DE60025400T2 - Vorrichtung und verfahren zum kalibrieren eines abtastsystems für mikroarrays - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zum kalibrieren eines abtastsystems für mikroarrays Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf optische Abtastsysteme, und insbesondere auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kalibrierung eines Mikroarray-Abtastsystems.
  • Beschreibung des Stands der Technik
  • Der Einsatz von Erregungsstrahlung, um in einer Reihe von abgetasteten genetischen Proben Fluoreszenz zu erzeugen, ist bekannt. Das an Dietz et al. erteilte US-Patent Nr. 5,689,110 offenbart beispielsweise ein Kalibrierverfahren und eine Kalibriervorrichtung für ein Fluoreszenzspektrometer, welches die Fluoreszenz einer homogenen Festkörper-Standardsubstanz als Quelle von Kalibrierungsfluoreszenz verwendet. Fluoreszierende Bildgeber werden verwendet, um Daten in Versuchen zu sammeln, in denen fluoreszierende Marker oder Fluorophore verwendet werden, um den Zustand einer im Test befindlichen Probe zu identifizieren. In manchen Fällen bestimmt die An- oder Abwesenheit von Fluorophoren in der Probe das Versuchsergebnis. In anderen Fällen ist die Fluorophorkonzentration, bei der es sich um eine Funktion der Stärke der von der Probe aufgenommenen Emissionsstrahlung handelt, der Messwert von Interesse, und das Versuchsergebnis kann durch Messen der Stärke der erfassten Strahlung abgeleitet werden.
  • Ein Beispiel für einen Prozess, der Fluorophore verwendet, ist der Mikroarray-Prozess, bei dem es sich um eine Versuchsreihe handelt, die genetisches Material wie DNA oder RNA verwendet, das an ein Glassubstrat gebunden ist. Referenz- oder "Target"-DNA wird punktweise auf ein Glassubstrat aufgebracht – typischerweise einen ein mal drei Zoll großen Mikroskop-Objektträger aus Glas – wo es sich chemisch an die Oberfläche bindet. Jeder Punkt (Spot) bzw. jede Probe der DNA stellt einen eigenen Versuch dar. Ein Muster einer "Proben" -DNA oder -RNA, dem das Fluorophormaterial zugesetzt wurde, wird anschließend auf die Target- oder Empfängerspots auf der Oberfläche des Substrats aufgetragen und kann mit der Target- oder Empfänger-DNA hybridisieren. Überschüssige Proben-DNA, die keine Bindung mit der Target-DNA eingeht, wird in einem anschließenden Waschprozess von der Oberfläche des Objektträgers entfernt.
  • Bei den Versuchen werden die Bindungsaffinitäten zwischen der Proben-DNA und der Target-DNA gemessen, um die Ähnlichkeit in der Molekularstruktur zu bestimmen. Komplementäre Moleküle weisen eine viel höhere Bindungswahrscheinlichkeit auf als Moleküle, die in keinem Bezug zueinander stehen. Das der Proben-DNA zugesetzte Fluorophor gibt einen Strahlungsenergiebereich ab, der sich um eine Wellenlänge Emission zentriert, wenn eine Beleuchtung durch einfallende Erregungsstrahlung mit einer insbesondere kürzeren Wellenlänge λErregung stattfindet. Die Helligkeit der abgegebenen Strahlung, die durch das Erfassungssystem eines Mikroarray-Abtastsystems gemessen wird, ist eine Funktion der im beleuchteten Punkt oder Spot vorhandenen Fluorophorkonzentration. Weil es sich bei der Fluorophorkonzentration um eine Funktion der Bindungsaffinität oder Ähnlichkeit des Probenmoleküls zum Empfängermolekül handelt, ist die Helligkeit eines hybridisierten Spots eine Anzeige für den Ähnlichkeitsgrad zwischen der Proben-DNA und der Target-DNA, die im hybridisierten Spot vorhanden ist. Ein typisches Mikroarray-Prüfgut kann bis zu Zehntausende von Versuchen bereitstellen, die gleichzeitig an der Proben-DNA vorgenommen werden sollen, wodurch eine detaillierte Charakterisierung eines bestimmten untersuchten Gens hergestellt wird.
  • Bei einem Mikroarray-Abtastsystem ist der Bereich von Interesse für gewöhnlich in eine Anordnung einzelner Elemente unterteilt, die als "Pixel" oder "Bildpunkte" bezeichnet werden. Jedes Pixel wird unabhängig angestrahlt, wenn sich das Abtastsystem darauf richtet. Bei der optischen Strahlungsquelle handelt es sich typischerweise um eine Laservorrichtung mit einer einzigen Wellenlänge, die nach unten fokussiert ist, um einen Erregungsstrahlungspunkt mit der gewünschten Größe zu bilden. Emissionsstrahlung wird vom beleuchteten Fluorphor in einem nach außen gerichteten, achsensysmmetrischen Strahl abgegeben. Ein Teil dieses Emissionsstrahls wird von einem optischen System aufgefangen und an eine Erfassungsvorrichtung übertragen. Zusätzlich zur Emissionsstrahlung wird auch ein Teil der einfallenden Erregungsstrahlung, die von der Oberfläche der Probe abgestrahlt wird, vom optischen System aufgefangen. Um die Menge an Erregungsstrahlung zu minimieren, die die Erfassungsvorrichtung erreicht, kann das optische System so ausgelegt sein, dass es Filterkomponenten wie dichroitische und Bandpassfilter einsetzt, um eine Unterscheidung zwischen Erregungs- und Emissionsstrahlungswellenlängen bereitzustellen.
  • Um aus der Abtastung eines Mikroarrays genaue Information zu erhalten, ist die Kenntnis wichtig, welche Fluorophorsubstanzen verwendet wurden, damit die richtigen Wellenlängen beim Ausleuchten der Spots verwendet und die richtigen Wellenlängen der Fluoreszenzemissionen gefiltert werden. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, die Fluorophore mit einem Erregungsstrahl hoher Intensität anzuregen, um das Signal mit dem Höchstwert an die Mikroarray-Abtastsystemerfassungsvorrichtung zurückzuschicken. Allerdings muss die Stärke des Erregungsstrahls unter der Höhe gehalten werden, bei der das Fluorophor gesättigt wird oder das Probenmaterial geschädigt werden kann.
  • Darüber hinaus muss die Analyse der durch das Mikroarray-Abtastsystem gesammelten Rohdaten in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt werden, die sich je nach den Versuchsparametern variieren lassen. Bei herkömmlichen Abtastsystemen erfolgt die Eingabe der Abtast- und Analyseprotokolle manuell. Dies führt für den Bediener zu einem erheblichen Zeitaufwand und ist darüber hinaus eine Fehlerquelle in der Abtast- und Analyseprozedur.
  • Die Empfindlichkeit des Erfassungssystems ist ein kritischer Parameter bei einem Mikroarray-Abtastsystem. Der mögliche Fluoreszenzemissionsbereich schwankt unter den Proben enorm und übersteigt oftmals den Dynamikbereich des Abtastsystems, was eine Sättigung von Signalen bewirkt. Das Auftreten gesättigter Signale in einem Datensatz macht es unmöglich, die Fluorophorhelligkeit zu quantifizieren, die von den Sättigung aufweisenden hybridisierten Spots ausgeht.
  • Bei einem herkömmlichen Mikroarray-Abtastsystem ist die Empfindlichkeitseinstellung des Erfassungssystems ein iterativer Vorgang. Der Benutzer führt eine Teilabtastung unter Verwendung eines besonderen Kanals des Systems durch, sichtet das Bild und stellt die Erregungsstrahlungsleistung und/oder die Verstärkung des Erfassungssystems entsprechend so ein, dass der optimale Bereich der Empfindlichkeiten innerhalb des Dynamikbereichs des Erfassungssystems liegt. Dieser Prozess ist zeitraubend für den Benutzer und wirkt sich darüber hinaus durch einen Prozess des Ausbleichens der fluoreszenzmarkierten Spots auf dem Substrat durch Lichteinwirkung (Photobleaching) negativ auf die Versuchsproben aus.
  • Obwohl die einschlägige Technik iterative Verfahren zur Kalibrierung von Mikroarray-Abtastsystemen bereitstellt, bleibt ein Bedarf an Verbesserungen bestehen, die Vorteile und Möglichkeiten bieten, die bei den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Kalibriermethoden nicht anzutreffen sind, und es ist eine primäre Aufgabe dieser Erfindung, solche Verbesserungen bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Nach der vorliegenden Erfindung wird eine Reihe von Lösungspunkten auf eine Mikroarray-Probe aufgedruckt, die eine Gruppierung genetischer Substanzproben umfasst, die ein oder mehrere Fluorophor/e enthalten. Ein Mikroarray-Abtastsystem, das eine Erregungsstrahlungsquelle, ein Erfassungssystem und eine Rechnereinrichtung umfasst, wird dazu verwendet, die Fluorophore in den Genmaterialproben zu analysieren. Eine automatische Kalibrierung des Erfassungssystems und/oder der Erregungsstrahlungsquelle wird erzielt durch i) Bestrahlen der Lösungspunkte mit der Erregungsstrah lungsquelle; ii) Erfassen der Emissionsstrahlung, die von der Lösungspunktfluoxophorsubstanz im Ansprechen auf die Bestrahlung erzeugt wird; iii) Ableiten mehrerer Helligkeitsmesswerte, die den Graden der Emissionsstrahlung entsprechen, die an entsprechenden Lösungspunkten erfasst werden; iv) Analysieren der Helligkeitsmesswerte mit der Rechnervorrichtung, um eine Fluorophorhelligkeitskennlinie als Funktion der Fluorophorkonzentration zu erhalten; und v) Einstellen der Empfindlichkeit des Erfassungssystems und/oder des Stärkegrads der Erregungsstrahlungsquelle entsprechend der Fluorophorhelligkeitskennlinie.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die nachstehende Erfindungsbeschreibung bezieht sich auf die beigefügten Zeichnungen:
  • 1 ist eine schematische Ansicht eines Mikroarray-Abtastsystems, wie es bei der Analyse einer Mikroarray-Probe verwendet wird;
  • 2 ist eine schematische Ansicht der Probenoberfläche der Mikroarray-Probe von 1;
  • 3 ist ein Schaubild, das eine Fluorophorhelligkeit als Funktion der Fluorophorkonzentration darstellt; und
  • 4 ist ein Schaubild, das das Ansprechen von Fluorophoren mit verschiedenen Konzentrationen auf einen konstanten Grad einfallender Erregungsstrahlung darstellt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG EINER VERANSCHAULICHENDEN
  • AUSFÜHRUNGSFORM
  • In 1 ist eine schematische Darstellung eines Mikroarray-Abtastsystems 10 gezeigt, wie es sich bei der Analyse einer Mikroarray-Probe 100 einsetzen lässt. Das Mikroarray-Abtastsystem 10 umfasst einen Beleuchtungskopf 20, ein optisches System 30 und eine Erfassungsvorrichtung 40. Der Beleuchtungskopf 20 umfasst eine Erregungsstrahlungsquelle 21, die eine Ausgangsstrahlung 25 mit zwei oder mehr unterschiedlichen Wellenlängen erzeugt, und eine Blendenvorrichtung 23, die so arbeitet, dass sie jede der verschiedenen Wellenlängen durchlässt, die von der Erregungsstrahlungsquelle 21 her eingehen. In dem gezeigten Beispiel erzeugt die Erregungsstrahlungsquelle 21 eine Strahlung mit einer Wellenlänge λ1 und einer Wellenlänge λ2. Die Blendenvorrichtung 23 blockiert die Strahlung mit der Wellenlänge λ1 und lässt die Strahlung mit der Wellenlänge λ2 als einen Erregungsstrahlungsstrahl 27 mit einer einzigen Wellenlänge hindurch. Die Erregungsstrahlungsquelle 21 kann beispielsweise eine oder mehrere kohärente optische Einzelwellenlängenstrahlungsquelle/n wie Laser, eine oder mehrere kohärente optische Mehrwellenlängenstrahlungsquelle/n oder eine oder mehrere Breitbandquelle/n umfassen. Somit sollte klar sein, dass der Betrieb des Mikroarray-Abtastsystems 19 nicht auf den Einsatz von lediglich zwei Wellenlängen beschränkt ist, und dass der Beleuchtungskopf 20 eine Erregungsstrahlung mit drei oder mehr unterschiedlichen Wellenlängen bereitstellen kann.
  • Das optische System 30 umfasst einen Erregungsspiegel 33, der so angeordnet ist, dass er den Erregungsstrahlungsstrahl 27 als einfallenden Erregungsstrahl 27' auf die Mikroarray-Probe 100 umleitet. Eine Objektivlinse 31 ist im Lichtweg des einfallenden Erregungsstrahlungsstrahls 27' zwischen dem Erregungsspiegel 33 und der Mikroarray-Probe 100 angeordnet. Die Objektivlinse 31 dient dazu, den einfallenden Erregungsstrahlungsstrahl 27' auf eine gewünschte Punktgröße auf der Mikroarray-Probe 100 zu fokussieren.
  • Wenn der einfallende Erregungsstrahlungsstrahl 27' eine Fluoreszenzmarkierung bzw. Fluorophor, das in der Mikroarray-Probe 100 vorhanden ist, bestrahlt, entsteht ein entsprechender Emissionsstrahlungsstrahl 29 mit einer Wellenlänge λEmission, der typischerweise 20 bis 40 nm länger ist als die Wellenlänge (d.h. λ1 oder λ2) des einfallenden Erregungsstrahlungsstrahls 27'. In der gezeigten Auslegung fungiert der Erregungsspiegel 33 als geometrischer Strahlenteiler, wobei die Breite des einfallenden Erregungsstrahlungsstrahls 27' viel kleiner ist als die Breite des Emissionsstrahlungsstrahls 29. Der relativ kleine Erregungsspiegel 33 reflektiert somit den einfallenden Erregungsstrahlungsstrahl 27', der von der Mikroarray-Probe 100 zum Beleuchtungskopf 20 zurückgestrahlt wird, während gleichzeitig der größere Anteil des Emissionsstrahlungsstrahls 29 die Objektivlinse 31 nach oben verlassen kann.
  • Die Erfassungsvorrichtung 40 umfasst eine Fotovervielfacherröhre 41 und eine variable Referenzhochspannungsvorrichtung 43. In einer alternativen Ausführungsform kann eine Lawinen-Fotodiode oder eine optische Festkörper-Erfassungsvorrichtung (z.B. eine CCD) anstelle der Fotovervielfacherröhre 41 verwendet werden. Die Fotovervielfacherröhre 41 gibt ein Signal an einen Regelverstärker 45 aus.
  • Ein Bandpass- oder Langpassfilter 37, das für den Emissionsstrahlungsstrahl 29 im Wesentlichen durchlässig und für den Erregungsstrahlungsstrahl 27 im. Wesentlichen undurchlässig ist, kann im Lichtweg des optischen Systems 30 zwischen der Objektivlinse 31 und einer Fokussierlinse 39 angeordnet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die Fokussierlinse 39 mit der Objektivlinse 31 ein konfokales System und bildet den Emissionsstrahlungsstrahl 29 auf der Fotovervielfachexröhre 41 ab. Das optische System 30 kann darüber hinaus einen Breitbandspiegel 35 umfassen, um einen gefalteten Übertragungsweg für den Emissionsstrahlungsstrahl 29 bereitzustellen, und eine Öffnungsblende 34 kann zwischen der Fokussierlinse 39 und der Fotovervielfacherröhre 41 vorgesehen sein. Die Öffnungsblende 34 dient dazu, den Teil der bestrahlten Mikroarray-Probe 100 abzudecken, der an der Fotovervielfacherröhre 41 nicht im Fokus ist. Wie einem Fachmann auf dem einschlägigen technischen Gebiet klar sein wird, kann das Mikroarray-Abtastsystem 10 auch noch ein entsprechendes Bandpass- oder Langpassfilter für jedes der anderen Erregungs-/Emissionswellenlängenpaare umfassen, die vom Mikroarray-Abtastsystem 10 genutzt werden.
  • Der Betrieb des Mikroarray-Abtastsystem 10 lässt sich am besten mit Bezug auf 1 und 2 beschreiben, wobei es sich um eine schematische Draufsicht auf die Mikroarray-Probe 100 handelt. Die Mikroarray-Probe 100 umfasst ein flächiges Substrat 101, wie etwa einen ein mal drei Zoll großen Mikroskop-Objektträger aus Glas. Eine Probenfläche 103 des flächigen Substrats 101 kann beispielsweise eine Markierung 105 und/oder einen geätzten oder "mattierten" Bereich 107 umfassen, der sich von einer Grenze 108 zum Rand des flächigen Substrats erstreckt, wovon eines oder beide durch den Substrathersteller hergestellt werden. Die Mikroarray-Probe 100 umfasst mindestens ein erstes Mikroarray 111 mit mehreren ersten, genetisches Empfängermaterial enthaltenden Empfängerpunkten oder Target-Spots 113 (durch offene Kreise angegeben), die auf der Probenfläche 103 angeordnet sind, und kann noch ein zweites Mikroarray 115 mit mehreren zweiten Empfängerpunkten oder Target-Spots 117 umfassen. Die ersten Empfängerpunkte 113 und die zweiten Empfängerpunkte 117 sind typischerweise, wie gezeigt, in Reihen und Spalten angeordnet. Eine (nicht gezeigte) Probensubstanz, die eine vorbestimmte Konzentration an Fluorophormaterial enthält, wird aufeinanderfolgenden ersten Empfängerpunkten 113 zugesetzt. Nachdem überschüssige Probensubstanz entfernt wurde, bleiben hybridisierte Punkte 114 (durch volle Kreise angegeben) zurück. Entsprechend ergeben sich hybridisierte Punkte 118 aus dem Zusetzen von Probensubstanz zu den zweiten Empfängerpunkten 117.
  • Die Mikroarray-Probe 100 ist in 1 abnehmbar an einer Testbühne 55 wie etwa durch eine mechanische Halterung oder eine Saugvorrichtung befestigt, wie in der einschlägigen Technik hinreichend bekannt ist. Ein Positionierungssystem 51 erteilt der Testbühne 55, und somit der Mikroarray-Probe 100, mittels eines mechanischen Gelenkgetriebes 52 eine Translationsbewegung in einer X-Y-Ebene. Das Mikroarray-Abtastsystem 10 umfasst darüber hinaus noch eine Rechnervorrichtung 60 wie einen Computer, der an das Positionierungssystem 51 angeschlossen ist, um durch die Rechnervorrichtung 60 eine Steuerung über eine Positionierungssoftware 61 bereitzustellen. Nachdem die Mikroarray-Probe 100 an der Testbühne 55 befestigt wurde, kann die Erfassungsvorrichtung 40 dazu verwendet werden, die Fokusstellung der Objektivlinse 31 optimal einzustellen. Dies lässt sich beispielsweise dadurch bewerkstelligen, dass die Markierung 105 oder eine vom Benutzer angebrachte Bezugsmarkierung 106 mit dem optischen System 30 abgebildet wird.
  • Die Rechnervorrichtung 60 empfängt auch das vom Regelverstärker 45 ausgegebene Signal, welcher eine Lagerückmeldung bereitstellt, wenn die Mikroarray-Probe 100 mittels des Positionierungssystems 51 ausgerichtet und abgetastet wird. Die Lagerückmeldung wird erhalten, indem die Testfläche 103 mit der einfallenden Erregungsstrahlung 27' bestrahlt und der bestrahlte Abschnitt der Testfläche 103 über die Erfassungsvorrichtung 40 an die Positionierungssoftware rückgespiegelt wird, wenn die Mikroarray-Probe 100 in der X-Y-Ebene bewegt wird.
  • Die Empfindlichkeit des Mikroarray-Abtastsystems kann für eine bestimmte Mikroarray-Probe 100 eingestellt werden, indem Lösungspunkte 119 verwendet werden, die auf der in 2 gezeigten Probenfläche 103 vorgesehen sind. Die Lösungspunkte 119 umfassen mehrere Lösungspunkte 119a bis 119g, wovon jeder eine andere Fluorophorkonzentration aufweist. Der Benutzer quantifiziert die Lösungspunkte 119 auf einer Punkt-für-Punkt-Basis, um für ein bestimmtes Fluorophor eine Konzentrations-/Helligkeitskurve zu erhalten. Es sollte klar sein, dass, obwohl sieben Lösungspunkte gezeigt sind, eine größere oder kleinere Anzahl verwendet werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden das erste Mikroarray 111, das zweite Mikroarray 115 und die Lösungspunkte 119 an vorbestimmten Stellen zueinander angeordnet, indem als Bezugsmerkmal beispielsweise die Markierung 105, der geätzte Bereich 107 und die Grenze 108, die vom Benutzer angebrachte Bezugsmarkierung 106, oder ein Rand 109 des Substrats 101 verwendet wird. Diese Auslegung ermöglicht den Einsatz einer automatisierten Ausrüstung, um das erste Mikroarray 111, das zweite Mikroarray 115 und die Lösungspunkte 119 abzubilden und eine anschließende Kalibrierung durchzuführen, wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben wird.
  • Das Mikroarray-Abtastsystem 10 unterteilt die Lösungspunkte 119 in Pixel. Wenn die Fluorphorsubstanz in jedem der Lösungspunkte 119a bis 119g durch die einfallende Erregungsstrahlung 27' bestrahlt wird, wird jedes Pixel sukzessive von der Erfassungsvorrichtung 40 erfasst und von der Rechnervorrichtung 60 auf das Vorhandensein von Fluorophormaterial hin analysiert. Jeder Analysemesswert ergibt einen Datenpunkt, der für die relative Fluorophorkonzentration des gemessenen Pixels steht. Die Pixeldaten werden dann rekonstruiert, um eine quantifizierte Beschreibung der abgetasteten Lösungspunkte 119 herzustellen. Eine entsprechende Vorgehensweise wird zur Analyse der Fluoreszenzemission aus den hybridisierten Punkten 114 und 118 verwendet.
  • Es ist in der einschlägigen Technik bekannt, dass es sich bei den Helligkeitseigenschaften der hybridisierten Punkte 114 typischerweise um nichtlineare Funktionen der Fluorophorkonzentration handelt, wie in 3 gezeigt ist. Wie durch eine Konzentrations-/Helligkeitskurve 121 beispielhaft dargestellt ist, kann ein Fluorophor ein auswertbareres Ansprechen in einem relativ engen Konzentrationsbereich (z. B. von ca. 10 bis Fluor 1000 Fluor/μm2 in dem gegebenen Beispiel), und ein im Wesentlichen flaches Ansprechen außerhalb dieses Konzentrationsbereichs aufweisen. Es ist wichtig, die Konzentrations-/Helligkeitskurve an einer bekannten fluoreszierenden Probe ermitteln zu können, um die Fluorophorkonzentration im entsprechenden hybridisierten Punkt 114 zu quantifizieren. Sobald die Kennlinie des entsprechenden fluoreszierenden Bildgebers bestimmt ist, lassen sich die Betriebsparameter des Mikroarray-Abtastsystems 10 festlegen.
  • Beispielsweise ist in 4 ein Vergleich verschiedener fluoreszierender Farbstoffe wiedergegeben. In einer Bezugsreihe 123 mit Cy3-Lösung, die sieben einzelne Lösungspunkte mit Fluorophorkonzentrationen im Bereich von 0,01 Fluor/μm2 bis 10.000 Fluor/μm2 enthält, wurde eine Helligkeit von 15.155 bei einer Konzentration von 100 Fluor/μm2 gemessen, und es trat Sättigung bei einer Konzentration von 1000 Fluor/μm2 bei einem konstanten Pegel einfallender Erregungsstrahlung auf. Die Signalwerte sind durchschnittliche Pixelwerte, die in einem 2 mm großen Kreis erhalten wurden. Bei einer Bezugsreihe 125 mit Alexa532-Lösung erzeugte eine Konzentration von 100 Fluor/μm2 eine gemessene Helligkeit von 21.280. Bei einer Bezugsreihe 127 mit Alexa594-Lösung und einer Konzentration von Fluor 1000 Fluor/μm2 betrug der Helligkeitsmesswert 38.363, und bei einer Bezugsreihe 129 mit Cy5-Lösung wurde Sättigung bei einer Konzentration von 10.000 Fluor/μm2 erreicht.
  • Wird die Empfindlichkeit des Erfassungssystems 40 zu hoch eingestellt, werden gesättigte Signal erzeugt, was die Auswertbarkeit des sich ergebenden Datensatzes senkt. Wird hingegen die Empfindlichkeit des Erfassungssystems 40 zu niedrig eingestellt, wird nicht die volle Auflösung des Mikroarray-Abtastsystems 10 genutzt und keine maximale Unterscheidung der Fluoreszenzgrade zwischen den hybridisierten Punkten 114 erzielt. Werden zwei oder mehr Kanäle des Mikroarray-Abtastsystems 10 genutzt, müssen die Kanäle darüber hinaus so abgeglichen werden, dass der Dynamikbereich der Fluorophorempfindlichkeit jedes Kanals innerhalb des Dynamikbereichs des Mikroarray-Abtastsystems 10 liegt.
  • Die in 1 gezeigte Rechnervorrichtung 60 umfasst eine Verdünnungssoftware 63 oder einen anderen maschinenlesbaren Code, um eine Konzentrations-/Helligkeitskurve von den Lösungspunkten 119 zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Lösungspunkte 119 nach einem Protokoll gesetzt, und die Position und Eigenschaften der Lösungspunkte 119 sind vorbestimmt. Vor dem Abbilden der hybridisierten Punkte 114 bildet das Mikroarray-Abtastsystem 10 die Lösungspunkte 119 ab, während gleichzeitig für alle geeigneten Kanäle beliebig kombiniert eingestellt werden: i) die abgegebene Leistung der Erregungsstrahlungsquelle 21, ii) eine Referenzhochspannungsvorrichtung 43 in der Fotovervielfacherröhre 41, und iii) die Verstärkung des Regelverstärkers 45. Die Ausgänge der Erregungsstrahlungsquelle 21 und der Fotovervielfacherröhre 41 lassen sich typischerweise über einen Bereich von mindestens 100:1 einstellen. Dies macht es möglich, dass die Empfindlichkeit des Mikroarray-Abtastsystems 10 über einen Bereich von 10.000:1 oder darüber eingestellt werden kann. Die Empfindlichkeit des Mikroarray-Abtastsystem 10 kann auf diese Weise optimal und ohne die Gefahr eingestellt werden, dass irgendwelche der hybridisierten Punkte 114 und 118 in den Mikroarrays 111 und 115 durch Lichteinwirkung ausgebleicht werden.
  • Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben wurde, wird klar sein, dass die vorliegende Erfindung keinesfalls auf die bestimmten Konstruktionen und Verfahren beschränkt ist, die hier offenbart und/oder in den Zeichnungen gezeigt sind, sondern auch alle Abwandlungen und gleichwertige Entsprechungen umfasst, die im Rahmen der Ansprüche liegen.

Claims (24)

  1. Mikroarray-Probe (100), die sich zur Verwendung in einem Mikroarray-Abtastsystem (10) eignet, wobei die Mikroarray-Probe umfasst: ein ebenflächiges Substrat (101) mit einer Probenfläche (103); eine Vielzahl von Empfängerpunkten (113, 117) die auf der Probenfläche angeordnet sind, wobei jeder Empfängerpunkt ein genetisches Empfängermaterial umfasst; und eine Vielzahl von Lösungspunkten (119), die auf der Probenfläche angeordnet sind, wobei jeder Lösungspunkt eine vorbestimmte Konzentration an Fluorophorsubstanz umfasst, wobei die Vielzahl beim Abtasten Information bereitstellt, aus der eine Fluorophorhelligkeitseigenschaft, die eine Funktion der Fluorophorkonzentration ist, bestimmt werden kann.
  2. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, wobei das ebenflächige Substrat (101) einen Mikroskopobjektträger umfasst.
  3. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmte Konzentration der Fluorophorsubstanz an mindestens einem Lösungspunkt (119) sich von der vorbestimmten Konzentration der Fluorophorsubstanz an irgendeinem anderen Lösungspunkt unterscheidet.
  4. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, wobei sich die Lösungspunkte (119) im Hinblick auf die Vielzahl der Empfängerpunkte (113, 117) an vorbestimmten Positionen befinden.
  5. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, wobei sich die Lösungspunkte (119) im Hinblick auf eine an der Probenfläche (103) angeordnete Bezugsmarkierung (106) an vorbestimmten Positionen befinden.
  6. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, darüber hinaus eine Bezugsmarkierung (106) umfassend, die in einem vorbestimmten Abstand von der Vielzahl der Lösungspunkte (119) angeordnet ist.
  7. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, darüber hinaus eine Vielzahl von zweiten, auf der Probenfläche angeordneten Lösungspunkten (119) umfassend, wobei jeder der zweiten Lösungspunkte eine zweite Fluorophorsubstanz umfasst.
  8. Mikroarray-Probe nach Anspruch 1, darüber hinaus einen Sondenpunkt oder mehrere Sondenpunkte umfassend, der/die auf einem oder mehreren der entsprechenden Empfängerpunkte angeordnet ist/sind, wobei die Sondenpunkte eine genetische Sondensubstanz und eine vorbestimmte Konzentration der Fluorophorsubstanz umfassen.
  9. Mikroarray-Abtastsystem (10), das sich zum Durchführen von Versuchen an einer Mikroarray-Probe nach Anspruch 1 eignet, wobei das Mikroarray-Abtastsystem umfasst: eine Bestrahlungseinrichtung (20) zum Bestrahlen der Vielzahl der Lösungspunkte (119); eine Erfassungseinrichtung (40) zum Erfassen von Emissionsstrahlung, die durch die Lösungspunktfluorophorsubstanz im Ansprechen auf die Bestrahlung erzeugt wird; eine Einrichtung zum Ableiten mehrerer Helligkeitsmesswerte, wobei jeder Helligkeitsmesswert dem Grad der Emissionsstrahlung entspricht, die an einem entsprechenden Lösungspunkt erfasst wird; eine Einrichtung (63) zum Analysieren der mehreren Helligkeitsmesswerte, um eine Fluorophorhelligkeitskennlinie als Funktion der Fluorophorkonzentration zu erhalten; und eine Einstelleinrichtung zum Einstellen der Empfindlichkeit des Mikroarray-Abtastsystems im Ansprechen auf die Fluorophorhelligkeitskennlinie, wobei die Bestrahlungseinrichtung und die Erfassungseinrichtung so angeordnet sind, dass sie die Empfängerpunkte (113, 117) bestrahlen und die entsprechende Emissionsstrahlung erfassen, nachdem die Einstelleinrichtung die Empfindlichkeit des Systems eingestellt hat.
  10. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Bestrahlungseinrichtung (20) mindestens ein Element aus der Gruppe umfasst, die aus einer kohärenten optischen Quelle mit einer Wellenlänge, einer kohärenten optischen Quelle mit mehreren Wellenlängen und einer Breitbandstrahlungsquelle besteht.
  11. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Erfassungseinrichtung (40) ein optisches System (30) umfasst.
  12. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 11, wobei das optische System (30) ein konfokales System umfasst.
  13. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Erfassungseinrichtung (40) mindestens ein Element aus der Gruppe umfasst, die aus einem Fotoelektronenvervielfacher, einer Avalanche-Photodiode und einer optischen Festkörpererfassungsvorrichtung besteht.
  14. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Ableitungseinrichtung einen maschinenlesbaren Code umfasst.
  15. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Einstelleinrichtung für die Empfindlichkeit eine Einrichtung umfasst, um einen Ausgangspegel der Bestrahlungseinrichtung (20) einzustellen.
  16. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Einstelleinrichtung für die Empfindlichkeit eine Einrichtung umfasst, um ein Ausgangssignal der Erfassungseinrichtung (40) einzustellen.
  17. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, wobei die Einstelleinrichtung für die Empfindlichkeit eine Einrichtung umfasst, um eine Bezugsquelle (43) einzustellen, die mit der Erfassungseinrichtung (40) in elektrischer Verbindung steht.
  18. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, darüber hinaus eine Einrichtung (55) zum Sichern des Substrats umfassend.
  19. Mikroarray-Abtastsystem nach Anspruch 9, darüber hinaus eine Einrichtung (51) zum Verschieben des Substrats in mindestens zwei Achsen umfassend.
  20. Verfahren zum Durchführen von Versuchen an einer Mikroarray-Probe (100) nach Anspruch 1 unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastsystems (10) nach Anspruch 9, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bestrahlen der Vielzahl von Lösungspunkten (119) mit einer Erregungsstrahlungsquelle (21); Erfassen der Emissionsstrahlung, die von der Lösungspunktfluorophorsubstanz im Ansprechen auf die Bestrahlung erzeugt wird; Ableiten mehrerer Helligkeitsmesswerte, wobei jeder Helligkeitsmesswert dem Grad der Emissionsstrahlung entspricht, die an einem entsprechenden Lösungspunkt (119) erfasst wird; Analysieren der mehreren Helligkeitsmesswerte, um eine Fluorophorhelligkeitskennlinie als Funktion der Fluorophorkonzentration zu erhalten; Einstellen der Empfindlichkeit des Mikroarray-Abtastsystems (10) im Ansprechen auf die Fluorophorhelligkeitskennlinie; und Bestrahlen der Vielzahl der Empfängerpunkte (113, 177), nachdem die Empfindlichkeit des Systems eingestellt wurde.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, darüber hinaus den Schritte des Anbringens einer Sondenprobe genetischer Substanz auf einem oder mehreren der Empfängerpunkte (113, 117) umfassend, um einen entsprechenden hybridisierten Punkt oder mehrere entsprechende hybridisierte Punkte (114, 118) herzustellen, wobei die Sondenprobe eine vorbestimmte Konzentration des Fluorophors umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, darüber hinaus den Schritt des Bestrahlens des einen hybridisierten Punkts oder der mehreren hybridisierten Punkte (114, 118) nach dem Schritt des Einstellens der Empfindlichkeit des Mikroarray-Abtastsystems (10) umfassend.
  23. Verfahren nach Anspruch 20, wobei sich die Vielzahl der Lösungspunkte (119) im Hinblick auf die Vielzahl der Empfängerpunkte (113, 117) an vorbestimmten Positionen befinden.
  24. Verfahren nach Anspruch 20, wobei sich die Vielzahl der Lösungspunkte (119) im Hinblick auf eine auf der Probenfläche (103) angeordneten Bezugsmarkierung (106) an vorbestimmten Positionen befinden.
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