DE60026561T2

DE60026561T2 - Suppressorzellen zur prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen

Info

Publication number: DE60026561T2
Application number: DE60026561T
Authority: DE
Inventors: Kevin Ellicott City MCINTOSH; Elena Baltimore KLUSHNENKOVA
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-10
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2020-10-11
Also published as: WO2001026470A1; ES2261250T3; AU775647B2; DE60026561D1; AU1077801A; US6281012B1; DK1220611T3; EP1220611A1; EP1220611B1; JP2003511398A; US6685936B2; ATE319312T1; US20020034504A1; CA2382737A1; CY1106437T1; PT1220611E; EP1220611A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Hemmung einer Immunantwort auf ein Alloantigen und ferner die Hemmung und/oder Verhinderung der Reaktivierung von vorher aktivierten T-Zellen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Gebiet der Verhinderung, der Verringerung oder Behandlung einer Immunantwort, die durch Immuneffektorzellen gegenüber fremdem Gewebe und/oder Zellen und/oder Organen hervorgerufen wird. Die Erfindung betrifft ferner die Verhinderung, Verringerung oder Behandlung einer Transplantatabstoßung und/oder einer Graft-versus-host-Reaktion.
Hintergrund der Erfindung
Bei "Toleranz" handelt es sich um den erworbenen Mangel einer spezifischen Reaktionsfähigkeit auf ein Antigen, gegen das es normalerweise zu einer Immunantwort kommen würde. Typischerweise muss zum Induzieren von Toleranz eine Belastung mit einem Tolerierungsantigen erfolgen, die zum Abtöten oder zur funktionellen Inaktivierung bestimmter Lymphozyten führt. Eine vollständige Toleranz ist durch das Fehlen einer nachweisbaren Immunantwort gegenüber einer zweiten antigenen Belastung gekennzeichnet. Eine mengenmäßige Verringerung einer Immunantwort ist typisch für eine partielle Toleranz.
Ungünstigerweise unterscheidet das Immunsystem nicht zwischen vorteilhaften Eindringlingen, wie transplantierte Gewebe, und schädlichen Eindringlingen, so dass das Immunsystem transplantierte Gewebe oder Organe abstößt. Die Abstoßung von transplantierten Organen wird in erheblichem Maße durch im Wirt vorhandene alloreaktive T-Zellen vermittelt, die Donor-Alloantigene oder Xenoantigene erkennen.
Um eine Immunantwort gegen ein Transplantat zu verhindern oder zu verringern, werden Patienten derzeit mit starken immunosuppressiven Arzneistoffen behandelt. Die Infusionsverabreichung von Arzneistoffen, die eine T-Zellen-Immunantwort verhindern oder unterdrücken, führt bei den behandelten Personen zu einer Hemmung der Transplantatabstoßung, kann aber auch zu einer allgemeinen Immunosuppression, Toxizität und aufgrund von opportunistischen Infektionen sogar zum Tode führen. Aufgrund der Toxizität und der unvollständigen Reaktionsrate auf eine herkömmliche Behandlung von Abstoßungsreaktionen von Spendergewebe werden alternative Wege benötigt, um Patienten zu behandeln, die die derzeitigen Verfahrensweisen bei der Arzneistofftherapie nicht aushalten oder darauf nicht reagieren.
WO-A-99/47163 beschreibt Verfahren zur Verringerung einer Immunantwort gegen ein Alloantigen unter Verwendung von mesenchymalen Zellen.
Demzufolge besteht ein Bedürfnis zur Verhinderung und/oder Verringerung einer unerwünschten Immunantwort eines Wirts gegen ein Transplantat durch Immuneffektorzellen als ein Verfahren, um eine Abstoßung von Spendergewebe durch den Wirt abzuwenden. Ferner wäre ein Verfahren von Vorteil, mit dem eine unerwünschte Immunantwort durch ein Spendergewebe gegen ein Empfängergewebe, bekannt als Graft-versus-host-Krankheit, beseitigt oder verringert werden kann.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs) alloaktivierte T-Zellen induzieren können, so dass sie für allogene Reaktionen suppressiv werden können, und dass humane Suppressorzellen, die gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 erhalten worden sind, bei Transplantationen verwendet werden können, um eine Antwort durch das Immunsystem zu verbessern, so dass eine Immunantwort auf ein oder mehr Antigene verringert oder beseitigt werden kann.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung humaner Suppressor-T-Zellen gemäß der Definition in Anspruch 1 bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verringerung oder Unterdrückung einer Immunantwort, die durch T-Zellen, die auf ein Alloantigen, insbesondere auf allogenes Gewebe, Organe oder Zellen, reagieren, hervorgerufen worden ist, wobei die Immunantwort durch die in vitro-Verwendung der Suppressor-T-Zellen gemäß Anspruch 4 verringert oder unterdrückt wird. Die Suppressor-T-Zellen können gegenüber den T-Zellen autolog sein (vom gleichen Wirt erhalten) oder sie können gegenüber den T-Zellen allogen sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung dieser Zellen entsprechend den Ansprüchen 6–13 bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Verhinderung der Restimulation von aktivierten T-Zellen (aktiviert gegen ein Alloantigen, insbesondere gegen ein allogenes Organ, Gewebe oder Zellen) durch Inkontaktbringen von aktivierten T-Zellen mit Suppressor-T-Zellen in einer Menge, die eine anschließende T-Zellreaktion auf ein fremdes Antigen verhindert und/oder verringert. Die verwendeten mesenchymalen Stammzellen können gegenüber den T-Zellen autolog sein oder können gegenüber den T-Zellen allogen sein. Vorzugsweise sind die mesenchymalen Stammzellen gegenüber den T-Zellen autolog.
Ferner wird die Verwendung der Suppressor-T-Zellen zur Unterdrückung oder Besserung einer Immunantwort gegen ein Transplantat (Gewebe, Organ, Zellen und dergl.) beschrieben, indem man dem Transplantatempfänger Suppressor-T-Zellen in einer Menge verabreicht, die eine Unterdrückung oder Besserung einer Immunantwort gegen das Transplantat bewirkt. Die Suppressor-T-Zellen können gegenüber dem Transplantatempfänger autolog sein oder die Suppressor-T-Zellen können gegenüber dem Transplantatempfänger allogen sein. Vorzugsweise sind die Suppressor-T-Zellen gegenüber dem Transplantatempfänger autolog.
Ferner wird ein Verfahren beschrieben, das das Inkontaktbringen des Empfängers von Spendergewebe mit autologen Suppressor-T-Zellen bereitstellt. Bei einer Ausführungsform dieses Aspekts beinhaltet das Verfahren die Verabreichung von Suppressor-T-Zellen an den Empfänger von Spendergewebe. Die Suppressor-T-Zellen können dem Empfänger vor dem Transplantat, gleichzeitig damit oder im Anschluss daran verabreicht werden.
Die Suppressor-T-Zellen können ferner dem Empfänger als Teil des Transplantats verabreicht werden. Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Beschreibung ein Verfahren zur Verringerung oder Besserung einer Immunantwort bereit, indem man für den Empfänger Spendergewebe oder ein Spenderorgan bereitstellt, das mit Suppressor-T-Zellen, die mit den T-Zellen autolog sind, perfundiert wird, oder diese enthält. Die Suppressor-T-Zellen bessern eine Immunantwort durch die T-Zellen des Empfängers gegen fremdes Gewebe, wenn dieses dem Empfänger transplantiert wird.
Ferner wird ein Verfahren zur Bereitstellung einer Behandlung eines Patienten, der ein Transplantat erhalten hat, bereitgestellt, um die Schwere einer Abstoßungsepisode gegen das Transplantat zu verringern oder die Episode zu beseitigen, indem man dem Empfänger von Spendergewebe Suppressor-T-Zellen verabreicht, nachdem das Spendergewebe dem Empfänger transplantiert worden ist. Die Suppressor-T-Zellen sind für den Empfänger vorzugsweise autolog. Die Darreichung von Suppressor-T-Zellen an einen Empfänger, der einer ungünstigen Immunantwort gegen ein Transplantat unterliegt, induziert eine Reaktionsunfähigkeit von T-Zellen gegen eine weitere antigenen Stimulation, wodurch eine nachteilige Reaktion durch aktivierte T-Zellen auf Spendergewebe oder -organe verringert oder beseitigt wird.
Ferner wird ein Verfahren zur Verringerung einer Immunantwort durch Gewebe, Organe oder Zellen eines Spenders gegen einen Empfänger, d. h. eine Graft-versus-host-Reaktion, beschrieben, das die Behandlung des Gewebes, der Organe oder Zellen des Spenders mit Suppressor-T-Zellen ex vivo vor der Transplantation des Gewebes, der Organe oder der Zellen auf den Empfänger umfasst. Die Suppressor-T-Zellen verringern die Reaktionsfähigkeit von T-Zellen im Transplantat, so dass sie anschließend gegen Empfängerantigen aufweisende Zellen aktiviert werden können, so dass das Transplantat in dem Körper des Empfängers (Wirts) ohne Auftreten einer nachteiligen Reaktion des Transplantats auf den Wirt oder unter einer Verringerung dieser Reaktion eingeführt werden kann. Auf diese Weise lässt sich der Zustand, der als "Graft-versus-host"-Krankheit bekannt ist, abwenden.
Das Donortransplantat kann zunächst ex vivo Empfänger- oder Drittgeweben oder -Zellen ausgesetzt werden, um die T-Zellen im Donortransplantat zu aktivieren. Das Donortransplantat wird sodann mit Suppressor-T-Zellen in Kontakt gebracht. Die Suppressor-T-Zellen bewirken eine Verringerung oder Hemmung einer nachteiligen sekundären Immunantwort durch T-Zellen im Donortransplantat gegen eine antigene Stimulation durch den Empfänger, wenn das Donortransplantat anschließend dem Empfänger verabreicht wird.
Die Suppressor-T-Zellen können vom Empfänger vor Gewinnung des Transplantats erhalten werden. Die Suppressor-T-Zellen können isoliert und bis zur Verwendung in eingefrorenem Zustand aufbewahrt werden. Die Suppressor-T-Zellen können ferner durch Züchtung auf die gewünschten Mengen expandiert und aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden. Die Suppressor-T-Zellen werden dem Empfänger in einer Menge verabreicht, die eine Verringerung oder Beseitigung einer ablaufenden nachteiligen Immunantwort, die durch das Donortransplantat gegen den Empfänger (Wirt) verursacht wird, bewirkt. Die Darreichung der Suppressor-T-Zellen an den Empfänger, der einer nachteiligen, durch ein Transplantat verursachten Immunantwort unterliegt, hemmt die ablaufende Reaktion und verhindert eine Restimulation der T-Zellen, wodurch eine nachteilige Reaktion durch aktivierte T-Zellen auf Empfängergewebe verringert oder beseitigt wird.
Somit können erfindungsgemäß humane Suppressor-T-Zellen zur Behandlung bei einer Transplantatabstoßung und/oder einer Graft-versus-host-Krankheit als Folge einer Transplantation und/oder zur Verhinderung oder Verringerung einer Transplantatabstoßung und/oder einer Graft-versus-host-Krankheit verwendet werden. Humane Suppressor-T-Zellen können auch zur Erleichterung der Verwendung von xenogenen Transplantaten verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Grad der Restimulation von Suppressor-T-Zellen in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion unter Verwendung von ursprünglichen Donor-Stimulator-Zellen (gleiche Donor-Stimulatoren, die zur Erzeugung der Suppressor-T-Zellen verwendet werden) am Tag 0. Suppressor-T-Zellen (T2) reagierten nicht auf eine Restimulation mit originalen Donor-PBMCs oder Phytohämagglutinin (PHA). Eine an CD8-Zellen verarmte T-Zellpopulation (T3) führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Reaktionsfähigkeit. Ohne MSCs gezüchtete T-Zellen (T1) reagierten gut bei der sekundären, gemischten Lymphozyten-Reaktion und auf PHA.
2 zeigt den Expressionsgrad einer ablaufenden gemischten Lymphozyten-Reaktion durch Suppressor-T-Zellen am Tag 0 (2A), am Tag 1 (2B) und am Tag 2 (2C) nach Zugabe der Suppressor-T-Zellen zu Reaktionskulturen. Die Stimulatorzellen bei der gemischten Lymphozytenreaktion stammen vom gleichen Spender wie die Stimulatorzellen, die zur Erzeugung der Suppressor-T-Zellen verwendet worden sind. Suppressor-T-Zellen (T2) unterdrückten eine ablaufende gemischte Lymphozyten-Reaktion in einem frühen Stadium und bei einer sehr niederen Zellzahl pro Vertiefung. Eine an CD8-Zellen verarmte Zellpopulation (T3) führte zu einer verzögerten und nur teilweisen Suppression. Ohne MSCs gezüchtete T-Zellen (T1) unterdrückten die gemischte Lymphozyten-Reaktion nicht, sondern verstärkten sie sogar.
3 zeigt den Suppressionsgrad einer ablaufenden gemischten Lymphozyten-Reaktion durch Suppressor-T-Zellen am Tag 0 (3A), am Tag 1 (3B) und am Tag 2 (3C) nach Zugabe der Suppressor-T-Zellen zu Reaktionskulturen. Die Stimulatorzellen bei der gemischten Lymphozyten-Reaktion stammen von einem Drittspender (Spender, der vom ursprünglichen Spender der Stimulatorzellen und vom Spender der Suppressor-T-Zellen abweicht). Suppressor-T-Zellen (T2) unterdrückten eine ablaufende gemischte Lymphozyten-Reaktion in einem frühen Stadium und bei einer sehr geringen Zellzahl pro Vertiefung. Eine an CD8-Zellen verarmte Zellpopulation (T3) führte zu einer verzögerten und nur teilweisen Suppression. Ohne MSCs gezüchtete T-Zellen (T1) unterdrückten die gemischte Lymphozyten-Reaktion nicht, sondern verstärkten sie sogar.
4 zeigt den Suppressionsgrad einer PHA-Proliferationsreaktion durch Suppressor-T-Zellen am Tag 1 (4A), am Tag 2 (4B) und am Tag 3 (4C). Suppressor-T-Zellen unterdrückten die PHA-induzierte Proliferation von autologen PBMCs, während allein gezüchtete T-Zellen die PHA-Reaktion beschleunigten. Eine Verarmung an CD8-Zellen führte zu einer verzögerten und nur teilweisen Suppression.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der hier geltenden Definition handelt es sich bei Suppressor-T-Zellen um T-Zellen, die beispielsweise in einer gemischten Lymphozytenreaktion durch Belastung mit einem Alloantigen vorbehandelt worden sind und anschließend mit mesenchymalen Stammzellen (in bezug zu den T-Zellen autolog oder allogen – vom Stimulator oder von einem Dritten stammend) gezüchtet wurden. Diese Suppressor-T-Zellen werden nicht restimuliert, wenn sie erneut in eine gemischte Lymphozyten-Reaktion gebracht werden und mit einem Alloantigen belastet werden, bei dem es sich entweder um das gleiche oder um ein drittes Alloantigen wie bei den ursprünglichen Stimulatorzellen handelt.
Der Ausdruck "Donorantigen" bezieht sich auf Antigene, die vom Spendergewebe exprimiert werden, das dem Empfänger zu transplantieren ist. Bei Alloantigenen handelt es sich um Antigene, die sich von den vom Empfänger exprimierten Antigenen unterscheiden. Bei Gewebe, Organen oder Zellen des Spenders, die zu transplantieren sind, handelt es sich um das Transplantat. Zu Beispielen für Transplantate gehören (ohne Beschränkung hierauf) Haut, Knochenmark und feste Organe, wie Herz, Pankreas, Niere, Lunge und Leber. Pankreas und Leber können für die Transplantation zu Einzelzellsuspensionen zerkleinert werden.
Die Erfinder haben festgestellt, dass Suppressor-T-Zellen eine MLR zwischen allogenen Zellen unterdrücken können. Suppressor-T-Zellen verringerten in aktiver Weise die allogene T-Zellantwort in gemischten Lymphozyten-Reaktionen, und zwar in dosisabhängiger Weise.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Anwendungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 13 bereit. Es wird ein Verfahren zur Verringerung, Hemmung oder Beseitigung einer Immunantwort beschrieben, indem man Suppressor-T-Zellen einem Empfänger von Geweben, Organen oder Zellen eines spenders verabreicht. Bei einer Ausführungsform werden Suppressor-T-Zellen dem Empfänger gleichzeitig mit dem Transplantat verabreicht. Alternativ können die Suppressor-T-Zellen vor der Verabreichung des Transplantats verabreicht werden. Beispielsweise können die Suppressor-T-Zellen dem Empfänger etwa 3 bis 7 Tage vor der Transplantation des Spendergewebes verabreicht werden.
Somit können Suppressor-T-Zellen dazu verwendet werden, das Immunsystem eines Empfängers gegenüber Spender- oder Fremdgewebe zu konditionieren, indem man dem Empfänger vor oder gleichzeitig mit einer Transplantation des Spendergewebes Suppressor-T-Zellen in einer Menge verabreicht, die eine Verringerung oder Beseitigung einer Immunantwort gegen das Transplantat durch die T-Zellen des Empfängers bewirkt. Die Suppressor-T-Zellen beeinflussen die T-Zellen des Empfängers in der Weise, dass die T-Zellantwort verringert oder beseitigt wird, wenn der Kontakt mit Spender- oder Fremdgewebe erfolgt. Somit kann die Abstoßung des Transplantats durch den Wirt vermieden oder deren Schweregrad verringert werden.
Demzufolge wird ferner ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten beschrieben, der einer ungünstigen Immunantwort gegenüber einem Transplantat unterliegt, indem man einem derartigen Patienten Suppressor-T-Zellen in einer Menge verabreicht, die eine Verringerung oder Unterdrückung der Immunantwort bewirkt. Die Suppressor-T-Zellen lassen sich vom Transplantatempfänger, vom Transplantatspender oder von einem Dritten erhalten.
Ferner wird ein Verfahren zur Verringerung, Hemmung oder Beseitigung einer Immunantwort durch ein Donortransplantat gegen dessen Empfänger (Graft-versus-host) beschrieben. Demzufolge sorgt das beschriebene Verfahren für das Inkontaktbringen eines Spenderorgans oder -gewebes mit Suppressor-T-Zellen vor der Transplantation. Die Suppressor-T-Zellen bewirken eine Besserung, Hemmung oder Verringerung einer ungünstigen Reaktion durch das Donortransplantat gegen den Empfänger.
Vor der Transplantation kann das Donortransplantat mit allogenen (vom Empfänger) Geweben oder Zellen behandelt werden, die die T-Zellen im Donortransplantat aktivieren. Das Donortransplantat wird sodann vor der Transplantation mit autologen Suppressor-T-Zellen behandelt. Die Suppressor-T-Zellen verhindern eine Restimulation oder induzieren eine Hyporeaktivität der T-Zellen gegen eine anschließende antigene Stimulation.
Somit kann im Zusammenhang mit einer Transplantation von Knochenmark (hämatopoetische Stammzellen) ein Angriff des Wirts durch das Transplantat verringert oder beseitigt werden. Spenderknochenmark kann vor der Implantation des Knochenmarks oder der peripheren Blutstammzellen in den Empfänger mit Donor-Suppressor-T-Zellen vorbehandelt werden. Das Donorknochenmark kann zunächst Geweben/Zellen des Empfängers ausgesetzt werden und anschließend mit Suppressor-T-Zellen behandelt werden. Obgleich keine Beschränkung hierauf besteht, wird angenommen, dass der anfängliche Kontakt mit Geweben oder Zellen des Empfängers eine Aktivierung der T-Zellen im Knochenmark bewirkt. Eine anschließende Behandlung mit Suppressor-T-Zellen bewirkt eine Hemmung oder Beseitigung der weiteren Aktivierung der T-Zellen im Knochenmark, wodurch eine nachteilige Wirkung durch das Spendergewebe verringert oder beseitigt wird, d. h. die Therapie verringert oder beseitigt die Graft-versus-host-Reaktion.
Ein Transplantatempfänger, der an der Graft-versus-host-Krankheit leidet, kann so behandelt werden, dass die Schwere der Krankheit verringert oder beseitigt wird, indem man einem derartigen Empfänger Suppressor-T-Zellen in einer Menge verabreicht, die eine Verringerung oder Beseitigung einer Transplantatabstoßung des Wirts bewirkt. Die Suppressor-T-Zellen bewirken, dass ein Anstieg einer Immunantwort gegen den Empfänger durch die aktivierten T-Zellen im Spendergewebe gehemmt oder unterdrückt wird, wodurch eine Graft-versus-host-Reaktion verringert oder beseitigt wird.
Die Suppressor-T-Zellen des Empfängers lassen sich vom Transplantatspender, vom Empfänger oder von einem Dritten vor der Transplantation erhalten und können aufbewahrt und/oder in Kultur vermehrt werden, um eine Reserve von Suppressor-T-Zellen in Mengen bereitzustellen, die für eine Behandlung eines ablaufenden Transplantatangriffes gegen den Wirt ausreichen.
Bei einem weiteren hier beschriebenen Verfahren wird das Spendergewebe Suppressor-T-Zellen ausgesetzt, so dass die Suppressor-T-Zellen vor der Transplantation in das Organ selbst integriert werden. Dabei wird eine Immunantwort gegen das Transplantat, die durch etwaige alloreaktive Empfängerzellen, die einer üblichen Behandlung zur Verhinderung einer Transplantatabstoßung, z. B. einer durch Arzneistoffe vermittelten Immunosuppression, entgangen sind, hervorgerufen wird, durch die im Transplantat vorhandenen Suppressor-T-Zellen unterdrückt. Die Suppressor-T-Zellen sind vorzugsweise für den Empfänger autolog.
Bei dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren kommt es in Betracht, dass die erfindungsgemäßen Suppressor-T-Zellen in Verbindung mit den gebräuchlichen Arten der Behandlung einer Abstoßung von Spendergewebe oder der Graft-versus-host-Krankheit eingesetzt werden. Ein Vorteil einer derartigen Anwendung besteht darin, dass aufgrund der Besserung der Schwere der Immunantwort bei einem Transplantatempfänger die Menge des Arzneistoffes, der bei der Behandlung verwendet wird, und/oder die Häufigkeit der Anwendung der Arzneistofftherapie verringert werden können, was zu einer Milderung der allgemeinen Immunosuppression und von unerwünschten Nebenwirkungen führt.
Ferner kommt es in Betracht, dass möglicherweise nur eine einzige Behandlung mit den erfindungsgemäßen Suppressor-T-Zellen erforderlich ist, wodurch die Notwendigkeit einer chronischen immunosuppressiven Arzneistofftherapie entfällt. Alternativ können mehrfache Verabreichungen von Suppressor-T-Zellen erfolgen.
Demzufolge werden hier Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung einer Transplantatabstoßung beschrieben, indem man die Suppressor-T-Zellen in einer prophylaktischen oder therapeutisch wirksamen Menge verabreicht, um eine Prophylaxe oder Therapie oder Besserung einer Transplantatabstoßung eines Organs, von Gewebe oder von Zellen der gleichen Spezies oder eines Xenotransplantat-Organs oder -Gewebes und/oder einer Graft-versus-host-Krankheit zu bewirken.
Die Verabreichung einer einzigen Dosis von Suppressor-T-Zellen kann eine Verringerung oder Beseitigung der T-Zell-Antwort auf Gewebe, das gegenüber den T-Zellen allogen ist, oder gegen Fremdgewebe bewirken, insbesondere in dem Fall, bei dem die T-Lymphozyten ihren nicht-reaktiven Charakter (d. h. Toleranz oder Anergie) gegenüber allogenen Zellen behalten, nachdem sie von den Suppressor-T-Zellen abgetrennt worden sind.
Die Dosierung der Suppressor-T-Zellen variiert innerhalb weiter Grenzen und wird selbstverständlich in jedem speziellen Fall an die individuellen Erfordernisse angepasst. Im allgemeinen ist es im Fall einer parenteralen Verabreichung üblich, etwa 0,01 bis etwa 5 Millionen Zellen pro kg Körpergewicht des Empfängers zu verabreichen. Die Anzahl der verwendeten Zellen hängt vom Gewicht und vom Zustand des Empfängers, der Anzahl oder der Frequenz der Verabreichungen und anderen variablen Größen, die dem Fachmann geläufig sind, ab. Die Suppressor-T-Zellen können auf einem Weg verabreicht werden, der sich für die zu transplantierenden Gewebe, Organe oder Zellen eignet. Die Verabreichung kann systemisch, d. h. parenteral, durch intravenöse Injektion oder in zielgerichteter Weise auf ein bestimmtes Gewebe oder Organ, z. B. Knochenmark, erfolgen. Die Suppressor-T-Zellen können über eine subkutane Implantation von Zellen oder durch Injektion von Stammzellen in Bindegewebe, z. B. Muskeln, verabreicht werden.
Die Zellen können in einem geeigneten Verdünnungsmittel in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 5 × 10⁶/ml verabreicht werden. Bei geeigneten Exzipientien für Injektionslösungen handelt es sich um solche, die biologisch und physiologisch mit den Zellen und mit dem Empfänger verträglich sind, z. B. um gepufferte Kochsalzlösung oder andere geeignete Exzipientien. Die Zusammensetzung für die Verabreichung muss gemäß üblicher Verfahren unter Berücksichtigung der entsprechenden Sterilitäts- und Stabilitätskriterien formuliert, hergestellt und aufbewahrt werden.
Obgleich die Erfindung nicht hierauf beschränkt ist, können mesenchymale Stammzellen, vorzugsweise aus Knochenmark, isoliert, gereinigt und in Kultur, d. h. in vitro, vermehrt werden, um eine ausreichende Anzahl an Zellen zur Verwendung bei den hier beschriebenen Verfahren zu erhalten. Mesenchymale Stammzellen, die im Knochen auftretenden formativen, pluripotenten Blastenzellen, liegen normalerweise im Knochenmark (1:100 000) und anderen mesenchymalen Geweben in einer sehr geringen Frequenz vor; vergl. Caplan und Haynesworth, US-Patent 5 486 359. Eine Gen-Transduktion von mesenchymalen Stammzellen beschreiben Gerson et al. im US-Patent 5 591 625.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die hier beschriebenen Verfahren auf einer Anzahl von Wegen und unter Vornahme verschiedener Modifikationen und Abänderungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden können. Es ist ferner ersichtlich, dass etwaige Theorien, die bezüglich der Wirkungsweisen oder der Wechselwirkungen zwischen Zelltypen aufgestellt werden, nicht in irgendeiner Weise als Beschränkung der Erfindung anzusehen sind, vielmehr dienen diese dazu, die erfindungsgemäßen Verfahren besser zu verstehen.
Die folgenden Beispiele erläutern weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung. Sie sind jedoch in keiner Weise als eine Beschränkung der Lehre oder der Offenbarung der vorliegenden Erfindung, die hier vorgestellt wird, zu verstehen.
Die gemischte Lymphozytenreaktion misst die Verträglichkeit der Oberflächenantigene des Spenders und stellt einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit der Abstoßung von Spendergewebe dar. Bei Zelloberflächen-Antigenen, die für die Auslösung von Transplantatabstoßungen verantwortlich sind, handelt es sich um MHC-Antigene der Klasse I und der Klasse II. T-Zellen sind gegenüber fremden MHC-Antigenen alloreaktiv. Klasse I- und Klasse II-MHC-Moleküle stimulieren die gemischte Lymphozytenreaktion.
Beispiele
Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation an Ficoll-Paque (Pharmacia) präpariert. Aliquotanteile von Zellen wurden in 90% FCS mit 10% DMSO eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Nach dem Auftauen wurden die Zellen zweimal mit MSC-Medium (DMEM mit geringem Glucosegehalt und 10% FCS) gewaschen und in Testmedium (ISCOVE'S mit 25 mM Hepes, 1 mM Natriumpyruvat, 100 μM nicht-essentielle Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 5,5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (sämtliche Reagenzien von GibcoBLR) und 5% humanem AB-Serum (Sigma, MLR-getestet)) resuspendiert.
Zur Herstellung einer in bezug auf T-Zellen angereicherten Fraktion wurden PBMCs des Spenders (Donors) 155 in bezug auf Monozyten und B-Zellen durch eine immunomagnetische, negative Selektion verarmt. PBMCs wurden mit Mäuse-anti-humanen CD19- und CD14-mAbs (Format ohne Azid/wenig Endotoxin (NA/LE)) inkubiert und im Anschluss daran mit Biotin-konjugiertem Ziegen-anti-Mäuse-IgG-(Mehrfachabsorption)-Ab (sämtliche Reagenzien von Pharmingen) und Streptavidin-Mikroperlen (Miltenyi Biotec) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend unter Verwendung eines magnetischen Zellsortiergeräts (MACS, Miltenyi Biotec) abgetrennt.
PBMCs des Spenders 413 wurde einer Röntgenbestrahlung mit 3600 rad (12 min bei 70 kV) unter Verwendung des Cabinet-Röntgensystems (Faxitron-X-Ray, Buffalo Grove, IL) bestrahlt.
Aktivierung von T-Zellen:
T-Zellen (15 × 10⁶/Schale) des Spenders 155 wurden in 10 cm-Gewebekulturschalen mit PBMC (15 × 10⁶ Zellen/Schale) des Spenders 413 sieben Tage gezüchtet. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂-Atmosphäre sieben Tage inkubiert.
Gemeinsame Züchtung mit MSCs:
Humane MSCs wurden vom Spender 273 aus Knochenmark gemäß den Angaben im US-Patent 5 486 359 isoliert und mit MSC-Medium in Kultur gehalten. Sie wurden in den Passagen 3 bis 6 verwendet. Die Zellen wurden unter Verwendung von 0,05% Trypsin/EDTA-Lösung abgehoben und einmal mit MSC-Medium gewaschen. Die MSCs (d 273) wurden in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/Schale in 10 cm-Gewebekulturschalen ausgestrichen, vier Tage gezüchtet und viermal mit PBS-D gewaschen, bevor aktivierte T-Zellen (d155) zugegeben wurden. Die T-Zellen (d155) wurden sieben Tage in der MLR aktiviert, gewonnen, einmal mit MSC-Medium gewaschen und im Testmedium resuspendiert und sodann auf die Schalen mit vorher ausgestrichenen MSC (0,5 × 10⁶ Zellen/ml, 1 × 10⁷ Zellen/Schale) übertragen und drei Tage bei 37°C und 5% CO₂-Atmosphäre belassen. In Kontrollkulturen wurden aktivierte T-Zellen ohne MSCs in der gleichen Dichte gezüchtet (die "T1"-Population). Bei mit MSCs gezüchteten Zellen handelt es sich um die "T2"-Population; die "T3"-Population wurde gemäß den nachstehenden Angaben in bezug auf CD8+-Zellen verarmt.
Immunomagnetische Verarmung und FACS-Färbung:
Am Ende der Züchtung mit MSCs (10 Tage nach Initiation der Primärkultur) wurden T-Zellen gewonnen und gewaschen. Hierbei handelt es sich um die "Suppressor-T-Zellen" ("T2-Population"). Eine Verarmung an CD8-Zellen wurde durch negative immunomagnetische Selektion mit anti-CD8-Mikroperlen (Miltenyi Biotec) durchgeführt (CD8-verarmt = "T3"-Population). Aliquotanteile von Zellen, die vor und nach der Verarmung gewonnen wurden, wurden mit anti-CD4-PE- und anti-CD8-APC-Antikörpern (Caltag) gefärbt und durch FACS analysiert.
Restimulation:
T-Zellen, die sieben Tage in MLR aktiviert worden waren und drei Tage ohne MSCs (T1) gezüchtet worden waren oder mit MSCs (nicht-fraktioniert ("T2") oder in bezug auf CD8 verarmt ("T3")) gezüchtet worden waren, wurden gewonnen und mit bestrahlten PBMCs, die mit dem ursprünglichen Stimulator (Spender 413) autolog waren oder mit dem Responder (Spender 155) autolog waren, restimuliert. Zellen wurden in einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung jeweils in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen. Alternativ wurden 5 × 10⁴ T-Zellen mit PHA (5 μg/ml) stimuliert.
Kulturen wurden 18 Stunden unmittelbar nach dem Ausstreichen mit [³H]TdR(Amersham)(5 Ci/mmol, 1 μCi/Vertiefung) 18 Stunden gepulst oder 1, 2, 3 oder 4 Tage inkubiert und anschließend mit [³H]TdR weitere 18 Stunden gepulst. Kulturen wurden unter Verwendung des Harvester 96 (Tomtec) gewonnen. Filter wurden unter Verwendung von Microbeta Trilux-Szintillationsflüssigkeit und eines Lumineszenzzählers (E. G. & G Wallac) analysiert.
Die Ergebnisse sind in 1 aufgeführt. Suppressor-T-Zellen (T2) reagierten nicht auf eine Restimulation mit ursprünglichen Spender-PBMCs oder PHA. Die Kultur mit Zellen, die in bezug auf CD8+-Zellen verarmt war, aus der Suppressor-T-Zell-Population (T3) führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Reaktivität. Ohne MSCs gezüchtete T-Zellen (T1) reagierten bei der sekundären gemischten Lymphozytenreaktion und auf PHA gut.
Unterdrückung der ablaufenden MLR durch Suppressor-T-Zellen
Eine MLR wurde in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen vier Tage vor Zugabe von Suppressor-T-Zellen angesetzt. In MLR wurden 1,5 × 10⁵ Antwort-T-Zellen mit der gleichen Anzahl an bestrahlten Stimulatorzellen vermischt. T-Zellen des Spenders 155 (autolog mit den Suppressor-T-Zellen) wurden aus PBMCs durch negative immunomagnetische Selektion mit anti-CD14- und anti-CD19-Mikroperlen präpariert. Stimulator-PBMCs stammten vom Spender 413 (identisch mit dem Stimulator für die Suppressor-T-Zellerzeugung) oder vom Spender 273 (Drittpartei in bezug zu den Suppressoren). T-Zellen des Spenders 155, die mit bestrahlten PBMCs des Spenders 413 sieben Tage voraktiviert worden waren und drei Tage allein oder mit MSCs des Spenders 273 (nicht-fraktioniert oder in bezug auf CD8 verarmt) gezüchtet worden waren, wurden als Suppressoren verwendet. Nach 4-tägiger Züchtung wurden Suppressor-T-Zellen in unterschiedlicher Anzahl pro Vertiefung (von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung bis 1,56 × 10³ Zellen/Vertiefung) zugegeben. Die Kulturen wurden mit [³H]TdR (5 Ci/mmol, 1 μCi/Vertiefung) 18 Stunden unmittelbar nach dem Ausstreichen gepulst oder 1 oder 2 Tage inkubiert und anschließend weitere 18 Stunden mit [³H]TdR gepulst.
Die Ergebnisse sind in den 2 und 3 dargestellt. Suppressor-T-Zellen ("mit MSC vorgezüchtet") unterdrückten eine ablaufende gemischte Lymphozytenreaktion in einem frühen Stadium und bei einer sehr niedrigen Zellzahl pro Vertiefung. Eine Verarmung an CD8+-Zellen führte zu einer verzögerten und nur partiellen Unterdrückung, was darauf hinweist, dass es sich bei den Suppressorzellen um CD8+ handelte. T-Zellen, die ohne MSCs gezüchtet worden waren, ("nur vorgezüchtet") unterdrückten nicht die gemischte Lymphozytenreaktion, sondern verstärkten diese sogar. Die suppressive Wirkung der Suppressor-T-Zellen wurde bei einer gemischten Lymphozytenreaktion, die durch die gleichen Stimulatorzellen (2) sowie durch dritte Stimulatoren (3) induziert worden war, beobachtet.
Suppression der PHA-induzierten Proliferation durch voraktivierte T-Zellen bei Züchtung mit MSCs:
PBMCs des Spenders 155 (autolog zu den Suppressor-Zellen) wurden in einer Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung mit PHA-M (5 μg/ml) in Gegenwart oder Abwesenheit von Suppressor-T-Zellen stimuliert. T-Zellen des Spenders 155 wurden durch bestrahlte PBMCs des Spenders 413 sieben Tage gemäß den vorstehenden Ausführungen voraktiviert. Diese Zellen wurden allein oder mit MSCs des Spenders 273 drei Tage gezüchtet (unfraktioniert oder CD8-verarmt). Suppressor-T-Zellen wurden in einer unterschiedlichen Anzahl/Vertiefung (5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung bis 1,56 × 10³ Zellen/Vertiefung) zugegeben. Die Kulturen wurden 1, 2 oder 3 Tage inkubiert und sodann weitere 18 Stunden mit [³H]TdR (5 Ci/mmol, 1 μCi/Vertiefung) gepulst.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Suppressor-T-Zellen unterdrückten die PHA-induzierte Proliferation von autologen PBMCs, während allein gezüchtete T-Zellen die PHA-Reaktion beschleunigten. Eine Verarmung an CD8-Zellen führte zu einer verzögerten und nur partiellen Suppression.

Claims

Verfahren zur Herstellung humaner Suppressor-T-Zellen, umfassend: (a) Inkontaktbringen aktivierter humaner Immuneffektor-T-Zellen mit mesenchymalen Stammzellen in vitro, wobei die mesenchymalen Stammzellen die aktivierten humanen T-Zellen dazu induzieren, humane Suppressor-T-Zellen zu werden; und (b) Isolieren der in Schritt (a) erzeugten humanen Suppressor-T-Zellen aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Immuneffektor-T-Zellen CD8+-Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die mesenchymalen Stammzellen allogene Zellen sind.
Verfahren zur Verringerung oder Unterdrückung einer Immunantwort gegen ein Alloantigen, wobei Immuneffektorzellen in vitro mit isolierten humanen Suppressor-T-Zellen in Kontakt gebracht wurden, die gemäß dem in den Ansprüchen 1 bis 3 definierten Verfahren hergestellt wurden, in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Effektorzellen T-Zellen sind.
Verwendung humaner Suppressor-T-Zellen für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verringerung einer Immunantwort gegenüber einem Donortransplantat oder zur Verringerung einer Immunantwort gegen ein Alloantigen oder zur Behandlung eines Transplantatempfängers gegen die Graft-versus-Host-Krankheit, wobei die humanen Suppressor-T-Zellen gemäß dem Verfahren, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert wurde, hergestellt werden, wobei die humanen Suppressor-T-Zellen in einer Menge verwendet werden, die wirksam ist, um eine vom Transplantat hervorgerufene Immunantwort gegen den Empfänger zu verringern.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die humanen Suppressor-T-Zellen gegenüber den mesenchymalen Stammzellen allogen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei das Transplantat ein Hauttransplantat oder Knochenmark ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei das Transplantat ein solides Organ ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das solide Organ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Herz, Pankreas, Niere, Lunge oder Leber.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die humanen Suppressor-T-Zellen vor dem Transplantat, gleichzeitig mit dem Transplantat, als Teil eines Transplantats und/oder nach dem Transplantat verabreicht werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei der Transplantat-Empfänger mit weiteren immunsupprimierenden Mitteln behandelt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei die Suppressorzellen für den Empfänger autolog sind.