DE60029323T2 - Verfahren zur analyse der dna-methylierung mit hoher durchsatzrate - Google Patents

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Description

  • TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Hoch-Durchsatz- und quantitatives Verfahren zur Bestimmung von Methylierungsmustern in genomischen DNA Proben zur Verfügung. Genauer gesagt, stellt das erfindungsgemäße Verfahren die Behandlung genomischer DNA Proben mit Natriumbisulfit zur Verfügung, um Methylierungs-abhängige Sequenzunterschiede zu erzeugen, gefolgt von Nachweis mit Fluoreszenz-basierten quantitative PCR Techniken.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In eukaryontischen Organismen höherer Ordnung ist die DNA nur an Cytosinen methyliert, die 5' zu Guanosin im CpG Dinukleotid lokalisiert sind. Diese Modifikation hat wichtige regulatorische Effekte auf die Genexpression, hauptsächlich dann, wenn sie CpG reiche Bereiche (CpG Inseln) einschließt, die in der Promotorregion einer Gensequenz lokalisiert sind. Die extensive Methylierung von CpG Inseln wurde mit der transkriptionellen Inaktivierung von ausgewählten „imprinted" Genen und Genen auf dem inaktiven X Chromosom von Weibchen assoziiert. Die aberrante Methylierung von normalerweise unmethylierten CpG Inseln wurde als ein häufiges Ereignis in immortalisierten und transformierten Zellen beschrieben, und wurde häufig mit transkriptioneller Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen in menschlichen Krebserkrankungen assoziiert.
  • DNA-Methylasen transferieren Methylgruppen von einem universellen Methyldonor, wie zum Beispiel S-Adenosylmethionin, zu spezifischen Stellen auf der DNA. Eine biologische Funktion der DNA Methylierung in Bakterien ist der Schutz der DNA vor Verdau durch kognate Restriktionsenzyme. Säugerzellen besitzen Methylasen, die Cytosinreste auf der DNA methylieren, die 5' Nachbarn von Guanin (CpG) sind. Diese Methylierung kann eine Rolle bei der Gen-Inaktivierung, Zelldifferenzierung, Tumorgenese, X-chromosomalen Inaktivierung und genomischem Imprinting spielen. CpG Inseln verbleiben in normalen Zellen unmethyliert, mit der Ausnahme während X-chromosomaler Inaktivierung und parenteral-spezifischem Imprinting, wo die Methylierung von 5'-regulatorischen Regionen zur transkriptionellen Repression führen kann. Die DNA Methylierung ist auch ein Mechanismus zur Ver änderung der Basensequenz der DNA, ohne ihre kodierende Funktion zu verändern. Die DNA Methylierung ist eine vererbbare, reversible und epigenetische Veränderung. Dennoch weist die DNA Methylierung das Potential auf, die Genexpression zu verändern, was grundlegende Entwicklungs- und genetische Konsequenzen hat.
  • Die Methylierungsreaktion schließt das Herausdrehen eines Ziel-Cytosins aus einer intakten Doppelhelix heraus ein, um den Transfer einer Methylgruppe von S-Adenosylmethionin in einer Furche des Enzyms DNA (Cystosin-5)-Methyltransferase zu erlauben (Klimasauskas et al., Cell 76: 357–369, 1994), um so 5-Methylcytosin (5-mCyt) zu bilden. Diese enzymatische Konversion ist die einzige epigenetische Modifikation von DNA, die als in Vertebraten existent bekannt ist und ist für die normale embryonale Entwicklung (Bird, Cell 70: 5–8, 1992; Laird und Jaenisch, Menschlich Mol. Genet. 3: 1487–1495, 1994; und Li et al., Cell 69: 915–926, 1992) essentiell. Die Anwesenheit von 5-mCyt an CpG Dinukleotiden führte zu einer 5-fachen Depletion dieser Sequenz im Genom während der Vertebratenevolution, vermutlich aufgrund spontaner Deaminierung von 5-mCyt zu T (Schoreret et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 957–961, 1992). Diejenigen Bereiche des Genoms, die keine solche Suppression zeigen, werden als "CpG Inseln" bezeichnet (Bird, Nature 321: 209–213, 1986; und Gardiner-Garden et al., J. Mol. Biol. 196: 261–282, 1987). Diese CpG Inselregionen umfassen ungefähr 1% der Vertebratengenome und also stellen auch ungefähr 15% der Gesamtzahl aller CpG Dinukleotide dar (Bird, Nature 321: 209–213, 1986). CpG Inseln sind typischerweise zwischen 0,2 bis ungefähr 1 kb lang und sind stromaufwärts von vielen Housekeeping- und Gewebe-spezifischen Genen lokalisiert, jedoch erstrecken sich viele auch in Gen-kodierende Regionen hinein. Daher, ist es die Methylierung von Cytosinresten innerhalb von CpG Inseln in somatischen Geweben, von der geglaubt wird, dass sie die Genfunktion durch Veränderung der Transkription (Cedar, Cell 53: 3–4, 1988) beeinflusst.
  • Die Methylierung von Cytosinresten, die innerhalb von CpG Inseln von bestimmten Genen vorhanden sind, wurde invers mit der Genaktivität korreliert. Dies könnte zu einer verringerten Genexpression durch eine Vielzahl von Mechanismen führen, einschließlich, zum Beispiel, der Unterbrechung der lokalen Chromatinstruktur, der Inhibierung von Transkriptionsfaktor-DNA Bindung oder durch Rekrutierung von Proteinen, die spezifisch mit methylierten Sequenzen interagieren, und die Transkriptionsfaktor-Bindung indirekt verhindern. Anders gesagt, es gibt mehrere Theorien darüber, wie die Methylierung die mRNA Transkription und Genexpression beeinflusst, jedoch ist der genaue Wirkmechanismus nicht gut verstanden.
  • Einige Untersuchungen haben eine inverse Korrelation zwischen Methylierung von CpG Inseln und der Genexpression gezeigt, jedoch verbleiben die meisten CpG Inseln auf autosomalen Genen in der Keimbahn unmethyliert, und die Methylierung dieser Inseln ist gewöhnlich von der Genexpression unabhängig. Gewebe-spezifische Gene sind gewöhnlich in den rezeptiven Zielorganen unmethyliert, sind jedoch in der Keimbahn und in nicht-exprimierenden adulten Geweben methyliert. CpG Inseln von konstitutiv exprimierten Housekeeping-Genen sind normalerweise in der Keimbahn und in somatischen Geweben unmethyliert.
  • Die abnormale Methylierung von CpG Inseln, die mit Tumorsuppressorgenen assoziiert sind, kann auch die verringerte Genexpression verursachen. Die erhöhte Methylierung solcher Regionen kann zu fortschreitender Verringerung der normalen Genexpression führen, was zu der Selektion einer Population von Zellen führt, die einen selektiven Wachstumsvorteil haben (d.h., eine Malignität).
  • Es wird geglaubt, dass ein verändertes DNA Methylierungsmuster, insbesondere der Methylierung von Cytosinresten, genomische Instabilität verursacht und mutagen ist. Dieses hat vermutlich zu einer 80% Suppression einer CpG Methylakzeptorstelle in eukaryontischen Organismen geführt, die ihre Genome methylieren. Cytosinmethylierung trägt weiter zur Erzeugung von Polymorphismen und Keimbahn-Mutationen und zu Transitions-Mutationen bei, die Tumorsuppressorgene inaktivieren (Jones, Cancer Res. 56: 2463–2467, 1996). Die Methylierung ist auch für die embryonale Entwicklung von Säugern erforderlich (Li et al., Cell 69: 915–926, 1992). Es scheint so, dass die Methylierung of CpG-reichen Promotorregionen die transkriptionelle Aktivität blockieren kann. Ushijima et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 94: 2284–2289, 1997) charakterisierten und klonierten DNA Fragmente, die Methylierungsveränderungen während der Maus-Hepatokarzinogenese zeigten. Daten von einer Gruppe an Untersuchungen von veränderten Methylierungsstellen in Krebszellen zeigen, dass es nicht einfach der Gesamtspiegel an DNA Methylierung ist, der in Krebs verändert ist, sondern Veränderungen in der Verteilung von Methylgruppen.
  • Diese Untersuchungen lassen vermuten, dass die Methylierung at CpG-reichen Sequenzen, als CpG Inseln bekannt, einen alternativen Signalweg für die Inaktivierung von Tumorsuppressoren zur Verfügung stellen kann. Die Methylierung von CpG Oligonukleotiden in den Promotoren von Tumorsuppressorgenen kann zu deren Inaktivierung führen. Andere Untersuchungen stellen Daten zur Verfügung, dass Veränderungen in dem normalen Methylierungspro zess mit genomischer Instabilität (Lengauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2545–2550, 1997) assoziiert sind. Solche abnormalen epigenetischen Veränderungen können in vielen Typen von Krebs gefunden werden und können als potentielle Marker für die onkogene Transformation dienen, unter der Voraussetzung, dass es ein verlässliches Mittel zur schnellen Bestimmung solcher epigenetischer Veränderungen gibt. Daher besteht ein Bedarf im Stand der Technik für ein verlässliches und schnelles (Hoch-Durchsatz) Verfahren zur Bestimmung von Methylierung als der bevorzugten epigenetischen Veränderung.
  • VERFAHREN, UM DNA METHYLIERUNG ZU BESTIMMEN
  • Es gibt eine Auswahl von genomischen Scanning-Verfahren, die verwendet wurden, um veränderte Methylierungsstellen in Krebszellen zu identifizieren. Zum Beispiel schließt ein Verfahren Restriktions-Landmark genomisches Scanning ein (Kawai et al., Mol. Zelle. Biol. 14: 7421–7427, 1994), und ein anderes Beispiel schließt Methylierungs-sensitive zufällig geprimte PCR ein (Gonzalgo et al., Cancer Res. 57: 594–599, 1997). Veränderungen im Methylierungsmuster an spezifischen CpG Stellen wurden durch Verdau von genomischer DNA mit Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen, gefolgt von Southern Analyse der Regionen von Interesse (Verdau-Southern-Verfahren) verfolgt. Das Verdau-Southern-Verfahren ist ein schlüssiges Verfahren, weist jedoch die inhärenten Nachteile auf, das es eine große Menge an DNA hohen Molekulargewichts (mindestens oder mehr als 5 μg) erfordert und einen begrenzten Bereich der Analyse von CpG Stellen (wie festgelegt durch die Anwesenheit von Erkennungsstellen für Methylierungs-sensitive Restriktionsenzyme) aufweist. Ein anderes Verfahren zur Analyse von Veränderungen im Methylierungsmuster schließt ein PCR-basiertes Verfahren ein, das den Verdau von genomischer DNA mit Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzyme vor der PCR Amplifikation einschließt (Singer-Sam et al., Nucl. Acids Res. 18: 687, 1990). Jedoch wurde dieses Verfahren nicht als effektiv gezeigt, aufgrund eines hohen Ausmaßes an falsch positive Signalen (Methylierung vorhanden), aufgrund von ineffizientem Enzymverdau oder Über-Amplifikation in einer anschließenden PCR Reaktion.
  • Das genomische Sequenzieren wurde für eine Analyse des DNA Methylierungsmusters und die 5-Methylcytosin-Verteilung durch die Verwendung von Bisulfit-Behandlung (Frommer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 1827–1831, 1992) vereinfacht. Die Bisulfit-Behandlung von DNA unterscheidet methylierte von unmethylierten Cytosinen, jedoch erfordert das ursprüngliche Bisulfit-genomische Sequenzieren das großflächige Sequenzieren von zahlreichen Plasmid-Klonen, um das gesamte Methylierungsmuster zu bestimmen, was diese Technik daran hindert, für die kommerzielle Bestimmung von Methylierungsmustern in irgend einem Typ eines Routine-diagnostischen Tests brauchbar zu sein.
  • Zusätzlich wurden andere Techniken berichtet, die eine Bisulfit-Behandlung von DNA als ein Ausgangspunkt für die Methylierungsanalyse verwenden. Diese schließen Methylierungs-spezifische PCR (MSP) (Herman et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 9821–9826, 1992); und Restriktionsenzym-Verdau von PCR Produkten, amplifiziert aus Bisulfit-umgewandelter DNA (Sadri und Hornsby, Nucl. Acids Res. 24: 5058–5059, 1996; und Xiong und Laird, Nucl. Acids Res. 25: 2532–2534, 1997) ein.
  • PCR Techniken wurden zum Nachweis von Genmutationen (Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143–1147, 1991) und der Quantifizierung von Allel-spezifischer Expression (Szabo und Mann, Gene Dev. 9: 3097–3108, 1995; und Singer-Sam et al., PCR Methods Appl. 1: 160–163, 1992) entwickelt. Solche Techniken verwenden interne Primer, die an ein PCR-erzeugtes Templat anhybridisieren und unmittelbar 5' des zu untersuchenden einzelnen Nukleotids enden. Jedoch wurde eine Allel-spezifische Expressionstechnik nicht im Zusammenhang mit Testen auf DNA Methylierungsmuster ausprobiert.
  • Die meisten molekularbiologischen Techniken, die verwendet werden, um spezifische Loci, wie zum Beispiel CpG Inseln in komplexer genomischer DNA, zu analysieren, schließen eine Form von Sequenz-spezifischer Amplifikation ein, ob es biologische Amplifikation durch Klonieren in E. coli, direkte Amplifikation durch PCR oder Signalamplifikation durch Hybridisierung mit einer Sonde ist, die sichtbar gemacht werden kann. Da die DNA Methylierung post-replikativ durch eine zugeordnete Maintenance-DNA Methyltransferase hinzugefügt wird, die in entweder E. coli oder in der PCR Reaktion nicht vorliegt, geht solche Methylierungsinformation während des molekularen Klonierens oder der PCR-Amplifikation verloren. Darüber hinaus unterscheidet die molekulare Hybridisierung nicht zwischen methylierter und unmethylierter DNA, da die Methylgruppe auf dem Cytosin nicht an der Basenpaarung teilnimmt. Das Fehlen eines leichten Weges, um die Methylierungsinformation in komplexer genomischer DNA zu amplifizieren, war möglicherweise eine der wichtigsten Behinderungen für die Forschung an DNA Methylierung. Daher besteht ein Bedarf im Stand der Technik, Methylierungs-Nachweistechniken zu verbessern, insbesondere auf eine quantitative Weise.
  • Die indirekten Verfahren für Bestimmungen von DNA Methylierungsmustern an spezifischen Loci, die entwickelt wurden, beruhen auf Techniken, die die genomische DNA vor dem Amplifikationsereignis auf eine Methylierungs-abhängige Weise verändern. Es gibt zwei primäre Verfahren, die verwendet wurden, um diese Methylierungs-abhängigen DNA-Veränderungen zu erreichen. Das erste ist Verdau durch ein Restriktionsenzym, das in seiner Aktivität durch 5-Methylcytosin in einem CpG Sequenzkontext beeinflusst wird. Die Spaltung, oder das Fehlen davon, kann anschließend durch Southern Blotting oder durch PCR aufgeklärt werden. Die andere Technik, die seit kurzem weit verbreitet verwendet wird, ist die Behandlung von genomischer DNA mit Natriumbisulfit. Die Behandlung mit Natriumbisulfit überführt alle unmethylierten Cytosine in der DNA durch Deaminierung in Uracil, lässt jedoch die methylierten Cytosinreste intakt. Anschließende PCR Amplifikation ersetzt die Uracilreste durch Thymin und die 5-Methylcytosinreste durch Cytosine. Der sich ergebende Sequenzunterschied wurde unter der Verwendung von Standard-DNA Sequenznachweis-Techniken, hauptsächlich PCR, ermittelt.
  • Viele DNA Methylierungs-Nachweistechniken verwenden die Bisulfit-Behandlung. Augenblicklich werden alle Bisulfit-Behandlungs-basierten Verfahren von einer PCR Reaktion gefolgt, um spezifisch Loci innerhalb des Genoms zu analysieren. Es gibt zwei prinzipiell unterschiedliche Wege, durch die die durch die Natriumbisulfit-Behandlung erzeugten Sequenzunterschiede ermittelt werden können. Der erste ist es, PCR Primer aufzubauen, die allein an entweder methylierte oder unmethylierte umgewandelte DNA anhybridisieren. Diese Technik wird als "Methylierungs-spezifische PCR" oder "MSP" bezeichnet. Das durch alle anderen Bisulfit-basierten Techniken (wie zum Beispiel Bisulfit genomisches Sequenzieren, COBRA und Ms-SNuPE) verwendete Verfahren ist es, die Bisulfit-umgewandelte DNA unter der Verwendung von Primern zu amplifizieren, die an Orten anhybridisieren, denen die CpG Dinukleotide in der Ausgangs-genomischen Sequenz fehlen. Auf diese Weise können die PCR Primer die Sequenz zwischen den zwei Primern amplifizieren, unabhängig von dem DNA Methylierungsstatus dieser Sequenz in der Ausgangs-genomischen DNA. Dies führt zu einem Pool an verschiedenen PCR-Produkten, alle mit derselben Länge, die sich in ihrer Sequenz nur an den Stellen von potentieller DNA Methylierung an CpGs, die zwischen den zwei Primer lokalisiert sind, unterscheiden. Der Unterschied zwischen diesen Verfahren der Aufarbeitung des Verarbeitens der Bisulfit-umgewandelte Sequenz ist, dass bei MSP die Methylierungsinformation von dem Auftreten oder Fehlen des Auftretens eines PCR Produkts abgeleitet wird, wohingegen in den anderen Techniken immer ein Gemisch von Produkten erzeugt wird, und das Gemisch anschließend analysiert wird, um eine quantitative Information über das relative Auftreten der verschiedenen Methylierungszustände zu geben.
  • MSP ist eine qualitative Technik. Es gibt zwei Gründe dafür, dass sie nicht quantitativ ist. Der erste ist, dass die Methylierungsinformation aus dem Vergleich von zwei getrennten PCR-Reaktionen abgeleitet ist (der methylierten und der unmethylierten Version). Es bestehen inhärente Schwierigkeiten bei der Durchführung kinetischer Vergleiche von zwei verschiedenen PCR-Reaktionen. Das andere Problem mit MSP ist, dass of®als die Primer mehr als ein CpG Dinukleotid abdecken. Die Konsequenz ist, dass multiple Sequenzvarianten erzeugt werden können, in Abhängigkeit von dem DNA Methylierungsmuster in der ursprünglichen genomischen DNA. Wenn zum Beispiel der Vorwärtsprimer ein 24-mer Oligonukleotid ist, das 3 CpGs abdeckt, dann könnten 23 = 8 verschiedene theoretische Sequenzpermutationen in der genomischen DNA im Anschluss an die Bisulfit-Umwandlung innerhalb dieser 24-Nukleotid-Sequenz auftreten. Wenn nur eine vollständig methylierte und eine vollständig unmethylierte Reaktion laufen gelassen wird, untersucht man in Wirklichkeit nur 2 von den 8 möglichen Methylierungszuständen. Die Situation wird weiter verkompliziert, wenn die intermediären Methylierungszustände zu Amplifikation führen, jedoch mit verringerter Effizienz. Daher ist die MSP-Technik nicht quantitativ. Daher besteht ein Bedarf im Stand der Technik, die MSP-Technik zu verbessern und sie so zu verändern, dass sie quantitativer ist und ihr Verfahren für einen höheren Durchsatz anzupassen. Die vorliegende Erfindung adressiert diesen Bedarf für einen schnelleren und quantitativen Methylierungstest.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung und/oder methylierten CpG Inseln innerhalb einer genomischen Sonde von DNA zur Verfügung, umfassend:
    • (a) in Kontakt bringen einer genomischen Sonde an DNA mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen; und
    • (b) Durchführen eines Amplifikations- und Nachweisschrittes, umfassend
    • – Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure mittels Oligonukleotid-Primern in der Anwesenheit von einer oder einer Vielzahl von spezifischen Oligonukleotid-Sonden, wobei die eine oder die Vielzahl der Oligonukleotid-Primer oder der spezifische(n) Sonde(n) in der Lage sind, zwischen unmethylierter und methylierter Nukleinsäure zu unterscheiden, mit der Voraussetzung, dass mindestens eine Oligonukleotid-Sonde eine CpG-spezifische Sonde ist, die in der Lage ist, zwischen unmethylierter und methylierter Nukleinsäure zu unterscheiden; und
    • – Nachweisen der methylierten Nukleinsäure, basierend auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR. Bevorzugterweise ist der Amplifikationsschritt eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) und das modifizierende Mittel ist Bisulfit. Bevorzugterweise enthält die umgewandelte Nukleinsäure Uracil anstelle von unmethylierten Cytosinresten, die in der nicht-modifizierten genomischen Probe an DNA vorliegt. Bevorzugterweise umfasst die Sonde weiterhin eine Fluoreszenzmarker-Gruppe, und der Amplifikations- und Nachweisschritt umfasst Fluoreszenz-basierte quantitative PCR.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer methyliertes CpG-enthaltenden Nukleinsäure zur Verfügung, umfassend:
    • (a) in Kontakt bringen einer Nukleinsäure-enthaltenden Sonde mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen;
    • (b) Durchführen eines Amplifikations- und Nachweisschrittes, umfassend
    • – Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure in der Sonde mittels Oligonukleotid Primern in der Anwesenheit einer CpG-spezifischen Oligonukleotid-Sonde, wobei die CpG-spezifische Sonde, jedoch nicht die Primer, zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheidet; und
    • – Nachweisen der methylierten Nukleinsäure, basierend auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR. Bevorzugterweise umfasst der Amplifikationsschritt eine Polymerase Kettenreaktion (PCR), und das modifizierende Mittel umfasst Bisulfit. Bevorzugterweise enthält die umgewandelte Nukleinsäure Uracil anstelle von unmethylierten Cytosinresten, die in der unmodifizierten Nukleinsäure-enthaltenden Probe vorliegen. Bevorzugterweise, findet das Nachweis Verfahren mittels einer Messung eines Fluoreszenzsignals, basierend auf der Amplifikations-vermittelten Verdrängung der CpG-spezifischen Sonde statt, und das Amplifikations- und Nachweisverfahren umfasst Fluoreszenz-basierte quantitative PCR. Die Methylierungsmengen in der Nukleinsäureprobe werden quantitativ basierend auf dem Bezug auf eine Kontrollreaktion für die Menge an eingesetzter Nukleinsäure bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Nachweis einer methyliertes CpG- enthaltenden Nukleinsäure zur Verfügung, umfassend:
    • (a) in Kontakt bringen einer Nukleinsäure-enthaltenden Sonde mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen;
    • (b) Durchführen eines Amplifikations- und Nachweisschrittes, umfassend
    • – Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure in der Sonde mittels Oligonukleotid-Primern in der Anwesenheit einer CpG-spezifischen Oligonukleotid-Sonde, wobei sowohl die Primer als auch die CpG-spezifische Sonde zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden; und
    • – Nachweisen der methylierten Nukleinsäure, basierend auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR. Bevorzugterweise ist der Amplifikationsschritt eine Polymerase Kettenreaktion (PCR), und das modifizierende Mittel ist Bisulfit. Bevorzugterweise enthält die umgewandelte Nukleinsäure Uracil anstelle von unmethylierten Cytosinresten, die in der unmodifizierten Nukleinsäure-enthaltenden Probe vorliegen. Bevorzugterweise umfasst das Nachweisverfahren die Messung eines Fluoreszenzsignals basierend auf der Amplifikations-vermittelten Verdrängung der CpG-spezifischen Sonde, und das Amplifikations- und Nachweisverfahren umfasst Fluoreszenz-basierte quantitative PCR.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Methylierungs-Nachweiskit zur Verfügung, brauchbar zum Nachweis einer methyliertes CpG-enthaltenden Nukleinsäure, umfassend ein Trägermittel, das unterteilt ist, um darin eng eingeschlossen einen oder mehrere Behälter aufzunehmen, umfassend:
    • (i) ein modifizierendes Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen;
    • (ii) Primer zur Amplifikation der umgewandelten Nukleinsäure;
    • (iii) Primer zur Amplifikation von nicht umgewandelter Kontroll-Nukleinsäure; und
    • (iv) eine CpG-spezifische Sonde, deren Nachweis auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR basiert, wobei die CpG-spezifische Sonde zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheidet; und wobei die Primer jeweils zwischen unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden oder nicht unterscheiden können.
  • Bevorzugterweise umfasst das modifizierende Mittel Bisulfit. Bevorzugterweise überführt das modifizierende Mittel Cytosinreste in Uracilreste. Bevorzugterweise ist die spezifische Oligo nukleotid Sonde eine CpG-spezifische Oligonukleotid Sonde, wobei die Sonde, jedoch nicht der Primer für die Amplifikation der umgewandelten Nukleinsäure, zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheidet. Alternativ ist die spezifische Oligonukleotid Sonde eine CpG-spezifische Oligonukleotid Sonde, wobei sowohl die Sonde und der Primer für die Amplifikation der umgewandelten Nukleinsäure zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden. Bevorzugterweise umfasst die Sonde weiter eine Fluoreszenzgruppe, die direkt oder über eine Linkergruppe an eine Oligonukleotidbase verbunden ist, und die Sonde ist eine spezifische, zweifach-markierte TaqMan Sonde.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt einen Abriss der MSP Technologie (Stand der Technik) unter der Verwendung von PCR Primern, die anfänglich zwischen methylierter und unmethylierter (Bisulfit-umgewandelter) DNA unterscheiden. Der obere Teil zeigt das Ergebnis des MSP-Verfahrens, wenn unmethylierte einzelsträngige genomische DNA anfänglich Natriumbisulfit-Umwandlung (Deaminierung von unmethylierten Cytosinresten in Uracil) unterzogen wird, gefolgt von PCR-Reaktionen mit dem umgewandelten Templat, so dass ein PCR Produkt nur mit Primern auftritt, die spezifisch an umgewandelte (und daher unmethylierte) DNA anhybridisieren. Der untere Teil zeigt das gegenteilige Ergebnis, wenn eine methylierte einzelsträngige genomische DNA Sonde verwendet wird. Wiederum stellt das Verfahren zuerst Bisulfit-Behandlung zur Verfügung, gefolgt von PCR-Reaktionen, so dass ein PCR Produkt nur mit Primern auftritt, die spezifisch an nicht umgewandelte (und daher ursprünglich methylierte) DNA anhybridisieren.
  • 2 zeigt an verändertes Verfahren zur Evaluierung von DNA Methylierung mit Natrium-bisulfit-behandelter genomischer DNA unter der Verwendung von nicht-diskriminatorischen (im Hinblick auf den Methylierungsstatus) vorwärts- und reversen PCR Primern, um einen spezifischen Lokus zu amplifizieren. In dieser Darstellung wird denaturierte (d.h., einzelsträngige) genomische DNA zur Verfügung gestellt, die einen gemischten Methylierungsstatus aufweist, wie typischerweise in einer Probe zur Analyse gefunden würde. Die Probe wird in einer Standard Natriumbisulfit-Reaktion umgewandelt, und die gemischten Produkte werden durch eine PCR Reaktion unter der Verwendung von Primern amplifiziert, die nicht mit irgendeinem CpG Dinukleotide überlappen. Dies produziert einen un-biased (im Hinblick auf den Methylierungszustand) heterogenen Pool von PCR-Produkten. Der gemischte oder hete rogene Pool kann dann durch eine Technik analysiert werden, die in der Lage ist, Sequenzunterschiede nachzuweisen, einschließlich direktes DNA Sequenzieren, Subklonieren von PCR Fragmenten, gefolgt von Sequenzieren von repräsentativen Klonen, Einzelnukleotid-Primerverlängerungsreaktion (MS-SNuPE) oder Restriktionsenzym-Verdau (COBRA).
  • 3A–3D zeigen ein Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens in verschiedenen, jedoch nicht allen, alternativen Ausführungsformen für die PCR Produktanalyse. Variationen in der Nachweismethodologie, wie zum Beispiel die Verwendung von dualer Sondentechnologie (Lightcycler®) oder fluoreszente Primer (Sunrise® Technologie), sind in dieser Figur nicht gezeigt. Genauer gesagt beginnt das erfindungsgemäße Verfahren mit einer gemischten Probe an genomischer DNA die in einer Natriumbisulfit-Reaktion in einen gemischten Pool an Methylierungs-abhängigen Sequenzunterschieden umgewandelt wird, gemäß Standardverfahren (das Bisulfit-Verfahren wandelt unmethylierte Cytosinreste in Uracil um). Dann wird eine Fluoreszenz-basierte PCR entweder in einer "un-biased" PCR-Reaktion mit Primern durchgeführt, die nicht mit bekannten CpG Methylierungsstellen überlappen (linker Arm von 3) oder in einer "biased" Reaktion mit PCR Primern, die mit bekannten CpG Dinukleotiden überlappen (rechter Arm von 3). Die Sequenzunterscheidung kann entweder auf dem Niveau des Amplifikationsverfahren (C und D) oder auf dem Niveau des Fluoreszenz-Nachweisverfahrens (B) oder beiden (D) erfolgen. Ein quantitativer Test auf Methylierungsmuster in der genomischen DNA Sonde wird auf dem linken Arm gezeigt (B), wobei die Sequenzunterscheidung auf dem Niveau der Sondenhybridisierung auftritt. Bei dieser Version stellt die PCR Reaktion eine un-biased Amplifikation in der Anwesenheit einer fluoreszenten Sonde, die eine bestimmte putative Methylierungsstelle überlappt, zur Verfügung. Eine un-biased Kontrolle auf die Menge an eingesetzter DNA wird durch eine Reaktion zur Verfügung gestellt, in der weder der Primer, noch die Sonde irgendwelche CpG Dinukleotide überlagern (A). Alternativ, wie in dem rechten Arm von 3 gezeigt, wird ein qualitativer Test für genomische Methylierung durch Sondieren des biased PCR Pools mit entweder Kontroll-Oligonukleotiden erreicht, die keine bekannten Methylierungsstellen "abdecken" (C; eine Fluoreszenz-basierten Version der MSP Technik, die nicht Teil der Erfindung bildet), oder mit Oligonukleotiden, die potentielle Methylierungsstellen abdecken (D).
  • 4 zeigt eine Flussdiagramm-Übersicht des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei eine "TaqManRT" Sonde bei dem Amplifikationsverfahren verwendet wird. Kurz, wird doppelsträngige genomische DNA mit Natriumbisulfit behandelt und einem von zwei Sets an PCR Reaktionen unter der Verwendung von TaqMan® Sonden unterzogen; nämlich mit entweder biased Primern und TaqMan® Sonde (linke Spalte) oder un-biased Primern und TaqMan® Sonde (rechte Spalte). Die TaqMan® Sonde ist mit einem fluoreszenten "Reporter-" (markiert "R" in 4) und "Quencher-" (markiert mit "O") Molekül dual-markiert und ist so aufgebaut, um für eine Region mit relativ hohem GC Gehalt spezifisch zu sein, so dass sie bei ungefähr 10°C höherer Temperatur in dem PCR Zyklus aufschmilzt, als die vorwärts oder reversen Primer. Dies erlaubt es ihr, während des PCR Anhybridisierungs-/Verlängerungsschritts vollständig hybridisiert zu bleiben. Während die Taq Polymerase enzymatisch einen neuen Strang während der PCR synthetisiert, wird sie gegebenenfalls die anhybridisierte TaqMan® Sonde erreichen. Die Taq Polymerase 5' zu 3' Endonuclease-Aktivität wird dann die TaqMan® Sonde durch Verdau verdrängen, um das fluoreszente Reportermolekül für den quantitativen Nachweis seines nun ungeminderten Signal unter der Verwendung eines Echtzeit fluoreszenten Systems, wie hier beschrieben, freizusetzen.
  • 5A–5B zeigen einen Vergleich des erfindungsgemäßen Tests mit einem herkömmlichen COBRA Test. 5A (Panel A) zeigt ein COBRA Gel, das verwendet wird, um das Niveau an DNA Methylierung an dem ESR1 Lokus in DNAs mit bekanntem Methylierungsstatus (Sperma, unmethyliert) und HCT116 (methyliert) zu bestimmen. Die relativen Mengen der gespaltenen Produkte werden unterhalb des Gels angezeigt. Ein 56-bp Fragment stellt DNA Moleküle dar, in denen die TaqI Stelle proximal zu der Hybridisierungssonde in der genomischen Ausgangs-DNA methyliert ist. Das 86-bp Fragment stellt DNA Moleküle dar, in denen die proximale TaqI Stelle unmethyliert ist und die distale Stelle methyliert ist. 5B (Panel B) fasst die COBRA Ergebnisse zusammen und vergleicht diese mit Ergebnissen, die mit der methylierten und unmethylierten Version des erfindungsgemäßen Testverfahrens erhalten wurden. Die Ergebnisse sind als Verhältnisse zwischen den Methylierung-spezifischen Reaktionen und einer Kontrollreaktion angegeben. Für die Bisulfit-behandelten Sonden war die Kontrollreaktion ein MYOD1 Test, wie in Beispiel 1 beschrieben. Für die unbehandelten Sonden, wurden die ACTB Primer wie beschrieben für die RT-PCR Reaktionen als eine Kontrolle verwendet, um den Einsatz von nicht-umgewandelten DNA Sonden zu verifizieren. (Der ACTB Primeren überspannen kein Intron). "Keine PCR" zeigt an, dass kein PCR Produkt mit nicht-umgewandelter genomischer DNA mit COBRA Primern erhalten wurde, die so aufgebaut waren, um Bisulfit-umgewandelte DNA Sequenzen zu amplifizieren.
  • 6A–6C verdeutlichen eine Bestimmung der Spezifität der Oligonukleotide. Acht ver schiedene Kombinationen an vorwärts-Primer, Sonde und reversem Primer wurden an DNA Sonden mit bekannter Methylierung oder Fehlen der Methylierung an dem ESR1 Lokus getestet. 6A (Panel A) zeigt die Nomenklatur, die für die Kombinationen der ESR1 Oligos verwendet wurde. "U" bezeichnet die Oligosequenz die an Bisulfit-umgewandelte unmethylierte DNA anhybridisiert, während "M" die methylierte Version bezeichnet. Position 1 gibt den vorwärts PCR Primer, Position 2 die Sonde und Position 3 den reversen Primer an. Die für die acht Reaktionen verwendeten Kombinationen sind unterhalb jedes Paares an Balken angegeben und stellen zweifache Experimente dar. Die Ergebnisse sind als Verhältnisse zwischen den ESR1 Werten und den MYOD1 Kontrollwerten angegeben. 6B (Panel B) stellt eine Analyse von menschlicher Sperma-DNA dar. 6C (Panel C) stellt eine Analyse von DNA dar, die aus der menschlichen colorektalen Krebszelline HCT116 erhalten wurde.
  • 7 zeigt einen Test der Reproduzierbarkeit der Reaktionen. Tests wurden in acht unabhängigen Reaktionen durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit mit Proben von komplexem Ursprung zu bestimmen. Für diesen Zweck wurden eine primäre menschliche colorektale Adenokarzinom- und gepaarte normale Mucosa verwendet (Sonden 10N und 10T, gezeigt in 8). Die in dieser Figur gezeigten Ergebnisse stellen die in diesem Test erhaltenen Rohwerte dar. Die Werte wurden Platten-normalisiert, jedoch nicht auf eingesetzte DNA korrigiert. Die Balken zeigen die Mittelwerte an, die für die acht separaten Reaktionen erhalten wurden. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittels dar.
  • 8 verdeutlicht einen Vergleich an MLH1 Expression, Mikrosatelliten Instabilität und MLH1 Promotor-Methylierung von 25 passend-gepaarten menschlichen colorektalen Proben. Das obere Diagramm zeigt die MLH1 Expressionsspiegel, wie durch quantitative, Echtzeit RT-PCR (TaqMan® in gepaarten normalen (schraffierte Balken) und Tumor (schwarze Balken) colorektalen Proben gemessen. Die Expressionsspiegel sind als ein Verhältnis zwischen MLH1 und ACTB Messungen angegeben. Der Mikrosatelliten Instabilitätsstatus (MSI) wird durch die Kreise, die zwischen den zwei Diagrammen lokalisiert sind, angezeigt. Ein schwarzer Kreis gibt MSI Positivität an, während ein offener Kreis anzeigt, dass die Sonde MSI negativ ist, wie durch die Analyse der BAT25 und BAT26 Loci bestimmt. Das untere Diagramm zeigt den Methylierungsstatus des MLH1 Locus, wie durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bestimmt. Die Methylierungsspiegel sind als das Verhältnis zwischen der MLH1 methylierten Reaktion und der MYOD1 Reaktion angegeben.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles, sensitives, reproduzierbares Hochdurchsatz-Verfahren zum Nachweis von Methylierungsmustern in Proben von Nukleinsäure zur Verfügung. Die Erfindung stellt die Methylierungs-abhängige Modifikation der Nukleinsäure zur Verfügung und verwendet dann Verfahren an Nukleinsäureamplifikation, -Nachweis oder beides, um zwischen methylierten und unmethylierten Resten zu unterscheiden, die in der Ausgangsprobe an Nukleinsäure vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Bestimmung des Methylierungsstatus von CpG Inseln innerhalb von Proben an genomischer DNA zur Verfügung.
  • Im Unterschied zu vorhergehenden Verfahren zur Bestimmung von Methylierungsmustern, ist der Nachweis der methylierten Nukleinsäure relativ schnell und basiert auf der Amplifikations-vermittelten Verdrängung von spezifischen Oligonukleotidsonden. In einer bevorzugten Ausführungsform treten die Amplifikation und der Nachweis in der Tat gleichzeitig auf, wie durch Fluoreszenz-basierte Echtzeit quantitative PCR („RT-PCR") unter der Verwendung von spezifischen, zweifach-markierten TaqMan® Oligonukleotid-Sonden gemessen. Die verdrängbaren Sonden können spezifisch aufgebaut sein, um zwischen methylierten und unmethylierten CpG Stellen zu unterscheiden, die in der anfänglichen unmodifizierten Nukleinsäureprobe vorliegen.
  • Wie die Technik von Methylierung-spezifischer PCR („MSP"; U.S. Pat. Nr. 5,786,146), stellt die vorliegende Erfindung signifikante Vorteile gegenüber früheren PCR-basierten und anderen Verfahren (z.B., Southern Analyse), die zur Bestimmung von Methylierungsmustern verwendet wurden, zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung ist wesentlich sensitiver als die Southern Analyse und erleichtert den Nachweis einer geringen Zahl (Prozentsatz) von methylierten Allelen in sehr kleinen Nukleinsäureproben, sowie Paraffin-eingebettete Proben. Darüber hinaus ist im Fall von genomischer DNA die Analyse nicht auf DNA Sequenzen begrenzt, die von Methylierungs-sensitiven Restriktionsendonukleasen erkannt werden, was daher eine feine Kartierung von Methylierungsmustern über breitere CpG-reiche Regionen ermöglicht. Die vorliegende Erfindung beseitigt auch jegliche falsch-positive Ergebnisse aufgrund von unvollständigem Verdau durch Methylierungs-sensitive Restriktionsenzyme, die früheren PCR-basierten Methylierungsverfahren inhärent sind.
  • Die vorliegende Erfindung biete auch signifikante Vorteile gegenüber der MSP Technologie. Sie kann als ein quantitatives Verfahren zur Messung von Methylierungsmengen angewendet werden und ist wesentlich schneller. Ein wichtiger Fortschritt gegenüber der MSP Technologie ist, dass die Gelelektrophorese nicht nur ein zeitaufwendige manuelle Maßnahme ist, welche die Hoch-Durchsatz Möglichkeiten begrenzt, sondern dass die Manipulation und Öffnung der PCR Reaktionsgefäße die Chance an Proben Miss-Identifizierung erhöht und sie die Chance an Kontamination von zukünftigen PCR Reaktionen mit Spuren PCR Produkten drastisch erhöht. Das Standardverfahren zur Vermeidung von PCR Kontamination durch Uracil-Einbau und die Verwendung von Uracil DNA Glycosylase (AmpErase) ist mit der Bisulfit-Technologie aufgrund der Anwesenheit von Uracil in Bisulfit-behandelter DNA inkompatibel. Daher ist die Vermeidung an PCR Produkt Kontamination in einer Hoch-Durchsatz Anwendung mit Bisulfit-behandelter DNA eine größere technische Herausforderung, als für die Amplifikation von unmodifizierter DNA. Die vorliegende Erfindung erfordert keinerlei post-PCR Manipulation oder Verarbeitung. Dies verringert nicht nur erheblich die Menge an Aufwand, der für die Analyse an Bisulfit-behandelter DNA erforderlich ist, sondern stellt auch ein Mittel zur Verfügung, die Handhabung von PCR Produkten zu vermeiden, die zukünftige Reaktionen kontaminieren könnten.
  • Zwei Faktoren beschränken MSP auf, zumindest, semi-quantitative Anwendungen. Zuerst ist die MSP Methylierungsinformation aus dem Vergleich von zwei separaten PCR Reaktionen (der methylierten und der unmethylierten Version) abgeleitet. Es bestehen inhärente Schwierigkeiten bei der Durchführung kinetischer Vergleiche von zwei verschiedenen PCR Reaktionen ohne ein hoch quantitatives Verfahren der Nachverfolgung der Amplifikationsreaktion, wie zum Beispiel Echtzeit quantitativer PCR. Das andere Problem hängt mit der Tatsache zusammen, dass die MSP Amplifikation mittels besonderer CpG-spezifischer Oligonukleotide zur Verfügung gestellt wird; das heißt, durch biased Primer. Oft enthält die durch solche Primer abgedeckte DNA Sequenz mehr als ein CpG Dinukleotid, mit der Konsequenz, dass die amplifizierte Sequenz nur eine von zahlreichen potentiell vorliegenden Sequenzvarianten, in Abhängigkeit von dem DNA Methylierungsmuster in der anfänglichen genomischen DNA, darstellen wird. Zum Beispiel, wenn der vorwärts Primer ein 24-mer Oligonukleotid ist, das 3 CpGs abdeckt, dann könnten 23 = 8 verschiedene theoretische Sequenz-Permutationen in der genomischen DNA im Anschluss an die Bisufit-Umwandlung innerhalb dieser 24-Nukleotid Sequenz auftreten. Wenn nur eine vollständig methylierte und eine vollständig unmethylierte Reaktion durchgeführt wird, dann werden nur 2 von den 8 möglichen Methylierungszustän den analysiert.
  • Diese Situation wird weiter verkompliziert, wenn die Zwischen-Methylierungszustände durch die vollständig methylierten oder vollständig unmethylierten Primer unspezifisch amplifiziert werden. Demzufolge beschreibt das MSP Patent ausdrücklich eine nicht-quantitative Technik, basierend auf dem Auftreten oder nicht-Auftreten eines PCR Produkts in der vollständig methylierten gegenüber der vollständig unmethylierten Reaktion, im Gegensatz zu einem Vergleich der Kinetiken der zwei Reaktionen.
  • Im Gegensatz dazu stellt eine Ausführungsform der vorliegende Erfindung die un-biased Amplifikation aller möglichen Methylierungszustände unter der Verwendung von Primern zur Verfügung, die keinerlei CpG Sequenzen in der anfänglichen, unmodifizierten DNA Sequenz überdecken. In dem Ausmaß, in dem alle Methylierungsmuster gleich amplifiziert werden, kann dann eine quantitative Information über DNA Methylierungsmuster aus dem sich ergebenden PCR Pool durch jede Technik, die in der Lage ist, Sequenzunterschiede nachzuweisen (z.B. durch Fluoreszenz-basierte PCR), extrahiert werden.
  • Weiterhin ist die vorliegende Erfindung wesentlich schneller als MSP. Wie oben angegeben, beruht MSP auf dem Auftreten oder nicht-Auftreten eines PCR Produkts in der methylierten gegenüber der unmethylierten Reaktion, um den Methylierungsstatus einer CpG Sequenz zu bestimmen, die durch einen Primer abgedeckt wird. Dieses erfordert mindestens die Durchführung von Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse (siehe U.S. Pat. Nr. 5,786,146, 2A–2E und 3A–3E). Darüber hinaus würde die Bestimmung des Methylierungsstatus aller CpG Stellen innerhalb einer gegebenen MSP amplifizierten Region zusätzliche Analysen erfordern, wie zum Beispiel: (a) Restriktionsendonuclease-Analyse entweder vor oder nach (z.B., COBRA Analyse; Xiong und Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532–2534, 1997) Nukleinsäure-Modifikation und -Amplifikation, unter der Voraussetzung, dass entweder die unmodifizierte Sequenzregion von Interesse Methylierungs-sensitive Stellen enthält, oder dass die Modifikation (z.B., Bisulfit) zur Erzeugung oder der Zerstörung von Restriktionsstellen führt; (b) Einzel-Nukleotid Primerverlängerungsreaktionen (Ms-SNuPE; Gonzalgo und Jones, Nucleic Acids Res 25: 2529–2531, 1997) oder (c) DNA Sequenzierung des Amplifikationsprodukts. Solche zusätzlichen Analysen sind nicht nur fehleranfällig (unvollständiger Restriktionsenzymverdau) sondern fügen auch wesentliche Zeit und Ausgaben zu dem Verfahren der Bestimmung des CpG Methylierungsstatus von, zum Beispiel, Proben an genomi scher DNA, hinzu.
  • Im Gegensatz dazu, in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, finden die Amplifikation und Nachweis gleichzeitig statt, wie durch Fluoreszenz-basierte Echtzeit quantitative PCR unter der Verwendung spezifischer, zweifach-markierter Oligonukleotidsonden gemessen. Im Prinzip kann der Methylierungsstatus an jeder Sonden-spezifischer Sequenz innerhalb an amplifizierten Region zusammen mit der Amplifikation bestimmt werden, ohne das Erfordernis einer anschließenden Manipulation oder Analyse.
  • Wie durch die MSP Erfinder offenbart, ist "[d]ie einzige Technik, die eine direktere Analyse als MSP für die meisten CpG Stellen innerhalb einer definierten Region zur Verfügung stellen kann, genomisches Sequenzieren." (U.S. Pat. Nr. 5,786,146 bei 5, Zeile 15–17). Die vorliegende Erfindung stellt in der Tat ein Verfahren für die teilweise direkte Sequenzierung von modifizierten CpG Stellen innerhalb einer bekannten (vorher sequenzierten) Region an genomischer DNA zur Verfügung. Daher wird eine Reihe von CpG-spezifischen TaqMan® Sonden konstruiert, die jede einer bestimmten Methylierungsstelle in einer gegebenen amplifizierten DNA Region entsprechen. Diese Reihe von Sonden wird dann in parallelen Amplifikationsreaktionen unter der Verwendung von Aliquots einer einzelnen modifizierten DNA Probe verwendet, um gleichzeitig das vollständige Methylierungsmuster zu bestimmen, das in der anfänglichen unmodifizierten Probe an genomischer DNA vorliegt. Dies wird mit einem Bruchteil der Zeit und den Ausgaben erreicht, die für die direkte Sequenzierung der Probe an genomischer DNA erforderlich sind und ist wesentlich sensitiver. Darüber hinaus stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine quantitative Ermittlung solch eines Methylierungssmusters zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahrenstechniken und damit assoziierte diagnostische Kits, die ein Methylierungs-abhängiges Nukleinsäure modifizierendes Mittel (z.B., Bisulfit) verwenden, um den CpG Methylierungsstatus in Nukleinsäuresonden (z.B., genomischer DNA Sonden) sowohl qualitativ als auch quantitativ zu bestimmen. Die vier Verfahren sind in 3 dargestellt und unterhalb mit den Buchstaben A bis D markiert. Insgesamt ist es für die methylierte-CpG Sequenzunterscheidung so vorgesehen, dass sie auf dem Niveau von Amplifikation, Sondenhybridisierung oder auf beiden Niveaus stattfindet. Zum Beispiel verwenden Anwendungen C und D "biased" Primer, die zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden und eine methylierte-CpG Sequenzunterschei dung auf dem PCR Amplifikationsniveau zur Verfügung stellen. Verfahren B verwendet "un-biased" Primer (die keine CpG Methylierungsstellen abdecken), um eine un-biased Amplifikation von modifizierter Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen, verwendet jedoch Sonden, die zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden, um quantitative methylierte-CpG Sequenzunterscheidung auf dem Nachweisniveau (z.B., nur auf dem fluoreszente (oder lumineszente) Sonden-Hybridisierungniveau) zur Verfügung zu stellen. Verfahren A selber stellt keine methylierte-CpG Sequenzunterscheidung auf entweder dem Amplifikations- oder Nachweisniveau zur Verfügung, sondern unterstützt und validiert die anderen drei Anwendungen durch ein zur Verfügung stellen von Kontrollreaktionen für die eingesetzte DNA.
  • Verfahren D. In einer ersten Ausführungsform (3, Anwendung D), stellt die Erfindung ein Verfahren zum qualitativen Nachweis einer methyliertes CpG-enthaltenden Nukleinsäure zur Verfügung, wobei das Verfahren einschließt: in Kontakt bringen einer Nukleinsäure-enthaltenden Sonde mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen; Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure mittels zwei Oligonukleotid-Primern in der Anwesenheit einer spezifischen Oligonukleotid-Hybridisierungssonde, wobei sowohl die Primer und Sonde zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden; und Nachweisen der "methylierten" Nukleinsäure, basierend auf der Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung.
  • Der Ausdruck "modifiziert", wie hier verwendet, bedeutet die Umwandlung eines unmethylierten Cytosins in ein anderes Nukleotid durch das modifizierende Mittel, wobei die Umwandlung unmethyliertes von methyliertem Cytosin in der anfänglichen Nukleinsäureprobe unterscheidet. Bevorzugt modifiziert das Mittel unmethyliertes Cytosin zu Uracil. Bevorzugt ist das für die Modifizierung von unmethyliertem Cytosin verwendete Mittel Natriumbisulfit, jedoch, können andere äquivalent modifizierende Mittel, die selektiv unmethyliertes Cytosin, jedoch nicht methyliertes Cytosin modifizieren, in dem Verfahren der Erfindung als Substituenten eingesetzt werden. Natrium-Bisulfit reagiert leicht mit der 5,6-Doppelbindung von Cytosin, jedoch nicht mit methyliertem Cytosin, um ein sulfoniertes Cytosin-Zwischenprodukt herzustellen, das einer Deaminierung unter alkalischen Bedingungen unterzogen wird, um Uracil herzustellen (Beispiel 1). Da die Taq Polymerase Uracil als Thymin erkennt und 5-Methylcytidin (m5C) als Cytidin, führt die sequentielle Kombination von Na trium Bisulfit-Behandlung und PCR Amplifikation zu der letztendlichen Umwandlung von unmethylierten Cytosinresten in Thymin (C -> U -> T) und von methylierten Cytosinresten ("mC") zu Cytosin (mC -> mC -> C). Daher erzeugt die Natrium-Bisulfit-Behandlung von genomischer DNA Methylierungs-abhängige Sequenzunterschiede durch Umwandlung von unmethylierten Cytosinen in Uracil, und nach PCR enthält das sich ergebende Produkt Cytosin nur an Positionen, wo methyliertes Cytosin in der unmodifizierten Nukleinsäure auftritt.
  • Oligonukleotid "Primer", wie hier verwendet, bedeutet lineare, einzelsträngige, oligomere Desoxyribonuklein- oder Ribonukleinsäuremoleküle, die in der Lage sind, Sequenz-spezifisch mit komplementären Strängen von modifizierter oder unmodifizierter Nukleinsäure zu hybridisieren (anzuhybridisieren). Wie hier verwendet, sind die spezifischen Primer bevorzugterweise DNA. Die Primer der Erfindung umfassen Oligonukleotide von geeigneter Sequenz und ausreichender Länge, um so eine spezifische und effiziente Initiation der Polymerisation (Primerverlängerung) während des Amplifikationsverfahrens zur Verfügung zu stellen. Wie in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, enthalten Oligonukleotid Primer typischerweise 12–30 Nukleotide oder mehr, obwohl sie weniger Nukleotide enthalten können. Bevorzugt enthalten die Primer von 18–30 Nukleotide. Die genaue Länge wird von zahlreichen Faktoren, einschließlich Temperatur (während der Amplifikation), Puffer und Nukleotidzusammensetzung abhängen. Bevorzugt sind die Primer einzelsträngig, obwohl doppelsträngige verwendet werden können, wenn die Stränge zuerst getrennt werden. Die Primer können unter der Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie zum Beispiel herkömmlicher Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierten Ausführungsformen, die herkömmlich im Stand der Technik bekannt sind.
  • Wie in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen hier verwendet, werden die spezifischen Primer bevorzugterweise so aufgebaut, das sie im wesentlichen komplementär zu jedem Strang des genomischen Lokus von Interesse sind. Typischerweise ist ein Primer komplementär zu dem negativen (–) Strang des Lokus (dem "unteren" Strang eines horizontal angeordneten doppelsträngigen DNA Moleküls) und der andere ist komplementär zu dem positiven (+) Strang ("oberen" Strang). Wie in der Ausführungsform von Anwendung D verwendet, sind die Primer bevorzugterweise so aufgebaut, dass sie potentielle Stellen an DNA Methylierung (CpG Nukleotide) überlappen und spezifisch modifizierte unmethylierte von methylierter DNA unterscheiden. Bevorzugt basiert diese Sequenzunterscheidung auf den verschiedenen Anhybridisierungs-Temperaturen von perfekt passenden gegenüber fehlgepaarten Oligo nukleotiden. In der Ausführungsform der Anwendung D sind die Primer typischerweise so aufgebaut, dass sie von einer bis mehrere CpG Sequenzen überlappen. Bevorzugt sind sie so aufgebaut, dass sie von 1 bis 5 CpG Sequenzen und am meisten bevorzugt von 1 bis 4 CpG Sequenzen überlappen. Im Gegensatz dazu überlappen die Primer in einer quantitativen Ausführungsform der Erfindung mit keinerlei CpG Sequenzen.
  • Im Fall der vollständig "unmethylierten" (komplementär zu den modifizierten unmethylierten Nukleinsäuresträngen) Primersets, enthalten die anti-Sinn Primer Adenosinreste ("As") anstelle von Guanosinresten ("Gs") in der entsprechenden (–) Strang-Sequenz. Diese substituierten As in dem anti-Sinn Primer werden zu den Uracil- und Thymidinresten ("Us" und "Ts") in der entsprechenden (+) Strangregion komplementär sein, die sich aus der Bisulfit-Modifikation von unmethylierten C-Resten ("Cs") und anschließender Amplifikation ergeben. Der Sinn-Primer wird in diesem Fall bevorzugterweise so aufgebaut, um zu den anti-Sinn Primer-Verlängerungs-Produkten komplementär zu sein, und Ts anstelle von unmethylierten Cs in der entsprechenden (+) Strang-Sequenz enthalten. Diese substituierten Ts in dem Sinn-Primer werden zu den As komplementär sein, die in den anti-Sinn Primer-Verlängerungs-Produkten an Positionen eingebaut sind, die komplementär zu modifizierten Cs (Us) in dem anfänglichen (+) Strang sind.
  • Im Fall des vollständig methylierten Primers (komplementär zu methylierten CpG-enthaltenden Nukleinsäuresträngen) wird der anti-Sinn Primer keine As anstelle von Gs in der entsprechenden (–) Strang-Sequenz enthalten, die komplementär zu methylierten Cs (d.h., mCpG Sequenzen) in dem anfänglichen (+) Strang sind. Ähnlich wird der Sinn Primer in diesem Fall keine Ts anstelle von methylierten Cs in den entsprechenden (+) Strang-mCpG Sequenzen enthalten. Jedoch werden Cs, die nicht in CpG Sequenzen in Regionen vorhanden sind, die durch die vollständig methylierten Primer abgedeckt werden, und nicht methyliert sind, durch das vollständig methylierte Primerset dargestellt werden, wie oben für unmethylierte Primer beschrieben.
  • Bevorzugt, wie in der Ausführungsform von Anwendung D verwendet, stellt das Amplifikationsverfahren ein Amplifizieren von Bisulfit-umgewandelter Nukleinsäure mittels zweier Oligonukleotid Primer in der Anwesenheit einer spezifischen Oligonukleotid-Hybridisierungssonde zur Verfügung. Beide der Primer und der Sonde unterscheiden zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure. Darüber hinaus basiert das Nachweisen der "methylierten" Nukleinsäure auf Amplifikations-vermittelter Sonden-Fluoreszenz. In einer Ausführungsform wird die Fluoreszenz durch Sondenabbau durch die 5' zu 3' Exonukleaseaktivität des Polymeraseenzyms erzeugt. In einer anderen Ausführungsform wird die Fluoreszenz durch Fluoreszenz-Energietransfereffekte zwischen zwei angrenzenden hybridisierenden Sonden (Lightcycler® Technologie) oder zwischen einer hybridisierenden Sonde und einem Primer erzeugt. In einer anderen Ausführungsform wird die Fluoreszenz durch den Primer selber (Sunrise® Technologie) erzeugt. Bevorzugt ist das Amplifikationsverfahren eine enzymatische Kettenreaktion, die den Oligonukleotid Primer verwendet, um exponentielle Mengen an Amplifikationsprodukt von einem Ziellokus relativ zu der Zahl an beteiligten Reaktionsschritten herzustellen.
  • Wie oben beschrieben, ist ein Mitglied eines Primersets komplementär zu dem (–) Strang, während das andere komplementär zu dem (+) Strang ist. Die Primer werden so ausgewählt, dass sie den Bereich von Interesse umgrenzen, der amplifiziert werden soll; das heißt, das "Amplicon". Die Hybridisierung der Primer an denaturierte Ziel-Nukleinsäure, gefolgt von Primerverlängerung mit einer DNA Polymerase und Nukleotiden, führt zur Synthese von neuen Nukleinsäuresträngen, die dem Amplicon entsprechen. Bevorzugt ist die DNA Polymerase Taq-Polymerase, wie herkömmlich im Stand der Technik verwendet, obwohl äquivalente Polymerasen mit einer 5' zu 3' Nukleaseaktivität ersatzweise verwendet werden können. Da die neuen Amplicon-Sequenzen auch Template für die Primer und Polymerase sind, führen wiederholte Zyklen an Denaturieren, Primeranhybridisierung und Verlängerung zur exponentiellen Produktion des Amplicons. Das Produkt der Kettenreaktion ist eine diskrete Nukleinsäureduplex, die der Amplicon-Sequenz entspricht, mit Termini, die durch die Enden der spezifischen verwendeten Primer definiert sind. Bevorzugterweise ist das verwendete Amplifikationsverfahren das von PCR (Mullis et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol 51: 263–273; Gibbs, Anal. Chem. 62: 1202–1214, 1990) oder, weiter bevorzugt, automatisierte Ausführungsformen davon, die herkömmlich im Stand der Technik bekannt sind.
  • Bevorzugt werden die Methylierungs-abhängigen Sequenzunterschiede durch Verfahren basierend auf Fluoreszenz-basierter quantitativer PCR (Echtzeit quantitativer PCR, Heid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996; Gibson et al., Genome Res. 6: 995–1001, 1996) (z.B., "TaqMan®," "Lightcycler®," und "Sunrise®" Technologien) nachgewiesen. Für die TaqMan® und Lightcycler® Technologien kann die Sequenzunterscheidung an einem oder beiden von zwei Schritten auftreten: (1) dem Amplifikationsschritt oder (2) dem Fluoreszenz-Nachweisschritt.
  • Im Fall der "Sunrise®" Technologie sind die Amplifikation- und Fluoreszenzschritte die selben. Im Fall der FRET Hybridisierung können als Sondenformate auf dem Lightcycler® eine oder beide der FRET Oligonukleotide verwendet werden, um die Sequenzunterschiede zu unterscheiden. Das am meisten bevorzugte Amplifikationsverfahren, wie in allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen hier verwendet, ist das von Fluoreszenz-basierter Echtzeit quantitativer PCR (Heid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996) wobei eine zweifach-markierte fluoreszente Oligonukleotidsonde verwendet wird (TaqMan® PCR, unter der Verwendung eines ABI Prism 7700 Sequenz Nachweissystems, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif).
  • Die "TaqMan®" PCR Reaktion verwendet ein Paar von Amplifikationsprimern, zusammen mit einem nicht-verlängerbaren Mess-Oligonukleotid, als TaqMan® Sonde bezeichnet, die so aufgebaut ist, um an eine GC-reiche Sequenz zu hybridisieren, die zwischen dem vorwärts und reversen (d.h., Sinn- und anti-Sinn) Primer lokalisiert ist. Die TaqMan® Sonde umfasst weiterhin eine fluoreszente "Reportergruppe" und eine "Löschungsgruppe", die kovalent an Linkergruppen (z.B., Phosphoramidite) gebunden sind, die an Nukleotide des TaqMan® Oligonukleotids angebracht sind. Beispiele von geeigneten Reporter- und Löschungs-Molekülen sind: die 5' fluoreszenten Reporterfarbstoffe 6FAM ("FAM"; 2,7-Dimethoxy-4,5-dichlor-6-carboxy-fluoreszein) und TET (6-Carboxy-4,7,2',7'-tetrachlorfluoreszein) und der 3' Löschungsfarbstoff TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin) (Livak et al., PCR Methods Appl. 4: 357–362, 1995; Gibson et al., Genome Res. 6: 995–1001; und 1996; Heid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996).
  • Ein Verfahren zum Aufbau von geeigneten TaqMan® Sonden schließt die Verwendung eines Software-Werkzeugs ein, wie zum Beispiel "Primer Express", das die Variabilitäten der CpG Insel Anordnung innerhalb GC-reicher Sequenzen bestimmen kann, um mindestens einen 10°C-Unterschied in der Schmelztemperatur (relativ zu den Primer Schmelztemperaturen) aufgrund entweder der spezifischen Sequenz (festere Bindung von GC relativ zu AT Basenpaaren) oder der Primerlänge zur Verfügung zu stellen.
  • Die TaqMan® Sonde kann oder kann nicht bekannte CpG Methylierungsstellen abdecken, in Abhängigkeit von dem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren, das verwendet wird. Bevorzugt wird in der Ausführungsform der Anwendung D die TaqMan® Sonde so aufgebaut, um zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure durch überlappen von 1 bis 5 CpG Sequenzen zu unterscheiden. Wie oben für die vollständig unmethylierten und vollständig methylierten Primersets beschrieben, können TaqMan® Sonden so aufgebaut werden, um komplementär zu entweder unmodifizierter Nukleinsäure oder, durch geeignete Basensubstitutionen, zu Bisulfit-modifizierten Sequenzen zu sein, die in der anfänglichen unmodifizierten Nukleinsäuresonde entweder vollständig unmethyliert oder vollständig methyliert waren.
  • Jeder Oligonukleotidprimer oder Sonde in der TaqMan® PCR Reaktion kann irgendwas von keiner bis zu vielen verschiedenen CpG Dinukleotide überspannen, was jeweils im Anschluss an die Bisulfit-Behandlung zu zwei verschiedenen Sequenzvariationen (mCpG oder UpG) führen kann. Zum Beispiel, wenn ein Oligonukleotid 3 CpG Dinukleotide überspannt, dann ist die Zahl von möglichen Sequenzvarianten, die in der genomischen DNA auftritt, 23 = 8 verschiedene Sequenzen. Wenn der vorwärts und reverse Primer jeweils 3 CpGs überspannen und das Sondenoligonukleotid (oder beide Oligonukleotide zusammen im Fall des FRET Formats) weitere 3 überspannt, dann wird die Gesamtzahl von Sequenzpermutationen 8 × 8 × 8 = 512. In der Theorie könnte man getrennte PCR Reaktionen vorsehen, um die relativen Mengen jeder dieser 512 Sequenzvarianten zu analysieren. In der Praxis kann eine wesentliche Menge an qualitativer Methylierungsinformation aus der Analyse einer viel kleineren Zahl an Sequenzvarianten abgeleitet werden. Daher, in seiner einfachsten Form, kann das erfindungsgemäße Verfahren durch Aufbauen von Reaktionen für die vollständig methylierten und vollständig unmethylierten Varianten durchgeführt werden, die die extremsten Sequenzvarianten in einem hypothetischen Beispiel darstellen (siehe 3, Anwendung D). Das Verhältnis zwischen diesen zwei Reaktionen, oder alternativ das Verhältnis zwischen der methylierten Reaktion und einer Kontrollreaktion (3, Anwendung A), würde ein Maß für das Ausmaß an DNA Methylierung an diesem Lokus zur Verfügung stellen. Eine genauere Übersicht der qualitativen Version ist in 4 gezeigt.
  • Der Nachweis von Methylierung in der Ausführungsform der Anwendung D, wie in den anderen Ausführungsformen hier, basiert auf der Amplifikations-vermittelten Verdrängung der Sonde. In der Theorie kann das Verfahren der Sondenverdrängung so vorgesehen werden, um die Sonde intakt zu belassen, oder zu einem Verdau der Sonde führen. Bevorzugt, wie hier verwendet, tritt eine Verdrängung der Sonde durch Verdau der Sonde während der Amplifikation auf. Während der Verlängerungsphase des PCR Zyklus wird die fluoreszente Hybridisierungssonde durch die 5' zu 3' nukleolytische Aktivität der DNA Polymerase gespalten. Nach der Spaltung der Sonde wird die Reportergruppen-Emission nicht mehr effizient auf die Löschungsgruppe übertragen, was zu einem Anstieg des Reportergruppen-Fluoreszenz-Emissionsspektrum bei 518 nm führt. Die Fluoreszenzintensität der Löschungsgruppe (z.B., TAMRA) verändert sich sehr wenig über den Verlauf der PCR Amplifikation hinweg. Mehrere Faktoren können die Effizienz von TaqMan® PCR Reaktionen beeinflussen, einschließlich: Magnesium- und Salzkonzentrationen; Reaktionsbedingungen (Zeit und Temperatur); Primersequenzen; und PCR Zielgröße (d.h., Amplicongröße) und -zusammensetzung. Die Optimierung dieser Faktoren, um die optimale Fluoreszenzintensität für einen gegebenen genomischen Lokus herzustellen, ist für einen Fachmann im Stand der Technik für PCR offensichtlich, und bevorzugte Bedingungen werden in den "Beispielen" hier weiter verdeutlicht. Das Amplicon kann in seiner Größe von 50 bis 8.000 Basenpaare oder größer reichen, kann aber auch kleiner sein. Typischerweise ist das Amplicon von 100 bis 1000 Basenpaare und bevorzugterweise von 100 bis 500 Basenpaare. Bevorzugt werden die Reaktionen in Echtzeit verfolgt, durch Durchführen der PCR Amplifikation unter der Verwendung von 96-Well optischen Haltern und Kappen und unter der Verwendung eines Sequenzdetektors (ABI Prism), um die Messung der Fluoreszenz-Spektren aller 96 Wells des Temperatur-Cyclers kontinuierlich während der PCR Amplifikation zu ermöglichen. Bevorzugt wird Verfahren D in Kombination mit dem Verfahren A (3) durchgeführt, um Kontrollen für die Menge an eingesetzter Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen und die Daten von Halter zu Halter zu normalisieren.
  • Anwendung C. Das erfindungsgemäße Verfahren wie oben kann modifiziert werden, um die Sequenzunterscheidung auf dem PCR Produkt Nachweisniveau zu vermeiden. Daher werden in einer zusätzlichen qualitativen Ausführungsform des Verfahrens (3, Anwendung C) wie hier beschrieben nur die Primer so aufgebaut, dass sie CpG Dinukleotide abdecken, und die Sequenzunterscheidung tritt allein auf dem Niveau der Amplifikation auf. Bevorzugt ist die in dieser Ausführungsform verwendete Sonde immer noch eine TaqMan® Sonde, ist jedoch so aufgebaut, dass sie nicht mit irgendeiner CpG Sequenz überlappt, die in der anfänglichen unmodifizierten Nukleinsäure vorliegt. Die Ausführungsform von Anwendung C stellt eine Hoch-Durchsatz, Fluoreszenz-basierte Echtzeit-Version der MSP Technologie dar, wobei eine wesentliche Verbesserung durch Verringern der Zeit erreicht wurde, die für den Nachweis von methylierten CpG Sequenzen erforderlich ist. Bevorzugt werden die Reaktionen in Echtzeit verfolgt, durch Durchführen einer PCR Amplifikation unter der Verwendung von 96-Well optischen Haltern und Kappen und unter der Verwendung eines Sequenzdetektors (ABI Prism), um die Messung der Fluoreszenz-Spektren aller 96 Wells des Temperatur-Cyclers kontinuierlich während der PCR Amplifikation zu ermöglichen. Bevorzugt wird Verfahren C in Kombination mit Verfahren A durchgeführt, um Kontrollen für die Menge an eingesetzter Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen und die Daten von Halter zu Halter zu normalisieren.
  • Anwendung B. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch modifiziert werden, um die Sequenzunterscheidung auf dem PCR Amplifikationsniveau (3, A und B) zu vermeiden. In einer quantitativen Ausführungsform (3, Anwendung B) des Verfahrens wird nur die Sonde so aufgebaut, dass sie CpG Dinukleotide abdeckt, und die Sequenzunterscheidung tritt allein auf dem Niveau der Sondenhybridisierung auf. Bevorzugt werden TaqMan® Sonden verwendet. In dieser Version werden Sequenzvarianten, die sich aus dem Bisulfit-Umwandlungsschritt ergeben, mit gleicher Effizienz amplifiziert; solange kein inhärenter Amplifikations-Bias vorhanden ist (Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25: 4422–4426, 1997). Der Aufbau von getrennten Sonden für jede der verschiedenen Sequenzvarianten, die mit einem besonderen Methylierungsmuster assoziiert sind (z.B., 23 = 8 Sonden im Fall von 3 CpGs) würde eine quantitative Bestimmung der relativen Prävalenz von jeder Sequenzpermutation in dem gemischten Pool an PCR Produkten ermöglichen. Bevorzugt werden die Reaktionen in Echtzeit durch Durchführen von PCR Amplifikation unter der Verwendung von 96-Well optischen Haltern und Kappen und unter der Verwendung eines Sequenzdetektors (ABI Prism) verfolgt, um die Messung der Fluoreszenz-Spektren aller 96 Wells des Temperatur-Cyclers kontinuierlich während der PCR Amplifikation zu ermöglichen. Bevorzugt wird Verfahren B in Kombination mit Verfahren A durchgeführt, um Kontrollen für die Menge an eingesetzter Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen und die Daten von Halter zu Halter zu normalisieren.
  • Anwendung A. Verfahren A (3) stellt selber keine methylierte-CpG Sequenzunterscheidung auf entweder den Amplifikations- oder Nachweisniveaus zur Verfügung, sondern unterstützt und validiert die anderen drei Anwendungen durch zur Verfügung stellen von Kontrollreaktionen auf die Menge an eingesetzter DNA, und um die Daten von Halter zu Halter zu normalisieren. Daher, wenn weder der Primer noch die Sonde irgendwelche CpG Dinukleotide überlagern, dann repräsentiert die Reaktion eine nicht-biased Amplifikation, und Messungen der Amplifikation unter der Verwendung von Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit PCR dienen als eine Kontrolle für die Menge an eingesetzter DNA (3, Anwendung A). Bevorzugt fehlt Verfahren A nicht nur CpG Dinukleotide in dem Primer und Sonde(n), son dern es enthält auch keinerlei CpGs innerhalb des Amplicons, um jegliche differentielle Effekte der Bisulfit-Behandlung auf das Amplifikationsverfahren zu vermeiden. Bevorzugt ist das Amplicon für Verfahren A eine Region an DNA, die nicht häufig einer Kopienzahl-Veränderung ausgesetzt ist, wie zum Beispiel Genamplifikation oder -deletion.
  • Die mit der qualitativen Version der Technologie erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Beispielen beschrieben. Dutzende von menschlichen Tumorsonden wurden unter der Verwendung dieser Technologie mit ausgezeichneten Ergebnissen analysiert. Hoch-Durchsatz unter der Verwendung einer TaqMan® Maschine ermöglichte die Durchführung von 1100 Analysen in drei Tagen mit einer TaqMan® Maschine.
  • BEISPIEL 1
  • Ein anfängliches Experiment wurde durchgeführt, um die erfindungsgemäße Strategie zur Ermittlung des Methylierungsstatus von CpG Inseln in genomischer DNA zu validieren. Dieses Beispiel zeigt einen Vergleich zwischen menschlicher Sperma DNA (als hoch unmethyliert bekannt) und HCT116 DNA (aus einer menschlichen colorektalen Zellline, als hoch methyliert an vielen CpG Stellen bekannt) im Hinblick auf den Methylierungsstatus von spezifischen, hypermethylierbaren CpG Inseln in vier verschiedenen Genen. COBRA (combined bisulfite restriction analysis; Xiong und Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532–2534, 1997) wurde als ein unabhängiges Maß des Methylierungsstatus verwendet.
  • DNA Isolierung und Bisulfit-Behandlung. Kurz, wurde genomische DNA aus menschlichem Sperma oder HCT116 Zellen durch das Standardverfahren von Proteinase K Verdau und Phenol-Chloroform Extraktion isoliert (Wolf et al., Am. J Hum. Genet. 51: 478–485, 1992). Die DNA wurde dann mit Natriumbisulfit durch anfängliches Denaturieren in 0,2 M NaOH, gefolgt von Zugabe von Natriumbisulfit und Hydrochinon (auf eine finale Konzentrationen von jeweils 3,1 M und 0,5 M), Inkubation für 16 h bei 55°C, Entsalzen (DNA Clean-Up System; Promega), Desulfonierung durch 0,3 M NaOH und finale Ethanolfällung behandelt (Xiong und Laird, supra, wobei Sadri und Hornsby, Nucleic Acids Res. 24: 5058–5059, 1996 zitiert wird; siehe auch Frommer et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 1827–1831, 1992). Nach der Bisulfit-Behandlung wurde die DNA entweder einer COBRA Analyse wie früher beschrieben (Xiong und Laird, supra) oder dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren unter der Verwendung von Fluoreszenz-basierter, Echtzeit quantitativer PCR unterzogen (Heid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996; Gibson et al., Genome Res. 6: 995–1001, 1996).
  • COBRA und MsSNuPE Reaktionen. Die ESR1 und APC Gene wurden unter der Verwendung von COBRA (combined bisulfite restriction analysis) analysiert. For die COBRA Analyse wurden Methylierungs-abhängige Sequenzunterschiede in die genomische DNA durch Standard Bisulfit-Behandlung gemäß dem durch Frommer et al beschriebenen Verfahren eingeführt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827–1831, 1992) (1 μg an Lachssperma DNA wurde als ein Träger hinzugefügt, bevor die genomische DNA mit Natriumbisulfit behandelt wurde). Die PCR-Amplifikation der Bisulfit-umgewandelten DNA wurde unter der Verwendung von Primer durchgeführt, die für die interessanten CpG Inseln spezifisch waren, gefolgt von Restriktionsendonuklease-Verdau, Gelelektrophorese und Nachweis unter der Verwendung spezifischer markierter Hybridisierungssonden. Die vorwärts und reversen Primersets, die für die ESR1- und APC-Gene verwendet wurden, waren jeweils: TCCTAAAACTACACTTACTCC [SEQ ID NO. 35], GGTTATTTGGAAAAAGAGTATAG [SEQ ID NO. 36] (ESR1 Promotor); und AGAGAGAAGTAGTTGTGTTAAT [SEQ ID NO. 37], ACTACACCAATACAACCACAT [SEQ ID NO. 38] (APC Promotor). Die PCR Produkte von ESR1 wurden durch die Restriktionsendonukleasen TaqI und BstUI verdaut, während die Produkte von APC by Taq I und SfaN I verdaut wurden, um die Methylierung von 3 CpG Stellen für APC und 4 CpG Stellen für ESR1 zu messen. Die verdauten PCR Produkte wurden auf denaturierendem Polyacrylamidgel elektrophoriert und durch Elektroblotting auf Nylonmembran transferiert (Zetabind; American Bioanalytical). Die Membranen wurden mit einem 5'-Ende-markierten Oligonukleotid hybridisiert, um sowohl verdaute und nicht-verdaute DNA Fragmente von Interesse sichtbar zu machen. Die verwendeten Sonden waren wie folgt: ESR1, AAACCAAAACTC [SEQ ID NO. 39]; und APC, CCCACACCCAACCAAT [SEQ ID NO. 40]. Die Quantifizierung wurde mit dem Phosphoimager 445SI (Molecular Dynamics) durchgeführt. Berechnungen wurden in Microsoft Excel durchgeführt. Das Ausmaß der DNA Methylierung an den untersuchten CpG Stellen wurde durch Berechnen der Prozentsätze der verdauten PCR Fragmente (Xiong und Laird, supra) bestimmt.
  • MLH1 und CDKN2A wurden unter der Verwendung von MsSNuPE (Methylation-sensitive Single Nukleotid Primer Extension Assay) analysiert, wie beschrieben durch Gonzalgo und Jones (Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531). Die PCR Amplifikation der Bisulfit-umgewandelten DNA wurde unter der Verwendung von Primern durchgeführt, die spezifisch für die interessanten CpG Inseln waren, und der Nachweis wurde unter der Verwendung zu sätzlicher spezifischer Primer (Verlängerungssonden) durchgeführt. Die vorwärts und reversen Primersets, die für die MLH1- und CDKN2A-Gene verwendet wurden, waren jeweils: GGAGGTTATAAGAGTAGGGTTAA [SEQ ID NO. 41], CCAACCAATAAAAACAAAAATACC [SEQ ID NO. 42] (MLH1 Promotor); GTAGGTGGGGAGGAGTTTAGTT [SEQ ID NO. 43], TCTAATAACCAACCAACCCCTCC [SEQ ID NO. 44] (CDKN2A Promotor); und TTGTATTATTTTGTTTTTTTTGGTAGG [SEQ ID NO. 45], CAACTTCTCAAATCATCAATCCTCAC [SEQ ID NO. 46] (CDKN2A Exon 2).
  • Die MsSNuPE Verlängerungssonden sind unmittelbar 5' des zu analysierenden CpGs lokalisiert, und die Sequenzen sind: TTTAGTAGAGGTATATAAGTT [SEQ ID NO. 47], TAAGGGGAGAGGAGGAGTTTGAGAAG [SEQ ID NO. 48] (jeweils MLH1 Promotor Stellen 1 und 2); TTTGAGGGATAGGGT [SEQ ID NO. 49], TTTTAGGGGTGTTATATT [SEQ ID NO. 50], TTTTTTTGTTTGGAAAGATAT [SEQ ID NO. 51] (jeweils Promotor Stellen 1, 2 und 3); und GTTGGTGGTGTTGTAT [SEQ ID NO. 52], AGGTTATGATGATGGGTAG [SEQ ID NO. 53], TATTAGAGGTAGTAATTATGTT [SEQ ID NO. 54] (jeweils Exon2 Stellen 1, 2, und 3). Ein Paar von Reaktionen wurde für jede Sonde unter der Verwendung von entweder 32P-dCTP oder 32P-dTTP für Einzel-Nukleotidverlängerung angesetzt. Die verlängerten MsSNuPE Primer (Sonden) wurden durch ein denaturierendes Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Quantifizierung wurde unter der Verwendung des Phosphoimagers durchgeführt.
  • Erfindungsgemäße Methylierungsanalyse. Die Bisulfit-umgewandelte genomische DNA wurde unter der Verwendung von Lokus-spezifischen PCR Primern, die eine Oligonukleotidsonde mit einem 5' Fluoreszenz Reporterfarbstoff (6FAM) und einem 3' Löschungsfarbstoff (TAMRA) (Livak et al., PCR Methods Appl. 4: 357–362, 1995) (für die Methylierungs-Analysen verwendete Primer und Sonden sind unter "Gene, MethyLight Primer und Sonde Sequenzen" hier infra aufgelistet) flankierten, amplifiziert. In diesem Beispiel wurden der vorwärts und reverse Primer und die entsprechenden fluorogenen Sonden so aufgebaut, um zwischen entweder vollständig methylierten oder vollständig unmethylierten Molekülen von Bisulfit-umgewandelter DNA zu unterscheiden (siehe Diskussion des Primeraufbaus unter "Genaue Beschreibung der Erfindung, Verfahren D" hier). Die Primer und eine Sonde wurden auch für einen Bereich des MYOD1 Gens (Myogenic Differentiation Gene) aufgebaut, der vollständig frei von CpG Dinukleotiden ist, als eine Kontrollreaktion für die Menge an einge setzter DNA. Parallele Reaktionen wurden unter der Verwendung der Verfahren mit den methylierten und unmethylierten (D) oder Kontrolloligos (A) auf den Bisulfit-behandelten Sperma und HCT116 DNA Proben durchgeführt. Die für die methylierten und unmethylierten Reaktionen erhaltenen Werte wurden auf die Werte für die MYOD1 Kontrollreaktionen normalisiert, um die Verhältnisse wie in Tabelle 1 (unten) gezeigt zu ergeben.
  • In einem TaqMan® Protokoll spaltete die 5' zu 3' Nukleaseaktivität der Taq DNA Polymerase die Sonde und setzte den Reporter frei, dessen Fluoreszenz durch den Laserdetektor des ABI Prism 7700 Sequenz Nachweissystems (Perkin-Elmer, Foster City, Calif.) nachgewiesen wurde. Nach Übersteigen einer Fluoreszenz-Nachweisgrenze, führte die PCR Amplifikation zu einem Fluoreszenzsignal proportional zu der Menge an erzeugtem PCR Produkt. Die anfängliche Templatmenge kann von der Zahl an Zyklen abgeleitet werden, bei der das Fluoreszenzsignal eine Grenze in der exponentiellen Phase der PCR Reaktion übersteigt. Mehrere Referenzproben wurden auf jeder Testplatte eingeschlossen, um die Platten-zu-Platten Konsistenz zu verifizieren. Die Platten wurden zueinander unter der Verwendung dieser Referenzproben normalisiert. Die PCR Amplifikation wurden unter der Verwendung eines 96-Well Halters und Kappen mit einem finalen Reaktionsgemisch von 25 μl durchgeführt, bestehend aus 600 nM jeden Primers, 200 nM Sonde, 200 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP, 400 μM dUTP, 5,5 mM MgCl2, 1 × TaqMan® Puffer A, enthaltend einen Referenzfarbstoff und Bisulfit-umgewandelte DNA oder nicht-umgewandelte DNA bei den folgenden Bedingungen: 50°C für 2 min, 95°C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95°C für 15 s und 60°C für 1 min.
  • Gen-, MethyLight Primer- und Sonden-Sequenzen. Vier menschlich Gene wurden für die Analyse ausgewählt: (1) APC (Adenomatous Polyposis coli) (Hiltunen et al., Int. J Cancer 70: 644–648, 1997); (2) ESR1 (Estrogenrezeptor) (Issa et al., Nature Genet. 7: 53640, 1994); (3) CDKN2A (p16) (Ahuja, Cancer Res. 57: 3370–3374, 1997); und (4) hMLH1 (Fehlpaarungsreparatur) (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6870–6875, 1998; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 8698–8702, 1998). Diese Gene wurden ausgewählt, da sie hypermethylierbare CpG Inseln enthalten, von denen bekannt ist, dass sie de novo Methylierung in menschlichem colorektalen Gewebe in allen normalen und Tumorsonden unterzogen werden. Das menschliche APC Gen wurde zum Beispiel mit der Entwicklung von colorektalem Krebs in Zusammenhang gebracht und von den CpG Stellen in den regulatorischen Sequenzen des Gens ist bekannt, dass sie in Colonkarzinomen distinkt mehr methyliert sind, jedoch nicht in prämalignen Adenomen; relativ zu einer normalen Colon Mucosa (Hiltunen et al., supra). Das menschliche ESR Gen enthält eine CpG Insel an seinem 5' Ende, die mit dem Alter in der colorektalen Mucosa ansteigend methyliert wird und in allen analysierten menschlichen colorektalen Tumoren stark methyliert ist (Issa et al., supra). Die Hypermethylierung von Promotor-assoziierten CpG Inseln des CDKN2A (p16) Gens wurde in 60% an colorektalem Krebs gefunden, der Mikrosatelliten Instabilität (MSI) zeigt, aufgrund von Defekten in einem von mehreren Basen-Fehlpaarungsreparaturgenen (Ahuja et al., supra). Das Fehlpaarungs-Reparaturgen MLH1 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung von sporadischen Fällen an Fehlpaarungsreparatur-defizienten colorektalen Tumoren (Thibodeau et al., Science 260: 816–819, 1993). Es wurde berichtet, dass MLH1 durch DNA Hypermethylierung seiner Promotorregion transkriptionell stummgeschaltet werden kann, was zu Mikrosatelliten Instabilität (MSI) führt (Kane et al., Cancer Res. 57: 808–811, 1997; Ahuja et al., supra; Cunningham et al., Cancer Res. 58: 3455–3460, 1998; Herman et al., supra; Veigl et al., supra).
  • Fünf Sets von PCR Primern und Sonden, spezifisch aufgebaut für Bisulfit-umgewandelte DNA Sequenzen, wurden verwendet: (1) ein Set, das vollständig methylierte und vollständig unmethylierte DNA für das ESR1 Gen darstellt; (2) ein vollständig methyliertes Set für das MLH1 Gen; (3) ein vollständig methyliertes und vollständig unmethyliertes Set für das APC Gen und (4) ein vollständig methyliertes und vollständig unmethyliertes Set für das CDKN2A (p16) Gen und (5) ein internes Referenzset für das MYOD1 Gen um auf eingesetzte DNA zu kontrollieren. Die methylierten und unmethylierten Primer und entsprechenden Sonden wurden so aufgebaut, um 1 bis 5 potentielle CpG Dinukleotidstellen zu überlappen. Die MYOD1 internen Referenzprimer und -sonden wurden so aufgebaut, um eine Region des MYOD1 Gens abzudecken, die vollständig frei von jeglichen CpG Dinukleotiden war, um eine nicht-biased PCR Amplifikation der genomischen DNA unabhängig vom Methylierungsstatus zu ermöglichen. Wie oben angegeben, wurden parallele TaqMan® PCR Reaktionen mit Primern spezifisch für die Bisulfit-umgewandelten methylierten und/oder unmethylierten Gensequenzen und mit dem MYOD1 Referenzprimer durchgeführt. Die Primer und Sondensequenzen sind unten aufgelistet. In allen Fällen ist der erste aufgeführte Primer der vorwärts PCR Primer, der zweite ist die TaqMan® Sonde und der dritte ist der reverse PCR Primer. ESR1 methyliert (GGCGTTCGTTTTGGGATTG [SEQ ID NO. 1], 6FAM 5'-CGATAAAACCGAACGACCCGACGA-3' TAMRA [SEQ ID NO. 2], GCCGACACGCGAACTCTAA [SEQ ID NO. 3]); ESR1 unmethyliert (ACACATATCCCACCAACACACAA [SEQ ID NO. 4], 6FAM 5'-CAACCCTACCCCAAAAACCTACAAATCCAA-3'TAMRA [SEQ ID NO. 5], AGGAGTTGGTGGAGGGTGTTT [SEQ ID NO. 6]); MLH1 methyliert (CTATCGCCGCCTCATCGT [SEQ ID NO. 7], 6FAM 5'-CGCGACGTCAAACGCCACTACG-3' TAMRA (SEQ ID NO. 8], CGTTATATATCGTTCGTAGTATTCGTGTTT [SEQ ID NO. 9]); APC methyliert (TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT [SEQ ID NO. 10], 6FAM 5'-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-3' TAMRA [SEQ ID NO. 11], GAACCAAAACGCTCCCCAT [SEQ ID NO. 12]); APC unmethyliert (GGGTTGTGAGGGTATATTTTTGAGG [SEQ ID NO. 13], 6FAM 5'-CCCACCCAACCACACAACCTACCTAACC-3' TAMRA [SEQ ID NO. 14], CCAACCCACACTCCACAATAAA [SEQ ID NO. 15]); CDKN2A methyliert (AACAACGTCCGCACCTCCT [SEQ ID NO. 16], 6FAM 5'-ACCCGACCCCGAACCGCG-3' TAMRA [SEQ ID NO. 17], TGGAATTTTCGGTTGATTGGTT [SEQ ID NO. 18]); CDKN2A unmethyliert (CAACCAATCAACCAAAAATTCCAT [SEQ ID NO. 19], 6FAM 5'-CCACCACCCACTATCTACTCTCCCCCTC-3' TAMRA [SEQ ID NO. 20], GGTGGATTGTGTGTGTTTGGTG [SEQ ID NO. 21]); und MYOD1, (CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT [SEQ ID NO. 22], 6FAM 5'-TCCCTTCCTATTCCTAAATCCAACCTAAATACCTCC-3' TAMRA [SEQ ID NO. 23], TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA (SEQ ID NO. 24]).
  • Tabellen 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Analyse der menschlichen Sperma und HCT116 DNAs für den Methylierungsstatus der CpG Inseln innerhalb der vier Gene APC, ESR1, CDKN2A (p16) und hMLH1. Die Ergebnisse sind als Verhältnisse zwischen den methylierten und unmethylierten Reaktionen und einer Kontrollreaktion (MYOD1) angegeben. Tabelle 1 zeigt, dass die Sperma DNA ein positives Verhältnis nur mit den "unmethylierten" Primern und Sonden ergab; konsistent mit dem bekannten unmethylierten Status von Sperma DNA, und konsistent mit den Prozent Methylierungswerten, wie bestimmt durch die COBRA Analyse. Das heißt, das Primen auf der Bisulfit-behandelten DNA trat in Regionen auf, die unmethyliertes Cytosin in CpG Sequenzen in der entsprechenden genomische DNA enthielten und daher durch die Bisulfit-Behandlung deaminiert (umgewandelt in Uracil) wurden. TABELLE 1
    Figure 00310001
    Figure 00320001
    • * Die Werte stellen keine Prozentsätze dar, sondern Werte in einer arbiträren Einheit, die quantitativ zwischen verschiedenen DNA Sonden für dieselbe Reaktion nach Normalisierung mit einem Kontrollgen verglichen werden können.
    • ** Basierend auf Ms-SNuPE.
  • Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von HCT116 DNA auf den Methylierungsstatus der CpG Inseln innerhalb der vier Gene APC, ESR1, CDKN2A (p16) und hMLH1. Die Ergebnisse sind als Verhältnisse zwischen den Methylierungs-spezifischen Reaktionen und einer Kontrollreaktion (MYOD1) angegeben. Für das ESR Gen wurde ein positives Verhältnis nur mit den "methylierten" Primern und Sonde erhalten; konsistent mit dem bekannten methylierten Status von HCT116 DNA und der COBRA Analyse. Für das CDKN2A Gen ergab die HCT116 DNA positive Verhältnisse mit sowohl den "methylierten" und "unmethylierten" Primern und Sonde; konsistent mit dem bekannten methylierten Status von HCT116 DNA und mit der COBRA Analyse, die nur teilweise Methylierung dieser Region des Gens zeigte. Im Gegensatz dazu ergab das APC Gen positive Ergebnisse nur mit der unmethylierten Reaktion. Jedoch ist dies vollständig konsistent mit der COBRA Analyse und zeigt, dass diese APC Gen-Region in HCT116 DNA unmethyliert ist. Dies kann bedeuten, dass der Methylierungszustand dieser bestimmten APC Gen-regulatorischen Region in der DNA aus der HCT116 Zellinie ähnlicher zu der von normaler Colonmucosa oder prämalignen Adenomaa ist, als die von Colonkarzinomen (als deutlich mehr methyliert bekannt). TABELLE 2
    Figure 00320002
    • * Die Werte stellen keine Prozentsätze dar, sondern Werte in einer arbiträren Einheit, die quantitativ zwischen verschiedenen DNA Sonden für dieselbe Reaktion nach Normalisierung mit einem Kontrollgen verglichen werden können.
    • ** Basierend auf Ms-SNuPE.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel ist ein Vergleich der erfindungsgemäßen Verfahren (A und D in 3) mit einem unabhängigen COBRA-Verfahren (Siehe "Verfahren", oben), um den Methylierungsstatus einer CpG Insel zu bestimmen, die mit dem Estrogenrezeptor (ESR1) Gen in der menschlichen colorektalen Zellinie HCT116 und in menschlicher Sperma DNA assoziiert ist. Diese CpG Insel wurde als hoch methyliert in HCT116 und unmethyliert in menschlicher Sperma DNA berichtet (Xiong und Laird, supra; Issa et al., supra). Die COBRA Analyse ist oben beschrieben. Zwei TaqI Stellen innerhalb dieser CpG Insel bestätigten dies, wobei ein Fehlen an Methylierung in der Sperma DNA und nahezu vollständige Methylierung in HCT116 DNA (5A) gezeigt wurde. Zusätzlich wurden Ergebnisse unter der Verwendung Bisulfit-behandelter und unbehandelter DNA verglichen.
  • Für eine Analyse wurden vollständig "methylierte" und vollständig "unmethylierte" ESR1 und Kontroll- MYOD1 Primer und Sonden wie oben unter "Beispiel 1" beschrieben aufgebaut. Drei separate Reaktionen unter der Verwendung entweder der "methylierten", "unmethylierten" oder Kontrolloligos auf sowohl Sperma als auch HCT116 DNA wurden durchgeführt. Wie in Beispiel 1 oben, wurden die für die methylierten und unmethylierten Reaktionen erhaltenen Werte mit den Werten für die MYOD1 Kontrollreaktionen normalisiert, um die in 5Β gezeigten Verhältnisse zu ergeben. Die Sperma DNA ergab ein positives Verhältnis nur mit den unmethylierten Primern und Sonden, konsistent mit seinem unmethylierten Status. Im Gegensatz dazu erzeugte die HCT116 DNA mit den hauptsächlich methylierten ESR1 Allelen ein positives Verhältnis nur in der methylierten Reaktion (5B). Beide der Sperma und HCT116 DNA ergaben positive Werte in den MYOD1 Reaktionen, was anzeigte, dass ausreichend eingesetzte DNA für jede Sonde vorhanden war. Wie erwartet wurde die nicht-Bisulfit umgewandelte DNA mit entweder den methylierten oder unmethylierten Oligonukleotiden (5B) nicht amplifiziert. Diese Ergebnisse sind mit den COBRA Ergebnissen konsistent (5A), was vermuten lässt, dass der erfindungsgemäße Test zwischen den methylierten und unmethylierten Allelen des ESR1 Gens unterscheiden kann. Zusätzlich sind die Reaktionen spezifisch für Bisulfit-umgewandelte DNA, was die Erzeugung von falsch positiven Ergebnissen aufgrund unvollständiger Bisulfit-Umwandlung ausschließt.
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel bestimmte die Spezifität der erfindungsgemäßen Primer und Sonden. 6 zeigt einen Test aller möglichen Kombinationen an Primern und Sonden, um die Spezifität der methylierten und unmethylierten Oligonukleotide an DNAs mit bekanntem Methylierungsstatus weiter zu untersuchen. Acht verschiedene Kombinationen der ESR1 "methylierten" und "unmethylierten" vorwärts und reversen Primer und Sonden (wie oben beschrieben in "Beispiel 1") wurden in verschiedenen Kombinationen in Tests an Sperma und HCT116 DNA in zweifachen Ansätzen getestet. Die Tests wurden wie beschrieben oben in Beispiel 1 durchgeführt. Panel A (6) zeigt die Nomenklatur, die für die Kombinationen der ESR1 Oligos verwendet wurde. "U" bezieht sich auf die Oligosequenz, die an mit Bisulfit-umgewandelte unmethylierte DNA anhybridisiert, während "M" sich auf die methylierte Version bezieht. Position 1 zeigt den vorwärts PCR Primer an, Position 2 die Sonde und Position 3 den reversen Primer. Die für die acht Reaktionen verwendeten Kombinationen sind unterhalb jedes Paares an Balken gezeigt und stellten zweifache Experimente dar. Die Ergebnisse sind als Verhältnisse zwischen den ESR1 Werten und den MYOD1 Kontrollwerten angegeben. Panel B stellt eine Analyse von menschlicher Sperma DNA dar. Panel C stellt eine Analyse von DNA dar, die aus der menschlichen colorektalen Krebszellinie HCT116 erhalten wurde.
  • Nur die vollständig unmethylierten (Reaktion 1) oder vollständig methylierten Kombinationen (Reaktion 8) führten zu einer positiven Reaktion jeweils für das Sperma und HCT116. Die anderen Kombinationen waren negativ, was anzeigt, dass die PCR Bedingungen kein schwaches anhybridisieren der fehlgepaarten Oligonukleotide erlauben. Diese Selektivität zeigt an, dass das erfindungsgemäße Verfahren zwischen vollständig methylierten oder unmethylierten Allelen mit einem hohen Ausmaß an Spezifität unterscheiden kann.
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren reproduzierbar ist. 7 verdeutlicht eine Analyse des Methylierungsstatus des ESR1 Lokus in DNA Proben, die von einem primären colorektalen Adenokarzinom abgeleitet wurden und passender normaler Mucosa, abgeleitet von dem selben Patienten (Proben 10N und 10T in 8), um eine hetero gene Population von methylierten und unmethylierten Allelen zu untersuchen. Die colorektalen Gewebeproben wurden wie beschrieben in Beispiel 5, unten, gesammelt. Zusätzlich wurde die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Durchführen von acht unabhängigen Reaktionen für jeden Test getestet. Die Ergebnisse für die ESR1 Reaktionen und für die MYOD1 Kontrollreaktion stellen anders als Verhältnisse absolute Rohwerte wie erhalten für diese Reaktionen dar, so dass die Standardfehler der einzelnen Reaktionen ermittelt werden können. Die Werte wurden Platten-normalisiert, jedoch nicht auf eingesetzte DNA korrigiert. Die Balken zeigen die Mittelwerte wie erhalten für die acht getrennten Reaktionen. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittels an.
  • 7 zeigt, dass der Mittelwert für die methylierte Reaktion in dem Tumor höher war, verglichen mit dem normalen Gewebe, wohingegen die unmethylierte Reaktion das gegenteilige Ergebnis zeigte. Die für die acht unabhängigen Messungen erhaltenen Standardfehler waren relativ moderat und waren mit denjenigen vergleichbar, die für andere Untersuchungen unter der Verwendung von TaqMan® Technologie erhalten wurden (Fink et al., Nature Med. 4: 1329–1333, 1998). Einiges der Variabilität des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Ergebnis von stochastischer PCR Amplifikation (PCR Bias) sein, die bei geringen Templat-Konzentrationen auftreten kann. (Warnecke et al., Nucleic Acids Res. 25: 4422–4426, 1997). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse an, dass das erfindungsgemäße Verfahren reproduzierbare Ergebnisse für komplexe heterogene DNA Sonden ergeben kann.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel zeigt einen Vergleich der MLH1 Expression, Mikrosatelliten Instabilität und MLH1 Promotor Methylierung in 25 übereinstimmend-gepaarten menschlichen colorektalen Proben. Der hauptsächliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Fähigkeit, menschliche Tumore schnell auf den Methylierungszustand eines bestimmten Lokus zu screenen. Zusätzlich ist die Analyse von DNA Methylierung als ein Surrogatmarker für die Genexpression ein neuer Weg, um klinisch brauchbare Information über Tumore zu erhalten. Wir testeten die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Untersuchen des Methylierungsstatus des MLH1 Promotors. Das Fehlpaarungs-Reparaturgen MLH1 spielt eine wesentliche Rolle in der Entwicklung von sporadischen Fällen von Fehlpaarungs-Reparatur-defizienten colorektalen Tumoren (Thibodeau et al., Science 260: 816–819, 1993). Es wurde berichtet, dass MLH1 durch DNA Hypermethylierung seiner Promotorregion transkriptionell stummgeschaltet werden kann, was zu Mikrosatelliten Instabilität (MSI) führt (Kane et al., Cancer Res 57: 808–811, 1997; Ahuja et al., Cancer Res 57: 3370–3374, 1997; Cunningham et al., Cancer Res. 58: 3455–3460, 1998; Herman, J. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6870–6875, 1998; Veigl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8698–8702, 1998).
  • Unter der Verwendung des Hoch-Durchsatz erfindungsgemäß Verfahren, wie beschrieben in Beispiel 1 Anwendung D, wurden 50 Sonden bestehend aus 25 gepaarten Paare von menschlichen colorektalen Adenokarzinomen und normaler Mucosa auf den Methylierungsstatus der MLH1 CpG Insel hin analysiert. Quantitative RT-PCR (TaqMan®) Analysen der Expressionspiegel von MLH1, normalisiert auf ACTB (β-Actin), wurden untersucht. Weiterhin wurde der Mikrosatelliten Instabilitäts-(MSI)-Status jeder Probe durch PCR der BAT25 und BAT26 Loki analysiert (Parsons et al., Cancer Res. 55: 5548–5550, 1995). Die fünfundzwanzig gepaarten Tumor- und normales Mucosagewebe-Proben wurden von 25 Patienten mit primärem colorektalem Adenokarzinom erhalten. Die Patienten umfassten 16 Männer und 9 Frauen in einem Alter von 39–88 Jahre, mit einem mittleren Alter von 68,8. Der mucosale Abstand von Tumor zu normalen Proben war zwischen 10 und 20 cm. Ungefähr 2 Gramm des chirurgisch entfernten Gewebes wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C bis zur RNA und DNA Isolierung gelagert.
  • Quantitative RT-PCR und Mikrosatelliten Instabilitäts-Analyse. Die Quantifizierung der mRNA Spiegel wurde unter der Verwendung von Echtzeit Fluoreszenz Nachweis durchgeführt. Die TaqMan® Reaktionen wurden wie oben beschrieben für den Test durchgeführt, jedoch mit der Hinzufügung von 1U AmpErase Uracil N-Glycosylase). Nach RNA Isolierung wurde die cDNA von jeder Probe wie vorher beschrieben präpariert (Bender et al., Cnacer Res 58: 95–101, 1998). Kurz, wurde RNA durch Lysieren von Gewebe in Puffer enthaltend Guanidinisothiocyanat (4 M), N-Laurylsarcosin (0,5%), Natriumcitrat (25 mM) und 2-Mercaptoethanol (0,1 M) isoliert, gefolgt von Standard Phenol-Chloroform Extraktion und Fällung in 50% Isopropanol/50% Lysepuffer. Um cDNA zu präparieren, wurden RNA Proben unter der Verwendung von zufälligen Hexameren, Desoxynukleotidtriphosphaten und Superscript II® reverser Transkriptase (Life Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) revers transkribiert. Die sich ergebende cDNA wurde dann mit Primern amplifiziert, die spezifisch für MLH1 und ACTB waren. Die Kontamination der RNA Proben durch genomische DNA wurde durch Analyse aller RNA Proben ohne vorherige cDNA Umwandlung ausgeschlossen. Die relative Genexpression wurde basierend auf den Schwellen-Zyklen (Zahl an PCR Zyklen, die für den Nachweis mit einer spezifischen Sonde erforderlich waren) des MLH1 Gens und des internen Referenz-Gens ACTB bestimmt. Die Sequenzen des Vorwärtsprimer, der Sonde und des reversen Primer der ACTB und MLH1 Gene sind: ACTB (TGAGCGCGGCTACAGCTT [SEQ ID NO. 25], 6FAM5'-ACCACCACGGCCGAGCGG-3'TAMRA [SEQ ID NO. 26], CCTTAATGTCACACACGATT [SEQ ID NO. 27]); und MLH1 (GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA [SEQ ID NO. 28], 6FAM5'-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-3'TAMRA [SEQ ID NO. 29], TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTG [SEQ ID NO. 30]).
  • Veränderungen zahlreicher Polyadenin ("pA") Sequenzen, die weit über das Genom verteilt sind, ist ein brauchbare Eigenschaft, um Tumore mit Mikrosatelliten Instabilität (Ionov et al., Nature 363: 558–561, 1993) zu definieren. Die Mikrosatelliten Instabilität (MSI) wurde durch PCR und Sequenzanalyse der BAT25 (25-Basenpaar pA Trakt aus einem Intron des c-kit Onkogens) und BAT26 (26- Basenpaar pA Trakt aus einem Intron des Fehlpaarungs-Reparaturgens hMSH2) Loci bestimmt, wie früher beschrieben (Parsons et al., Cancer Res 55: 5548–5550, 1995). Kurz, wurden Segmente der BAT25 und BAT26 Loci für 30 Zyklen unter der Verwendung eines 32P-markierten Primers und eines nicht markierten Primers für jeden Locus amplifiziert. Die Reaktionen wurden auf Harnstoff-Formamidgelen aufgetrennt und gegenüber Film ausgesetzt. Die vorwärts und reversen Primer, die für die Amplifikation von BAT25 und BAT26 verwendet wurden, waren: BAT25 (TCGCCTCCAAGAATGTAAGT [SEQ ID NO. 31], TCTGCATTTTAACTATGGCTC [SEQ ID NO. 32]); und BAT26 (TGACTACTTTTGACTTCAGCC [SEQ ID NO. 33], AACCATTCAACATTTTTAACCC [SEQ ID NO. 34]).
  • 8 zeigt die Korrelation zwischen MLH1 Genexpression, MSI Status und Promotor Methylierung von MLH1, wie durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt. Das obere Diagramm zeigt die MLH1 Expressionsspiegel, wie gemessen durch quantitative, Echtzeit RT-PCR (TaqMan®) in gepaarten normalen (schraffierter Balken) und Tumor (schwarze Balken) colorektalen Sonden. Die Expressionsspiegel sind als das Verhältnis zwischen MLH1 und ACTB Messungen dargestellt. Der Mikrosatelliten Instabilitätsstatus (MSI) ist durch die Kreise angegeben, die zwischen den zwei Diagrammen vorhanden sind. Ein schwarzer Kreis zeigt MSI Positivität an, während ein offener Kreis anzeigt, dass die Probe MSI negativ ist, wie durch die Analyse der BAT25 und BAT26 Loci bestimmt. Das untere Diagramm zeigt den Methylierungsstatus des MLH1 Locus an, wie durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt. Die Methylierungsspiegel sind als das Verhältnis zwischen der MLH1 methylierten Reaktion und der MYOD1 Reaktion dargestellt.
  • Vier colorektale Tumore wiesen signifikant erhöhte Methylierungsspiegel auf, verglichen mit dem entsprechenden normalen Gewebe. Einer von diesen (Tumor 17) zeigte ein besonders hohes Ausmaß an MLH1 Methylierung, wie durch das erfindungsgemäße Verfahren ermittelt. Tumor 17 war die einzige Probe, die sowohl MSI positiv war (schwarzer Kreis) und eine transkriptionelle Stummschaltung von MLH1 zeigte. Die übrigen methylierten Tumore exprimierten MLH1 bei mittleren Spiegeln und waren MSI negativ (weißer Kreis). Diese Ergebnisse zeigen, dass MLH1 in Tumor 17 biallelisch methyliert war, was zu epigenetischem Stummschalten und konsequenter Mikrosatelliten Instabilität führte, wohingegen die anderen Tumore ein geringeres Ausmaß an MLH1 Promotor Hypermethylierung zeigten und nur ein methyliertes Allel aufweisen könnten, was die Expression von dem nicht veränderten Allel ermöglicht. Demzufolge war das erfindungsgemäße Verfahren in der Lage, schnell signifikante biologische Information zu erzeugen, wie zum Beispiel Promotor CpG Insel Hypermethylierung in menschlichen Tumoren, die mit dem transkriptionellen Stummschalten von Genen assoziiert ist, die relevant für das Fortschreiten der Krebserkrankung sind.
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Claims (21)

  1. Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung und/oder methyliertes CpG Inseln innerhalb einer genomischen Probe an DNA, umfassend: (a) in Kontakt bringen einer genomischen Probe an DNA mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen; und (b) Durchführen eines Amplifikations- und Nachweisschrittes, umfassend – Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure mittels Oligonukleotid-Primern in der Anwesenheit von einer oder einer Vielzahl von spezifischen Oligonukleotid-Sonden, wobei die eine oder die Vielzahl der Oligonukleotid-Primer oder der spezifische(n) Sonde(n) in der Lage sind, zwischen unmethylierter und methylierter Nukleinsäure zu unterscheiden, mit der Voraussetzung, dass mindestens eine Oligonukleotid-Sonde eine CpG-spezifische Sonde ist, die in der Lage ist, zwischen unmethylierter und methylierter Nukleinsäure zu unterscheiden; und – Nachweisen der methylierten Nukleinsäure, basierend auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 wobei die CpG-spezifische Sonde eine Vielzahl von Fluoreszenz-Markergruppen umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde eine FRET Sonde oder eine Dual-Marker Sonde ist, umfassend eine Fluoreszenz-Reportergruppe und eine Fluoreszenz löschende Gruppe.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine bevorzugende oder nicht-bevorzugende PCR-Reaktion durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Cytosin-Methylierung einer CpG Insel innerhalb einer genomischen Probe an DNA nachgewiesen wird.
  6. Verfahren zum Nachweis einer methyliertes CpG-enthaltenden Nukleinsäure, umfassend: (a) in Kontakt bringen einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen; (b) Durchführen eines Amplifikations- und Nachweisschrittes, umfassend – Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure in der Probe mittels Oligonukleotid-Primern in der Anwesenheit einer CpG-spezifischen Oligonukleotid-Sonde, wobei die CpG-spezifische Sonde, jedoch nicht die Primer, zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheidet; und – Nachweisen der methylierten Nukleinsäure, basierend auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR.
  7. Verfahren nach Anspruch 6 wobei die Sonde weiterhin eine Vielzahl von Fluoreszenz-Markergruppen umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die CpG-spezifische Sonde eine FRET Sonde oder eine Dual-Marker Sonde ist, umfassend eine Fluoreszenz-Reportergruppe und eine Fluoreszenz löschende Gruppe.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Mengen an Methylierung in der Nukleinsäureprobe basierend auf einem Bezug auf eine Kontrollreaktion für die Menge von Ausgangs-Nukleinsäure quantitativ bestimmt werden.
  10. Verfahren zum Nachweis einer methyliertes CpG-enthaltenden Nukleinsäure, umfassend: (a) in Kontakt bringen einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe mit einem modifizierenden Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen; (b) Durchführen eines Amplifikations- und Nachweisschrittes, umfassend – Amplifizieren der umgewandelten Nukleinsäure in der Probe mittels Oligonukleotid-Primern in der Anwesenheit einer CpG-spezifischen Oligonukleotid-Sonde, wobei sowohl die Primer als auch die CpG-spezifische Sonde zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden; und – Nachweisen der methylierten Nukleinsäure, basierend auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sonde eine Vielzahl von Fluoreszenz-Markergruppen umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Sonde eine FRET Sonde oder eine Dual-Marker Sonde ist, umfassend eine Fluoreszenz-Reportergruppe und eine Fluoreszenz löschende Gruppe.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Verfahren ein Hochdurchsatz-Verfahren ist.
  14. Methylierungs-Nachweiskit, brauchbar zum Nachweis einer methyliertes CpG-enthaltenden Nukleinsäure, umfassend ein Trägermittel, das unterteilt ist, um darin eng eingeschlossen einen oder mehrere Behälter aufzunehmen, umfassend: (i) ein modifizierendes Mittel, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, um eine umgewandelte Nukleinsäure herzustellen; (ii) Primer zur Amplifikation der umgewandelten Nukleinsäure; (iii) Primer zur Amplifikation von nicht umgewandelter Kontroll-Nukleinsäure; und (iv) eine CpG-spezifische Sonde, deren Nachweis auf einer Amplifikations-vermittelten Sondenverdrängung und Fluoreszenz-basierter quantitativer Echtzeit-PCR basiert, wobei die CpG-spezifische Sonde zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheidet; und wobei die Primer jeweils zwischen unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden oder nicht unterscheiden können.
  15. Kit nach Anspruch 14, wobei das modifizierende Mittel Cytosinreste in Uracilreste umwandelt.
  16. Kit nach Anspruch 14, wobei die CpG-spezifische Sonde, jedoch nicht die Primer für die Amplifikation der umgewandelten Nukleinsäure, zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheidet.
  17. Kit nach Anspruch 14, wobei sowohl die CpG-spezifische Sonde als auch die Primer für die Amplifikation der umgewandelten Nukleinsäure zwischen modifizierter unmethylierter und methylierter Nukleinsäure unterscheiden.
  18. Kit nach Anspruch 14, wobei die CpG-spezifische Sonde eine Vielzahl von Fluoreszenz-Markergruppen umfasst.
  19. Kit nach Anspruch 18, wobei die CpG-spezifische Sonde eine FRET Sonde oder eine Dual-Marker Sonde ist, umfassend eine Fluoreszenz-Reportergruppe und eine Fluoreszenz löschende Gruppe.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 6 oder 10, wobei der Amplifikationsschritt eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) umfasst.
  21. Verfahren oder Kit nach einem der Ansprüche 1, 6, 10 oder 14, wobei das das modifizierende Mittel Bisulfit umfasst.
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