DE60018392T2

DE60018392T2 - Verfahren und vorichtung zum abgaben von tröpfchen auf einem substrat

Info

Publication number: DE60018392T2
Application number: DE60018392T
Authority: DE
Inventors: Zbigniew Bryning; S. Charles VANN
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: WO2000054883A1; US20020174831A1; EP1541236A3; EP1156880B1; CA2361835A1; DE60018392D1; US6413586B2; US7211148B2; US6579367B2; US20010016359A1; US20010010206A1; US20070148050A1; US6440217B2; US6296702B1; ATE289873T1; US20010009136A1; AU761013B2; US20030205200A1; JP2002538953A; US6849127B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Abgabe von Flüssigkeiten. Insbesondere stellt die Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufbringen von Flüssigkeitströpfchen auf einem Substrat vor, wobei die Flüssigkeit aus biologischen Proben oder Reagenzien bestehen kann.
Hintergrund der Erfindung
Die in einer Probe vorhandenen Zielverbindungen oder Analyten können oft identifiziert werden, indem man die Probe einem geeigneten Prüfmittel aussetzt mit anschließender Erkennung der erfolgten Reaktion. Bei einer typischen Anordnung wird eine Probe einer Testlösung, die den interessierenden Analyten enthält, einem Prüfmittel ausgesetzt, das einen erkennbaren Nachweisstoff enthält. Das Prüfmittel wird dabei so ausgewählt, dass es spezifisch nur den Analyten bindet, z.B. durch Hybridisierung komplementärer Nukleotid-Sequenzen oder durch Antikörper-Antigen-Reaktionen. Nach Entfernen des überschüssigen Prüfmittels, z.B. durch Abwaschen, kann dann die spezifische Bindung des Prüfmittels an den Analyten erkannt werden.
Da sich die Empfindlichkeit der analytischen Techniken ständig erhöht, empfiehlt es sich zunehmend, solche Analysen mit sehr geringen Probe- oder Reagens-Mengen durchzuführen. Dies gilt insbesondere dann, wenn die verwendeten Verbindungen kostspielig sind. Demzufolge ist es heute üblich, solche Flüssigkeiten in sehr kleinen Mengen zu verwenden, die als "Tröpfchen" oder "Tupfen" auf einem Substrat, wie etwa einem Objektträger, einer Mikro-Karte oder einem Chip, abgelegt werden.
Es ist oft nicht nur wünschenswert, sehr kleine Mengen der einzelnen Proben und/oder Reagenzien in Form von Tupfen zu erhalten, sondern man möchte zunehmend eine Vielzahl dieser Tupfen in geringem Abstand zueinander auf einem Substrat anordnen. Im Labor möchte man beispielsweise eine Probe auf das Vorhandensein einer breiten Palette von biologischen und/oder chemischen Zielverbindungen untersuchen, oder die Reaktion von vielen verschiedenen Proben mit einem oder mehreren Reagenzien, wie z.B. markierte Proben, bestimmen. Diese sehr dicht gepackten Anordnungen ermöglichen es, viele Reaktionen im Wesentlichen gleichzeitig durchzuführen, wodurch sich Platz, Zeit und Geld sparen lässt.
Es wurden sowohl manuelle als auch automatische Systeme zur Abgabe von sehr geringen Flüssigkeitsmengen entwickelt, wie z.B. Mikro-Pipetten, Pens, Federkiele oder Tintenstrahl-Vorrichtungen. Diese Systeme eignen sich für bestimmte Zwecke recht gut, sind aber mit Nachteilen behaftet. Beispielsweise sind Mikro-Pipetten im Allgemeinen nicht geeignet, die extrem kleinen Volumina von Flüssigkeiten genau zu dosieren, die von den heutigen Prüfprotokollen verlangt werden. Bezogen auf Pens und Federkiele, müssen mehrere Probleme gelöst werden, hinsichtlich unterschiedlicher Größen und Formen der abgegebenen Tupfen (was zu Unterschieden in der Signal-Intensität oder zu Überlappungen der Tupfen führen kann), durch "fehlende Tupfen" (wo zu wenig oder gar keine Probenflüssigkeit auf die Oberfläche abgegeben wurde), sowie durch Zusatzarbeiten für Reinigung und Nachfüllung. Tintenstrahl-Vorrichtungen geben eine kontrollierte Menge Flüssigkeit auf dem Substrat ab, indem sie in der Strahl-Patrone eine Druckwelle erzeugen. Dieses Verfahren ist allerdings nicht akzeptabel für die Tröpfchenabgabe von Probeflüssigkeiten, die relativ empfindliche Makromoleküle enthalten, da diese abgeschert oder sonst wie beschädigt werden können. Außerdem treten bei Tintenstrahl-Vorrichtungen in großem Umfang Spritzer auf, was zu einem hohen Kontaminationsrisiko führt, besonders bei eng beieinander liegenden Tupfen.
Ein zusätzlicher Nachteil ist, dass die meisten bekannten Betupfungsvorrichtungen eine sehr genaue Positionierung des Betupfungskopfes in Bezug zur Substratoberfläche erfordern. Ungleiche Abstände zwischen Betupfungskopf und Substratoberfläche können zu unregelmäßigen Tupfengrößen und/oder zu fehlenden Tupfen führen. Insbesondere kann es bei Vorrichtungen mit Abgabe durch Berührung dazu kommen, dass die Tupferspitze bei zu geringem Abstand zum Substrat mit der Substratoberfläche kollidiert und dabei Kräfte auftreten, die die Tupferspitze und/oder das Substrat beschädigen.
Aus dem oben Gesagten wird deutlich, dass ein Bedarf für eine Vorrichtung und ein Verfahren besteht, mit denen eine kleinste Flüssigkeitsmenge schnell und exakt auf eine Substratoberfläche aufgebracht werden kann. Diese Vorrichtung sollte vorzugsweise einfach zu benutzen und kostengünstig sein, sowie einfach anpassbar an die Abgabe von Mikro-Anordnungen einer Vielzahl von einzelnen Tupfen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung ist durch die Ansprüche definiert. Gemäß einem ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung vor, mit der eine vorgegebene Menge Flüssigkeit auf eine Vielzahl von benachbarten Regionen auf einem oder mehreren Substrat(en) durch Mikro-Betupfung aufgetragen werden kann.
In einer Ausführungsform enthält die Vorrichtung ein Rohr, das so ausgelegt ist, dass sich eine ausgewählte Flüssigkeit, wie etwa eine biologische Probe, ein Reagens oder ähnliches in ihm befinden kann. Am unteren Ende dieses Rohrs befindet sich eine Öffnung mit einem Durchmesser von weniger als ca. 1 mm. In einer beispielhaften Ausführung beträgt dieser Durchmesser weniger als ca. 500 μm und vorzugsweise weniger als 200 μm. In diesem Rohr ist eine längliche Faser so angeordnet, dass sie sich zwischen einer angehobenen und einer abgesenkten Stellung axial bewegen kann. Die Faser hat ein freies unteres Ende und einen Durchmesser, der geringer ist als der Innendurchmesser am unteren Ende des Rohrs. In einer beispielhaften Ausführung ist der Faserdurchmesser zwischen ca. 10 bis 100 μm geringer als derjenige der Öffnung. Beispielsweise kann man eine Faser mit einem Durchmesser von ca. 100 μm in einem Rohr mit einem Innendurchmesser zwischen 110 bis 200 μm anordnen. Für die Halterung des oder der ausgewählten Substrate während der Betupfung kann man einen Werkstück-Halter benutzen. In angehobener Stellung ist das freie Ende der Faser zur Substrat-Oberfläche beabstandet, in abgesenkter Stellung berührt das freie Ende der Faser die Substrat-Oberfläche.
Um die Faser zwischen ihrer angehobenen und abgesenkten Stellung zu verschieben, sind Mittel zur Verschiebung vorgesehen, die mit der Faser wirkend verbunden sind. Diese Mittel zur Verschiebung können zum Beispiel ein Aktuator sein, wie etwa ein Linear- oder Vertikal-Aktuator oder ähnliches. Für die Po sitionierung des Rohrs und der zugehörigen Faser seitlich des Werkstück-Halters, auf bestimmten Aufbring-Positionen auf dem Substrat, sind Mittel zur Positionierung vorgesehen. Diese Mittel zur Positionierung können so ausgelegt sein, dass sie das Substrat und/oder das Rohr mit seiner Faser und den Mitteln zur Verschiebung bewegen. In einer Ausführungsform zum Beispiel sind diese Mittel zur Positionierung ein X/Y-Koordinatenantrieb (z.B. ein durch Roboter-Technik gesteuerter, in X- und Y-Richtung beweglicher Arm), der wirkend mit dem Rohr und den Mitteln zur Verschiebung verbunden ist.
Mit den Mitteln zur Verschiebung und zur Positionierung ist ein Steuergerät wirkend verbunden, um nacheinander (i) das Rohr und die zugehörige Faser auf eine ausgewählte Aufbring-Position auf dem Substrat zu positionieren, und anschließend (ii) die Faser in ihre abgesenkte Position zu verschieben, um eine ausgewählte Menge Flüssigkeit auf dem Substrat abzulegen. In einer vorzugsweisen Ausführungsform ist (i) die Faser seitlich biegsam, jedoch (ii) im Wesentlichen unkomprimierbar in ihrer Längsachse. Geeignete Fasern, die solche Eigenschaften aufweisen, sind zum Beispiel Glasfasern. Deren Eigenschaften ermöglichen es vorteilhafterweise, einerseits die Bewegung von den Mitteln zur Verschiebung effektiv auf die Faser zu übertragen und anderseits die unterschiedlichen Abstände zwischen dem unteren Ende des Rohrs und dem Substrat durch Biegung der Faser auszugleichen.
In einer Ausführungsform ist die Vorrichtung für den Gebrauch der Mikro-Betupfung einer vorgegebenen Flüssigkeitsmenge auf eine vorgewählte Stelle auf jedem der Vielzahl von unterschiedlichen Substraten in dem Werkstück-Halter angepasst. Bei dieser Ausführungsform ist die Steuereinheit so ausgelegt, dass sie das Rohr nacheinander auf jede der vorgewählten Stellen auf jedem Substrat positioniert.
In einer Ausführungsform hat das Rohr einen im Wesentlichen gleichmäßigen Durchmesser und verfügt über einen oberen Behälter mit größerem Durchmesser, um die Flüssigkeit zu speichern. Rohr und Behälter können dabei getrennt geformt und anschließend zusammengefügt werden, oder sie können aus einem Stück geformt werden.
In einer anderen Ausführungsform verjüngt sich der Innendurchmesser des Rohrs nach unten zunehmend bis auf einen Rohrendbereich mit definiertem Inhalt, der den Durchmesser der Öffnung hat. Der Durchmesser des Rohrendbereichs ist bei dieser Ausführungsform im Wesentlichen derselbe wie derjenige der Faser. In der angehobenen Stellung der Faser befindet sich deren Ende oberhalb des Rohrendbereichs, so dass beim Verschieben der Faser von ihrer angehobenen in die abgesenkte Stellung die im Rohrendbereich enthaltene Flüssigkeitsmenge aus dem Rohr ausgestoßen wird.
Eine Ausführungsform der Vorrichtung, die besonders dazu geeignet ist, auf vorgewählten Aufbringbereichen eines Substrats eine vorgegebene Menge einer oder mehrerer ausgewählter Flüssigkeiten in Mikro-Tupfen gleichzeitig abzulegen, besitzt eine Vielzahl von Rohren und zugehörigen Fasern, sowie Mittel zu deren Verschiebung. Die Rohre können dabei zum Beispiel die Form von Kanälen in einem Verteilerblock annehmen. Die Biegung der Fasern gleicht dabei die unterschiedlichen Abstände zwischen dem unteren Ende des Rohrs und der entsprechenden Stelle auf dem Substrat aus.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Vorrichtung vor, mit der eine vorgegebene Menge Flüssigkeit auf einem Substrat durch Mikro-Betupfung aufgetragen werden kann, und die ein Rohr mit einem Innendurchmesser enthält, der sich nach unten zunehmend bis auf einen Rohrendbereich mit definiertem Inhalt und einem im Wesentlichen gleichmäßigen Durchmesser von weniger als ca. 1 mm verjüngt. Gemäß einer Ausführungsform ist der Innendurchmesser des Rohrendbereichs kleiner als ca. 500 μm und vorzugsweise kleiner als ca. 200 μm. Das Rohr ist so ausgelegt, dass es die gewählte Flüssigkeit durch Kapillarkräfte oder Oberflächenspannung einschließt. Im Rohr ist eine längliche Faser angeordnet, die einen im Wesentlichen gleichen Durchmesser hat wie der Rohrendbereich und die zwischen einer angehobenen und einer abgesenkten Stellung axial verschiebbar ist. In angehobener Stellung befindet sich das freie Ende der Faser über dem Rohrendbereich, in abgesenkter Stellung unter diesem. Um die Faser zwischen der angehobenen und der abgesenkten Stellung zu verschieben, und dadurch eine definierte Menge im Rohrendbereich enthaltene Flüssigkeit aus diesem Rohr auszustoßen und diese auf einem darunter befindlichen ausgewählten Substrat abzulegen, sind Mittel zur Verschie bung (z.B. ein Aktuator, wie etwa ein Linear- oder Vertikal-Aktuator oder ähnliches) wirkend mit der Faser verbunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist (i) die Faser seitlich biegsam, jedoch (ii) im Wesentlichen unkomprimierbar in ihrer Längsachse. Die Faser kann zum Beispiel eine Glasfaser sein. Deren Eigenschaften ermöglichen es vorteilhafterweise, einerseits die Bewegung von den Mitteln zur Verschiebung effektiv auf die Faser zu übertragen und anderseits die unterschiedlichen Abstände zwischen dem unteren Ende des Rohrs und dem Substrat durch Biegung der Faser auszugleichen.
In einer Ausführungsform berührt die Faser das Substrat, wenn sie in ihre abgesenkte Stellung verschoben wird.
Die Vorrichtung zur Mikro-Betupfung lässt sich dazu verwenden, ausgewählte Aufbring-Positionen auf jedem einzelnen einer Vielzahl von Substraten mit einer vorgegebenen Flüssigkeitsmenge zu betupfen. In einer solchen Ausführungsform enthält die Vorrichtung des weiteren Mittel, um das Rohr und die zugehörige Faser nacheinander auf die vorgewählten Aufbring-Positionen zu positionieren. Die Biegung der Faser gleicht dabei unterschiedliche Abstände zwischen dem unteren Ende des Rohrs und den verschiedenen Substrat-Positionen aus.
In einer anderen Ausführungsform dient die Vorrichtung dazu, auf mehreren vorgewählten Ablagebereichen eines Substrats eine vorgegebene Menge einer oder mehrerer ausgewählter Flüssigkeiten in Mikro-Tupfen gleichzeitig aufzubringen. In dieser Ausführungsform verfügt die Vorrichtung des weiteren über eine Vielzahl von Rohren und zugehörigen Fasern, sowie Mittel zu deren Verschiebung. In einer beispielhaften Anordnung haben die Rohrendbereiche einen Durchmesser von weniger als ca. 200 μm, die Fasern sind biegsam und sind so ausgelegt, dass sie in ihrer abgesenkten Stellung das Substrat berühren. Zusätzlich gleicht die Durchbiegung der Fasern die unterschiedlichen Abstände zwischen dem unteren Ende des Rohrs und den entsprechenden Stellen auf dem Substrat aus.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Flüssig-Reagens-Tupfen auf einem Substrat vor.
In einer Ausführungsform enthält die Vorrichtung zur Erzeugung von Anordnungen einen Verteilerblock oder Kanalblock mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen, die jeweils dazu dienen, eine ausgewählte Flüssigkeit zu speichern. Die Kanäle verfügen über sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen, und ihr Innendurchmesser verjüngt sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung. In dieser Ausführungsform legen die unteren Öffnungen das Aufbring-Muster fest, d.h. den Mittenabstand oder das Rastermaß der Tupfen-Anordnung. Ein Träger kann sich in Bezug zu diesem Verteilerblock zwischen einer angehobenen und einer abgesenkten Stellung bewegen. Von diesem Träger hängen eine Vielzahl von Fasern herab, die sich mit dem Träger bewegen. Jede dieser Fasern kann sich in einem zugehörigen Kanal längs bewegen, wenn sich der Träger zwischen der angehobenen und der abgesenkten Stellung bewegt. Durch die Bewegung der Fasern von ihrer angehobenen in ihre abgesenkte Stellung wird jeweils eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal des Verteilerblocks abgelegt.
Eine Ausführungsform verfügt des Weiteren über Mittel zur Verschiebung, die wirkend mit dem Träger verbunden sind, um diesen zwischen der angehobenen und abgesenkten Stellung zu verschieben.
Der Abstand zwischen benachbarten oberen Öffnungen und unteren Öffnungen im Verteilerblock kann derselbe oder er kann unterschiedlich sein. In einer Ausführungsform ist der Abstand zwischen benachbarten oberen Öffnungen wesentlich größer als der zwischen benachbarten unteren Öffnungen. Beispielsweise kann der Abstand zwischen den unteren Öffnungen halb, oder ein Drittel oder ein Viertel so groß sein wie der Abstand zwischen den oberen Öffnungen.
In einer Ausführungsform sind die Fasern so ausgelegt, dass sie in der unteren Stellung des Trägers das darunter liegende Substrat berühren und dass Unterschiede in der Länge des Überstands der Faser aus dem zugehörigen Kanalende und ihrem Berührungspunkt auf dem Substrat durch Biegung der Faser ausgeglichen werden.
In einer besonderen Konstruktion beträgt der Durchmesser der Kanäle an ihrem unteren Ende weniger als ca. 200 μm und ist ca. 10 bis 100 μm größer als der Durchmesser der zugehörigen Faser.
In einer anderen beispielhaften Konstruktion hat jeder Kanal in seinem unteren Endbereich einen im Wesentlichen gleichmäßigen Durchmesser bis zu seinem unteren Ende. Weiterhin ist der Durchmesser jedes Kanalendbereichs im Wesentlichen derselbe wie derjenige der zugehörigen Faser. Ist die Faser in angehobener Stellung, befindet sich ihr Ende oberhalb des Kanalendbereichs, so dass beim Verschieben der Faser von ihrer angehobenen in ihre abgesenkte Stellung die im Kanalendbereich enthaltene Flüssigkeitsmenge ausgestoßen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung zur Dosierung einer ausgewählten Flüssigkeitsmenge auf eine Substratoberfläche benutzt. Diese Ausführungsform wird im folgenden als Dosierapparat bezeichnet.
In einer Ausführungsform enthält dieser Dosierapparat einen Behälter zur Speicherung einer ausgewählten Flüssigkeit. Aus diesem Behälter erstreckt sich ein Rohr, das in einer unteren Öffnung endet, welche sich ihrerseits in der Nähe einer Ebene befindet, in der die Oberfläche eines ausgewählten Substrats liegen kann. In dem Rohr ist eine Faser zwecks schwingender axialer Bewegung in demselben angeordnet, wobei der untere Teil der Faser über die Rohröffnung hinausreicht. Der Innendurchmesser des Rohrs und der Durchmesser der Faser sind so bemessen, dass ohne Schwingung der Faser keine Flüssigkeit durch die Öffnung hindurchfließen kann. Mittel zur Schwingungserzeugung (z.B. eine Oszillator-Einheit) sind wirkend mit der Faser verbunden, um diese in Schwingung zu versetzen. Sie enthalten außerdem eine Steuereinheit, welche die Schwingungsamplitude, deren Frequenz und die Zeit bestimmt während der die Faser in Schwingung versetzt wird, und dadurch die Flüssigkeitsmenge festlegt, welche durch die Rohröffnung hindurchfließen kann.
Eine Ausführungsform dieses Dosierapparats enthält weiterhin Mittel zur Positionierung, um das Rohr und die Faser in Bezug auf das Substrat von einer gewählten seitlichen Stelle zur nächsten zu positionieren. In einer beispielhaften Anordnung sind diese Mittel zur Positionierung wirkend mit dem Rohr, der Faser und den Mitteln zur Schwingungserzeugung verbunden.
In einer Ausführungsform sind die Mittel zur Schwingungserzeugung dazu geeignet, Schwingungen mit einer Frequenz von mindestens ca. 10 Hertz und vorzugsweise von mindestens ca. 100 Hertz zu erzeugen. In einer anderen Ausführungsform sind die Mittel zur Schwingungserzeugung dazu geeignet, Schwingungen mit einer Amplitude von mindestens ca. 10 μm und vorzugsweise von mindestens ca. 100 μm zu erzeugen.
In einer beispielhaften Konstruktion hat das Rohr des Dosierapparats am unteren Ende einen Durchmesser von weniger als ca. 100 μm und das Spiel zwischen Faser und Rohr an dessen unterem Ende beträgt weniger als ca. 25 μm.
Die Faser des Dosierapparats ist dazu geeignet, das Substrat wenigstens während eines Teils ihres Schwingungszyklus zu berühren. In einer Ausführungsform zum Beispiel bleibt die Faser während des gesamten Schwingungszyklus in Kontakt mit dem Substrat.
Gemäß einem anderen ihrer Aspekte, stellt die Erfindung ein Verfahren vor, um einen Reagens-Tupfen auf einem Substrat zu erzeugen. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: (i) die Längs-Hin- und -Herbewegung einer länglichen Faser im Innern einer Kapillarröhre, die eine ausgewählte Flüssigkeit enthält, mit einer Frequenz und einer Amplitude, die ausreichend sind, um einen Teil der Flüssigkeit durch eine Öffnung am unteren Ende des Rohrs nach außen zu pumpen, so dass sich ein hängender Tropfen bildet; und (ii) Positionierung des hängenden Tropfens auf einen ausgewählten Bereich des Substrats.
In einer allgemeinen Ausführungsform wird dieser hängende Tropfen auf dem Substrat platziert, indem der Tropfen und/oder die Spitze der Faser den ausgewählten Bereich des Substrats berühren.
Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung verdeutlicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Der Aufbau und die Betriebsweise der Erfindung, zusammen mit ihren weiteren Zwecken und Vorteilen, werden am besten verständlich durch die nachfolgende Beschreibung und Bezugnahme auf die folgenden beigefügten Zeichnungen.
1 ist eine teilweise schematische Seitenansicht einer Betupfungs-Vorrichtung mit im Schnitt gezeigten Teilen, die entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde.
2 ist eine teilweise schematische Ansicht von oben, die Bauteile einer automatischen Vorrichtung zum erfindungsgemäßen Aufbringen von Tupfen-Anordnungen zeigt.
Die 3A bis 3C zeigen eine Betupfungs-Vorrichtung und deren Benutzungsmethode, um gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine sehr kleine Flüssigkeitsmenge auf die Oberfläche eines Substrats aufzubringen.
Die 4A bis 4C zeigen eine Betupfungs-Vorrichtung und deren Benutzungsmethode, um gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine sehr kleine Flüssigkeitsmenge auf die Oberfläche eines Substrats aufzubringen.
5 zeigt ein berührungsloses Aufbringverfahren, um mit dem in der vorliegenden Erfindung vorgestellten Dosierapparat sehr kleine Flüssigkeitsmengen aus einem Rohr auf die Oberfläche eines Substrats zu übertragen.
6 zeigt ein Aufbringverfahren mit Berührung, um mit dem in der vorliegenden Erfindung vorgestellten Dosierapparat sehr kleine Flüssigkeitsmengen aus einem Rohr auf die Oberfläche eines Substrats zu übertragen.
Die 7A bis 7E zeigen eine Betupfungsvorrichtung und deren Benutzungsmethode, um gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sehr kleine Flüssigkeitsmengen auf die Oberfläche eines Substrats aufzubringen.
Die 8 und 9 sind teilweise schematische Seitenansichten eines Betupfungskopfes, um gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine An ordnung von Flüssigkeitstupfen auf die Oberfläche eines Substrats aufzubringen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Erläuterungen der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung haben lediglich Beispielcharakter. Dementsprechend schränken sie den Umfang der Erfindung in keiner Weise ein.
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung eine Vorrichtung zur Abgabe einer geringen Menge eines flüssigen Reagens auf ein Substrat vor. Im Allgemeinen enthält die Vorrichtung ein Rohr, das diese Flüssigkeit enthält. In diesem Rohr ist eine längliche Faser so angeordnet, dass sie sich zwischen einer angehobenen und einer abgesenkten Stellung axial bewegen kann. Durch Verschieben oder Hin- und Herschwingen der Faser zwischen ihrer angehobenen und ihrer abgesenkten Stellung kann ein Tupfen Flüssigkeit auf eine gewählte Position des Substrats abgegeben werden.
In einer beispielhaften Ausführungsform der Betupfungs-Vorrichtung, im Allgemeinen mit 8 in 1 bezeichnet, erstreckt sich eine mit 12 bezeichnete Faser längs des mit 14 bezeichneten Rohrs, welches an seinem unteren Ende eine Öffnung 16 besitzt. Rohr 14 ist so ausgelegt, dass es ein flüssiges Reagens, wie z.B. 18, enthalten kann, um es kontrolliert auf einem Substrat abzugeben, wie nachfolgend genauer beschrieben wird. Rohr 14 kann beispielsweise aus Metall, Kunststoff, Glas, Keramik oder anderen von Fachleuten für geeignet gehaltenen Werkstoffen geformt werden. Ein Behälter 20, der in flüssiger Verbindung zu Rohr 14 steht, ist so ausgelegt, dass er einen Vorrat an flüssigem Reagens aufnehmen und speichern kann. Aus dem Behälter 20 fließt flüssiges Reagens in Rohr 14 sobald der Reagensvorrat im Rohr erschöpft ist. In einer beispielhaften Ausführung wird als Rohr eine Injektionskanüle (⌀ 0,3 mm (Gauge 30), 0,64 cm (1/4 in) lang, 90° stumpfes Ende) und als Behälter der zugehörige konische Kunststoff-Stutzen (plastic luer hub) verwendet.
Normalerweise verhindern Kapillarkräfte oder die Oberflächenspannung das freie Abfließen des flüssigen Reagens aus der unteren Rohröffnung. Zu diesem Zweck kann der untere Bereich des Rohrs kapillare Abmessungen aufweisen, so dass die Kapillarkräfte das freie Abfließen des flüssigen Reagens 18 aus der Öffnung 16 verhindern. Beispielsweise können Öffnung 16 und der darüber liegende Bereich des Rohrs 14 mit einem Innendurchmesser von weniger als ca. 2 mm und vorzugsweise von weniger als ca. 1 mm hergestellt werden. In einer besonderen Konstruktion beträgt der Innendurchmesser des unteren Bereichs von Rohr 14 weniger als ca. 200 μm. Um den erwünschten Kapillar-Effekt noch zu unterstützen, kann der Bereich des Rohrs 14 mit kapillaren Abmessungen auf seiner Innenseite eine hydrophile, d.h. benetzbare Oberfläche aufweisen. Die Innenfläche von Rohr 14 kann beispielsweise aus einem hydrophilen Werkstoff gefertigt und/oder so behandelt sein, dass sie hydrophile Eigenschaften aufweist. In einer Ausführungsform besitzt die Innenfläche originäre, gebundene oder kovalent verbundene geladene Gruppen. Eine geeignete Oberfläche ist eine Glas-Oberfläche mit einer absorbierten Schicht eines polykationischen Polymers, wie zum Beispiel Poly-L-Lysin.
Rohr 14 kann mit einer hydrophoben Außenfläche gefertigt werden, d.h. einer Fläche, auf der darauf abgelegte Flüssigkeiten Perlen bilden. Beispielsweise kann die Außenfläche von Rohr 14 aus einem hydrophoben Werkstoff gefertigt und/oder so behandelt sein, dass sie hydrophobe Eigenschaften aufweist. Dies kann z.B. nützlich sein, um zu verhindern, dass ein Tropfen, der sich im Bereich der Öffnung 16 gebildet hat, auf der Außenseite des Rohrs verläuft. Es kann weiterhin dazu beitragen, dass sich ein Flüssigkeitstropfen als Kügelchen am unteren Ende des Rohrs sammelt. Eine Vielzahl von bekannten hydrophoben Polymeren, wie etwa Polystyrol, Polypropylen und/oder Polyethylen können zur Erzielung dieser gewünschten hydrophoben Eigenschaften verwendet werden. Zusätzlich oder als Alternative können eine Vielzahl von Schmierstoffen oder andere übliche hydrophobe Beschichtungen auf die Außenfläche des Rohrs aufgebracht werden, insbesondere in seinem unteren Bereich, nahe der Öffnung 16.
Unter weiterer Bezugnahe auf die Ausführungsform der 1 ist der Durchmesser der Faser 12 um ca. 10 bis 500 μm kleiner als der Innendurchmesser des Rohrs 14. In diesem Zusammenhang kann Faser 12 einen Durchmesser von ca. 25 bis zu 1,000 μm haben. Gemäß einer Ausführungsform hat Faser 12 einen Durchmesser von weniger als ca. 200 μm und vorzugsweise von weniger als 100 μm. In einer besonderen Anordnung erstreckt sich eine Faser mit einem Durchmesser von ca. 75 μm längs in einem Rohr mit einem Innendurchmesser von ca. 100 μm an seinem unteren Endbereich und mit einem Außendurchmesser von ca. 200 μm. In einer anderen Anordnung erstreckt sich eine Faser mit einem Durchmesser von ca. 50 μm längs in einem Rohr mit einem Innendurchmesser von ca. 75 μm an seinem unteren Endbereich und mit einem Außendurchmesser von ca. 200 μm.
Aus noch einsichtig werdenden Gründen ist die Faser 12 vorzugsweise so aufgebaut, dass sie seitlich biegsam ist und in der Längsrichtung unkomprimierbar. Zu den Werkstoffen, die sich zur Herstellung der Faser 12 vorzugsweise eignen, gehören die üblicherweise zur Herstellung von Lichtwellenleitern (optical fibers) verwendeten Werkstoffe, wie z.B. Glas, Kunststoff, Silikat, Quarz und ähnliche. Geeignete Lichtwellenleiter sind von vielen Lieferanten im Handel erhältlich. Eine im Einzelfall bevorzugte Faser hat einen Durchmesser von ca. 0,002 in (d.h. ca. 50,8 μm) und wird von Edmund Scientific Co. (Barrington, N.J.) unter der Katalog-Nr. # F54014 angeboten.
Wie bereits ausgeführt, ist die Faser 12 im Rohr 14 so angeordnet, dass sie sich zwischen einer angehobenen und einer abgesenkten Stellung axial bewegen kann. In der vorliegenden Ausführungsform ist das freie Ende der Faser oder ihre Spitze 12a in der angehobenen Stellung zur Oberfläche des gewählten Substrats, wie etwa einem Objektträger 22, beabstandet. Nach Verschiebung der Faser in die untere Stellung nähert sich die Spitze 12a der Oberfläche von Substrat 22.
Die Mittel zur Verschiebung sind wirkend mit Faser 12 verbunden, um diese zwischen ihrer angehobenen und ihrer abgesenkten Stellung zu bewegen. Diese Mittel zur Verschiebung können beispielsweise einen Aktuator einschließen, der sich zwischen zwei Stellungen bewegen kann, wie etwa einen Linear- oder Vertikal-Aktuator oder ähnliches. In der Ausführungsform gemäß 1 lässt sich eine Spulenanordnung 24 so ansteuern, dass der kolbenförmige Spulenanker 26 nach unten gezogen wird und danach wieder freigegeben, so dass er, z.B. durch Federkraft, in seine normale angehobene Stellung zurückkehrt (gestrichelt gezeichnet). Es gibt viele Lieferanten für derartige Magnetspulen und geeignete Modelle können von mit dieser Technik vertrauten Fachleuten sehr schnell ausgewählt werden. Eine besondere Magnetspule, die für die Benut zung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wurde, ist von Jameco Electronics Components (Belmont Kalifornien) unter Teile-Nr. # 145314 erhältlich (Röhrenförmige 12 V Gleichstrom Vor/Zurück-Magnetspule). In einer Ausführungsform ist die Magnetspule so ansteuerbar, dass die Faser um ca. 1 mm angehoben bzw. abgesenkt wird.
Andere Aktuatoren, die zur Verschiebung der Faser benutzt werden können, sind beispielsweise pneumatische, hydraulische, magnetostriktive oder piezoelektrische Aktuatoren, ebenso wie Motoranordnungen (wie z.B. Schrittmotoren), die eine nach unten gerichtete Antriebskraft mit anschließender Richtungsumkehr bewirken können. Verschiedene besondere Vorrichtungen, die sich schnell an den hier vorliegenden Einsatz als Mittel zur Verschiebung anpassen lassen, sind in den U.S.-Patenten Nr. 3,164,304; 3,329,964; 3,334,345; 5,443,791; 5,525,515; 5,551,487; 5,601,980 und 5,807,522 offenbart.
Mittel zur Positionierung können benutzt werden, um die Betupfungsvorrichtung linear oder in einer X/Y-Ebene zu bewegen, um diese Vorrichtung auf eine ausgewählte Aufbring-Position zu stellen. In diesem Zusammenhang verwenden bestimmte Ausführungsformen eine Bewegung des Rohrs, während das Ablage-Substrat still steht. Bei anderen Ausführungsformen bleibt das Rohr in einer festen Stellung, während das Substrat in Position gebracht wird. Weitere Ausführungsformen verwenden sowohl eine Bewegung des Rohrs als auch des Ablage-Substrats, entweder nacheinander oder gleichzeitig.
In einer beispielhaften Anordnung der Mittel zur Positionierung befindet sich die Betupfungsvorrichtung auf dem Arm eines X/Y-Koordinatenantriebs. Bei dieser Anordnung kann sich der Arm entweder linear oder entlang der X/Y-Ebene bewegen, um die Betupfungsvorrichtung auf eine ausgewählte Aufbring-Position zu stellen. Eine solche Bewegung lässt sich beispielsweise durch eine Roboter-Einrichtung oder ähnliches erreichen. Beispielhafte Roboter-Einrichtungen sind etwa Roboter mit elektronisch gesteuerten, verbundenen oder gekreuzten beweglichen Armen, wie z.B. SCARA-, Portal- oder kartesische Roboter. Es versteht sich von selbst, dass sich jede andere Roboter-Einrichtung im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzen lässt, solange sie im Wesentlichen dieselben Zwecke erfüllt und im Wesentlichen dieselben Ergebnisse erbringt. In diesem Zusammenhang lassen sich also auch zylindrische Roboter, polare Ro boter, Gelenkarm-Roboter oder ähnliche verwenden. In einer Ausführungsform enthalten die Mittel zur Positionierung einen angetriebenen Kreuzschlitten oder eine X/Y-Schienen-Anordnung. Beispielsweise lässt sich das Gerät AUTOMOVE^® 402, erhältlich bei Asymtek (Carlsbad, CA), für die X/Y-Positionierung und die Spulenansteuerung verwenden.
Der Arm, der in der obengenannten Anordnung das Rohr trägt, kann eine Zange enthalten, die das Rohr lösbar greifen kann. Durch diese Anordnung lässt sich das Rohr durch ein anderes auswechseln, das z.B. ein anderes flüssiges Reagens enthält.
Ein besonderes Mittel zur Positionierung, das in der vorliegenden Erfindung benutzt werden kann, wird im Folgenden genauer beschrieben. Dieses Gerät wird in der Draufsicht in einer teilweise schematischen Darstellung in 2 dargestellt. Eine Betupfungsvorrichtung 8 hat in diesem Gerät den oben mit Bezug auf 1 beschriebenen Grundaufbau und enthält ein Rohr 14, das mit einer unteren Öffnung endet. Eine Faser 12 ist axial in Rohr 14 der Betupfungsvorrichtung 8 angeordnet und ist so angelegt, dass sie sich zur Oberfläche eines Substrats hin- oder von ihr wegbewegen kann, um ein gewähltes Volumen einer flüssigen Probe oder eines Reagens wie beschrieben aufzubringen. Eine Magnetspule 24 oder andere Mittel zur Verschiebung führen diese Bewegung aus. Die Magnetspule 24 wird von einer Steuereinheit 52 angesteuert, deren Funktion weiter unten beschrieben wird.
Die Betupfungsvorrichtung ist an einem Arm 54 befestigt, der seinerseits mit einem Gewinde auf der Gewindespindel 58 montiert ist, die von dem ebenfalls durch die Steuereinheit 52 angesteuerten Schrittmotor 62 in die gewünschte Richtung angetrieben (gedreht) wird. An ihrem in der Figur linken Ende ist diese Gewindespindel 58 in einer Buchse 64 gelagert, um sich um ihre Achse drehen zu können. An ihrem anderen Ende ist die Gewindespindel auf der Antriebswelle des Schrittmotors befestigt, der seinerseits von Buchse 66 getragen wird. Die Betupfungsvorrichtung, die Gewindespindel, die beiden Buchsen in denen die Gewindespindel geführt wird, sowie der Schrittmotor, mit dem die Vorrichtung in "X-Richtung" (horizontal) gemäß Zeichnung bewegt wird, bilden was im Folgenden allgemein als Positionierschlitten 66 bezeichnet wird.
Dieser Positionierschlitten ist so konstruiert, dass er hochgenaue Bewegungen mit kleinster Schrittweite in Richtung der Gewindespindel, d.h. entlang der X-Achse in der Zeichnung ausführen kann. In einer Betriebsart arbeitet der Positionierschlitten so, dass die Betupfungsvorrichtung in der X-Achse mit einer gewählten Schrittweite im Bereich von 5 bis 500 μm bewegt wird. In einer anderen Betriebsart kann die Betupfungsvorrichtung in genauen X-Achs-Inkrementen von einigen Tausendstel mm oder mehr bewegt werden, um die Betupfungsvorrichtung auf zugehörige Positionen von benachbarten Substraten zu stellen, wie nachfolgend beschrieben.
Andererseits ist der Positionierschlitten zur Bewegung in "Y-Richtung" (vertikal) gemäß Zeichnung, so aufgebaut, dass er die Betupfungsvorrichtung auf eine gewählte Y-Achs-Position stellen kann. Der Unterbau des Schlittens umfasst dazu einen festen Stab 68, der unbeweglich zwischen das Paar Halteblöcke 70, 72 montiert ist, sowie eine Gewindespindel 74, die drehbar zwischen dem Paar Halteblöcke 76, 78 gelagert ist. Die Gewindespindel wird von einem Schrittmotor 80 angetrieben (gedreht), der durch Steuereinheit 52 angesteuert wird. Wie gezeigt, ist der Motor an den Halteblock 76 angebaut.
Der oben beschriebene Aufbau mit Gewindespindel 74 und Schrittmotor 80 ist so konstruiert, dass er hochgenaue Bewegungen mit kleinster Schrittweite in Richtung der Gewindespindel, d.h. entlang der Y-Achse in der Zeichnung ausführen kann. Wie oben beschreiben, arbeitet der Aufbau in einer Betriebsart so, dass die Betupfungsvorrichtung in der Y-Achse mit einer gewählten Schrittweite im Bereich von 5 bis 500 μm bewegt wird, und in einer anderen Betriebsart so, dass die Betupfungsvorrichtung in genauen Y-Achs-Inkrementen von einigen Tausendstel mm oder mehr bewegt wird, um diese Vorrichtung auf zugehörige Positionen von benachbarten Substraten zu stellen.
Ein Werkstück-Halter 82 wird im Gerät dazu benutzt, eine Vielzahl von Substraten zu halten, wie etwa die Substrate 22, auf denen durch die Vorrichtung Mikro-Anordnungen von Reagens-Bereichen aufgebracht werden sollen. Der Werkstück-Halter verfügt über eine Anzahl Aussparungen, wie etwa Aussparung 86, in welche die Substrate eingelegt werden und in welchen sie exakt auf vorgewählte Positionen in Bezug auf die Halteblöcke, auf denen die Mittel zur Positionierung der Betupfungsvorrichtung montiert sind, gebracht werden.
Wie oben ausgeführt, steuert die Steuereinheit die beiden Schrittmotoren und die Magnetspule mit einer Befehlsfolge so an, dass das Gerät automatisch arbeitet, um eine vorgewählte Mikro-Anordnung von Reagens-Bereichen auf jedem einzelnen einer Vielzahl von Substraten aufzubringen.
Diese Steuereinheit ist nach den herkömmlichen Steuerprinzipien eines Mikroprozessors aufgebaut, um an die Magnetspule und die Schrittmotoren geeignete Signale in einer bestimmten Reihenfolge und mit der geeigneten Signaldauer abzugeben. Der Aufbau der Einheit und die vom Benutzer zur Erzielung der gewünschten Tupfen-Anordnung zu wählenden Einstellungen werden durch die nachfolgende Beschreibung einer typischen Gerätefunktion verständlich.
Zunächst werden in eine oder mehrere Aussparungen des Werkstück-Halters eine oder mehrere Substrate eingelegt. Die Motoren 62, 80 werden dann so betätigt, dass die Betupfungsvorrichtung auf eine gewählte Anordnungs-Position des ersten Substrats gestellt wird. Dann wird die Magnetspule aktiviert, um an dieser Position den betreffenden Anteil der gewählten Flüssigkeitsmenge des jeweiligen Reagens aufzubringen. Dieser Vorgang dient dazu, um beispielsweise gewählte Volumina von weniger als ca. 1 μl (d.h. vorzugsweise zwischen ca. 2 pl und 2 nl) des flüssigen Reagens aufzubringen.
Die Betupfungsvorrichtung wird nun an die entsprechende Stelle eines benachbarten Substrats gefahren und an dieser Position wird eine ähnliche Menge des flüssigen Reagens aufgebracht. Dieser Vorgang wird so oft wiederholt, bis das Reagens an dieser vorgewählten Position auf jedem der Substrate aufgebracht wurde.
Wenn gewünscht wird, ein einzelnes Reagens an mehr als zwei Anordnungs-Positionen auf einem Substrat aufzubringen, kann die Betupfungsvorrichtung auf verschiedene Positionen des Substrats gestellt werden, bevor sie zu einem neuen Substrat bewegt wird, oder das flüssige Reagens kann auf einzelne Positionen des Substrats auf einer ausgewählten Position aufgebracht werden und danach wird der Zyklus für jede neue Anordnungs-Position wiederholt.
Um das nächste Reagens aufzubringen, wird die Betupfungsvorrichtung gegen eine andere solche Vorrichtung ausgewechselt, die ein anderes ausgewähltes Reagens enthält. Der Vorgang zur Ablage des Reagens auf jeder der entsprechenden zweiten Anordnungs-Positionen wird dann wie oben ausgeführt. Dieser Vorgang wird so oft wiederholt bis eine vollständige Mikro-Anordnung flüssiger Reagenzien auf jedem der Substrate erreicht wurde.
Verschiedene andere X/Y-Positionierschlitten, die sich schnell an den hier vorliegenden Einsatz als Mittel zur Positionierung anpassen lassen, sind beispielsweise in den U.S. Patenten Nr. 5,443,791; 5,551,487 und 5,587,522 offenbart.
Wie bereits oben gesagt, kann das Mittel zur Positionierung stattdessen oder zusätzlich so angepasst werden, dass das Substrat in die Betupfungs-Position gebracht wird. In diesem Zusammenhang kann das Substrat an die Handhabung durch eine Roboter-Vorrichtung angepasst werden, oder es kann auf ein Förderband oder auf eine in X/Y-Richtung bewegliche Platte oder Plattform gelegt werden.
Jedes gewünschte Substrat lässt sich in der vorliegenden Erfindung benutzen, einschließlich Objektträgern, Karten, Platten, Chips und ähnlichem. In einer allgemeinen Ausführungsform ist die Substratoberfläche relativ hydrophil, d.h. benetzbar. Die Oberfläche kann originäre, gebundene oder kovalent verbundene geladene Gruppen enthalten. Eine solche Oberfläche ist etwa eine Glas-Oberfläche mit einer absorbierten Schicht eines polykationischen Polymers, wie zum Beispiel Poly-L-Lysin. In einer Ausführungsform wird zum Beispiel die wässrige oder vorwiegend wässrige Reagens-Lösung oder biologische Probe auf einen Objektträger-Halter mit hydrophiler Oberfläche getupft. In einer anderen Ausführungsform ist die Substratoberfläche hydrophob oder so behandelt, dass sie hydrophobe Eigenschaften aufweist, d.h. dass auf diese Oberfläche aufgetragene wässrige Medien Perlen bilden. Eine Vielzahl von bekannten hydrophoben Polymeren, wie etwa Polystyrol, Polypropylen oder Polyethylen haben die gewünschten hydrophoben Eigenschaften, ebenso wie eine Anzahl von Schmierstoffen oder andere hydrophobe Beschichtungen, die auf die Substratoberfläche aufgebracht werden können.
In einigen Fällen möchte man das Reagens in einer feuchten Umgebung ablegen, damit die Tröpfchen nicht antrocknen bevor die Tupfen-Anordnung fertig ist.
Einige beispielhafte Vorrichtungen und Verfahren für das Betupfen eines Substrats sind in den 3 bis 6 dargestellt. Im Allgemeinen wird die erfindungsgemäße Betupfungsvorrichtung auf einen gewählten Bereich des Substrats positioniert. In einer typischen Arbeitsweise erfolgt dies dadurch, dass der gewählte Substratbereich so auf die Betupfungsvorrichtung ausgerichtet wird, dass der gewählte Bereich die gedachte Verlängerung der mittleren Längsachse der Betupfungsvorrichtung schneidet. Eine längliche Faser, die an eine axiale Bewegung innerhalb der Betupfungsvorrichtung angepasst ist, wird nun zwischen ihrer angehobenen und abgesenkten Stellung so verschoben oder schwingend bewegt, dass eine bestimmte Menge Flüssigkeit aus dem Rohr auf den gewählten Substratbereich aufgebracht wird. Anzumerken ist, dass jedes der oben genannten Mittel zur Verschiebung oder Positionierung zusammen mit jeder der folgenden Ausführungsformen eingesetzt werden kann. Ebenso kann jede geeignete Steuereinheit, wie z.B. 52 in 2, benutzt werden.
Weiterhin ist anzumerken, dass die Spitze der Faser bei ihrer Hin- und Herbewegung zwischen der angehobenen und abgesenkten Stellung einen Weg zurücklegt, der im Folgenden als "Hub" gezeichnet wird. Bei ihrem Vorwärts-Hub bewegt sich die Faserspitze von der angehobenen in die abgesenkte Endstellung, bei ihrem Rückwärts-Hub bewegt sich die Faserspitze von der abgesenkten in die angehobene Endstellung zurück.
In einer in den 3A bis 3C gezeigten Ausführungsform liegt Spitze 12a der Faser 12 bei Beginn des Hubs, d.h. in ihrer angehobenen Endstellung, außerhalb des Rohrs 14, so dass ein Querschnitt der Faser 12 die an Öffnung 16 durch den Rand von Rohr 14 definierte Ebene schneidet. Ausgehend von dieser in 3A dargestellten Anfangsstellung wird die Faserspitze 12a nun zur Oberfläche eines ausgewählten Substrats, wie etwa Objektträger 22, bewegt, wobei sie, wie in 3B gezeigt, in ihrer abgesenkten Endstellung gegebenenfalls den ausgewählten Substratbereich 22a berührt. Anzumerken ist, dass Faser 12 dabei an ihrer Außenfläche einschließlich der Oberfläche von Spitze 12a eine Schicht von flüssigem Reagens 18 mit sich führt. Bei Berührung des Sub strats wird eine geringe und kontrollierte Menge des flüssigen Reagens von Spitze 12a auf den ausgewählten Bereich 22a von Substrat 22 aufgebracht. Nach der Berührung mit Substrat 22 wird die Faser 12 wieder in ihre angehobene Stellung zurück verschoben und hinterlässt auf der Oberfläche des Substrats einen Tupfen Flüssigkeit, wie in 28 dargestellt. Wenn gewünscht, kann die Betupfungsvorrichtung nun auf einen anderen gewählten Bereich positioniert werden, um dort einen weiteren Tupfen aufzubringen. Die dafür benutzte Wiederholrate kann einige wenige Hübe pro Sekunde betragen, z.B. im Bereich von 1 Hz bis 10 Hz. In einer Ausführungsform beträgt diese Wiederholrate ca. 5 Hübe pro Sekunde.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Einhaltung einer exakten Toleranz zwischen Betupfungsvorrichtung und Substrat für erfolgreiche Ergebnisse mit der vorliegenden Erfindung nicht kritisch ist. Das bedeutet, dass die Faser in ihre angehobene Stellung zurückgezogen werden kann, nachdem sie die Substratoberfläche kaum berührt hat, oder die Faser kann weiter nach abgesenkt werden, als es für eine Kontaktaufnahme mit der Substratoberfläche notwendig ist. Wenn die Faser auf der Substratoberfläche auftrifft, ermöglicht die Biegsamkeit der Faser in vorteilhafter Weise eine Biegung oder Krümmung der Faser. Das bedeutet, dass eine Durchbiegung der Faser unterschiedliche Abstände zwischen unterem Ende der Betupfungsvorrichtung und Substratoberfläche ausgleichen kann. 3B zeigt dies zur besseren Verdeutlichung in übertriebener Weise.
Ebenso ist zu berücksichtigen, dass die Unkomprimierbarkeit der Faser in Längsrichtung für eine wirksame Übermittlung der Bewegung der Mittel zur Verschiebung zur Faserspitze hin sorgt. Diese Eigenschaft ermöglicht vorteilhafterweise die Verwendung von Fasern unterschiedlicher Längen, einschließlich relativ langer Fasern (z.B. 10, 20, 30 cm lang oder noch mehr).
In den 4A bis 4C ist ein weiteres Betupfungsverfahren gezeigt. Zu Beginn der Faser-Verschiebung, d.h. in ihrer angehobenen Endstellung, befindet sich die Spitze 12a der Faser 12 noch im Rohr 14, oberhalb der an Öffnung 16 durch den Rand von Rohr 14 definierten Ebene. Ausgehend von dieser in 4A dargestellten Ausgangsstellung wird die Faserspitze nun in Richtung der ausgewählten Substratoberfläche, z.B. des Objektträgers 22, verschoben. Die plunger- oder kolbenähnliche Aktion der Faserspitze 12a bewirkt das Ausstoßen einer bestimmten Menge flüssigen Reagens 18 aus dem unteren Endbereich des Rohrs 14. Die Menge der auf diese Weise ausgestoßenen Flüssigkeit hängt teilweise von der Menge Flüssigkeit ab, die sich im Bereich unter der Spitze 12a befand, als die Spitze 12a gegen das Substrat 22 verschoben wurde. Die obere Endstellung der Faserspitze im Rohr ergibt sich daher bei dieser Ausführungsform zumindest teilweise aus der Menge Flüssigkeit, die man auf das Substrat auftupfen möchte. Weitere Variablen, durch deren Beeinflussung sich die aufgetupfte Flüssigkeitsmenge bei dieser Ausführungsform steuern lässt, sind z.B. die Größe der Oberfläche von Spitze 12a und der Abstand zwischen Faser und Innenseite des Rohrs.
Wenn die Faserspitze 12a in Richtung des Substrats verschoben wird, kann sie gegebenenfalls das Substrat 22 in ihrer unteren Endstellung berühren. Nach Berühren des Substrats 22 wird die Faser 12 wieder in ihre angehobene Stellung zurück verschoben und hinterlässt dabei, wie in 4C an Stelle 28 dargestellt, einen Flüssigkeitstupfen auf der Substratoberfläche. Die Betupfungsvorrichtung kann nun an eine andere ausgewählte Position bewegt werden, um bei Bedarf einen weiteren Tupfen aufzubringen. Wie bei der vorher beschriebenen Ausführungsform kann die Wiederholrate einige wenige Hübe pro Sekunde betragen, etwa im Bereich zwischen ca. 1 Hz bis 10 Hz. In einer Ausführungsform beträgt diese Wiederholrate ca. 5 Hübe pro Sekunde.
Es ist zu beachten, dass die kolbenähnliche Aktion von Faser 12, wie oben beschrieben, im Bereich des unteren Faserendes zur Ausbildung einer dickeren Flüssigkeitsschicht führt als bei der Ausführungsform gemäß den 3A bis 3C. Aus diesem Grunde ist davon auszugehen, dass die obige Ausführungsform für die Erzeugung von Reagenstupfen mit größerem Volumen eingesetzt wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erzeugt einen Dosierapparat, der zur Abgabe einer vorgewählten Menge Flüssigkeit auf einer Substratoberfläche benutzt werden kann. In einer in den 5 und 6 dargestellten Ausführungsform steht ein Rohr 14 an seinem oberen Ende in Verbindung mit einem Reagens-Vorratsbehälter 20 und endet in einer unteren Öffnung 16 ganz ähnlich zu den bereits oben beschriebenen Betupfungsvorrichtungen. Ei ne Faser 12 ist hier für eine schwingende Axial-Bewegung innerhalb von Rohr 14 angeordnet.
Der Innendurchmesser des Rohrs 14 und der Außendurchmesser der Faser 12 sind so bemessen, dass ohne Schwingung der Faser ein Abfließen der Flüssigkeit durch Öffnung 16 verhindert wird. In einer Ausführungsform zum Beispiel hat Rohr 14 am unteren Ende einen Durchmesser von weniger als ca. 200 μm, vorzugsweise ca. 100 μm, und das Spiel zwischen Faser und Rohr an dessen unterem Ende beträgt weniger als ca. 50 μm, vorzugsweise sogar weniger als ca. 25 μm.
Mittel zur Schwingungserzeugung sind wirkend mit Faser 12 verbunden, um diese in Schwingung zu versetzen. Die Mittel zur Schwingungserzeugung umfassen zum Beispiel eine Schwingeinheit mit einer Steuereinheit zur Festlegung der Schwingungsamplitude, der Schwingfrequenz und der Schwingdauer der Faser, und damit der Flüssigkeitsmenge, die durch Öffnung 16 austreten kann. Die Schwingeinheit kann jede Art Vorrichtung umfassen, die die Faser axial im Rohr in eine derart gesteuerte Schwingung versetzen kann. Geeignete Schwingeinheiten können beispielsweise Vorrichtungen mit Magnetspulen oder Motorantrieben umfassen, ebenso pneumatische, hydraulische, magnetostriktive oder piezoelektrische Aktuatoren. In einer Ausführungsform ist die Schwingeinheit so ausgelegt, dass sie eine Schwingfrequenz von mindestens ca. 10 Hz und vorzugsweise von mindestens ca. 100 Hz erzeugt. Die Schwingeinheit ist weiter so ausgelegt, dass sie eine Schwingungsamplitude von mindestens ca. 10 μm und vorzugsweise von mindestens ca. 100 μm erzeugt.
Dieser Dosierapparat kann weiterhin Mittel zur Positionierung umfassen, um das Rohr und die Faser in Bezug zu einem Substrat von einer vorgewählten seitlichen Position auf eine andere zu positionieren. In einer Ausführungsform ist das Mittel zur Positionierung wirkend mit dem Rohr, der Faser und dem Mittel zur Schwingungserzeugung verbunden. Das Mittel zur Positionierung kann Vorrichtungen umfassen wie oben im Hinblick auf die Betupfungsvorrichtung ausgeführt.
Im Betrieb kann die Faser 12 in einer Hin- und Her-Bewegung axial innerhalb des die Flüssigkeit enthaltenden Rohrs bewegt werden. Diese Schwingbewe gung findet bei einer Frequenz, einer Amplitude und während einer Dauer statt, die ausreichend sind, um durch die Öffnung 16 am unteren Ende des Rohrs 14 eine gewählte Menge flüssiges Reagens 18 zu pumpen, so dass sich dort ein hängender Tropfen bildet, wie in 5 an Position 18a dargestellt. Dieser hängende Tropfen kann auf einen gewählten Bereich eines Substrats aufgebracht werden, indem der Tropfen 18a mit dem gewählten Substratbereich in Kontakt gebracht wird. Die Faserspitze 12a wird dazu bewegt, bis sie das Substrat berührt. Diese Berührung kann periodisch sein, d.h. einmal pro Schwingung der Faser erfolgen, oder sie kann dauernd sein, dergestalt, dass die Faser während ihres ganzen Schwingungszyklus das Substrat berührt. Es ist zu beachten, dass die Ausbildung einer solchen "Flüssigkeitsbrücke" wie in 6 gezeigt, die Erzeugung von relativ großen Reagens-Tupfen ermöglicht.
In den 7A bis 7E ist eine weitere beispielhafte erfindungsgemäße Betupfungsvorrichtung dargestellt. Ähnlich wie bei den vorhergehenden Ausführungsformen erstreckt sich längs innerhalb eines Rohrs 14 mit der unteren Öffnung 16 eine biegsame Faser 12. In dieser Ausführungsform verjüngt sich allerdings der Innendurchmesser des Rohrs 14 zunehmend nach unten bis auf einen Rohr-Endbereich mit definiertem Volumen, der allgemein mit 14a bezeichnet wird und im Wesentlichen einen gleichmäßigen Durchmesser aufweist. Der Durchmesser des Rohr-Endbereichs 14a ist vorzugsweise im Wesentlichen derselbe wie der Durchmesser der Öffnung 16. Weiterhin liegt der Innendurchmesser entlang des Rohr-Endbereichs 14a in der Nähe der Öffnung 16 sehr nahe (z.B. innerhalb 10 μm) beim Durchmesser der Faser 12 und ist vorzugsweise im Wesentlichen zu ihm identisch. In einer Ausführungsform zum Beispiel sind sowohl der Durchmesser der Faser und der Innendurchmesser des Rohrs längs des Bereiches 14a geringer als ca. 200 μm und betragen vorzugsweise ca. 100 μm. In einer anderen Ausführungsform betragen beide Werte ca. 50 μm. Der obere Teil des Rohrs mit größerem Durchmesser kann als Vorratsbehälter 20 dienen, um während des Betupfungsvorgangs flüssiges Reagens in den unteren Teil des Rohrs zu leiten.
Mittel zur Verschiebung sind wirkend mit Faser 12 verbunden, um die Faser von ihrer angehobenen in ihre abgesenkte Stellung zu verschieben. Weiterhin kann die Vorrichtung Mittel zur Positionierung umfassen, um das Rohr und die Faser in Bezug zu einem Substrat von einer vorgewählten seitlichen Position auf eine andere zu positionieren. In einer Ausführungsform ist das Mittel zur Positionierung wirkend mit dem Rohr, der Faser und dem Mittel zur Schwingungserzeugung verbunden. Das Mittel zur Verschiebung und das Mittel zur Positionierung können Vorrichtungen umfassen wie oben ausgeführt.
Die Schritte beim typischen Betrieb der Vorrichtung sind in zeitlicher Reihenfolge in den 7A bis 7E dargestellt. Zu Anfang verschieben die (hier nicht gezeigten) Mittel zur Verschiebung die Faser 12 von ihrer angehobenen Stellung in 7A in Richtung zu einem Substrat, wie z.B. Objektträger 22. Solange sich Faser 12 in ihrer angehobenen Stellung befindet, liegt ihre Spitze 12a oberhalb des Rohr-Endbereichs 14a. Wird Faser 12 nun von ihrer angehobenen in ihre abgesenkte Stellung verschoben, so wird das im Rohr-Endbereich 14a befindliche flüssige Reagens-Volumen 18, wie in 7B dargestellt, aus dem Rohr 14 gedrückt. Hat die Faser ihre abgesenkte Stellung erreicht, wie in 7C gezeigt, wird das herausgedrückte flüssige Reagens an einen ausgewählten Bereich 22a des Substrats 22 übertragen. Wenn Faser 12, wie in den 7D und 7E gezeigt, wieder in die angehobene Stellung zurück verschoben wird, verbleibt auf der Oberfläche von Substrat 22 ein Tupfen flüssigen Reagens 28. Wenn die Faser völlig in den Flüssigkeitsbehälter (7E) zurückgezogen ist, kann auf Wunsch ein neuer Aufbring-Zyklus ablaufen.
Wie bei den vorherigen Ausführungsformen, bei denen zwischen Faser und Substrat eine Berührung stattfand, ist zu beachten, dass die Einhaltung einer exakten Toleranz zwischen Betupfungsvorrichtung und Substrat für erfolgreiche Ergebnisse mit der soeben beschriebenen Betupfungsvorrichtung nicht kritisch ist. Ihre Biegsamkeit ermöglicht es der Faser, sich in vorteilhafter Weise zu biegen oder zu krümmen wenn die Spitze auf die Substratoberfläche auftrifft, wie in 7C zur besseren Verdeutlichung in übertriebener Weise gezeigt. Das bedeutet, dass eine Durchbiegung der Faser unterschiedliche Abstände zwischen unterem Ende der Betupfungsvorrichtung und Substratoberfläche ausgleichen kann. Ebenso ist zu berücksichtigen, dass die Unkomprimierbarkeit der Faser in Längsrichtung für eine wirksame Übermittlung der Bewegung der Mittel zur Verschiebung zur Faserspitze hin sorgt.
Gemäß einem anderen ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung einen Betupfungskopf zum Aufbringen einer Anordnung von Tupfen eines flüssigen Re agens auf einem Substrat vor. Wie unten näher ausgeführt, kann der erfindungsgemäße Betupfungskopf eine große Anzahl von Tupfen aufbringen, z.B. Hunderte oder Tausende Tupfen pro Sekunde.
Die 8 zeigt eine Ausführungsform des Betupfungskopfes. Bei dieser Ausführungsform umfasst eine Vorrichtung mit Kanälen 101, die im Folgenden auch Verteilerblock genannt wird, eine Vielzahl von Kanälen, wie z.B. 114a–114b. Jeder Kanal 114a, 114b hat obere und untere Öffnungen, wie in der Zeichnung mit 115a–115b und 116a–116b bezeichnet. Diese Kanäle stehen in fester, räumlicher Anordnung zueinander. Bei einer Ausführungsform haben die Kanäle die Form von Röhren, Fässern oder Trichtern, die auf einem Rahmen oder Gestell befestigt sind (z.B. durch Einklipsen). Bei einer anderen Ausführungsform sind die Kanäle aus einem Teil gefertigt. Die Kanal-Anordnung kann beispielsweise durch ein Spritzgussverfahren aus einem Stück Kunststoff gefertigt werden, oder jeder Kanal kann durch eine Bohrung in einem Block aus Metall oder einem anderen Werkstoff, wie z.B. Glas, Kunststoff, oder ähnlichem hergestellt werden.
Der Innendurchmesser jedes Kanals verjüngt sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung. Die Kanäle können z.B. eine konische oder hornartig gebogene Form haben. Die Längsachse der Kanäle kann gerade abgewinkelt oder gebogen sein, oder eine andere geeignete Form aufweisen. Zur Verdeutlichung wird auf die im allgemeinen S-förmigen Kanäle gemäß 8 verwiesen.
Jeder Kanal mündet am unteren Ende in einen Bereich oberhalb der Öffnung mit kapillaren Abmessungen, dergestalt dass eine sich im Kanal befindende Flüssigkeit, z.B. eine biologische Probe oder eine Reagens-Lösung, durch die Kapillarkräfte normalerweise darin zurückgehalten wird. Im Rahmen der Erfindung kann hierzu jeder Innendurchmesser verwendet werden, der den gewünschten Kapillareffekt hervorruft. Für den kapillaren Bereich können beispielsweise Innendurchmesser von weniger als ca. 1 mm und vorzugsweise von weniger als ca. 200 μm benutzt werden. Um den Kapillareffekt noch weiter zu unterstützen, lässt sich die Innenseite des kapillaren Bereichs in jedem Kanal mit einer hydrophilen Oberfläche versehen.
In 8 sind lediglich sechs nebeneinander in einer Reihe angeordnete Kanäle gezeigt, es ist jedoch völlig einsichtig, dass jede vernünftige Anzahl von Kanälen in jeder gewünschten räumlichen Konfiguration angeordnet werden kann. Der Verteilerblock kann beispielsweise 24, 48, 96, 384, 1024, 1536 Kanäle oder noch mehr umfassen. Bei einer solchen Aufteilung werden die Öffnungen an den oberen und unteren Kanalenden üblicherweise nach einem regelmäßigen Muster angeordnet, z.B. als 8 × 12-, 16 × 24-, 32 × 32- oder 32 × 48-Matrix, wobei andere Anordnungen jederzeit möglich sind.
Der mit 105 bezeichnete Träger ist für eine Bewegung zwischen einer angehobenen und einer abgesenkten Stellung im Verteilerblock 101 ausgelegt. In der in 8 gezeigten Ausführungsform besteht die Anordnung aus einem Rahmen, wie z.B. 107, mit einer Führung, die aus parallelen, zueinander beabstandeten linearen Schienenabschnitten, bezeichnet mit 109a und 109b, besteht, in denen der Träger 105 geführt wird. Träger 105 kann beispielsweise an jedem seiner Seitenteile in der Nähe der Schienenführungen 190a, 109b mit einer (hier nicht gezeigten) Nut oder einem Schlitz versehen sein, in welchen die jeweilige Schienenführung gleitend eingreift.
Bewegung und Positionierung des Trägers 105 in den Führungen kann durch manuelle oder automatische Mittel zur Verschiebung erfolgen. Durch zusätzliche Bezugnahme auf 9 ist ersichtlich, dass eine Antriebseinheit 121 über die Steuerung 123 mit einer Stromversorgung 125 in Verbindung steht. Ein biegsamer Draht oder Leitung 127 erstreckt sich zwischen Antrieb 121 und Träger 105. Ein Ende des Drahts 127 ist an der Oberseite von Träger 105 befestigt. Das andere Ende des Drahts 127 ist an einer Trommel (hier nicht gezeigt) befestigt, die ihrerseits durch Antrieb 121 in Drehung versetzt werden kann. In einer Betriebsart kann die Antriebseinheit 121 die Trommel so drehen, dass der Draht 127 auf sie aufgewickelt und dadurch Träger 105 in seinen Führungen nach oben verschoben wird (8). In einer anderen Betriebsart dreht die Antriebseinheit 121 die Trommel in Abwickelrichtung, so dass der Draht länger wird und sich der Träger in seinen Führungen in die abgesenkte Stellung bewegt. Anstelle eines Drahts sehen andere Ausführungsformen für die mechanische Verbindung zwischen Antrieb und Träger den Einsatz eines Getriebes vor. Hierbei ist anzumerken, dass andere automatische Mittel zur Verschiebung, wie etwa hydraulische oder pneumatische Aktuatoren, ebenfalls hierfür verwendet werden können. Alternativ kann der Träger 105 auch manuell verschoben werden.
Am Träger 105 sind eine Vielzahl von Fasern, wie etwa die Lichtwellenleiter 112a–112b, befestigt, um sich mit ihm zu bewegen. Diese Fasern lassen sich in jeder geeigneten Weise am Träger befestigen. Beispielsweise kann der obere Endbereich jeder Faser in eine entsprechende Bohrung an der Unterseite von Träger 105 eingesteckt werden. Das obere Ende jeder Faser kann dann zum Beispiel durch Reibkräfte und/oder durch herkömmliche Klebstoffe in der Bohrung festgehalten werden. Die Fasern sind so angeordnet, dass der Abstand benachbarter Fasern im Wesentlichen mit dem Abstand benachbarter oberer Öffnungen am Verteilerblock 101 übereinstimmt, so dass jeweils eine Faser in den Kanal eindringt, wenn Träger 105 in seine abgesenkte Stellung verschoben wird. In einer typischen Anordnung sind die Fasern in einem regelmäßigen Muster angeordnet. Der Durchmesser der sich vom Träger 105 erstreckenden Fasern ebenso wie der Innendurchmesser des kapillaren Bereiches in jedem Kanal können ähnlich sein, wie die bei den vorhergehenden Ausführungsformen beschriebenen. In einer beispielhaften Anordnung beträgt der Durchmesser jedes Kanals weniger als 200 μm und jeder Kanal ist zwischen ca. 10–100 μm größer als die zugehörige Faser. In einer anderen Anordnung ist der Innendurchmesser im unteren Endbereich jedes Kanals im Wesentlichen gleich dem zugehörigen Faserdurchmesser.
Bei Bewegung des Trägers 105 in seine untere Stellung bewegt sich die untere Spitze jeder Faser durch den entsprechenden Kanal im Verteilerblock 101 und erreicht dabei eine Ebene, in der sich ein Substrat befinden kann. Wenn sich, wie in 9 gezeigt, ein Substrat wie z.B. Objektträger 22, in dieser Ebene befindet, berührt die Spitze der Faser das Substrat an dieser Stelle. Auf diese Weise kann jede Faser eine abgezählte Menge flüssigen Reagens aus ihrem zugehörigen Kanal auf die Substratoberfläche übertragen. Anzumerken ist, dass die Anordnung der unteren Öffnungen am Verteilerblock 101 die Anordnung der Tupfen auf Substrat 22 definiert.
Wie am besten in 8 ersichtlich, haben nicht alle sich vom Träger 105 erstreckenden Fasern dieselbe Länge. Sie sind im Gegenteil so abgeschnitten, dass sie beim Absenken durch ihre jeweiligen Kanäle hindurch alle etwa zur selben Zeit das darunter liegende Substrat berühren, oder zumindest kurz hintereinander. Die jeweils geeignete Faserlänge lässt sich finden, indem die Fasern durch ihre Kanäle hindurch gesteckt und anschließend auf derjenigen Ebene abgeschnitten werden, in der sich später die Oberfläche eines Substrats befindet. Für die einwandfreie Funktion der Erfindung ist es nicht erforderlich, dass die verschiedenen Fasern mit hoher Genauigkeit auf der Substratebene abgeschnitten werden, da sich Unterschiede zwischen der aus dem Kanalende überstehenden Faserlänge und dem Berührungspunkt auf dem Substrat durch Biegung der Faser ausgleichen lassen.
Für Anwendungen, bei denen eine Anordnung von Reagens-Tupfen mit identischem Mittenabstand oder mit einem Rastermaß zwischen benachbarten Tupfen und damit zwischen benachbarten Fasern der Faser-Anordnung erforderlich ist, kann das Rastermaß sowohl zwischen den oberen als auch den unteren Öffnungen etwa gleich groß gemacht werden. In einer Ausführungsform kann beispielsweise (i) die Faseranordnung, (ii) die Anordnung der oberen Öffnungen und (iii) die Anordnung der unteren Öffnungen jeweils im Wesentlichen denselben Mittenabstand aufweisen. Für Anwendungen bei denen die Anordnung der Reagens-Tupfen ein geringeres Rastermaß als die Faser-Anordnung aufweisen muss, ist es dagegen vorteilhaft, eine Vorrichtung mit Kanälen zu verwenden, bei denen sich das Rastermaß der oberen und unteren Öffnungs-Anordnungen ebenfalls unterscheidet. Bei einer beispielhaften Ausführungsform dieser Art hat die Anordnung der unteren Öffnungen einen geringeren Mittenabstand als die Anordnung der oberen Öffnungen. Die 8 und 9 zeigen beispielsweise eine Ausführungsform bei der der Mittenabstand der unteren Öffnungen wesentlich kleiner ist als derjenige der oberen Öffnungen. Das Rastermaß des Mittenabstands bei den unteren Öffnungen kann beispielsweise ca. 1/2 bis 1/4 so groß sein wie dasjenige der oberen Öffnungen. Bei einer bestimmten Ausführungsform ist der Mittenabstand der unteren Öffnungen ca. 1/3 so groß wie derjenige der oberen Öffnungen.
Gemäß einer Ausführungsform wird eine Vielzahl von Substraten nacheinander unter den Betupfungskopf transportiert. Beispielsweise kann ein Förderband eine Anzahl von paarweise nebeneinander liegenden Substraten auf einem Transportweg unter einem Verteilerblock hindurch transportieren. In den Kanälen des Verteilerblocks kann sich eine Art von Reagens-Flüssigkeit oder können sich verschiedene Arten von Reagens-Flüssigkeiten befinden. Sobald ein Substrat unter dem Verteilerblock positioniert ist, kann das Förderband anhalten. Nun können die Fasern zwischen ihren angehobenen und ihren abgesenkten Stellungen verschoben werden, um auf dem Substrat eine Anordnung von Tupfen abzulegen. Falls gewünscht, kann die Faserbetätigung einmal oder mehrmals wiederholt werden, um zusätzliche Flüssigkeit auf das Substrat aufzubringen. Diese zusätzliche Flüssigkeit kann auf die bereits vorhandenen Tupfen aufgebracht werden oder durch eine inkrementelle Lateralbewegung des Substrats unter dem Verteilerblock auf bisher unbetupfte Bereiche des Substrats. Das derart betupfte Substrat kann nun unter dem Verteilerblock wegtransportiert werden und ein neues, vorgelagertes, Substrat kann der Betupfung zugeführt werden. Falls gewünscht, lassen sich mehrere Betupfungsköpfe entlang eines Transportweges an entsprechenden Positionen anordnen. Bei einer Ausführungsform transportiert ein Förderband eines oder mehrere Substrate auf einem Transportweg, der unter verschiedenen Betupfungsköpfen entlang läuft, die jeweils seitlich gegeneinander versetzt sind. Mit dieser Anordnung lässt sich eine sehr enge Anordnung von Tupfen auf einem bestimmten Substrat erreichen, obwohl die von einem einzelnen Kopf aufgebrachten Tupfen einen größeren Abstand zueinander hatten.
Das Auswechseln eines Satzes von flüssigen Reagenzien gegen einen anderen oder der Tausch eines leeren Verteilerblocks gegen einen gefüllten lassen sich schnell und effizient durchführen. Beispielsweise kann ein Bediener oder ein Roboter den aktuellen Verteilerblock einfach herausnehmen und einen anderen dafür einsetzen. Zu diesem Zweck kann der Verteilerblock so konstruiert sein, dass er in den Rahmen lösbar einrastet. Wird ein Verteilerblock mit einem ersten Satz flüssiger Reagenzien gegen einen Verteilerblock mit einem zweiten unterschiedlichen Satz solcher Reagenzien ausgetauscht, lässt sich auch die Faseranordnung einfach austauschen. Zu diesem Zweck lässt sich auch der Faser-Träger so konstruieren, dass er in den Rahmen lösbar einrastet.
Das Nachfüllen teil- oder ganz entleerter Kanäle im Verteilerblock lässt sich ebenfalls schnell vornehmen. Zu diesem Zweck können die oberen Öffnungen der Kanäle so groß bemessen werden (z.B. Durchmesser > 3 mm), dass sie für übliche Mittel zur Befüllung mit Flüssigkeiten, wie etwa Pipetten oder Spritzen, leicht zugänglich sind.
In einer Ausführungsform sind sowohl der Verteilerblock als auch der Faser-Träger aus relativ kostengünstigen Werkstoffen, wie z.B. Kunststoff, Metall oder Glas, mit üblichen Bearbeitungs- und/oder Gussverfahren gefertigt. Indem man Bauteile-Kosten niedrig hält, kann es kosteneffektiv sein, den gesamten Faser-Träger (mit den Fasern) und/oder den Verteilerblock wegzuwerfen, wenn auf einen neuen Satz flüssiger Reagenzien umgestellt werden soll. Das Wegwerfen eines oder beider Bauteile, anstatt sie zu reinigen und wiederzuverwenden, verhindert eine mögliche Kontaminationsursache. Außerdem spart man durch den Einsatz von Wegwerfartikeln Zeit, Geräte und Laborkosten, die für Reinigung und Trocknung anfallen würden. Im Gegensatz dazu müssen die meisten herkömmlichen Betupfungssysteme, wie etwa Federkiele, Pens oder Tintenstrahl-Vorrichtungen, gereinigt werden, bevor man eine neue Flüssigkeit verwenden kann.
Die oben beschriebenen Betupfungsvorrichtungen und -verfahren ermöglichen eine Flüssigkeits-Aufbringung mit relativ wenig Energie. Der Betupfungskopf kann beispielsweise in großem Umfang parallel arbeiten, so dass viele Tupfen (z.B. hundert oder tausend) pro Sekunde aufgebracht werden. Das Aufbringen eines einzelnen Tupfens ist ein relativ langsamer Vorgang. Beispielsweise kann eine einzelne Faser nur einen oder nur wenige Tupfen pro Sekunde aufbringen. Infolgedessen lassen sich die mit energiereichen Betupfungsverfahren verbundenen Probleme, wie etwa Spritzer oder ein falsch gerichteter Strahl (Satellitenbildung) und die sich daraus ergebende Kontaminierung durch die vorliegende Erfindung vermeiden.
Die hier beschriebenen Betupfungsvorrichtungen ermöglichen auch geringere Reagens-Verluste als die meisten herkömmlichen Aufbringsysteme. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die auf ein Substrat aufzubringenden Flüssigkeiten direkt aus dem Rohr oder dem Kanal auf der Substratoberfläche abgelegt, ohne Benutzung eines Zwischenbehältnisses. Es ist zu berücksichtigen, dass solche Zwischenbehältnisse normalerweise immer eine Vergeudung der Flüssigkeit bedeuten, da an ihnen anhaftende Reste und Rückstände nicht vermeidbar sind. Für Anwendungen, die eine sehr geringe Flüssigkeitsmenge erfordern (z.B. ein Mikroliter oder noch weniger) können die Zwischenbehältnisse, wie etwa die Vorratsbehälter von Tintenstrahl-Systemen oder der Schlitz in Federkielen eine unzulässig große Menge Flüssigkeit vergeuden.

Claims

Vorrichtung zur Mikro-Betupfung einer Vielzahl von voneinander getrennten Bereichen eines oder mehrerer Substrate(s) (22) mit einer vorgegebenen Menge einer biologischen Probe oder eines Reagens, umfassend: ein Rohr (14), so angelegt, dass es solche Flüssigkeiten enthalten kann, und dessen unteres Ende eine Öffnung (16) mit einem Innendurchmesser von weniger als 1 mm definiert; eine längliche, biegsame Faser (12), mit einem kleineren Durchmesser als dem Innendurchmesser der Öffnung am unteren Ende des Rohrs und mit einem freien unteren Ende, wobei diese Faser (12) innerhalb des Rohrs (14) axial verschiebbar zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen angeordnet ist, so dass das freie Ende der Faser in angehobener Stellung zur Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) beabstandet ist; Mittel zum Verschieben der Faser (12) zwischen ihren angehobenen und abgesenkten Stellungen, die mit der Faser wirkend verbunden sind; Mittel zur Positionierung des Rohrs (14) und der zugehörigen Faser (12) in ausgewählte Aufbring-Positionen seitlich des (der) Substrats(e) (22); und eine Steuereinheit (52), die mit den Mitteln zur Positionierung und zur Verschiebung wirkend verbunden ist, um nacheinander (i) das Rohr (14) und die zugehörige Faser (12) auf eine ausgewählte Aufbring-Position in Bezug auf ein Substrat (22) zu positionieren, und (ii) die Faser in ihre abgesenkte Stellung zu verschieben, um eine ausgewählte Menge der Flüssigkeit auf das Substrat (22) aufzubringen, wobei Schwankungen des Abstands zwischen dem unterem Ende des Rohrs und dem Substrat (22) durch Biegung der Faser (12) ausgeglichen werden; dadurch gekennzeichnet, dass während der Benutzung das freie Ende der Faser die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) in seiner unteren Stellung berührt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das Mittel zur Positionierung mit dem Rohr (14) und dem Mittel zur Verschiebung wirkend verbunden ist.
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei ein Werkstück-Halter zum Halten des (der) Substrats(e) (22) vorgesehen ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 3 zur Mikro-Betupfung einer vorgewählten Position auf jedem einer Vielzahl von unterschiedlichen Substraten (22) im Werkstück-Halter mit einer vorgegebenen Flüssigkeitsmenge, wobei die Steuereinheit (52) betriebsfähig ist, um das Rohr (14) nacheinander auf diese vorgewählte Position auf jedem der Substrate (22) zu positionieren.
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Durchmesser der Öffnung ca. 10 μm bis 100 μm größer ist als derjenige der Faser (12).
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei das Rohr (14) einen im Wesentlichen gleichmäßigen Durchmesser und weiterhin einen oberen Behälter (20) mit größerem Durchmesser besitzt, um die Flüssigkeit zu halten.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei sich der Innendurchmesser des Rohrs nach unten hin zunehmend bis zu einem Rohrendbereich mit definiertem Inhalt verjüngt, der den Durchmesser der Öffnung aufweist, und wobei der Durchmesser dieses Rohrendbereichs im Wesentlichen gleich ist dem Durchmesser der Faser (12), und wobei sich das Faserende in der angehobenen Stellung über dem Rohrendbereich befindet, so dass durch eine Verschiebung der Faser von ihrer angehobenen in ihre abgesenkte Stellung die im Rohrendbereich enthaltene Flüssigkeitsmenge aus dem Rohr (14) ausgestoßen wird.
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche zur gleichzeitigen Mikro-Betupfung von ausgewählten Aufbringbereichen auf einem Substrat (22) mit einer vorgegebenen Flüssigkeitsmenge, die weiterhin eine Vielzahl von Rohren (14) mit zugehörigen Fasern und Mitteln zur Verschiebung umfasst.
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die untere Rohröffnung weniger als im Wesentlichen 500 μm ist.
Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 8, wobei die untere Rohröffnung weniger als im Wesentlichen 200 μm ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Rohr (14) einen Durchmesser der unteren Rohröffnung von weniger als im Wesentlichen 100 μm hat, und wobei der Abstand zwischen Faser (12) und Rohr (14) an dessen unterem Ende weniger als im Wesentlichen 25 μm beträgt.
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die Axial-/Längsbewegung der Faser(n) (112) zwischen ihren angehobenen und abgesenkten Stellungen bei einer Frequenz von mindestens im Wesentlichen 10 Hertz erfolgt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Axial-/Längsbewegung der Faser(n) (112) zwischen ihren angehobenen und abgesenkten Stellungen bei einer Frequenz von mindestens im Wesentlichen 100 Hertz erfolgt.
Vorrichtung gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, wobei die Axial-/Längsbewegung der Faser(n) (112) zwischen ihren angehobenen und abgesenkten Stellungen mit einer Amplitude von mindestens im Wesentlichen 10 μm erfolgt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Axial-/Längsbewegung der Faser(n) (112) zwischen ihren angehobenen und abgesenkten Stellungen mit einer Amplitude von mindestens im Wesentlichen 100 μm erfolgt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Faser (112) so ausgelegt ist, dass sie während ihres Schwingungszyklus in Kontakt mit dem Substrat (22) bleibt.
Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 11, wobei das Mittel zur Verschiebung in Form eines Aktuators vorliegt.
Vorrichtung gemäß Ansprüchen 1 bis 11 und 17, wobei das Mittel zur Positionierung in Form eines X/Y-Koordinatenantriebs vorliegt.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf (einem) Substrat(en) (22), umfassend: einen Verteilerblock (101) mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen (114), jeweils so ausgelegt, um eine ausgewählte Flüssigkeit halten zu können, wobei die Kanäle (114) sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen (115, 116) besitzen, und Innendurchmesser, die sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung (115, 116) verjüngen, wobei die unteren Öffnungen die Anordnung bilden; einen Träger (105), der zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen in Bezug zum Verteilerblock (101) beweglich ist, und eine Vielzahl von biegsamen Fasern (112), die auf dem Träger getragen werden, um sich mit ihm zu bewegen, wobei jede Faser (112) ausgelegt ist, um sich im jeweils zugeordneten Kanal (114) längs bewegen können, wenn der Halter (105) zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen bewegt wird, wobei die Bewegung der Fasern (112) von ihren angehobenen in die abgesenkten Stellungen dazu dient, eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal (114) in dem Verteilerblock (101) aufzubringen, wobei die freien Enden der Fasern die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) berühren, wenn sich der Halter (105) in seiner unteren Stellung befindet; wobei der Verteilerblock (101) durch eine Anordnung mit Schnappschloss mit der Vorrichtung lösbar verbunden ist.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf (einem) Substrat(en) (22), umfassend: einen Verteilerblock (101) mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen (114), jeweils so ausgelegt, um eine ausgewählte Flüssigkeit halten zu können, wobei die Kanäle (114) sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen (115, 116) besitzen, und Innendurchmesser, die sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung (115, 116) verjüngen, wobei die unteren Öffnungen die Anordnung bilden; einen Träger (105), der zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen in Bezug zum Verteilerblock (101) beweglich ist, und eine Vielzahl von biegsamen Fasern (112), die auf dem Träger getragen werden, um sich mit ihm zu bewegen, wobei jede Faser (112) ausgelegt ist, um sich im jeweils zugeordneten Kanal (114) längs bewegen können, wenn der Träger (105) zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen bewegt wird, wobei die Bewegung der Fasern (112) von ihren angehobenen in die abgesenkten Stellungen dazu dient, eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal (114) in dem Verteilerblock (101) aufzubringen, wobei die freien Enden der Fasern die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) berühren, wenn sich der Träger (105) in seiner unteren Stellung befindet; wobei der Verteilerblock (101) herausnehmbar ist, so dass der Verteilerblock beim Betrieb herausgenommen werden kann, wenn eine neue Probe oder ein neues Reagens eingeführt wird.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf (einem) Substrat(en) (22), umfassend: einen Verteilerblock (101) mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen (114), jeweils so ausgelegt, um eine ausgewählte Flüssigkeit halten zu können, wobei die Kanäle (114) sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen (115, 116) besitzen, und Innendurchmesser, die sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung (115, 116) verjüngen, wobei die unteren Öffnungen die Anordnung bilden; einen Träger (105), der zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen in Bezug zum Verteilerblock (101) beweglich ist, und eine Vielzahl von biegsamen Fasern (112), die auf dem Träger getragen werden, um sich mit ihm zu bewegen, wobei jede Faser (112) ausgelegt ist, um sich im jeweils zugeordneten Kanal (114) längs bewegen können, wenn der Träger (105) zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen bewegt wird, wobei die Bewegung der Fasern (112) von ihren angehobenen in die abgesenkten Stellungen dazu dient, eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal (114) in dem Verteilerblock (101) aufzubringen, wobei die freien Enden der Fasern die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) berühren, wenn sich der Halter (105) in seiner unteren Stellung befindet; wobei der Träger (105) durch eine Anordnung mit Schnappschloss mit der Vorrichtung lösbar verbunden ist.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf (einem) Substrat(en) (22), umfassend: einen Verteilerblock (101) mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen (114), jeweils so ausgelegt, um eine ausgewählte Flüssigkeit halten zu können, wobei die Kanäle (114) sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen (115, 116) besitzen, und Innendurchmesser, die sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung (115, 116) verjüngen, wobei die unteren Öffnungen die Anordnung bilden, einen Träger (105), der zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen in Bezug zum Verteilerblock (101) beweglich ist, und eine Vielzahl von biegsamen Fasern (112), die auf dem Träger getragen werden, um sich mit ihm zu bewegen, wobei jede Faser (112) ausgelegt ist, um sich im jeweils zugeordneten Kanal (114) längs bewegen können, wenn der Träger (105) zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen bewegt wird, wobei die Bewegung der Fasern (112) von ihren angehobenen in die abgesenkten Stellungen dazu dient, eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal (114) in dem Verteilerblock (101) aufzubringen, wobei die freien Enden der Fasern die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) berühren, wenn sich der Träger (105) in seiner unteren Stellung befindet; wobei der Träger (105) herausnehmbar ist, so dass der Träger im Betrieb herausgenommen werden kann, wenn eine neue Probe oder ein neues Reagens eingeführt wird.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf (einem) Substrat(en) (22), umfassend: einen Verteilerblock (101) mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen (114), jeweils so ausgelegt, um eine ausgewählte Flüssigkeit halten zu können, wobei die Kanäle (114) sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen (115, 116) besitzen, und Innendurchmesser, die sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung (115, 116) verjüngen, wobei die unteren Öffnungen die Anordnung bilden; einen Träger (105), der zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen in Bezug zum Verteilerblock (101) beweglich ist; und eine Vielzahl von biegsamen Fasern (112), die auf dem Träger getragen werden, um sich mit ihm zu bewegen, wobei jede Faser (112) ausgelegt ist, um sich im jeweils zugeordneten Kanal (114) längs bewegen können, wenn der Träger (105) zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen bewegt wird, wobei die Bewegung der Fasern (112) von ihren angehobenen in die abgesenkten Stellungen dazu dient, eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal (114) in dem Verteilerblock (101) aufzubringen, wobei die freien Enden der Fasern die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) berühren, wenn sich der Träger (105) in seiner unteren Stellung befindet; wobei jeder Kanal (114) eine hydrophile Innenfläche besitzt.
Vorrichtung zur Erzeugung einer Anordnung von Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf (einem) Substrat(en) (22), umfassend: einen Verteilerblock (101) mit einer Vielzahl von Kapillarkanälen (114), jeweils so ausgelegt, um eine ausgewählte Flüssigkeit halten zu können, wobei die Kanäle (114) sich gegenüberliegende obere und untere Öffnungen (115, 116) besitzen, und Innendurchmesser, die sich auf dem Weg von der oberen zur unteren Öffnung (115, 116) verjüngen, wobei die unteren Öffnungen die Anordnung bilden; einen Träger (105), der zwischen angehobenen und abgesenkten Stellungen in Bezug zum Verteilerblock (101) beweglich ist; eine Vielzahl von biegsamen Fasern (112), die auf dem Träger getragen werden, um sich mit ihm zu bewegen, wobei jede Faser (112) ausgelegt ist, um sich im jeweils zugeordneten Kanal (114) längs bewegen können, wenn der Träger (105) zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen bewegt wird, wobei die Bewegung der Fasern (112) von ihren angehobenen in die abgesenkten Stellungen dazu dient, eine ausgewählte Flüssigkeitsmenge aus jedem Kanal (114) in dem Verteilerblock (101) aufzubringen, wobei die freien Enden der Fasern die Oberfläche des (der) Substrats(e) (22) berühren, wenn sich der Träger (105) in seiner unteren Stellung befindet; wobei jeder Kanal (114) eine hydrophobe Außenfläche besitzt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei der Abstand zwischen benachbarten oberen Öffnungen (116) größer ist als der zwischen benachbarten unteren Öffnungen (115).
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 25, die weiterhin Mittel zur Verschiebung enthält, die wirkend mit dem Träger (105) verbunden sind, um diesen zwischen seinen angehobenen und abgesenkten Stellungen zu verschieben.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei der Durchmesser der Kanäle an deren unterem Ende weniger als ca. 200 μm beträgt und von ca. 10 bis ca. 100 μm größer ist als der Durchmesser der zugehörigen Faser (112).
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei der Durchmesser jeder unteren Öffnung (116) im Wesentlichen derselbe ist wie derjenige der Faser.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 28, wobei jeder Kanal (114) in seinem unteren Endbereich bis zu seinem unteren Ende einen im Wesentlichen gleichmäßigen Durchmesser aufweist, wobei der Durchmesser jedes Kanal-Endbereichs im Wesentlichen derselbe ist wie der der zugehörigen Faser (112), und wobei sich das Ende der Faser in ihrer angehobenen Stellung über dem Endbereich des Kanals befindet, so dass durch eine Verschiebung der Faser (112) von ihrer angehobenen in ihre abgesenkte Stellung die im Kanal-Endbereich enthaltene Flüssigkeitsmenge aus dem Kanal (114) ausgestoßen wird.
Verfahren zum Bilden eines oder mehrerer Tupfen einer biologischen Probe oder eines Reagens auf einem Substrat (22) durch Benutzung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Ansprüchen 19 bis 24, umfassend: eine wechselseitige Bewegung einer länglichen Faser (12) im Innern einer Kapillarröhre (14), die eine ausgewählte Flüssigkeit enthält, mit einer Frequenz und einer Amplitude, die ausreichend sind, um einen Teil der Flüssigkeit durch eine Öffnung (16) am unteren Ende des Rohrs (14) nach außen zu pumpen, so dass sich ein hängender Tropfen bildet; und Positionierung des hängenden Tropfens auf einem ausgewählten Bereich des Substrats (22); wobei Faser (12) biegsam ist; und wobei der hängende Tropfen auf das (die) Substrat(e) (22) aufgebracht wird, indem ein Ende der Faser (12) mit dem ausgewählten Bereich des Substrats (22) in Kontakt gebracht wird.