DE60023943T2 - Antisense oligonukleotide zur inhibition der expression von typ i prokollagen - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft Antisense-Oligonukleotide und deren Verwendung zur Inhibition der Expression von Typ I Prokollagen.
• Die Kollagene sind eine Familie eng verwandter Proteine mit einer Dreifach-Helix-Proteinstruktur. Viele Kollagenarten wurden identifiziert (> 10), von denen das Typ-I-Prokollagen (bestehend aus zwei Alpha-1-Ketten und einer Alpha-2-Kette), die Hauptkomponente von Knochen, Haut und Sehnen ist.
• Es ist seit vielen Jahren anerkannt, dass viele pathologische Zustände durch die Überproduktion von Kollagenfasern in Form von Narben und überschüssigem faserförmigem Gewebe hervorgerufen werden. Beispielsweise ist Leberzirrhose ein zweistufiger Prozess, bei welchem zunächst normales Lebergewebe durch einen Virus oder durch Alkohol oder durch andere Gifte zerstört wird und danach übergroße Mengen von Kollagenfasern die beschädigten Zellen ersetzen, ehe die normale Leberregeneration erfolgt. Idiopathische Lungenfibrose ist ein tödlicher Zustand, bei welchem normales Lungengewebe allmählich durch zu große Mengen von Kollagenfasern ersetzt wird. Die progressive systemische Sklerose (Skleroderma) ist häufig eine tödliche Krankheit, bei welcher Haut und viele innere Organe aufgrund der exzessiven Ablagerung von Kollagenfasern lederähnlich werden. Bei vielen Individuen schließt sich an Wunden oder chirurgische Eingriffe ein exzessives Ablagern von Kollagen in Form hypertrophischer Narben und Keloide an, welche kosmetische Probleme darstellen und manchmal ernstere Folgen haben. Ferner tritt bei normalen Einzelpersonen häufig eine exzessive Narbenbildung nach einer Verletzung und chirurgischen Eingriffen auf. Bei diesen und ähnlichen Bedingungen wäre ein Mittel, welches speziell die Kollagensynthese und Ablagerung behindert, von erheblichem Vorteil.
• Die PCT-Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. WO 94/11494 beschreibt ein DNA- oder RNA-Oligonukleotid, welches zwischen 5 bis 200 Nukleotide enthält, die im Wesentlichen zu einer mutierten Kollagennukleotidsequenz oder einer normalen Kollagennukleotidsequenz vom wilden Typus komplementär sind, welches die Expression von Kollagengenen inhibieren kann. Bevorzugte Oligonukleotide sollen hierbei die Antisense-Oligonukleotide sein. Die Beispiele der WO 94/11494 beschreiben eine Reihe von DNA-Oligonukleotiden, von denen einige antisense sind, welche primär bezüglich des Bereichs am 3'-Ende von Exon 1 (von den Nukleotiden 198 bis 222) und der ersten beiden Nukleotide von Intron 1 des menschlichen Gens für die proα1-Ketten des Typs I-Prokollagen (COL1A1 synthetisiert wurden. Die synthetisch hergestellten Oligonukleotide zeigten hinsichtlich ihrer Fähigkeit die Expression eines intern entfernten mutierten COL1A1-Gens menschlichen Ursprungs eine starke Varianz. Die Effektivität der Nukleotide beim Inhibieren der Expression menschlichem COL1A1-Gens vom wilden Typ wurde jedoch gezeigt. Da die Struktur und Konformation der RNA-Transkripte menschlicher mutierter und wilder COL1A1-Gene sich mit größter Wahrscheinlichkeit unterscheidet, folgt daraus nicht notwendigerweise, dass Oligonukleotide, welche wirksame Inhibitoren der Expression des mutierten COL1A1-Gens sind, gleichzeitig effektive Inhibitoren der Expression des COL1A1-Gens vom wilden Typ ist.
• Es wäre daher wünschenswert, Antisense-DNA-Oligonukleotide zu identifizieren, welche die Fähigkeit aufweisen, die Expression eines COL1A1-Gens vom wilden Typ zu inhibieren.
• Nach vorliegender Erfindung wird daher ein Antisense-DNA-Oligonukleotid geschaffen, welches von 18 bis 25 Nukleotide aufweist und welches einer Nukleotidsequenz von der Position 750 zur Position 3900 einschließlich von SEQ ID NO: 1 komplementär ist, wobei SEQ ID NO: 1 eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäurensequenz entsprechend SEQ ID NO: 2 enthält, wobei das Oligonukleotid fähig ist, die Expression des Polypeptids in einer Zelle, welche dieses zeigt, zu inhibieren.
• SEQ ID NO: 1 ist der Nukleotidsequenz identisch, welche unter EMBL-Accession-Nr. Z74615 registriert ist. SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäurensequenz des Polypeptids kodiert durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1. Das durch die SEQ ID NO: 1 kodierte Polypeptid ist ein Vorläufer des Wildtyps, proα1-Kette des Typ-I-Prokollagens ("prepro-alpha1 (I)-Kollagen").
• Das Antisense-DNA-Oligonukleotid nach der Erfindung umfasst 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Nukleotide und ist bevorzugt 20 Nukleotide lang.
• Die Oligonukleotide nach der Erfindung können durch jedes zweckdienliche bekannte Verfahren hergestellt werden. Das Oligonukleotid wird sehr zweckdienlich durch synthetische chemische Verfahren hergestellt, beispielsweise Phosphoramiditchemie durch Schwefeln mit Tetraäthylthiuramdisulfid in Acetonnitril, wie dies in Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005–30008 beschrieben ist.
• Die Oligonukleotide nach der vorliegenden Erfindung sind von Vorteil dahingehend, dass sie die Expression des Wildtyp-COL1A1-Gens inhibieren. Es ist folglich bei der Behandlung oder Prävention von Zuständen/Erkrankungen zweckdienlich, die durch Überproduktion von Kollagenfasern hervorgerufen werden, beispielsweise Leberzirrhose, Nieren-, Leber- und Herzfibrose, Skleroderma, hypertrophische Narben und Keloide.
• Folglich schafft die vorliegende Erfindung ein DNA-Oligonukleotid nach der Erfindung zur Verwendung in der Therapie.
• Nach einem anderen Gesichtspunkt schafft die Erfindung die Verwendung eines Antisense-DNA-Oligonukleotids nach der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Therapie.
• Im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung umfasst der Ausdruck "Therapie" gleichfalls die "Prophylaxe", soweit nicht spezielle Angaben zum Gegenteil gemacht werden. Die Ausdrücke "therapeutisch" und "in der Therapie" sollten gleichermaßen interpretiert werden.
• Die Erfindung schafft ferner ein Verfahren zur Behandlung oder Verringerung des Risikos einer Kollagenerkrankung bei einem Patienten, der unter der Störung oder dem Risiko einer Störung leidet, welches die Gabe einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antisense-DNA-Oligonukleotids nach der Erfindung einem Patienten einschließt.
• Für die oben erwähnten therapeutischen Verwendungen wird die gegebene Dosierung selbstverständlich mit dem verwendeten Oligonukleotid, der Art der Gabe und der gewünschten Behandlung und der angezeigten Störung variieren. Wirksame Dosie rungen sind diejenigen, die fähig sind, die Kollagenproteinproduktion in Zellen bei einem Niveau zu inhibieren, welches die Symptome oder die mit der Kollagenproteinproduktion verbindenden Zustände eliminiert oder verringert.
• Das Oligonukleotid nach der Erfindung wird allgemein in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingegeben, in welcher das Oligonukleotid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel, Verdünnungsmittel oder Träger formuliert ist.
• Folglich schafft die vorliegende Erfindung gleichermaßen eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Antisense-DNA-Oligonukleotid nach der Erfindung in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel, Verdünnungsmittel oder Träger enthält.
• Die Erfindung schafft ferner ein Verfahren zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach der Erfindung, welches das Mischen des Antisense-DNA-Oligonukleotid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
• Die pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung kann beispielsweise topisch in Form einer Creme, Lotion oder Salbe oder systematisch beispielsweise durch orale Aufnahme in Form von Tabletten, Kapseln, Sirups, Pulvern oder Granulaten oder durch parenterale Eingabe in Form steriler Lösungen oder Suspensionen eingegeben werden.
• Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die folgenden veranschaulichenden Beispiele näher erläuert.
• BEISPIELE
• Beispiel 1
• Oligonukleotidsynthese
• Die Phosphorothioat-Oligodeoxynukleotid-Synthese wurde bei einer 1 μm- Skala auf einem PE-Biosystem 394 DNA-Synthesizer durchgeführt, wobei Phosphoramidit-Chemie mit TETD/Acetonitril-Schwefelungsmittel verwendet wurde. Oligonukleotide wurden auf Poly-Pak TM II-Patronen (Glen Research) gereinigt, auf NAPTM 10-Kolonnen (Amersham Pharmacia Biotech AB) entsalzt und ein Ionentausch unter Verwendung von Dowex 50WX8-100-Ionentauscherharz (Aldrich)durchgeführt. Das Antisense-DNA-Oligonukleotid (ASOs) wurde mit der folgenden Sequenz (5' → 3') hergestellt:
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• Beispiel 2
• Behandlung der Zellen
• Die menschliche Zellenlinie WI-26 wurde in Dulbecco's modiziertem Eagle's Medium (DMEM), welches 10% fetales Kälberserum enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden auf Tabletts mit 48 Vertiefungen oder Tabletts mit 6 Vertiefungen (Costar, Corning Inc.) aufgetragen, um eine 70–80%-ige Konfluenz zu erreichen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem DMEM und 0,35 ml (für die Experimente mit 48 Vertiefungen) oder 1 ml (Experimente mit 6 Vertiefungen) DMEM gewaschen, welches 5 μg/ml Lipofectin (Gibco BRL) oder 2,5 μg/ml Cytofectin GSV (Glen Research Ltd.) enthielt und Oligonukleotide wurden bei 200 nM jeder Vertiefung hinzugefügt.
• Nach 4–5 Stunden bei 37°C wurden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem DMEM gewaschen und 0,35 ml DMEM (Tabletts mit 48 Vertiefungen) oder 1 ml DMEM (Tabletts mit 6 Vertiefungen) wurde zusammen mit Ascorbinsäure bei 50 μg/ml hinzugegeben. Die Zellen wurden für 20 Stunden vor der Analyse der Kollagengehalten inkubiert.
• Beispiel 3
• Proteinanalyse
• Am Ende des Experiments wurden 150 μl des Mediums entfernt und die Menge abgeschiedenen Typ-I-Kollagens unter Verwendung eines ELISA-Kits (Amersham Pharmacia Ltd.) bestimmt und die Resultate als Nanogramme von Prokollagen in dem Medium/10.000 Zellen ausgedrückt. Zum Korrigieren der Zellzahlen wurden die Tabletts mit vorgewärmtem PBS gewaschen, die Zellen mit Trypsin behandelt und die Zellzahlen. unter Verwendung eines automatisierten Coulter-Zählers bestimmt. Für die Versuche mit 6 Vertiefungen wurden die Zellen gezählt, mit 1 ml TRI-Reagens (SIGMA Ltd.) behandelt und die Proteine und RNA nach den Richtlinien der Hersteller extrahiert. Das Proteinpellet wurde in 1%-iger SDS, welches Proteaseinhibitoren enthielt, wieder in Suspension gebracht. 30–100 μgs zellulare Proteine wurden bei 100°C 5 Minuten erhitzt und dann in einem 4–12%-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophorisiert. Die Proteine wurden auf elektrophoretischem Wege in Nitrozellulose-Filter übertragen und mit einem Antikörper gegen ein synthetisches Peptid hybridisiert, welches menschlichem proα1(I)-Ketten vom Typ 1-Kollagen (von Dr. Larry Fisher, NIH, USA erhalten) entspricht. Das proα1-Band wurde unter Verwendung eines Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpers der mit HRP (Biorad Ltd.) gekoppelt war, erfasst und unter Verwendung von ECL (Pierce Ltd.) entwickelt. Die Proteinlast wurde bestimmt, indem die Membran mit einem Antikörper zu GAPDH (Advanced Immunochemi cals) behandelt wurde. Die Proteinlast wurde auf GAPDH-Niveaus unter Verwendung von Desitometrie normalisiert.
• Beispiel 4
• RNA-Analyse
• RNA wurde unter Verwendung von TRI-Reagens extrahiert und das endgültig erhaltene Pellet wurde in 0,5%-iger SDS wieder in Suspension gebracht. Ein bis drei Mikrogramm des Gesamt-RNA wurden in einem Formaldehyd-Denaturierungsgel gemäß Standardprozeduren (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) elektrophorisiert. RNA wurde auf Hybond-N-Membrane (Amersham) übertragen und 24 Stunden zu einer alpha1(1)-cDNA-Probe hybridisiert, welche unter Verwendung eines T7-Polymerasekits (Amersham Pharmacia) radioaktiv markiert wurde. Nach dem Waschen wurde der Filter einem Röntgenstrahlfilm ausgesetzt und der Film 4–24 Stunden später entwickelt. Die autoradiografischen Bilder der alpha1(1)-Transkripte (4,8 kb & 5.8 kb) wurden durch densitometrische Analyse analysiert und die RNA-Belastung wurde unter Verwendung der Intensität des GAPDH-Transkripts oder die Intensität des 28S rRNA als innere Kontrolle korrigiert.
• Resultate
• Die unten stehende Tabelle zeigt die durchschnittlichen Prozentgehalte (%) Kollageninhibition, welche sich auf Kollagenniveaus in dem Medium oder Kollagen-mRNA-Niveaus bezieht. Bei der behandelten Probe, welche verwendet wurde, bestand eine sehr gute Korrelation zwischen der prozentualen Kollageninhibition gemessen im Medium und der prozentualen Inhibition interzellularen Kollagen-mRNA-Niveaus.
• Tabelle 2

  
• SEQUENZ-LISTE

  
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Claims (5)

1. Ein Antisense-DNA-Oligonukleotid, enthaltend SEQ ID NO: 14, welches einer Nukleotidsequenz von der Position 750 bis zur Position 3900 einschließlich der SEQ ID NO: 1 komplementär ist, wobei SEQ ID NO: 1 eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Polypeptid, welches eine Aminosäurensequenz entsprechend SEQ ID NO: 2 umfasst, kodiert, wobei das Oligonukleotid fähig ist, die Expression des Polypeptids in einer Zelle, die es ausdrückt, zu inhibieren.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Oligonukleotid nach Anspruch 1 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel, Verdünnungsmittel oder Träger.
3. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend das Mischen eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel, Verdünnungsmittel oder Träger.
4. Oligonukleotid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Therapie.
5. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Therapie.