DE60029209T2

DE60029209T2 - Vorrichtung und verfahren zur einbringung von substanzen in eine zelle durch elektroporation

Info

Publication number: DE60029209T2
Application number: DE60029209T
Authority: DE
Inventors: John Dodgson; Robert Anthony Ash CORLESS
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: Q Futures Ltd Chester Cheshire Gb
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-04-18
Also published as: ATE332387T1; WO2000063408A2; AU4582100A; US20040106189A1; WO2000063408A3; WO2000063407A2; GB9908681D0; US6653136B1; DE60029209D1; JP2004500022A; EP1173599A2; EP1173599B1; AU4129600A; WO2000063407A3; ES2267518T3

Description

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Einbringen einer Substanz in eine Zelle.
Die Erfindung ist im Speziellen, aber nicht ausschließlich, dazu befähigt, in Zellen Substanzen einzubringen, die ein Transfektionsagens wie etwa eine Chemikalie, ein Molekül, ein Protein, ein Virus, ein Prion oder DNA-Material umfassen können.
Zuvor wurde Material über eine spritzenartige Vorrichtung in Zellen eingebracht. Diese spritzenartigen Vorrichtungen müssen von Hand oder von komplexen Robotersystemen betrieben werden, und infolgedessen ist der Injektionsprozess bisher sehr langsam gewesen.
Die vorliegende Erfindung kam auf, um dieses und weitere Probleme im Zusammenhang mit spritzenartigen Vorrichtungen zu überwinden.
Der Erfindung liegt als Aufgabe zugrunde, die Effizienz des Injizierens von Material in Zellen mittels des gegenwärtig bekannten Elektroporationsverfahrens zu steigern. Bei diesem Verfahren werden in einem Medium suspendierte Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt, das hinreichend stark ist, um die Membran permeabel werden zu lassen. Nach Stand der Technik werden Zellen in einem Medium suspendiert, welches die Spezies enthält, die injiziert werden soll. Nachdem die Membran permeabel gemacht worden ist, diffundiert die zu injizierende Spezies entweder in die Zelle oder wird durch Elektrophorese in diese hineingetrieben. Nach einiger Zeit erholt sich die Zellmembran von den Auswirkungen des Impulses und wird erneut nichtpermeabel. Nach Stand der Technik werden hohe Zellkonzentrationen zusammen mit makroskopischen Elektroden (d.h., Elektroden mit einer typischen Mindestabmessung in der Größenordnung von 100 μm) benutzt. Dies bedeutet, dass im Allgemeinen mehr als eine Zelle in einer Reihe mit jeder der Feldlinien im System liegt, wobei die präzise Anzahl zufällig ist. Daher kann das von den Zellen im System erfahrene Feld in großem Maße schwanken, von unterhalb des für das Öffnen der Membran erforderlichen Werts bis zu über dem Wert, den die Zellen aushalten und bei dem sie lebend bleiben können. Der Erfindung liegt als Aufgabe zugrunde, ein mikrofabriziertes System mit charakteristischen Abmessungen zu schaffen, die wesentlich kleiner sind als die bei gegenwärtig benutzten Elektroporationsvorrichtungen anzutreffenden, in welchem die Elektroporation von Zellen und die Injektion von Material unter Bedingungen erfolgen kann, die von Zelle zu Zelle sehr ähnlich sind, was es erlaubt, Unsicherheiten bei Feldstärke und Tastung zu reduzieren.
Mikrofabrizierte Einrichtungen, mit denen Zellen gehandhabt und elektrischen Feldern ausgesetzt werden können, sind bekannt. Ayliffe et al. (IEEE J MEMS 8(1)50–57 (1999)) zeigen mikrofabrizierte Kanäle mit Mikroelektroden, die für elektrische Impedanzmessungen an Flüssigkeiten und Zellen benutzt werden können, wobei Letztere auf das Nachweisen des Typs der vorhandenen Zelle und (sofern möglich) das Messen einiger ihrer Eigenschaften abzielen. Die Einrichtung ist nicht zum Zwecke der Elektroporation konstruiert, und diese findet keine Erwähnung. Tanaka et al. ( US 4,894,343 ) offenbaren eine mikrofabrizierte Einrichtung für den Umgang mit Zellen in Mulden, die zu dem Zweck konstruiert wurde, zwei in derselben Zelle angeordnete Zellen zu fusionieren. Ihre Anordnung umfasst ein Array aus in Silizium geätzten Mulden, die dazu konstruiert sind, die Zellen einzufangen und gleichzeitig Flüssigkeit an diesen vorbei durch die Auslässe im Boden der Mulde fließen zu lassen. Jedoch ist die Einrichtung nicht dazu konstruiert, optimal für die Elektroporation zu sein; die vorliegende Erfindung benutzt eine verbesserte Konstruktion.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine mikrofabrizierte Vorrichtung zum Einbringen einer Substanz in eine Zelle geschaffen, die Folgendes aufweist: einen mikrofabrizierten Kanal (22), durch welchen die Zelle in einem Fluid zu einer Stelle, an der sie permeiert werden soll, strömt oder geleitet wird; Mittel zum Einbringen der Substanz in die Zelle; Elektroporationsmittel zum Verursachen von Permeabilität der Zellwand, um dadurch die Substanz in die Zelle eindringen zu lassen; wobei die Elektroporationsmittel, eine erste und eine zweite Elektrode (14, 16) umfassen, die dergestalt angeordnet sind, dass sie bei Anlegen eines Spannungsimpulses in die Zellwand permeieren, wobei der Kanal (22) und die Elektroden (14, 16) charakteristische Abmessungen aufweisen, um den Spannungsimpuls an eine individuelle Zelle anzulegen, und wobei der Kanal den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zelle aufweist oder schmaler ist als die Zelle in ihrem relaxierten Zustand.
Der Kanal ist bevorzugt schmal, zum Beispiel weist er den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zellen auf, welcher typischerweise ungefähr 5 bis 20 μm beträgt. Bevorzugt liegt eine charakteristische Abmessung eines Kanals, durch den oder entlang dessen eine Zelle geleitet wird oder strömt, in der Größenordnung von 50 μm, besonders bevorzugt beträgt sie weniger als 30 μm und ganz besonders bevorzugt weniger als das Vierfache des Durchmessers der Zelle.
In einem flüssigen Medium suspendierte Zellen werden mittels einer Pumpe, Schwerkraftzuführung oder eines anderen geeigneten Fluidumlagerungsmechanismus, zum Beispiel mittels Elektroosmose, in eine Kammer eingebracht, in welcher die Vorrichtung(en) angeordnet ist/sind.
Bevorzugt werden mindestens zwei Elektroden bereitgestellt, so dass die Zelle dergestalt bezüglich der Elektroden angeordnet wird, dass eine Potentialdifferenz angelegt werden kann, um die Zellwand vorübergehend permeabel zu machen.
Es können Mittel bereitgestellt werden, um die Zelle dergestalt festzuhalten oder anzuordnen, dass sie bezüglich der bzw. jeder Elektrode positioniert wird. Ein Vorteil des Anordnens der Zelle besteht darin, dass sie in einem bestimmten Teil eines festgelegten elektrischen Feldes positioniert wird. Folglich kann das elektrische Feld mit größerer Präzision angelegt werden.
Vorteilhafterweise ist ein Nähedetektor aufgenommen, so dass, wenn eine Zelle sich am korrekten Ort in einem festgelegten Teil des elektrischen Feldes befindet, der Spannungsimpuls automatisch angelegt wird. Es können Verarbeitungsmittel einschließlich elektronischer Logik benutzt werden, um diesen Vorgang zu verbessern und auszubauen.
Bevorzugt werden mehrere der zuvor erwähnten Vorrichtungen bereitgestellt und in einem Array angeordnet. Ein Vorteil eines solchen Arrays besteht darin, dass auf viele Zellen parallel eingewirkt werden kann. Dies steigert den Durchsatz.
Ein Array aus Vorrichtungen kann auf einem Halbleitersubstrat, wie zum Beispiel Silizium oder Germanium, ausgebildet werden. Auf das Substrat können Nähedetektoren, Elektroden und Verarbeitungsmittel aufgenommen werden, zum Beispiel in einer anderen Schicht einer integrierten Halbleiterstruktur.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird DNS in lebende Zellen eingebracht, indem die Zellwand durch den Elektroporationsvorgang permeabel gemacht wird. Dann tritt DNS aus dem umgebenden Medium in die Zelle ein. Die Zellen werden in einem Fluid getragen, das unter einem Druck steht, der hinreicht, um die Zellen sich bezüglich der Elektroden bewegen zu lassen. Die Mittel zum Anordnen jeder Zelle in Bezug zu einer Elektrode können eine mechanische oder elektrische Struktur umfassen. Ein Beispiel kann eine zum Beispiel durch Rückseitenätzen eines Siliziumsubstrats ausgebildete Mulde oder muldenartige Struktur sein, in welcher die Zelle angeordnet wird. Am Ausgang der Mulde kann eine netz- oder siebartige Anordnung platziert werden, welche Fluid durchlässt, aber die Zelle daran hindert, die Mulde zu verlassen. Bevorzugt drängt ein am Substrat hergestelltes Druckdifferential Zellen in die muldenartigen Strukturen.
In dem Maße, wie sich mehr und mehr Zellen in Mulden angeordnet befinden, steigt das Druckdifferential, weil weniger Mulden zur Verfügung stehen, durch welche Fluid strömen kann. Dieser höhere Druck neigt dazu, Zellen in die Mulden zu zwingen, da sie sich relativ leicht deformieren. Eine Art und Weise, zu verhindern, dass dies geschieht, besteht darin, eine Angabe über belegte Mulden zu ermitteln, und diese Information dazu zu verwenden, das Druckdifferential zu verringern oder zu erhöhen. Diese Information kann ohne weiteres ermittelt werden, da das Vorhandensein einer Zelle von den Nähedetektoren bekannt ist und ein Zähler in einem Mikroprozessor benutzt werden kann, der jedes Mal hochgezählt wird, wenn eine Mulde belegt wird.
Bevorzugt wird die Vorrichtung aus einem biokompatiblen Material mikrofabriziert. Die mikrofabrizierte Vorrichtung kann einen oder mehrere mikrofabrizierte Kanäle aufweisen. Diese können beispielsweise durch Ätzen in Silizium ausgebildet werden. Die Mulden oder Stellen für das Einbringen von Material können sich an einem Locus in einem Fluidströmungskanal befinden.
Der Kanal ist bevorzugt schmal und weist zum Beispiel den ein- bis fünffachen Durchmesser der zu elektroporierenden Zellen (welcher typischerweise ungefähr 5 bis 20 μm beträgt) auf. Solche schmalen Kanäle sind bei der Elektroporation vorteilhaft, da ein größerer Anteil der Elektroporationsspannung an die Zelle per se angelegt werden kann statt an die Zelle mitsamt etwaiger benachbarter Zellen und der Trägerflüssigkeit. Dies erlaubt es, das von der Zelle erfahrene Feld präzise zu steuern. Bei einer alternativen Ausführungsform kann der Kanal sogar schmaler sein als der Durchmesser der Zelle in ihrem relaxierten Zustand. Bei dieser Ausführungsform deformieren sich Zellen, strömen den Kanal entlang und befinden sich in engerem Kontakt mit den Wänden.
Alternativ hierzu können der Kanal oder die Mulde vergleichsweise breit sein, mit Ausnahme einer Verengung in dem Bereich, an welchem das Einbringen von Material stattfindet. Die Verengung und/oder die Elektroporationselektroden können dergestalt konstruiert werden, dass die Poren, die in der Zellmembran geöffnet werden, um das Einbringen von Material zu erlauben, bevorzugt einer Quelle des Materials zugewandt sind.
Bei einer mikrofabrizierten Einrichtung kann elektronische Logik benutzt werden, um die Amplitude der Elektroporationsspannungsimpulse bzw. -impulssequenz zu steuern. Die Logikschaltungen können in einem halbleitenden Substrat integriert sein, beispielsweise unter Verwendung von CMOS, DMOS oder bipolaren Komponenten, die in einem herkömmlichen Verfahrenszug fabriziert werden. Bevorzugt bildet das Substrat außerdem einen Träger für mikrofabrizierte Kanäle aus. Während der Herstellung des Substrats können Nachbearbeitungstechniken eingesetzt werden, um elektronische Komponenten mit Elektroden in dem Strömungskanal bzw. den Strömungskanälen zusammenzuschalten.
Besonders vorteilhaft ist die Integration einer (zum Steuern der Elektroporationsspannung benutzten) Schalteinrichtung für moderat hohe Spannungen (typischerweise 5 bis 25 Volt, es können jedoch andere Spannungen benutzt werden), da die minimale elektrische Impedanz zwischen dem Schalter und dem Kanal benutzt werden kann, um die Steuerung der Elektroporationsparameter zu verbessern. Ganz besonders bevorzugt ist die Aufnahme eines oder mehrerer kapazitiver Elemente neben dem Schalter, da dies die Fähigkeit zum schnellen Ziehen von Strom verbessert, ohne dass komplexe Schaltungen zur Stromverteilung an den Schalter erforderlich werden. Im Falle der Integration mehrfacher Elektroporationseinrichtungen beispielsweise in einem Array kann dies von besonderem Vorteil sein. Ein Vorteil der vorliegenden Einrichtung besteht darin, dass aufgrund der kleinen Kanäle die Elektroden eng zusammen gebracht werden können und die zum Erreichen von Elektroporation benötigten Spannungen niedrig und leicht zu steuern sind.
Die Aufnahme von elektronischen Komponenten oder Logikschaltungen über eine Technik mit aktivem Substrat ist elegant und besonders nützlich, wenn ein Array oder Arrays aus Elektroporationsvorrichtungen zusammen auf einem gemeinsamen Substrat fabriziert werden. Es besteht die Möglichkeit, solche Komponenten oder Schaltungen zu ersetzen oder zu verbessern, indem an geeigneten Positionen zusätzliche mikroelektronische Komponenten an dem Substrat angebracht werden. Solche Komponenten können über Oberflächenmontage, Chipbonden und Drahtbonden, automatisches Folienbonden oder Höckerbonden angebracht werden. Das Anbringen von Einrichtungen mittels leitenden Haftmitteln ist besonders bevorzugt, da dies thermische Belastungen minimiert, denen die Struktur während ihrer Fabrikation ausgesetzt ist.
Bevorzugte Einrichtungen und Anbringungsmittel und Kondensatoreinrichtungen werden mittels Oberflächenmontage (einschließlich Anbringen durch leitende Haftmittel) oder durch Drahtbonden angebracht. Die zuvor erwähnten Einrichtungen sind besonders bevorzugt, wo das Substrat passiv ist oder Niederspannungskomponenten enthält. Außerdem können auch analoge Verarbeitungsschaltungen, Analog-Digital-Wandler, digitale Signalverarbeitungseinrichtungen, Mikrocomputing- oder Mikrocontrollerelemente und Kommunikationseinrichtungen auf dem Substrat integriert werden. Die letztgenannten Einrichtungen umfassen optische Kommunikationseinrichtungen. Die Integration erleichtert die Verbindung von Verarbeitungs- oder Steuerschaltungen mit externen Prozessoren wie etwa einem Mikroprozessor für die Strömungsregelung mit Rückführung und/oder das Anlegen von Elektroporationsimpulsen.
Bevorzugt wird ein Messfühlermittel bereitgestellt, das im Zusammenspiel mit einer Elektrode und einer gemeinsamen Erdung oder mit einem Elektrodenpaar betrieben wird und einen Kanal oder eine Mulde abfragt, um das Vorhandensein einer Zelle zu ermitteln.
Bevorzugt steuern Steuermittel den Zeitpunkt der Eletroporationsimpulstastung in Zusammenarbeit mit dem Nachweis einer Zelle in der Mulde oder dem Kanal. Zum Beispiel kann ein Mikrocontroller, Impulsgeber oder Automat integriert und dazu benutzt werden, in Reaktion auf ein Signal, das das Vorhandensein einer Zelle anzeigt, den Zeitpunkt des Anlegens und/oder die Amplitude eines Elektroporationsimpulses zu steuern.
Bevorzugt werden Mittel bereitgestellt, die den Zustand oder die Kondition von Zellen im Anschluss an die Transfektion ermitteln und anzeigen, ob eine Zelle unbeeinflusst ist, ob erfolgreich Material in sie eingebracht wurde oder ob die Zelle beschädigt ist. Für diese Aufgabe kann zum Beispiel eine Vorrichtung genutzt werden, wie sie in der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung Nr. WO-A-9402846 (BTG) beschrieben wird. Es ist somit möglich, die Zelle sowohl vor als auch nach einem Materialeinbringungsversuch an einem Locus oder mehreren Loci zu beschreiben und den Erfolg oder Misserfolg statt durch eine absolute Kalibrierung durch den Unterschied bei der Reaktion der Zelle zu ermitteln.
Bevorzugt reagieren die Verarbeitungsmittel auf eine externe Anzeige des Vorhandenseins oder des Zustands einer Zelle in der Nachbarschaft der Elektrode. Von einem Bediener oder automatisch durch eine digitale E/A-Karte in einem gewöhnlichen Mikrocomputer kann ein Trigger bereitgestellt werden. Der Trigger wiederum kann durch Bildverarbeitungsmittel etwa ein Videomikroskopbild des Kanals abgeleitet werden.
Der Nachweis oder die Überwachung der Zellen kann durch ein optisches Mittel erfolgen. Beim Einbringen des Materials kann in die Zellen eine fluoreszierende Komponente eingebracht werden. Dies erlaubt die automatische Fluoreszenzdetektion von behandelten Zellen, beispielsweise durch Verwendung eines Videomikroskops und/oder eines anderen Bildverarbeitungsmittels, um ein erfolgreiches Einbringen nachzuweisen. Diese Daten können benutzt werden, um das Vorhandensein der Zelle in der Elektroporationsvorrichtung zu signalisieren.
Integrierte Komponenten oder Schaltungen und eine zugehörige Mulde oder ein zugehöriger Kanal in der bzw. jeder Elektroporationsvorrichtung sind mit einer eindeutigen Adresse versehen, und es ist ein Kommunikationsmittel bereitgestellt, das Kommunikationsübertragungen an einen und von einem Mikroprozessor ermög licht. Bevorzugt erfolgt die Kommunikation über eine gemeinsame Verbindungsstrecke bzw. einen gemeinsamen Bus.
In dem Falle, dass es sich bei dem Trägersubstrat um Silizium handelt, besteht die Möglichkeit, die mit den Zellen umgehenden Strukturen unter Verwendung geeigneter Infrarotstrahlung durch das Silizium hindurch zu sehen. Bei einer solchen Ausführungsform muss bei der Anordnung der Strukturen darauf geachtet werden, eine Verdeckung des Strahlungswegs zu vermeiden. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass die Einrichtung kein Glied benutzen muss, das im normalen sichtbaren Band optisch durchlässig ist, sondern ein infrarotdurchlässiges Glied benutzen kann. Da Infrarotstrahlung jegliche Fluoreszenzdetektion unterbinden kann, sollte eine etwaige Infrarotdetektion an einer von der Fluoreszenzdetektion separaten Stelle durchgeführt werden.
Im Anschluss an das Einbringen des Materials in die Zellen wird bevorzugt ein Sortiermittel bereitgestellt, um Zellen abhängig von dem Ergebnis des Einbringens entweder in eine Sammelströmung oder eine Ausschussströmung zu leiten. Eine solche Sortierung lässt sich mittels einer Anzahl von Methoden erzielen, darunter: Elektrophorese, Dielektrophorese, „optische Pinzetten" und/oder gerichtete Druckimpulse.
Es können Mittel bereitgestellt werden, um Zellen zu zerstören, die nicht auf erwünschte Weise behandelt worden sind. Eine solche Zerstörung lässt sich erzielen, indem die Zelle(n) getötet, jedoch im Wesentlichen physikalisch intakt gelassen werden, oder indem die Zelle(n) physikalisch gespaltet werden. Bevorzugte Mittel hierfür umfassen: elektrische Spaltung der Zelle, im Wesentlichen durch übermäßig starke Elektroporation, Einbringen eines Zellauflösungsagens oder schnelles lokales Erwärmen der Zelle oder des Fluidmediums in der Nachbarschaft der Zelle. Zu diesem Zwecke können ein Mikroheizelement oder ein gerichteter, gepulster Infrarotstrahler benutzt werden.
In Fällen, bei denen die Elektroporationsvorrichtung über elektrische Verbindungen verfügt, die über oder rings um sie geführt sind, beispielsweise in einem hochgradig integrierten aktiven Substrat, kann es wünschenswert sein, elektrische Schutzbänder zu schaffen, die auf geeignete Weise rings um Abschnitte der mit dem Fluid umgehenden Struktur angeordnet sind, so dass ein an das Fluid angelegtes elektrisches Feld hinreichend abgesenkt wird, damit schädliche Auswirkungen auf in dem Kanal strömende Zellen auf einem Minimum gehalten werden.
In bearbeitete Schichten des Substrats können optische Komponenten wie etwa Wellenleiteroptik integriert werden, die bevorzugt in ähnlichen Prozessen fabriziert werden wie jene, die die Fluidkanäle definieren. Solche optische Komponenten können Wellenleiter zum Abfragen der Zelle oder des Trägermediums in dem Fluidkanal umfassen. Diese können eine Abklingfeldkopplung (engl. „evanescent field coupling") umfassen. Alternativ hierzu kommunizieren optische Komponenten mit externen Signalverarbeitungsmitteln. Optische Komponenten umfassen Strukturen, die eine Schnittstelle zu Lichtwellenleiterelementen wie etwa geätzten Silizium-V-Gräben bilden.
Arrays aus Vorrichtungen können gemeinsame externe Anschlüsse für die Zufuhr von Fluiden und Zellen und gemeinsame Stromversorgungen nutzen und können unter Verwendung geeigneter Videomikroskopiemittel parallel abgebildet werden.
Ausführungsformen der Erfindung werden nun, lediglich beispielhaft, anhand der folgenden Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
1 eine diagrammatische Gesamtansicht einer Ausführungsform einer Vorrichtung,
2 eine allgemeine Gesamtansicht eines Substrats, das ein Array aus zu der in 1 gezeigten Vorrichtung alternativen Vorrichtungen enthält,
3 eine Schnittansicht durch die Vorrichtung von 2,
4 und 5 sind Schnitte durch alternative Fluidströmungs- und Elektrodenanordnungen, die Nähedetektoren zeigen, und
6 eine Gesamtansicht eines Systems, das die Erfindung enthält.
Es wird auf die Figuren Bezug genommen. In 1 wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung gezeigt, die ein Substrat 10 aufweist, welches aus Halbleitermaterial wie etwa Silizium oder einem Isolator wie etwa Glas, Keramik oder Plastik ausgebildet ist. Falls es aus einem Halbleitermaterial ausgebildet ist, können optional aktive CMOS-, DMOS- oder bipolare Einrichtungen aufgenommen sein, die zusammengeschaltet sind. In der Einrichtung sind Kanäle 22 fabriziert, um die Strömung aus Fluid und Zellen zu leiten. Ein Elektrodenpaar 16a und 16b ist über einen Schalter, der von der aktiven Einrichtung aktiviert wird, an eine (nicht gezeigte) Spannungsversorgung angeschlossen. Das Elektrodenpaar 16a und 16b ist bevorzugt aus vergoldeten Säulen ausgebildet. Es ist das Elektrodenpaar, das, wenn es mit einem Spannungsimpuls unter Strom gesetzt wird, die Zellwand permeabel macht, um das Einbringen einer Substanz zuzulassen. Optional führen die Elektroden 16a und 16b die Funktion des Nachweisens des Vorhandenseins einer Zelle aus, beispielsweise durch Variationen der Kapazität zwischen den Elektroden. Es können ein oder mehrere weitere Elektrodenpaare 14a, 14b bereitgestellt werden, um Zellen nachzuweisen oder Elektroporationsimpulse an sie anzulegen. Wie erforderlich werden durch Bahnen 23 und Kontaktlöcher 25 Kontakte zu den Elektroden hergestellt. Es versteht sich, dass andere Mittel für den Nachweis von Zellen benutzt werden können, zum Beispiel können diese einen optischen Detektor umfassen.
Ein Fluid, das durch den Kanal 22 strömt, erlaubt die Durchleitung von in dem Fluid getragener Zellmaterie durch die Elektrodenkonfiguration. Das Fluid kann entlang der Oberfläche des Substrats 10 in mehrere andere (nicht gezeigte) Kanäle geleitet werden, von wo aus es zur weiteren Verarbeitung zu einem größeren Kanal oder Kapillarrohr geleitet wird.
Die mikroelektronische Logikeinrichtung 18 kann integral mit dem Substratmaterial 10 ausgebildet oder an dieses gebondet werden. Von der Einrichtung 18 ausgehende Verbindungen können über Leitkleber oder über Löthügel 20, wie sie etwa beim Höckerbonden erzielt werden, hergestellt sein. Eine (nicht gezeigte) Abdeckplatte schließt den Kanal 22. Zum Nachweis oder zur Analyse von Zellen in dem Kanal, beispielsweise um nachzuweisen, ob Material erfolgreich in die Zelle eingebracht worden ist, kann optional ein optisches System bereitgestellt sein, das eine Quelle 29 und einen Detektor 31 umfasst. Alternativ hierzu kann die optische Abfrage mittels Lichtleitern erfolgen, die auf oder an dem Substrat befestigt sind. Fluidanschlüsse an den Kanal können über Kapillaren 28, die in aufnehmende Gräben eingesetzt sind, oder durch andere auf dem Fachgebiet bekannte Fluidanschlussmittel hergestellt werden.
Alternativ hierzu können, wie in 2 gezeigt, Kanäle durch das Substrat ausgebildet werden. Bei der Ausführungsform, die in 2 gezeigt wird, in welcher gleiche Merkmale wie in 1 die gleichen Bezugszeichen tragen, werden Zellen in einer muldenartigen Struktur 15 angeordnet, und an alle Zellen wird parallel eine Potentialdifferenz angelegt. Der Vorteil der in 2 gezeigten Ausführungsform besteht darin, dass eine sehr große Anzahl von Zellen zu im Wesentlichen demselben Zeitpunkt transfektiert werden kann. Um die Benennung zu vereinfachen, werden kleine Objekte hier als Zellen bezeichnet. Der Begriff „Zelle" oder „Zellen" ist jedoch so zu verstehen, dass er auch kleine unbelebte Objekte wie etwa Partikel umfasst.
Bei der in 2 und im Querschnitt in 3 gezeigten Ausführungsform sind Kanäle durch ein Substrat 10 ausgebildet, die auf mindestens einer Seite eine muldenartige Struktur 15 aufweisen, wobei die Kanäle am Grund der Mulde von einer solchen Abmessung sind, dass jede in die Mulde eintretende Zelle, statt durch den Kanal weitergeleitet zu werden, in der Zelle zurückgehalten wird, wodurch der Kanal im Wesentlichen blockiert wird. Das Substrat steht mit zwei Lösungen in Kontakt, eine über und die andere unter ihm, die, mit Ausnahme des Kontaktpunkts in den Kanälen, voneinander elektrisch isoliert sind. In den einzelnen Mulden werden von der Lösung über der jeweiligen Mulde Zellen angeordnet, beispielsweise durch eine am Substrat anliegende Druckdifferenz, die eine Strömung durch die Kanäle verursacht. Die Belegung der Mulden kann anhand der am Substrat anliegenden Druckdifferenz, der Strömungsrate durch die Kanäle, der Leitfähigkeit durch das Substrat (die ungefähr gleich der Anzahl offener Kanäle ist) etc. gemessen werden. Diese Messung kann außerdem benutzt werden, um die anordnende Kraft dergestalt zu steuern, dass die Zellen nicht übermäßig deformiert werden. Wenn die erforderliche Mindestbelegung der Mulden erreicht wird, können die Zellen durch Anlegen eines Spannungsimpulses zwischen den zwei Lösungen elektroporiert werden. Das in die Zellen einzubringende Material kann etwa in der Lösung auf der Seite des Sub strats angeordnet werden, die der Seite gegenüberliegt, an welche die Zellen abgegeben werden, und die Polarität des Elektroporationsimpulses kann dergestalt gewählt werden, dass sie die Zellmembran öffnet und Material bevorzugt auf dieser Seite eindringen lässt. In diesem Falle muss die von der Vorderseite beim Anordnen der Zellen durchgesaugte Lösung aus dem Verteiler entfernt und durch eine das einzubringende Material enthaltende Lösung ersetzt werden. Alternativ hierzu könnten die Zellen in einem das einzubringende Material enthaltenden Medium suspendiert werden, und die Poration könnte dergestalt eingerichtet werden, dass sie bevorzugt von dieser Seite aus arbeitet. Wenn der Porationsvorgang abgeschlossen ist, kann eine Umkehr der am Substrat anliegenden Druckdifferenz die Zellen aus der Mulde entfernen, und es kann veranlasst werden, dass sie (durch nicht gezeigte Kanäle) aus der Vorrichtung heraus strömen. Optional kann die Anordnung der Zellen in den Mulden durch Impulse von einem geformten beweglichen Plattenglied über dem Substrat erreicht werden, das agiert, um die Zellen in die Mulden zu drängen; in 3 zum Beispiel mittels einer geformten deformierbaren Abdeckplatte 29.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Elektroden 16 auf dem Substrat selbst befestigt, zum Beispiel auf der oberen und der unteren Fläche, welche agieren können, um die Elektroporation auszuführen. Die Elektrode auf der oberen Fläche kann in eine Anzahl von individuellen Elektroden, eine für jede Mulde oder Untergruppe aus Mulden in dem Array, unterteilt sein, so dass eine Zelle in einer individuellen Mulde (oder eine Zellengruppe in einer Gruppe aus Mulden) individuell elektroporiert werden kann. Die Elektroden können auch benutzt werden, um das Vorhandensein einer Zelle in einer gegebenen Mulde nachzuweisen, wobei dann die Koordinaten dieser Mulde notiert und die Gesamtanzahl von Zellen gezählt werden, wobei das Zählergebnis benutzt wird, um die Parameter (Span nung oder Strom und Zeit) des Elektroporationsimpulses zu steuern. Falls notwendig, können Impulse nur an diejenigen Mulden angelegt werden, in denen sich eine Zelle befindet. Dieses Konzept unterscheidet sich von dem von Tanaka et al. ( US 4,894,343 ) offenbarten Konzept, da in deren Vorrichtung in jeder Mulde Elektrodenpaare bereitgestellt sind und Strom im Wesentlichen parallel zur oberen Fläche des Substrats zwischen dem Paar in der Mulde geleitet wird (deren 11). Diese Konstruktion eignet sich für deren erklärtes Ziel, zwei zusammen in der Mulde vorhandene Zellen zu fusionieren. Das Elektrodenmuster der vorliegenden Erfindung, bei dem das Feld im wesentlichen senkrecht zu der Substratebene durch die Kanäle verläuft, führt dazu, dass die Zelle ein stärkeres Feld erfährt, und daher zu einer höheren Effizienz der Elektroporation. Im Gegensatz zu Tanaka et al., die spezifizieren, dass ein Siliziumwafer für die Fabrikation ihrer Vorrichtung essentiell ist, kann bei der vorliegenden Erfindung jedes beliebige Substrat benutzt werden, durch welches Kanäle verlaufen und welches den Kontakt zwischen den Zellen auf seiner Oberfläche und der das einzubringende Material enthaltenden Lösung erlaubt. Daher können auch andere Materialien wie etwa Glas und Keramik, synthetisches Plastikmaterial oder mit einem Isolator beschichtetes Metall benutzt werden.
4a zeigt einen Schnitt durch die mikrofabrizierte Einrichtung 2, die zum Beispiel aus geätztem Glas, Silizium oder geformtem Plastik hergestellt ist und einen Strömungskanal 40 aufweist. Der Kanal weist typischerweise den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zellen auf, die durch ihn strömen, um transfektiert zu werden. Bei dieser Ausführungsform werden die Zellen in einem Medium getragen. Es sind Einlass- und Auslass-Anschlussmittel (Vertiefungen, Steckanschlüsse, Hülsen etc.) 60 bereitgestellt, die den Anschluss von Kapillaren oder anderen hohlen Verbindungen 80 an den Strömungskanal ermöglichen. In Kontakt mit dem Kanal sind eine oder mehrere Elektrodenpaare 100, 120 bereitgestellt, die elektrische Verbindungen über Bahnen 140 und Kontakte 160 an externe Einrichtungen aufweisen. Die Elektroporationspotentiale werden von nicht gezeigten Stromversorgungen bereitgestellt. Alternativ hierzu kann ein Elektrodenpaar eingangs in einem Nachweismodus konfiguriert und, wenn eine Zelle nachgewiesen wird, in den Elektroporationsmodus umgeschaltet werden. Für sequentielle Potentialbehandlungen kann eine Reihe aus Elektrodenpaaren bereitgestellt werden. Die Elektroden können außerdem dazu benutzt werden, Eigenschaften der Zellen zu messen.
Wie in 4b gezeigt, können die Elektroden anstelle diskreter Paare eine gemeinsame Erdungselektrode 200 benutzen. Es kann eine Elektroporationselektrode 240 benutzt werden, die dergestalt geformt ist, dass sie das Feld in Richtung der Zelle oder eines bestimmten Bereichs der Zelle konzentriert. Die Nachweiselektroden 220 können für maximale Empfindlichkeit oder einfach eben geformt sein. Wie in 4c kann der Durchmesser des Kanals 40 insgesamt oder teilweise nahe an dem Durchmesser der Zellen liegen oder sogar kleiner als dieser sein, um einen engen Kontakt zwischen den Elektroden und der Zellwand zu ergeben.
Bei allen obigen Ausführungsformen können sich Elektrodenpaare auf derselben Seite des Kanals oder auf gegenüberliegenden Seiten befinden.
4d zeigt eine Ausführungsform, bei welcher Zellen 180 aus einem nicht gezeigten Vorratsreservoir in einem Trägermedium ohne das einzubringende Material in den Strömungskanal 40 strömen gelassen werden; die Einrichtung 20 weist eine als T gezeigte Vereinigung 300 mit einem zweiten Kanal 320 für die Zufuhr des Materials 340 auf. Bei den Elektroden 380a, b und optional 400 und 420 handelt es sich um Elektroporationselektroden. Wiederum kann es sich hierbei um diskrete Paare oder um Elektroden mit gemeinsamer Erdung handeln. Wiederum kann es sich bei der Stromversorgung für die Elektroporation um ein einzelnes, für eine gegebene Zeitdauer an jedes Elektrodenpaar angelegtes Potential oder um eine Sequenz aus an ein oder mehrere Elektrodenpaare angelegten Potentialen handeln. Das Material 340 kann kontinuierlich in den Kanal 40 strömen gelassen werden, oder es kann als Schwall nur dann angewendet werden, wenn eine Zelle vorhanden ist, so dass der Schwall während der Elektroporation eine Hülle bildet. Um dies zu erreichen, können stromaufwärts der Vereinigung angeordnete Nachweiselektroden 360 die Injektion des Materials 340 steuern; die Elektroden 360 können auch den Elektroporationsvorgang steuern. Wie in 4b können die Elektroden dergestalt geformt sein, dass der Elektroporationsvorgang verbessert wird. Die Position der Zelle kann unter Verwendung von (diagrammatisch als 430 gezeigten) Detektoren in verschiedenen Stadien des Vorgangs optisch überwacht werden. Die Überwachung nach dem Vorgang, um zum Beispiel zu prüfen, ob zusammen mit dem gewünschten Material ein fluoreszierender Farbstoff in die Zelle eingebracht worden ist, ermöglicht es, die Zellen entsprechend Erfolg oder Misserfolg des Einbringens zu sortieren.
Es können zusätzliche Seitenströmungskanäle bereitgestellt werden, um der Nachbarschaft der Zelle zusätzliche Materialien zuzuführen, die die Abgabe des Materials in die Zelle unterstützen. Zum Beispiel kann durch Einbringen einer geeigneten Chemikalie lokalisierte chemische Poration erzielt werden. Diese Einbringung kann transient und in mikrofluidischen Kanälen unter strikterer Kontrolle sein, wodurch sich ein Vorteil gegenüber dem Stand der Technik ergibt. Die Kontrolle der zusätzlichen Einbringung kann durch Elektroden oder optische Mittel erreicht werden.
4e zeigt eine zu den Anordnungen in 4a bis d alternative Anordnung, bei welcher an die Zellen angelegter Druck den Vorgang der Einbringung des Materials unterstützt. Die Zelle 180 wird in einem Trägermedium mitgeführt und tritt entlang eines Strömungskanals 4 in die Vorrichtung ein. Aus dieser Strömung wird die Zelle von einer sekundären Strömung entlang der Kanäle 52 abgefangen und in der Mulde 50 lokalisiert. Von einer durch den Druckabfall der Strömung zwischen den Kanälen 4 und 52 erzeugten Kraft oder, falls die Zelle dicht an der Mulde 50 anliegt, von einer statischen Druckdifferenz zwischen diesen Kanälen wird die Zelle gegen die Mündung des das Material 34 enthaltenden Kanals 54 lokalisiert. Alternativ hierzu kann die Zelle durch eine physikalische Kraft von einem Druckkolben oder einem deformierbaren Abschnitt in der Deckenwand 55 des Kanals 4 am Platz gehalten werden. Ein an das Material 34 im Kanal 54 angelegter Druckimpuls zwingt daraufhin das Material in die Zelle. Der Impuls kann zum Beispiel durch Deformation einer Membran 60 auf einer Kammer 56 angelegt werden. Das große Flächenverhältnis von 60 und der Mündung des Kanals 54 erzeugen ohne weiteres einen großen plötzlichen Druck für die Injektion.
Die Einbringung kann durch einen Elektroporationsimpuls unterstützt werden, der zwischen einer in Kontakt mit dem Material 34 befindlichen Elektrode und einer weiteren, mit dem Trägermedium in Kanal 4 in Kontakt befindlichen Elektrode angelegt wird.
Es können zusätzliche und/oder optionale Elektroden 62, 64 bereitgestellt werden, um die Zellmembran rings um die Öffnung des Kanals 54 zu elektroporieren. Die Elektroden 62, 64 können außerdem oder alternativ dazu benutzt werden, um das Vorhandensein der Zelle nachzuweisen, um den Vorgang in Gang zu setzen oder zu steuern. Um das Obige zu erzielen, können zusätzlich oder alternativ hierzu Elektroden an anderen Positionen platziert werden, wie etwa an den Seitenwänden oder rings um die Oberseite der Mulde 50, wie an den Positi onen 66, 68 gezeigt.
5 zeigt eine Hüllströmungsanordnung, die benutzt wird, um zu verhindern, dass Zellen an den Seitenwänden haften, und um deren Verhalten unter Verwendung von Fluidströmung zu steuern. Die Zellen werden durch einen Strömungskanal 100 in die Einrichtung eingebracht, der sich mit einem oder mehreren weiteren Kanälen 102 vereinigt, um eine umhüllende, laminare Strömung bereitzustellen; die Grenzflächen zwischen den Strömungen sind diagrammatisch bei 104 gezeigt. Daraufhin führen Elektroden 106 mit Anschlüssen 108 die Elektroporation aus. Diese Elektroden können vorteilhafterweise dergestalt geformt werden, dass sie das Feld konzentrieren und/oder die Poration lokalisieren. Es können weitere Elektrodenpaare oder andere, oben beschriebene, Varianten aufgenommen werden. Dann kann, wie oben beschrieben, das in die Zellen einzubringende Material 34 in die den Kanal 100 hinunterströmende Zellströmung eingebracht werden, oder sie kann alternativ hierzu in die Hüllströmung eingebracht werden, wobei optional weitere Kanäle 110 benutzt werden. Das Material 34 kann in Form von Schwallen 114 injiziert werden, welche die Zellen umgeben; die Steuerung der Injektion von 34 kann wie zuvor durch Nachweiselektroden 112 erfolgen. Der Erfolg der Einbringung von Material in die Zellen kann wie oben unter Verwendung von Elektroden oder optisch (122) überwacht werden; es kann mehr als ein Auslass 116, 118 bereitgestellt werden, um die Zellen entsprechend der Ausgabe der Überwachung zu sortieren. Solche Sortiervorgänge sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Es versteht sich, dass oben zwar eine Vorrichtung mit einer einzelnen Stelle beschrieben worden ist, die Erfindung jedoch darauf abzielt, entweder einfache oder mehrfache Vorrichtungen abzudecken, die möglicherweise – je nachdem, was notwendig oder vorteilhaft ist – mit separaten oder gemeinsamen fluidischen und elektrischen Anschlüssen in einem Array auf einem gemeinsamen Substrat angeordnet sind.
Anhand aller Figuren sowie unter spezifischer Bezugnahme auf 6, die eine diagrammatische Ansicht eines Systems zeigt, das die in 2 und 3 gezeigte Ausführungsform enthält, wird jetzt der erfindungsgemäße Ablauf beschrieben.
Es wird das Substrat 10 gezeigt, in welchem die Mulden 15 diagrammatisch veranschaulicht sind. Ein Adressbus 17 stellt ein Mittel zum Verbinden der Datenleitungen von den Elektroden 16 zu einem Mikroprozessor 50 bereit. Wenn eine Zelle in der Mulde 15 vorhanden ist, was von den Elektroden 16 nachgewiesen wird, wird ein dies anzeigendes Signal über den Adressbus 17 an den Mikroprozessor 50 gesendet. Eine separate Funktion, die von dem Mikroprozessor ausgeführt wird, zählt jedes Mal, wenn eine Zelle in einer Mulde 15 nachgewiesen wird, einen Zähler hoch. Unter Verwendung einer festgelegten Verweistabelle und/oder eines Algorithmus sendet der Mikroprozessor auf der Leitung L1 ein Signal an die Pumpe 52. Die Pumpe kann durch ein geeignetes Druckaufbaumittel oder einen beliebigen geeigneten Mechanismus zum Umlagern von Fluiden, wie etwa elektrostriktive Mittel oder Elektroosmose, ersetzt werden. Dieses Signal variiert den Druck, der von der Pumpe 52 auf das in der Vorrichtung vorhandene Fluid angelegt wird. Der Grund dafür, dass der Fluiddruck variiert wird, besteht darin, dass, je mehr Zellen in die Mulden 15 eindringen, desto weniger Druck erforderlich ist, um Zellen in die verbleibenden freien Zellen zu treiben. Falls der Druck unverändert gehalten würde, würde aufgrund des Anstiegs der Impedanz in dem Maße, wie die Mulden belegt werden, der Druck auf einer Seite des Substrats ansteigen, und dies würde dazu neigen, die Zellen durch die Mulden hindurch zu drängen. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann ein sehr feines Netz (nicht gezeigt) oder ein anderes restriktives Mittel auf die Rückwand der Mulden angewendet werden, durch welches Fluid strömen, aber keine Zellen durchgehen können. Am Ende eines Zyklus kann das restriktive Mittel bewegt oder entfernt werden, um so zuzulassen, dass die Zellen durch die Mulden durchgehen und eine neue Ladung von Zellen eingebracht wird. Die Zellen werden in einem Reservoir 54 aufbewahrt und über ein Ventil 56 eingebracht, welches von dem Mikroprozessor 50 gesteuert wird.
Das Verfahren wird nun unter allgemeiner Bezugnahme auf alle Figuren beschrieben. Eine Zelle 18 wird in die Mulde 15 geleitet, und ihr Vorhandensein wird von Nähedetektoren nachgewiesen. Ein Signal wird an einen Zähler im Mikroprozessor 50 gesendet. Der Zähler wird hochgezählt, und der darin gespeicherte Wert kann benutzt werden, um einen oder mehrere Systemparameter zu modifizieren, zum Beispiel den Pumpendruck. Daraufhin erfolgt die Elektroporation entweder an der individuellen Zelle oder gleichzeitig mit einer oder mehreren weiteren Zellen.
Die Erfindung wurde lediglich beispielhaft beschrieben. Es versteht sich, dass Abwandlungen an den Beispielen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Mikrofabrizierte Vorrichtung zum Einbringen einer Substanz in eine Zelle, die Folgendes aufweist: einen mikrofabrizierten Kanal (22), durch welchen die Zelle in einem Fluid zu einer Stelle strömt oder geleitet wird, an der sie permeiert werden soll; Mittel zum Einbringen der Substanz in die Zelle; Elektroporationsmittel zum Verursachen von Permeabilität der Zellwand, um dadurch die Substanz in die Zelle eindringen zu lassen; wobei die Elektroporationsmittel eine erste und eine zweite Elektrode (14, 16) umfassen, die so angeordnet sind, dass sie bei Anlegen eines Spannungsimpulses in die Zellwand permeieren, wobei der Kanal (22) und die Elektroden (14, 16) charakteristische Abmessungen zum Anlegen des Spannungsimpulses an eine individuelle Zelle aufweisen, und wobei der Kanal den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zelle aufweist oder schmaler ist als die Zelle in ihrem relaxierten Zustand.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Kanal den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zelle aufweist und der Durchmesser der Zelle ungefähr 5 bis 20 μm beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die charakteristischen Abmessungen des mikrofabrizierten Kanals (22) in der Größenordnung von bis 50 μm liegen und der Kanal besonders bevorzugt weniger als 30 μm misst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die charakteristischen Abmessungen des Kanals weniger als das 4-fache des Durchmessers der Zelle betragen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Spannungsimpuls automatisch an die Zelle angelegt wird, wenn sich die Zelle an der Permeationsstelle befindet.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche Folgendes aufweist: eine Pumpe zum Lenken von Zellen an einen Ort, an dem ein Spannungsimpuls angelegt wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Substanz in dem Fluid vorhanden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Mittel ferner einen zweiten Kanal aufweisen, der mit dem ersten Kanal in Fluidverbindung steht, durch welchen ein zweites Fluid in den ersten Kanal strömt oder geleitet wird, wobei das zweite Fluid die in die Zelle einzubringende Substanz umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 8, welche ein Mittel zum Steuern des Einbringens der Substanz in den ersten Kanal aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei zum Einbringen der Substanz in den ersten Kanal eine Pumpe bereitgestellt ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Mittel zum Festhalten oder Anordnen einer Zelle an einer gewünschten Position bereitgestellt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das Mittel zum Festhalten oder Anordnen der Zelle eine muldenartige Struktur ist, die an einem Locus im ersten Kanal bereitgestellt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei die Zelle in Kontakt mit den Kanalwänden festgehalten oder angeordnet wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche einen Nähedetektor aufweist, der so angeordnet ist, dass er einen Spannungsimpuls auslöst, wenn eine Zelle korrekt angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der bisherigen Ansprüche, welche auf einem Halbleitersubstrat ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei das Halbleitersubstrat Silizium umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mittel zum Einbringen der Substanz in die Zelle eine Spritze aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche Mittel zum Ermitteln des Zustands oder der Kondition der Zelle im Anschluss an das Einbringen der Substanz aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 18, abhängig von Anspruch 16, wobei das Mittel zum Ermitteln des Zustands oder der Kondition einer Zelle einen optischen Sensor und eine Infrarotquelle aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei das Mittel zum Ermitteln des Zustands oder der Kondition einer Zelle Fluoreszenzdetektion aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die Sortiermittel aufweist, die so angeordnet sind, dass sie transfektierte Zellen zu einem ersten Behältnis und nicht transfektierte Zellen zu einem zweiten Behältnis leiten.
Mehrere Vorrichtungen nach Anspruch 1, die zu einem Array angeordnet sind.
Verfahren zum Einbringen einer Substanz in eine Zelle, das folgende Schritte umfasst: Leiten der Zelle in einem Fluid entlang eines mikrofabrizierten Kanals (22) an eine Permeationsstelle; Verursachen, dass die Zellwand permeabel wird, um dadurch die Substanz in die Zelle eindringen zu lassen; Gegeneinanderdrängen der Substanz und der Zelle, so dass die Substanz in die Zelle eindringt, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle durch Elektroporation permeabel gemacht wird, indem sie einem Spannungsimpuls ausgesetzt wird, wobei der Spannungsimpuls an eine individuelle Zelle an der Permeationsstelle angelegt wird, und wobei der Kanal den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zelle aufweist oder schmaler ist als die Zelle in ihrem relaxierten Zustand.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Spannungsimpuls automatisch angelegt wird, wenn sich die Zelle an einer gewünschten Position befindet, um permeiert zu werden.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei der Kanal den ein- bis fünffachen Durchmesser der Zelle aufweist und der Durchmesser der Zelle ungefähr 5 bis 20 μm beträgt.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei die charakteristischen Abmessungen des mikrofabrizierten Kanals (22) in der Größenordnung von bis zu 50 μm liegen und der Kanal besonders bevorzugt weniger als 30 μm misst.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei die charakteristischen Abmessungen des Kanals weniger als das 4-fache des Durchmessers der Zelle betragen.