DE60023919T2

DE60023919T2 - Verbesserte topische zusammensetzungen mit extrazellulären produkten von probiotischen bakterien und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60023919T2
Application number: DE60023919T
Authority: DE
Inventors: Sean Farmer
Original assignee: Ganeden Biotech Inc
Current assignee: Ganeden Biotech Inc
Priority date: 1999-08-26
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2020-08-26
Also published as: US20050271758A1; US7541042B2; US20080089963A1; EP1212069A2; US6645506B1; CA2382840C; CA2382840A1; ATE308988T1; EP1632239A1; JP2003507428A; WO2001013927A2; US6905692B2; US6723326B1; WO2001013927A9; DE60023919D1; AU7332400A; US20030003107A1; WO2001013927A3; US20090238907A1; EP1212069B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Anspruch 1 sowie auf seine Verwendung zur Verhinderung und/oder Kontrolle von Infektionen, die durch ein Bakterium, Pilze, Hefe, ein Virus sowie Kombinationen davon verursacht werden.
Probiotische Mikroorganismen sind solche, die einen Nutzen bringen, wenn sie in einer bestimmten Umgebung wachsen, häufig durch Hemmung des Wachstums anderer biologischer Organismen in derselben Umgebung. Beispiele für probiotische Organismen umfassen Bakterien und Bakteriophagen, die die Fähigkeit besitzen, im gastrointestinalen Trakt zu wachsen, zumindest zeitweise pathogene Organismen zu verdrängen oder zu vernichten und weitere Vorteile für den Wirt zu bringen. Siehe z. B. Salminen et al, 1996, Antonie Van Leeuwenhoek 70: 347–358: Elmer et al, 1996. JAMA 275: 870–876; Rafter, 1995. Scand. J. Gastroenterol. 30: 497–502; Perdigon et al, 1995. J. Dairy Sci. 78: 1597–1606; Gandi, Townsend Lett. Doctors & Patients, pp. 108–110, Jan. 1994; Lidbeck et al, 1992. Eur. J. Cancer Prev. 1: 341–353.
Die Mehrheit vorausgegangener Priobiose-Studien basierte eher auf Beobachtungen als mechanistischer Natur zu sein und daher sind die Vorgänge, die für viele probiotische Phänomene verantwortlich sind, noch quantitativ aufzuklären. Einige Priobioten sind Bestandteil der normalen Darmflora und werden nicht als offenkundig pathogen betrachtet. Jedoch haben die Organismen gelegentlich Infektionen hervorgerufen (z.B. Bakteremie) und zwar bei Individuen, die beispielsweise ein geschwächtes Immunsystem aufweisen. Siehe beispielsweise Sussman, J. et al, 1986. Rev. Infect. Dis. 8: 771–776; Hata D. of al, 1988. Pediatr. Infect. Dis. 7: 669–671.
Beispielsweise wurden die probiotischen Bakterien saurer Milch schon früher (d.h. lange bevor Bakterien entdeckt wurden) als therapeutische Behandlung für die Dysenterie und verwandte gastrointestinale Krankheiten verwendet. Vor kürzerer Zeit in den frühen Jahren des 20. Jahrhunderts wurden probiotische Präparate systematisch hinsichtlich ihres Effektes auf Gesundheit und Langlebigkeit ausgewertet (siehe beispielsweise Metchinikoft, E., Prolongation of Life, Willaim Heinermann, London 1910), obwohl sich ihre Verwendung seit dem Aufkommen von Antibiotika in den 50'er Jahren zur Behandlung pathologischer Mikroben merklich verringert hat. Siehe z.B. Winberg, et al, 1993. Pediatr. Nephrol. 7: 509–514; Malin et al, Ann. Nutr. Metab. 40: 137-T45; und U.S. Patent Nr. 5,176,911. In ähnlicher Weise wurden Milchsäure produzierende Bakterien (z.B. Bacillus, Lactobacillus und Streptococcus Spezies) als Nahrungsergänzungsmittel verwendet und es gab einige Behauptungen dahingehend, dass diese einen ernährungs- oder therapeutischen Wert mit sich bringen. Siehe z.B. Gorbach, 1990. Ann. Med. 22: 37–41; Reid et al. 1990. Clin. Microbiol. Rev. 3: 335–344.
Die am besten bekannten Probioten sind Milchsäure produzierende Bakterien (d.h. Lactobacilli) und Bifidobakterien, die eine breite Verwendung in Jogurth und anderen Molkereiprodukten finden. Diese probiotischen Organismen sind nicht-pathogen und nicht-toxisch, bleiben lebensfähig während ihrer Lagerung und besitzen die Fähigkeit, die Passage durch den Magen und den Dünndarm zu überstehen. Da Probioten im Wirt keine permanenten Kolonien bilden, müssen sie regel mäßig aufgenommen oder angewendet werden, damit gesundheitsfördernde Eigenschaften fortdauern. Kommerzielle probiotische Präparate bestehen im wesentlichen aus Mischungen aus Lactobacilli und Bifidobakterien, obwohl Hefe, wie Saccharomyces ebenfalls genutzt wurden.
Vielleicht ist die am besten charakterisierte Verwendung probiotischer Mikroorganismen die Aufrechterhaltung der gastrointestinalen Mikroflora. Es konnte gezeigt werden, dass die gastrointestinale Mikroflora eine Anzahl entscheidender Rollen bei der Aufrechterhaltung der Funktion des gastrointestinalen Traktes sowie insgesamt bei der physiologischen Gesundheit spielt. Beispielsweise hängen das Wachstum und der Metabolismus von vielen individuellen bakteriellen Spezies, die den gastrointestinalen Trakt besiedeln, in erster Linie von den für diese verfügbaren Substraten ab, von denen die meisten von der Ernährungsweise abgeleitet sind. Siehe z. B. Gibson, G.R. et al., 1995, Gastroenterology 106: 975–982; Christi, S.U. et al., 1992. Gut 33: 1234–1238. Diese Erkenntnisse führten zu Versuchen, die Struktur und die metabolischen Aktivitäten der Gesellschaft durch die Ernährungsweise zu verändern, und zwar in erster Linie durch Probioten, die lebende mikrobische Nahrungsergänzungen darstellen.
Während die Anhaftung von Probioten an dem gastrointestinalen Epithel eine wichtige Determinante für deren Fähigkeit darstellt, die Immunreaktivität des Wirtes zu verändern, ist darauf hinzuweisen, dass dies nicht eine allgemeine Eigenschaft von Lactobacilli oder Bifidobakterien ist und dass dies auch nicht essentiell für eine erfolgreiche Probiose ist. Siehe z. B. Fuller, R., 1989. J. Appl. Bacteriol. 66: 365–378. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Adhärenz von Lactobacillus acidophilus und einiger Bifidobakterien an menschlichen enterozyten-ähnlichen CACO-2 Zellen die Bindung von enterotoxigenen and enterophatogenen Eschericha Coli sowie von Salmonella typhimurium und Yersinia pseudotuberculosis verhindert. Siehe z.B. Bernet, M.F. et al., 1994. Gut 35: 483–489; Bernet, M.F. et al., 1993. Appl. Environ. Mircobiol. 59: 4121–4128.
Während die gastrointestinale Mikroflora eine mikrobiell-basierte Barriere gegen das Eindringen von Organismen darstellt, entwickeln sich Pathogene häufig, wenn die Integrität der Biozönose durch Streß, Krankheit, antibiotische Behandlung, Änderungen in der Ernährungsweise oder physiologische Änderungen im Gastrointestinaltrakt beeinträchtigt ist. Beispielsweise ist es von Bifidobakterien bekannt, dass sie bei der Wiedersetzung gegen die Ansiedlung von Pathogenen im Dickdarm mitwirken. (Siehe z.B. Yamazaki, S. et al., 1982, Bifidobacteria and Microflora 1: 55–60. In ähnlicher Weise entfernte die Gabe von Bifidobacteria breve an Kindern mit Gastroenteritis die verursachenden pathogenen Bakterien (d.h Campylobacter jejuni) von ihren Positionen (siehe z.B. Tojo, M., 1987. Acta Pediatr. Jpn. 29: 160–167) und es wurde gefunden, dass die Ergänzung von Babymilch mit Bifidobacteria bifidum und Streptococcus thermophilus die Rotavirus-Ablagerung sowie die Durchfallepisoden hospitalisierter Kinder reduzierte (Siehe z.B. Saavedra, J. M., 1994. The Lancet 344: 1046–109).
Ferner produzieren einige Milchsäure produzierende Bakterien auch Bakteriozine, die hemmende Metaboliten darstellen, die für anti-microbische Effekte von Bakterien verantwortlich sind. Siehe z.B. Kleanhammer, 1993: FEMS Microbiol. Rev. 12: 39–85; Barefoot et al., 1993. J. Diary Sci. 76: 2366–2379. Beispielsweise wurde gezeigt, dass ausgewählte Lactobazillus Stämme, die Antibiotika produzieren, Wirkungen bei der Behandlung von Infektionen, Sinusitis, Hämorrhiden, dentalen Entzündungen und bei verschiedenen anderen entzündlichen Zuständen zeigen. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,439,995. Ferner wurde gezeigt, dass Lactobacillus reuteri Antibiotika produziert, die anti-mikrobielle Aktivität gegen gramnegative und grampositive Bakterien, Hefe and verschiedene Protozoen zeigt. Siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5,413,960 und 5,439,678.
Es wurde auch gezeigt, dass Probioten antimutagene Eigenschaften besitzen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass grampositive und gramnegative Bakterien mutagene Pyrolysate binden, die beim Kochen bei hohen Temperaturen entstehen. Studien mit Milchsäure produzierenden Bakterien haben gezeigt, dass diese Bakterien entweder tot oder lebend sein können und zwar aufgrund der Tatsache, dass sich der Prozeß durch Adsorption von mutagenen Pyrolysaten an Carbohydratpolymeren vollzieht, die sich in der bakteriellen Zellwand befinden. Siehe z.B. Zang, X. Bacillus et al., 1990. J. Dairy sci. 73, 2702–2710.
Es konnte gezeigt werden, dass Lactobacilli auch die Fähigkeit aufweisen, Karzinogene zu zerstören (z.B. N-Nitrosamine), die eine wichtige Rolle spielen, wenn der Prozeß anschließend auf der Ebene der mucosalen Oberfläche stattfindet. Siehe z.B. Rowland, I.R. und Grasso P., Appl. Microbiol. 29: 7–12. Ferner wurde gezeigt, dass die gemeinsame Gabe von Lactulose und Bifidobacteria longum bei Ratten, injiziert mit karzinogenem Azoxymethan, die intestinal anormalen crypt foci verringerten, die im wesentlichen als pre-neoplastische Marker betrachtet werden. Siehe z.B. Challa, A. et al., 1997. Carcinogenesis 18: 5175–21. Gereinigte Zellwände von Bifidobacteria können auch anti-tumorgene Aktivitäten aufweisen und zwar indem die Zellwand von Bifidobacteria infantis die Aktivierung von Phagocyten induziert, um wachsende Tumorzellen zu vernichten. Siehe z.B. Sekine, K. et al., 1994. Bifidobacteria and Microflora 13: 65–77. Es wurde gezeigt, dass Bifidobacteria Probioten ferner die Darmcarinogese reduzieren, die durch 1, 2 Dimethylhydrazin in Mäusen induziert wurde, wenn die Gabe gleichzeitig mit Fructo-Oligosachariden erfolgte (FOS; siehe z.B. Koo und Rao, 1991. Nutrit. Rev. 51: 137–146), sowie auch Leber- und Brusttumoren bei Ratten hemmen (siehe z.B. Reddy and Revenson, 1993. Cancer Res. 350: 3914–3918).
Es wurde auch gezeigt, dass die Microbioten des Gastointestinaltraktes sowohl mucosale als auch systemische Immunität innerhalb des Wirtes bewirken. Siehe z.B. Farmularo, G. et al., Stimulation of immunity by probiotics. In: Probiotics: Therapeutic and other beneficial effects. pg. 133–161. (Fuller, R. ed. Chapman and Hall, 1997). Die intestinalen Epithelzellen, Blutleukocyten, B- und T-Lymphocyten und akzessorische Zellen des Immunsystems wurden alle mit der oben genannten Immunität in Zusammenhang gebracht. Siehe z.B. Schiffrin, E.J. et al., 1997. Am. J. Clin. Nutr. 66.5-20S. Andere bakterielle metabolische Produkte die immunmodulierende Eigenschaften aufweisen umfassen: endotoxische Lipopolysaccharide, Peptidoglycane und lipoteichoische Säuren. Siehe z.B. Standiford, T. K., 1994. Infect. Linmun. 62: 119–125. Dementsprechend geht man davon aus, dass probiotische Organismen mit dem Immunsystem auf vielen Stufen interagieren einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Cytokineproduktion, mononukleare Zellproliferation, Makrophagen-Phagocytose und Vernichtung, Modulation der Autoimmunität, Immunität gegenüber bakteriellen und Protzoen Pathogenen und dergleichen. Siehe z.B., Matsumara, K. et al., 1992. Animal Sci. Technol. (Jpn) 63:1157–1159; Solis-Pereyra, B. und Lemmonier, D., 1993. Nutr. Res. 13: 1127–1140. Es wurde gefunden, dass Lactobacillusstämme auch merklich Änderungen in entzündlichen und immunologischen Reaktionen bewirken, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine Reduktion der Darmentzündungsinfiltration ohne eine ähnliche Verringerung in der Anzahl von B- und T-Lymphozyten hervorzurufen. Siehe z.B. De Simone, C. et al., 1992. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 14: 331–340.
Antibiotika besitzen eine breite Verwendung, um pathogene Mikroorganismen in Menschen und Tieren zu kontrollieren. Unglücklicherweise hat die weitverbreitete Verwendung von antimikrobiellen Agenzien, insbesondere von Breitbandantibiotika in einer Anzahl schwerwiegender klinischen Konsequenzen resultiert. Beispielsweise hat die wahllose Verwendung dieser Chemikalien in der Erzeugung von multipel antibiotisch resistenten Pathogenen resultiert. Siehe z.B. Mitchell P., 1998. The Lancet 352: 463–463; Shannon, K., 1998. The Lancet 352: 490–491. Die anfänglichen Berichte über Meticillin-resistente Staphylococcus aurous (MRSA) Infektionen wurden durch die kürzlichen Ausbrüche der Vancomycin-resistenten Enterococci (VRE) in den Schatten gestellt. Die Ausbildung von derartigen Resistenzen führte zu zahlreichen Berichten über systemische Infektionen, die mit üblichen antibiotischen Therapien nicht zu behandeln waren. Kürzlich war ein Vancomycin- (im wesentlichen als Antibiotikum des letzten Auswegs betrachtet) resistenter Stamm von Staphylococcus aurous für über 50 Todesfälle in einem einzigen australischen Krankenhaus verantwortlich.
Enterococci stellen derzeit ein wesentliches nosocomiales Pathogen dar, woran sich wahrscheinlich für längere Zeit nichts ändern wird. Enterococci sowie auch andere Mikroben erhalten antibiotisch resistente Gene in verschiedenen unter schiedlichen Wegen. Beispielsweise emittieren Enterococci Pheromone, die dazu führen, dass diese klebrig werden und Aggregate bilden, wodurch der Austausch genetischen Materials erleichtert wird, wie beispielsweise von Plasmiden (die autonom eine circuläre DNA replizieren, die häufig die antibiotisch resistenten Gene trägt). Darüber hinaus besitzen manche Enterococci ferner „konjugative Transposone", bei denen es sich um DNA-Sequenzen handelt, die es ihnen ermöglicht, unmittelbar resistente Gene zu transferieren, ohne dazwischen geschaltetes Plasmid. Man geht davon aus, dass die Penicillinresistenz von Enterococci zu Streptococci zu Staphylococci durch diesen letztgenannten Mechanismus übertragen wird.
Darüber hinaus vernichten Antibiotika häufig nützliche, nicht pathogene Mikroorganismen (nämlich Flora) im Gastrointestinaltrakt die zur Verdauungsfunktion und Gesundheit beitragen. Dementsprechend entstehen Rückfälle (die Rückkehr von Infektionen und ihrer assoziierten Symptome) und sekundäre opportunistische Infektionen häufig aufgrund der Verringerung von Milchsäure produzierender und anderer nützlicher Flora im Gastrointestinaltrakt. Die meisten, wenn nicht alle Milchsäure produzierenden oder probiotischen Bakterien sind extrem empfindlich gegenüber üblich antibiotischen Komponenten. Während des üblichen Verlaufes einer antibiotischen Therapie entwickeln viele Individuen eine Anzahl von schädlichen physiologischen Nebenwirkungen einschließlich: Durchfall, Koliken und manchmal Verstopfung. Diese Nebenwirkungen beruhen im wesentlichen auf der nicht selektiven Wirkung von Antibiotika, da Antibiotika nicht die Fähigkeit besitzen zwischen nützlichen, nicht pathogenen und pathogenen Bakterien zu unterscheiden, beide Bakterientypen werden durch diese Agenzien vernichtet. Dies führt dazu, dass Individuen, die Antibiotika nehmen, häufig gastrointestinale Beschwerden haben, und zwar als Ergebnis der Tötung oder schweren Schädigung nützlicher Mikroorganismen (nämlich der Intestinalflora), die üblicherweise den Gastrointestinaltrakt besiedeln. Die sich daraus ergebende Änderung in der Zusammensetzung der intestinalen Flora kann in Vitaminmangel resultieren, wenn die vitaminproduzierenden Intestinalbakterien getötet werden, in Durchfall und Entwässerung und, noch schlimmer, in einer Krankheit, sollte der pathogene Organismus die verbleibenden nützlichen gastrointestinalen Bakterien überwachsen und ersetzen.
Zusätzlich zu der gastrointestinalen Mikroflora, können nützliche und/oder pathologische Organismen auch die Mundhöhle, den Genitalbereich und die Vagina besiedeln (siehe z.B. Thomason, et al, 1991. Am. J. Obstet Gynecol. 165: 1210–1217; Marsh, 1993. Caries Res. 27: 72–76; Lehner, 1985. Vaccine 3: 65–68; Hill & Embil, 1986, Can. Med. Assoc. J. 134: 321–331). Die Verwendung antimikrobieller Medikamente kann in ähnlicher Weise ein Ungleichgewicht bei diesen Mikroorganismen hervorrufen und es wurde die therapeutische Verwendung probiotischer Bakterien, wie der Lactobacillus Stämme, die diese Bereiche besiedeln, beschrieben (siehe z.B. Winberg, et al., 1993, Pediatr. Nephrol. 7: 509–514; Malm et al., 1996, Ann. Mar. Metab. 40: 137–145, U.S. Patent Nr. 5,176,911). Eine steigende Anzahl pathogener Mikroorganismen entwickelte eine antibiotische Resistenz, was die Entwicklung und die Verwendung von Antibiotika der zweiten und dritten Generation erforderte. Mikroorganismen, die gegen eine Vielzahl von Medikamenten resistent sind, entwickelten sich ebenfalls, häufig mit einer multiplen Mediamentenresistenz, die sich zwischen Spezies ausbreitete, woraus sich ernsthafte Infektionen ergeben, die nicht durch den Einsatz von Antibiotika kontrolliert werden können.
Darüber hinaus treten opportunistische mikrobielle Infektionen häufig bei Individuen mit geschwächtem Immunsystem auf. Individuen mit geschwächtem Immunsystem haben eine geschwächte natürliche Immunität, die pathogenen Mikroorganismen das Überleben und Wachsen ermöglicht und dies entweder intern oder extern, was aufgrund der geschwächten Immunantwort des Individuums auf den Pathogen erfolgt. Immunschwäche kann das Ergebnis genetischer Verhältnisse, von Krankheiten wie AIDS oder von therapeutischen Behandlungen wie die Krebstherapie (Chemotherapie oder Bestrahlung) und von arzneimittelbedingter Immunsuppresion sein, die einer Organtransplantation folgt. Die Behinderung pathogener Mikroorganismen durch Probioten ist bei der Verhinderung und Behandlung opportunistischer Infektionen hilfreich, insbesondere bei Individuen mit Immunschwäche.
Dementsprechend besteht ein Bedarf an präventiv wirkenden und therapeutischen Agentien, die das Wachstum pathogener Mikroorganismen ohne die Verwendung antibiotischer Chemikalien kontrollieren können, gegenüber denen die Mikroorganismen bereits resistent sind oder anschließend resistent werden können. Probioten können entweder intern oder extern appliziert werden, um die Balance nützlicher Mikroorganismen zu pathogenen Spezien wiederherzustellen, ohne dabei gleichzeitig zur Bildung von arzneimittelresistenten Pathogenen beizutragen. Milchsäure produzierende Bakterien (beispielsweise Bacillus, Lactobacillus und Streptokokken Spezies) wurden als Nahrungsergänzungen verwendet und es gibt einige Behauptungen, dass diese einen ernährungs- und therapeutischen Wert aufweisen (siehe z.B. Gorbach, 1990. Ann. Med. 22: 27–41; Reid, et al., 1990. Clin. Microbiol. Rev. 3, 335–344).
Darüber hinaus wurden einige Milchsäure produzierende Bakterien (z.B. die zur Herstellung von Jogurth verwendeten) vorgeschlagen, die antimutagene und anti-cancerogene Eigenschaften aufweisen, die in der Vermeidung menschlicher Tumoren nützlich sind. (siehe z.B. Pool-Zobel, et al., 1993. Nutr. Cancer 20: 261–270; U.S. Patent Nr. 4,347,240). Es wurde ferner gezeigt, dass einige Milchsäure produzierende Bakterien Bakteriozine produzieren, wobei es sich um inhibierende Metaboliten handelt, die für antimikrobielle Effekte von Bakterien verantwortlich sind (Kleanhammer, 1993. FEMS Micorbiol. Rev. 12: 39–85; Barefoot & Nettles, 1993. J. Dairy Sci. 76: 2366–2379). Ausgewählte Lactobacillus Stämme, die Antibiotika produzieren, wurden als wirksam in der Behandlung von Infektionen, Sinusitis, Hämorrhiden, dentalen Entzündungen und anderen entzündlichen Zuständen beschrieben (siehe U.S. Patent Nr. 4,314,995). In ähnlicher Weise wurde gefunden, dass Lactobacillus reuteri Antibiotika produziert mit einer Aktivität gegen gramnegative und grampositive Bakterien, Hefe und Protozoen (siehe U.S. Patent 5,413,960 und U.S. Patent 5,439,678). Lactobacillus casei asp. rhamnosus Stamm LC-705, DSM 7061 wurden allein oder in Kombination mit Propionibacterium Spezies in fermentischer Nährlösung als hemmend gegenüber Hefe und Schimmel in Nahrungsmittel und Silage beschrieben (U.S. Patent 5,378,458). Darüber hinaus wurden anti-fungale Serratia Spezies zu Tierfutter und/oder Silage hinzugefügt, um das Tierfutter zu erhalten, insbesondere Serratia rubidaea FB299, allein oder in Kombi nation mit dem anti-fungalen Bacillus subtilis (Stamm P3260). Siehe U.S. Patent Nr. 5,371,011.
Bacillus coagulans ist ein nicht pathogenes grampositives Sporen bildendes Bakterium, das L(+) Milchsäure (rechtsdrehend) in der Homofermentation bildet. Dieser Mikroorganismus wurde aus natürlichen Quellen isoliert, wie beispielsweise aus wärmebehandelten Bodenproben, die in Nährmedium eingeimpft wurden (siehe z.B. Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, Vol. 2, Sneath, P. H. A., et al., eds., (Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1986). Gereinigte Bacillus coagulans Stämme dienten als Quelle verschiedener Enzyme einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: Restriktion Endonuclease (siehe U.S. Patent Nr. 5,200,336); Amylase (siehe U.S. Patent 4,980,180); Lactase (siehe U.S. Patent Nr. 4,323,651); und Cyto-Malto-Dextrin Glucano-Transferase (siehe U.S. Patent Nr. 5,102,164). Bacillus coagulanz wurde genutzt, um Milchsäure herzustellen (siehe U.S. Patent Nr. 5,079,164). Darüber hinaus wurde ein Stamm von Bacillus coagulans (als Lactobacillus sporogenes, Sakaguti & Nakayama (ATCC 31284) bezeichnet) mit anderen Milchsäure produzierenden Bakterien kombiniert und Bacillus natto, um ein fermentiertes Nahrungsprodukt aus gedämpften Sojabohnen herzustellen (siehe U.S. Patent Nr. 4,110,477). Stämme von Bacillus coagulans wurden ebenfalls als Additive für Tierfutter für Geflügel und Vieh verwendet, um Krankheiten zu verringern und die Futterausnutzung zu verbessern und um daher die Wachstumsrate von Tieren zu verbessern (siehe Internationale Patentanmeldungen Nr. WO 9313187 und WO 9411492).
Dementsprechend besteht ein Bedarf an einer hoch effizienten biorationalen Therapie, die pathogene Spezies im Verdauungstrakt sowohl von Menschen als auch vor Tieren verringert, und zwar durch die Besiedlung (oder erneute Besiedlung) des Gastrointestinaltraktes mit probiotischen Mikroorganismen, gefolgt von der Anwendung von Antibiotika, anti-fungalen, anti-viralen und ähnlichen Agenzien.
Hautinfektionen, speziell die durch mycotische Pathogene hervorgerufenen, machen einen erheblichen Prozentsatz des Verkaufes von verschreibungspflichtigen und nicht verschreibungspflichtigen Medikamenten aus, die weltweit jährlich verkauft werden. Nach dem Center for Disease Control and Prevention (CDCP) besteht derzeit ein dramatischer Anstieg in der Anzahl der berichteten mycotischen und bakteriellen Hautinfektionen. Die jährlichen Verkäufe von Haut- und cuticularen Antipilzmitteln übersteigt derzeit zwei Milliarden US. Dollar/Jahr. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass dermale mycotische Krankheiten mit einer Rate von 9 % bis 15 % pro Jahr zunehmen, was von dem spezifischen Pathogen und der Krankheit abhängt. Einer der primären Faktoren, die für das Wachstum dieser Märkte verantwortlich ist, ist die Tatsache, dass jedes Jahr mehr fungale Pathogene gegenüber üblicherweise angewandten Antipilzmitteln resistent werden. Beispiele für üblicherweise angewandte Antipilzmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Fluconazole (Diflucan^®; Pfizer Pharamceutical), Intraconazole (Sporonox^®; Janssen Pharmaceutical), Miconazole Nitrate, Ketoconazole, Tolnaftate, Lamasil, Griseofulvin, Amphotercin B, sowie andere Komponenten und deren Formulierungen.
Jedes Jahr werden neue Generationen antifungaler und antibakterieller Medikamente und Präparaten entwickelt, um die Medikation zu ersetzen, gegenüber der die Pathogene Resistenz entwickelt haben. In dem Maße, in dem die Suche nach effektiveren anti-mikrobiellen Agentien fortschreitet, gilt dies auch für Suche nach „Trägeragentien", die benötigt werden, um die Verteilung und das Penetrieren dieser Medikamente durch die verschiedenen dermalen und cuticularen Membranen und Gewebe zu erleichtern. Jedoch besteht heute nur ein geringer Erfolg beim Auffinden eines Agens, das in der Lage ist, ein dichtes cuticulares Material, wie z.B. Finger/Nägel und Tierhufe zu durchdringen.
Die üblichsten Krankheiten bei menschlichen dermalen und cuticularen Membranen umfassen: (i) Candidaiasis (z.B. hervorgerufen durch Candida albicans, Candida tropicalis, Candida golbretta, Candida parapsosis); (ii) Tineale Krankheiten, auch bekannt als Fußpilz (Tinea Pedis), Leistenbeugenmykose (Tinea Cruis), Kopfhautinfektion (Tinea Capitis), Ringelflechte, and Bart Infektionen (Tinea Barbae), die alle durch Trichophyton Spezies hervorgerufen werden, einschließlich aber nicht be schränkt auf: Trichophyton mentagrophytes; (iii) Krankheiten, die durch bakterielle Pathogene hervorgerufen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Pseudomonas aeruginose, Staphylococcus aerues, Staphylcoccus epidermus und Propionibacterium acens; und (iv) Krankheiten, die durch virale Pathogene verursacht werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf: Herpes Simplex I & II und Herpes Zoster. Vielleicht sind mit am schwersten zu behandelnde Krankheiten fungaler Ätiologie fungale Infektionen des Zehen- oder des Fingernagels (nämlich Onychomycosis), was auf die Unfähigkeit der derzeit erhältlichen therapeutischen Zusammensetzungen zurückzuführen ist, die Dermis oder die Cuticula zu durchdringen. Der am häufigsten mit dieser sehr schwer zu behandelnden Krankheit in Verbindung zu bringende Pathogen ist Trichophyton rubrum.
Bei Tieren ist die häufigste dermale fungale Krankheit die Ringelfächte. In Tierhufen, insbesondere von athletischen Pferden gibt es verschiedene Krankheiten der Hufe, die möglicherweise ziemlich ernst und schwer zu behandeln sind, einschließlich: Erkrankung der weißen Linie („White Line Disease", ebenfalls bekannt als „Seedy Toe"), Strahlfäule („Hoof Thrush", eine weitere Hefe- oder Candida-bezogene Krankheit) und Vollhuf („Drop Sole"). Darüber hinaus ist Klumphuf („Clubbed Foot") eine weitere dermale fungale Krankheit, die für die Pferdeindustrie von signifikantem Interesse ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Erkenntnis, dass Bacillus coagulans Spezies die Fähigkeit besitzen eine probiotische Aktivität in aeroben Bedingungen unter entfalten wie auf Haut oder Schleimhautmembrangeweben und dabei zahlreiche Zustände behandeln, kontrollieren und/oder verhindern, die durch bakterielle, fungale, Hefe und virale Infektionen, oder deren Kombinationen hervorgerufen sind. Die vorliegende Erfindung umfasst therapeutische Zusammensetzungen, gefertigte Gegenstände und Verfahren, die zur Vermeidung verschiedener mikrobieller Infektionen genutzt werden, die durch Bakterien, Hefen, Pilze oder Viren hervorgerufen sind, die isolierte Bacillus coagulans Spezies und Pseudomonas lindbergii Stämme verwenden.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit gestellt, die einen Pseudomonas lindbergii Überstand, einen Bacillus coagulans Überstand, ein antifungales Mittel und Emuöl in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst und die für die topische Aufbringung auf die Haut oder eine Schleimhautmembran eines Säugers geeignet ist. In diesen vorgenannten Zusammensetzungen kann der Träger eine Emulsion, Creme, Lotion, eine Paste, ein Gel, Öl, eine Salbe, eine Suspension, ein Aerosolspray, Pulver, ein Aerosolpulver oder eine halbfeste Formulierung sein.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Pseudomonas lindbergii Überstand, einen Bacillus coagulans Überstand, ein antifugales Mittel und Emuöl umfasst, und zwar für die Herstellung eines Medikamentes zur Behinderung des Wachstums von Bakterien, Hefen, Pilzen, Viren oder einer Kombination davon, umfassend die topische Anwendung dieser Zusammensetzung auf der Haut oder einer Schleimhautmembran eines Säugers, wobei die Zusammensetzung ausreichend lange vorhanden ist, um das Wachstum der Bakterien, Hefen, Pilze, Viren oder Kombinationen davon zu behindern.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung vorgeschlagen, umfassend einen Bacillus coagulans Überstand, einem Pseudomonas lindbergii Überstand, ein antifugales Mittel und Emuöl zur Verwendung der Behinderung des Wachstums von Bakterien, Hefen, Pilzen und Viren.
Eine Ausführungsform umfasst des weiteren die Schritte der Bereitstellung der Sporen von Bacillus coagulans Spezies in der probiotischen Zusammensetzung, wobei die Sporen nach der Applikation auskeimen. In einer weiteren Ausführungsform verhindert der Schritt des Wachsens von Bacillus coagulans das Wachstum einer oder mehrerer mikrobieller Spezies, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Staphylococcus Spezies, Streptococcus Spezies, Pseudomonas Spezies, Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Propionibacterium acnes, Blastomyces Spezies, Pneumocystis carinii, Aeromonas hydrophilia, Trichosporon Spezies, Aspergillus Spezies, Proteus Spezies, Acremonium Spezies, Cryptococcus neoformans, Microsporum Spezies, Aerobacter Spezies, Clostridium Spezies, Klebsiella Spezies, Candida Spezies und Trichophyton Spezies. Darüber hinaus werden bestimmte Virenspezies behindert (z. B. Herpes simplex I und II, und Herpes zoster). In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist der Schritt der Applikation die Anwendung einer probiotischen Zusammensetzung in Form einer Creme, Lotion, Gel, Öl, Salbe, Suspension, Aerosolspray, Pulver, Aerosolpulver oder einer halbfesten Formulierung.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein gefertigter Gegenstand bereit gestellt, der einen flexiblen Gegenstand und eine wirksame Menge eines extrazellularen Produktes, das einen Überstand oder Filtrat einer Kultur eines Pseudomonas lindbergii Stammes, eines extrazellulären Produktes, das einen Überstand oder Filtrat einer Kultur eines Bacillus coagulans Stammes, ein antifugales Mittel und Emuöl umfasst, das auf den genannten flexiblen Gegenstand appliziert wird, wobei der flexible Gegenstand getragen werden soll oder an der Haut oder der Schleimhautmembran eines Säugers befestigt werden soll, so dass die antimikrobielle Aktivität des extrazellulären Produktes benachbart zu oder auf der Haut oder Schleimhautmembran zur Wirkung kommt.
In einer Ausführungsform umfasst der Applikationsschritt die Applikation der Zusammensetzung an eine Windel, an ein nachgiebiges Material zum Abwischen der Haut oder einer Schleimhautmembran an einem Hautpflaster, an einem adhäsiven Band, an einem adsorbierenden Tupfer, Tampon oder Kleidungsstück. In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst der Applikationsschritt die Imprägnierung der Zusammensetzung in eine faserförmige oder nichtfaserförmige feste Matrix.
Dementsprechend wird gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung ein therapeutisches System bereit gestellt, und zwar zur Verhinderung des Wachstums von Bakterien, Hefen, Pilzen und Viren oder einer Kombination davon umfassend einen Behälter mit einem Etikett und einer Zusammensetzung die einen Bacillus coagulans Überstand, einen Pseudomonas lindbergii Überstand, ein antifungales Mittel und Emuöl umfasst, wobei das Etikett Instruktionen zur Verwendung der Zusammensetzung zur Behinderung des Wachstums enthält.
Die vorliegende Erfindung bietet verschiedene Vorteile insoweit als die Nutzung von Antibiotika einen negativen Effekt aufgrund der Möglichkeit gegen antibiotikaresistente mikrobielle Spezies zu produzieren, mit sich bringt, ist es insbesondere anzustreben, eine antimikrobielle Therapie bereit zu stellen, die nicht übliche antimikrobielle Reagenzien nutzt. Die vorliegende Erfindung trägt nicht zu der Produktion einer zukünftigen Generation von Pathogenen bei, die gegen Antibiotika resistent sind.
Es versteht sich, dass sowohl die vorausgegangene allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung lediglich beispielhaft und zum Zwecke der Erläuterung dargestellt sind und nicht die beanspruchte Erfindung beschränken.
1: zeigt verschiedene Stoffwechselaktivitäten und die damit verbundene charakteristische physiologische oder biochemische Reaktion in Bacillus coagulans.
2: zeigt die verschiedenen Pathogene, die durch Verwendung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen behandelt werden können, sowie deren zugehörige Erkrankungen.
3: führt die getesteten Pilzstämme der Spezies Trichophyton (erhältlich von American Type Culture Collection (ATTC, Rockville, Maryland), deren zugehörige ATTC-Zugriffsnummern und die Ergebnisse der der in-vitro-Hemmung durch Bacillus coagulans auf.
4: führt die getesteten fähigen Hefestämme der Spezies Candida (erhältlich von American Type Culture Collection (ATTC, Rockville, Maryland), deren zugehörige ATTC-Zugriffsnummern und die Ergebnisse der in-vitro-Hemmung durch Bacillus coagulans auf.
5: zeigt eine Wellenlängen-Abtastung von Bacillus-coagulans-Überständen (Tafel A) und Pseudomonas-lindbergii-Überständen (Tafel B) mit einem Wasser-Blindwert.
6: zeigt eine Wellenlängen-Abtastung von Bacillus-coagulans-Überständen (Tafel A) und Pseudomonas-lindbergii-Überständen (Tafel B) mit einem LB-Nährlösungs-Blindwert.
7: zeigt eine 12%ige SDS PAGE von Pseudomonas-lindbergii-Proteinen. Die linke Spur sind Molecular-Weight-Marker.
8: zeigt eine 12%ige SDS PAGE von Bacillus-coagulans-Proteinen. Die linke Spur sind Molecular-Weight-Marker.
9: zeigt eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie eines mit Acetonitril extrahierten Pseudomonas-lindbergii-Überstands.
10: zeigt eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie eines mit Acetonitril extrahierten Bacillus-coagulans-Überstands.
11: zeigt in tabellarischer Form einen Vergleich des Antipilzmittels Fluconazol mit Bacillus-coagulans- und Pseudomonas-lindbergii-Überständen (allgemein als Gandenden-Überstand bezeichnet) bei der Hemmung verschiedener Bakterien-, Pilz- und Hefearten.
Die Einzelheiten einer oder mehrerer Ausführungen der Erfindung werden in der nachstehenden Begleitbeschreibung dargelegt. Bei der Umsetzung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung können Verfahren und Materialien verwendet werden, die zu den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, doch werden nun die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung gehen aus der Beschreibung und den Ansprü chen hervor. In der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen umfassen Formen im Singular auch Pluralangaben, sofern der Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes vorgibt. Sofern nicht anders festgelegt, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie vom Durchschnittsfachmann des Gebiets, in das diese Erfindung fällt, allgemein verstanden wird. Sofern nicht ausdrücklich etwas Gegenteiliges angegeben wird, sind die hierin eingesetzten oder erwogenen Techniken Standardverfahren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Die Beispiele der Ausführungen dienen lediglich dem Zweck der Veranschaulichung.
Der Betriff „probiotisch", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Hefen, Viren und/oder Pilze), die mindestens einen Teil der Durchgangsflora oder endogenen Flora bilden und somit eine vorteilhafte prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung auf den Wirtsorganismus ausüben. Probiotika sind dem Durchschnittsfachmann allgemein als klinisch unbedenklich bekannt (d.h. nicht-pathogen). Obwohl das Gebundensein an einen bestimmten Mechanismus nicht erwünscht ist, wird angenommen, dass die probiotische Aktivität der Bacillus-Spezien aus der kompetitiven Hemmung des Wachstums von Pathogenen aufgrund überlegener Besiedelung, Parasitismus unerwünschter Mikroorganismen, Milchsäurebildung und/oder anderer extrazellulärer Produkte mit antimikrobieller Aktivität oder Kombinationen derselben herrührt.
Der Begriff „mikrobiell", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Bakterien, Hefen, Pilze und/oder Viren.
Die vorliegende Erfindung offenbart die Fähigkeit, die Bacillus-Spezien in therapeutischen Zusammensetzungen als Probiotikum zur Verhinderung und/oder Bekämpfung von Infektionen zu verwenden, die durch Pathogene verursacht werden, einschließlich aber nicht ausschließlich mikrobielle Infektionen, Hefe-, Pilz- oder Virusinfektionen. Wie nachstehend beschrieben wird, können diese Zusammensetzungen aufgrund der Tatsache, dass das Bakterium als lebensfähiger Organismus vorliegt, entweder als vegetative Zelle oder als Spore, und das interessierende Gewe be besiedelt, in einer Vielzahl von Konfigurationen formuliert werden. Im Einzelnen können die Zellen/Sporen in therapeutischen Zusammensetzungen, die für eine topische Anwendung bei einem Gewebe geeignet sind, oder in Suspensionen, beispielsweise einem Bad, oder auf biegsamen Materialien wie Windeln, Pflastern, Tampons und ähnlichen Artikeln des persönlichen Bedarfs verwendet werden, wobei alle auf das Ziel des topischen Aufbringens von Bakterien auf die Haut oder ein Schleimhautgewebe gerichtet sind.
Die prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung von eine Milchsäure erzeugenden Bakterien der vorliegenden Erfindung ergibt sich zum Beispiel – und nicht als Beschränkung auf einen bestimmten Mechanismus gedacht – zum Teil aus einer kompetitiven Hemmung des Wachstums von Pathogenen aufgrund: (i) ihrer ausgezeichneten Besiedelungsfähigkeiten; (ii) dem Parasitismus unerwünschter Mikroorganismen; (iii) der Erzeugung von Milchsäure und/oder anderer extrazellulärer Produkte, die eine antimikrobielle Aktivität besitzen; oder (iv) verschiedener Kombinationen derselben. Zu beachten ist, dass die oben erwähnten Produkte und Aktivitäten des Milchsäure erzeugenden Bacillus der vorliegenden Erfindung synergistisch wirken, um die hierin offenbarte vorteilhafte probiotische Wirkung zu erzeugen.
Ein probiotisches Bakterium, das zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzung geeignet ist: (i) besitzt die Fähigkeit, Milchsäure zu erzeugen; (ii) weist eine vorteilhafte Funktion auf; und (iii) ist nicht pathogen. Geeignete Bakterien werden hierin beispielhaft und nicht einschränkend genannt und beschrieben, wenngleich zu beachten ist, dass die vorliegende Erfindung in Bezug auf die Offenbarung der Zwecke und Ziele nicht auf die derzeit klassifizierten Bakterienarten beschränkt ist. Die physiochemischen Ergebnisse der in vivo Erzeugung von Milchsäure sind ausschlaggebend für die Wirksamkeit der probiotischen, Milchsäure erzeugenden Bakterien der vorliegenden Erfindung. Die Milchsäureproduktion senkt den pH-Wert (d.h. erhöht die Azidität) innerhalb der lokalen mikrofloralen Umgebung erheblich und trägt nicht zum Wachstum vieler unerwünschter, physiologisch schädlicher Bakterien, Pilze und Viren bei. Dadurch hemmt das Probiotikum durch den Mechanismus der Milchsäureproduktion das Wachstum von konkurrierenden pathogenen Bakterien.
Typische Milchsäure erzeugende Bakterien, die als Probiotikum dieser Erfindung brauchbar sind, sind effiziente Milchsäureerzeuger, die nicht pathogene Mitglieder der Spezies Bacillus coagulans umfassen, die Bakteriocine oder andere Zusammensetzungen erzeugen, die das Wachstum pathogener Organismen hemmen. Beispielhafte Milchsäure erzeugende, nicht pathogene Spezien von Bacillus coagulans umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt: Bacillus coagulans; Bacillus coagulans Hammer und Bacillus brevis Unterspezies coagulans.
Die bei der Ausübung der Erfindung verwendeten Bacillus-Spezien umfassen: die Bacillus-coagulans-Spezien, die die Fähigkeit zur Sporenbildung haben und Gewebe aerobisch besiedeln können. Es gibt eine Vielzahl verschiedener Spezien von Bacillus coagulans, einschließlich aber nicht ausschließlich viele verschiedene Stämme, die von gewerblichen und öffentlichen Quellen bezogen werden können, beispielsweise der American Tissue Culture Collection (ATTC). Bacillus-coagulans-Stämme sind zum Beispiel unter den ATTC-Zugriffsnummern 15949, 8038, 35670, 11369, 23498, 51232, 11014, 31284, 12245, 10545 und 7050 erhältlich.
Eine Bacillus-coagulans-Spezies ist für die vorliegende Erfindung aufgrund der Eigenschaften besonders geeignet, die sie mit den Spezien der Gattung Bacillus gemein hat, einschließlich aber nicht ausschließlich die Fähigkeit zur Bildung von Sporen, die relativ beständig gegen Wärme und andere Bedingungen sind, was sie ideal zur Lagerung (Haltbarkeit) in Produktformulierungen und ideal für das Überleben und die Besiedelung von Geweben unter Bedingungen wie pH, Salzhaltigkeit und dergleichen bei Geweben macht, die einer mikrobiellen Infektion ausgesetzt wurden. Das probiotische Bacillus coagulans ist nicht pathogen und wird von der US-Arznei- und Lebensmittelbehörde (FDA) und dem US-Landwirtschaftsministerium (USDA) und von der Fachwelt im Allgemeinen als unbedenklich betrachtet (d.h. GRAS-Klassifizierung). Weitere nützliche Eigenschaften der Bacillus Spezien umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt: Apathogenität, die Tatsache, dass sie aerob, fakultativ und heterotroph sind, wodurch die Spezien unbedenklich sind, und Haut, Schleimhautgewebe und verschiedene andere interessierende Gewebe besiedeln können.
Da die Spezies Bacillus coagulans die Fähigkeit zur Erzeugung wärmebeständiger Sporen besitzt, ist sie für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die bei der Herstellung Wärme und Druck erfordern, besonders brauchbar. Dementsprechend sind Formulierungen, die den Einsatz von lebensfähigen Bacillus-Sporen in einem pharmazeutisch zulässigen Träger umfassen, für die Herstellung und Verwendung von in der vorliegenden Erfindung offenbarten Zusammensetzungen besonders bevorzugt. Das Züchten dieser verschiedenen Bacillus-Spezien zur Bildung von Zellkulturen, Zellpasten und Sporenpräparaten ist auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung werden gereinigte Bacillus coagulans als Probiotikum für die biologische Bekämpfung verschiedener mikrobieller Pathogene verwendet. Da Bacillus coagulans wärmebeständige Sporen bilden, sind sie besonders geeignet für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung mikrobieller Infektionen. Topische Formulierungen, die lebensfähige Bacillus-coagulans-Sporen in einem pharmazeutisch zulässigen Träger aufweisen, sind für die Herstellung und Verwendung präventiver und therapeutischer erfindungsgemäßer Zusammensetzungen besonders bevorzugt. Der Begriff „topisch" wird hier breit gefasst verwendet und soll sowohl Epidermis- und/oder Hautflächen als auch Schleimhautflächen des Körpers umfassen.
Die grampositiven Stäbchen von Bacillus coagulans weisen einen Zellendurchmesser von über 1,0 μm auf, mit variabler Schwellung des Sporangiums, ohne Bildung von parasporalem Kristall. Bacillus coagulans ist ein nicht pathogenes, grampositives, sporenbildendes Bakterium, das unter homofermentativen Bedingungen L(+)-Milchsäure (rechtsdrehend) erzeugt. Es wird aus natürlichen Quellen wie wärmebehandelten Bodenproben, mit denen ein Nährmedium angeimpft wird, isoliert (siehe z.B. Bergeys Manual of Systemic Bacteriology, Bd. 2, Sneath, P.H.A. et al., Hrsg., Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1986). Gereinigte Bacillus-coagulans-Stämme dienen als Quelle für Enzyme, einschließlich Endonukleasen (z.B. U.S. Patent Nr. 5,200,336); Amylase (U.S. Patent Nr. 4,980,180); Laktase (U.S. Patent Nr. 4,323,651) und Cyclo-Maltodextrin-Glucantransferase (U.S. Patent Nr. 5,102,800). Bacillus coagulans wird auch zur Erzeugung von Milchsäure (U.S. Patent Nr. 5,079,164) verwendet. Ein Bacillus-coagulans-Stamm (auch als Lacfobacillus sporogenes bezeichnet; Sakaguti & Nakayama, ATCC Nr. 31284) wird mit anderen Milchsäure erzeugenden Bakterien und Bacillus natto kombiniert, um aus gedünsteten Sojabohnen ein fermentiertes Nahrungsmittel zu erzeugen (U.S. Patent Nr. 4,110,477). Bacillus-coagulans-Stämme werden auch als Tierfutterzusätze für Geflügel und Vieh verwendet, um Krankheiten einzudämmen und die Futteraufnahme zu verbessern und daher die Wachstumsgeschwindigkeit der Tiere zu steigern (Internationale PCT-Patentanmeldungen Nr. WO 9314187 und Nr. WO 9411492). Insbesondere werden Bacillus-coagulans-Stämme als allgemeine Nahrungsmittelergänzungen und Mittel zur Bekämpfung von Verstopfung und Durchfall bei Menschen und Tieren verwendet.
In der vorliegenden Erfindung verwendete gereinigte Bacillus-coagulans-Bakterien sind von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) unter Verwendung folgender Zugriffsnummern erhältlich: Bacillus coagulans Hammer NRS 727 (ATCC Nr. 11014); Bacillus coagulans Hammer Stamm C (ATCC Nr. 11369); Bacillus coagulans Hammer (ATCC Nr. 31284) und Bacillus coagulans Hammer NCA 4259 (ATCC Nr. 15949). Gereinigte Bacillus-coagulans-Bakterien sind auch von der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Deutschland) unter Verwendung folgender Zugriffsnummern erhältlich: Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSM Nr. 2356); Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSM Nr. 2383, entspricht ATCC Nr. 11014); Bacillus coagulans Hammer (DSM Nr. 2384, entspricht ATCC Nr. 11369) und Bacillus coagulans Hammer (DSM Nr. 2385, entspricht ATCC Nr. 15949). Bacillus-coagulans-Bakterien sind auch von gewerblichen Lieferanten wie Sabinsa Corporation (Piscataway, NJ) oder K.K. Fermentation (Kyoto, Japan) beziehbar.
Bacillus-coagulans-Stämme und deren Wachstumsanforderungen wurden bereits beschrieben (siehe z.B. Baker, D. et al, 1960. Can. J. Microbiol. 6: 557–563; Nakamura, H. et al, 1988. Int. J. Syst. Bacteriol. 38: 63–73). Ferner können verschiedene Stämme von Bacillus coagulans auch aus natürlichen Quellen (z.B. wärmebehandelten Bodenproben) mit Hilfe bekannter Verfahren (siehe z.B. Bergeys Manual of Systemic Bacteriology, Bd. 2, S. 1117, Sneath, P.H.A. et al., Hrsg., Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1986) isoliert werden.
Zu beachten ist, dass Bacillus coagulans früher angesichts der Tatsache, dass dieses Bakterium wie ursprünglich beschrieben als Lactobacillus sporogenes bezeichnet wurde (siehe Nakamura et al. 1988. Int. J. Syst. Bacteriol. 38: 63–73), fälschlich als Lactobacillus dargestellt wurde. Die ursprüngliche Klassifizierung war aber inkorrekt, da Bacillus coagulans Sporen bildet und Stoffwechsel L(+)-Milchsäure ausscheidet, beides Aspekte, die wichtige Merkmale für seine Nützlichkeit darstellen. Diese Entwicklungs- und Stoffwechselaspekte machten es stattdessen erforderlich, das Bakterium als Milchsäure-Bacillus zu klassifizieren, und daher wurde es neu klassifiziert. Des weiteren wird allgemein nicht beachtet, dass die klassischen Lactobacillus-Spezien aufgrund ihrer Instabilität in der ätzenden (d.h. sauren) pH-Umgebung der Galle, insbesondere der menschlichen Galle, für die Besiedelung des Darms ungeeignet sind. Bacillus coagulans kann dagegen im Magendarmtrakt der Gallenumgebung überleben und diesen besiedeln und kann sogar in diesem niedrigen pH-Bereich wachsen. Im Einzelnen unterscheidet sich die Gallenumgebung des Menschen von der Gallenumgebung von Tiermodellen, und bisher gab es keine zutreffenden Beschreibungen des Wachstums von Bacillus coagulans in menschlichen Magendarmtraktmodellen.
Bacillus coagulans ist aerob und fakultativ, wird üblicherweise bei einem pH von 5,7 bis 6,8 in einer Nährlösung gezüchtet, die bis zu etwa 2% (nach Gewicht) NaCl enthält, wenngleich weder NaCl noch KCl für das Wachstum unbedingt erforderlich sind. Ein pH-Wert von etwa pH 4 bis pH 6 ist für die Auslösung der Sporenbildung optimal. Er wächst optimal bei etwa 30°C bis etwa 55°C, und die Sporen können einer Pasteurisierung standhalten. Bei Verwendung einer Nitrat- oder Sulfatquelle weist er fakultatives und heterotrophes Wachstum auf. Weitere Stoffwechseleigenschaften von Bacillus coagulans werden in 1 zusammengefasst.
Bacillus coagulans kann in verschiedenen Medien kultiviert werden, wenngleich sich gezeigt hat, dass bestimmte Vermehrungsbedingungen eine Kultur erzeugen, die ein hohes Maß an Sporenbildung ergibt. Die Sporenbildung wird zum Beispiel gefördert, wenn das Kulturmedium 10 mg/l Mangansulfat enthält, was ein Verhältnis von Sporen zu vegetativen Zellen von etwa 80:20 ergibt. Ferner erzeugen bestimmte Vermehrungsbedingungen eine Bakterienspore, die ein Spektrum von Stoffwechselenzymen enthält, die für die vorliegende Erfindung besonders geeignet sind (d.h. Bekämpfung mikrobieller Infektionen). Auch wenn durch diese speziellen Vermehrungsbedingungen erzeugte Sporen bevorzugt sind, sind durch alle kompatiblen Vermehrungsbedingungen erzeugte Sporen für die Erzeugung eines in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Bacillus coagulans geeignet. Zu beachten ist, dass die bevorzugteste erfindungsgemäße Ausführung Bacillus coagulans in Sporenform statt in Form vegetativer Bakterien verwendet.
Die Herstellung eines vegetativen Bacillus-coagulans-Bakteriums und der Sporen wird nachstehend in dem Abschnitt über spezifische Beispiele näher beschrieben.
Bacillus-coagulans-Kulturen enthalten Ausscheidungsprodukte, die eine antimikrobielle Aktivität aufweisen. Diese Ausscheidungsprodukte sind in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen brauchbar. Zellkulturen werden wie vorstehend beschrieben geerntet, und die Kulturüberstände werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren oder beides gesammelt, und der sich ergebende Überstand weist antimikrobielle Aktivität auf, die in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen brauchbar ist.
Die Herstellung extrazellulärer Produkte von Bacillus coagulans wird nachstehend in dem Abschnitt über spezifische Beispiele näher beschrieben.
Es ist klinisch gut belegt, dass viele Spezien von bakteriellen, mykotischen und Hefe-Pathogenen die Fähigkeit besitzen, verschiedene Erkrankungen hervorzurufen. Daher hemmt die Nutzung der probiotische Mikroorganismen enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung diese Pathogene, sie sind bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Symptomen nützlich, die mit einer Infektion durch diese erwähnten Pathogene in Verbindung stehen.
Durch Bacillus-coagulans-Aktivität gehemmte pathogene Bakterien umfassen zum Beispiel Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (d.h. enterohämorrhagische Spezies), zahlreiche Clostridium-Spezien (z.B. Clostridium perfingens, Clostridium botulinum, Clostridium tributrycum, Clostridium sporogenes und dergleichen); Gardnereia vaginalis; Proponbacterium acnes; Aeromonas hydrophia; Aspergillus-Spezien; Proteus-Spezien und Klebsiella-Spezien.
Pathogene Hefe und andere Pilze, die durch Bacillus-coagulans-Aktivität gehemmt werden, umfassen Candida albicans, Candida tropicalis und Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton interdigitale, Trichophyton rubrum und Trichophyton yaoundei.
Bacillus coagulans hemmt nachweislich auch Herpes-Simplex-Viren I (HSV-I; orale „Fieberbläschen" und Herpes Whitlow) sowie Infektionen mit Herpes simplex II (HSV-II, Herpes genitalis) und Herpes zoster (Gürtelrose).
Diese oben erwähnten Pathogene werden mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich aber nicht ausschließlich: Windelausschlag; orale, genitale, zervikale und vaginale Hefeinfektionen; toxisches Schocksyndrom; chronische mukokutane Candidaiasis; Dermatophytie; bakterielle Vaginose; Tinea-Pilzinfektionen (z.B. Tinea, Fußpilz und Leistenbeugenmykose); Pilzinfektionen von Kopfhaut und Nägeln, oberflächliche Hauterkrankungen (z.B. Erysipel, Infektionen offener Wunden, Akne, Abszess, Geschwür, Ekzem, Dermatitis, Kontaktdermatitis, Hypersensitinitis, Kontaktläsionen, Druckgeschwüre und Diabetesläsionen); ver schiedene opportunistische Infektionen; orale und genitale Virusläsionen und ähnliche Symptome sind auf dem Gebiet bekannt. Daher ist die topische Verwendung von Zusammensetzungen, die diese Pathogene hemmende Bacillus-coagulans-Wirkstoffe enthalten, bei der Verhinderung oder Behandlung dieser Symptome brauchbar.
Die verschiedenen Pathogene, die durch Verwendung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen behandelt werden können, sowie ihre zugehörigen Erkrankungen werden in 2 dargestellt. Es ist aber zu beachten, dass die in 2 aufgelisteten Pathogene nur als Beispiele aufgeführt sind und nicht die Arten von Organismen einschränken sollen, die durch die Verwendung der Verfahren oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden können. Dem entsprechend können durch die Verwendung der vorliegenden, hier offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren auch verschiedene andere haut- und schleimhaut-infizierende Mikroben und Deimatophyten behandelt werden.
Die oben erwähnte antimikrobielle Aktivität einer erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung wird nachstehend in dem Abschnitt über spezifische Beispiele näher beschrieben.
Bifidogene Oligosaccharide, wie sie hier bezeichnet werden, sind eine Klasse von Kohlenhydraten, die für das gezielte Fördern des Wachstums eines erfindungsgemäßen, Milchsäure herstellenden Bakteriums besonders geeignet sind. Diese Oligosaccharide umfassen – sind aber nicht hierauf beschränkt: Fructo-Oligosaccharide (FOS); Gluco-Oligosaccharide (GOS); andere langkettige Oligosaccharidpolymere von Fructose und/oder Glucose; sowie die Trisaccharid-Raffinose. Alle diese oben erwähnten Kohlenhydrate lassen sich nicht einfach von pathogenen Bakterien abbauen. Daher wird das gezielte Kultivieren von Milchsäure erzeugenden Bakterien durch die Verwendung dieser bifidogenen Oligosaccharide aufgrund der Nährstoffanforderungen dieser Klasse von Bakterien gegenüber pathogenen Bakterien gefördert.
Bifidogene Oligosaccharide sind langkettige Polymere, die nahezu ausschließlich durch die natürlichen im Darmtrakt vorkommenden Bifidobacteria und Lactobacillus verwendet werden und analog durch Bacillus verwendet werden können. Physiologisch schädliche Bakterien wie Clostridium, Staphylococcus, Salmonella und Escherichia coli können dagegen FOS oder andere bifidogene Oligosaccharide nicht umwandeln, und daher ermöglicht die Verwendung dieser bifidogenen Oligosaccharide in Kombination mit einem Milchsäure erzeugenden Bakterium der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise Bacillus coagulans, dass sich diese nützlichen probiotischen Bakterien vermehren und erfolgreich mit unerwünschten pathogenen Mikroorganismen im Magendarmtrakt konkurrieren und diese schließlich ersetzen.
Die Verwendung bifidogener Oligosaccharide in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bietet eine synergistische Wirkung, wodurch die Wirksamkeit der hierin offenbarten, Probiotikum enthaltenden Zusammensetzungen verstärkt wird. Diese Synergie manifestiert sich durch gezieltes Verstärken der Vermehrungsfähigkeit der probiotischen Bakterien durch beispielsweise Anheben des Umfangs der Nährstoffzugabe, was gezielt das Wachstum der probiotischen Bakterien gegenüber vielen anderen bakteriellen Spezies in dem infizierten Gewebe fördert.
Ferner lässt sich problemlos nachvollziehen, dass Bifidobacterium und Lactobacillus auch Milchsäurebildner sind. Bifidogene Oligosaccharide lassen diese oben erwähnten probiotischen Organismen gezielt gegenüber unerwünschten Bakterien im Magendarmtrakt gedeihen, wodurch der probiotische Zustand des Körpers durch weiteres Verbessern der Löslichkeit dieser Nährstoffe (ob sie nun aus Nahrung stammen oder das Ergebnis von Nahrungsergänzung sind) verbessert wird. Daher lässt das Vorhandensein der bifidogenen Oligosaccharide in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine wirksamere mikrobielle Hemmung durch Verbessern der Vermehrungsfähigkeit aller Abarten von probiotischen Bakterien zu und bietet daher diesen Vorteil.
Die erfindungsgemäßen bifidogenen Oligosaccharide können entweder allein oder in Kombination mit eine Milchsäure bildenden Mikroorganismen in einer therapeuti schen Zusammensetzung verwendet werden. Im Einzelnen zieht die vorliegende Erfindung aufgrund der wachstumsfördernden Aktivität von bifidogenen Oligosacchariden eine Zusammensetzung in Betracht, die ein bifidogenes Oligosaccharid umfasst, das in ausreichender Konzentration zur Wachstumsförderung von Milchsäure erzeugenden Mikroorganismen vorhanden ist. Wie hier gezeigt, können diese Konzentrationsmengen stark schwanken, da die probiotischen Mikroorganismen auf jede Stoffwechselmenge von Nährstoffoligosaccharid reagieren, und daher muss die vorliegende Erfindung nicht derart beschränkt werden.
Ein bevorzugtes und beispielhaftes Oligosaccharid ist Fructo-Oligosaccharid (FOS), wenngleich andere Kohlenhydrate ebenfalls entweder allein oder in Kombination verwendet werden können. FOS kann man aus einer Vielzahl natürlicher Quellen erhalten, einschließlich gewerblicher Lieferanten. Bei einem von natürlichen Quellen isolierten Produkt können die Komponenten stark schwanken und immer noch die nützliche Substanz, nämlich FOS, tiefem. FOS weist üblicherweise eine Polymerkettenlänge von etwa 4 bis 200 Zuckereinheiten auf, wobei die größeren Längen bevorzugt sind. Der Reinheitsgrad kann zum Beispiel schwanken, solange biologisch funktionsfähiges FOS in der Endformulierung vorhanden ist. Bevorzugte FOS-Formulierungen enthalten verglichen mit einfachen (Mono- oder Disaccharid-)Zuckern wie Glucose, Fructose oder Saccharose mindestens 50 Gewichtsprozent Fructo-Oligosaccharide, vorzugsweise mindestens 80% Fructo-Oligosaccharide (FOS), bevorzugter mindestens 90% und am bevorzugtesten mindestens 95%. Zuckergehalt und -zusammensetzung können durch eines einer Vielzahl komplexer analytischer Kohlenhydratdetektionsverfahren, wie sie gut bekannt sind, ermittelt werden. Bevorzugte FOS-Quellen umfassen – sind aber nicht hierauf beschränkt: Inulin; Frutafit IQ^TM (Imperial Sulker Unie; Sugar Land, Texas); NutraFlora^TM (Americal Ingredients, Inc.; Anaheim, CA); und Friuttrimfat Replacers and Sweeteners (Emeryville, CA). Bifidogene Oligosaccharide wie GOS und andere langkettige Oligosaccharide sind ebenfalls von gewerblichen Lieferanten erhältlich.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die zur Verwendung bei der Verhinderung, Behandlung und Bekämpfung mikrobieller Infektionen geeignet sind, umfas sen einen Wirkstoff, im Einzelnen: (i) vegetative Zellen oder Sporen von Bacillus coagulans; (ii) extrazelluläre antimikrobielle oder antibiotische Metaboliten von Bacillus coagulans oder (iii) Kombinationen derselben in verschiedenen Formulierungen. Sie können auch andere Bakterien der Spezies Bacillus (z.B. eine vegetative Zelle) oder eine Spore umfassen.
Die Bacillus-Wirkstoffe umfassen in einer für topische Verabreichung geeigneten Formulierung etwa 0,1% bis etwa 50 Gew.% der Endzusammensetzung, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.%.
Die Formulierung für eine therapeutische Zusammensetzung dieser Erfindung kann andere probiotische Substanzen oder Nährstoffe für das Fördern von Sporenkeimung und/oder Wachstum von Bacillus enthalten. Die Zusammensetzungen enthalten ein Antipilzmittel und können auch bekannte antimikrobielle, antivirale oder Antihefe-Mittel enthalten, die allesamt mit der Wahrung der Lebensfähigkeit des spezifischen Bacillus-Wirkstoffs kompatibel sein müssen, wenn Bacillus-Organismen oder Sporen als Wirkstoff eingesetzt werden. Die verschiedenen anderen Substanzen in der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung können entweder Synergisten oder Wirkstoffe sein. In einer bevorzugten Ausführung sind die bekannten antimikrobiellen, antiviralen, Antihefe- und/oder Antipilzmittel probiotische Mittel, die mit Bacillus kompatibel sind. Die therapeutischen Zusammensetzungen können auch bekannte Antioxidantien (z.B. Vitamin E); Puffersubstanzen, Schmiermittel (z.B. synthetisches oder natürliches Bienenwachs); Sonnenschutzfilter (z.B. Paramino-Benzoesäure); und andere Kosmetiksubstanzen (z.B. Farbstoffe, Duftstoffe, Öle, ätherische Öle, Feuchthaltemittel oder Entfeuchtungsmittel) enthalten, sind aber nicht auf deren Einbeziehen beschränkt. Eindicker (z.B. Polyvinylpyyrrolidon, Polyethylenglycol oder Carboxymethylcellulose) können den Zusammensetzungen ebenfalls hinzugefügt werden.
Duftstoffe und ätherische Öle sind für die bei Körperpflegeprodukten verwendeten Zusammensetzungen und Verfahren besonders geeignet und können Meeressalze, Kräuter oder Kräuterextrakte, Duftöle aus einer großen Vielzahl an Pflanzen oder Tieren sowie Duftstoffe von einer großen Vielzahl von Pflanzen oder Tieren, die gut bekannt sind, umfassen. Bevorzugte Duftstoffe, die in einer Zusammensetzung dieser Erfindung nützlich sind, umfassen Usambaraveilchen, Weihrauch & Myrrhe, Lavendel, Vanille, Gardenie, Geißblatt, Sandelholz, Moschus, Jasmin, Lotus, Orangenblüte, Patschouli, Heide, Magnolie, Ambra, Rose und ähnliche Duftstoffe. Emu-Öl wird in den topisch verabreichten erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung allgemein in einer Konzentration von etwa 1 bis 75 Gew.% eingesetzt. Die Verwendung von Emu-Öl in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen wird nachstehend eingehender beschrieben. Bevorzugte Öle, die zusätzlich verwendet werden können, einschließlich ätherische Öle bzw. Duftöle, umfassen Mandel, Aloe, Ambra, Apfel, Aprikose, Lorbeerbaumfrucht, Benzion, Kaktusblüte, Nelke, Carrageenan, Zedernholz, Zimt, Gewürznelken, Kokosnuss, Zeder, Kopal, Eukalyptus, Frangipani, Weihrauch und Myrrhe, Gardenie, Grapefruit, Heide, Kräuter, Geißblatt, Jasmin, Jojoba, Seetang, Lavendel, Zitrone, Flieder, Lotus, Magnolie, Maulbeere, Moschus, Myrrhe, Narzisse, Orangenblüte, Patschouli, Pfirsich, Pinus monophylla, Plumeria, Rose, Rosmarin, Saflor, Salbei, Sandelholz, Spirulina, Erdbeere, Vanille, Veilchen, Wisteria und ähnliche Öle.
Ferner können die Duftstoffe und ätherischen Öle in verschiedenen Badesalz- und Toilettenseifen-Zusammensetzungen vorgesehen werden. Salze und Seifen sind auf dem Gebiet ebenfalls gut bekannt und können Meeressalze, Wüstensalze, mineralische Salze, Trinatriumhydrogendicarbonat, Magnesiumsulfat und ähnliche, üblicherweise verwendete Badesalze umfassen.
Duftstoffe, Öle und Salze sind auf dem Gebiet gut bekannt, können aus einer Vielzahl natürlicher und gewerblicher Quellen erhalten werden und gelten nicht als Einschränkung der Erfindung. Beispielhafte gewerbliche Quellen umfassen: Innovative Body Science (Carlsbad, CA); Scents of Paradise-SunBurst Technology, Inc., (Salem, OR); Intercontinental Fragrances, Inc., (Houston, TX); Scentastics, Inc., (Ft. Lauderdale, FL); und Michael Giordano International, Inc., (North Miami, FL).
In den vorliegenden Zusammensetzungen verwendete Chemikalien können aus einer Vielzahl gewerblicher Quellen bezogen werden, einschließlich Spectrum Quality Products, Inc (Gardena, CA); Seltzer Chemicals, Inc., (Carlsbad, CA) und Jarchem Industries, Inc., (Newark, NJ).
In den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen werden die Wirkstoffe mit einem „Träger" kombiniert, der mit der Haut, der Membran oder einem Schleimhautgewebe eines Menschen oder Tiers, dem sie topisch verabreicht werden, physiologisch kompatibel ist. Im Einzelnen ist der Träger in der bevorzugten Ausführung mit Ausnahme seiner inhärenten oberflächenaktiven Eigenschaften, die bei Herstellung einer Suspension der Wirkstoffe genutzt werden, im Wesentlichen inaktiv. Die Zusammensetzungen können andere physiologisch aktive Bestandteile enthalten, die nicht die Wirksamkeit der Wirkstoffe in der Zusammensetzung beeinträchtigen.
Eine typische erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung enthält in einem Gramm Applikationsformulierung etwa 1 × 10³ bis 1 × 10¹² und vorzugsweise etwa 2 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Kolonie bildende Einheiten (engt. kurz CPU) lebensfähiger Bacillus-Bakterien (d.h. vegetative Bakterien) oder Bakteriensporen. In einer bevorzugten Ausführung kann die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung auch etwa 10 mg bis zu ein Gramm eines bifidogenen Oligosaccharids (z.B. Fructo-Oligosaccharid) enthalten. Die Formulierung kann durch Verwendung eines beliebigen von vielen verschiedenen Trägern und/oder Bindemitteln auf das Gesamtgewicht komplettiert werden. Ein bevorzugter Träger ist zum Beispiel mikrokristalline Cellulose (MCC), die in ausreichender Konzentration zur Vervollständigung des üblichen Verabreichungsgesamtgewichts von einem Gramm hinzugegeben wird. Besonders bevorzugte Formulierungen der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen werden nachstehend in dem Abschnitt Spezifische Beispiele näher beschrieben.
Die in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen verwendeten Träger können auf Trockenmasse basierende Trockenmaterialien zur Verwendung in pulverförmigen Formulierungen oder alternativ flüssige oder auf Gel basierende Materialien zur Verwendung in Flüssig- oder Gelformulierungen sein. Die spezifischen Formulierungen hängen zum Teil von den Wegen oder Arten der Verabreichung ab.
Typische Träger für Trockenformulierungen umfassen Trehalose, Maltodextrin, Reismehl, mikrokristalline Cellulose (MCC), Magnesiumsterat, Inositol, Fructo-Oligosaccharide FOS, Gluco-Oligosaccharide (GOS), Dextrose, Saccharose, Talkum und ähnliche Träger, sind aber nicht hierauf beschränkt. Wenn die Zusammensetzung trocken ist und verdampfte Öle enthält, die eine Neigung der Zusammensetzung zum Zusammenbacken erzeugen (d.h. Anhaften der beteiligten Sporen, Salze, Pulver und Öle), ist es bevorzugt, Trockenfüllstoffe zuzugeben, die sowohl die Komponenten verteilen als auch ein Zusammenbacken verhindern. Beispielhafte Antibackmittel umfassen MCC, Talkum, Kieselgur, amorphen Schwefel und dergleichen, die üblicherweise in einer Konzentration von etwa 1 bis 95 Gew.% zugegeben werden.
Geeignete flüssige oder auf Gel basierende Träger sind auf dem Gebiet gut bekannt (z.B. Wasser, Kochsalzlösungen, Harnstoff, Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Ethylenglykol und Propylenglykol und dergleichen). Vorzugsweise sind wasserbasierte Träge in etwa pH-neutral.
Geeignete Träger schließen wässrige und fettige Träger wie zum Beispiel weißes Petrolatum, Isopropylmyristat, Lanolin oder Lanolinalkohole, Mineralöl, Duftstoff oder ätherisches Öl, Nasturtiumextraktöl, Sorbitanmonooleat, Propylenglykol, Cetylstearylalkohol (zusammen oder in verschiedenen Kombinationen), Hydroxypropylzellulose (MG = 100.000 bis 1.000.000), Detergenzien (z.B. Polyoxylstearat oder Natriumlaurylsulfat) sowie gemischt mit Wasser zur Bildung einer Lotion, eines Gels, einer Creme oder halbfesten Zusammensetzung ein. Andere geeignete Träge umfassen Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-Emulsionen und Mischungen von Emulgatoren und Weichmachern mit Lösungsmitteln wie beispielsweise Saccharosestearat, Saccharosecocoat, Saccharosedistearat, Mineralöl, Propylenglykol, 2- Ethyl-1,3-Hexandiol, Polyoxypropylen-15-stearylether und Wasser. Beispielsweise sind Emulsionen, die Wasser, Glycerinstearat, Glycerin, Mineralöl, synthetisches Walrat, Catylalkohol, Butylparaben, Propylparaben und Methylparaben enthalten, gewerblich erhältlich. Konservierungsmittel können ebenfalls in den Träger aufgenommen werden, einschließlich Methylparaben, Propylparaben, Benzylalkohol und Ehtylendiamintetraacetatsalze. Bekannte Aromastoffe und Farbstoffe können ebenfalls in den Träger aufgenommen werden. Die Zusammensetzung kann auch einen Weichmacher wie zum Beispiel Glycerin oder Polyethylenglykol (MG 400 bis 20.000) enthalten. Die Zusammensetzung des Trägers kann variiert werden, solange dies die pharmakologische Aktivität der Wirkstoffe oder die Lebensfähigkeit der Bacillus-Zellen oder -Sporen nicht wesentlich beeinträchtigt.
Eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann so formuliert werden, dass sie zur Verabreichung in verschiedener Weise geeignet ist, zum Beispiel in einer Creme zur topischen Anwendung auf der Haut (z.B. für Tinea oder Fußpilz), in einer Mundspülung (z.B. für Mundsoor), in einer Dusche zur vaginalen Anwendung (z.B. für Vaginitis), in einem Pulver für Wundscheuern (z.B. für Dermatitis), in einer Flüssigkeit für Zehennägel (z.B. für Tinea pedis), in einem Badsalz oder Badpulver für die Behandlung von Genital-, Fuß- oder anderen Gewebeinfektionen in einem Bad und dergleichen. Andere Formulierungen sind für den Fachmann leicht ersichtlich und werden nachstehend ausführlicher in dem Abschnitt Spezifische Beispiele beschrieben.
Die vorliegende Erfindung gibt Mittel zur Behandlung, Besserung und/oder Bekämpfung mikrobieller Infektionen bei verschiedenen Haut- und Schleimhautgeweben unter Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung oder eines therapeutischen gefertigten Gegenstands nach der vorliegenden Erfindung an die Hand. Optimalerweise reduzieren die Zusammensetzungen die Bakterien-, Hefe-, Pilz- und/oder Viren-Titer in dem behandelten Individuum wirksam, insbesondere an der Stelle der Aufbringung der topischen Zusammensetzung. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass der Titer pathogener Mikroorganismen in Läsionen im Anschluss an die topische Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammen setzung auf die betroffene(n) Fläche(n) der Haut oder Schleimhaut signifikant reduziert wird. Die offenbarten Behandlungsverfahren mindern auch die Symptome einer Infektion durch pathogene Mikroorganismen (z.B. Schmerzen, die mit infizierten oder durch Mikroorganismen verursachten Läsionen verbunden sind) und fördern eine schnellere Heilung al ssie ohne Bacillus-Behandlung auftreten würde.
Hier wird die Verabreichung einer den Bacillus-Wirkstoff enthaltenden Zusammensetzung an Mensch oder Tier zur Behandlung oder Verhinderung mikrobieller (z.B. bakterieller, Hefe-, fungaler oder viraler) Infektion beschrieben. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf die Haut oder eine Schleimhaut unter Verwendung einer Creme, einer Lotion, eines Gels, eines Öls, einer Salbe, einer Suspension, eines Aerosolsprays, eines Pulvers, einer halbfesten Formulierung (z.B. eines Suppositoriums) oder eines gefertigten Gegenstands, wobei alle mit Hilfe von in der Fachwelt wohlbekannten Verfahren so formuliert sind, dass sie eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung enthalten.
Die Applikation der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung, die den zur Verhinderung oder Behandlung einer mikrobiellen Infektion wirksamen Bacillus-Wirkstoff enthält, besteht im Allgemeinen aus einer bis zu zehn Applikationen von 10 mg bis 10 g Konzentration einer Zusammensetzung pro Applikation über einen Zeitraum von einem Tag bis zu einem Monat. Die Anwendungen erfolgen im Allgemeinen einmal alle 12 Stunden und bis zu einmal alle vier Stunden. Bevorzugterweise sind zwei bis vier Anwendungen der therapeutischen Zusammensetzung pro Tag, mit etwa 0,1 g bis 5 g Konzentration pro Applikation, über einen bis sieben Tage ausreichend, um eine mikrobielle Infektion zu verhindern oder zu behandeln. Bei topischen Wendungen werden die therapeutischen Zusammensetzungen bevorzugt täglich auf Läsionen aufgetragen, sobald eine Symptomatik (z.B. Schmerzen, Schwellung oder Entzündung) festgestellt wird. Die spezifische Art, Dosierung und Zeitvorgabe der Verabreichung hängt zum Teil von dem jeweiligen Pathogen und/oder Symptom ab, das behandelt wird, sowie vom Ausmaß des Symptoms.
Eine bevorzugte Verwendung ist die Applikation von etwa 1 × 10³ bis 1 × 10¹² lebensfähigen Bakterien oder Sporen pro Tag, vorzugsweise von etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ lebensfähigen Bakterien oder Sporen pro Tag und bevorzugter von etwa 5 × 10⁸ bis 1 × 10⁹ lebensfähigen Bakterien oder Sporen pro Tag. Ferner umfasst ein bevorzugtes Verfahren optional die Applikation einer therapeutischen Zusammensetzung, die zusätzlich etwa 10 mg bis 20 g Fructo-Oligosaccharid (FOS) enthält, pro Tag, vorzugsweise etwa 50 mg bis 10 g FOS pro Tag und bevorzugter etwa 150 mg bis 5 g FOS pro Tag, so dass das Wachstum der probiotischen Bacillus-Spezies gegenüber dem Wachstum der pathogenen Mikrobe gefördert wird.
Bezüglich eines therapeutischen Bads sieht eine erfindungsgemäße Ausführung die Zugabe und das Beimischen einer Zusammensetzung trockener Bacillus-Sporen (die zusätzlich Seifen, Öle, Duftstoffe, Salze und ähnliche Badbestandteile enthält) zu einem angesetzten Bad vor, gefolgt von Kontaktieren des infizierten Gewebes bzw. der infizierten Gewebe mit dem Badwasser, wie beim Baden im herkömmlichen Sinn. In dieser Ausführung können die therapeutischen probiotischen Bacillus-Sporen wie hier beschrieben in einem System mit Anweisungen verpackt werden. Ein typisches Bad würde etwa 1 × 10⁸ bis 1 × 10¹⁰ CFU oder Bakterienzellen oder -sporen pro Bad vorsehen, und vorzugsweise etwa 1 × 10⁹ bis 5 × 10⁹ CFU Bakterienzellen oder -sporen pro Bad.
Zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen verwendete spezifische Mittel werden nachstehend in dem Abschnitt Spezifische Beispiele ausführlicher beschrieben und umfassen die Behandlung von Windelausschlag, vaginaler Hefeinfektion, opportunistischer Hautinfektion, Mehlpilzinfektion, oberflächlicher Hautinfektion, Akne, Fieberbläschen, Läsionen bei Genitalherpes, „Herpetic Whitlow", Gürtelrose, Fußpilz und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner ein therapeutisches System zur Behandlung, Besserung und/oder Bekämpfung mikrobieller Infektionen, wobei sie einen Behälter mit einem Etikett und eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung umfasst, wobei das Etikett Anweisungen zur Verwendung der therapeuti schen Zusammensetzung bei der Behandlung der Infektion umfasst. Das therapeutische System kann zum Beispiel eine oder mehr Dosiseinheiten einer erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung umfassen. Alternativ kann das System lose Mengen der therapeutischen Zusammensetzung enthalten. Das Etikett enthält je nach Erfordernis Anweisungen zur Verwendung der therapeutischen Zusammensetzung entweder in Form einer Einheitsdosis oder in loser Menge und kann Informationen zur Lagerung der Zusammensetzung, Krankheitsindikationen, Dosierungen, Verabreichungswege und -arten und ähnliche Informationen enthalten.
Weiterhin kann das System abhängig von der bestimmten erwogenen Verwendung entweder kombiniert oder in separaten Packungen eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten: FOS, Badesalze, Seifen und Öle (für Badezwecke) und ähnliche Komponenten. Ein besonders bevorzugtes System umfasst Einheitsdosispackungen mit Bacillus-Sporen zur Verwendung in Kombination mit einem herkömmlichen Badesalz- oder Toilettenseifenprodukt, zusammen mit Anweisungen zur Verwendung des Bacillus-Probiotikums in einem therapeutischen Verfahren.
Es wurden mehrere aus Tieren gewonnene Lipide für die Verwendung als „Trägersubstanzen" geprüft, die zum Dispergieren und Erleichtern des Eindringens dieser therapeutischen Zusammensetzungen durch die verschiedenen Membrane und Gewebe von Haut und Oberhaut verwendet werden. Vor der hierin enthaltenen Offenbarung gab es aber wenig Erfolg beim Auffinden einer Substanz, die dichtes Oberhautmaterial wie Finger-/Zehennägel und Tierhufe durchdringen kann.
Hierin wird die Verwendung eines von einem Tier gewonnenen Lipids, Emu-Öl, als „Trägersubstanz" zur Erleichterung der Verteilung und des Eindringens der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen durch die verschiedenen Membrane und Gewebe von Haut und Oberhaut offenbart, und es wird gezeigt, dass es die Wirksamkeit von antimikrobiellen und antifungalen Therapien merklich verbessert. Dieses Lipidmaterial wird aus dem Emu (Dromais Novae-Hollandiae), einem in Australien und Neuseeland heimischen Vogel, extrahiert. Emu-Öl wurde zwar bereits früher beschrieben, die in diesen Unterlagen näher beschriebenen Verwendungen gehen aber nur auf seine Vorteile als entzündungshemmende Substanz bei Arthritis und seine Verwendungen für die kardiovaskuläre Gesundheit bei Verzehr ein, was mit der Verwendung von Omega-3-Fischölen zur Verbesserung des „High Density" Lipoproteincholesterins (HDL) vergleichbar ist.
Dementsprechend können Hauterkrankungen sowohl des Menschen als auch des Tiers, die durch bakterielle und/oder mykotische Dennatophyten verursacht werden, gemildert oder verhindert werden, während gleichzeitig die Gesundheit von Haut und Oberhaut durch Verwendung einer Kombination aus Wirkstoffen in einer therapeutischen Zusammensetzung, die antifungale/antibakterielle Substanzen (z.B. organische Moleküle, Proteine und Kohlenhydrate und/oder bakterielle Fermentationsprodukte) aufweist, in Kombination mit Emu-Öl gewahrt wird. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung wird eine therapeutisch wirksame Konzentration von Emu-Öl mit den Fermentationsprodukten von Bakterien, die erwiesenermaßen hemmende Metaboliten (z.B. Bacillus coagulans) erzeugen, mit einer antifungalen Substanz und optional mit einer anderen antimikrobiellen Substanz (z.B. ein Antibiotikum) in einem pharmazeutisch zulässigen Träger kombiniert, der für die Verabreichung auf die Membrane von Haut und/oder Oberhaut eines Tiers geeignet ist.
In einer Ausführung der Bakterienüberstand-Zusammensetzung können weitere Bakterienstämme verwendet werden, z.B. ein Mitglied der Gattung Lactobacillus, einschließlich aber nicht ausschließlich: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantrum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus delbrukil, Lactobacillus rhammosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus gaserli, Lactobacillus jensenii und Lactobacillus sporogenes. In einer anderen Ausführung ist der weitere Bakterienstamm ein Mitglied der Gattung Enterococcus, einschließlich aber nicht ausschließlich: Bacillus facium und Enterococcus thermophilus. In einer anderen Ausführung ist der weitere Bakterienstamm ein Mitglied der Gattung Bifidiobacterium, einschließlich aber nicht ausschließlich: Bacillus longum, Bacillus infantis, Bacillus bifidus und Bacillus bifidum. In einer anderen Ausführung ist der weitere Bakterienstamm ein Mitglied der Gattung Bacillus, einschließlich aber nicht ausschließlich: Bacillus therophilus, Bacillus laterosporus Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus myocoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus uniflagellatus, Bacillus cereus und Bacillus circulans. In einer anderen Ausführung ist der weitere Bakterienstamm ein Mitglied der Gattung Pseudomonas, einschließlich aber nicht ausschließlich: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas florescenes und Pseudomona 679-2. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführung sind die weiteren verwendeten Bakterienstämme Mitglieder der Gattung Micomonospora, Sporolactobacillus, Micrococcus, Berkholderia, Rhodococcus und beliebige andere Bakterien, die die Fähigkeit zur Erzeugung eines Metaboliten haben, der eine antibakterielle, antimykotische oder antivirale Aktivität besitzt.
In der vorliegenden Erfindung werden die oben erwähnten Bakterienüberstand-Zusammensetzungen mit einer antifungalen Substanz kombiniert. Diese und jegliche weitere antimikrobielle Substanz kann eine nichtmikrobiell gewonnene Verbindung sein. Diese nichtmikrobiell gewonnene, antimikrobielle Verbindung kann folgendes umfassen: ein quarternäres Ammoniumchlorid, eine Iod- oder iodhaltige Verbindung (z.B. Betadine^R), eine Phenolverbindung, eine Alkoholverbindung oder -tinktur (z.B. Ethanol, Isopropyl oder dergleichen), ist aber nicht hierauf beschränkt. In anderen Ausführungen ist die nichtmikrobiell gewonnene, antimikrobielle Verbindung eine systemische antifungale Verbindung, einschließlich aber nicht ausschließlich: Amphotericin B, Dapson, Fluconazol, Fluctysin, Griseofulvin, Itraconazol, Ketoconazol oder Miconazol Kl. In anderen Ausführungen ist die nichtmikrobiell gewonnene, antimikrobielle Verbindung eine topische antifungale Verbindung, einschließlich aber nicht ausschließlich: Amphotericin B, Karbolfuchsin, Ciclopirox, Clotrimzol, Econazol, Haloprogin, Ketoconazol, Melanid, Miconazol, Naftifin, Nystatin, Oxiconazol, Silber-Sulfdiazin, Silconazol, Terminafin, Tioconazol, Tolnaftat oder Undecylensäure. In anderen Ausführungen ist die nichtmikrobiell gewonnene, antimikrobielle Verbindung eine antifungale vaginale Verbindung, einschließlich aber nicht ausschließlich: Butoconazol, Clotrimazol, Econazol, Gentianaviolett, Miconazol, Nystatin, Terconazol oder Ticonazol.
Üblicherweise sind Substanzen, die einen niedrigen pH-Wert aufweisen, äußerst schwierig in lösbare Zusammensetzungen mit lipophilen Substanzen wie Emu-Öl zu mischen. Die von Bacillus coagulans und Pseudomonas lindbergii gewonnenen extrazellulären Produkte, die in der vorliegenden Erfindung offenbart werden, sind nicht lipophil. Die hydrophilen extrazellulären Produkte besitzen einen sehr niedrigen (d.h. sauren) pH-Wert. Stabile Mischungen solcher extrazellulärer Produkte mit Emu-Öl sind schwer herzustellen. Die hierin beschriebenen Mischungen werden durch Mischen der extrazellulären Produkte und des Emu-Öls und Erwärmen des Gemisches zum Verwirklichen einer stabilen Emulsion hergestellt.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch verschiedene gefertigte Gegenstände, die die vorteilhaften Aspekte der vorliegenden Erfindung durch Kombination der therapeutischen Zusammensetzung mit verschiedenen medizinischen oder Körperpflege-Geräten nutzen, zum Beispiel um mikrobielle Infektionen in Verbindung mit der Verwendung dieser Geräte zu reduzieren oder zu verhindern. Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen eines isolierten Bacillus-coagulans-Wirkstoffs und optional eines anderen Bacillus-Wirkstoffs, die auf eine feste Oberfläche aufgebracht oder in eine feste Matrix eines Geräts oder gefertigten Gegenstands imprägniert werden, der in Kontakt mit Haut oder Schleimhaut kommen soll. Vorzugsweise ist die feste Oberfläche ein biegsamer Gegenstand, der auf der Haut oder Schleimhaut getragen oder über diese gewischt werden kann. Wenn der biegsame Gegenstand, der den Bacillus-Wirkstoff trägt, auf der Haut getragen werden soll, umfasst er bevorzugter ein Mittel zum Anbringen des Gegenstands auf der Haut, beispielsweise eine Klebeschicht, einen greifenden Haken zum Eindringen in dichtes Oberhautmaterial, beispielsweise Finger-/Zehennägel und Tierhufe.
Spezifische Ausführungen, die einen isolierten Bacillus coagulans und optional einen anderen Bacillus-Wirkstoff enthalten, sind Windeln, Tücher (Babywischtücher oder Damenhygienetücher), Tampons, Hautpflaster, Klebeband, Saugkissen, Klei dungsstücke (z.B. Unterwäsche, Schlafbekleidung), Badehandtücher, Waschlappen und dergleichen. Die Artikel können aus faserförmigen gewebten, gestrickten oder nicht gewebten Materialien, aus okklusiven oder nicht okklusiven Filmen oder Membranen, synthetischen Polymerfasern-, -filmen, -membranen und -schäumen (z.B. Nylon, Polytetrafluorethylen (PTFE wie beispielsweise Teflon^® oder Gore-Tex^®), Polystyrol, Polycarbonat, Polyvinylchlorid und Polysulfon) bestehen. All diese Formen sind in der Fachwelt gut bekannt und schließen zum Beispiel Gestricke oder Gewebe, Vliesstoffe wie Filz und Fasermaterial, Faserbällchen aus Baumwolle, Rayon, Cellulose und synthetischen Fasern und ähnliche Materialien ein.
Der isolierte Bacillus-coagulans-Wirkstoff und optional der andere Bacillus-Wirkstoff können mit Hilfe eines von vielen bekannten Verfahren auf die feste Oberfläche aufgebracht werden, einschließlich zum Beispiel Aufbringen eines Pulvers, Strühtrocknen des Probiotikums auf das Material oder Tränken des Materials in der das Probiotikum enthaltenden Lösung und dann Verwenden des nass gemachten Materials oder Trocknen des Materials für die Verwendung. Poröses Material kann den Bacillus-Wirkstoff bzw. die Bacillus-Wirkstoffe in den Poren oder Zwischenräumen des festen Materials enthalten. Der Bacillus-Wirkstoff bzw. die Bacillus-Wirkstoffe können durch Adhäsion, beispielsweise durch Anbringen auf einer Klebschicht, die dann auf die Haut aufgebracht wird (z.B. in einer Bandage oder einem Hautpflaster), aufgebracht werden. Der Bacillus-Wirkstoff bzw. die Bacillus-Wirkstoffe können während des Herstellungsprozesses des biegsamen Gegenstand in das feste Material imprägniert werden (z.B. vor oder während des Polymerisationsvorgangs einer synthetischen Komponente zugegeben werden). Dank der Druck- und Wärmebeständigkeit von Bacillus-Sporen sind diese für die Aufnahme in das Material während der Herstellung besonders geeignet. Jedes der festen Materialien, das einen Bacillus-Wirkstoff bzw. Bacillus-Wirkstoffe trägt, kann auch einzeln oder in Gruppen verpackt werden, wobei es zum Halten des behandelten Materials mit Hilfe von Standardverpackungsmaterialien (z.B. in einer Schrumpffolie, einer luftdichten Verpackung, einer Schützhülle oder einem Spenderbehälter, der für trockene oder feuchte Materialien geeignet ist) geeignet ist. Der gefertigte Gegenstand kann einen beliebigen der weiteren/optionalen Komponenten einer therapeutischen Zu sammensetzung dieser Erfindung, einschließlich Träger, Salze, FOS, Duftstoffe und dergleichen, darauf aufgebracht aufweisen.
Es kann ein beliebiges der verschiedenen Verfahren für das Aufbringen der therapeutischen Zusammensetzung auf einen betreffenden Gegenstand verwendet werden, und daher muss die Erfindung nicht diesbezüglich beschränkt werden. Bevorzugte Verfahren umfassen jedoch ein „Sprühtrocknungs"-Verfahren, bei dem das Material in einer Kammer niedriger Feuchtigkeit einer zerstäubten Mischung, die eine flüssige Zusammensetzung enthält, ausgesetzt wird, wobei die Kammer anschließend zum Trocknen der Flüssigkeit etwa 80–110°F ausgesetzt wird, wodurch das Material des Gegenstands mit den Bestandteilen der Zusammensetzung imprägniert wird.
Eine typische Konzentration reicht von etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁹ CFU lebensfähiger Bakterien oder Sporen/Zoll² der Außenfläche von faserartigem Träger/Artikelmaterial. Nach der Trocknung ist der Gegenstand zur Lagerung in einer sterilen Verpackung oder zur direkten Verwendung fertig.
Beispiele
Die folgenden Beispiele, die sich auf die vorliegende Erfindung beziehen, dienen der Veranschaulichung und sollen nicht als spezifische Einschränkung der Erfindung ausgelegt werden. Zudem sollen solche bereits bekannte oder später entwickelte Abwandlungen der Erfindung, die im Bereich des Könnens eines Fachmanns liegen, als in den Schutzumfang der nachstehend beanspruchten vorliegenden Erfindung fallend gelten.
Probiotische Aktivität von Bacillus coagulans
(A) Antimykotische probiotische Aktivität von Bacillus coagulans
Die Fähigkeit von Bacillus coagulans, verschiedene Pilzpathogene zu hemmen, wurde unter Verwendung eines In-Vitro-Tests gezeigt. Bei dem Test wurden Kartoffel-Dextrose-Platten (DIFCO^®, Detroit, MI) mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt, und wurden einzeln mit einem konfluenten Bett (etwa 1,7 × 10⁶) verschiedener Spezien des Pilzes Trichophyton inokuliert. Die getesteten Pilzstämme der Trichophyton-Spezien (erhältlich von American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)) und deren ATCC-Zugriffsnummern sowie die Ergebnisse der In-Vitro-Hemmung durch Bacillus coagulans sind in 3 dargestellt.
Die Hemmung durch Bacillus coagulans wurde durch Aufbringen von etwa 1,5 × 10⁶ Kolonie bildenden Einheiten (CFU, engt. Colony Forming Units) in 10 μl Nährlösung oder Puffer, direkt in der Mitte der Kartoffel-Dextrose-Platte aufgebracht, mit einem Testort pro Platte, sichergestellt. Die Größe jedes Testorts betrug etwa 8 mm Durchmesser, und es wurden mindestens drei Tests pro Hemm-Assay durchgeführt. Die Negativkontrolle bestand aus einem 10 ml Volumen 2% Miconazol (1-[2-(2,4-Dichlorphenyl)-2-[(2,4-Dichlorphenyl)methoxymethal-1,11-imidazol) in einer reaktionslosen Creme.
Die Platten wurden dann etwa 18 Stunden lang bei 30°C inkubiert, woraufhin die Hemmungshöfe gemessen wurden. Die hier verwendete Bezeichnung „ausgezeichnete Hemmung" bedeutet, dass der Hof einen Durchmesser von 10 mm oder mehr aufwies, und „gute Hemmung" bedeutet, dass der Hof einen Durchmesser von über 2 mm, aber weniger als 10 mm aufwies.
Die Ergebnisse der In-Vitro-Hemmung durch Bacillus coagulans werden in 3 dargestellt. Für jede der getesteten Trichophyton-Spezien wird das einer Infektion zugeordnete Krankheitssymptom in Spalte 2 von 3 angegeben. Zum Vergleich war bei der Negativkontrolle kein Hemmungshof zu beobachten, wohingegen gute Hemmung (etwa 8,5 mm Durchmesser, Mittelwert von drei Tests) bei der Positivkontrolle beobachtet wurde.
(B) Probiotische Hemmung von Hefe durch Bacillus coagulans
Analog wurde die Fähigkeit von Bacillus coagulans, verschiedene Hefepathogene zu hemmen, in vitro für vier Spezien von Candida nachgewiesen, die alle von American Type Culture Collection (ATCC; Rockville Maryland) erhältlich sind. Jedes der Hefepathogene und deren ATCC-Zugriffsnummern werden in 4 gezeigt.
Bei dem In-Vitro-Hemm-Assay wurden Kartoffel-Dextrose-Platten (DIFCO®, Detroit, MI) mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt, und wurden einzeln mit einem konfluenten Bett (etwa 1,7 × 10⁶) der vier Spezien von Candida inokuliert. Die Hemmung durch Bacillus coagulans wurde durch Aufbringen von etwa 1,5 × 10⁶ Kolonie bildenden Einheiten (CFU, engl. Colony Forming Units) in 10 μl Nährlösung oder Puffer, direkt in der Mitte der Kartoffel-Dextrose-Platte aufgebracht, mit einem Testort von etwa 8 mm Durchmesser pro Platte, getestet. Es wurden mindestens drei Tests pro Hemm-Assay durchgeführt. Die Negativkontrolle bestand aus einem 10 μl Volumen einer sterilen Kochsalzlösung, während die Positivkontrolle aus einem 1 μl Volumen von Miconazol-Creme bestand.
Die Platten wurden dann etwa 18 Stunden lang bei 30°C inkubiert, woraufhin die Hemmungshöfe gemessen wurden. Die hier verwendete Bezeichnung „ausgezeichnete Hemmung" bedeutet, dass der Hof einen Durchmesser von 10 mm oder mehr aufwies, und „gute Hemmung" bedeutet, dass der Hof einen Durchmesser von über 2 mm, aber weniger als 10 mm aufwies.
Die Ergebnisse der In-Vitro-Hemmung werden in 4 dargestellt, wobei die pathologischen Symptome bei Menschen, die einer Infektion durch die Candidas-Spezies zugeordnet werden, in Spalte 2 gezeigt werden. Wie erwartet war bei der Negativkontrolle keine Hemmung zu beobachten, und bei der Positivkontrolle wurde gute Hemmung (etwa 8,7 mm Durchmesser, Mittelwert von drei Tests) beobachtet.
(C) Antimikrobielle probiotische Aktivität von Bacillus coagulans
Die Fähigkeit von Bacillus coagulans, verschiedene opportunistische bakterielle Pathogene zu hemmen, wurde quantitativ durch Verwendung eines In-Vitro-Tests abgesichert. Dieser Test ist Teil einer standardisierten Überwachung für bakterielle Pathogene (entwickelt durch die US-Arznei- und Lebensmittelbehörde (FDA)) und ist im Handel auf festen Trägerplatten erhältlich (DIFCO^®BACTROL^®Platten-Set). Zur Ausführung des Tests wurden Kartoffel-Dextrose-Platten (DIFCO®) zunächst mit Hilfe von Standardverfahren herstellt. Die Platten wurden dann einzeln mit jedem der zu testenden Bakterien (etwa 1,5 × 10⁶ CFU) inokuliert, um ein konfluentes Bakterienbett zu bilden.
Die Hemmung durch Bacillus coagulans wurde anschließen durch Aufbringen von etwa 1,5 × 10⁶ CFU Bacillus coagulans in 10 μl Nährlösung oder Puffer direkt in die Mitte der Kartoffel-Dextrose-Platte mit einem Testort von etwa 8 mm Durchmesser pro Platte bestimmt. Es wurden mindestens drei Testorte pro Assay verwendet. Die Negativkontrolle bestand aus einem Volumen von 10 μl steriler Salzlösung, wohingegen die Positivkontrolle aus einem Volumen von 10 μl Glutaraldehyd bestand. Die Platten wurden dann ungefähr etwa 18 Stunden lang bei 30°C inkubiert, woraufhin die Hemmungshöfe gemessen wurden. Die hier verwendete Bezeichnung „ausgezeichnete Hemmung" bedeutet, dass der Hof einen Durchmesser von 10 mm oder mehr aufwies, und „gute Hemmung" bedeutet, dass der Hof einen Durchmesser von über 2 mm, aber weniger als 10 mm aufwies.
Wie erwartet wurde bei der Negativ-(Salz)-Kontrolle keine „Hemmung" beobachtet, bei der Positiv-(Glutaraldehyd-)Kontrolle wurde eine ausgezeichnete Hemmung (etwa 16,2 mm Durchmesser; Mittelwert von drei Tests) gefunden. Für die getesteten Darm-Mikroorganismen wurde die folgende Hemmung durch Bacillus coagulans gefunden: (i) Clostridium-Spezien – ausgezeichnete Hemmung; (ii) Escherichia coli – ausgezeichnete Hemmung; (iii) Clostridium-Spezien – ausgezeichnete Hemmung, wobei der Hemmungshof einen Durchmesser von durchweg mehr als 15 mm aufwies. Analog wurde auch eine ausgezeichnete Hemmung bei den opportunistischen Pathogenen Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus gefunden.
Zusammengefasst: die pathogenen Enterobakterien, die nachweislich durch die Aktivität von Bacillus coagulans gehemmt werden, umfassen: Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidus; Streptococcus pyogenes; Pseudomonas aeruginosa; Escherichia coli (entero-hämorrhagische Spezien); zahlreiche Clostridium-Spezien (z.B. Clostridium perfingens, Clostridium botulinum, Clostridium tributrycum, Clostridium sporogenes und dergleichen); Gardnereia vaginalis; Proponbacterium aenes; Aeromonas hydrophia; Aspergillus-Spezies; Proteus-Spezies und Klebsiella-Spezies, sind aber nicht hierauf beschränkt. Formulierungen therapeutischer Zusammensetzungen (A) Formulierung 1: Badeformulierung (pro Bad/Dosis)

Bacillus coagulans 2,5 × 10⁸ Sporen (etwa 18 mg)

Badesalze (Meeressalze & mineralische Salze) 10 g

Fructo-Oligosaccharide (FOS) 1 g

Mikrokristalline Cellulose (MCC) 5 g

Duftstoff Spuren

(B) Formulierung 2: Topische Salbe (pro ml)

Bacillus-coagulans-Extrakt 100 μl (siehe spezifisches Beispiel C(ii)

Lanolin 780 μl

Emu-Öl 100 μl

Ätherisches Geranienöl 20 μl

Duftstoff Spuren

(C) Formulierung 3: Topische Flüssigkeit für Tropfer-Applikation (pro ml)

Bacillus- coagulans-Extrakt 500 μl (siehe spezifisches Beispiel C(ii)

Emu-Öl 450 μl

Ätherisches Geranienöl 20 μl

Tween-80 Detergent 30 μl

Duftstoff Spuren

(D) Formulierung 4: Pulver (pro Gramm)

Bacillus- coagulans 1 × 10⁸ Sporen (etwa 8 mg)

Talkum 992 mg

Lavendelduftstoff in Pulverform Spuren

Ätherisches Geranienöl

Duftstoff
Wachstum von Bacillus coagulans
(A) Kultur von vegetativem Bacillus coagulans
Bacillus coagulans ist aerob und fakultativ und wird üblicherweise bei pH 5,7 bis 6,8 in einer Nährlösung kultiviert, die bis zu 2% (nach Gewicht) NaCl enthält, wenngleich weder NaCl noch KCl für das Wachstum unbedingt erforderlich sind. Ein pH-Wert von etwa pH 4,0 bis pH 7,5 ist für die Auslösung der Sporulation (d.h. Sporenbildung) optimal. Die Bakterien werden optimal bei etwa 30°C bis etwa 45°C kultiviert, und die Sporen können einer Pasteurisierung standhalten. Ferner weisen die Bakterien durch Verwendung einer Nitrat- oder Sulfatquelle fakultatives und heterotrophes Wachstum auf.
Bacillus coagulans kann in verschiedenen Medien kultiviert werden, wenngleich sich gezeigt hat, dass bestimmte Vermehrungsbedingungen für das Erzeugen eine Kultur, die ein hohes Maß an Sporenbildung ergibt, wirksamer sind. Die Sporenbildung wird zum Beispiel nachweislich gefördert, wenn das Kulturmedium 10 mg/l MgSO₄-Sulfat enthält, was ein Verhältnis von Sporen zu vegetativen Zellen von etwa 80:20 ergibt. Ferner erzeugen bestimmte Vermehrungsbedingungen eine Bakterienspore, die ein Spektrum von Stoffwechselenzymen enthält, die für die vorliegende Erfindung besonders geeignet sind (d.h. Bildung von Milchsäure und Enzy men für die verbesserte probiotische Aktivität). Auch wenn durch diese speziellen Vermehrungsbedingungen erzeugte Sporen bevorzugt sind, können verschiedene andere kompatible Vermehrungsbedingungen, die lebensfähige Bacillus-coagulans-Sporen erzeugen, bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Geeignete Medien für die Kultivierung von Bacillus coagulans umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt: PDB (Kartoffeldextrose-Nährlösung); TSB (tryptische Sojanährlösung) und NB (Nährlösung), die alle in der Fachwelt gut bekannt sind und von verschiedenen Quellen zu beziehen sind. Bei einer Ausführung der vorliegenden Erfindung sind Medienzusätze, die enzymatischen Verdau von Geflügel- und/oder Fischgewebe enthalten, besonders bevorzugt. Ein bevorzugter Zusatz bildet ein Medium, das mindestens 60% Protein und etwa 20% komplexe Kohlenhydrate und 6% Lipide enthält. Medien sind von verschiedenen gewerblichen Quellen beziehbar, namentlich DIFCO (Newark, NJ); BBL (Cockeyesville, MD); Advanced Microbial Systems (Shakopee, MN); und Troy Biologicals (Troy, MD). Optional umfasst das Wachstumsmedium für Bacillus coagulans ein Glucose- und Hefeextrakt-Medium, das die folgenden Bestandteile enthält:

Hefeextraktpulver (Difco)	5,0 g
Casiton/Pepton (Difco)	5,0 g
D-Glucose (Difco)	3,0 g
Dikaliumhydrogenphosphat	0,5 g
Kaliumdihydrogenphosphat	0,5 g
Magnesiumsulfat	0,3 g
Spurenmineralienlösung	1,0 ml (siehe unten)
Destilliertes Wasser	1.000 ml
Agar (nach der pH-Einstellung zuzugeben)	15,0 g

Der pH des Mediums wurde dann auf ungeführt 6,3 eingestellt, gefolgt von einer Dampfsterilisation bei 1,2 kg/cm² Druck bei 120°C über 15 Minuten.
Die Spurenmineralienlösung, die für die Analyse des Bacillus-coagulans-Baterienstamms der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wurde nach folgender Zusammensetzung hergestellt:

NaCl 500,0 mg

MnSO₄·5H₂O 500,0 mg

ZnSO₄·7H₂O 80,0 mg

CuSO₄·5H₂O 80,0 mg

CoSO₄·7H₂O 80,0 mg

Destilliertes Wasser 50,0 ml
Die benötigte Menge der Salze wurde exakt abgewogen, und es wurde eine kleine Menge destilliertes Wasser zugegeben, um das Auflösen zu erleichtern. Das Volumen wurde dann in einem Messkolben auf insgesamt 50 ml gebracht. Die endgültige Lösung nahm eine rosa Farbe an, und kann bei 4°C bis zu insgesamt 2 Monate aufbewahrt werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführung wurde eine Kultur von Bacillus-coagulans-Hammer-Bakterien (ATCC Nr. 31284) angeimpft und zu einer Zelldichte von etwa 1 × 10⁸ bis 1 × 10⁹ Zellen/ml in dem oben erwähnten Glucose-/Hefeextrakt-Wachstumsmedium angezogen. Die Bakterien wurden durch Verwendung eines Standard-Airlift-Fermentationsgefäßes bei 30°C kultiviert. Wenn Sporulation erwünscht war, erwiesen sich 1,0 mg/l bis 1,0 g/l als zulässig für den MnSO₄-Bereich. Die vegetativen Bakterienzellen können sich bei bis zu 65°C reproduzieren, und die Sporen sind bei bis zu 90° stabil.
Im Anschluss an die Kultivierung wurden die Bacillus-coagulans-Hammer-Bakterienzellen oder -Sporen mit Hilfe von Standardverfahren (z.B. Filtration, Zentrifugation) gesammelt, und die gesammelten Zellen und Sporen können anschließend lyophilisiert, sprühgetrocknet, luftgetrocknet oder eingefroren werden. Der Überstand der Zellkultur kann, wie hier beschrieben, gesammelt und als von Bacil lus coagulans ausgeschiedenes extrazelluläres Mittel verwendet werden, das eine bei einer erfindungsgemäßen Formulierung nützliche antimikrobielle Aktivität besitzt.
Ein typischer Ertrag, der durch das vorgenannte Kulturverfahren erhalten wurde, lag vor dem Trocknen im Bereich von ungefähr 10⁹–10¹³ lebensfähige Sporen und typischer bei ungefähr 10–15 × 10¹⁰ Zellen/Sporen/pro Gramm. Zu beachten ist auch, dass die Bacillus-coagulans-Sporen im Anschluss an einen Trocknungsschritt bei Lagerung bei Raumtemperatur bis zu sieben Jahre lang mindestens 90% Lebensfähigkeit beibehalten. Die effektive Haltbarkeit einer Bacillus-coagulans-Hammer-Sporen enthaltenden Zusammensetzung beträgt bei Raumtemperatur etwa 10 Jahre.
(B) Herstellung von Bacillus-coagulans-Sporen
Eine Kultur getrockneter Sporen von Bacillus-coagulans-Hammer-Bakterien (ATCC Nr. 31284) kann wie folgt hergestellt werden. Etwa 1 × 10⁷ Sporen wurden in einem Liter Kulturmedium angeimpft, das enthielt: 24 g (Gew./Vol.) Kartoffeldextrose-Nährlösung; 10 g eines enzymatischen Verdaus von Geflügel- und Fischgewebe; 5 g Fructo-Oligosaccharide (FOS); und 10 m MnSO₄. Die Kultur wurde 72 Stunden lang unter Hochsauerstoff-Umgebung bei 37°C gehalten, um eine Kultur herzustellen, die etwa 15 × 10¹⁰ Zellen/Gramm Kultur aufwies. Die Kultur wurde dann filtriert, um das flüssige Kulturmedium zu entfernen, und der erhaltene Bakterienniederschlag wurde in Wasser resuspendiert und lyophylisiert. Die lyophylisierten Bakterien wurden unter Verwendung von standardmäßige „Good Manufacturing Practice"-Verfahren (GMP) zu einem feinen „Pulver" zermahlen. Das Pulver wird dann mit Formulierung 1 oder Formulierung 4, wie in dem spezifischen Beispiel 7.2 beschrieben, kombiniert, um Trockenpulverzusammensetzungen zu bilden.
Zu beachten ist, dass die bevorzugtesten erfindungsgemäßen Ausführungen Bacillus coagulans in Sporenform, statt in vegetativer Bakterienform verwenden.
Herstellung extrazellulärer Produkte von B. coagulans und P. lindbergii
Ein Liter Kulturen von entweder Bacillus coagulans oder Pseudomonas lindbergii wurde wie folgt hergestellt: (i) Kulturen von Bacillus coagulans wurden wie in Beispiel 7.3 beschrieben unter Verwendung eines Glucose/Hefeextrakt-Mediums hergestellt, und (ii) Kulturen von Pseudomonas lindbergii wurden unter Verwendung eines Kartoffeldextrose-Mediums angezogen. In beiden Fällen wurde auf die anfängliche Zugabe von Fructo-Oligosacchariden (FOS) zu dem Kulturmedium verzichtet. Die Kultur wurde 5 Tage lang wie beschrieben gehalten, woraufhin FOS in einer Konzentration von 5 g/Liter zugegeben wurde, und dann wurde die Kultur weiter gezogen. Anschließend wurden am 7. Tag 20 ml Karottenpulpe hinzugegeben und die Kultur wurde bei Erreichen von Sättigung geerntet (d.h. keine nennenswerte Zellteilung).
Die Kultur wurde zunächst 30 Minuten lang bei 250°F autoklaviert und dann bei 4.000 U/min 15 mm zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde gesammelt und einer Submikron-Filtration unterzogen, zunächst mit einem Büchner-Trichter durch einen 0,8 μm großen Filter. Das Filtrat wurde gesammelt und weiter durch einen 0,2 μm großen Nalge-Vakuumfilter filtriert. Das erhaltene endgültige Filtrat wurde dann gesammelt (ein Volumen von etwa 900 ml), um eine Flüssigkeit zu bilden, die ein extrazelluläres Produkt enthielt, das quantitativ zu analysieren und in den anschließenden Hemmungsstudien zu verwenden war.
Die folgenden Verfahren wurden zur Charakterisierung und/oder Reinigung des Überstands verwendet.
Flüssigchromatographie von Proteinen: 20 ml des Kulturüberstands wurden auf eine analytische Mono-9-Chromatographiesäule (Pharmacia) äquilibriert in Puffer A (0,25 M Tris-HCl; pH 8,0) mit Hilfe eines BioCAD Sprint Chromatographiesystems (Perseptive Biosystems, Inc.), betrieben bei 2 ml/mm, geladen. Die Säule wurde mit 15 ml Puffer A gewaschen und mit einem linearen Gradienten im Bereich von 0% B (d.h. Puffer B ist eine wässrige 3 M NaCl-Lösung) bis 50% B über einen Zeitraum von 12 Minuten eluiert. Die Säule wurde dann mit 100% B 5 Minuten lang gewaschen. Anschließend wurde die Säule mit Puffer A reäquilibriert. Die Absorbanz wurde bei 280 nm überwacht, um die Elution von aromatischen Aminosäuren (d.h. Tyrosin), die sich in Bakterienproteinen finden, festzustellen.
Die Ergebnisse zeigen eine Mischung von Proteinen, deren Großteil bei 0,1 M bis 0,8 M NaCl eluiert, und eine kleinere Fraktion von Material, die bei einer Konzentration von 3,0 M NaCl eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und aufbewahrt und in Spectrapor-Dialysemembranen (MG „Cutoff" etwa 1.000 Dalton) gegen Wasser dialysiert, um die anschließende Analyse zu erleichtern.
Spektroskopie im Ultraviolett- und sichtbaren Bereich: Differentielle Absorbanzspektren wurden zwischen Wellenlängen von 200 und 600 nm in 1 cm großen Quarzküvetten mit Hilfe eines Uvikon-930-Raster-Spektralphotometers (Kontron Instruments) bestimmt. Die Basislinie wurde mit Wasser oder LB-Nährlösungskulturmedium (DIFCO) bestimmt.
Die Ergebnisse mit einem Wasser-Blindwert zeigen für Bacillus coagulans (siehe 5; Tafel A) und Pseudomonas lindbergii (siehe 5; Tafel B) eine Absorbanzspitze bei 290 nm bis 305 nm, wobei eine signifikante Menge von zusätzlichem absorbierenden Material zwischen 210 nm und 400 nm gefunden wurde. Es wurde auch eine signifikante Absorbanz bei den UV-Wellenlängen gefunden, was primär auf die Anwesenheit von Proteinen zurückzuführen war. Die Ergebnisse mit LB-Nährlösung (siehe 6) zeigen eine starke Abnahme von absorbierendem Material im Bereich von 300 nm bis 440 nm, jedoch einen Anstieg bei den höheren Wellenlängen, was einen Anstieg bei den hochkonjugierten organischen Stoffen (d.h. Proteinen) mit einem Verbrauch von einfacheren Stoffen (d.h. Aminosäuren) anzeigt. Die Tatsache, dass eine kleine Änderung bei den Wellenlängen zu verzeichnen ist, bei denen Proteine spezifisch absorbieren, ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass LB bereits 10 Gramm Casein-Hydrolysat (Casaininosäuren, DIFCO) enthält.
SDS Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese: die Elektrophorese wurde nach dem Verfahren von Laemmli (siehe Laemmli, 1970, Nature 227: 680–685) durchgeführt, und die Acrylamidgele wurden in 1-mm-Kassetten (Novex) gegeben und nach den Empfehlungen des gewerblichen Anbieters laufengelassen (d.h. 120 Volt, 90 Minuten lang [12% Gel] und 2 Stunden lang [16%]). Die Gele wurden dann nach der Methode von Blum et al. silbergefärbt (siehe Blum, et al., 1987, Elektrophoresis 8: 93–99). Ein 12%-Acrylamidgel erwies sich als das beste, um die Pseudomonas-lindbergii-Proteine zu trennen (siehe 7); wohingegen ein 16%-Gel die Bacillus-coagulans-Proteine am besten trennte (siehe 8). Alle Proben wurden vor der Vorbereitung für die Elektrophorese gegen Wasser dialysiert, um salzbedingte Elektrophorese-Artefakte zu mindern. Für die Molekularwichtbestimmung der Proteine wurden breitbandige Proteinmarker (BioRad) verwendet.
Die Ergebnisse der Elektrophorese zeigen eine signifikante Zahl von Proteinbändern im Bereich von unter 4.000 bis 90.000 Dalton bei Pseudomonas lindbergii und im Bereich von unter 4.000 bis 30.000 Dalton bei Bacillus coagulans.
Hochdruck-Flüssigchromatographie: 5 ml Kultur-Überstände wurden mit 2 ml Azetonitril, Benzen oder 24:1 (v:v) Chloroform:Isoamylalkohol etwa zwei Stunden lang extrahiert. Diese Phasen durften sich vier Stunden lang trennen und wurden durch Zentrifugation bei 5.000 × g 10 Minuten lang weiter aufgetrennt. Die organische Phase wurde dann durch 0,2 μm große PVDF-Filter (Gehnan Acrodisc LC-13) filtriert und auf eine Econosil C-18 10U HPLC-Säule (Altech) in einer mobilen Phase von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) geladen. Die Elution wurde nach insgesamt 5 Minuten gestartet, in einem 15 minütigem Gradienten bis 60% Azetonitril (ACN) in Wasser. Die Elution wurde 5 Minuten lang in 60% ACN fortgesetzt, dann wurde die Säule gewaschen und in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) reäquilibriert.
Die Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC von ACN-extrahierten Bacillus coagulans und Pseudomonas lindbergii werden in 9 bzw. 10 gezeigt und demonstrieren, dass eine Verstärkung des organischen Charakters des Lösungsmittels zu stärker „organischen Profilen" bei der HPLC (d.h. zu einer Zunahme von Material, das bei einem höheren ACN-Prozentsatz eluierte) und einem stärken Einfangen von pigmentierten Molekülen (d.h. Molekülen, die sichtbares Licht absorbieren) führte. Diese oben erwähnten Moleküle werden isoliert und weiter charakterisiert.
Die Ergebnisse der vorgenannten analytischen Verfahren zeigten, dass die Kulturüberstände sowohl von Bacillus coagulans als auch Pseudomonas lindbergii sehr heterogen sind und eine Vielzahl von proteinartigen und organischen Molekülen enthalten. Die vorherrschenden Moleküle sind jedoch Proteine, von denen insgesamt 20 verschiedene Spezies in jeder Probe vorhanden sind. Diese Protein-Spezies können durch Verwendung von Ionenaustausch-Chromatographie weiter fraktioniert werden, wodurch eine zusätzliche Charakterisierung ermöglicht wird. Darüber hinaus existieren viele pigmentierte Moleküle (d.h. Moleküle, die sichtbares Licht absorbieren), die sowohl hochkonjugiert (auf Grundlage ihrer Absorbanz bei hohen Wellenlängen) als auch hydrophob (auf Grundlage ihrer Präferenz für nicht-polare Lösungsmittel und ihrer Retention auf der C-18-HPLC-Säule) sind.
Im Anschluss an die oben erwähnte Analyse und Charakterisierung wurde in dem zunächst in dem spezifischen Beispiel A (i) unter Verwendung von Candida albicans beschriebene Assay 1 ml des oben erwähnten extrazellulären Produkts an Stelle des Bakteriums auf die Testplatte gegeben. Nach einer identischen Kulturzeit wurde ein Hemmungshof von etwa 10 bis 25 mm Durchmesser beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen die starke antimikrobielle Aktivität des extrazellulären Produkts von Bacillus coagulans, das unter Verwendung der in den spezifischen Beispielen A(i)–(iii) enthaltenen Terminologie von „ausgezeichneter" Qualität ist.
In einem zusätzlichen Test wurde ein Vergleich des antimykotischen Fluconazols mit Bacillus-coagulans-Überstand bei der Hemmung verschiedener Bakterien-, Pilz- und Hefespezies durchgeführt. Wie in 11 dargestellt, waren diese Überstände bei der Hemmung eines Großteils der Organismen wirksam, gegen die sie getestet wurden. Reihenverdünnungen des Bacillus-coagulans-Überstands wurden mit RPMI-Medium durchgeführt, und die Hemmung wurde gemäß dem NCCLS-Standard für Antipilzempfindlichkeit bei 80% ermittelt.
Insbesondere zeigten die Ergebnisse, dass T. rubrum durch unverdünnten Überstand und durch die Reihenverdünnungen 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 und 1:256 vollständig gehemmt wurde und dass der Organismus durch die 1:512-Verdünnung der Verbindung mit RPMI-Medium zu 80% gehemmt wurde. T. mentagrophytes wurde durch den unverdünnten Überstand und Reihenverdünnungen von 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16 vollständig gehemmt, und der Organismus wurde durch den 1:32 mit RP-MI-Medium verdünnten Überstand zu 80% gehemmt. C. parapsilosis wurde durch den unverdünnten Überstand und Reihenverdünnungen von 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 und 1:256 vollständig gehemmt, und der Organismus wurde durch den 1:16 mit RPMI-Medium verdünnten Überstand zu 80% gehemmt. C. albicans wurde durch den unverdünnten Überstand und eine 1:2-Verdünnung vollständig gehemmt, und der Organismus wurde durch den 1:4 mit RPMI-Medium verdünnten Überstand zu 80% gehemmt. Acremonium sp. wurde durch den unverdünnten Überstand vollständig gehemmt und wurde durch den 1:2 mit RPMI-Medium verdünnten Überstand zu 80% gehemmt. Scopulariopis sp. wurde durch den unverdünnten Überstand zu 80% gehemmt, wurde aber durch keine der Reihenverdünnungen des Überstands gehemmt. Der Überstand zeigte keine hemmende Wirkung auf C. glabrata, C. krusel oder die zwei Aspergillus-Spezien. Es wurde somit gezeigt, dass der Überstand auf eine Vielzahl getesteter Organismen in einem großen Bereich von Verdünnungen eine stark hemmende Wirkung besitzt. Darüber hinaus erwies sich der Bacillus-coagulans-Überstand gegen Dermatophyten (z.B. Trichophyton sp.), die der verursachende Organismus vieler Hautkrankheiten von Säugern darstellen, als äußerst wirksam.
Bei einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wurde die Flüssigkeit, die das extrazelluläre Produkt enthält, zu einer flüssigen Salbenzusammensetzung zur Verwendung bei der direkten Applikation auf ein Gewebe mit Hilfe eines Tropfers formuliert, wie es zur Behandlung einer Pilzinfektion des Zehennagels zweckmäßig ist. Hergestellt wurde diese flüssige Seife durch Kombinieren des oben hergestellten flüssigen extrazellulären Produkts mit Emu-Öl in einem Verhält nis von etwa 8:2, und es wurden Spuren von Duftstoffen zugegeben, um eine ästhetische Komponente zu erzeugen.
Alternativ kann man eine beliebige Liposomen- oder ölbasierte transdermale Abgabekomponente an Stelle des Emu-Öls verwenden. Das typische Verhältnis von probiotischem extrazellulären Produkt zum Träger oder zur Abgabekomponente liegt im Bereich von etwa 1 % bis 90% Probiotikum, und beträgt vorzugsweise etwa 10% bis 75% Probiotikum.
Topische Applikation zur Verhinderung von Windelausschlag
Ein Pulver, eine Aerosolsprühflüssigkeit oder ein Aerosolsprühpulver, die den Bacillus-coagulans-Wirkstoff, vorzugsweise Bacillus-coagulans-Sporen, enthalten, wird vor der Verwendung durch den Konsumenten auf den Windeln aufgebracht. Alternativ können vom Hersteller gelieferte Wegwerfwindeln den Bacillus-coagulans-Wirkstoff im Windelmaterial imprägniert enthalten, wo er bei Verwendung an der Kinderhaut anliegen würde. Wenn die Windel durch Urin und/oder Fäkalien nass wird, werden die Sporen aktiviert, für gewöhnlich innerhalb von etwa zwanzig Minuten. Die Bacillus-coagulans-Sporenkeimung und das Bacillus-coagulans-Wachstum nach der Sporenkeimung erzeugen eine ausreichende antifungale Aktivität, was auch eine Antihefeaktivität einschließt, um das Wachstum von Hefe- und Pilzorganismen in den Windeln und auf der Kinderhaut zu hemmen, wodurch Windelausschlag oder andere durch Windeln ausgelöste opportunistische Infektionen verhindert werden.
Alternativ oder zusätzlich zur Behandlung der Windeln mit Bacillus-coagulans kann die Kinderhaut im Windelbereich mit einem durchtränkten weichen Stoffwischtuch, einem Pulver, einer Aerosolsprühflüssigkeit, einem Aerosolsprühpulver, einer Lotion, Creme oder Salbe, die den Bacillus-coagulans-Wirkstoff enthalten, behandelt werden. Vorzugsweise wird die Bacillus-coagulans-Formulierung nach dem baden und/oder bei Windelwechsel auf die Kinderhaut aufgebracht.
Geeignete Formulierungen schließen ein Pulver aus Talk und optional Duftstoff 10, das etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm enthält, ein. Andere geeignete Pulverformulierungen enthalten Talk, Mineralöl, Magnesiumcarbonat, DMDM, Hydantoin und etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm einer Kornstärke und Calciumcarbonatpulver. Ein unter Standardbedingungen hergestelltes Aerosolpulver, das ein Isobutan oder einen anderen gut bekannten Treibstoff enthält, ist ebenfalls geeignet. Ein Aerosolpulver kann durch Kombinieren von etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm in einem Isopropylmyristat, etwa 60% (w/w) SD-Alkohol 40-B und Isobutan als Treibstoff mit Hilfe von Standardverfahren formuliert werden. Ein manuelles Pumpspray, das 1 × 10⁶ bis 1 × 10¹¹ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm einer neutralen wässrigen Lösung ohne chemischen Treibstoff enthält, ist ebenfalls geeignet. Eine geeignete Sprühformulierung enthält neben dem Bacillus-coagulans-Probiotikum Alkohol, Glycerin, gereinigtes Wasser und Methylparaben. Eine Cremeformulierung enthält Aloe Vera, Isopropyl-Myristat, Methylparaben, Polysorbat 60, Propylparaben, gereinigtes Wasser, Sorbitanmonostearat, Sorbitollösung, Stearinsäure und etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm. Eine andere schützende Creme enthält Vitamin A und D äquivalent zur in Lebertranöl gefundenen Konzentration, Cetylpalmitat, Baumwollsamenöl, Glycerin, Glycerolmonostearat, optionalen Duftstoff, Methylparaben, Mineralöl, Kaliumstearat, Propylparaben und etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm. Eine Salbe enthält Lebertranöl, Lanolinöl, Methylparaben, Propylparaben, Talkum, optionalen Duftstoff und etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm. Eine andere Salbenformulierung enthält Petrolat, Wasser, Paraffin, Propylenglycol, Milchprotein, Lebertranöl, Aloe-Vera-Gel, optionalen Duftstoff, Kaliumhydroxid, Methylparaben, Propylparaben, Vitamine A, D und E sowie etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm. Ein weiches Stofftuch (d.h. ein Babywischtuch) wird in einer wässrigen Lösung (z.B. Wasser, amphoter 2, Aloe-Vera-Gel, DMDM, Hydantoin oder eine wässrige Lösung mit 30% bis 70% Alkohol) und etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm getränkt.
Topische Behandlung von vaginaler Hefeinfektion
(A) Mikroökologie der Vagina
Dem Fachmann ist allgemein bekannt, dass milchsäurebildende Mikroorganismen (z.B. Lactobacillus) eine wichtige Rolle bei der Wahrung einer gesunden Ökologie der Vagina besitzen. Die traditionellen Verfahren, die zur Verabreichung dieser biorationalen Materialien verwendet werden, berücksichtigen aber nicht die vielen Infektionsarten von Candida- und Gardnerella-Spezien, die eine schwere Erkrankung verursachen können.
Die große Mehrheit der Gynäkologen besteht darauf, dass die Risiken vaginaler Infektionen eine Folge von häufigem Baden sind. Entsprechend empfehlen Gynäkologen das Duschen an Stelle von Wannenbädern, um die Wahrscheinlichkeit zu senken, aufgrund der damit verbundenen Störungen der „normalen" milchsäurebildenden vaginalen Flora nachfolgende vaginale Infektionen zu entwickeln.
(B) Hefevermittelte vaginale Infektionen
Hefeinfektionen oder vulvovaginale Candidiasis (WC) werden durch verschiedene Arten von Candida (z.B. primär Candida albicans) verursacht. Über 85% aller Frauen leiden irgendwann an vulvovaginaler Candidiasis. Beispielsweise liegt der Markt innerhalb des US-Markts für antifungale Verbindungen, die zur Linderung dieser Krankheit verabreicht werden können, bei über $ 700 Millionen pro Jahr, mit einer damit einhergehenden Wachstumsrate von 9–11 % pro Jahr. Darüber hinaus werden jedes Jahr weitere Stämme der vorgenannten mykotischen Pathogene gegenüber den häufig verwendeten antifungalen Verbindungen (z.B. Ketoconazol, Miconazol, Fluconazol und dergleichen) resistent.
Eine gesunde vaginale Ökologie hängt primär von spezifischen angestammten milchsäurebildenden Mikroorganismen (z.B. Lactobacilli) ab. Es gibt daher auf dem Gebiet zahlreiche Ansätze, Produkte und/oder Verfahren zu entwickeln, die diese milchsäurebildenden Bakterien verstärken oder wiederherstellen. Ein Produkt ver sucht beispielsweise, Wasserstoffperoxid (H₂O₂) bildende Lactobacilli als vaginale Zäpfchentherapie zur Linderung von vaginalen Hefeinfektionen einzusetzen.
Die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen stellt weiterhin die Hauptschwierigkeit bei der Verwendung von Lactobacilli bei der vaginalen Supplementation dar, wenngleich viele Unternehmen, die vaginale Lactobacilli-Zäpfchen vertreiben, behaupten, dass jeder zähe Bakterienstamm zur Linderung einer Pilzinfektion in der Vagina genügt. Die vorgenannten Unternehmen basieren ihre Logik und die anschließenden Behauptungen jedoch auf die Tatsache, dass es Lactobacillus-Stämme gibt, die die Vagina besiedeln können, und dass ihr Stamm durch Zugehörigkeit zur Gattung Lactobacillus folglich auch wirksam sein sollte. Leider könnte diese Vermutung oder Annahme nicht falscher sein. In einer neueren Studie, die die verschiedenen angestammten Spezien und Stämme von Lactobacilli untersucht, die die Vagina von 100 gesunden Frauen besiedelten, zeigten die Ergebnisse, dass Lactobacillus acidophilus nicht die häufigste Lactobacillus-Spezies war, die aus der Vagina dieser Frauen isoliert wurde, als die häufigsten Stämme erwiesen sich vielmehr: Lactobacillus jensenii; Lactobacillus gasserii; Lactobacillus salivarius und Lactobacillus casel.
Die oben erwähnten Informationen in Verbindung mit dem neueren Nachweis, der zeigte, dass Wasserstoffperoxid (H₂O₂) ein obligatorisches Stoffwechselnebenprodukt für eine wirksame Bioaugmentation ist, widerlegen die bisherige Meinung, dass jeder Lactobacillus-Stamm gleichermaßen wirksam bei der Verwendung in einer auf Zäpfchen basierenden Verabreichungsform ist. Diese Tatsachen belegen daher den ungebrochenen Bedarf nach der Entwicklung eines Produkts zur vaginalen Supplementation in Verbindung mit einem wirksamen Verabreichungsverfahren, das die möglichen physiologischen Probleme in Verbindung mit der Verwendung von Badeprodukten und Baden im Allgemeinen mindert. Im Einzelnen muss dieses Produkt einen Stamm Milchsäure bildender Bakterien enthalten, der Eigenschaften wie (i) lange Gebrauchsfähigkeit und Lebensfähigkeit; (ii) eine schnelle Wachstumsrate (d.h. eine schnelle Verdopplungszeit) und (iv) eine höchst wirksame Produktion von Milchsäure zur Erzeugung eines sauren Milieus in der Vagina
(C) Bakterienvermittelte vaginale Infektionen
Trotz überzeugender Beweise, dass Infektionen des unteren Genitaltrakts in den oberen Genitaltrakt wandern und Entzündungen hervorrufen, vorzeitige Wehen auslösen und dergleichen können, halten einige Kliniker daran fest, dass Infektionen des unteren Genitaltrakts und bakterielle Vaginose lediglich „Marken" von Infektionen des oberen Genitaltrakts sind.
Zu beachten ist, dass bakterielle Vaginose keine wirklich durch Mikroorganismen vermittelte Infektion ist, sondern ein mikroökologischer Zustand, bei dem dramatische Veränderungen der endogenen vaginalen Mikroflora vorliegen. Insbesondere schließt bakterielle Vaginose eine Verminderung der Gesamtzahl an milchsäurebildenden Bakterienstämmen bei gleichzeitigem, mehrfach logarithmischen Anstieg der Population einer charakteristischen Mikroflora-Gruppe ein, einschließlich aber nicht ausschließlich: Gardnerella vaginalis, genitale Anaerobier und Mykoplasmen. Interessanterweise sind diese letzteren Mikroorganismen zusammen mit Streptokokken und Coliformen dieselben Arten, die bei Chorioamnionitis vorgefunden werden.
Darüber hinaus ist bakterielle Vaginose auch verbunden mit erhöhten Konzentrationen an bakteriellem Endotoxin, Proteasen, Muzinasen, Sialidasen, IgA-Proteasen und Phospholipasen A2 und C im unteren Genitaltrakt. Sowohl Beobachtungs- als auch Interventionsstudien haben gezeigt, dass das Vorliegen bakterieller Vaginose in den frühen Stadien der Schwangerschaft mit Frühgeburt und in den späteren Stadien der Gestation mit Fehlgeburt verbunden ist. Diese Studien legen nahe, dass bakterielle Vaginose eine direkte Ursache für nachteilige Schwangerschaftsausgänge ist, und nicht nur einfach ein Ersatzmarker ist. Studien legen nahe, dass aufsteigende Infektionen oder eine anomale Mikroflora des unteren Genitaltrakts nachteilige Schwangerschaftsausgänge begünstigen. Ähnliche Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Wirt treten bei Zahnfleischerkrankungen auf.
Bakterielle Vaginose-Infektionen können auch durch die Verwendung von milchsäurebildenden (d.h. probiotischen) Organismen gelindert werden. Wie vorstehend beschrieben ist die Beziehung von Ursache und Wirkung bei bakterieller Vaginose auf die Reduzierung von milchsäurebildenden Bakterienstämmen mit dem resultierenden, mehrfach logarithmischen Anstieg der anaeroben Mikroorganismen zurückzuführen, einschließlich aber nicht ausschließlich von Gardnerella vaginalis. Die Ergebnisse einer neueren Studie mit 3.900 Frauen, die in Dänemark durchgeführt wurde, zeigte jedoch, dass das Fehlen bakterieller Vaginose direkt mit einer ausreichenden vaginalen Besiedelung durch aerobe, milchsäurebildende Bakterien verbunden war. In Übereinstimmung damit dient die vaginale Supplementation mit einer wirksamen milchsäurebildenden Bakterien-Spezies dazu, das Ungleichgewicht zwischen aeroben milchsäurebildenden Organismen und den anaeroben Arten, die bei der Ätiologie bakterieller Vaginose eine Rolle spielen, zu beheben. Eine solche vaginale Supplementation kann entweder prophylaktisch oder therapeutisch eingesetzt werden.
Es wurde nun gezeigt, dass bestimmte Arten von milchsäurebildenden Bakterien in hochalkalischen Badeprodukt-Zusammensetzungen aufgenommen werden können. Diese Zusammensetzungen würden sich für nahezu alle anderen Spezien von milchsäurebildenden Bakterien als letal erweisen, einschließlich aber nicht ausschließlich: Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus und verschiedene andere Stämme von Bakterien mit vegetativen Zellen.
Die Verabreichung bleibt das Hauptproblem der vaginalen Supplementation, und vor der vorliegenden Erfindung bestand lange schon Bedarf nach einer Inokulierungsstrategie, die eine vaginale Milchsäuren-Supplementation nebensächlich macht. Die Verabreichung einer angemessenen Dosis eines wirksamen Milchsäure-Organismus in einem Bade- oder Duschprodukt würde daher einige der vaginalen Probleme angehen, die mit häufigem, aber auch gelegentlichen Baden einhergehen; Aromtherapie, Meersalz, Badepulver, Badegele, Badeöle und dergleichen könnten ein wirksames Inokulum von milchsäurebildenden Bakterien zur vaginalen Behandlung enthalten.
Der Mechanismus dieser Art von Verabreichung kann wie folgt erklärt werden. Nachdem die Frau ein warmes Bad eingelassen hat, würde sie 1 bis 4 Unzen des vorgeschlagenen Badeprodukts, das etwa 1 × 10⁹ bis 2,5 × 10¹⁰ vegetative Bakterienzellen (oder Sporen, abhängig von dem verwendeten spezifischen Bakterienstamm) enthält, in das Wasser geben. Die Frau würde insgesamt etwa 20 Minuten lang im Bad sitzen, wobei sie ihre Beine bewegen würde, um die vaginale Inokulation zu erleichtern. Anschließend könnte diese Behandlung am dritten Tag (z.B. in Fällen akuter vulvovaginaler Candidiasis (WC) oder bakterieller Vaginitis (BV)) oder „regelmäßig" (d.h. mindestens monatlich) wiederholt werden, um die dauerhafte Stabilität der vaginalen Ökologie und Mikroflora zu fördern. Darüber hinaus sollte sich diese Methodik auch zur Förderung der allgemeinen Hautgesundheit als nützlich erweisen, da einige Arten von milchsäurebildenden Bakterien zur Förderung gesunder Haut geeignet sind.
Andere Bakterienstämme, die in einem Bad- oder Duschprodukt verwendet werden können, umfassen Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus, Bacillus uniflagellatus, Bacillus pumilus, Bacillus sterothermophilus, Bacillus lentus, Bacillus mycoides, Sporolactobacillus sp., Bacillus licheniformis oder andere Bacillus-Spezien, die Pathogene aus dem Feld schlagen oder nachweislich Stoffwechselnebenprodukte erzeugen, die mykotische oder bakterielle Pathogene hemmen. Andere Eigenschaften, die die Wirksamkeit eines Bad- oder Duschprodukts beeinflussen würden, würden die Barotoleranz (d.h. Drucktoleranz), die Halotoleranz (d.h. alkalische Toleranz) und Thermotoleranz (d.h. Wärmetoleranz) des verwendeten spezifischen probiotischen Organismus umfassen. Eine beispielhafte Badesalz-Formulierung (pro Dosis) der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:

Bacillus coagulans 250.000.000 Sporen (etwa 18 mg)

Badesalze (Meeressalze & mineralische Salzte) 10 g

Fructo-Oligosaccharide (FOS) 1 g

Mikrokristalline Cellulose (MCC) 5 g

Duftstoff Spuren
Badeprodukte, einschließlich granuliertes oder pulverförmiges Schaumbad, Badesalze, Badeöle, Pulver, suspendierte Aerosol-Mikropartikel und dergleichen, zur Behandlung vaginaler Candida albicans und/oder von Candida-tropicalis-Infektionen können in verschiedenen Formulierungen hergestellt werden, die vegetative Zellen oder (vorzugsweise) Sporen von Bacillus coagulans enthalten. In einer bevorzugten Ausführung, in der Schaumbäder, Badkristalle, Badesalze, Badeöle und dergleichen, in Badewasser gegeben werden, etwa 1 × 10⁹ Bacillus-coagulans-Sporen pro ml einer ölbasierten Formulierung wie Mineralöl, Laureth-4, Quaternium-18, Hektorit und Phenylcarbinol. In einem typischen Bad (etwa 30 – 100 Gallonen Gesamtvolumen) werden insgesamt etwa 5 × 10⁹ Bacillus-coagulans-Sporen verwendet. Natürliche ölbasierte Formulierungen mit oder ohne Duftstoff, die etwa 1 × 109 Bacillus-coagulans-Sporen pro ml eines Öls einschließlich aber nicht ausschließlich Olivenöl, Traubenkernöl, Süssmandelöl, Geraniumöl, Grapefruitöl, Mandarinenöl, Pfefferminzöl, verschiedene ätherische Öle (z.B. Rosmarin, Zitrone, Geranie, Ylang Ylang, Orange, Grapefruit, Fichte, Muskat, Balsam, Limette, Pfefferminz, Vanille, Lavendel, Eukalyptus, Mandel, Rose, Palmarosa, Olbas, Kukui-Nuss, Olibanum und dergleichen) sowie andere Öle, Kräuter und Materialien enthalten, die für Aromatherapie-Anwendungen wohlbekannt sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführung umfasst eine seifenfreie weichmachende Reinigungszusammensetzung Natriumoctoxynol-2-ethansulfonat-Lösung in Wasser, Petrolat, Octoxynol-3, Mineralöl oder Lanolinöl, Cocamid MEA, optionalen Duftstoff, Imidazolidinyl-Harnstoff, Natriumbenzoat, Tetranatrium-EDTA, Methylcellulose, eingestellt auf einen pH von 6,5 bis 7,5, etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm. Andere geeignete Reinigungsmittel umfassen gut bekannte auf Wasser, Glycerin und Natriumoleat basierende Formulierungen, eingestellt auf einen neutralen pH-Wert von 7,0, die etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm enthalten. Hartgewalzte Seifen, die nach Standard verfahren hergestellt werden, können aufgrund der Tatsache, dass Sporen den für die Seifenherstellung erforderlichen Druck und die erforderliche Wärme überstehen können, ebenfalls etwa 1 × 10⁷ bis 1 x 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen pro Gramm enthalten.
In einer noch anderen bevorzugten Ausführung werden für eine pulverbasierte Zusammensetzung etwa 1 × 10⁹ Bacillus-coagulans-Sporen pro g Talkum, pulverförmiges Hafermehl, Kornstärke oder ähnliche pulverförmige Substanzen verwendet.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführung kann ein weiches Stofftuch, getränkt mit einer Lösung aus Wasser, Kaliumsorbat, Dinatrium-EDTA, das etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁹ Bacillus-coagulans-Sporen pro Tuch enthält, zum Reinigen des äußeren Vaginalbereichs verwendet werden. Zusätzliche Bestandteile der vorgenannten Formulierung können DMDM-Hydantoin, Isopropylmyristat, Methylparaben, Polysorbat 60, Propylenglykol, Propylparaben oder Sorbitanstearat einschließen. Das Einwegtuch kann zum behutsamen Abwischen des perivaginalen Bereichs verwendet werden und wird dann weggeworfen.
In einer anderen bevorzugten Ausführung werden feste Vaginalsuppositorien oder -zäpfchen, die etwa 1 × 10⁸ Bacillus coagulans pro Zäpfchen enthalten, für die Schleimhautbehandlung von Candida abbicans und/oder Candida-tropicalis-Infektionen genutzt. Solche Formulierungen können zum Beispiel aus einer Kombination von Kornstärke, Lactose, einem Metallstearat (z.B. Magnesiumstearat) und Povidon hergestellt werden. Üblicherweise sollten ein bis drei feste Zäpfchen pro Tag verwendet werden, solange Symptome (z.B. vaginaler Juckreiz und/oder weißlicher Ausfluss) festgestellt werden. Optional wird ein Zäpfchen pro Tag über insgesamt drei bis sieben Tage, vorzugsweise zur Bettzeit, verwendet.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführung kann für eine aerosolbasierte Abgabe von suspendierten Mikropartikeln ein Aerosolspray formuliert werden, indem etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10¹¹ Bacillus-coagulans-Sporen pro g eines Trägergemisches, das aus Isopropylmyristat, etwa 60% (w/w) SD-Alkohol 40-B und Isobutan als Treibstoff besteht, kombiniert werden. Ein nichtaerosolhaltiges manuelles Pumpspray, das etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹¹ Bacillus-coagulans-Sporen pro g einer neutralen wässrigen Lösung enthält, kann ebenfalls eingesetzt werden. Eine geeignete Sprayformulierung umfasst Alkohol, Glycerin, gereinigtes Wasser und Methylparaben neben den probiotischen Bacillus-coagulans-Mikroorganismen.
Zu beachten ist, dass diese Zusammensetzungen sich auch bei der Behandlung von nicht-pathogener, nicht-spezifischer Dermatitis als hochwirksam erwiesen haben, wenngleich die Linderung von Hefeinfektionen die primäre vaginabasierte Nutzung von therapeutischen Bacillus-coagulans-Zusammensetzungen ist. Die Immersion in die erfindungsgemäßen therapeutischen Badezusammensetzungen ermöglicht das Festsetzen des probiotischen Bacillus coagulans auf Haut oder Schleimhaut, was Dermatitis unbekannter Ätiologie zu lindern pflegt.
Verhinderung und/oder Behandlung von opportunistischen Hautinfektionen
Opportunistische Hautinfektionen mit Pseudomonas- und/oder Staphylococcus-Spezien (d.h. üblicherweise Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidus, Staphylococcus aureus und dergleichen) treten häufig gleichzeitig mit Hautallergien (z.B. allergische Reaktionen auf pflanzliche Reizstoffe wie beispielsweise Giftsumach), Druckgeschwüren, Diabetes-Läsionen oder anderen Arten von Läsionen auf. Probiotische Formulierungen, die Bacillus-coagulans-Sporen (d.h. etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰/ml abhängig von der spezifischen Formulierung und Anwendung) und/oder Überstand oder Filtrat mit extrazellulären Bacteriocinen enthalten, die von Bacillus-coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Stämmen erzeugt werden, sind bei der Verhinderung oder Behandlung von opportunistischen Hautpathogenen höchst nützlich. Zudem sind probiotische Bacillus-coagulans-Formulierungen bei der Verhinderung einer Infektion mit meticillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) brauchbar, insbesondere im Anschluss an eine Verletzung oder invasive chirurgische Eingriffe. Es werden eine Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-Emulsion, Creme, Lotion, Pulver, Aerosolpulver oder Aerosolspray, die etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml enthalten, verwendet. Verschiedene geeignete Träger wurden hier bereits beschrieben und andere sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Bei der Ausübung dieser erfindungsgemäßen Ausführung wird die Haut zunächst mit Seife und Wasser gereinigt und sorgfältig getrocknet. Die Bacillus coagulans enthaltende therapeutische Zusammensetzung wird dann auf die Haut aufgetragen, wobei sichergestellt wird, dass die Zusammensetzung auf die Flächen zwischen den Zehen, unter den Brüsten, unter den Armen oder anderen Flächen, die feucht werden oder Wundreiben oder Abschürfungen aufweisen können, aufgetragen wird.
Zusätzlich zur topischen Behandlung der Haut mit einer Emulsion, Creme, Lotion, Pulver, Aerosolpulver oder Aerosolspray, die Bacillus-coagulans-Probiotikum enthalten, kann die Haut mit einer probiotischen Formulierung, wie sie hier beschrieben wird, gereinigt werden.
Behandlung von Tinea-Pilzinfektionen
Kleienflechte (Tinea versicolor) wird durch lokalisierte Infektionen der Haut von Rumpf und Nacken durch Dermatophytenpilze, die die äußere Schicht der Haut besiedeln, verursacht, was zu im Allgemeinen kreisrunden Flecken von weißer, brauner oder rosafarbener, sich ablösender Haut führt, die häufig juckt. Wenn Kleienflechte einmal festgestellt wurde, wird die betroffene Fläche und eine Umgebung von ungefähr 1 bis 10 cm² Fläche zweimal täglich mit einer Creme oder Lotion, die etwa 10 Gew.% Bacillus-coagulans-Sporen enthält, behandelt. In dieser Anmeldung werden geeignete Träger beschrieben, die vorzugsweise etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml Träger enthalten.
Zur Behandlung der verwandten Erkrankung Tinea cruris (d.h. Leistenbeugenmykose) wird ein Pulver, das etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10⁹ Bacillus-coagulans-Sporen/ml kolloidalen Silicondioxid, Isopropylmyristat, Talkum und optionalem Duftstoff enthält, auf die Leistengegend aufgebracht, um Juckreiz, wunde Stellen, brennenden Aus schlag und Reizung zu lindern. Die Behandlung erfolgt zweimal täglich, im Allgemeinen nach dem Baden und zur Bettzeit, bis keine Symptome mehr feststellbar sind.
Kleidung, insbesondere Unterwäsche und Nachtbekleidung, die in Kontakt mit Rumpf und Nacken kommen, wird mit einem Aerosol, das etwa 1 % bis etwa 20% Bacillus-coagulans-Wirkstoff in einem hier beschriebenen geeigneten Träger enthält, besprüht, um die Ausbreitung der Infektion auf weitere Bereiche des Körpers zu verhindern.
Behandlung von Bakterien- und Pilzinfektionen der Haut und Cuticula
Wie bereits beschrieben erzeugen verschiedene milchsäurebildende Bakterien (z.B. Bacillus coagulans und Pseudomonas lindbergii) nachweislich extrazelluläre Produkte, die von antifungaler Art sind, wenngleich alle Produkte, die von diesen Bakterien stammen, ein Ergebnis der Reinigung eines spezifischen wirksamen Analogons wie beispielsweise eines Proteins, Kohlenhydrats oder eines organischen Moleküls zur Schaffung einer neuen antifungalen Verbindung sind. Es wurde vorgeschlagen, dass die Verwendung eines einzelnen Wirkstoffs dazu beiträgt, resistente Spezien von pathogenen Pilzen zu erzeugen, und daher müssen neue Generationen von antifungalen Verbindungen entdeckt werden, um diese neu entwickelten Arten zu bekämpfen. Die Verwendung eines bakteriellen Überstands in seiner rohen oder in einem halb-raffiniertem Zustand kann bei topischen Anwendungen wirksamer sein, und kann sogar durch Bereitstellen eines komplexeren Tötungsmechanismus, der schwieriger zu überwinden ist als ein einzelnes chemisches Mittel oder Analogon, die Rate antifungaler Resistenz senken.
Die Verwendung von Emu-Öl als „Träger" in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen verbessert die Wirksamkeit bei der Verhinderung und/oder therapeutischen Behandlung von Pilz- oder Bakterieninfektionen der haut und Cuticula sowohl beim Menschen als auch bei Tieren beachtlich. Diese therapeutischen Zusammensetzungen bestehen aus den Fermentationsprodukten von spezifischen Bakterienstämmen und optional einem im Handel erhältlichen Antibiotikum oder antifugalen Mittel in Kombination mit einer wirksamen Menge Emu-Öl in einem pharmazeutisch zulässigen Träger, der für die Verabreichung auf die dermalen und/oder cuticularen Membranen eines Menschen oder Tieres geeignet ist.
Bei verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungen kann die endgültige Form der therapeutischen Zusammensetzung ein stabilisiertes Gel, eine Lotion, eine Creme, einen halbfesten Rollstift, ein Fluid, ein Aerosol, ein Sprühpulver oder eine Emulsion enthalten, ist aber nicht hierauf beschränkt.
Die Gesamtwirkung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen hängt von der Konzentration von Emu-Öl ab, die bei der Formulierung verwendet wird. Insbesondere wurde festgestellt, dass höhere Prozentanteile an Emu-Öl wirksamer sind als niedrigere Prozentanteile. Ohne an einen wirksamen Prozentanteil gebunden zu sein, liegt der Bereich von Emu-Öl, der in einer erfindungsgemäßen topischen therapeutischen Zusammensetzung verwendet wird, in einem Bereich von etwa 0,5 bis 99,9%, wobei ein bevorzugterer Bereich zwischen etwa 10% bis 75% und der am meisten bevorzugte Bereich zwischen etwa 25% bis 60% liegt. Der weiteste Wirkbereich von 0,5% bis 99,9% für die Emu-Öl-Konzentration ist auf die geringen Konzentrationen von antimikrobiellen Verbindungen zurückzuführen, die üblicherweise in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Zum Beispiel macht das Antipilzmittel Miconazolnitrat in einer dermalen Anwendung im Allgemeinen nur 2% der Gesamtformulierung aus. Folgendes sind Beispiele therapeutischer Zusammensetzungen, die sich bei der Linderung bakterieller und mykotischer Erkrankungen von Haut und Cuticula als wirksam erwiesen haben. Therapeutische Zusammensetzung Nr. 1

Miconazolnitrat, Fluconazol, Tolnaftat, Ketoconazol oder Intraconazol 2%

Emu-Öl oder Fraktion davon 90%

Emulgator 5%

Duftstoff 3%

Therapeutische Zusammensetzung Nr. 2

Quaternäres Ammoniumchlorid, Iod, Alkohol oder Phenolverbindungen 10%

Emu-Öl oder Fraktion davon 80%

Emulgator 7%

Duftstoff 3%

Therapeutische Zusammensetzung Nr. 3

Fermentationsprodukte einer Bakterienüberstand-Zusammensetzung 50%

Emu-Öl oder Fraktion davon 40%

Emulgator 7%

Duftstoff 3%

Therapeutische Zusammensetzung Nr. 4

Fermentationsprodukte einer Bakterienüberstand-Zusammensetzung 50%

Emu-Öl oder Fraktion davon 25%

Lavendelöl 2%

Hydrosperse-Öl 20%

Emulgierende Mittel 3%
Wie bereits beschrieben können diese oben erwähnten erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen in Kombination mit anderen antifungalen verwendet werden, einschließlich aber nicht ausschließlich mit: Fluconazol, Intraconazol, Ketoconazol, Tolnaftat, Lamasil, Quaternäre Ammoniumchloride, Phenole, Iodiphere und dergleichen. Ferner können auch verschiedene andere Materialien (z.B. Titanoxid) zur Verbesserung der Weißfärbung von Zehen- oder Fingernagel verwendet werden.
In einem spezifischen Beispiel wurde eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung, die einen aus Bacillus coagulans gewonnenen Bakterienüberstand enthielt, zur Linderung der menschlichen Pilzinfektion Onychomycosis verwendet. Ein Milliliter der oben genannten therapeutischen Zusammensetzung wurde nach dem Baden auf jeden infizierten Nagel aufgebracht. Die Behandlung führte bei allen untersuchten Personen innerhalb von 10 Tagen zu einer Veränderung der grünen bis gelben Farbe des Nagels. Darüber hinaus löste sich der Detritus unter dem Nagel innerhalb der ersten sieben Tage ab, und die Dicke des Nagels (eine der klinischen Manifestationen der Krankheit) begann abzunehmen. Obwohl die zur Besserung dieser Krankheit insgesamt erforderliche Zeit von Patient zu Patient variierte, lag die durchschnittlich nötige Zeit im Bereich von einem Monat bei oberflächlichen Infektionen bis hin zu sechs Monaten bei ausgeprägterer Onychomykose. Es muss auch in Betracht gezogen werden, dass das kosmetische Erscheinungsbild ein Aspekt dieser Krankheit ist, der unabhängig von der Erkrankung des Nagels ist.
Es hat sich gezeigt, dass die gleichzeitige antifungale Wirkung des Bakterienkulturüberstands kombiniert mit den hautpenetrierenden und heilenden Eigenschaften des Emu-Öls bei der Besserung von Pilzinfektionen synergistisch zusammenwirken. Es ist allgemein bekannt, dass Emu-Öl Hautzellen so rehydrieren kann, dass das Wachstum neuer Zellen gefördert wird. Gleichermaßen ist es sehr gut möglich, dass Emu-Öl in gleicher Weise bei menschlichen Nägeln und Oberhautgewebe wirkt.
In anderen spezifischen Beispielen wurde eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung, die einen aus Bacillus coagulans gewonnenen Bakterienüberstand enthielt, zur Behandlung von Fällen von Windelausschlag verwendet, die durch bakterielle Infektionen oder Pilzinfektionen kompliziert waren. Es wurde ein unmittelbares (d.h. 18 Stunden) Nachlassen der Hautentzündung und -rötung erzielt, und alle Infektionen besserten sich innerhalb von 48 Stunden vollständig. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Verwendung dieser therapeutischen Zusammensetzungen bei Behandlung von Leistenbeugenmykose (Tinea cruris), Kleinenflechte, Fußpilz (Tinea pedis), Kopfhautinfektionen (Tinea capitis), Bartinfektionen (Tinea barbae), Candidaiasis von Haut, Zehen, Fingernägeln und Vulva und anderen Haut- und Oberhauterkrankungen beobachtet.
Verschiedene Pferdehufkrankheiten (z.B. Erkrankung der weißen Linie, Strahlfäule, Vollhuf und selbst Klumpfuß) haben auf die Verwendung von erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen, die aus Bacillus coagulans gewonnenen Bakterienüberstand enthalten, in gleicher Weise wie Onychomycosis bei Menschen angesprochen. Darüber hinaus kann Emu-Öl entsprechend seiner physiologischen Wirkung beim Menschen auch eine Rehydration und Stimulierung neuen Zellwachstums in Tierhufen und anderen Oberhautmaterialien bewirken.
Behandlung oberflächlicher Hautinfektionen
Oberflächliche Infektionen mit Staphylococcus-Spezien (z.B. Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis) einer verstopften Schweiß- oder Talgdrüse verursachen Pusteln; Geschwüre, Abszesse, Gerstenkörner oder Eitergeschwüre. Diese oberflächlichen Hautinfektionen können aufgrund bakterieller Toxine, die von der Spezies Staphylococcus freigesetzt werden, auch von einem Blasen bildenden Ausschlag begleitet werden (insbesondere bei Babys).
Es werden eine Wasser-in-Öl- oder Öl-in-Wasser-Emulsion, Creme, Lotion, oder ein Gel, die etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml enthalten, verwendet. Ein beispielhaftes topisches Gel wird durch Vermischen gleicher Volumen von Propylenglycol und Wasser, 1 Gew.% Hydroxpropylcellulose (MG 100.000 bis 1.000.000 Dalton) und lyophilisierte Bacillus-coagulans-Kultur zu einer Endkonzentration von etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁹ Bacillus-coagulans-Sporen/ml der Kombination und Stehenlassen der gerührten Mischung über 3 bis 5 Tage, um ein Gel zu bilden, erzeugt. Andere Formulierungen werden in dieser Anmeldung ebenfalls vorgestellt.
Die Bacillus coagulans enthaltende Emulsion, Creme, Lotion bzw. Gel wird auf die Hautfläche aufgetragen, die oberflächliche Hautinfektionen (z.B. Pusteln, Geschwü re, Abszesse, Gerstenkörner oder Eitergeschwüre) oder Ausschlag aufweist, und wird vorsichtig in die Haut gerieben, wo sie trocknen darf. Die Anwendungen erfolgen mindestens einmal pro Tag und vorzugsweise zwei- bis dreimal pro Tag (z.B. morgens und abends) oder nach jedem Waschen der infizierten Fläche bei den Flächen, die häufig gewaschen werden (z.B. die Hände oder der Windelbereich). Die Anwendungen werden fortgesetzt, bis die Hautentzündung zurückgegangen ist und die Haut für den Beobachter normal erscheint. In Fällen, da es in der infizierten Fläche zu Schorfbildung gekommen ist, werden die einmal täglichen Anwendungen fortgesetzt, bis kein Schorf mehr vorhanden ist.
Aknebehandlung
Zur Behandlung oder Verhinderung von Akne vulgaris wird ein Reinigungsmittel mit Bacillus-coagulans-Wirkstoff, der aus einem Überstand einer Bakterienkultur gewonnen wurde, täglich als Hautpflegeprodukt zur Entfernung übermäßigen Schmutzes und von Öl und zur Verhinderung opportunistischer Infektion der Haut aufgetragen. Ein geeignetes Reinigungsmittel umfasst Bentonit, Cocoamphodiproprionat, optionalen Duftstoff, Glycerin, Eisenoxide, Magnesiumsilicat, Natriumborhydrid, Natriumchlorid, Natriumcocoat, Natriumtallowat, Talkum, Tetranatrium-EDTA, Titandioxid, Trinatrium-EDTA, Wasser und etwa 1 % bis etwa 20% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung vermehrten Bacillus-coagulans-Kultur.
Ein ähnliches Reinigungsmittel, insbesondere für empfindliche Haut, umfasst etwa 30% bis 50% kolloidales Hafermehl, suspendiert in einer Basis aus Wasser, Glycerin, Distearyldimoniumchlorid, Petrolat, Isopropylpalmitat, Cetylalkohol, Dimethicon, Natriumchlorid, eingestellt auf einen pH von etwa 7,0 und mit etwa 5% bis etwa 50% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung vermehrten Bacillus-coagulans-Kultur.
Alternativ kann die Haut mit Hilfe eines beliebigen gut bekannten Reinigungsmittels gereinigt werden, und dann wird eine Creme, die einen aus einer Bacillus- coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Kulturüberstand bzw. -filtrat gewonnenen Wirkstoff enthält, in einer dünnen Schicht nach Bedarf etwa alle zwei Tage bis zu etwa dreimal täglich auf die Haut aufgetragen. Eine geeignete Creme umfasst etwa 10% bis 12% Alkohohl (v/v), Bentonit, optionalen Duftstoff, Eisenoxide, Kaliumhydroxid, Propylenglycol, Titandioxid, gereinigtes Wasser und etwa 0,5% bis 60% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung vermehrten Bacillus-coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Kultur.
Die obige Formulierung ist für die Behandlung von Akne geeignet, die durch Propionibacterium acne oder durch Staphylococcus epidermidis verursacht wird.
Behandlung von Herpes simplex I & II sowie Herbes-Zoster-Infektionen Fieberbläschen (die sich im Allgemeinen im oder um den Mund finden) werden von dem Virus Herpes simplex I verursacht, während ähnliche Läsionen im Bereich der Genitalien von Herpex simplex II verursacht werden. Herpes-Simplex-Virusinfektionen können auch schmerzhafte Schwellungen von Fingern und Zehen verursachen (z.B. Herpetic Whitlow). Beide Arten von Herpes-Simplex-Läsionen oder Whitlow können mit einer Creme, Lotion oder Gelsalbe, die tea 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml enthält, behandelt werden.
Für oralen Fieberbläschen enthält ein lindernder, weich machender Lippenfettstift Allantoin, Petrolal, Titandioxid in kosmetisch zulässiger Höhe sowie etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml. Der Lippenfettstift kann weiterhin einen Sonnenschutzfilter (z.B. Padimat O) einschließen. Ein alternativer weich machender Lippenfettstift enthält die gleichen Grundinhaltsstoffe, die zu einer Emulsion mit etwa 0,5% bis 20% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer zur Sättigung angezogenen Bacillus-coagulans-Kultur gemischt sind. Der Lippenfettstift wird dann auf die Lippen und den betroffenen Bereich aufgetragen, so dass er prophylaktisch eine dünne Schicht bildet, wenn prodromale Symptome verspürt werden (z.B. Kribbeln, Jucken, Brennen) oder wenn eine Läsion sichtbar ist. Der Lippenfettstift sollte so oft wie erforderlich (z.B. bei Vorliegen einer Läsion jede Stunde) und im Allgemeinen einmal pro Tag zur Bettzeit aufgetragen werden.
Bei oralen Fieberbläschen können die Bacillus-coagulans-Sporen oder das extrazelluläre Mittel in Kulturüberstand oder Filtrat in einen halbfesten Lippenfettstift formuliert werden, der etwa 20% bis 40% weißes Petrolat, Wachsparaffin, Mineralöl, Isopropyllanolat, Kampfer, Lanolin, Isopropylmyristat, Cetylalkohol, Carnuba-Wachs, Methylparaben, Propylparaben, Titandioxid und optional Duftstoff und Farbstoffe enthält.
Für genitale Herpesläsionen wird eine Creme oder Salbe mit Hilfe von hier beschriebenen Standardverfahren formuliert, die etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml und/oder etwa 0,5% bis 20% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung angezogenen Bacillus-coagulans-Kultur enthält. Die Creme oder Salbe wird mindestens zweimal täglich nach Bedarf aufgetragen.
Für von Herpes Zoster verursachte Läsionen (z.B. Gürtelrose) wird eine Creme oder Salbe mit Hilfe von hier beschriebenen Standardverfahren formuliert, die etwa 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ Bacillus-coagulans-Sporen/ml und/oder etwa 0,5% bis 20% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung angezogenen Bacillus-coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Kultur enthält. Die Creme oder Salbe wird mindestens zweimal täglich nach Bedarf aufgetragen.
Bacillus-coagulans-Sporen enthaltende Ohrtropfen oder Ohrspülung
Zur Verhinderung oder Behandlung von Infektionen des äußeren Ohrkanals wird eine wässrige Formulierung, die etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁸ Bacillus-coagulans-Sporen/ml und/oder etwa 0,1% bis 15% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung angezogenen Bacillus-coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Kultur enthält, verwendet. Die Sporen bzw. der Überstand werden einer sterilen wässrigen Lösung zugegeben, die etwa 5% bis 50% Glycerin (v/v), etwa 0,1% bis 5% Propylenglycol (v/v) und Natriumhexahydroxostannat oder Natriumchlorid enthält. Eine alternative Formulierung weist etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁸ Bacillus-coagulans-Sporen/ml und/oder etwa 0,1% bis 15% (v/v) eines wässrigen Überstands oder Filtrats einer bis zur Sättigung angezogenen Bacillus-coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Kultur in einer sterilen wässrigen Lösung von etwa 0,5% bis 25% Glycerin (v/v), etwa 5% bis 10% Alkohol (v/v) und Polysorbat 20 auf.
Zum Aufbringen der Formulierung neigt der Verwender den Kopf zur Seite, und mit Hilfe eines standardmäßigen Tropferapplikators werden etwa 3 bis 10 Tropfen der vorgenannten Ohrformulierung in das Ohr gegeben, ohne dass der Applikator tatsächlich in den Ohrkanal eindringen muss. Der Kopf wird mehrere Minuten lang geneigt gehalten, alternativ kann das Ohr leicht mit einem Wattebausch verschlossen werden, damit die Lösung bis zu 15 Minuten lang im Ohr bleiben kann. Dann wird der Kopf wieder geneigt und überschüssige Lösung kann aus dem Ohr abfließen. Zum Entfernen der überschüssigen Formulierung kann auch behutsames Waschen mit einer warmes Wasser enthaltenden Ohrspritze verwendet werden. Die probiotische Lösung kann gelegentlich oder täglich über insgesamt bis zu etwa fünf Tagen appliziert werden. Die beiliegenden Anweisungen weisen darauf hin, dass ein Arzt aufgesucht werden sollte, wenn es zu Flüssigkeitsabgang, Ausfluss, Ausschlag, starker Reizung im Ohr kommt oder wenn beim Patienten Schwindel auftritt.
Prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Fußpilz
Zur Verhinderung oder therapeutischen Behandlung von Fußpilz (d.h. Tinea-Pilzinfektion) werden die Füße mit Seife und Wasser gewaschen, sorgfältig getrocknet, und es wird ein Pulver, eine Creme, Lotion, Salbe oder ein Gel, wie sie in den vorstehenden Beispielen beschrieben werden, auf der gesamten Fußfläche aufgetragen. Vorzugsweise enthält die Formulierung etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁸ Bacillus-coagulans-Sporen/ml und/oder etwa 0,5% bis 20% Bacillus-coagulans-Überstand oder -Filtrat einer bis zur Sättigung angezogenen Bacillus-coagulans- oder Pseudomonas-lindbergii-Kultur. Die täglichen Behandlungen werden nach Bedarf fortgeführt.
Ferner kann Fußpilz durch Verwendung einer standardmäßigen Einlegsohle (z.B. ein Gewebe, ein Faserstoff oder ein synthetischer Schaum), auf deren Oberfläche das Bacillus-coagulans-Probiotikum oder extrazelluläre antifungale Produkt gesprüht wurde oder die damit imprägniert wurde, verhindert oder behandelt werden. Solche behandelten Einlegsohlen können täglich über bis zu zwei bis drei Monate getragen werden, woraufhin sie weggeworfen und durch frische, behandelte Einlegsohlen ersetzt werden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Pseudomonas lindbergii-Überstand, einen Bacillus coagulans-Überstand, ein Antipilzmittel und Emu-Öl in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, welcher für die topische Aufbringung auf die Haut oder eine Schleimhautmembran eines Säugers geeignet ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen Pseudomonas lindbergii-Überstand, einen Bacillus coagulans-Überstand, ein Antipilzmittel und Emu-Öl, für die Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren des Wachstums von Bakterien, Hefe, Pilzen, Viren oder einer Kombination davon, wobei die Zusammensetzung auf die Haut oder eine Schleimhautmembran eines Säugers topisch aufzubringen ist und eine ausreichende Zeit lang vorhanden sein zu lassen ist, um das Wachstum von Bakterien, Hefe, Pilzen, Viren oder einer beliebigen Kombination davon zu inhibieren.
Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 2, umfassend: a) Aufbringen einer Zusammensetzung, welche einen Pseudomonas lindbergii-Überstand, einen Bacillus coagulans-Überstand, ein Antipilzmittel und Emu-Öl umfasst, auf eine feste Oberfläche; b) wobei die feste Oberfläche mit dem darauf aufgebrachten Pseudomonas lindbergii-Überstand, Bacillus coagulans-Überstand, Antipilzmittel und Emu-Öl mit der Haut oder einer Schleimhautmembran eines Säugers in Kontakt zu bringen ist; und c) eine ausreichende Zeit lang mit der Haut oder Schleimhautmembran in Kontakt zu lassen ist, um die Initiation von probiotischer Aktivität des isolierten Pseudomonas lindbergii-Überstands, Bacillus coagulans-Überstands, Antipilzmittels und Emu-Öls zu gestatten, sodass das Wachstum von Bakterien, Hefe, Pilzen, Viren oder einer Kombination davon, benachbart zu oder auf der Haut oder Schleimhautmembran des Säugers inhibiert wird.
Verwendung von Anspruch 3, wobei der Pseudomonas lindbergii-Überstand in der Zusammensetzung in Form eines extrazellulären Produkts eingeschlossen ist, umfassend einen hydophilen Überstand oder Filtrat einer Kultur eines Pseudomonas lindbergii-Stamms, fraktioniert unter Anwendung eines Verfahrens, welches aus der aus Sub-Mikrometer-Filtration, Ionenaustauschchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestehenden Gruppe gewählt ist, in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, welcher für die topische Aufbringung auf die Haut oder eine Schleimhautmembran eines Säugers geeignet ist.
Gefertigter Gegenstand, umfassend einen flexiblen Gegenstand und eine wirksame Menge eines extrazellulären Produkts, das ein Überstand oder Filtrat einer Kultur eines Pseudomonas lindbergii-Stamms ist, eines extrazellulären Produkts, das ein Überstand oder Filtrat einer Kultur eines Bacillus coagulans-Stamms ist, eines Antipilzmittels und von Emu-Öl, welche auf den flexiblen Gegenstand aufgebracht sind, wobei der flexible Gegenstand dazu beabsichtigt ist, von einem Säuger getragen oder an die Haut oder eine Schleimhaumembran desselben angeheftet zu werden, sodass der antimikrobiellen Aktivität des extrazellulären Produkts erlaubt wird, benachbart zu oder auf der Haut oder Schleimhautmembran aufzutreten.
Gefertigter Gegenstand von Anspruch 5, wobei der Gegenstand aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Verband, einem Tampon, einer Damenbinde oder einem Kleidungsstück besteht.
Gegenstand von Anspruch 5, wobei der Schritt des Tragens oder Anheftens von Überstand oder Filtrat einer Kultur eines Bacillus coagulans-Stamms, des besagten extrazellulären Produktes eines Pseudomonas lindbergii-Stamms, eines Antipilzmittels und von Emu-Öl an die Haut oder eine Schleimhautmembran das Wachstum von einer oder mehreren Mikroben inhibiert, die aus der Gruppe gewählt sind, welche umfasst: Staphylococcus-Spezies, Pseudomonas-Spezies, Clostridium-Spezies, Escherichia coli, Proteus-Spezies, Klebsiella-Spezies, Gardnereia vaginalis, Proponbacterium acnes, Aeromonas hydrophia, Candida-Spezies, Trichophyton-Spezies, Aspergillus-Spezies, Acremonium-Spezies, Scopulariopis-Spezies, Herpes simplex I, Herpes simplex II und Herpes zoster.
Zusammensetzung von Anspruch 1, Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, oder Gegenstand von mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, ferner umfassend eine wirksame Menge eines bifidogenen Oligosaccharids.
Zusammensetzung, Verwendung oder Gegenstand von Anspruch 8, wobei das bifidogene Oligosaccharid ein Fructo-Oligosaccharid (FOS) ist.
Zusammensetzung, Verwendung oder Gegenstand von Anspruch 9, wobei das Fructo-Oligosaccharid in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 10 Milligramm bis 1000 Milligramm pro Gramm der Zusammensetzung vorhanden ist.
Zusammensetzung, Verwendung oder Gegenstand von Anspruch 10, wobei das Fructo-Oligosaccharid in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 100 Milligramm bis 500 Milligramm pro Gramm der Zusammensetzung vorhanden ist.
Zusammensetzung von Anspruch 1 oder Gegenstand von Anspruch 5, wobei der Träger aus einer Gruppe gewählt ist, bestehend aus: einer Emulsion, Creme, Lotion, Gel, Öl, Salbe, Suspension, Aerosol-Spray, Pulver, Aerosol-Pulver oder einer halbfesten Formulierung.
Verwendung von Anspruch 2, wobei der Aufbringungsschritt das Aufbringen der Zusammensetzung in der Form von Creme, Lotion, Gel, Öl, Salbe, Suspension, Aerosol-Spray, Pulver, Aerosol-Pulver oder einer halbfesten Formulierung umfasst.
Gegenstand von Anspruch 5, wobei der Schritt des Tragens oder Anheftens des extrazellulären Produktes eines Bacillus coagulans-Stamms, des Überstands oder Filtrats eines Pseudomonas lindbergii-Stamms, des Antipilzmittels und von Emu-Öl an die Haut oder eine Schleimhautmembran das Wachstum von einer oder mehreren Mikroben inhibiert, die aus der Gruppe gewählt sind, welche folgendes umfasst: Staphylococcus-Spezies, Pseudomonas-Spezies, Clostridium-Spezies, Escherichia coli, Proteus-Spezies, Klebsiella-Spezies, Gardnereia vaginalis, Proponbacterium acnes, Aeromonas hydrophia, Candida-Spezies, Trichophyton-Spezies, Aspergillus-Spezies, Acremonium-Spezies, Scopulariopis-Spezies, Herpes simplex I, Herpes simplex II und Herpes zoster.
Verwendung von Anspruch 3, wobei die feste Oberfläche einen flexiblen Gegenstand umfasst, der aus der Gruppe gewählt ist, welche eine Windel, ein geschmeidiges bzw. nachgiebiges Material zum Abwischen der Haut oder einer Schleimhautmembran, ein Hautpflaster, Klebeband, ein absorptionsfähiges Polster, einen Tampon oder ein Kleidungsstück umfasst.
Verwendung von Anspruch 3, wobei der Aufbringungsschritt das Imprägnieren der Zusammensetzung in eine faserartige oder nicht-faserartige feste Matrix umfasst.
Therapeutisches System zum Inhibieren des Wachstums von Bakterien, Hefe, Pilzen, Viren oder einer Kombination davon, umfassend einen Behälter, der ein Etikett und eine Zusammensetzung beinhaltet, welche folgendes umfasst: einen Bacillus coagulans-Überstand, einen Pseudomonas lindbergii-Überstand, ein Antipilzmittel und Emu-Öl, wobei das Etikett Anweisungen zur Verwendung der Zusammensetzung zum Inhibieren des Wachstums umfasst.
Zusammensetzung, umfassend einen Bacillus coagulans-Überstand, einen Pseudomonas lindbergii-Überstand, ein Antipilzmittel und Emu-Öl, für die Verwendung zum Inhibieren des Wachstums von Bakterien, Hefe, Pilzen oder Viren.
Zusammensetzung von Anspruch 1 oder Anspruch 18, Verwendung von mindestens einem der Ansprüche 2 bis 6, Gegenstand von mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7 oder System von Anspruch 17, wobei das Antipilzmittel aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Miconazol-Nitrat, Fluconazol, Tolnaftat, Ketoconazol, Amphotericin B, Carbol-Fuchsin, Ciclopirox, Clotrimazol, Econazol, Haloprogin, Mafenid, Miconazol, Naftifin, Nystatin, Oxiconazol, Silber-Sulfadiazin, Sulconazol, Terbinafin, Tioconazol, Undecylensäure, Butoconazol, Enzianviolett, Terconazol, Griseofulvin, Intraconazol, Lamasil, quaternären Ammoniumchloriden, Phenolen, Iodophoren, Dapson, Flucytosin und Miconazol Kl besteht.
Zusammensetzung von Anspruch 1 oder Anspruch 18, Verwendung von mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, Gegenstand von mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7 oder System von Anspruch 17, wobei das Antipilzmittel aus der Gruppe gewählt ist, welche aus Amphotericin B, Carbol-Fuchsin, Ciclopirox, Clotrimazol, Econazol, Haloprogin, Ketoconazol, Mafenid, Miconazol, Naftifin, Nystatin, Oxiconazol, Silber-Sulfadiazin, Sulconazol, Terbinafin, Tioconazol, Tolnaftat und Undecylensäure besteht.