DE60019147T2

DE60019147T2 - Fibrinolytisch wirksames polypeptid

Info

Publication number: DE60019147T2
Application number: DE60019147T
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas BOONE; Huimin Li; Benjamin Michael MANN
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2020-09-30
Also published as: EP1605049A2; KR100700753B1; US20080058256A1; EA200400290A1; WO2001025445A1; PL355017A1; US20030186422A1; CA2386185A1; HK1049351B; PT1224298E; SK4232002A3; HUP0202650A2; CN100357430C; NZ517951A; NO20021501L; DK1224298T3; MXPA02003126A; US6261820B1; DE60019147D1; BR0014414A

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine fibrinolytisch aktive Metalloproteinase mit einer nicht-natürlich vorkommenden Sequenz, rekombinante Verfahren für ihre Herstellung und ihre Verwendung bei der Behandlung von Thrombose in vivo.
Hintergrund der Erfindung
Die Fibrolase ist ein enzymatisch aktives Polypeptid (genauer gesagt eine Metalloproteinase), die aus 203 Aminosäureresten zusammengesetzt ist, die ursprünglich durch Reinigung aus dem Schlangengift der südlichen Kupferkopfschlange isoliert wurde; Patent der Vereinigten Staaten von Amerika Nr. 4,610,879, erteilt am 9. September 1986 (Markland et al.); und Guan et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 289, Nummer 2, Seiten 197–207 (1991). Das Enzym zeigt eine direkte fibronolytische Aktivität mit geringer oder keiner hämorrhagischen Aktivität und es löst Blutklumpen auf, die entweder aus Fibrinogen oder Vollblut bestehen.
Die Aminosäuresequenz der Fibrolase ist auch bestimmt worden, wobei mit Verfahren für die rekombinante Herstellung in Hefe und die Verwendung bei der Behandlung thromboembolischer Zustände in vivo beschrieben wurden; Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), Seiten 590–600 und die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 323 722 (Valenzuela et al.), am 12. Juli, 1989 publiziert.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt eine fibronolytische Metalloproteinase zur Verfügung, die die nicht-natürlich vorkommende lineare Aminosäureanordnung, die in der SEQ ID Nr.: 1 dargestellt ist, aufweist, hierin auch als „neu wirkendes Thrombolytikum" („NWT") bezeichnet. Auch zur Verfügung gestellt werden Nukleinsäuremoleküle wie das der SEQ ID Nr.: 2 und Varianten davon gemäß NWT.
Der Begriff „reif" wird in seiner üblichen Bedeutung verwendet, um biologisch aktive Polypeptide zu bezeichnen, die in situ in der Wirtszelle enzymatisch bearbeitet worden sind, um sie von der Prä/Pro-Region abzuspalten.
Aufgrund seiner fibronolytischen Aktivität ist NWT in vivo als Blutklumpenauflösungsmittel nützlich, um eine Thrombose in einem Säugetier (die Ratten, Schweine und Menschen umfassen) zu behandeln.
Das NWT-Polypeptid dieser Erfindung stellt gegenüber natürlich auftretenden Fibrolasen Vorteile als therapeutische Mittel zur Verfügung (d.h. dem fibronolytischen Polypeptid, das im Schlangengift gefunden wird). Für die native Fibrolase ist bekannt, daß sie mehrere unterschiedliche N-Termini enthält: QQRFP, EQRFP und ERFP (wobei „E" ein zyklisiertes Glutamin oder eine Pyroglutaminsäure bezeichnet). Genauer gesagt wird das Fibrolasemolekül, das mit einem N-Terminus beginnt, der aus QQRFP zusammengesetzt ist, einen Abbau unterzogen, der zu zwei Iso-Formen führt, die die N-terminalen Sequenzen EQRFP bzw. ERFP aufweisen. Die rekombinante Fibrolase wie sie in der Hefe hergestellt wird, ergibt typischerweise ein Gemisch aller drei dieser Formen und ist daher nicht homogen. Siehe Loayza et al., Journal of Chromatography, B662, Seiten 227–243 (1994). Darüber hinaus führt der zyklisierte Glutaminrest zu einem „blockierten" N-Terminus, der die Sequenzierung unmöglich macht.
Im Gegensatz dazu stellt das rekombinante NWT dieser Erfindung eine einzelne Spezies zur Verfügung: typischerweise wird nur ein N-Terminus hergestellt. Das Ergebnis ist eine im Vergleich zu rekombinanten Fibrolase größere Homogenität des Endprodukts, was vorteilhaft ist, wenn medizinische Anwendungen die beabsichtigte Endverwendung sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt die gesamte Aminosäuresequenz der NWT (SEQ ID Nr.: 3) in linearer Weise dar, bestehend aus der „Prä/Pro"-Region (unterstrichen), die das „Signal"-Peptid und das reife Polypeptid (nicht unterstrichen) umfaßt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das NWT kann durch rekombinante Expression des Nukleinsäuremoleküls der SEQ ID Nr.: 4, die für die vollständige Aminosäuresequenz des NWTs (SEQ ID Nr.: 3) kodiert, umfassend die Prä/Pro-Region von den Nukleotiden 1–738 und das reife Polypeptid von den Nukleotiden 748–1368, in einem geeigneten Wirt erzeugt werden. Nach der Expression wird die Prä/Pro-Region enzymatische in der Wirtszelle abgespalten, um das reife aktive Polypeptid zu ergeben (SEQ ID Nr.: 1).
Vorzugsweise wird das NWT rekombinant in Hefe hergestellt, wie in größerem Detail weiter unten erläutert werden wird.
Das reife Polypeptid (SEQ ID Nr.: 1), das so hergestellt wird, kann ein oder kann kein aminoterminales Methionin aufweisen, abhängig von der Weise, in der es hergestellt wird. Typischerweise wird ein aminoterminaler Methioninrest vorhanden sein, wenn das Polypeptid in einem nicht-sekretierenden bakteriellen Stamm als Wirt, z.B. E. coli hergestellt wird. Neben dem Nukleinsäuremolekül der SEQ ID Nr.: 2 sind auch degenerierte Sequenzen davon verwendbar, die für dasselbe Polypeptid kodieren. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Nukleinsäuremoleküle, die für weitere Aminosäurereste angrenzend an die 5'- oder 3'-Teile der für das reife Polypeptid-kodierenden Regionen kodieren, wie Sequenzen, die anstelle der „nativen" Prä/Pro-Regionen (d.h. die, die in der natürlich vorkommenden Fibrolase gefunden werden) für alternative Prä/Pro-Regionen kodieren (d.h. Sequenzen, die für die Sekretion des Polypeptids durch die Zellmembranen verantwortlich sind). Die weiteren Sequenzen können auch nicht-kodierende Sequenzen sein, die regulatorische Sequenzen wie Promotor der Transkription oder Translation, abhängig von der Wirtszelle umfassen.
Die NWT kann unter Verwendung gut bekannter rekombinanter DNA technologischer Verfahren wie die, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) und/oder Ausubel et al., Herausgeber, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. und Wiley und Sons, New York (1994) dargestellt sind, hergestellt werden. Ein DNA-Molekül, das für das Polypeptid oder trunkierte Versionen davon kodiert, kann beispielsweise durch das Durchsuchen einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Vervielfältigung erhalten werden, um ein Nukleinsäuremolekül zu erhalten, das für Fibrolase kodiert, gefolgt von dem Ersatz des Kodons, der für die N-terminalen Aminosäurereste QQR kodiert durch ein Kodon für Serin (S). Alternativ kann ein DNA-Molekül, das für NWT kodiert, durch chemische Synthese und Verwendung von dem Fachmann wohl bekannten Verfahren wie die, die durch Engels et al. in Angew. Chem. Intl. Ed., Band 28, Seiten 716–734 (1989) beschrieben wurden, hergestellt werden. Typischerweise wird die DNA einer Länge von mehreren 100 Nukleotide aufweisen. Nukleinsäuren mit einer Größe von mehr als etwa 100 Nukleotiden können als mehrere Fragmente unter Verwendung derselben Verfahren synthetisiert werden und die Fragmente können dann zusammen ligiert werden, um eine Nukleotidsequenz der gewünschten Länge zu bilden.
Das DNA-Molekül wird in einem geeigneten Expressionsvektor für die Expression in einem geeigneten Wirt eingeführt. Der Vektor wird ausgewählt, um in der jeweilig verwendeten Wirtszelle zu funktionieren (d.h. der Vektor ist mit der Wirtszellmaschinerie kompatibel, so daß die Expression der DNA stattfinden kann). Das Polypeptid kann in prokaryontischen, Hefe, Insekten (Baculovirus-Systeme) oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden, obwohl Hefe wie im größeren Detail weiter unten beschrieben wird, bevorzugt ist.
Die in einer beliebigen dieser Wirtszellen zur Expression von NWT verwendeten Vektoren, können auch eine 5'-angrenzende Sequenz (auch als ein „Promotor" bezeichnet) und andere expressionsregulatorische Elemente enthalten, die wirksam mit der zu exprimierenden DNA verknüpft sind, sowie (einen) Enhancer, ein Replikationsurpsrungselement, ein transkriptionelles Terminationselement, eine vollständige Intronsequenz, die eine Donor- und Akzeptorsplicestelle enthält, eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosombindungsstellenelement, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinkerregion für das Einfügen der Nukleinsäurekodierenden NWT und ein selektierbares Markierungselement. Jedes dieser Elemente wird unten diskutiert.
Optional kann der Vektor auch eine „Tag"-Sequenz enthalten, d.h. eine Oligonukleotidsequenz, die an dem 5'- oder 3'-Ende der Polypeptid-kodierenden Sequenz angeordnet ist, die für Poly-His (wie ein Hexa-His) oder für eine andere kleine immunogene Sequenz (wie das c-myc oder das Hämaglutinin-Epitop, für das Antikörper, die monoklonale Antikörper umfassen, kommerziell erhältlich sind) kodiert. Dieses Tag wird zusammen mit dem NWT exprimiert werden und kann als Affinitäts-Tag für die Reinigung dieses Polypeptids aus der Wirts zelle dienen und gegebenenfalls kann das Tag anschließend aus dem gereinigten Polypeptid durch verschiedene Mittel beispielsweise durch die Verwendung einer selektiven Peptidase entfernt werden.
Die 5'-angrenzende Sequenz kann die native 5'-angrenzende Sequenz sein oder sie kann homolog sein (d.h. aus derselben Spezies und/oder dem Stamm wie die Wirtszelle), heterolog (d.h. von einer Spezies, die von der Wirtszellenspezies oder dem Stamm verschieden ist), hybrid (d.h. eine Kombination von 5'-flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle) oder synthetisch sein. Die Quelle der 5'-angrenzenden Sequenz kann jeder einzellige prokaryontische oder eukaryontische Organismus, jeder Wirbeltier- oder wirbellose Organismus oder jede Pflanze sein, unter der Voraussetzung, daß die 5'-angrenzende Sequenz in dieser(m) wirksam ist und durch die Wirtszellmaschinerie aktiviert werden kann.
Das Replikationsursprungselement ist typischerweise ein Teil kommerziell erhältlicher prokaryontischer Expressionsvektoren und hilft bei der Vervielfältigung des Vektors in einer Wirtszelle. Die Vervielfältigung des Vektors bis zu einer bestimmten Kopienzahl kann in einigen Fällen für die optimale Expression des NWTs wichtig sein. Wenn der Vektor der Wahl keine Replikationsursprungsstelle enthält, kann eine solche beruhend auf einer bekannten Sequenz chemisch synthetisiert und dann in den Vektor ligiert werden.
Das Transkriptionsterminationselement ist typischerweise 3' vom Ende der Polypeptidkodierenden Sequenz angeordnet und dient der Termination der Transkription der mRNA. Üblicherweise ist das Transkriptionsterminationselement in prokaryontischen Zellen ein G-C-reiches Fragment gefolgt von einer Poly-T-Sequenz. Während dieses Element leicht aus einer Bibliothek kloniert werden kann oder sogar kommerziell als Teil eines Vektors gekauft werden kann, kann es auch ohne weiteres unter Verwendung bekannter Verfahren für die Nukleinsäuresynthese synthetisiert werden.
Ein selektierbares Markergenelement kodiert für ein Protein, das für das Überleben und das Wachstum der Wirtszelle, die in einem selektiven Kulturmedium wachsen gelassen wird, notwendig ist. Typische Selektionsmarkergene kodieren für Proteine, die: (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen beispielsweise Ampizillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryontische Wirtszellen, Zeocin für Hefewirtszellen und Neomycin für Säugetierwirtszellen verleiht; (b) die auxotrophe Mängel der Zelle ergänzen; oder (c) kritische Nährstoffe, die nicht aus komplexen Medien erhältlich sind, zur Verfügung stellen. Bevorzugte selektierbare Marker für die Verwendung in der prokaryontischen Expression sind das Kanamycin-Resistenzgen, das Ampizillin-Resistenzgen und das Tetracyclin-Resistenzgen.
Das Ribosombindungselement, das üblicherweise die Shine-Dalgarno-Sequenz (für Prokaryonten) oder die Kozak-Sequenz (für Eukaryonten) genannte wird, ist für die Initiation der Translation der mRNA notwendig. Das Element ist typischerweise 3' vom Promotor und 5' zu der kodierenden Sequenz des zu synthetisierenden Polypeptids angeordnet. Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist veränderlich ist aber typischerweise ein Polypurin (d.h. besitzt einen hohen A-G-Gehalt). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen sind identifiziert worden, von denen jede unter Verwendung von oben beschriebenen Verfahren synthetisiert werden kann und in prokaryontischen Vektoren verwendet werden kann. Die Kozak-Sequenz umfaßt typischerweise Sequenzen unmittelbar vor und nach dem Initiationskodon. Eine bevorzugte Kozak-Sequenz ist eine, die mit einer hohen Effizienz der Initiation der Translation an dem AUG-Startkodon in Verbindung steht.
In den Fällen, bei denen es für das NWT-Polypeptid wünschenswert ist, aus der Wirtszelle sekretiert zu werden, kann eine Signalsequenz verwendet werden, um das Polypeptid aus der Wirtszelle, in der es synthetisiert wurde, herauszuleiten. Typischerweise wird die Signalsequenz in der kodierenden Region der Nukleinsäuresequenz plaziert oder direkt an dem 5'-Ende der kodierenden Region. Viele Signalsequenzen sind identifiziert worden und jede dieser, die in der ausgewählten Wirtszelle wirksam ist, kann hier verwendet werden. Dementsprechend kann die Signalsequenz homolog oder heterolog zu dem Polypeptid sein. Zusätzlich kann die Signalsequenz unter Verwendung der oben in Bezug genommenen Verfahren chemisch synthetisiert werden.
Nachdem der Vektor konstruiert worden ist und eine Nukleinsäure an der richtigen Stelle des Vektors eingefügt worden ist, kann der vervollständigte Vektor in eine geeignete Wirtszelle für die Vervielfältigung und/oder Polypeptidexpression eingeführt werden.
Wie erwähnt können die Wirtszellen prokaryontisch (wie E. coli) oder eukaryontische (wie eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Wirbeltierzelle) sein. Die Wirtszelle, ob sie eine Hefe oder ein anderer Wirt ist, kann wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, NWT synthetisieren, das anschließend aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium sekretiert) oder direkt aus der Wirtszelle, die es produziert (wenn es nicht sekretiert wird) gewonnen werden kann. Nach der Gewinnung kann das NWT-Polypeptid unter Verwendung von Verfahren, wie der Molekularsieb-Chromatographie, der Affintiätschromatographie und ähnlichen gereinigt werden.
Die Auswahl der Wirtszelle wird im großen Maße davon abhängen, in welcher Weise die Wirtszelle dazu in der Lage ist, das NWT in seine native Sekundär- und Tertiärstruktur zu „falten" (z.B. richtige Orientierung der Disulfidbrücken etc.), so daß durch die Zelle biologisch aktives Material hergestellt wird. Selbst wenn die Wirtszelle nicht biologisch aktives Material herstellt, kann es jedoch nach der Synthese unter Verwendung geeigneter chemischer Bedingungen wie die, die dem Fachmann bekannt sind, „gefaltet" werden. In jedem Fall kann die richtige Faltung aus der Tatsache abgeleitet werden, daß biologisch aktives Material erhalten worden ist.
Geeignete Wirtszellen oder Zellinien können Säugetierzellen wie die chinesischen Hamsterovarialzellen (CHO) oder 3T3-Zellen sein. Die Selektion geeigneter Säugetierwirtszellen im Verfahren für die Transformation, die Kultivierung, die Vervielfältigung, das Durchsuchen und die Produktherstellung und die Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Andere geeignete Säugetierzellinien sind die Affen-COS-1- und COS-7-Zellinien und die CV-1-Zellinie. Weitere Beispiele von Säugetierwirtszellen umfassen Primatenzellinien und Nagetierzellinien, umfassend transformierte Zellinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus der in vitro-Kultur von Primärgewebe abgeleitet sind, sowie primäre Explantate sind auch geeignet. Kandidatenzellen können für das Selektionsgen genotypisch defizient sein oder können ein dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Weitere geeignete Säugetierzellinien umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf HeLa, Mäuse-L-929-Zellen, 3T3-Zellinien, die aus Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen abgeleitet sind, BHK- oder HaK-Hamsterzellinien.
Als Wirtszellen auch nützlich sind bakterielle Zellen. Beispielsweise sind die verschiedenen E. coli-Stämme (z.B. HB101, DHSa, DH10 und Mc1061) als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas Spezies, anderen Bacillus Spezies, Streptomyces Spezies, und ähnliche können auch verwendet werden. Zusätzlich sind viele dem Fachmann bekannte Hefezellstämme auch als Wirtszelle für die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erhältlich. Auch können, wo ge wünscht, Insektenzellen als Wirtszellen verwendet werden. Siehe beispielsweise Miller et al., Genetic Engineering, Ausgabe 8, Seiten 277–298 (1986).
Die Einführung (auch als „Transformation" oder „Transfektion" bezeichnet) des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter Verwendung von Verfahren wie dem Kalziumphosphat-, dem Elektroporations-, dem Mikroinjektions-, dem Lipofektions- oder dem DEAE-Dextran-Verfahren erreicht werden. Das ausgewählte Verfahren wird zum Teil vom Typ der zu verwendenden Wirtszelle abhängen. Dieses Verfahren und andere geeignete Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und sind beispielsweise in Sambrook et al. (siehe oben) dargestellt.
Die Wirtszellen, die den Vektor enthalten, können unter Verwendung von Standardmedien, die dam Fachmann gut bekannt sind, kultiviert werden. Die Medien werden im allgemeinen Nährstoffe enthalten, die für das Wachstum und das Überleben der Zellen notwendig sind. Die geeigneten Medien für die Kultivierung von E. coli-Zellen sind beispielsweise Luria Brühe (LB) und/oder Terrific Brühe (TB). Geeignete Medien für die Kultivierung eurkaryontischer Zellen sind RPMI1640, MEM, DMEM, die alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren, wie durch die jeweils kultivierte Zellinie erforderlich ergänzt werden können. Ein geeignetes Medium für Insektenkulturen ist Grace's-Medium ergänzt wie erforderlich durch Yeastolat, Lactabluminhydrolysat und/oder fötales Kälberserum.
Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die für das selektive Wachstum der transformierten Zellen nützlich ist, nur als Zusatzstoff zu dem Medium hinzugefügt. Die zu verwendende Verbindung wird durch das selektierbare Markerelement, das auf dem Plasmid vorhanden ist, mit dem die Wirtszelle transformiert wurde, bestimmt. Beispielsweise wird die zu dem Kulturmedium hinzugefügte Verbindung wenn das selektierbare Markerelement eine Kanamycinresistenz ist, Kanamycin sein.
Die Menge des in der Wirtszelle hergestellten NWTs kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren bewertet werden. Solche Verfahren umfassen ohne Beschränkung die Western Blot-Analyse, die SDS-Plyacrylamidgelelektrophorese, die nicht-denaturierende Gelelektrophorese, die HPLC-Auftrennung, die Immunpräzipitation und/oder Aktivitätstests wie DNA-Bindungsgelverschiebungstests.
Wenn NWT aus anderen Wirtszellen als Gram-negativen Bakterien sekretiert wird, wird der Hauptteil wahrscheinlich im Zellkulturmedium gefunden werden. Wenn das NWT von Gram-negativen Bakterien sekretiert wird, wird es in einem gewissen Maße im Periplasma gefunden werden. Wenn das NWT nicht sekretiert wird, wird es im Zytoplasma vorhanden sein.
Für das intrazelluläre NWT werden die Wirtszellen üblicherweise zuerst mechanisch zerstört. Für das NWT, das einen periplasmischen Aufenthaltsort besitzt, kann entweder die mechanische Zerstörung oder die osmotische Behandlung verwendet werden, um dem periplasmischen Inhalt in einer gepufferten Lösung freizusetzen. Das NWT-Polypeptid wird dann aus dieser Lösung isoliert. Die Reinigung aus einer Lösung kann danach unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren erreicht werden. Wenn das NWT synthetisiert worden ist, so daß es ein Tag wie ein Hexahistidin oder ein anderes kleines Peptid entweder an seinem Carboxyl- oder Aminoterminus enthält, kann es im wesentlichen in einem Einschrittverfahren durch das Überleiten der Lösung über eine Affinitätssäule, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für das Tag oder direkt für das Polypeptid aufweist (d.h. ein monoklonaler Antikörper) gereinigt werden. Beispielsweise bindet Polyhistidin mit großer Affinität und Spezifität an Nickel, so daß eine Nickelaffinitätssäule (sowie die Quiagen-Nickelsäulen) für die Reinigung verwendet werden kann. (Siehe, beispielsweise, Ausubel et al., Herausgeber, Current Protocols in Molecular Biology, siehe oben.)
Wenn auf der anderen Seite das Polypeptid kein Tag hat und keine Antikörper verfügbar sind, können andere gut bekannte Verfahren für die Reinigung verwendet werden. Solche Verfahren umfassen, ohne Beschränkung, die Ionenaustauchchromatographie, die Molekularsiebchromatographie, die umgekehrte-Phasenchromatography, die HPLC, die native Gelelektrophorese in Zusammenhang mit der Gelelution und die präparative isoelektrische Fokusierung („Isoprime" Machine/Technik, Hoefer Scientific). In einigen Fällen können zwei oder mehr dieser Techniken verbunden werden, um eine verbesserte Reinheit zu erreichen.
Besonders für die Verwendung bei der Herstellung von NWT bevorzugt sind Hefezellen und am meisten vorteilhaft die vom Hefegenus, die als Pichia bekannt sind (z.B. Pichia pastoris), aufgrund der großen Effizienz der Faltung im Vergleich zu beispielsweise baktieriellen Zellen wie E. coli. Geeignete rekombinante Verfahren der Expression für diesen Hefestamm sind im Patent der Vereinigten Staaten Nr. 4,855,231 (Stroman et al.), 4,812,405 (Lair et al.), 4,818,700 (Cregg et al.), 4,885,242 (Cregg) und 4,837,148 (Cregg) beschrieben.
Bemerkenswerterweise können Pichiazellen auch verwendet werden, um Fibrolase mit gleicher Effizienz von DNA-Molekülen zu exprimieren, die für diese Metalloproteinase kodieren und solch ein Verfahren stellt einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Die Fibrolase ist eine bekannte Metalloproteinase, die in der wissenschaftlichen und in der Patentliteratur beschrieben worden ist; siehe Randolph et al., und die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 323 722, die oben zitiert wurde. Typischerweise wird die zu exprimierende Fibrolase die mit der SEQ ID Nr.: 5 sein, die durch das cDNA-Molekül der SEQ ID Nr.: 6 kodiert wird (oder Varianten davon, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren). Die Expression der Fibrolase in einem solchen System wird typischerweise ein DNA-Molekül der SEQ ID Nr.: 7 beinhalten, die für eine „Prä/Pro"-Sequenz (Nukleotide 1–783) zusätzlich zu dem „reifen" Polypeptid (Nukleotide 784–1392) kodieren.
Chemisch modifizierte Versionen des NWTs, in denen das Polypeptid mit einem Polymer oder einem anderen Molekül verknüpft ist, um ein Derivat zu bilden, um die Eigenschaften zu modifizieren, werden auch vom Umfang der vorliegenden Erfindung erfaßt. Insbesondere für menschliche therapeutische Zwecke kann es vorteilhaft sein, daß NWT in einer solchen Weise durch die Anheftung von einem oder mehreren anderen chemischen Resten an den Polypeptidrest zu derivatisieren. Solche chemischen Reste können aus einer Vielzahl wasserlöslicher Polymere ausgewählt sein. Das Polymer sollte wasserlöslich sein, so daß das NWT-Polypeptid, an dem es befestigt ist, in einer wäßrigen Umgebung wie in einer physiologischen Umgebung mischbar ist. Das wasserlösliche Polymer kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus beispielsweise Polyethylenglykol, Copolymeren des Ethlylenglycols/Propylenglycols, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinanhydridcopolymer, Polyaminosäuren (entweder homopolymere oder Zufalls- oder Nicht-Zufallscopolymere (siehe weiter unten im Hinblick auf Fusionsmoleküle) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrolidon)polyethylenglycol, Propylenglycolhomopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxidcopolymere, polyoxyethylierte Polyole, Polystyrenmaleat und Polyvinylalkohol. Das Polyethylenglycolpropionaldehyd kann bei der Herstellung aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile haben.
Das Polymer kann jedes Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglycol liegt das bevorzugte Molekulargewicht zwischen etwa 2 Kilodal ton (kDa) und etwa 100 kDa (der Begriff „ungefähr" deutet daraufhin, daß in Zubereitungen des Polyethylenglycols einige Moleküle ein größeres einige ein kleineres als das genannte Molekulargewicht aufweisen) für eine einfache Handhabung und Herstellung. Abhängig von dem gewünschten therapeutischen Profil (z.B. der Dauer der gewünschten andauernden Freisetzung, der Wirkungen, wenn überhaupt auf die biologische Aktivität, der Einfachheit der Handhabung, dem Grad oder dem Fehlen der Antigenität und anderer bekannter Wirkungen des Polyethylenglycols auf ein therapeutisches Protein) können andere Größen verwendet werden.
Die Zahl der so befestigten Polymermoleküle kann variieren und ein Fachmann wird dazu in der Lage sein, die Wirkung auf die Funktion zu ermitteln. Man kann monoderivatisieren oder mit demselben oder mit verschiedenen chemischen Resten (z.B. Polymeren wie Polyethelenglycol mit verschiedenen Gewichten) eine Di-, Tri-, Tetra- oder eine Kombinationsderivatisierung zur Verfügung stellen. Der Anteil der Polymermoleküle zu den NWT-Polypeptidmolekülen wird variieren, wie auch ihre Konzentrationen in dem Reaktionsgemisch. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (im Hinblick auf die Effizienz der Reaktion, so daß kein unreagierter Polypeptid- oder Polymerüberschuß vorhanden ist) durch Faktoren, wie den gewünschten Grad der Derivatisierung (z.B. mono-, di-, tri-, etc.), das Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist und die Reaktionsbedingungen bestimmt werden.
Die chemischen Reste sollten unter Berücksichtigung von Wirkungen auf die funktionellen oder antigenen Domänen des Polypeptids am NWT befestigt werden. Es gibt für den Fachmann eine Anzahl von verfügbaren Befestigungsverfahren. Siehe Beispielsweise EP 0 401 384 (Kopplung von PEG and G-CSF) und Malik et al., Experimental Hematology, Band 20, Seiten 1028–1035 (1992) (das über die Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid berichtet). Lediglich als Beispiel kann Polyethylenglycol durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe, wie eine freie Amino- oder Carboxylgruppe, kovalent gebunden werden. Reaktive Gruppen sind die, an die ein aktiviertes Polyethylenglycolmolekül (oder ein anderer chemischer Rest) gebunden werden kann. Die Aminosäurereste, die eine freie Aminosäuregruppe aufweisen, können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest umfassen. Die, die eine freie Carboxylgruppe aufweisen, können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest umfassen. Sulfhydrylgruppen können auch als eine reaktive Gruppe für die Befestigung des (der) Polyethylenglycolmoleküls(e) oder anderer chemischer Reste verwendet werden. Für den Zweck der Herstellung ist die Befestigung an einer Aminogruppe, wie dem N-Terminus, oder einer Lysingruppe bevorzugt. Die Befestigung an Resten, die für die Rezeptorbindung wichtig sind, sollte vermieden werden, wenn die Rezeptorbindung gewünscht wird.
Man kann insbesondere N-terminal chemisch modifizierte Derivate wünschen. Unter Verwendung von Polyethylenglycol als Beispiel kann man aus einer Vielzahl von Polyethylenglycolmolekülen (nach Molekulargewicht, Verzweigung, etc.), dem Verhältnis der Polyethylenglycolmoleküle zu Polypeptidmolekülen im Reaktionsgemisch, der Sorte der Pegylierungsreaktion, die durchgeführt werden soll und dem Verfahren des Erhaltens des ausgewählten N-terminal pegylierten NWTs auswählen. Das Verfahren des Erhaltens der N-terminal pegylierten Zubereitung (d.h., wenn notwendig das Abtrennen dieses Restes von anderen mono-pegylierten Resten) kann durch Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Mischung pegylierter NWT-Molekülen erfolgen. Die selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch die reduktive Alkylierung erreicht werden, die die unterschiedliche Reaktivität verschiedener Sorten primärer Aminosäuren (Lysin versus N-terminal), die für die Derivatisierung zur Verfügung stehen, ausnutzt. Siehe PCT-Anmeldung WO 96/11953, publiziert am 25. April 1996. Unter geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des NWTs am N-Terminus mit einem eine Carbonylgruppe enthaltendem Polymer erreicht. Man kann beispielsweise NWT durch das Durchführen der Reaktion bei einem pH, der es einem erlaubt einen Vorteil aus dem pK_a Unterschieden zwischen der ε-Aminogruppe der Lysinreste und der α-Aminogruppe des N-terminalen Rests des Polypeptids zu ziehen, selektiv N-terminal pegylieren. Durch eine solche selektive Derivatisierung wird die Befestigung eines Polymers an einem Polypeptid kontrolliert: Die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich am N-Terminus des Polypeptids statt und keine bedeutende Modifikation anderer reaktiver Gruppen wie Lysinseitenaminosäuregruppen findet statt. Unter Verwendung der reduktiven Alkylierung kann das Polymer vom oben beschriebenen Typ sein und sollte für die Kopplung an das Polypeptid einen einzelnen reaktiven Aldehyd aufweisen. Der Polyethylenglycolpropionaldehyd, der einen einzelnen reaktiven Aldehyd enthält, kann verwendet werden.
NWT oder in Übereinstimmung mit der Erfindung chemisch modifizierte Derivate können für die in vivo-Verabreichung und am meisten bevorzugt für die Intrathrombusverabreichung (d.h. über die Orts-spezifische Verabreichung direkt an die Stelle des Klumpens im Blutgefäß z.B. durch einen Katheter) formuliert werden. Die systemische Verabreichung ist normalerweise aufgrund der Wahrscheinlichkeit, daß körpereigenes α2-Makroglobulin im allgemeinen Blutkreislauf mit NWT komplexieren kann, um die Interaktion mit Fibrin oder Fibrinogen zu verhindern, wodurch die Blutklumpenauflösung behindert wird, bevorzugt. Es kann jedoch Fälle geben, bei denen größere Mengen des NWTs verwendet werden können, die die zirkulierenden Mengen des α2-Makroglobulins übertreffen, wodurch die systemische Verabreichung und Anlieferung ermöglicht wird, nicht bevorzugt. Im allgemeinen sind von der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen umfaßt, die wirksame Mengen des NWTs zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvanzien und/oder Trägern umfassen. Mit „wirksamer Menge" ist eine Menge gemeint, die ausreichend ist, um eine meßbare biologische Wirkung hervorzurufen (d.h. eine thrombolytisch wirksame Menge, die die Lyse des (der) behandelten Blutklumpens oder -klumpen beeinflußt).
Typischerweise wird das NWT in hochgereinigter Form vorliegen und eine beliebige pharmazeutische Zusammensetzung, die als Verabreichungsvehikel verwendet wird, wird normalerweise für die Verwendung durch Filtration über Sterilfiltrationsmembranen vorsterilisiert sein.
Ein Fachmann wird dazu in der Lage sein, wirksame Dosierungen durch die Verabreichung und Beobachtung der gewünschten therapeutischen Wirkung festzulegen. Besonders wirksame Dosen innerhalb dieses Bereiches werden von der jeweils behandelten Erkrankung oder dem Zustand sowie vom Alter und der allgemeinen Gesundheit des Empfängers abhängen und können durch klinische Standardverfahren bestimmt werden. Wo möglich wird es wünschenswert sein vor dem in vivo-Testen in Menschen die Dosis-Antwort-Kurve der pharmazeutischen Zusammensetzung zuerst in vitro wie in einem Bioassaytestsystem und dann in nützlichen Tiermodellsystemen zu bestimmen. Der Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, der Art der Erkrankung, die behandelt wird, und anderen anwendbaren Faktoren dazu in der Lage sein, die richtige Dosierung ohne einen unangemessenen Aufwand festzulegen. Typischerweise wird der Fachmann die NWT-Zusammensetzung verabreichen, bis eine Dosierung erreicht ist, die die gewünschte Wirkung erreicht (d.h. Auflösung des Blutklumpens). Die Zusammensetzung kann als eine einzelne Dosis oder als zwei oder mehr Dosen (die dieselbe Menge des Polypeptids enthalten können oder nicht enthalten können) über einen Zeitraum oder beständig verabreicht werden.
Das NWT kann auch verwendet werden, um Antikörper in Übereinstimmung mit Standardverfahren zu erzeugen. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimär, einzelkettig und/oder dispezifisch etc. sein. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, eine Immunantwort zu erzeugen, kann die Aminosäuresequenz des NWTs analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die mit einer erhöhten Immunogenität in Verbindung stehen können. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz einer Computeranalyse unterzogen werden, um in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Hope und Woods, Proceedings of the National Academy of Science USA, Band 78, Seiten 3814–3828 (1981) Oberflächenepitope zu identifizieren.
Verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Herstellung polyklonaler Antikörper, die Epitope des NWTs erkennen, verwendet werden. Für die Herstellung des Antikörpers können verschiedene Wirtstiere, umfassend aber nicht eingeschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. durch die Injektion des Polypeptids immunisiert werden. Verschiedene Adjuvanzien umfassend aber nicht eingeschränkt auf Freund's, mineralische Gele, wie Aluminiumhydroxid (Alum), Oberflächen-aktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssellochnapfschneckenhämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise nützliche menschliche Adjuvanzien wie Bacille Calmette-Guerin und Corynebacterium parvum können verwendet werden, um abhängig von der Wirtsspezies die immunologische Antwort zu erhöhen.
Für die Zubereitung monoklonaler Antikörper, die gegen das NWT gerichtet sind, kann jedes Verfahren, das die Erzeugung von Antikörpermolekülen aus beständigen Zellinien in Kultur zur Verfügung stellt, verwendet werden. Beispielsweise sind die Hybridomtechnik, die ursprünglich durch Kohler und Milstein entwickelt wurde, die in Nature, Band 256, Seiten 495–497 (1975) beschrieben wurde, sowie das Triomaverfahren, das menschliche B-Zellhybridomverfahren, das durch Kozbor et al. in Immunology Today, Band 4, Seite 72 (1983) beschrieben wurde und das EBV-Hybridomverfahren, um monoklonale Antikörper herzustellen, das durch Cole et al. in „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96 (1985) beschrieben wurde, alle für die Herstellung monoklonaler Antikörper in Übereinstimmung mit dieser Erfindung nützlich.
Die Antikörper dieser Erfindung können therapeutisch verwendet werden, um an überflüssige Mengen des NWTs in vivo nach der Verabreichung zu binden und dadurch diese zu neutralisieren oder zu inhibieren. Die Antikörper können des weiteren für diagnostische Zwecke wie in markierter Form verwendet werden, um die Gegenwart des NWTs in einer Körperflüssigkeit, einer Gewebeprobe oder einem anderen Extrakt in Übereinstimmung mit bekannten diagnostischen Verfahren nachzuweisen.
Beschreibung spezifischer Ausführungsformen
Die Erfindung wird des weiteren durch die folgenden Beispiele verdeutlicht.
Beispiel 1
Derivatisierung der NWT-Sequenz
Eine effiziente Weise um Fibrolase herzustellen, liegt darin, sie anfänglich als Prä/Pro-Fibrolase zu exprimieren, wobei die Spaltung durch die Protease kex-2 an der Verbindung der „Prä/Pro" und der „reifen" Regionen auftritt, um biologisch aktives Material („reife" Fibrolase) zu ergeben. Von dieser Anordnung ausgehend, führt die Synthese und Bearbeitung der Prä/Pro-Fibrolase zur Sekretierung der reifen Fibrolase in das Kulturmedium. Die tatsächliche Sequenz an der gespaltenen Verbindung ist (...TKR↓QQRF...).
Kex-2 ist eine Endoprotease, die nach zwei aneinandergrenzenden basischen Aminosäuren, in diesem Fall Lysin (K)-Arginin (R) spaltet. Die reife Fibrolase, die von DNA exprimiert wird, die die oben erwähnte Sequenz aufweist, offenbarte, daß der erwartete N-terminale Glutaminrest (Q) tatsächlich einer Deaminierung und Zyklisierung unterzogen worden war, so daß Pyroglutaminsäure (E) erzeugt wurde. Diese chemische Modifikation wurde als nicht-wünschenswert erachtet, da Peptide mit einem N-terminal zyklisierten Glutaminrest (Pyroglutaminsäure) nicht dazu in der Lage sind, in dem Edman-Abbauverfahren für die Aminosäuresequenzierung zu reagieren. Dementsprechend wurden beide Glutaminreste (Q) am N-Terminus der Sequenz der reifen Fibrolase entfernt, was zu einem N-terminalen Argininrest (R) führte. Da kex-2 angrenzende basische Aminosäuren spaltet, wurde angenommen, daß die Sequenz (...KRRF...) eine mehrdeutige Stelle für die kex-2-Spaltung darstellen würde. Dementsprechend wurde der N-terminale Argininrest (R) (oben unterstrichen gezeigt) durch einen Serinrest (S) ersetzt, um die Sequenz (...KRSF...) zu ergeben. Die Auswahl von Serin beruh te auf der Notwendigkeit, eine Aminosäure einzuführen, die die kex-2-Spaltung ermöglicht, wenn sie an der C-terminalen Seite der Hydrolysestelle auftritt. Rholam et al., European Journal of Biochemistry, Band 227, Seiten 707–714 (1995).
Im Ergebnis wurde die DNA-Sequenz für die Prä/Pro-Fibrolase durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung eines Standard-PCR-Protokolls in der N-terminalen kodierenden Region für die reife Fibrolase modifiziert, um die Kodons für „QQR" durch ein Kodon für „S" zu ersetzten, was zu einem Prä/Pro-NAT führte, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 3 aufwies. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die PCR-Reaktion zu initiieren, sind unten wiedergegeben und ihre Homologie mit der Zielsequenz ist auch gezeigt. Anfänglich wurden zwei PCR-Reaktionen unter Verwendung der Oligos 1 und 4 als ein Primerpaar und der Oligos 2 und 3 als ein weiteres Primerpaar, beide mit der DNA des Ausgangsgens als Vorlage ausgeführt. Die DNA-Produkte dieser zwei Reaktionen (mit einer Länge von 601 und 815 Nukleotiden) wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und zusammengenommen, um als Vorlage bei einer zweiten PCR-Runde unter Verwendung der Oligos 1 und 2 als Primerpaar zu dienen. Dieses endgültige PCR-Produkt (mit einer Länge von 1372) Nukleotiden wurde mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und NotI gespalten. Der Verdau wurde mit Phenol/Chloroform deproteiniert und die DNA präzipitiert. Ein Teil der wiedergewonnen DNA wurde in das Plasmid pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA, Katalog Nr. VI95-20) ligiert, das gleichermaßen mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und NotI gespalten, enzymatisch dephosphoryliert und mit Phenol/Chloroform deproteiniert worden war. Alle anschließenden Schritte wurden gemäß dem Invitrogen Pichia Expression Kit Handbuch (Invitrogen Corp., Katalog Nr. K1710-01) ausgeführt. Die Ligationsreaktionsprodukte wurden in E. coli durch Elektroporation transformiert und nach Überleben auf Zeocin-enthaltendem festem Medium selektioniert. Das Plasmid wurde isoliert und die Pro-Fibrolaseregion wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid wurde durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PmeI linearisiert und dann im Pichia pastoris GS115his⁺ transformiert. Der GS 115-Stamm ist normalerweise his^–, so daß der his⁺-Genotyp durch Transformation mit einer DNA-Quelle, die die Wildtypversion des his4-Gens trägt, wieder hergestellt wurde. Alternativ kann ein his⁺-Stamm kommerziell von der Invitrogen Corp. (X-33 Zellinie, Katalog Nr. C180-00) erhalten werden. Die Integranten wurden als Zeocin-resistente Kolonien selektiert. Die Klonierungskandidaten wurden in Methanol-enthaltendem Medium induziert und das Wachstumsmedium wurde auf NWT-Produktion auf 4–20% PAGE, unter Verwendung von Coomassie-Färbung getestet.
Die für die Orts-gerichtete PCR-Mutagenese verwendeten Oligonukleotide waren wie folgt:
Oligo 1 5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3' (SEQ ID Nr: 8)
Oligo 2 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3' (SEQ ID Nr: 9)
Oligo 3 (SEQ ID Nr: 10)
5'-TCCAATTAAACTTGACTAAGAGATCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3'
Oligo 4 (SEQ ID Nr: 11)
5'-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3'
Die Anordnung dieser Oligonukleotide wird unten im Verhältnis zur doppelstängigen DNA-Sequenz (SEQ ID Nr.: 12 kodierender oder sense-Strang; SEQ ID Nr.: 13 komplementärer oder anti-sense-Strang) und der entsprechenden Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 14) der Fibrolase (umfassend die Prä/Pro-Region), die modifiziert wurde, um NWT zu erzeugen, gezeigt. Die N-terminalen und C-terminalen Bereiche der reifen Fibrolase sind durch Unterstreichung der terminalen Aminosäuresequenz (QQRF und LNKP) angezeigt. Die N-terminale Region (QQRF) ist die, die modifiziert wird (um QQR durch S zu ersetzen). Für die Oligos 3 und 4 sind unten gestrichelte Linien eingefügt, um den Ort der weggelassenen Kodons, die für die Reste QQ im N-terminalen Bereich der Fibrolase kodieren, anzuzeigen.
Beispiel 2
Expression des NWTs in Pichia pastoris
Wenn Versuche gemacht wurden, die DNA für NWT in E. coli zu exprimieren, verringerte eine sehr schlechte Faltung und ein Erfordernis für verdünnte Bedingungen die Reinigungseffizienz. Diese und andere Überlegungen führten uns zu der Verwendung von Pichia pastoris, einer Hefespezies, als Wirtszelle. Eine Kultur ausgewählter Klone der Pichia pastoris, die mit Prä/Pro-NWT-cDNA (SEQ ID Nr.: 4) transfiziert worden war, wurde in 500 ml des folgenden Animpfungswachstumsmedium angeimpft: Pro Liter einer Mediumcharge

Hefeextrakt 30,0 g

Kaliumphosphat, zweibasisch 17,2 g

Glukose 20,0 g

Biotin 0,004 g

Wasser bis auf 1 Liter

Phosphorsäure, 85% um den pH auf 6,00 anzupassen
Die transfizierten P. pastoris-Zellen wurden bei 30°C in einem Schüttler für etwa 30 bis 32 Stunden inkubiert. Ungefähr 1 % (w/v) der sich ergebenden Kultur wurde verwendet, um einen 10 Liter Fermenter anzuimpfen. Der Fermenter enthielt sterilisierte Grundsalze und Glukose (siehe unten). Zwölf Milliliter pro Liter PTM4-Salze (PTM4 ist eine Spurenmetallösung, die Kupfersulfatpentahydrat, Natriumiodid, Mangansulfatmonohydrat, Natriummolybdatdihydrat, Borsäure, Cobaltchloridhexahydrat, Zinkchlorid, Eisensulfatheptahydrat, d-Biotin, Schwefelsäure und gereinigtes Wasser enthält) wurden pro Liter Mediumcharge nach der Fermentersterilisation hinzugefügt. Die Fermentationswachstumstemperatur betrug 30°C. Der Fermenter-pH wurde mit Ammoniumhydroxid und Phosphorsäure bei einem pH von 6,0 kontrolliert. Zink aus den Zinksalzen, die zu dem Medium zugefügt wurden, werden in das NWT als Teil der Metalloproteinasestruktur aufgenommen. Grundlegende Salze pro Liter Mediumcharge

Phosphorsäure, 85% 26,7 ml

Kalziumsulfat 0,93 g

Kaliumsulfat 18,2 g

Magnesiumsulfat-7 H₂O 14,9 g

Kaliumhydroxid 4,13 g

Glukose 30,0 g

Wasser auf 1 Liter
Die Kulturcharge wurde wachsen gelassen bis die Glukose vollständig aufgebraucht war (17 bis 20 Stunden). Dann wurde eine Fütterungschargenphase initiiert. Das Fütterungschargenphasemedium bestand aus Glukose und 12 ml der PTM4-Salze pro Liter. Die Induktion der Zuführung bestand aus Glukose, 25% Methanol und 12 ml PTM4-Salzen pro Liter. Bei der Induktion wurde die Temperatur des Reaktors auf 20°C geändert. Die Induktionsphase dauerte für 60 bis 75 Stunden an. Das vorbereitete Medium wurde geerntet und die zellulären Bruchstücke wurden verworfen.
Beispiel 3
Reinigung des NWTs aus Pichia pastoris
Die Hefebrühe (vorbereitetes Medium ohne zelluläre Bruchstücke) aus Beispiel 2 wurde gereinigt und der pH und die Leitfähigkeit wurden auf 6,5 bzw. 10–20 mS/cm eingestellt. Die Brühe wurde auf ein immobilisiertes Metallaffinitätsharz, das mit Kupfer (Cu) beladen und mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) äquilibriert worden war, geladen. Das Harz wurde mit PBS gewaschen und mit einem Imidazolgradienten (0–100 mM) in PBS eluiert. Fraktionen, die „reifes" NWT (SEQ ID Nr.: 1) enthielten, wurden zusammengenommen und verdünnt bis die Leitfähigkeit weniger als 1,5 mS/cm, pH 6,4, betrug. Der verdünnte Pool wurde auf ein SP-Sepharoseharz (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) geladen, das mit 10 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit MES gewaschen und mit einem NaCl-Gradienten (0–500 mM) in MES eluiert. Fraktionen, die NWT enthielten, wurden zusammengenommen und gelagert.
Beispiel 4
Thrombolyse in der akuten Thrombose der Rattenhalsschlagader; Vergleich von NWT mit Urokinase
Um zu zeigen, daß „reifes" NWT (SEQ ID Nr.: 1) biologisch aktiv ist und funktionell besonders, wurden akute pharmakologische Studien in Ratten durchgeführt, bei denen eine fokale Verletzung in einer der Halsschlagadern durch das Anlegen eines Anodenstroms erzeugt wurde. Die Verletzung erzeugt verschließende Thromben, die sich im allgemeinen innerhalb von 15 Minuten bilden. Sobald der Thrombus gebildet war, wurde die Arterie für einen Zeitraum von 30 Minuten beobachtet, um sicherzustellen, daß der Verschluß der Halsschlagader stabil war. Dann wurden Heparin und Aspirin intravenös verabreicht, um die weitere Ausbreitung des Thrombus zu verhindern. Die Tiere wurden dann mit einer intraarteriellen Infusion des Testmaterials behandelt. Der Blutfluß durch die Halsschlagader wurde während der Verabreichung des Testmaterials überwacht, so daß die erfolgreiche Blutklumpenauflösung nachgewiesen werden konnte und die Zeit, in der die Blutklumpenauflösung auftrat vermerkt werden konnte. Der Prozentsatz der Experimente, bei denen die Blutklumpenauflösung auftrat, wurde vermerkt und ein Durchschnitt der Gruppe wurde nur für die Experimente berechnet, bei denen die Blutklumpenauflösung erfolgreich war. Als ein Maß des Potentials des Testmaterials eine Hämorrhage auszulösen, wurde alles Blut, das von der chirurgischen Stelle abgegeben wurde, mit Gazetupfern aufgesammelt. Die Tupfer wurden in Detergenzlösung eingebracht, um rote Blutzellen aufzulösen und Hämoglobin freizusetzen, das dann spektrophotometrisch quantifiziert wurde. Das abgegebene Hämoglobin wurde verwendet, um das Volumen des Blutverlustes zu berechnen. Die Testdaten werden in der Tabelle unten wiedergegeben.
Tabelle 1 Auftreten der Blutklumpenauflösung, Zeit bis zur Blutklumpenauflösung und chirurgischer Blutverlust (Durchschnitt ± 1 Standardabw.)
Diese Studien zeigen, daß NWT in einem Tiermodell für die in vivo-Blutklumpenauflösung biologisch aktiv ist. Des weiteren, wurde die Blutklumpenauflösung in einer deutlich verringerten Zeit und mit einem geringeren Blutverlust aus der chirurgischen Stelle im Vergleich zu Urokinase erreicht. So kann das Aktivitätsprofil des NWTs von der plasminogenen Aktivatorklasse der thrombolytischen Mittel (die durch Urokinase repräsentiert werden) dadurch unterschieden werden, daß die Blutklumpenauflösung mit NWT schneller und mit verringerten hämorrhagischen Komplikationen auftritt.
Die fibronolytische Aktivität des NWTs ist mit der der Fibrolase vergleichbar. Zusätzlich führt, wie oben erwähnt, die Stabilität des N-Terminus des NWTs nach der rekombinanten Expression zu einem homogeneren Endprodukt, was einen eindeutigen Vorteil darstellt (d.h. der N-Terminus wird sich über die Zeit nicht verändern, was zu einem Gemisch verschiedener Formen führt, wodurch das Polypeptid stabiler gemacht wird).
Sequenzprotokoll

Claims

Fibrinolytisch aktives Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 1 aufweist.
Polypeptid des Anspruchs 1, das durch rekombinante Expression in Hefe hergestellt worden ist.
Nukleinsäuremolekül, das für das Polypeptid der SEQ ID Nr: 1 kodiert.
Nukleinsäuremolekül des Anspruchs 3, das die Sequenz der SEQ ID Nr: 4 aufweist.
Expressionsvektor, umfassend expressionsregulatorische Elemente, die wirksam mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 verknüpft sind.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 5, in dem das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr: 4 aufweist.
Wirtszelle transformiert oder transfiziert mit einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder 4.
Transformierte oder transfizierte Wirtszelle gemäß Anspruch 7, die eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle ist.
Transformierte oder transfizierte eukaryotische Zelle nach Anspruch 8, die eine Hefezelle ist.
Transformierte oder transfizierte Hefezelle nach Anspruch 9, die Pichia pastoris ist.
Verfahren für die Herstellung einer thrombolytischen Metalloproteinase mit neuer Wirkung kodiert durch eine Nukleinsäure des Anspruchs 3, wobei das Verfahren die Kultivierung von Wirtszellen, die ein DNA-Molekül enthalten, das für eine Metallo proteinase kodiert, das wirksam mit regulatorischen Elementen für die Stimulierung der Expression dieses unter Bedingungen verknüpft, so daß das DNA-Molekül exprimiert wird, und Isolierung der exprimierten Metalloproteinase aus der Wirtzellkultur umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem das DNA-Molekül die SEQ ID Nr: 4 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, in dem die Wirtszellen Hefezellen sind.
Verfahren nach Anspruch 13, in dem die Hefezellen Pichia pastoris sind.
Verfahren für die Herstellung eines fibrinolytischen metalloproteinase Wirkstoffs, umfassend die Kultivierung von Pichia-Wirtszellen, die ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder 4 umfassen, das wirksam mit regulatorischen Elementen zur Stimulierung der Expression dieses unter Bedingungen, so daß das Nukleinsäuremolekül exprimiert wird, verknüpft ist und Isolierung der exprimierten Metalloproteinase aus der Wirtszellkultur.
Verfahren nach Anspruch 15, in dem die Pichia-Wirtszelle Pichia pastoris ist.
Antikörper gegen das Polypeptid des Anspruchs 1 oder 2.
Antikörper nach Anspruch 17, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 17 oder 18 für die Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 3 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Lösungsmittel, Emulgator, Adjuvants und/oder Träger.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 für die Verwendung in medizinischen Anwendungen.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 für die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung in der Behandlung von Thrombose.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Polypeptid für die Zuführung über in-den-Thrombus-verabreichung geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Polypeptid für die Zuführung in eine Arterie geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei das Polypeptid für die Zuführung über einen Katheter geeignet ist.