiotriethyl (DTT), 0,019 g Inosinmonophosphat (IMP), 0,134 g NA₂EDTA und 0, 10 g SUTTOCIDE A (GAF Chemicals Corp.) versetzt. Der pH wurde mit 0,1 N Salzsäure (HCl) auf einen Wert von 8,0 eingestellt. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt. Schließlich wurden 0,034 Einheiten hochgereinigte rekombinante menschliche IMPDH-II zugegeben und vollständig gelöst.
Die zur Klonierung und Reinigung von IMPDH-II verwendete Vorschrift ist bei Carr, S.F. et al., J. Biological Chemistry 268(36): 27286–27290 (1993) beschrieben, deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die Klonierung von IMPDH wird auch bei Collart, F.R. et al., US-Patent Nr. 5,665,583 (1997) beschrieben. IMPDH aus natürlichen Quellen ist im Handel erhältlich.
Die wirksamen Mengen an Reagenskomponenten variieren je nach den spezifischen Bedürfnissen und können durch einfaches Experimentieren im Labor zur Erfüllung bestimmter Testerfordernisse angepaßt werden.
Herstellung des NAD-Reagens
100 ml einer zweiten Reagenszusammensetzung wurden wie folgt hergestellt. Ungefähr 80 ml entionisiertes Wasser wurden in einen Behälter gefüllt und mit 1,82 g N-[2-Acetamido]-2-aminoethansulfonsäure (ACES) versetzt und vollständig gelöst. Der pH wurde mit 2 N Natriumhydroxid (NaOH) auf einen Wert von 6,0 eingestellt. Anschließend wurde mit 0,166 g Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) und danach mit 0,095 g Natriumazid und 0,1 g SUTTOCIDE A versetzt. Das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt.
Herstellung von Mycophenolsäure-Standards
Mycophenolsäure-Standards wurden aus im Handel erhältlichem Material (Sigma Chemical) hergestellt. Gemäß Dünnschichtchromatographie und HPLC war die MPA ungefähr 98% rein, und die Identiät der MPA stimmte mit der NMR-Struktur überein. Ein Satz von MPA-Standards wurde mit aus mehreren Spendern gesammeltem normalem menschlichen Plasma (Kalium/EDTA) hergestellt. Dabei wurde die MPA ausgewogen und im Plasma-Pool auf Zielkonzentrationen von 0,98 μg/ml, 4,9 μg/ml, 9,8 μg/ml und 14,7 μg/ml gelöst. Diese Standards wurden zur Kalibrie rung des im nachfolgenden Test verwendeten Geräts verwendet.
Test für Mycophenolsäure
Mycophenolsäurebestimmungen wurden unter Verwendung eines HITACHI 717-Analysegeräts vorgenommen (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis). Die primäre verwendete Wellenlänge lag bei 340 nm und die sekundäre Wellenlänge bei 700 nm. Das Analysegerät wurde so programmiert, daß 3 μl Probe in eine in einem Wasserbad bei 37°C inkubierte Küvette abgefüllt wurden. Anschließend wurde die Probe mit 250 μl der IMPDH-II-Reagenszusammensetzung versetzt, und nach dem Mischen ließ man 5 Min. inkubieren, wonach 50 μl der NAD-Reagenszusammensetzung zugegeben und gemischt wurde. Der Unterschied der Absorption bei 340 nm wurde von der ersten Zugabe der zweiten Reagenszusammensetzung bis 5 min nach der Zugabe der zweiten Reagenszusammensetzung berechnet. Die Geschwindigkeit der Absorptionsabnahme bei 340 nm ist umgekehrt proportional zur Mycophenolsäurekonzentration in der Probe. MPA-Konzentrationen werden von dem Gerät berechnet, indem die Geschwindigkeit der Produktion von NADH durch die unbekannte Probe mit der Geschwindigkeit der Produktion von NADH durch die bekannte Mengen an MPA enthaltenden Standards verglichen wird.
Vergleich mit HPLC
Plasmaproben von einer Gruppe von 55 Transplantationspatienten wurden auf Mycophenolsäure unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung (Verfahren Y) getestet. Erhaltene Ergebnisse wurden dann mit Ergebnisse, die beim Testen der Patientenproben auf Mycophenolsäure unter Verwendung von HPLC als Referenzverfahren (Verfahren X) erhalten wurden, verglichen. Die verwendeten Plasmaproben wurden unter Verwendung von EDTA-Antikoagulans gewonnen, und die für Verfahren Y verwendete Vorschrift entsprach der oben beschriebenen. Das verwendete HPLC-Verfahren ist dem Fachmann ebenso gut bekannt (siehe Jones, C.E. et al., Journal of Chromatography B 708: 229–234 (1998) für ein repräsentatives Verfahren.) Mit den beiden Verfahren erhaltene Ergebnisse sind unten aufgeführt, wobei eine vergleichende graphische Darstellung der mit den beiden Verfahren erhaltenen Werte in 2 gezeigt ist. Eine lineare Regressionsanalyse („Least Squares") ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,994 und die folgende Gleichung: Y = 0,957X + 0,515.
Sollte eine erhöhte Testempfindlichkeit erwünscht sein, so könnte ein Fachmann auf dem Gebiet des Immuntests eine Enzymkreisführung zur Amplifikation der primären Enzymreaktion verwenden, wodurch das in der primären Reaktion produzierte NADH als Substrat in einer sekundären Reaktion verwendet wird.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Mycophenolsäure in einer Körperflüssigkeitsprobe, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a. Zusammengeben der Probe, von der vermutet wird, daß sie Mycophenolsäure enthält, mit wirksamen Mengen an IMP, NAD und IMPDH unter für die IMPDH-Aktivität geeigneten Bedingungen, wodurch man ein Reaktionsgemisch erhält b. Verfolgen der Produktion von NADH in dem Reaktionsgemisch mittels Spektrophotometrie und c. Vergleichen der Produktion von NADH mit der Produktion von NADH durch eine eine bekannte Menge an Mycophenolsäure enthaltende Probe, nachdem diese gemäß den Schritten (a) und (b) behandelt wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfolgen der Produktion von NADH unter Verwendung eines Analyseautomaten ausgeführt wird.
Kit zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend in abgepackter Kombination: a. ein erstes Reagens, umfassend wirksame Mengen an IMPDH, IMP sowie einen Puffer, und b. ein zweites Reagens, umfassend wirksame Mengen an NAD sowie einen Puffer, wobei der Kit ferner ein eine bekannte Menge an Mycophenolsäure umfassendes Kalibrierungsreagens umfaßt.