DE60016947T2 - Template Abhängige Ligierung mit PNA-DNA chimerischen Sonden - Google Patents

Template Abhängige Ligierung mit PNA-DNA chimerischen Sonden Download PDF

Info

Publication number
DE60016947T2
DE60016947T2 DE60016947T DE60016947T DE60016947T2 DE 60016947 T2 DE60016947 T2 DE 60016947T2 DE 60016947 T DE60016947 T DE 60016947T DE 60016947 T DE60016947 T DE 60016947T DE 60016947 T2 DE60016947 T2 DE 60016947T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
pna
probe
chimera
ligation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60016947T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60016947D1 (de
Inventor
Michael Egholm
Caifu Chen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Biosystems LLC
Original Assignee
Applera Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applera Corp filed Critical Applera Corp
Publication of DE60016947D1 publication Critical patent/DE60016947D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60016947T2 publication Critical patent/DE60016947T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862Ligase chain reaction [LCR]

Description

  • I. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Gebiete der Enzymologie und der Nukleinsäureanaloga. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Matrizenabhängige Ligation von PNA-DNA Chimären und Oligonukleotiden mit Ligaseenzymen.
  • II. LITERATUR
    • Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) in PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Seiten 39–54.
    • Barany, F. "Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189–93 (1991).
    • Barany, F., Hood, L., Kaiser, R., Nickerson, D., Zebala, J. "New thermostable DNA ligase-obtd. using DNA from Thermus aquaticus strain HB8, used for ligation of oligonucleotides", WO 91/17239, Intl. Veröffentlichungsdatum Nov. 14, 1991.
    • Beaucage, S. und Iyer, R. "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223–2311 (1992).
    • Benson, S., Menchen, S., Theisen, P., Uphadhya, K., und Hauser, J. "Aromatic substituted xanthene dyes", WO 99/16832, Intl. Veröffentlichungsdatum Apr. 8, 1999.
    • Bergot, B., Chakerian, V., Connell, C., Eadie, J., Fung, S., Hershey, N., Lee, L., Menchen, S. und Woo, S. "Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination", U.S. Pat. No. 5,366,860, erteilt Nov. 22, 1994.
    • Blackburn, G. und Gait, M. Eds. "DNA and RNA structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2. Auflage, (1996) Oxford University Press.
    • Breipohl, G., Will, D. W., Peyman, A. & Uhlmann, E. "Novel synthetic routes to PNA monomers and PNA-DNA linker molecules", Tetrahedron 53:14671–86 (1997).
    • Bronstein, I. und Voyta, J., "Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes" U.S. Pat. No 4,931,223, erteilt Jun. 5, 1990.
    • Buchardt, O., Egholm, M., Nielsen, P., und Berg, R. "Peptide Nucleic Acids", WO 92/20702, Intl. Veröffentlichungsdatum Nov. 26, 1992.
    • Caruthers, M. und Beaucage, S. "Phosphoramidite compounds and processes", U.S. Pat. No. 4,415,732, erteilt Nov. 15, 1983.
    • Caruthers, M. und Matteucci, M. "Process for preparing polynucleotides", U.S. Pat. No. 4,458,066, erteilt Jul. 3, 1984.
    • Clegg, R., "Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids", Meth. Enzymol., 211:353–388 (1992).
    • Cook, P. "PNA-DNA-PNA Chimeric macromolecules", U.S. Pat. No. 5,700,922, erteilt Dec. 23, 1997.
    • Delahunty, C., Ankener, W., Deng, Q., Eng, J. und Nickerson, D. "Testing the feasibility of DNA typing for human identification by PCR and an oligonucleotide ligation assay", Am. J. Hum. Genetics 58:1239–46 (1996).
    • Egholm, M., Christensen, L., Dueholm, K., Buchardt, O., Coull, J., und Nielsen, P. "Efficient pH-independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine containing bis-PNA", Nucleic Acids Res. 23:217–22 (1995).
    • Egholm, M., Buchardt, O., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S., Driver, D., Berg, R. und Kim, S. "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen bonding rules", Nature 365:566–68 (1993).
    • Finn, P. J., Gibson, N. J., Fallon, R., Hamilton, A. & Brown, T. "Synthesis and properties of DNA-PNA Chimeric oligomers", Nucleic Acids Research 24:3357–63 (1996).
    • Flanagan, W., Wagner, R., Grant, D., Lin, K. und Matteucci, M. "Cellular penetration and antisense activity by a phenoxazine-substituted heptanucleotide", Nature Biotech. 17:48–52 (1999).
    • Fodor, S., Pirrung, M., Read, J., und Stryer, L. "Array of oligonucleotides on a solid substrate", U.S. Pat. No. 5,445,934, erteilt Aug. 29, 1995.
    • Grossman, P., Bloch, W., Brinson, E., Chang, C., Eggerding, F., Fung, S., Iovannisci, D., Woo, S. und Winn-Deen, E. "High-density multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence-coded separation", Nucl. Acids Res. 22:4527–34 (1994).
    • Guo, Z., Guilfoyle, R., Thiel, A., Wang, R. und Smith, L., "Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports", Nucl. Acids Res. 22:54560–65 (1994).
    • Jensen, K., Orum, H., Nielsen, P., Norden, B. "Kinetics for hybridization of peptide nucleic acids (PNA) with DNA and RNA studied with the BIAcore technique", Biochem 36:5072–77 (1997).
    • Khan, S., Menchen, S., Rosenblum, B. "Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same", U.S. Pat. No. 5,770,716, issued Jun. 23, 1998, and "Propargylethoxyamino nucleotides", U.S. Pat. No. 5,821,356, erteilt Oct. 13, 1998
    • Koppitz, M., Nielsen, P., Orgel, L. "Formation of Oligonucleotide-PNA-Chimeras by Template-Directed Ligation", J. Am. Chem. Soc., 120:4563–69 (1998).
    • Kornberg, A. in DNA Replication (1980), W. H. Freeman und Co., San Francisco, Seiten 261–76.
    • Kricka, L. in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, Seiten 3–28.
    • Kubista, M. und Svanvik, N. "Probe for analysis of nucleic acids", WO 97/45539, Intl. Veröffentlichungsdatum Dez. 4, 1997.
    • Kutyavin, I., Lukhtanov, E., Gamper, H. und Meyer, R. "Covalently linked oligonucleotide minor groove binder conjugates", WO 96/32496, Intl. Veröffentlichungsdatum Okt. 17, 1996.
    • Kyger, E., Krevolin, M. und Powell, M. "Detection of the hereditary hemochromatosis gene mutation by real-time fluorescence polymerase gene reaction and peptide nucleic acid clamping", Anal. Biochem. 260:142–48 (1998).
    • Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J. und Hood, L. "A ligase mediated gene detection technique", Science 241:1077–80 (1988).
    • Lee, L., Spurgeon, S., Rosenblum, B. "Energy transfer dyes with enhanced fluorescence", U.S. Pat. No. 5,800,996, erteilt Sep. 1, 1998.
    • Lutz, M., Will, D., Breipohl, G, Benner, S. und Uhlmann, E. "Synthesis of a monocharged peptide nucleic acid (PNA) analog and its recognition as substrate by DNA polymerase", Nucleosides & Nucleotides 18:393–401 (1999).
    • Lutz, M., Benner, S., Hein, S., Breipohl, G. und Uhlmann, E. "Recognition of uncharged polyamide-linked nucleic acid analogs by DNA polymerases and reverse transcriptatses", J. Am. Chem. Soc. 119:3177–78 (1997).
    • Menchen, S., Lee, L., Connell, C., Hershey, N., Chakerian, V., Woo, S. und Fung, S. "4,7-Dichlorofluorescein dyes as molecular probes", U.S. Pat. No. 5,188,934, erteilt Feb. 23, 1993.
    • Meyer, R. "Incorporation of modified bases in oligonucleotides" in Protocols for Oligonuocleotide Conjugates, Ed. S. Agrawal (1994) Humana Press, Totowa, N.J., pp. 73–92.
    • Mullah, B. und Andrus, A. "Solid support reagents for the direct synthesis of 3'- labeled polynucleotides", U.S. Pat. No. 5,736,626, erteilt Apr. 7, 1998.
    • Nickerson, D., Kaiser, R., Lappin, S., Stewart, J., Hood, L. und Landegren, U. "Automated DNA diagnostics using an ELISA-based oligonucleotide assay" Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:8923–27 (1990)
    • Nielsen, P., Egholm, M., Berg, R. und Buchardt, O. "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymidine-substituted polyamide", Science 254:1497–1500 (1991).
    • Rajur, S., Robles, J., Wiederholt, K., Kuimelis, R. und McLaughlin, L. "Hoechst 33258 tethered by a hexa (ethylene glycol) linker to the 5'-termini of oligodeoxynucleotide 15-mers: duplex stabilization and fluorescence properties", J. Organic Chem. 62:523–29 (1997).
    • Stanton, T., Schindele, D., Renzoni, G., Pepich, B., Anderson, N., Clagett, J. und Opheim, K. "Preparation and use of monomeric phthalocyanine reagents", WO 8804777, Intl. Veröffentlichungsdatum: Juni 30, 1988.
    • Stetsenko, D. A., Lubyako, E. N., Potapov, V. K., Azhikina, T. L. & Sverdlov, E. "New Approach to Solid Phase Synthesis of Polyamide Nucleic Acids Analogues (PNA) and PNA-DNA Conjugates", Tetrahedron Lett. 37:3571–74 (1996).
    • Takahashi, M. etal, "Thermophilic DNA ligase", J. Biol. Chem. 259:10041–47 (1984).
    • Theisen, P., McCollum, C. und Andrus, A. "Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides", in Nucleic Acid Symposium Series No. 27, Oxford University Press, Oxford, Seiten 99–100 (1992).
    • Uhlmann, E. "Peptide nucleic acids (PNA) and PNA-DNA chimeras: from high binding affinity towards biological function", Biol. Chem. 379:1045–52 (1998).
    • Uhlmann, E., Will, D. W., Breipohl, G., Langner, D. & Ryte, A. "Synthesis and properties of PNA/DNA chimeras", Angew. Chem., Intl. Ed. Eng. 35:2632–35 (1996).
    • Uhlmann, E., Peyman, A., Breipohl, G. und Will, D. "PNA: Synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties", Angew. Chem., Intl. Ed. Eng. 37:2796–2823 (1998).
    • Van der Laan, A. C. et al. "Optimization of the binding properties of PNA-(5')-DNA Chimerae", Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:663–68 (1998).
    • Van der Laan, A., Brill, R., Kuimelis, R., Kuyl-Yeheskiely, E., van Boom, J., Andrus, A. und Vinayak, R. "A convenient automated solid-phase synthesis of PNA-(5')-DNA- (3')-PNA chimera", Tetrahedron Lett. 38:2249–52 (1997).
    • Vinayak, R., van der Laan, A., Brill, R., Otteson, K., Andrus, A., Kuyl-Yeheskiely, E. und van Boom, J. "Automated chemical synthesis of PNA-DNA chimera on a nucleic synthesizer", Nucleosides & Nucleotides 16:1653–56 (1997).
    • Vinayak, R. "Process and compounds for RNA synthesis", U.S. Pat. No. 5,281,701, erteilt Jan. 25, 1994.
    • Wengel, J. "Oligonucleotide analogs", WO 99/14226, Intl. Veröffentlichungsdatum März. 25, 1999.
    • Whiteley, N., Hunkapiller, M. und Glazer, A. "Detection of specific sequences in nucleic acids", U.S. Pat. No. 4,883,750, erteilt 1989.
    • Will, D. W., Breipohl, G., Langner, D., Knolle, J. & Uhlmann, E. "The Synthesis of Polyamide Nucleic Acids using a Novel Monomethoxytrityl Protecting-Group Strategy", Tetrahedron 51:12069–12082 (1995).
  • III. HINTERGRUND
  • Die kovalente Verknüpfung von Nukleinsäuresonden durch Ligaseenzyme ist eines der nützlichsten Werkzeuge, das Molekularbiologen zur Verfügung steht. Wenn zwei Sonden an eine Matrizen-Nukleinsäure angelagert werden, wobei die beiden Sonden benachbart und zwischen ihnen keine Lücken sind, dann kann durch ein Ligaseenzym eine Phosphodiesterbindung gebildet werden (Whiteley, 1989). Die Ligationsbindung wird zwischen einem 5'-Ende einer Sonde und dem 3'-Terminus der anderen Sonde gebildet.
  • Die Vorgänge der Anlagerung und der Ligation erfordern jeweils ein hohes Maß an Genauigkeit, d.h. Komplementarität zwischen den Sequenzen der ligierenden Sonden und der Matrizen-Nukleinsäure. Beide Ereignisse sind dann ineffizient, wenn Fehlpaarungen bei der Basenpaarung auftreten. Im allgemeinen kann die DNA-Ligase zwei benachbarte Sonden nur dann verknüpfen, wenn diese eine denaturierte Matrizen-Nukleinsäure, wie ein PCR-Produkt, perfekt komplementieren (Landegren, 1988; Nickerson, 1990). Auch eine einzige Nukleotid-Fehlpaarung an oder nahe bei der Ligationsstelle der Sonden verhindert die Ligation der angelagerten Sonden.
  • Assays für die Oligonukleotid-Ligation weisen die Anwesenheit spezifischer Sequenzen in der Ziel-DNA-Probe nach. So beruhen z.B. Assays zur Allel-Unterscheidung auf Sonden, die die komplementären Sequenzen der allelen Formen zum Target darstellen. Die Ligation an eine allgemeine, zweite, zum Ziel komplementäre Sonde zeigt die Anwesenheit einer polymorphen Stelle an (Whiteley, 1989; Landegren, 1988). Das Fehlen von Ligation zeigt das Fehlen einer polymorphen Stelle an. Die Ligation kann durch nachweisbare Markierungen auf der allelischen Sonde und elektrophoretische Auftrennung der Ligationsprodukte nachgewiesen werden (Grossman, 1994).
  • Die Matrizen-abhängige Ligation einer PNA-DNA Chimäre wurde auch gezeigt (Uhlmann, 1998).
  • Es ist wünschenswert, optimierte Sonden und Verfahren zur Anlagerung und Ligation bereitzustellen. Solche Verfahren würden Assays und Test verbessern, die von höherer Präzision und Genauigkeit profitieren würden.
  • IV. ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf chimäre Moleküle von PNA und DNA Monomereinheiten und deren Verwendung in Ligationsverfahren zur Erzeugung von Ligationsprodukten. Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, dass ein Ligaseenzym eine PNA-DNA chimäre Sonde und eine zweite Sonde über einen weiten Bereich von experimentellen Bedingungen und Variablen ligieren kann. Erfindungsgemäße PNA-DNA Chimären umfassen wenigstens zwei Reste, die kovalent miteinander verknüpft sind, vorzugsweise: i) ein aufeinanderfolgender Rest von 3 bis 15 PNA-Monomereinheiten, und ii) ein aufeinanderfolgender Rest von wenigstens 2 Nukleotiden. Der Nukleotidrest hat einen ligierbaren Terminus, so dass die PNA-DNA Chimäre an eine zweite Sonde ligiert werden kann.
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Matrizen-abhängigen Ligationsprodukts bereit durch Ligieren einer PNA-DNA chimären Sonde, die in Anwesenheit einer Ligase und eines Ligationsreagenzes an eine Matrizen-Nukleinsäure angelagert ist, an eine zweite Sonde, die benachbart an die chimäre Sonde an die Matrizen-Nukleinsäure angelagert ist. Die zweite Sonde ist in der Lage, die Matrizen-abhängige Ligation zu unterstützen. Die zweite Sonde ist eine PNA-DNA Chimäre oder ein Oligonukleotid. Die zweite Sonde kann 5 bis 100 Monomereinheiten oder Nukleotide (nt) lang sein. Vorzugsweise ist die zweite Sonde 10 bis 30 nt lang. Die chimäre Sonde und die zweite Sonde können zusammen 10 bis 100 nt lang sein.
  • In einer veranschaulichenden Ausführungsform der Erfindung hat die PNA-DNA Chimäre die Formel: Px-L-Ny
  • Wobei jedes P unabhängig ein PNA-Monomer ist, x ist eine ganze Zahl von 3 bis 15, L stellt eine kovalente Verknüpfung dar zwischen P und N, jedes N ist unabhängig ein Nukleotid, y ist eine ganze Zahl von 2 bis 15, und das Ende N weist entweder eine 3'-Hydroxyl- oder eine 5'-Hydroxylgruppe auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der PNA-Rest, d.h. Px der PNA-DNA Chimäre eine 2-Aminoethylglycin-Peptidnukleinsäure.
  • Der DNA-Rest, d.h. Ny der PNA-DNA Chimäre kann aus 2'-Desoxynukleotiden (DNA), Ribonukleotiden (RNA) und modifizierten Zuckern oder Internukleotidverknüpfungen davon bestehen, insbesondere jene, die eine größerer Spezifität, Affinität, Hybridisierungsrate und chemische Stabilität verleihen.
  • Die Chimäre und/oder die zweite Sonde können mit einer nicht-radioaktiven Sonde markiert sein, so dass das Ligationsprodukt nicht-radioaktiv markiert ist. In Ausführungsformen, die eine markierte PNA-DNA Chimäre verwenden, kann die PNA-DNA Chimäre markiert sein an: (i) einer Nukleobase, z.B. an den 7-Deaza oder an den C-8 Positionen einer Purin- oder einer Deazapurinnukleobase, oder an der C-5 Position einer Pyrimidinnukleobase; (ii) an einem Zucker; (iii) am PNA-Gerüst; oder (iv) an einer Amino-, einer Sulfid-, einer Hydroxyl- und/oder an einer Carboxylgruppe. Vorzugsweise ist die Chimäre am Aminoterminus des PNA-Rests markiert. In Ausführungsformen, in denen ein markiertes Oligonukleotid verwendet wird, wird das Oligonukleotid vorzugsweise am Ende markiert, das der Ligationsstelle gegenüber liegt, 3' oder 5'. Alternativ dazu kann das Oligonukleotid an einer Nukleobase markiert sein, kann aber auch an anderen Positionen markiert sein, vorausgesetzt, die Markierung beeinflusst die Hybridisierungsaffinität oder – spezifität oder die Ligaseeffizienz nicht negativ. Markierungen können Fluoreszenzfarbstoffen, Fluoreszenzunterdrückern, Hybridisierungsstabilisatoren, Energietransfer-Farbstoffpaaren, Modifikatoren der elektrophoretischen Mobilität, chemilumineszierenden Farbstoffen, Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Enzymen und Affinitätsliganden sein. Vorzugsweise ist die Markierung nach Anregung mit Licht nachweisbar, z.B. Laserquellen bei infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Anregungswellenlängen.
  • Die PNA- und DNA-Reste der chimären Sonde sind kovalent miteinander verknüpft. Die Bindung, L, zwischen den PNA- und DNA-Resten kann eine Bindung sein, z.B. die Carbonyl-Stickstoff-Bindung in einer Amidgruppe, wobei die Reste ohne dazwischenliegende Atome oder mit einem Multi-Atomlinker verknüpft werden. Die Verknüpfung kann eine Phosphodiestergruppe oder eine Phosphoramidatgruppe umfassen.
  • Die Matrize oder Ziel-Nukleinsäure kann jede Nukleinsäure/jedes Nukleinsäureanalog sein, das matrizengerichtete-Nukleinsäuresynthese vermitteln kann. Beispiele für geeignete Matrizen-Nukleinsäuren umfassen z.B. genomische DNA, DNA-Verdauprodukte, DNA-Fragmente, DNA-Transkripte, Plasmide, Vektoren, virale DNA, PCR-Produkte, RNA und synthetische Nukleinsäuren. Die Matrizen-Nukleinsäure kann auch ein Metaphasen- oder ein Interphasenchromosom sein. Vorzugsweise wird das Chromosom vor der PNA-DNA Chimärenhybridisierung und Ligation denaturiert. Matrizen-Nukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngig sein und können je nach Anwendung von 20–30 als auch viele Millionen Nukleotide (nt) oder Basenpaare (bp) lang sein. Die Matrizennukleinsäure, die PNA-DNA Chimäre oder die zweite Sonde können auf einem festen Substrat immobilisiert sein. Ligationen können durchgeführt werden, wobei eine der Sonden oder die Matrize an einen festen Träger oder eine Oberfläche angeheftet ist.
  • V. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1. Strukturen von PNA und PNA-DNA Chimären mit: (1A) zwei 2'-Desoxynukleotiden, und (1B) drei 2'-Desoxynukleotiden. B ist eine Nukleobase.
  • 2. Strukturen von Linkerreagenzien und Verknüpfungen: (2A) Linkerreagenzien zur Bildung von Amid- und Phosphodiesterbindungen, (2B) bis-Amidbindung von 2-(2-Aminoethoxy) Ethoxyessigsäure, und (2C) Amid, Phosphatbindung von 2-(2-Aminoethoxy)ethanol.
  • 3. Allgemeines Ligationsschema: (3A) zwischen einer 3'-Hydroxyl-PNA-DNA Chimäre und einem 5'-Phosphatoligonukleotid, dass an eine DNA-Matrize hybridisiert ist, zur Bildung eines PNA-DNA Ligationsprodukts, und (3B) Sondensequenzen und eine 38 nt lange DNA Matrize mit genauer Übereinstimmung für Ligationsexperimente.
  • 4. Gescannte Bilder von PAGE Analysen von Ligationsexperimenten: (4A oben) mit T4 DNA-Ligase und (4A unten) ohne Ligase; und (4B) quantitative Abschätzung der Ligation durch Densitometrie, SpotDenso Programm.
  • 5. Gescannte Bilder von PAGE Analysen von Ligationsexperimenten mit T4 DNA-Ligase: (5A) SYBR-Grün gefärbtes Gelbild; und (5B) Schema der Ligat6ion von PNA, PNA-DNA Chimäre, und DNA an 5'-Phosphatoligonukleotide, die an eine DNA-Matrize mit 38 nt Länge hybridisiert sind.
  • 6. Gescanntes Bild von PAGE Analysen von PNA-DNA Chimäre Ligasereaktionen, die Wildtyp- und mutierte Sequenzen nachweisen. Die Spezifität der PNA-DNA chimären Sonde: Oligonukleotidligation verglichen mit der Oligonukleotid:Oligonukleotid-Ligation.
  • 7. MALDI-TOF Massenspektroskopienanalyse der Ligationsreaktionsprodukte (7A) ohne Ligase und (7B) mit Ligase.
  • 8. Oligonukleotid-Ligationsassay (OLA) mit PNA-DNA chimären Sonden. (8A) Nachweis der Art eines Lokus mit verschiedenen Farbstoffmarkierungen; (8B) Multiplex-OLA mit fehlgepaarten Basen am 5'.Phosphat von Oligonukleotiden verschiedener Länge und/oder Mobilitätsmodifikatoren; (8C) Multiplex-OLA mit fehlgepaarter Base am 3'-Ende von PNA-DNA Chimären verschiedener Länge und/oder Mobilitätsmodifikatoren.
  • 9. Oligonukleotid-Ligationsassay mit PNA-DNA chimären Sonden zur Unterscheidung von Mutationen im menschlichen CFTR Loci: (9A) menschliche pCFTR621G-T: Exon 4; (9B) menschliche pCFTR1078delT: Exon 7; (9C) menschliche pCFTRG551D; Exon 11 (Großbuchstaben -PNA, kleine Buchstaben -DNA); (9D) OLA mit ONA10mer-DNAs3mer am CFTR Lokus 621G-T. Sichtbarmachung und Aufzeichnung unter UV-Licht (oben) und mit SYBR-Grün-Färbung (unten).
  • VI. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es wird nun ausführlich auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen. Die Erfindung wird unter Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, es ist jedoch nicht beabsichtigt, die Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken.
  • VI.1. DEFINITIONEN
  • Die folgenden Begriffe und Ausdrücke haben die folgende Bedeutung, außer ausdrücklich anders angegeben:
    „Nukleobase" bezieht sich auf einen Stickstoff-enthaltenden heterozyklischen Rest, z.B. ein Purin, eine 7-Deazapurin, oder ein Pyrimidin. Typische Nukleobasen sind Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymi, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und Ähnliche.
  • „Nukleosid" bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer Nukleobase besteht, gekoppelt an den C-1'-Kohlenstoff eines Ribosezuckers.
  • „Nukleotid" bezieht sich auf einen Phosphatester eines Nukleosids, als Monomereinheit oder innerhalb einer Nukleinsäure. Nukleotide werden manchmal als „NTP", oder „dNTP" und „ddNTP" bezeichnet, um die strukturellen Eigenschaften des Ribosezuckers genau hervorzuheben. „Nukleotid 5'-Triphosphat" bezieht sich auf ein Nukleotid mit einer Triphosphatestergruppe an der 5'-Position. Die Triphosphatestergruppe kann Schwefelsubstitutionen für die verschiedenen Sauerstoffe enthalten, z.B. ein α-Thio-Nukleotid-5'-Triphosphat.
  • Der hier verwendete Begriff „Nukleinsäure" umfasst die Begriffe „Oligonukleotid" und „Polynukleotid" und bezeichnet einzelsträngige und doppelsträngige Polymere von Nukleotidmonomeren, einschließlich 2'-Desoxyribonukleotiden (DNA) und Ribonukleotiden (RNA). Die Nukleinsäure kann vollständig aus Desoxyribonukleotiden, aus Ribonukleotiden oder chimären Gemischen daraus bestehen, die durch Internukleotid-Phosphordiesterbrückenbindungen und durch assoziierte Gegenionen, z.B. H+, NH4+, Trialkylammonium. Mg2+, Na+ und Ähnliche verbunden sind. Nukleinsäuren sind typischerweise einige monomere Einheiten, z.B. 5–40 Einheiten lang, wenn sie gewöhnlich als Oligonukleotide bezeichnet werden, bis zu mehreren tausend Einheiten von monomeren Einheiten.
  • Wann immer eine Oligonukleotidsequenz dargestellt ist, so ist dies so zu verstehen, das die Nukleotide von links nach rechts in 5'→3'-Richtung vorliegen und dass „A" für Desoxyadenosin, „C" für Desoxycytosin, „G" für Desoxyguanosin und „T" für Thymidin steht, sofern nichts anderes angegeben ist.
  • „Watson-Crick-Basenpaarung" bezieht sich auf die Wasserstoffbrücken-Basenpaarung, die in doppelsträngiger DNA häufig beobachtet wird.
  • „Anheftungsstelle" bezieht sich auf eine Stelle auf einem Rest, z.B. einer Chimäre oder einem Nukleotid, an die ein Linker kovalent angeheftet ist.
  • „Linker" bezieht sich auf einen Rest, der einen Rest an einen anderen heftet, z.B.: (i) eine Markierung an ein Oligonukleotid oder an eine PNA-DNA Chimäre, oder (ii) den PNA-Rest and einen DNA-Rest in einer PNA-DNA Chimäre.
  • „PNA-DNA Chimäre" bezieht sich auf ein Oligomer bestehend aus: (i) einem aufeinanderfolgenden Rest von PNA-Monomereinheiten und (ii) einem aufeinanderfolgenden Rest von Nukleotid-Monomereinheiten mit einem enzymatische verlängerbaren N-Terminus.
  • „Alkyl" bezieht sich auf gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes, geradkettiges, verzweigtes oder cyklisches Hydrokohlenstoff-Radikal. Dass durch Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzelnen Kohlenstoffatom eines parentalen Alkans, Alkens oder Alkys abgeleitet ist. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht beschränkender Weise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Ähnliche. IN bevorzugten Ausführungsformen besteht die Alkylgruppe aus 1–12 gesättigten und/oder ungesättigten Kohlenstoffen.
  • „Cycloalkyl" bezieht sich auf ein zyklisches Alkyradikal. Stickstoffatome mit Zykloalkylsubstituenten können Aziridinyl, Azetidinyl. Pyrrolidinyl, Piperidinyl, größerer Ringe und substituierte Formen von Heterozyklen davon bilden.
  • „Alkyldiyl" bezieht sich auf ein gesättigtes, ungesättigtes, verzweigtes, geradkettiges oder zyklisches Wasserstoffkohlenstoff-Radikal aus 1–20 Kohlenstoffatomen, mit zwei einwertigen Radikalzentren, die durch die Entfernung von zwei Wasserstoffatomen vom gleichen oder von zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen eines parentalen Alkans, Alkens oder Alkys abgeleitet sind. Typische Alkyldiylradikale umfassen in nicht-beschränkender Weise 1,2-Ethyldiyl, 1,3-Propyldiyl, 1,4-Butyldiyl und Ähnliche.
  • „Aryldiyl" bezieht sich auf ein ungesättigtes zyklisches oder polyzyklisches Wasserstoffkohlenstoff-Radikal aus 6–20 Kohlenstoffatomen mit einem konjugierten Resonanzelektronensystem und wenigstens zwei einwertigen Radikalzentren abgeleitet durch Entfernung von zwei Wasserstoffatomen von zwei unterschiedlichen Kohlenstoffatomen einer parentalen Arylverbindung. Typische Aryldiylgruppen umfassen in nicht beschränkender Weise Radikale, die von Benzol, substituiertem Benzol, Naphtalen, Antrazen, Biphenyl, und Ähnlichem abgeleitet sind.
  • „Markierung" bezieht sich auf einen nicht-radioaktiven Rest, der kovalent an einer Chimäre oder an ein Nukleotid angeheftet ist, der nachweisbar ist oder dem Ligationsverlängerungsprodukt eine erwünschte Funktionalität oder Eigenschaft verleiht.
  • „Ligation" ist die enzymatische Verknüpfung durch Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer PNA-DNA chimären Sonde und einem zweiten Sondenoligonukleotid, wenn die Chimäre und die zweite Sonde benachbart und an eine Matrizen-Nukleinsäure hybridisiert sind.
  • VI.2. PNA-DNA CHIMÄRE
  • In einem Aspekt werden in der Erfindung chimäre Sonden verwendet, die PNA- und DNA-Reste enthalten. Die PNA-Reste können jedes Gerüst aus azyklischen, achiralen und neutralen Polyamidverknüpfungen sein, an die Nukleobasen angeheftet sind. Eine bevorzugte Form des PNA-Rests ist ein Gerüst aus N-(2-Aminoethyl)-Glycin, eine peptidartige, amidverknüpfte Einheit (Buchardt, 1992; Nielsen, 1991), wie nachstehend gezeigt in einer Teilstruktur mit einem carboxyterminalen Amid:
  • Figure 00130001
  • PNA-Oligomere sind selbst keine Substrate für Nukleinsäure-verarbeitende Enzyme, wie DNA-Polymerasen (Lutz, 1999; Kyger, 1998; Lutz, 1997).
  • PNA-DNA Chimären sind Oligomere bestehend aus: 1) einem aufeinanderfolgenden Rest aus PNA-Monomereinheiten und 2) einem aufeinanderfolgenden Rest aus Nukleotiden. Die zwei Reste sind kovalent aneinander geknüpft. Der Nukleotidrest der Chimäre können 2'-Desoxynukleotide, Ribonukleotide, oder ein Gemisch daraus sein. Der Nukleotidrest der Chimäre hat einen 3'-Hydroxylterminus. Die bevorzugte Lange des PNA-Restes beträgt von 3 bis 15 PNA-Monomereinheiten, worin sich eine optimale enzymatische Aktivität, Hybridisierungsspezifität und -affinität, Ökonomie der Synthesereagenzien und Einfachheit der Chimärensynthese und -aufreinigung widerspiegelt. Die bevorzugte Länge des DNA-Rests ist die kürzeste Abfolge, die eine effiziente Ligation fördert, d.h. wenigstens 2'-Desoxynukleotide. (1A).
  • Bevorzugte Nukleobasen in einer oder mehreren PNA-Monomereinheiten umfassen in nicht beschränkender Weise Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, C-5-Alkylpyrimidine, 2-Thiopyrimidin, 2,6-Diaminopurin, C-5-Propynpyrimidin, Phenoxazin (Flanagan, 1999), 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin (Egholm, 1995), Isoguanosin, 4(3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin und 8-Oxopurine (Meyer, 1994).
  • Die erhöhte Affinität und Spezifität (Egholm, 1993; Jensen, 1997), die in der PNA-DNA Chimäre durch den PNA-Rest verliehen wird, ermöglicht die Verwendung kürzerer Sonden in Hybridisierungsexperimenten und -assays (Uhlmann und Peyman, 1998; Uhlmann, 1998; Cook; 1997; Uhlmann, 1996), Im allgemeinen sind kürzere Sonden spezifischer als die entsprechenden langen Sonden, d.h., die relative strukturelle Perturbation ist in einer kürzeren Sonde größer. Kürzere Sonden sind auch ökonomischer, d.h. billiger zu synthetisieren, und benötigen weniger Sequenzinformation zum Entwerfen. Es ist wünschenswert, Verfahren bereitzustellen, durch die PNA-DNA Chimären an Oligonukleotide ligiert werden können und an andere PNA-DNA Chimären, um PNA-enthaltenden Ligationsprodukte zu erzeugen.
  • Die Bindung des PNA-Rests in einer PNA-DNA-Chimäre an ihr DNA- oder RNA-Komplement kann entweder in einer parallelen oder in einer anti-parallelen Orientierung erfolgen. Die antiparallele Duplex, wobei der Carboxyterminus der PNA an den 5'-Terminus der komplementären DNA angelagert ist, und wobei der Aminoterminus der PNA an den 3'-Terminus der komplementären DNA angelagert ist, ist typischerweise stabiler als die parallele Duplex, wobei der Carboxyterminus der PNA an den 3'-Terminus der DNA und der Aminoterminus der PNA an den 5'-Terminus der komplementären DNA angelagert ist (Koppitz, 1998; Egholm, 1993). Die beispielhaften Chimären, die hier gezeigt werden, sind so aufgebaut, dass der PNA-Rest sich in anti-paralleler Richtung an die Zielsequenzen anlagert. Immer wenn eine PNA-Sequenz als Abfolge von Buchstaben dargestellt ist, ist dies so zu verstehen, dass der Aminoterminus auf der linken und der Carboxyterminus auf der rechten Seite ist.
  • Chimärensequenzen sind typischerweise vollständig komplementär zu einem Teil der Zielsequenz. Chimärensequenzen können jedoch auch gemischte-Base („redundante" oder „degenerierte") Stellen enthalten, wobei eine Chimärenprobe ein Gemisch aus Sequenzen mit einer oder mehreren Basenposition sein kann, die durch zwei oder mehrere unterschiedliche Nukleobasen repräsentiert sind. Die gemischte-Base Stelle kann in den PNA- oder DNA-Resten des Oligomers lokalisiert sein. Gemischte-Base Chimären sind Gemische aus Sequenzen mit variierenden Leveln von Komplementarität zu einer bestimmten Zielsequenz. Gemischte-Base Chimären können für das Zufallspriming oder dann nützlich sein, wenn die Zielsequenz unbekannt oder unsicher ist.
  • Obwohl einige Eigenschaften der Erfindung bezogen auf einzelsträngige Sonden und Zielnukleinsäuren beschrieben sind, ist es selbstverständlich, dass jede Sonde und Zielnukleinsäure auf doppelsträngige Bereiche enthalten kann. Es ist auch beabsichtigt, dass PNA-DNA Chimären Ligation eingehen können als ein oder beide Stränge einer Duplex, die mit einer zweiten Duplex ligieren, wobei beide Stränge der Duplex mit Überhängen („sticky ends") ligieren können. Wenn die chimäre Sonde in einer doppelsträngigen Form bereitgestellt wird, dann hat die chimäre Sonde ein Sticky end in dem Sinne, dass der überhängende Strang den DNA-Rest und wenigstens einen Teil des PNA-Rests enthält, der zur Zielnukleinsäure komplementär ist, und so, dass der zurückgezogene Strang der chimären Sonde, nach Hybridisierung der chimären Sonde an die Matrize entweder unmittelbar benachbart an ein terminales Ende der Zielnukleinsäure oder durch eine Lücke von einer oder mehreren Nukleotidpositionen getrennt positioniert ist. Es sind auch Matrizen von Interesse, die einen PNA-Rest aus einem oder mehreren PNA-Monomeren enthalten, die die Hybridisierung von aufeinanderfolgend hybridisierten Sonden ermöglichen.
  • PNA-DNA Sonden können durch kovalente Verknüpfungen von PNA-Monomeren und Nukleotiden in quasi jeder Kombination und Reihenfolge synthetisiert werden, unter Verwendung der jeweiligen herkömmlichen Verfahren zur Synthese von PNA-Oligomeren, DNAOlignukleotiden und RNA-Oligonukleotiden (Vinayak, 1997; Uhlmann, 1996; Van der Laan, 1997). Effiziente und automatisierte Verfahren wurden zur Synthese von PNA/DNA Chimären im Maßstab von 2–25 μmol auf käuflichen, automatisierten Synthesegeräten entwickelt, z.B. „ExpediteTM", Modelle 433A und Modell 394-Synthesegeräte (PE Biosystems) und mit käuflichen Reagenzien (Uhlmann, 1996; Vinayak, 1997; Van der Laan, 1997). IN diesem Ansatz können die Chimären kontinuierlich, in einer einzigen Säule und auf einem einzigen Synthesegerät hergestellt werden.
  • Typischerweise wird die Synthese von Chimären durch Detritylierung der 5'-Dimethoxytritylgruppe (DMT) von handelsüblichen, hoch quervernetzten, nichtquellenden Polystyrol-Kügelchen gestartet, die in einer Synthesesäule gepackt sind. Die Träger sind bei 20–30 μmol/g mit 5'-DMT Desoxynukleosiden (Abz, Gibu, Cbz, T) beladen, gekoppelt durch die 3'-Hydroxylgruppe an den Träger durch einen basenlabilen, Succinat/Hydroxymethylbenzoesäure-Linker (Vinayak, 1997). 5'-DMT, 3'-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Desoxynukleosidmonomere (Beaucage, 1992) werden in trockenen Acetonitril gelöst und gleichzeitig mit einem Tetrazolaktivator bereitgestellt und an das Träger-gebundene 5'-Hydroxyl gekoppelt. Auf die Kopplung folgt das „Capping" mit essigsaurem Anhydrid unreagierter 5'-Hydroxylgruppen und Iod-Oxidation zu den fünfwertigen Internukleotidphosphattriestern. Der DNA-Synthesezyklus wird bis zur letzten Desoxynukleosidaddition wiederholt, wobei ein 5'-Monomethoxytrityl (MMT) Aminonukleosid-Phosphoramidit dazu verwendet wird, einen 5'-Aminoterminus auf den Träger-gebundenen DNA-Rest bereitzustellen zur Kopplung eines PNA-Monomers an der Verknüpfung zwischen DNA und PNA in der Chimäre. Die MMT-Gruppe wird aufgrund ihrer Säurelabilität zum Schutz des Aminogerüsts bei der Synthese von PNA-DNA Chimären bevorzugt verwendet. Die MMT-Gruppe wird von Stickstoff unter sanften Säurebedingungen effizient und schnell entfernt, die keine Depurinierung oder anderen Schaden in der Chimäre erzeugen.
  • Zur Initiierung der Synthese des PNA-Rests wird die MMT-Gruppe mit 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan entfernt und die Aminogruppe wird mit einem PNA-Monomer und einem Kopplungsreagenz gekoppelt. Die Gerüst-Aminogruppe der PNA-Monomere wird vorzugsweise durch MMT geschützt und die Nukleobaseexozyklischen Amine werden als Abz, Gibu, und Cbz geschützt (Breipohl, 1997; Finn, 1996; Will, 1995). Jedes herkömmliche Peptidkopplungsreagenz kann verwendet werden, aber HBTU und HATU sind bevorzugte Kopplungsreagenzien. PNA-Monomere können in 1:1 DMF:Acetonitril bis zu einer Konzentration von 0,2M verdünnt werden. Vor dem Auftrag auf die Synthesesäule wird die Monomerlösung mit einem gleichen Volumen an 0.2M HBTU (O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-Tetramethyluronium-Hexafluorphosphat), ebenfalls in 1:1 DMF:Acetonitril (Vinayak, 1997), vermischt. Die Lösung wird gleichzeitig mit 0,2M Diisopropylethylamin in 1:1 DMF:Azetonitril auf die Säule aufgetragen. Die Synthesezyklen für die PNA- und DNA-Reste in einer Chimäre auf einem Model 394-Synthesegerät in einem Maßstab von 2 μmol sind nachstehend in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Tabelle 1 Synthesezyklen von PNA-DNA Chimären
    Figure 00170001
  • Nachdem die Synthese vollständig ist, kann der Aminoterminus, um Migration oder Zyklisierung zu minimieren, acetyliert werden, oder bei der Markierung als ein Nukleophil reagiert werden. Die rohe Chimäre wird vom Träger gespalten, und alle Schutzgruppen werden mit konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55°C für 8–16 Stunden entfernt. Die Chimären werden analysiert und durch reverse Phase HPLC oder Poylacrylamidgelektrophorese (PAGE) aufgereinigt, durch Massenspektroskopie analysiert und durch Korrelation der UV-Absorption bei 260 nm mit der Masse quantifiziert.
  • Chimären mit einem DNA-Rest, der Ribonukleotide umfasst können mit den geeigneten RNA-Phosphoramiditnukleosiden und/oder 5'-DMT-geschütztem Ribonukleotidträger synthetisiert werden (Vinayak, 1994). Die 2'-Hydroxylgruppe der RNA-Phosphoramidite sind typischerweise mit der tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS)-Gruppe geschützt und die exozyklischen Aminogruppen der Nukleobasen sind als Abz, Gdmf, Cbz geschützt. Nach der Synthese werden TBDMS-Gruppen mit einem Fluoridreagenz entfernt, z.B. Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran. Ansonsten sind die. Synthese-, Aufreinigungs- und Analyseverfahren für Ribonukleotid-haltige PNA-DNA Chimären im wesentlichen dieselben wie für Chimären, die nur 2'-Desoxynukleotid-haltige DNA-Reste enthalten.
  • Die Verknüpfung zwischen den PNA- und DNA-Resten der chimären Sonden kann eine direkte Verbindung sein, z.B. einen Amidbindung, gebildet durch die Aminogruppe des PNA-Rests ohne ein Atom dazwischen (1A1B). Alternativ dazu kann die Verknüpfung L eine Phosphodiester- oder eine Phosphoramidatgruppe sein. Die Bindung kann auch eine oder mehrere Einheiten eines nicht-basenpaarenden Rests wie ein Ethylenoxy umfassen, gekoppelt an die PNA- und DNA-Reste durch Amid- (2B) oder Phosphat- (2C)-Bindungen. Ethylenoxy-Bindungseinheiten zwischen den DNA- und PNA-Resten können durch Kopplungsreagenzien eingebaut werden, wie durch egschützte Formen von 2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy] Essigsäure. Der O-Linker, 2-[2-(2-Aminoethoxy]Essigsäure, wird als MMT-Amino geschützte Amid-bildende Carboxylsäure gekoppelt, oder Phosphoramiditsynthons (2A). Einer oder mehrere O-Linkereinheiten können als flexible, nicht-basenpaarende Verknüpfung zwischen den PNA- und DNA-Resten wirken. 2 zeigt einen Bis-Ethylenoxy-Acetamido-Linker (2B) und einen Bis-Ethylenoxy-Phosphat-Linker (2C). Andere beispielhafte Linker umfassen Alkyldiyl, z.B. Hexyldiyl (Vinayak, 1997) oder 1,4-Phenyldiyl (2A).
  • VI.3 OLIGONUKLEOTIDE
  • Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Oligonukleotide durch das Phosphoramiditsyntheseverfahren hergestellt, welches wegen seiner effizienten und schnellen Kopplung und wegen der Stabilität der beginnenden Nukleosidmonomere bevorzugt wird (Caruthers, 1983; Beaucage, 1983; Beaucage, 1992). Das Phosphoramiditverfahren umfasst die zyklische Anlagerung von Nukleotidmonomereinheiten an eine Oligonukleotidkette, die an einem festen Träger wächst, meistens in Richtung von 3' zu 5', wobei der 3'-Terminus am Anfang der Synthese an den festen Träger angeheftet ist. Das Verfahren wird gewöhnlicherweise mit automatisierten, käuflich erwerbbare Synthesegeräten durchgeführt (Caruthers, 1994). Typischerweise umfassen Phosphoramidit-Nukleosidmonomereinheiten:
    Figure 00190001
    wobei R1 eine Schutzgruppe oder ein Substituent ist, z.B. Cyanoethyl, Methyl, niederes Alkyl, substituiertes Alkyl, Phenyl, Aryl, und substituiertes Aryl; R2 und R3 sind Aminsubstituenten, z.B. Isopropyl, Morpholino, Methyl, Ethyl, niederes Alkyl, Zykloalkyl und Aryl; R4 ist eine exozyklische Stickstoff-Schutzgruppe wie Benzoyl, Isobutyryl, Acetyl, Phenoxyacetyl, Aryloxyacetyl, Dimethylformamid, Dialkylformamid und Dialkylacetamidin; und R5 ist eine säurelabile Schutzgruppe wie DMT, MMT, Pixyl, Trityl und Trialkylsilyl.
  • Bevorzugte Nukleobasen in einem oder mehreren Nukleosiden umfassen in nicht beschränkender Weise Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymi, 7-Deaazaadenin, 7-Deazaguanin, C-5-Alkylpyrimidine, 2-Thiopyrimidin, 2,6-Diaminopurin, C-5-Propynpyrimidin, Phenoxazin (Flanagan, 1999), 7-Deazapurin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin (Egholm, 1995), Isoguanosin, 4/3H)-Pyrimidon, Hypoxanthin und 8-Oxopurine (Meyer, 1994).
  • Bevorzugte Zucker in einem oder mehreren der Nukleosiden umfassen in nicht beschrankender Weise 2'-Desoxyribose, Ribose, und 2'- oder 3'-Ribosemodifikationen in denen die 2'- oder 3'-Positionen Wasserstoff, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Allyloxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, Methoxyethyl, Alkoxy, Phenoxy, Azido, Amino, Alkylamino, Fluor, Chlor und Brom sein können.
  • Andere bevorzugte Zucker umfassen 4'-α-anomere Nukleotide, 1'-α-anomere Nukleotide und 2',4'-verknüpfte und andere „verriegelte" bizyklische Zuckermodifikationen (Wengel 1999).
  • VI.4 LIGASEENZYME
  • Das in der Erfindung verwendete Ligaseenzym kann jede Ligase sein, die die Ligation der chimären DNA-PNA-Sonde an die zweite Sonde durchführt, wenn die chimäre Sonde und die zweite Sonde in einer Zielmatrize an benachbarte Regionen angelagert sind. DNA-Ligasen verbinden DNA-Sequenzen durch Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einem 5'-Phosphat und einem 3'-Hydroxyl auf zwei benachbarten Sonden, d.h. die unmittelbar nebeneinander hybridisiert sind (Kornberg, 1980; Whiteley, 1989). Alternativ kann das 3'-Phosphatende einer Sonde und das 5'-Hydroxyl der anderen Sonde einer Phosphodiesterbindung bilden. Erfindungsgemäß enthält eine oder beide Sonden einen PNA-Rest.
  • So kann z.B. die DNA-Ligase aus dem Bakteriophagen T4 sowohl DNA und RNA-Sequenzen verknüpfen, und sie kann entweder DNA- oder RNA-Matrizen dazu verwenden, die zu ligierenden Sequenzen anzulagern. Reaktionen, an denen nur DNA-Strange beteiligt sind, laufen mit größerer Effizienz ab. Zwei DNA-Duplizes mit basengepaarten glatten Enden können durch die Phagen-Ligase verknüpft werden. Bestimmte Ligasen benötigen Cofaktoren wie NAD oder ATP.
  • Kürzlich wurde eine Reihe von Ligasen aus thermophilen Organismen isoliert, die signifikante Aktivität oberhalb 60°C aufweisen und Bedingungen überleben, bei denen DNA denaturiert. Eine bevorzugte thermostabile Ligase ist von Thermus aquaticus (Takahashi, 1984) abgeleitet und kann auch rekombinant hergestellt werden (Barany, WO 91/17239, 1991). Die thermostabilen Ligasen zeigen auch eine verminderte Aktivität zur Verknüpfung von doppelsträngiger DNA mit glatten Enden oder kurzen komplementären Überhangenden. Diese Eigenschaften führen zu einer erhöhten Spezifität des Nachweises und sind für viele analytische Tests und Anwendungen, die eine Ligation erfordern, günstig.
  • VI.5 MARKIERUNGEN
  • Es ist wünschenswert, Verfahren bereitzustellen, durch die markierte PNA-DNA Chimären und markierte Oligonukleotide enzymatisch als Sonden gekoppelt werden können um nicht-radioaktiv markierte Ligationsprodukte zu bilden. Fluoreszenz hat Radioaktivität als bevorzugtes Nachweisverfahren für viele Ligationsexperimente und Anwendungen ersetzt, wie der Oligonukleotid-Ligationsassay und andere in vitro auf DNA-Sonden basierende diagnostische Tests. Daher sind Fluoreszenzmarkierungen eine bevorzugte Klasse von Nachweismarkierungen.
  • Markierungen, die die Hybridisierungsspezifität und -affinität erhöhen, werden ebenfalls bevorzugt, z.B. Agenzien, die an die minor groove binden. Affinitätsliganden-Markierungen sind ebenfalls bevorzugt. Biotin ist eine nützliche Affinitätsliganden-Markierung für chimäre Sonden und Oligonukleotide für das Capture und die Isolierung von Ligationsprodukten. In bestimmten Experimenten kann die Biotinmarkierung der Matrizennukleinsäure für Zwecke des Capture, der Isolierung, der Entfernung oder der Gewinnung nützlich sein.
  • Die PNA-DNA Chimären und die Oligonukleotide, die an der Ligation teilnehmen, können kovalent angeheftete Markierungen tragen. Die Markierung kann durch eine aus einer Vielzahl von bekannten Techniken ausgeführt werden, unter Verwendung von bekannten Markierungen, Verknüpfungen, Verknüpfungsgruppen, Standardreagenzien und Reaktionsbedingungen, und Analyse- und Aufreinigungsverfahren. Im allgemeinen sollte die Verknüpfung, die den Farbstoff und das Oligonukleotid oder die Chimäre verknüpft nicht (i) die Ligation stören, (ii) die Ligaseaktivität nicht hemmen oder (iii) die Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffs nicht durch z.B. Unterdrückung oder Ausbleichen negativ beeinflussen.
  • PNA-DNA Chimäre und Oligonukleotide können an Stellen markiert werden einschließlich einer Nukleobase, einem Zucker, dem Aminoethylglycin-Gerüst, Amino, Sulfid, Hydroxyl und Carboxyl. Nukleobasen-Markierungsstellen umfassen typischerweise die 7-Deaza- oder C-8 Positionen des Purins oder des Deazapurins, und die C-5 Position des Pyrimidins. Die Verknüpfung zwischen der Markierung und der Chimäre oder dem Oligonukleotid (NUC) kann eine Acetylen-Amido oder eine Alken-Amido-Verknüpfung sein (Khan, 1998). Typischerweise wird eine Carboxylgruppe auf der Markierung durch Bildung eines aktiven Esters, z.B. eines N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester aktiviert und mit einer Aminogruppe auf der Alkynylamino- oder der Alkenylamino-derivatisierten Chimäre oder Nukleotid reagiert. Die entstehende Verknüpfung ist ein 3-(Carboxy)amino-1-Propyn-1-yl mit den Strukturen:
  • Figure 00210001
  • Markierungen können an Oligonukleotide an jedem geeigneten Ende oder an internen Anheftungsstellen angelagert sein, einschließlich (i) ein Terminus, z.B. ein 5' und/oder 3' (Mullah, 1998), (ii) eine Internukleotidverknüpfung, (iii) ein Zucker, oder (iv) eine Nukleobase. Markierungen werden am effizientesten und am angenehmsten am 5'-Terminus mit Fluoreszenzfarbstoffen (FAM, HEX, TET) und anderen Markierungen eingebaut, die als Phosphoramiditreagenzien funktionalisiert wurden, als Teil des automatisierten Protokolls (Theisen, 1992).
  • Eine bevorzugte Klasse von Markierungen stellen ein Signal zum Nachweis der markierten Oligonukleotide durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz und elektrochemische Lumineszenz bereit (Kricka, 1992). Zur Markierung von Oligonukleotiden nützliche fluoreszierende Farbstoffe umfassen Fluoreszeine (Menchen, 1993), Rhodamine (Bergot, 1992), Energie-Transfer-Farbstoffe (Lee und Spurgeon, 1998), Cyanine (Kubista, 1997) und metallische Porphyrin-Komplexe (Stanton, 1988).
  • Beispiele für Fluoreszein-Farbstoffe umfassen 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',4',1,4-Tetrachlorfluorescein (TET), 2',4',5',7',1,4-Hexachlorfluorescein (HEX), 2',7'-dimethoxy-4',5'-Dichlor-6-Carboxyrhodamin (JOE) und aromatisch substituierte Xanthen-Farbstoffe (Benson, 1997). Das 5-Carboxyl, und andere Bereichs-Isomere können ebenfalls nützliche Nachweiseigenschaften haben.
  • Eine andere bevorzugte Klasse von Markierungen umfassen Fluoreszenzquencher. Das Emissionsspektrum eines Quenchers überlappt mit einem proximalen intramolekularen oder intermolekularen Fluoreszenzfarbstoff, so dass die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs im wesentlichen vermindert, oder gequencht wird, durch das Phänomen des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers „FRET" (Clegg, 1992). Ein Beispiel für FRET in der vorliegenden Erfindung liegt vor, wenn die PNA-DNA chimäre Sonde mit einem Fluoreszenzfarbstoff und die zweite Sonde mit einem Fluoreszenzquencher markiert ist. Alternativ dazu kann die Chimäre mit einem Fluoreszenzquencher und die zweite Sonde mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Vor der Hybridisierung und der Ligation ist der Fluoreszenzfarbstoff im wesentlichen ungequencht. Nach der Ligation ist der Fluoreszenzfarbstoff des Ligationsprodukts durch FRET im wesentlichen gequencht.
  • Besonders bevorzugte Quencher umfassen in nicht beschränkender Weise (i) Rhodaminfarbstoffe,,ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin (TAMRA), Tetrapropan-6-Carboxyrhodamin (ROX) und (ii) DABSYL, DABCYL, Cyaninfarbstoffe umfassend Nitrothiazolblau (NTB), Anthraquinon, Malachitgrün, Nitrothiazol und Nitroimidazol-Verbindungen und Ähnliche. Nitro-substituierte Formen der Quencher werden besonders bevorzugt.
  • Energietransfer-Farbstoffe sind eine bevorzugte Klasse von Chimären- und Oligonukleotidmarkierungen. Eine Energietransfer-Markierung umfasst einen Donorfarbstoff, gekoppelt an einen Akzeptorfarbstoff (Lee und Spurgeon, 1998). Licht, z.B. von einem Laser, in einer ersten Wellenlänge wird durch einen Donorfarbstoff, z.B. FAM absorbiert. Der Donorfarbstoff emittiert Anregungsenergie, die von dem Akzeptorfarbstoff absorbiert wird. Der Akzeptorfarbstoff fluoresziert bei einer zweiten, längeren Wellenlänge. Die Donorfarbstoff- und Akzeptorfarbstoffreste einer Energietransfer-Markierung können durch einen Linker angeheftet sein, der die 4' oder 5'-Positionen des Akzeptorfarbstoffs, z.B. FAM, und eine 5- oder 6-Carboxylgruppe des Akzeptorfarbstoffs verknüpft. Andere starre und nicht-starre Linker können nützlich sein.
  • Metall-Porphyrin-Komplexe, z.B. Aluminium-Phtalocyanin-Tetrasulfonat (Stanton, 1988) und chemilumineszierende Verbindungen, z.B. 1,2-Dioxetan chemilumineszierende Reste (Bronstein, 1990), sind auch bevorzugte Klassen von Markierungen für Chimären und Oligonukleotide.
  • Eine andere bevorzugte Klasse von Markierungen, die hier als Hybridisierungsstabilisierende Reste bezeichnet werden, umfassen in nicht beschränkender Weise Agenzien, die an die minor groove binden (Blackburn, 1996, Seiten 337–46), Interkalatoren, Polykationen, wie Poly-Lysin und Spermin, und quervernetzende funktionelle Gruppen. Hybridisierungs-stabilisierende Reste können auch die Stabilität der Basenpaarung, d.h., die Affinität, oder die Hybridisierungsrate erhöhen, was sich in den hohen Schmelztemperaturen, Tm, der Duplex zeigt. Hybridisierungs-stabilisierende Reste können auch die Spezifität der Basenpaarung erhöhen, beispielhaft dargestellt durch große Unterschiede der Tm zwischen perfekt komplementären Oligonukleotiden und Zielsequenzen und in Fällen, in denen die entstehende Duplex eine oder mehrere Fehlpaarungen bei der Watson-Crick-Basenpaarung enthält (Blackburn, 1996, Seiten 15–81). Bevorzugte Agenzien, die an die minor groove binden, umfassen Hoechst 33258 (Rajur, 1997), CDPI1-3 (Kutyavin, 1996), Netropsin und Distamycin. Andere nützliche Markierungen umfassen Modifikatoren der elektrophoretischen Mobilität, Aminosäuren, Peptide, Enzyme und Affinitätsliganden, z.B. Biotin und Digoxigenin.
  • Linker zwischen einer Markierung und der PNA-DNA Chimäre können eine Amidbindung sein, z.B. wobei die aktive Esterform einer Markierung mit einer Aminogruppe der Chimäre gekoppelt ist. Linker können auch Alkyldiyl, Aryldiyl oder eine oder mehrere Ethylenoxy-Einheiten (Rajur, 1997) umfassen.
  • VI.6 LIGATION
  • 3A zeigt ein allgemeines Schema der Ligation zwischen einer 3'-Hydroxyl PNA-DNA chimären Sonde und einem 5'-Phosphat-Oligonukleotide als zweite Sonde, hybridisiert an eine DNA-Matrize mit DNA-Ligase zur Bildung eines PNA-DNA Ligationsprodukts. Die erste Sonde hat einen 3'-Hydroxylterminus und die zweite Sonde hat einen 5'-Phosphat-Terminus. Alternativ hat die erste Sonde einen 5'-Phosphat-Terminus und die zweite Sonde hat einen 3'-Hydroxyl-Terminus.
  • Ein Ligationsgemisch umfasst im allgemeinen eine DNA-Matrize, eine PNA-DNA chimäre Sonde, eine zweite Sonde, die eine andere PNA-DNA chimäre Sonde ist oder ein Oligonukleotid, Ligase und andere Ligationsreagenzien. DNA-Sonden, die den PNA-DNA Chimären entsprechen, können als Kontrolle oder zum Vergleich verwendet werden. Unter typischen Bedingungen werden die Sonden in einer Endkonzentration von jeweils 1 μM verwendet.
  • Zusätzlich kann das Ligationsgemisch Reagenzien enthalten wie 1 × T4 DNA Ligasepuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin] und 1000 Einheiten T4 DNA Ligase plus 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase in einem Volumen von 50 μl. Das Ligationsreagenz kann auch Kofaktoren der Ligase enthalten, z.B. NAD und ATP, Polyethylenglykol, EDTA, KCl, Ammoniumsulfat, Dithiothreitol, BSA, MgCl2, Tris-HCl, Glycerin, Wasser, NaCl, Mercaptoethanol, und andere Salze und Puffer. Das Gemisch kann bei 22 bis 25°C für 3 Stunden oder langer inkubiert werden. Während der Ligation kann die Zugabe von 10 bis 20 Einheiten T4 Polynukleotidkinase für die Ligation nützlich sein.
  • Typischerweise nach der Inkubation werden die Reaktionsprodukte der Ligase bei 80°C für etwa 20 Minuten durch Hitze inaktiviert und auf Eis oder für eine kurze Zeit nach 4°C gestellt. Für die Analyse werden typischerweise 5 bis 25 pmol des Ligationsprodukts mit einer Endkonzentration von 1× Ladepuffer (45 mM Tris Base, 45 mM Borsäure, 0.4 mM EDTA, 3% Ficoll, 0.02% Bromphenolblau; 0.02 Xylencyanol) vermischt, und für 10 bis 20 Minuten bei 95°C denaturiert. Die Probe wird dann auf ein 10–15% denaturierendes PAGE-Gel geladen und in 1×TBE (89 mM Tris Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8.3) bei 100 bis 160 V, 70°C für 25–60 min aufgetrennt. Das Ligationsprodukt wird durch Färbung des Gels mit SYBR-grün (Molecular Probes, Eugene, OR) in einem Volumen von 40 bis 120 ml in 1×TBE für 10 bis 30 Minuten sichtbar gemacht. Das Bild kann in einem Geldokumentationssystem (zB ChemiImager 4000 Imaging System, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) festgehalten werden.
  • 3B zeigt die Sequenzen von Matrize und Sonde für einen Ligationsassay in einem Modellsystem. Die Sondensequenzen umfassen zwei Oligonukleotidsonden, 6nt und 9nt, und fünf PNA-DNA Chimären, die 0 bis 4 DNA 2'-Desoxynukleotide enthalten. Die Oligonukleotide und die Chimären hybridisieren an eine 38 nt DNA-Matrize. Die Matrize ist am 3'- oder 5'-Ende mit Biotin markiert, um die Isolierung und den Transfer zu erleichtern.
  • Der Oligonukleotid Ligationsassay (OLA) ist ein angenehmes, hoch-stringentes Verfahren, das die Unterscheidung zwischen bekannten DNA-Sequenzvarianten ermöglicht (Landegren, 1988). Die Multiplex-Analyse hoch polymorpher Loci ist zur Identifizierung von Individuen nützlich, z.B. bei Vaterschaftstest und in der Forensik, bei der Übereinstimmung von Donor und Empfänger bei Organtransplantationen, genetischer Krankheitsdiagnose, Prognose und bei pränataler Beratung, und anderen auf Genetik basierenden Tests, die auf der Unterscheidung von Einzelbasenunterschieden in einer Vielzahl von Loci beruhen (Delahunty, 1996). Produkte eines Multiplex Oligonukleotid Ligationsassays (OLA) können elektrophoretisch voneinander und von unligierten Sonden unter denaturierenden Bedingungen mit Fluoreszenz-Nachweis getrennt werden (Grossman, 1994). Die 8A bis 8C zeigen z.B. verschiedene Assays, wobei zwei PNA-DNA Chimären, eine Wildtyp (WT)-Sequenz Chimäre und eine Chimäre mit mutierter Sequenz verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe tragen. Nur dann, wenn die mutierte Sequenz in der Zielsonde anwesend ist, dann wird sich die Chimäre mit der mutierten Sequenz an die benachbart angelagerte zweite Sonde (Oligo) ligieren, wenn das mutierte Basenpaar an der Ligationsstelle ist (8A).
  • Die Ligationsprodukte können unterschieden werden durch Auftrennung basierend auf: (i) Größe unter Verwendung von Elektrophorese oder Chromatographie und/oder (ii) nachweisbarer Markierungen (Grossman, 1994). Wenn eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen an Chimären gekoppelt ist, wobei Sequenzen auf einzigartige Zielsequenzen gerichtet sind, dann kann die Multiplex OLA in einer einzigen Probe in einem einzigen Gefäß durchgeführt werden. Erfordernisse für eine effiziente Multiplex OLA umfassen Sonden, die in einer hochspezifischen und schnellen Weise anlagern und ligieren. Die Chimären und die Sequenzen der zweiten Sonde können so ausgewählt sein, dass die mutierte Base, oder der Einzelbasen-Polymorphismus am 5'-Phosphate der zweiten Sonde (8B) oder am 3'-Terminus der Chimäre vorliegen (8C).
  • Es ist beabsichtigt, dass erfindungsgemäße OLA Experimente auf festen Substraten durchgeführt werden, wobei die Matrizen-Nukleinsäure, die PNA-DNA chimäre Sonde, oder die zweite Sonde auf einem festen Partikel oder einem Kügelchen, oder auf einer festen porösen oder nicht-porösen Oberfläche immobilisiert sind. Nach Immobilisierung werden die Matrize, die Chimäre oder die zweite Sonde vorzugsweise kovalent an das feste Substrat angeheftet, z.B. über eine terminale Monomer-Einheit. Das feste Substrat kann Polystyrol, Glas mit kontrollierter Porengröße, Silicagel, Silica, Polyacrylamid, magnetische Kügelchen, Polyacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyethylenoxy und Copolymere und Implantate eines der vorhergehend genannten festen Substrate sein. Die Konfiguration oder das Format des festen Substrats können kleine Partikel oder Kügelchen von etwa 1 bis 50 μm Durchmesser sein, Membranen, Fritten, Objektträger, Platten, Mikrochips, Alkanethiol-Goldschichten, nicht-poröse Oberflächen und Polynukleotid-immobilisierende Medien sein.
  • Eine PNA-DNA chimäre Sonde ist z.B. durch einen Linker kovalent an den Aminoterminus einer nicht-porösen, anorganischen Oberfläche, z.B. Glas (Guo, 1994) angeheftet. Es wird zugelassen, dass sich eine Matrizen-Nukleinsäureprobe an die chimäre Sonde hybridisiert, unter Bedingungen, die die Hybridisierung fördern. Eine zweite Sonde mit einer Sequenz, die komplementär zur Matrize ist, wird zur hybridisierten Duplex zugegeben und die zweite Sonde hybridisiert an die Matrize benachbart zur chimären Sonde. Die chimäre Sonde und die zweite Sonde werden durch eine Ligase miteinander ligiert. Das ligierte Produkt kann nachgewiesen und/oder isoliert werden, wobei die chimäre Sonde, die Matrize oder die zweite Sonde eine Markierung oder einen Affinitätsliganden tragen und dadurch ein Oligonukleotids-Ligationsassay durchgeführt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Array von chimären Sonden auf einem festen Substrat aufgereiht, wobei eine chimäre Sonde bekannter Sequenz einen definierten Bereich auf einer zweidimensionalen Oberfläche besetzt. Die Anzahl von chimären Sonden auf irgendeiner bestimmten Oberfläche kann hundert oder auch Tausende betragen, begrenzt durch die räumlichen Erfordernisse für Synthese, Anheftungen und Nachweis (Fodor, 1995). Alternativ dazu kann ein Array von Sonden auf Kügelchen oder Partikeln, die in Vertiefungen oder Gefäßen enthalten sind, immobilisiert sein. Eine Matrize, oder ein Gemisch aus Matrizen kann für die Hybridisierung an die immobilisierten chimären Sonden auf der Oberfläche zugegeben werden. In Fällen, in denen eine ausreichende Sequenzkomplementarität unter den definierten Hybridisierungsbedingungen existiert, wird eine Duplexbildung auftreten. Ein Gemisch aus zweiten Sonden kann getrennt, oder mit der Matrizenprobe zur Hybridisierung zugegeben werden. In Anwesenheit von Ligase wird Ligation nur auftreten, wenn chimäre Sonden und zweite Sonden benachbart hybridisiert sind. Unhybridisierte Sonden und Matrizenproben können durch Waschen unter Bedingungen entfernt werden, die die Hybridisierung erhalten, oder unter denaturierenden Bedingungen. Wenn die zweite Sonde eine Markierung trägt, z.B. einen Fluoreszenzfarbstoff, dann wird das Ligationsprodukt kovalent auf der Oberfläche immobilisiert und kann z.B. durch Laser-induzierte Fluoreszenz nachgewiesen werden. Aus dem Wissen über immobilisierte chimäre Sonden-Sequenzen kann die Anwesenheit bestimmter Sequenzen in der Matrizenprobe aus der (den) Lokalisation(en) der nachgewiesenen Fluoreszenz auf der Array-Oberfläche abgeleitet werden.
  • In einem zweiten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Kit für die Ligation bereitgestellt. In einer Ausführungsform umfasst der Kit, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nützlich ist, z.B.: (i) eine PNA-DNA Chimäre, die von 3 bis 15 aufeinanderfolgende PNA-Monomereinheiten enthält, von 2 bis 15 aufeinanderfolgende Nukleotide, und ein 3'-Hydroxyl; (ii) eine zweite Sonde, wobei die zweite Sonde eine PNA-DNA Chimäre oder ein Oligonukleotid ist und (iii) ein Ligaseenzym und eine Matrizennukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die zur chimären Sonde komplementär ist oder im Vergleich zur chimären Sonde eine oder mehrere Fehlpaarungen enthält. Die Chimäre und/oder das Oligonukleotid können mit einer nicht-radioaktiven Markierung markiert sein. In einer anderen Ausführungsform enthält der Kit zusätzlich eine Polynukleotidkinase.
  • Aus der vorhergehenden Diskussion kann man sehen, wie verschiedene Eigenschaften und Vorteile der Erfindung erfüllt werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von ausgewählten Zielsequenzen bereit, wobei das Verfahren hoch sensitiv und akkurat ist. Ausgewählte Zielsequenzen können nachgewiesen werden unter Verwendung chimärer PNA-DNA Sonden, die zielspezifische Sequenzen enthalten, die kürzer als die von Sonden sind, die ausschließlich aus DNA bestehen, die in früheren Oligonukleotid-Ligationsassays verwendet wurden. Die chimären Sonden erfordern daher weniger Sequenzinformation über die Zielsequenz, und können weniger teuer in der Synthese sein.
  • Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung an eine Vielzahl von Zielsequenzen und Assayformate angepasst werden, und kann leicht automatisiert werden.
  • VI.7 BEISPIELE
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die lediglich beispielhaft und nicht beschränkend zu verstehen sind.
  • Beispiel 1 Markierung der PNA-DNA Chimäre
  • Markierung mit TAMRA und NTB:
  • Die Markierung wird durchgeführt mit 5 mg NHS Ester von TAMRA oder NTB, gelöst in 100 μl DMF und 10 μl DIEA. Das Markierungsgemisch wird zu der an einen Träger gebundenen PNA-DNA Chimäre hinzugegeben und für 2 bis 18 Stunden reagieren gelassen (typischerweise über Nacht). Nach der Markierung mit DMF und nach DCM vor der Spaltung wird der Träger gewaschen.
  • Markierung mit CDPI:
  • CDPI3 wird durch drei aufeinander folgende Kopplungen von Fmoc-CDPI (Lukhtanov, 1995) an den Aminoterminus einer PNA-DNA Chimäre angeheftet, um CDPI3-markierte PNA-DNA Chimären zu ergeben. Die CDPI-Monomereinheit, 1,2-Dihydro-(3H)-pyrol[3,2-e]indol-7-carboxylat, geschützt mit Fmoc (5 mg, 0.012 mmol) wird in 100 μl NMP gelöst und durch 0.95 Äquivalente HATU (0.2M in DMF) und 2 Äquivalente DIEA (0.4 M in DMF) aktiviert. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wird die aktivierte Fmoc-CDPI-Lösung zur an den Träger gebundenen Chimäre zugegeben und die Kopplung wird für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur ermöglicht. Das Harz wird nach der Kopplung mit 20 ml DMF gewaschen. Fmoc wird durch Behandlung des Harz-Trägers mit 1:4 Piperidin:DMF für 10 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Dieser Zyklus aus Kopplung und Entschützung wird weitere zwei Mal für insgesamt 3 manuelle Kopplungen durchgeführt, um zu CDPI3-markierten PNA-DNA Chimären zu führen.
  • Beispiel 2 Ligation
  • 4 zeigt Ligationsexperimente, wobei ein Ligationsgemisch eine Matrize enthielt und zwei Sonden in einer Endkonzentration von jeweils 1 μM, 1 × T4 DNA Ligasepuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin] und 1000 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) in einem Volumen von 50 μl. T4 DNA-Ligase ist auch von Boehringer Mannheim erhältlich. Etwa 70 Einheiten von NE Biolabs T4 DNA Ligase ist äquivalent zu 1 Weiss Einheit der Boehringer Mannheim T4 Ligase. Die gleichen Reaktion werden auch ohne Ligase durchgeführt. Nach Inkubation bei 22,5 bis 25°C für 3 bis 4 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf 80°C für 20 Minuten erhitzt und dann bei 4°C gelagert. Fünf ml des Reaktionsgemisches wurden auf ein 15% Polyacrylamidgel aufgetragen, wobei eine elektrophoretische Trennung bei 120–140V für 20–60 Minuten unter denaturierenden Bedingungen (7M Harnstoff) erfolgte (4A). Die Ligation der 5-Phosphat-Oligonukleotide(DNA2, DNA4 oder DNAS) an ein Oligonukleotid DNA3 oder an PNA-DNA Chimären wurden auf Matrizen durchgeführt (DNA1 oder DNA6), gemäß Tabelle 2. Die Ligation mit der T4 Ligase (oberes Gelbild) ist in den Spuren 3, 4, 6, 8, und 10 zwischen den PNA-DNA Chimären und den 5'-Phosphat-Oligonukleotiden durch das Auftreten neuer Banden evident. Die Ligation war bei den Chimären, die 6 PNA-Monomere und von 2 bis 4 2'-Desoxynukleotidmonomere aufweisen, effektiv. Die Kontrollligation zwischen zwei Oligonukleotidsonden (Spur 2) zeigt eine Ligationsprodukt-Bande. Kontrollligation nur mit einer Sonde (Spuren 1, 5, 7, 9) zeigt keine neue Bande. Experimente ohne T4 Ligase (unteres Gelbild) zeigen Banden für die Matrizen und die Sonden. Tabelle 2. Figuren 4A–4B
    Figure 00300001
    Figure 00300002
    (Großbuchstaben -PNA, Kleinbuchstaben -DNA)
  • 4B zeigt die quantitative Abschätzung der Ligasereaktionen in 4A durch Densitometrie mit dem SpotDenso Programm. Die von den Kästchen eingeschlossenen Boxen sind die 5'-Phosphat-Sonden, die nach der Ligation verbleiben. Die negativen Kontrollexperimente in den Spuren 1, 5, 7 und 9 etablierten die Konzentrationen anverbliebener 5'-Phosphat-Sonde, wenn keine Ligation auftrat. Die positiven Kontrollexperimente in Spur 2 ergaben die Ligationseffizienz zwischen Sonden, die nur aus DNA bestehen. Aus diesen quantifizierten Werten können die Ligationseffizienzen mit PNA-DNA Chimären Sonden aus den Bereichen (IDV -integrierter Dichte-Wert) in der Aufstellung (rechts) berechnet werden.
  • 5 zeigt Ligationsexperimente mit der T4 DNA Ligase mit PNA-DNA Chimären Sonden, an die 1 bis 4 DNA-Basen am 3'-Terminus des PNA-Oligomers angeheftet sind und einer zweiten Sonde, einem 5'-Phosphat-Oligonukleotid von variabler Länge (Spuren 4–7). Die Längen der Chimäre und der Oligonukleotid-Sonden werden so ausgewählt, dass sie Ligationsprodukte gleicher Lange bilden (Tabelle 3). Zusätzlich wurden Kontrollligationen durchgeführt, in denen anstelle der Chimäre, keine Sonde (Spur 2), eine vollständig aus PNA bestehende Sonde (Spur 3) und eine vollständig aus DNA bestehende Sonde, 6nt (Spur 8) und eine vollständig aus DNA bestehende Sonde, 9nt (Spur 9) verwendet wurden. Das Ligationsgemisch enthielt eine 38 nt DNA-Matrize und die zwei Sonden in einer Endkonzentration von jeweils 1μM, 1 × T4 DNA Ligasepuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin] und 1000 Einheiten T4 DNA Ligase in einem Volumen von 50 μl. Die Ligationsreaktionen wurden bei 22,5 bis 25°C für 3 bis 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch 20 Minuten lang bei 80°C erhitzt und dann bei 4°C gelagert. Fünf ml des Reaktionsgemisches wurden auf ein 15% Polyacrylamidgel aufgetragen, wobei eine elektrophoretische Trennung bei 120–140V für 20–60 Minuten unter denaturierenden Bedingungen (7M Harnstoff, 70°C) erfolgte. Danach erfolgte Färbung mit SYBR-Grün. 5 zeigt ein gescanntes Bild des gefärbten Gels. 5B ist eine schematische Darstellung der Ligation von PNA, PNA-DNA Chimäre und DNA an 5'-Phosphat-Oligonukleotide, die an eine DNA-Matrize 38 nt (SEQ ID NO:9) hybridisiert sind.
  • Aus neuen Banden unterhalb von den Matrizen-Banden ist ersichtlich, dass PNA- DNA Chimären ligiert werden, wobei die Chimäre 2, 3 oder 4 DNA-Monomere aufweist (2-Desoxynukleotide), bzw. Spuren 5–7. Bei einer Sonde, die ausschließlich aus PNA besteht und bei einer Chimäre, die nur 1 DNA-Monomer enthält, zeigt sich keine Ligation, bzw. Spuren 3 und 4. Spur 1 ist eine Negativkontrolle. Spuren 8 und 9 sind Positivkontrollen, wobei 6nt und 9nt Oligonukleotide an 5'-Phosphat-Oligonukleotide ligiert werden. Die elektrophoretische Verlangsamung der PNA in den Ligationsprodukten der Chimären, Spuren 5–7 ist offensichtlich verglichen mit den Ligationsprodukten bei ausschließlich aus DNA bestehenden Sonden, Spuren 8 und 9.
  • Tabelle 3. Figuren 5A–5B
    Figure 00320001
  • Figure 00320002
  • 5'-Phosphat-Oligos:
    19nt 5'-phos-ccatgctatgtgttgagcg-biotin (SEQ. ID NO. 8)
    20nt 5'-phos-accatgctatgtgttgagcg-biotin (SEQ.ID NO. 11)
    21nt 5'-phos-gaccatgctatgtgttgagcg-biotin (SEQ. ID NO. 12)
    22nt 5'-Phos-agaccatgctatgtgttgagcg-biotin (SEQ. ID NO. 13)
    23nt 5'-Phos-tagaccatgctatgtgttgagcg-biotin (SEQ. ID NO. 14)
  • DNA-Matrize 38 nt:
    cgctcaacacatagcatggtccagaactaagcctggaa
    (SEQ. ID NO. 16)
    (Großbuchstaben -PNA, Kleinbuchstaben -DNA)
  • 6 zeigt die Spezifität der Ligation mit PNA-DNA chimären Sonden. PNA-DNA Chimären und 5'-Phosphat-Oligonukleotide wurden auf Matrizen ligiert, als perfekte Übereinstimmungen und mit Fehlpaarungen. Ligationsgemische enthielten eine Matrize und zwei Sonden in einer Endkonzentration von jeweils 1 μM, 1 × T4 DNA Ligasepuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin] und 1000 Einheiten T4 DNA Ligase in einem Volumen von 50 μl. Die Ligationsreaktionen wurden bei 22,5 bis 25°C für 3 bis 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch 20 Minuten lang bei 80°C erhitzt und dann bei 4°C gelagert. Fünf ml des Reaktionsgemisches wurden für PAGE Analyse verwendet, wobei eine elektrophoretische Trennung bei 120–140V für 20–60 Minuten erfolgte.
  • Tabelle 4. Figur 6.
    Figure 00340001
  • DNA-Matrize
    DNA1C (SEQ. ID NO). 27)
    Biotin-cgctcaacacatagcatggcctagaactaagcctggaa
    DNA2C (SEQ. ID NO. 16)
    Biotin-cgctcaacacatagcatggtccagaactaagcctggaa
  • Phosphorylierte DNA
    DNA2 5'-Phos-gccatgctatgtgtt-Biotin (SEQ. ID NO. 17)
    DNA2A 5'-Phos-accatgctatgtgtt-Biotin (SEQ. ID NO. 18)
    DNA3 5'-Phos-ccatgctatgtgttgagcg-Biotin (SEQ. ID NO. 8)
    DNA4 5'-Phos-accatgctatgtgttgagcg-Biotin (SEQ.ID NO.11)
    DNA
    DNA9 tagttctag (SEQ. ID NO. 2)
  • PNA-DNA Chimäre
    Figure 00350001
    (Großbuchstaben -PNA, Kleinbuchstaben -DNA)
  • Die Experimente in 6 zeigen, dass PNA-DNA chimäre Sonden zum Auftreten einer Ligation ein hohes Maß an Sequenzkomplementarität benötigen. Wenn entweder in der chimären Sonde oder in der zweiten Sonde eine Fehlpaarung auftritt, dann ist keine Ligation nachweisbar, innerhalb der Grenzen des gezeigten Systems. Zum vergleich, Sonden, die vollständig aus DNA bestehen, sind weniger spezifisch. Tritt eine Fehlpaarung in einer Sonde auf, die vollständig aus DNA besteht, dann ist immer noch ein wenig Ligation zu sehen. Spur 1 ist eine positive Kontrollligation, wobei zwei Oligonukleotide mit der Matrize perfekt übereinstimmen (W) und ligieren, um ein Produkt zu bilden, dass bei der erwarteten Größe von 24 nt wandert. Das Experiment von Spur 2 weist zusätzlich eine fehlgepaarte Sonde (W+M) auf, die ligiert, was sich durch das Auftreten einer neuen Bande zwischen dem Produkt der perfekten Übereinstimmung und der Matrize (38 nt) zeigt. Die fehlgepaarte Sonde, DNA2A, hat eine Fehlpaarung an der Ligationsstelle, der A-Base am 5'-terminus der 5'-Phosphat-Sonde. Das Experiment von Spur 3 ligiert übereinstimmende PNA6-DNA3 Chimären und eine DNA2 zweite Sonde, wodurch eine neue Bande entsteht, die schneller als die Matrize wandert. Das Experiment von Spur 4 weist zusätzlich die fehlgepaarte DNA2A Sonde auf. Im Gegensatz zu dem Experiment nur mit DNA in Spur 2, ligiert die fehlgepaarte DNA2A nicht mit der Chimäre, was zeigt, dass durch den PNA-Rest eine größere Spezifität verliehen wird. Die Experimente von Spuren 5 und 7 haben in ähnlicher Weise Fehlpaarungen am 3'-Terminus der Chimären. Der 3'-Terminus der Chimäre im Experiment von Spur 8 hat eine Deletion und eine Fehlpaarung. Diese Experimente in den Spuren 5, 7 und 8 zeigen kein Ligationsprodukt. Das Experiment von Spur 6 hat eine Fehlpaarung in der DNA9-Sonde an der vorletzten Base nahe dem 3'-Terminus. In diesem Experiment ist ein Ligationsprodukt vorhanden, worin sich die niedrigere Spezifität der Ligation von Sonden zeigt, die vollständig aus DNA bestehen.
  • Zusammengefasst veranschaulichen die in 6 gezeigten Ligationsexperimente, dass PNA-DNA chimäre Sonden, wenn sie an Oligonukleotide ligiert sind, besser in der Lage sind, Basenpaar-Fehlpaarungen (Spezifität) zu unterscheiden als Ligationen zwischen Oligonukleotidsonden, die nur aus DNA bestehen, ungeachtet dessen, ob die Fehlpaarung in der chimären Sonde oder der Oligonukleotid-Sonde auftritt.
  • Beispiel 3 MALDI-TOF Analyse der Ligationsreaktion
  • Massenspektren erhielt man auf einer MALDI-TOF MS (Voyager DE, PerSeptive Biosystems, Tochtergesellschaft von PE Corporation) Workstation. Entsalzte Proben werden 1:1 mit Matrixlösung vermischt, die aus 50mg/ml Hydroxy-Picolinsäure, 50 mM Ammoniumcitrat und 30% Acetonitril besteht, und werden auf eine Probenplatte aufgetropft. „Time-of-flight"-Daten von 20 bis 50 individuellen Laserpulsen werden auf einem transienten Digitalisierer aufgezeichnet und gemittelt, wonach die gemittelten Spektren durch eine Daten verarbeitende Software automatisch in Massen umgewandelt werden. 7 von Ligationsreaktionen. Ein 3'-biotinyliertes 20 nt Oligonukleotid (Masse 6303) und eine PNA-DNA Chimäre (Masse 2539) wurden an die 5'-Biotinylierte DNA-Matrize 38 nt (Masse 12358) hybridisiert. 7 zeigt MALDI-TOF Massenspektrokopie-Analyse des Gemischs ohne Ligase. Die Analyse zeigt nur Ionenpeaks der Ausgangsmaterialien. Wenn das Ligationsgemisch Ligase enthält (7B), dann zeigt sich ein Ligationsprodukt mit der erwarteten Masse von 8823.8.
    Figure 00360001
    (Großbuchstaben -PNA, Kleinbuchstaben -DNA)
  • Beispiel 4 Multiplex Oligonukleotid-Ligationsassay für CFTR-Loci
  • OLA Reaktionen für CFTR-Loci wurden in einem Röhrchen im Multiplex-Ansatz durchgeführt. Zwei unterschiedlich markierte (d.h., FAM oder TET an der 5'-Stelle) PNA-DNA Chimären und ein 5'-phosphoryliertes DNA-Oligonukleotid wurde zur Analyse jeder Mutation verwendet. Die Sequenzen der Sonden und der Matrizen sind in 8 dargestellt. Alle Multiplex-OLA Reaktionen werden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt, enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 25 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 10 mM DTT, 1mM NAD, 0.1 % Triton X-100, 1 bis 50 nM jeder Sonde, 5 bis 10 μl von gepooltem PCR-Produkt und 2 bis 10 Einheiten thermostabile Ligase wie Thermus aquaticus Ligase. Die lineare Amplifikation des Produkts wird erreicht durch 20 bis 30 Zyklen bei 94°C für 30 sec., und 30–50°C für 1 bis 3 Minuten, gefolgt von Erhitzen auf 95°C für 10 bis 20 Minuten in einem Modell 9700 Thermocycler (PE Biosystems, Division von PE Corporation).
  • Ein Aliquot von jeweils 2μl von jedem Multiplex OLA-Produkt wurde mit 2,5 ml deionisiertem Formamid, 0.5 μl Dextranblau-Ladepuffer und 0,5 μl GENESCAN-500 TAMRA-Größenmacker vermischt. Das Gemisch wurde bei 95°C für 3 Minuten denaturiert und dann vor Beladen des Gels schnell auf Eis abgekühlt. OLA-Produkte wurden für 3,5 h bei 2500 V auf einem Modell 373A Fluoreszenz-Scan DNA-Sequenziergerät (PE Biosystems, Division von PE Corporation) mit einem 8% Acrylamid, 19:1 Acrylamid:Bisacrylamid denaturierenden Gel, das 8.3 M Harnstoff, 89 mM Tris, 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA enthielt, elektrophoretisch aufgetrennt. Die resultierenden Geldaten werden hinsichtlich Peak-Farbe und Fragmentengröße mit der GENESCAN Fragment Analyse Software und der Genotyper Software (PE Biosystems, Division von PE Corporation) analysiert.
  • 9 zeigt den Oligonukleotid-Ligationsassay mit den PNA-DNA chimären Sonden zur Unterscheidung von Mutation in humanen CFTR Loci. Ligationsgemische enthielten eine Matrize und zwei Sonden in einer Endkonzentration von jeweils 1 μM, 1 × T4 DNA Ligasepuffer [50mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, 1mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin] und 1000 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) plus 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase in einem Volumen von 50 μl. Die Gemische wurden bei 22,5 bis 25°C für 3 bis 4 Stunden inkubiert. Nach Inkubation wurde das Reaktionsgemisch für 20 Minuten auf 80°C erhitzt und dann bei 4°C gelagert. Fünf μl des Reaktionsgemischs wurden für eine PAGE Analyse verwendet, mit Elektrophorese bei 120–140 V für 20–60 Minuten. (9A) humaner pCFTR621G-T Exon 4; (9B) humaner pCFTR1078delT: Exon 7; (9C) humaner pCFTRG551D: Exon 11. (Großbuchstaben – PNA, Kleinbuchstaben -DNA).
  • 9D zeigt gescannte Bilder von OLA Experimenten mit PNA-DNA chimären Sonden und eine Kontrollspur mit DNA (Spur 10). Die Ligation mit 3'-TAMRA-markierten, 5'-Phosphat-Oligonukleotiden mit PNA10-DNA3 Chimären des CFTR Lokus 621G-T mit der T4 DNA-Ligase erzeugte ein fluoreszenzmarkiertes Produkt, sichtbar ohne Färbung unter UV-Licht (9D, oberes Gel) und durch Färbung mit SYBR-Grün (9D, unteres Gel). Ligationsprodukte mit PNA-DNA chimären Sonden zeigen sich auch in den Experimenten in den Spuren 3 und 9.
  • Tabelle 5. Figur 9D
    Figure 00380001
  • DNA-Matrize
    DNA1a (SEQ. ID NO. 20)
    gtttgatttataagaaggtaatacttccttgcacag
    DNA1b (SEQ. ID NO.21)
    cacagataaaaacaccacaaagaaccctgagaagaagaag
    DNA1c (SEQ. ID NO. 9)
    Biotin-cgctcaacacatagcatggtctagaactaagcctggaa
  • PNA-DNA Chimäre
    Figure 00390001
  • 5'-Phosphat-Oligonukleotide
    Figure 00390002
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00400001
    Figure 00410001
    Figure 00420001
    Figure 00430001
    Figure 00440001
    Figure 00450001

Claims (34)

  1. Verfahren zur Herstellung eines matrizen-abhängigen Ligationsprodukts umfassend den Schritt der enzymatischen Ligation einer chimären PNA-DNA Sonde an eine zweite Sonde in Anwesenheit einer Matrizen-Nukleinsäure und einer Ligase, wobei die chimäre Sonde einen PNA-Teil und DNA-Teil aufweist, wobei der DNA-Teil wenigstens zwei Nukleotide und einen 3'-Hydroxyl oder 5'-Hydroxyl Terminus aufweist, wobei die chimäre Sonde und die zweite Sonde jeweils an die Matrizen-Nukleinsäure und zueinander benachbart hybridisiert werden, und wobei wenigstens ein Teil des PNA-Teils an die Matrize hybridisiert ist, wobei im Falle einer doppelsträngigen chimären Sonde die chimäre Sonde ein klebriges Ende aufweist, so dass der überhängende Strang den DNA-Teil enthält und wenigstens einen Teil des PNA-Teils, der komplementär zur Matrizen-Nukleinsäure ist, und wobei die zweite Sonde eine PNA-DNA Chimäre oder ein Oligonukleotid ist, wobei die chimäre PNA-DNA Sonde die Struktur aufweist: Px -L – Ny wobei: jedes P unabhängig ein PNA Monomer ist; x eine ganze Zahl von 3 bis 15 ist; jedes N unabhängig ein Nukleotid ist und y eine ganze Zahl von 2 oder mehr ist; L eine kovalente Verknüpfung zwischen P und N darstellt; mit der Maßgabe, dass das terminale Nukleotid N eine 3'-Hydroxyl Gruppe oder eine 5'-Hydroxyl Gruppe aufweist.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei, das 3'-terminale Nukleotid N der Chimäre eine 3'-Phosphat Gruppe enthält und das 5'Ende der zweiten Sonde ein 5'-Hydroxyl enthält.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das 3'-terminale Nukleotid N der Chimäre ein 3'-Hydroxyl und das 5'Ende der zweiten Sonde eine 5'-Phosphat Gruppe enthält.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das 5'-terminale Nukleotid N der Chimäre eine 5'-Phosphat Gruppe und das 3'Ende der zweiten Sonde ein 3'-Hydroxyl enthält.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das 5'-terminale Nukleotid N der Chimäre ein 5'-Hydroxyl und das 3'Ende der zweiten Sonde eine 3'-Phosphat Gruppe enthält.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Px eine 2-Aminoethylglycin Peptidnukleinsäure ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei jedes Nukleotid N unabhängig ein 2'-Desoxyribonukleotid ist.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei jedes Nukleotid N unabhängig ein Ribonukleotid ist.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleobasen von Ny ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, C-5-Alkyl Pyrimidin, 2,6-Diaminopurin, 2-Thiopyrimidin, C-5-Propynpyrimidin; Phenoxazin, Isocytidin, Pseudo-Isocytidin, Isoguanosin, Hypoxanthin, 8-Oxopurin, and 4(3H)-Pyrimidon.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zucker von Ny jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 2'-O-Alkyl-Ribonukleotiden, 2'-O-Methyl-Ribonukleotiden, 2'-O-Allyl- Ribonukleotiden, 2'-Allyl- Ribonukleotiden, 2'-Haloribonukleotiden, 2'-O-Methoxyethyl-Ribonukleotiden, 4'-α-anomeren Nukleotiden, 1'-α-anomeren Nukleotiden, 2',4'-gekoppelten Nukleotiden und bizyklischen Nukleotiden.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die PNA-DNA Chimäre und/oder das Oligonukleotid nicht-radioaktiv markiert sind.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die PNA-DNA Chimäre am Aminoterminus des PNA-Teils markiert ist.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Oligonukleotid an einer Nukleobase markiert ist.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Nukleobasen an den 7-Deaza oder C-8 Positionen des Purins oder Deazapurins und der C-5 Position des Pyrimidins markiert sind.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzfarbstoffen, Fluoreszenzquenchern, Hybridisierungs-Stabilisatoren, Energietransfer-Farbstoffsets, Modifikatoren der elektrophoretischen Mobilität, chemilumineszenten Farbstoffen, Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Enzymen und Affinitätsliganden.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX, aromatisch-substituierten Xanthen-Farbstoffen, 4,7-Dichloro-Floureszeinen, 4,7-Dichloro-Rhodaminen und Cyaninen.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Markierung ein Fluoreszenzquencher ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, d-TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, Malachitgrün, NTB und Cyaninen.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Markierung ein Hybridisierungs-Stabilisator ist, der an die „Minor groove" bindet.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das an die „Minor groove"-bindende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hoechst 33258, CDPI1_3, MGB1, Netropsin und Distamycin.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Markierung ein Affinitätsligand ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Biotin, 2,4-Dinitrophenyl, Digoxigenin. Cholesterin, Polyethylenoxy, Peptiden und Fluoreszein.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Oligonukleotid an einem 3'-Terminus markiert ist.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Oligonukleotid an einem 5'-Terminus markiert ist.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei L ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer kovalenten Bindung, Phosphat, Phosphoramidat, Alkyldiyl bestehend aus 1–20 Kohlenstoffatomen, Aryldiyl bestehend aus 6–20 Kohlenstoffatomen, O-linker und – (CH2CH2O)m, wobei m 1 bis 6 ist.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Matrizen-Nukleinsäure eine DNA ist und die Ligase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus T4 DNA Ligase, E. coli DNA Ligase und einer thermostabilen Ligase.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Matrizen-Nukleinsäure eine RNA und die Ligase eine RNA Ligase ist.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die chimäre PNA-DNA Sonde, die zweite Sonde oder die Matrizen-Nukleinsäure auf ein festes Substrat immobilisiert ist.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei die chimäre PNA-DNA Sonde, die zweite Sonde oder die Matrizen-Nukleinsäure kovalent an das feste Substrat angeheftet ist, optional mit Hilfe eines Linkers.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das feste Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Glas mit kontrollierter Porenbildung, Glas, Silika-Gel, Silika, Polyacrylamid, magnetischen Kügelchen, Polyakrylat, Hydroxyethylmethakrylat, Polyamid, Polyethylen, Polyethylenoxy und Kopolymeren und Transplantaten eines der vorstehend genannten festen Substrate.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das feste Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kleinen Partikeln, Kügelchen, Membranen, Fritten, Objektträgern, Platten, Mikrochips, Alkanthiol-Gold Beschichtungen, nicht-porösen Oberflächen, Polynukleotid-immobilisierenden Medien.
  30. Verfahren der matrizen-abhängigen Ligation gemäß Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Nachweises des Ligationsproduktes.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die chimäre Sonde und/oder die zweite Sonde nicht-radioaktiv markiert ist.
  32. Kit zur matrizen-abhängigen Ligation umfassend: eine chimäre PNA-DNA Sonde gemäß Anspruch 1, wobei diese Sonde 5 bis 15 benachbarte monomere PNA Einheiten umfasst, 2 bis 15 benachbarte Nukleotide und einen 3'-Hydroxyl Terminus; eine zweite Sonde, die eine PNA-DNA Chimäre oder ein Oligonukleotid ist; ein Ligaseenzym und eine Matrizen-Nukleinsäure umfassend eine Sequenz komplementär zur chimären Sonde oder enthaltend eine oder mehrere Fehlpaarungen verglichen zur chimären Sonde.
  33. Kit gemäß Anspruch 32, wobei die chimäre Sonde und/oder die zweite Sonde nicht radioaktiv markiert ist.
  34. Kit gemäß Anspruch 32 weiter umfassend eine Polynukleotid-Kinase.
DE60016947T 1999-10-08 2000-10-06 Template Abhängige Ligierung mit PNA-DNA chimerischen Sonden Expired - Lifetime DE60016947T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/416,003 US6297016B1 (en) 1999-10-08 1999-10-08 Template-dependent ligation with PNA-DNA chimeric probes
US416003 1999-10-08
PCT/US2000/027730 WO2001027326A2 (en) 1999-10-08 2000-10-06 Template-dependent ligation with pna-dna chimeric probes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60016947D1 DE60016947D1 (de) 2005-01-27
DE60016947T2 true DE60016947T2 (de) 2005-12-15

Family

ID=23648121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60016947T Expired - Lifetime DE60016947T2 (de) 1999-10-08 2000-10-06 Template Abhängige Ligierung mit PNA-DNA chimerischen Sonden

Country Status (8)

Country Link
US (2) US6297016B1 (de)
EP (1) EP1220953B1 (de)
JP (2) JP3789817B2 (de)
AT (1) ATE285479T1 (de)
AU (1) AU768240B2 (de)
CA (1) CA2353801A1 (de)
DE (1) DE60016947T2 (de)
WO (1) WO2001027326A2 (de)

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6368801B1 (en) * 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
JP3596868B2 (ja) * 2000-11-24 2004-12-02 キヤノン株式会社 末端標識プローブアレイのプローブの量の評価方法、及び、該標識プローブアレイを用いた標的物質量の評価方法
CA2436857A1 (en) * 2000-12-14 2002-06-20 Gen-Probe Incorporated Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
DE60216468T2 (de) 2001-03-09 2007-09-27 Boston Probes, Inc., Bedford Kombinationsoligomere betreffende verfahren, kits und zusammensetzungen
WO2002074995A1 (en) * 2001-03-15 2002-09-26 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
AU2002360361A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-10 Biomicroarrays, Inc. High surface area substrates for microarrays and methods to make same
US6686162B2 (en) 2001-12-04 2004-02-03 Quest Diagnostics Investments, Incorporated Oligonucleotides and methods for detecting Borrelia burgdorferi
US6946245B2 (en) * 2001-12-04 2005-09-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Oligonucleotides and methods for detecting hepatitis C viral nucleic acids
WO2003064701A2 (en) * 2002-01-30 2003-08-07 Epigenomics Ag Method for the analysis of cytosine methylation patterns
EP2112229A3 (de) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Verfahren zum Identifizieren des Brustkrebsrisikos und zugehörige Behandlungen
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
CN103289893B (zh) * 2003-02-26 2015-11-18 凯利达基因组股份有限公司 通过杂交进行的随机阵列dna分析
US20040259128A1 (en) * 2003-03-24 2004-12-23 Glenn Kawasaki Methods and compositions for detecting the presence of target nucleic acids in a sample
US20040203005A1 (en) * 2003-04-14 2004-10-14 White Wanda L. B. Dual hybridization of complex nucleic acid samples for sequencing and single-nucleotide polymorphism identification
DE602004029694D1 (de) * 2003-08-11 2010-12-02 Univ Georgia State Res Found Rna-nachweis und quantifizierung
US20050153300A1 (en) * 2004-01-09 2005-07-14 Quest Diagnostics Incorporated Methods and compositions for the detection of mucolipidosis IV mutations
EP2208797A3 (de) 2004-03-01 2010-11-24 Applied Biosystems, LLC Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für Polynukleotidamplifikation
US7575863B2 (en) * 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
US20060057595A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-16 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for identifying and quantitating small RNA molecules
WO2006052842A2 (en) 2004-11-09 2006-05-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for diagnosis of myelodysplastic syndromes (mds)
WO2006081426A2 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Applera Corporation Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target dna template
EP1902142B1 (de) * 2005-04-14 2010-01-06 Applied Biosystems, LLC 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden
DK2463386T3 (en) 2005-06-15 2017-07-31 Complete Genomics Inc Nucleic acid analysis using random mixtures of non-overlapping fragments
US7892737B2 (en) * 2005-06-30 2011-02-22 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods pertaining to stability modulation of PNA oligomer/nucleic acid complexes
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
EP1994180A4 (de) 2006-02-24 2009-11-25 Callida Genomics Inc Genomsequenzierung auf dna-arrays mit hohem durchsatz
US7951572B2 (en) * 2006-02-27 2011-05-31 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Construction of gold nanoparticle-based peptide chip, and assaying enzyme activity and inhibitor effect using secondary ion mass spectrometric analysis thereof
US8859752B2 (en) 2006-04-18 2014-10-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SIRNA-based therapy of Fibrodyplasia Ossificans Progressiva (FOP)
WO2007123896A2 (en) 2006-04-18 2007-11-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mutated acvr1 for diagnosis and treatment of fibrodyplasia ossificans progressiva (fop)
CA2651815A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-22 Dxterity Diagnostics Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
EP2236623A1 (de) 2006-06-05 2010-10-06 Cancer Care Ontario Feststellung des Risikos für Kolorektalkrebs
US20100003679A1 (en) * 2006-06-09 2010-01-07 University Of Miami Assessment of cellular composition and fractional viability and uses thereof
WO2008070352A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090075343A1 (en) * 2006-11-09 2009-03-19 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by nicking
US20090105961A1 (en) * 2006-11-09 2009-04-23 Complete Genomics, Inc. Methods of nucleic acid identification in large-scale sequencing
US20080131880A1 (en) * 2006-11-22 2008-06-05 Bortolin Laura T PNA-DNA oligomers and methods of use thereof
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
CA2677517C (en) 2007-02-08 2015-11-03 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
US20080194416A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sigma Aldrich Detection of mature small rna molecules
EP2079839A4 (de) 2007-03-05 2009-11-18 Cancer Care Ontario Abschätzung des kolorektalkarzinomrisikos
AU2008230813B2 (en) 2007-03-26 2014-01-30 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
US8008010B1 (en) 2007-06-27 2011-08-30 Applied Biosystems, Llc Chimeric oligonucleotides for ligation-enhanced nucleic acid detection, methods and compositions therefor
ATE549419T1 (de) 2007-08-29 2012-03-15 Sequenom Inc Verfahren und zusammensetzungen für die universelle grössenspezifische polymerasekettenreaktion
US20090061424A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Sigma-Aldrich Company Universal ligation array for analyzing gene expression or genomic variations
WO2009052214A2 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Complete Genomics, Inc. Sequence analysis using decorated nucleic acids
US8617811B2 (en) 2008-01-28 2013-12-31 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US7897344B2 (en) 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US20090263872A1 (en) * 2008-01-23 2009-10-22 Complete Genomics Inc. Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
WO2009061840A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
KR20090081260A (ko) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법
EP2276858A4 (de) 2008-03-26 2011-10-05 Sequenom Inc Durch restriktionsendonuklease verbesserter nachweis polymorpher sequenzen
US20090270273A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Complete Genomics, Inc. Array structures for nucleic acid detection
JP5438922B2 (ja) * 2008-06-25 2014-03-12 日東電工株式会社 核酸の製造方法
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
CN102439454B (zh) 2009-02-11 2015-05-13 卡里斯Mpi公司 肿瘤的分子谱分析
JP2012531887A (ja) 2009-04-01 2012-12-13 ディクステリティー ダイアグノーティクス インコーポレイテッド 化学的ライゲーション依存型プローブ増幅(clpa)
EP3211095B1 (de) 2009-04-03 2019-01-02 Sequenom, Inc. Zusammensetzungen und verfahren für die herstellung von nukleinsäuren
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
US9631227B2 (en) 2009-07-06 2017-04-25 Trilink Biotechnologies, Inc. Chemically modified ligase cofactors, donors and acceptors
JP5903379B2 (ja) * 2009-07-06 2016-04-13 トリリンク バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド 化学修飾リガーゼ補因子、ドナーおよびアクセプター
AU2010315400B2 (en) 2009-10-27 2016-07-21 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
CA2785020C (en) 2009-12-22 2020-08-25 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
US9404160B2 (en) 2009-12-22 2016-08-02 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
US9777332B2 (en) 2011-03-31 2017-10-03 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for identifying minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia
EP2710145B1 (de) 2011-05-17 2015-12-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von zielnukleinsäuren
EP3401399B1 (de) 2012-03-02 2020-04-22 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nicht-invasiven beurteilung genetischer variationen
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
KR101974577B1 (ko) * 2012-05-21 2019-05-02 삼성전자주식회사 나노입자 제작용 주형 및 이를 이용한 나노입자의 제조 방법
AU2013290102B2 (en) 2012-07-13 2018-11-15 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
EP2929050A1 (de) 2012-12-10 2015-10-14 AdvanDx, Inc. Verwendung von sonden zur massenspektrometrischen identifizierung von mikroorganismen oder zellen und relevanten erkrankungen von interesse
US9896728B2 (en) 2013-01-29 2018-02-20 Arcticrx Ltd. Method for determining a therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration (AMD)
US9289502B2 (en) 2013-03-08 2016-03-22 Emerald Therapeutics, Inc. Preparation of oligo conjugates
WO2014168711A1 (en) 2013-03-13 2014-10-16 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
EP3117011B1 (de) 2014-03-13 2020-05-06 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nicht-invasiven beurteilung genetischer variationen
CN106879252B (zh) 2014-06-10 2020-07-17 德克斯特里蒂诊断公司 用于收集和稳定生物样品的装置及方法
GB201612011D0 (en) 2016-07-11 2016-08-24 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel processes for the production of oligonucleotides
EP3299472A1 (de) * 2016-09-27 2018-03-28 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Verfahren zur markierung von oligonukleotidsonden
EP3519554A4 (de) 2016-09-30 2020-05-20 The Governing Council Of The University Of Toronto System zur identifizierung und zum targeting von zellen in einer heterogenen population zur selektiven extraktion von zellgehalt
WO2018218250A2 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
WO2019202536A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 St. Jude Children's Research Hospital Genotyping assays to identify mutations in xaf1
JP2022512080A (ja) 2018-11-30 2022-02-02 カリス エムピーアイ インコーポレイテッド 次世代分子プロファイリング
WO2021015234A1 (ja) * 2019-07-24 2021-01-28 国立大学法人東北大学 キメラ分子、医薬組成物、標的核酸の切断方法、及び、標的核酸切断用又は診断用キット
EP4069865A4 (de) 2019-12-02 2023-12-20 Caris MPI, Inc. Platinresistenztest für pan-krebs
WO2023069429A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Oncogenuity, Inc. Peptide nucleic acid compositions and methods of use for gene editing

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020068275A1 (en) 1993-09-21 2002-06-06 Michael A. Reeve Methods of using a chimeric nucleic acid/nucleic acid analogue molecule
GB9507238D0 (en) * 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
DE19637339A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes

Also Published As

Publication number Publication date
JP3789817B2 (ja) 2006-06-28
US6469151B1 (en) 2002-10-22
CA2353801A1 (en) 2001-04-19
JP2003511059A (ja) 2003-03-25
US6297016B1 (en) 2001-10-02
EP1220953B1 (de) 2004-12-22
WO2001027326A2 (en) 2001-04-19
DE60016947D1 (de) 2005-01-27
ATE285479T1 (de) 2005-01-15
WO2001027326A3 (en) 2002-05-10
EP1220953A2 (de) 2002-07-10
US20020177133A1 (en) 2002-11-28
JP2006055177A (ja) 2006-03-02
AU7871200A (en) 2001-04-23
AU768240B2 (en) 2003-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60016947T2 (de) Template Abhängige Ligierung mit PNA-DNA chimerischen Sonden
DE60020124T2 (de) Verlängerung einer pna-dna chimäre an ihrem 3' ende mittels einer polymerase
DE60108897T2 (de) Methoden für externe kontrollen zur nukleinsäure amplifizierung
DE60028534T2 (de) Binärsonde, klammerzusammensetzung und verfahren zum zielhybridisierungsnachweis
DE60125243T2 (de) Polynukleotid-sequenzassay
DE69827060T2 (de) Modifizierte Primer
DE112007002932B4 (de) Vierfarben DNA-Sequenzierung mittels Synthese unter Verwendung von abspaltbaren, reversiblen, fluoreszierenden Nucleotidterminatoren
DE69930379T2 (de) Oligonukleotide mit pyrazolä3,4-dü pyrimidin zur hybridisierung und unterscheidung von fehlpaarungen
DE69433487T2 (de) Methoden und zusammensetzungen zur effizienten nukleinsaeuresequenzierung
DE69916877T2 (de) Ligations-vermittelte assemblierung und nachweis von polynukleotiden auf einem festträger
CA2257227C (en) Substituted propargylethoxyamido nucleosides
DE60005309T2 (de) Methode zur sequenzierung von polynukleotiden
DE69636895T2 (de) Die Verwendung der 3'-wesentlichen Bearbeitungswirksamkeit von DNS-Polymerase
DE69837255T2 (de) Bestimmung der anzahl von nukleinsäurewiederholungsequenzeinheiten durch schrittweise primerverlängerung
JP2004509613A (ja) 非同調的刺激pcr
JP2008526877A (ja) 可逆的ヌクレオチドターミネーターおよびその使用
CN102083846A (zh) 包含2’-终止子核苷酸的核酸的合成和组合物
DE69924140T2 (de) Bestimmung der länge von repetitiven nukleinsäure-sequenzen durch eine diskontinuierliche primerverlängerung
JP2005516595A (ja) ヘテロ配座ポリヌクレオチドおよび使用方法
US6063571A (en) Process for amplifying nucleic acids using DNA/PNA primers
DE19815864A1 (de) 5'-modifizierte Nukleotide und ihre Anwendung in der Molekularbiologie und Medizin
DE69921594T2 (de) Methoden zur synthese von polynukleotiden durch ligation von multiplen oligomeren
DE69919875T2 (de) Methoden für exogene, interne kontrollen während der amplifizierung von nukleinsäuren

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: APPLIED BIOSYSTEMS, LLC (N. D. GES. D. STAATES, US

8380 Miscellaneous part iii

Free format text: PFANDRECHT

8380 Miscellaneous part iii

Free format text: PFANDRECHT AUFGEHOBEN