DE60016281T2

DE60016281T2 - Transferrin-assay

Info

Publication number: DE60016281T2
Application number: DE60016281T
Authority: DE
Inventors: Erling Sundrehagen; Asgeir Husa; Ingar Eilertsen
Original assignee: Axis Shield ASA; Axis Shield PoC AS
Current assignee: Axis Shield ASA; Axis Shield PoC AS
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-12-11
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2020-12-12
Also published as: ATE283488T1; EP1247101A2; GB9929308D0; US7166473B2; DE60016281D1; WO2001042795A2; EP1247101B1; WO2001042795A3; ES2233484T3; US20030087450A1; AU1871001A; JP2003516543A; CA2393556A1; DK1247101T3

Description

Diese Erfindung betriff ein Prüf- bzw. Assay-Verfahren zur Bestimmung einer Transferrin-Variante oder einer Kombination von Transferrin-Varianten bei der Diagnose und der Überwachung von Alkoholismus sowie Ausrüstungen bzw. Kits zur Durchführung des Assays. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Assay-Verfahren zur Bestimmung einer Kohlenwasserstoff defizienten Transferrin-Variante oder jeder Kombination solcher Varianten.
Serum-Transferrin ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 80 kD, das eine einzige Polypeptidkette mit zwei N-gebundenen Polysaccharid-Ketten umfasst. Diese Polysaccharidketten sind verzweigt, und jede Kette kann entweder in zwei oder drei Antennen enden, jede mit endständigen Sialinsäureresten.
Wong und Regoeczi, in Int. J. Peptide Res. (1977) 9:241–248, berichteten, dass menschliches Transferrin von Natur aus heterogen war, in verschiedene Formen mit unterschiedlichen Graden der Sialysierung vorkommend. Im allgemeinen glaubt man, dass solche Varianten Hexasialo-, Pentasialo-, Tetrasialo-, Trisialo-, Disialo-, Monosialo- und Asialo-Transferrine sind. Es wurde kürzlich berichtet, dass die Anteile von Monosialotransferrin sehr niedrig sind (siehe Landberg u.a. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. =1(2):267–274 und Jochen u.a. Biochemica et Biophysica Acta (1998) 1380:93–101).
Die Asialo-, Monosialo- und Disialo-Varianten werden hier als Kohlenwasserstoff-defizientes Transferrin oder CDT bezeichnet. Die Asialo-Variante, von der man jetzt weiß, dass sie vollständig frei von Kohlenwasserstoffkette ist, wird hier als Kohlenwasserstoff-freies Transferrin oder CFT bezeichnet.
Im normalen gesunden Individuum scheint die Tetrasialo-Variante vorzuherrschen; es wurde jedoch berichtet, dass die Asialo-, Monosialo-, Disialo-, und zu einem gewissen Grad die Trisialo-Varianten in erhöhten Anteilen im Blut von Alkoholikern vorkommen (siehe van Eijk u.a. (1983) Clin. Chim. Acta 132:167–171, Stibler (1991) Clin. Chim. 37:2029–2037 und Stibler u.a. in "Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) in serum as a marker of high alcohol consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann u.a.), Pergamon, 1988, Vol. 71, Seite 353–357).
Es wurde gezeigt, dass CDT ein effektiver Marker für Alkoholkonsum ist, besonders für den Nachweis und die Überwachung chronischen Alkoholkonsums, und im Gegensatz zu konventionellen Tests (z.B. Quantifizierung von γ-Glutamyltransferase oder Messung des mittlerem Zellvolumen), kann es für das Screening nach starker Alkoholaufnahme bei Patienten mit Leberkrankheit verwendet werden.
Die Tatsache, dass sich das CDT-Profil von Alkoholmissbrauchenden von dem Abstinenter oder Normalanwender unterscheidet, kombiniert mit der Identifikation der relativen Mengen jeder CDT-Isoform, z.B. auf der Basis der Unterschiede im isoelektrischen Punkt (pI) oder der Ladung der unterschiedlichen Transferrin-Moleküle, führte zur Entwicklung von mehreren diagnostischen Assays für CDT. Diese sind in der Patent- und wissenschaftlichen Literatur beschrieben, beispielsweise in US-A-4626355, WO 91/19983, WO 96/26444, Heil u.a. (1994) Anaesthetist 43:447–453, und Dumon u.a. (1996) Clin. Biochem. 29(6):549–553).
Aktuellere Studien (beispielsweise von Landberg u.a. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 210(2): 267–274) haben gezeigt, dass wenn die N-Glycane von jeder Transferrin-Isoform freigesetzt werden und sie durch Hoch-pH Anionen-Austausch-Chromatographie analysiert werden, die Existenz der Disialo- und Asialo-Transferrine mit dem Verlust einer beziehungsweise beider der vollständigen Kohlenwasserstoffketten vom Transferrin-Polypeptid korreliert. Dies wurde von Jochen u.a. in Biochemica et Biophysica Acta (1998) 1380:93–101 bestätigt.
Basierend auf der Entdeckung, dass die Präsenz von Transferrin-Isoformen, die vollständig frei von Kohlenwasserstoffen sind (nachfolgend als kohlenwasserstofffreies Transferrin oder CFT bezeichnet), ein wichtiger Indikator für Alkoholismus ist, wenn keine Kenntnis über die Prävalenz irgendeiner anderen CDT-Variante vorliegt (d.h. Monosialo-, Disialo- oder Trisialo-Transferrin-Varianten), entwickelten und beschrieben die Anmelder in WO 99/00672 einen Assay für die Bestimmung von CFT als eine Möglichkeit, um Alkoholismus zu messen. Der Assay ist robust, einfach und schnell durchzuführen, und ist leicht für eine Automation zugänglich oder kompatibel mit existierenden klinischdiagnostischen Routinelaborverfahren. Dies wurde durch Trennung des Kohlenwasserstoff enthaltenden Transferrine aus einer Probe durch In-Kontakt-Bringung der Probe mit einem Kohlenwasserstoff bindenden Liganden, z.B. ein Lectin, und Bestimmung und Messung des Kohlenwasserstoff freien Transferrins, das in der abgetrennten nicht bindenden Fraktion enthalten ist, erreicht.
Die Genauigkeit und folglich der klinische Wert jeder dieser oben erwähnten Assay-Verfahren hängt von einer effiziente Methode der Trennung der individuellen Transferrin-Isoformen oder Kombinationen solcher Isoformen ab. Folglich sind relativ komplexe, teure Trennungsverfahren notwendig, um eine genaue Diagnose zu erzielen.
Besonders die pI oder ladungsbasierten Methoden des bisherigen Standes der Technik sind primär zentriert auf Verfahren, die Ionenaustausch-Chromatographie miteinschließen. Der Unterschied im pI zwischen den verschiedenen Transferrin-Varianten ist sehr klein, runter auf 1/10 einer pH-Einheit. Daher ist eine sehr gute Trennung erforderlich, um eine effektive Trennung von CDT-Varianten herbeizuführen. Im Fall der Ionenaustausch-Chromatographie bedeutet diese Einschränkung, dass ein Säulenformat benutzt werden muss; Batch-Filtrierung-basierte Ionenaustausch-Verfahren bieten keine ausreichende Trennung oder Auflösung. Säulenformate werden jedoch in der klinische Chemie oder bei diagnostischen Verfahren wegen ihrer zeitaufwendigen und arbeitsintensiven Durchführung, Problemen bei Lagerung und Transport, Inkompatibilität mit allgemein verwendeten Systemen, usw. weniger bevorzugt.
Aufgrund des niedrigen CFT-Anteils, der im allgemeinen in Serumproben gefunden wird (selbst bei Alkoholikern sind nur ungefähr 1% der Transferrin-Moleküle Asialotransferrin oder CFT), ist bei dem in WO99/00672 beschriebenen Assay eine effiziente Trennung genauso notwendig, um eine Trennung von CFT von jedem kohlenwasserstoffenthaltenden Transferrin herbeizuführen.
Es gibt daher einen Bedarf an einem alternativen Assay-Verfahren, bei dem unvollständige oder teilweise Trennung von Transferrinvarianten, z.B. eine oder mehr CDT- Varianten, toleriert werden kann, ohne dass es sich auf die klinische Werte des Assays auswirkt. Die vorliegende Erfindung versucht, sich dieser Aufgabe zu widmen.
Mårtensson u.a. (Alcoholism: Clin. and Exp. Research (1997) 21(9):1710–1715) beschreiben eine klinische Studie von Transferrin-Varianten-Konzentrationen durch Ionenaustausch HPLC in Kombination mit RIA-Analyse des Transferringehalts in der eluierten HPLC-Fraktion. Höhere klinische Sensitivität wurde bei Messung des Disialo-Transferrins alleine und mit der Summe der Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrine im Vergleich zu Asialo- und Monosialo-Transferrinen alleine gefunden. Eine viel niedrigere klinische Sensitivität wurde mit Trisialo-Transferrinen gefunden. Mårtensson u.a. fokussieren auf die Unterschiede der klinischen Signalen zwischen den unterschiedlichen Transferrin-Varianten mit Blick darauf, die beste Transferrin-Variante oder Kombination von Varianten zu selektieren. Es wurden keine Korrelationszahlen für verschiedenen Varianten berichtet.
Im Juni 1999 berichtete Professor Jan-Olof Jeppson, der an der Universität von Malmo in Schweden arbeitete, über eine schwache Korrelation (Korrelationskoeffizient R²=0,63) zwischen Asialo- und Disialo-Transferrinen, bei Verwendung des Ionenaustausch-Chromatographie-Verfahrens und der spektrophotometrischen Detektion bei 470 nm, wie in WO 95/04932 beschrieben.
Im Gegensatz zu den Erkenntnissen von Jeppson haben wir jetzt überraschenderweise einen hohen Grad der Korrelation zwischen den Asialo- und Disialo-Transferrin Gehalten von Serumproben gefunden. Dies führte zu der Entwicklung eines verbesserten Assay-Verfahrens für die Bestimmung des Gehalts an einer beliebigen gewünschten Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten, besonders Asia lo- oder Disialo-Transferrin oder CDT, in einer Körperflüssigkeitsprobe, in der eine weniger effiziente Trennung von Transferrinvarianten toleriert werden kann. Dies erlaubt eine viel einfacherer Trennungsmethode, die für die Bemessung des Alkoholkonsums verwendet werden kann.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren für die Erstellung eines Algorithmus zur Bestimmung des Gehaltes einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten bereit, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in einer Körperflüssigkeitsprobe, wobei das Verfahren umfasst

(a) Erhalten von mindestens zwei Lösungen, jede mit bekanntem Gehalt von Asialo- (A1, A2, A3 usw.) und Disialotransferrinen (D1, D2, D3 usw.);
(b) Behandeln jeder der besagten Lösungen mit einer Trennungsmethode, wodurch Bruchteile bzw. Fraktionen separiert werden, die im wesentlichen frei sind von Tri- und höher sialierten Transferrinen;
(c) Bestimmen des Gesamt-Transferrinvarianten-Gehalts (T1, T2, T3 usw.) der besagten Fraktionen; und
(d) Erzeugen eines Algorithmus, der in der Lage ist, den Gehalt jeder Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten zu bestimmen, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in jeder gegebenen Körperflüssigkeitsprobe, die der besagten Trennungsmethode unterzogen wird.

Wie weiter unten beschrieben, ist jedoch der Zweck des Trennungsschritts, der in der hier beschriebenen Methoden verwendet wird, hauptsächlich die Entfernung aller oder im wesentlichen aller Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasialo-Transferrine (nicht-Zielvarianten) aus der Probe, was erlaubt, dass die verbleibenden Zielvarianten (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrine) bestimmt werden können.
Folglich, betrachtet unter einem breiterem Aspekt, stellt die Erfindung ein Verfahren für die Erstellung eines Algorithmus bereit zur Bestimmung des Gehalts einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in einer Körperflüssigkeitsprobe, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Erhalten von mindestens zwei Lösungen, jede mit bekanntem Gehalt an Asialo- (A1, A2, A3 usw.) und Disialo-Transferrinen (D1, D2, D3 usw.);
(b) Bestimmen des Gehalts in jeder der besagten Lösungen von einer Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten in Fraktionen, die im wesentlichen frei sind von Tri- und höher sialierten Transferrinen;
(c) Bestimmen des Gesamt-Transferrinvarianten-Gehalts (T1, T2, T3 usw.) der besagten Fraktionen; und
(d) Erzeugen eines Algorithmus, der in der Lage ist, den Gehalt jeder Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten zu bestimmen, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in jeder gegebenen Körperflüssigkeitsprobe, die dem besagten Bestimmungsschritt b) unterzogen wird.

Der erstellte Algorithmus wird, in Übereinstimmung mit der Erfindung, grundsätzlich in der Lage sein, den tatsächli chen Gehalt oder die Menge von Asialo- oder Disialo-Transferrin, oder den tatsächlichen Gehalt oder die Menge von Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrins (z.B. CDT) in jeder Körperflüssigkeitsprobe zu, bestimmen.
Offensichtlich wird der Algorithmus spezifisch sein für einen gegebenen Bestimmungsschritt oder eine Trennungsmethode, die unter spezifischen Bedingungen ausgeführt wird. Vorzugsweise wird der in der Erfindung zu verwendende Algorithmus auf einer Quantifizierung jeder der Transferrin-Isoformen basieren, die null, ein oder zwei Sialinsäurereste pro Molekül haben. Am besten könnte der Algorithmus auf der Basis der hohen Korrelation zwischen dem Gehalt von Asialo- (CFT) und Disialo-Transferrin in einer Probe erstellt werden, vorzugsweise auch der geringe Anteil von Monosialo-Transferrin.
Basierend auf der zwischen Asialo- und Disialo-Transferrinen bestimmten Korrelation stellt die Erfindung hauptsächlich ein Verfahren zur Erstellung einer Kalibrierungskurve bereit, spezifisch für jeden gegebenen Bestimmungsschritt oder jede Trennungsmethode, der/die verwendet werden könnte, um den Gehalt oder die Menge jeder Transferrinvariante oder Varianten in jeder gegebenen Körperflüssigkeitsprobe zu berechnen. Der Korrelationskoeffizient zwischen Asialo- und Disialo-Transferrin kann durch Verwendung von mathematischen Techniken und Korrelatiosstandards aus dem Stand der Technik, z.B. durch eine Analyse der kleinsten Quadrate bzw. Annäherung, bestimmt werden.
Noch spezifischer könnte der in Übereinstimmung mit der Erfindung erstellte Algorithmus mit mindestens eine der folgenden Gleichung definiert werden: A = (T – d.b)/(c + d.a) D = b + a(T – d.b)/(c + d.a) CDT = A + D = b + (a + 1)(T – d.b)/(c + d.a)(wobei T den bestimmten Gesamttransferringehalt in der bestimmten Fraktion (oder in der aufgetrennten Fraktion nach der Trennung) wiedergibt,
A den tatsächlichen Gehalt an Asialo-Transferrin in der Probe wiedergibt,
D den tatsächlichen Gehalt an Disialo-Transferrin in der Probe wiedergibt,
CDT den tatsächlichen Gesamtgehalt an Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrinen in der Probe wiedergibt,
a und b Konstanten sind, welche die Korrelation zwischen A und D in jeder Serumprobe definieren, und
c und d Konstanten sind, die spezifisch für die Bestimmungsschritte oder Trennungsmethode sind).
Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts einer Transferrinvariante oder der Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in einer Körperflüssigkeit bereit, für die Messung der Alkoholaufnahme, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Behandeln einer Probe einer besagte Körperflüssigkeit mit einer Trennungsmethode, die in der Lage ist, eine Fraktion zu trennen, die im wesentlichen frei von Tri- und höher sialierten Transferrinen ist;
(b) Bestimmen des Gesamt-Transferrinvarianten-Gehalts in besagter Fraktion; und
(c) Bestimmen des Gehalts jeder Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise des Gehalts von jeder CDT-Variante oder Kombination von CDT-Varianten, in besagter Probe, unter Verwendung eines Algorithmus, der in Übereinstimmung mit einem hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurde.

Der Trennungsschritt muss jedoch nicht bereit gestellt werden, wenn ein alternativer Weg für die Bestimmung der Zielvarianten (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrine) verfügbar ist. Es ist weiterhin möglich den Gehalt nur eines Teils der Zielvarianten zu bestimmen, so lange wie der Teil der Zielvarianten konstant und reproduzierbar ist.
Folglich, betrachtet unter einem breiteren Aspekt, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in einer Körperflüssigkeit bereit, um die Alkoholaufnahme zu messen, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bestimmen des Gehalts in einer Probe besagter Körperflüssigkeit an einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten in einer Fraktion, die im wesentlichen frei von Tri- und höher sialierten Transferrinen ist;
(b) Bestimmen des Gesamttransferrinvariantengehalts in besagter Fraktion; und
(c) Bestimmen des Gehalts an jeder Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise der Gehalt von jeder CDT-Variante oder Kombination von CDT-Varianten, in besagter Probe, unter Verwendung eines Algorithmus, der in Übereinstimmung mit einer hierin beschriebene Methode erhalten wurde.

In dem Assay kann, in Übereinstimmung mit der Erfindung, der gemessene Transferrinvariantengehalt für die Bestimmung des tatsächlichen Anteils jeder Transferrinvariante oder -varianten in der Probe verwendet werden, auf der Basis einer Kalibrierung, die sich aus der entdeckten Korrelation der Anteile von Asialo- und Disialo-Transferrinen ableitet.
Wie allgemein verstanden wird, werden der Bestimmungsschritt oder die Trennungsmethode, die in Übereinstimmung mit der Erfindung bei der Durchführung des Assays verwendet werden, dieselben sein wie die, die für die Erstellung des Algorithmus oder der Kalibrierungskurve verwendet werden, wobei solche Bestimmungsschritte oder Trennungsmethoden unter denselben Bedingungen durchgeführt werden.
Wie hier verwendet wird, umfassen beide Begriffe "Bestimmung" oder Messung" die Quantifizierung im Sinne von Erhalten eines absoluten Wertes für die Menge oder Konzentration von Transferrinvariante(n) in der Probe genauso wie semiquantitative und qualitative Messungen oder Bestimmungen. Es ist möglich, einen Index, Verhältnis, Prozentwert oder ähnliche Indikatoren für den Anteil oder die Menge von Transferrin-Variante(n), z.B. relativ zum Gesamttransferrin (d.h. alle Transferrinvarianten) zu erhalten.
Das Assay-Verfahren der Erfindung stellt eine zweckmäßige Methode für die Bestimmung der Alkoholaufnahme bereit, indem der Anteil einer Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten in einer Körperflüssigkeit gemessen wird, vorzugweise eine aus Blut gewonnene Körperflüssigkeit. Es kann besonders bei der Diagnose und der Überwachung von Alkoholismus oder Alkoholmissbrauch Anwendung finden. Sowohl Asialo- als auch Disialo-Transferrine, genauso wie eine Kombination aus Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrinen, wurden bislang als ein guter Indikator oder Marker für Alkoholismus oder Alkoholmissbrauch gezeigt, und indem der Gehalt jedes dieser in Körperflüssigkeitsproben gemessen wird, ist es möglich, dass ein Unterschied zwischen Alkoholikern und Nicht-Alkoholikern oder Sozialtrinkern gefunden werden kann.
Die Körperflüssigkeit, die in dem Assay-Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann jede transferrinenthaltende Körperflüssigkeit sein, beispielsweise synoviale Flüssigkeit, amniotische Flüssigkeit oder Zerebrospinalflüssigkeit, wird aber im allgemeinen Blut sein oder eine aus Blut gewonnene Probe. Wenn dies der Fall ist, wird die für die Analyse verwendete Probe vorzugsweise zellfrei sein und somit können entweder Serum oder Plasma verwendet werden. Die Probe kann, bevor sie in dem Assay-Verfahren der Erfindung verwendet wird, behandelt werden, beispielsweise, kann sie durch Hinzufügen eines Puffers oder eines anderen wässerigen Mediums verdünnt werden.
Der Zweck des Trennungsschrittes in den hier beschriebenen Verfahren ist hauptsächlich die Entfernung aller oder im wesentlichen aller Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasialo-Transferrine (nicht-Zielvarianten) aus der Probe, was erlaubt, die verbleibenden Zielvarianten (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrine) zu bestimmen.
Wo sich das Verfahren auf einen Bestimmungsschritt bezieht, kann dies in einer bevorzugten Ausführungsform ein Trennungsschritt sein. Es kann jedoch unter bestimmten Umständen wünschenswert sein, den Gehalt der Zielvariante(n) direkt in eine Fraktion der Probe zu bestimmen, ohne die Fraktionen physikalisch abzutrennen.
Beispielsweise sind verschiedenen Immunoassay-Techniken verfügbar, welche die Bestimmung oder Quantifizierung von Zieltransferrin-Variante(n) in einer Körperflüssigkeit erlauben könnten. Der in EP 0 605 627 beschriebene Antikörper ist spezifisch für ein bei Alkoholikern gefundenes Transferrinhomolog oder CDT, und solch ein Antikörper sollte deshalb für die Bestimmung des Gehalts einer Zieltransferrin-Variante oder Kombination von Transferrin-Varianten verwendet werden. Vorausgesetzt, dass der Antikörper eine konstante Fraktion der Probe bindet, die im wesentlichen frei von Tri- und höher sialierten Transferrin ist, ist es möglich, in Übereinstimmung mit der Erfindung einen Algorithmus zu erstellen.
Folglich ist in einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung der Bestimmungsschritt eine direkte Bestimmung oder direkte Messung des Gehalts an Zieltransferrin-Varianten oder einer Kombination besagter Zielvarianten.
Transferrin-Präparate, die als im wesentlichen frei von Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasialo-Transferrins betrachtet werden können, sind solche, die weniger als 20 % mehr bevorzugt, weniger als 10 %, z.B. weniger als 5 %, Transferrin-Varianten umfassen, die drei oder mehr Sialinsäurereste pro Molekül haben.
Vorausgesetzt, dass der Bestimmungsschritt oder die Trennungsmethode reproduzierbar ist, ist während der Durchführung der Erfindung die Trennung von allen Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrinen oder die Bestimmung des Gehalts von jedem eizelnen nicht notwendig. Obwohl es möglich ist, alle CDT-Varianten zu isolieren, können klinisch wertvolle Ergebnisse durch Trennung oder Bestimmung nur einer Fraktion dieser Varianten erhalten werden. Was eine Rolle spielt, ist, dass die aufgetrennte oder bestimmte Fraktion jeder Variante für einen gegebenen Bestimmungsschritt unter gegebenen Konditionen oder für eine gegebene Trennungsmethode und gegebenen Trennungsbedingungen reproduzierbar ist (d.h. essentiell konstant). Quantifizierung (im Sinne von Erhalten eines absoluten Werts) von jeder oder aller CDT-Varianten ist nicht essentiell bei der Durchführung der hier beschriebenen Methoden.
Nach der Trennung (wo die Trennung ausgeführt wird) oder im Falle eines Bestimmungsschrittes, wird die Fraktion, welche die gewünschten Zielvarianten enthält, typischerweise mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 70 bis 80 %, z.B. 90 bis 95 % der Asialo- und Monosialo-Transferrin-Varianten, die in der Probe vor der Trennung oder Bestimmung vorhanden sind. Der Disialo-Transferringehalt der abgetrennten oder bestimmten Fraktion wird allgemein mindestens 20 % sein, bevorzugt bis zu 60 bis 70 %, besonders bevorzugt 20 bis 50 %, z.B. ungefähr 30 % des Gesamtdisialo-Transferrinsgehalts der Probe vor der Trennung oder Bestimmung.
In der abgetrennten oder bestimmten Fraktion, die die gewünschten Zielvarianten enthält, werden mindestens 40 %, bevorzugt mindestens 60 %, z.B. mindestens 70 bis 80 % der Transferrin-Moleküle eine Kohlenwasserstoffkette oder einen solchen Rest tragen. Die abgetrennte oder bestimmte Fraktion wird typischerweise weniger als 20 %, z.B. 10 bis 15 %, Asialotransferrin (oder CFT), weniger als 5 % Monosialo-Transferrin und 70 bis 80 %, z.B. ungefähr 75 % Disialotransferrin umfassen. Eine Menge an Trisialo-Transferrin, typischerweise bis zu 20 %, bevorzugt bis zu 10 %, z.B. bis zu 5 %, kann, ohne dass es den klinischen Wert des Assays beeinflusst, toleriert werden.
Auf diese Weise könnte beispielsweise die zu bestimmende oder zu trennende Fraktion im wesentlichen aus Asialo-Transferrin bestehen oder es könnte im wesentlichen aus Disialo-Transferrin bestehen, aber in jedem Fall könnte einiges oder alles des Monosialo-Transferrins (und/oder Trisialotransferrins) in derselben Fraktion vorliegen. Weil die Menge von Monosialo- (oder Trisialo-) Transferrin relativ zu der Menge von Asialo- und Disialo-Transferrin niedrig ist, wird dies nicht signifikant mit den Ergebnissen eines Assays in Übereinstimmung mit der Erfindung interferieren.
Zweckmäßigerweise könnte die Ionenaustausch-Chromatographie verwendet werden, um alles oder im wesentlichen alles der Tri- und höher sialierten Transferrine in jeder der hier beschriebenen Verfahren zu entfernen. Ionenaustausch-Chromatographie als Maßnahme zur Trennung der verschiedenen Isotransferrin-Komponenten ist bekannt, und beispielsweise in der US-A-4626355, Heil u.a. (supra) und WO 96/26444 beschrieben. Vorteilhaft könnte eine Anionenaustausch-Chromatographie-Schritt verwendet werden, mit den Chromatographiebedingungen (z.B. pH und Ionenbindende Stärke), die ausgewählt wurden, um die gewünschten Transferrin-Varianten zurückzuhalten (z.B. Hexa-, Penta-, Tetra- und Trisialo- Transferrin, und optional einige oder alle Disialofraktionen).
Geeignete Bedingungen, z.B. Pufferkapazität des Harzes, Proben/Gleichgewichts/Elutions-Puffer pH und/oder Ionenstärke, können leicht in Übereinstimmung mit Techniken, die in dem Stand der Technik bekannt sind, und in Übereinstimmung mit der gewünschten Trennung, die erreicht werden soll, erreicht werden. Wie im Stand der Technik bekannt, kann die Probe vor dem Ionenaustausch mit eisenhaltigem Puffer behandelt werden, um die Eisen bindenden Stellen in den Transferrin-Molekülen der Probe zu sättigen.
Zweckmäßigerweise kann in Übereinstimmung mit den nach dem Stand der Technik bekannten Techniken, Chlorid als Gegenion im Ionenaustausch-Verfahren verwendet werden, um die gewünschte Trennung erreichen zu können. Auf diese Weise können geeignete Mengen der in dem Chromatographie-Verfahren vorhandenen Chloridionen, die notwendig sind, um die Rückhaltung der gewünschten Transferrin-Varianten zu erreichen, durch Routineexperimente bestimmt werden, und können von den präzisen Bedingungen, Chromatographie-Medium-Charge usw., abhängen. Das Verfahren kann mit isoelektrische Fokussierung oder HPLC-Analyse überwacht werden, erneut in Übereinstimmung mit den nach dem Stand der Technik bekannten Techniken.
Der Ionenaustausch-Chromatographie-Schritt kann auf jede zweckmäßige Weise, die nach dem Stand der Technik bekannt ist, in Übereinstimmung mit der Wahl, z.B. in einem Chargen- oder Säulenformat, ausgeführt werden. Gleichermaßen können die Bedingungen gewählt werden, um die Trennung (d.h. Verringerung oder Entfernung) in jeder gewünschte Weise zu erreichen, beispielsweise durch Zurückhaltung der Isotransferrin-Varianten, die entfernt werden sollen (d.h. Zielvarianten), oder durch Vorbehandlung der Probe mit Ionenaustausch, so dass die "ungewünschten" (d.h. nicht-Ziel-) Varianten nicht an das Medium absorbieren, und der Rest der Probe aufgetrennt und dann vom Ionenaustauschmedium eluiert wird. Vorteilhaft sind die Chromatographiebedingungen so eingestellt, dass sie die Rückhaltung der "ungewünschten" Transferrin-Varianten erlauben.
Als Beispiel für Ionenaustausch-Bedingungen, die verwendet werden können, könnte man Whatman QASL Anionenaustausch Harz gepuffert auf pH 6,3 erwähnen, was zum Binden der Tri sialo- und höher sialierten Transferrine verwendet werden könnte.
Alternativ könnte die Trennung von Ziel- und Nicht-Ziel-Varianten durch Verwendung eines Bindungsliganden erreicht werden, der in der Lage ist, selektiv entweder an die Ziel- oder Nicht-Ziel-Varianten zu binden. Jeder Bindungsligand, der eine Affinität für die Ziel- oder Nicht-Zieltransferrin-Varianten hat, kann so verwendet werden, um die Zielvarianten von anderen Transferrin-Varianten in der Probe zu trennen. Vorzugsweise könnte der Bindungsligand ein Kohlenwasserstoff bindender Ligand sein, wie ein Lektin oder Mischung von Lektinen, z.B. beschrieben in WO 99/00672. Wie in diesem früheren Patent angemerkt, kann die 100%ige Trennung von CFT in der Praxis nicht immer erreichen werden. Es wurde jetzt gefunden, dass Transferrin-Varianten, die einen geringen Kohlenwasserstoffgehalt haben, inbesonderen Monosialo- und Disialo-Transferrine mit einer niedrigen Affinität an Kohlenwasserstoff bindende Liganden, wie Lektine, binden. Es wurde vor allem gefunden, dass solche Varianten an Kohlenwasserstoff bindender Liganden mit einer niedrigeren Affinität als die Transferrin-Varianten mit höherem oder hohem Kohlenwasserstoffgehalt (d.h. die höher sialierten Transferrine, z.B. Tri-, Tetra- und Pentasialo-Transferrine) binden. Trennungsmethoden, die Kohlenwasserstoff bindende Liganden verwenden, beispielsweise Lektine, sind auf diese Weise effektiv, um die höher sialierten Transferrine (z.B. Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasialo-Transferrine) zu entfernen, aber sind im allgemeinen weniger effektiv, um die niedriger sialierten Transferrine (z.B. Mono- und Disialo-Transferrine) zu entfernen. Das Ergebnis ist eine unvollständige Trennung von CFT, bei der die abgetrennte "nicht bindende" Fraktion typischerweise einige oder alle der Mono- und Disialo-Transferrine zusätzlich zu Asialotransferrin (CFT) enthalten wird. Wie zu vor angemerkt, kann das erfindungsgemäße Assay-Verfahren eine unvollständige Trennung der Transferrin-Varianten tolerieren, ohne dass der klinische Wert des Assays gefährdet wird.
Wenn die Transferrin-Varianten umfassende Körperflüssigkeit in Kontakt mit dem Kohlenwasserstoff bindenden Liganden gebracht wird, werden im wesentlichen alle der höher sialierten Varianten (Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasialo-Transferrine) mit Kohlenwasserstoffseitenketten oder Reste davon durch die Kohlenwasserstoffbindenden Liganden zurückgehalten. Die nichtgebundene Fraktion, die CFT, Mono- und Disia-lo-Transferrin enthält, könnte dann von den anderen Varianten getrennt und durch jedes geeignete Mittel gesammelt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Trennungsmethode die Schritte des In-Kontakt-Bringens einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Kohlenwasserstoff bindenden Liganden, z.B. einem Lektin oder einer Mischung von Lektinen, gefolgt von der Trennung einer Fraktion, die nicht an den besagten Liganden bindet. Die gesamte Menge des Transferrins in der nicht-bindenden Fraktion könnte direkt durch Messung des nicht durch den Kohlenwasserstoff bindenden Liganden gebundenen Transferrins bestimmt werden. Alternativ könnte es indirekt bestimmt werden, indem die Menge des Transferrins bestimmt wird, das an den Kohlenwasserstoff bindenden Liganden gebunden ist und dies von der Gesamtmenge des in der Probe vorliegenden Transferrins abgezogen wird. Im allgemeinen wird der direkte Ansatz bevorzugt.
Jeder Kohlenwasserstoff bindende Ligand oder jede Kombination davon können verwendet werden, um die Zielvarianten von anderen Transferrin-Varianten zu trennen. Dies umfasst jeden Liganden, der in der Lage ist, sich an irgendeinen Kohlenwasserstoff oder Oligosaccharid oder Zuckerstrukturen zu binden. Eine oder mehrere Kohlenwasserstoff bindende Liganden können bei der Methode der Erfindung verwendet werden. Wo mehr als ein Ligand verwendet wird, können diese zusammen verwendet werden oder sie können individuell bspw. aufeinanderfolgend verwendet werden. Der funktionelle Anspruch an den/die Kohlenwasserstoff bindenden Liganden, der sie geeignet für die Verwendung in dem Assay-Verfahren der vorliegende Erfindung macht, ist, dass sie in der Lage sind, CDT von anderen Transferrin-Varianten, zu trennen.
Im allgemeinen wird der Kohlenwasserstoff bindenden Liganden eine Protein sein, und im Stand der Technik sind sehr viele solche Kohlenwasserstoff bindende Proteine bekannt und ausführlich in der Literatur beschrieben. Das Kohlenwasserstoff bindende Protein könnte zum Beispiel ein Antikörper sein, entweder polyklonal oder monoklonal, oder ein Antikörperfragment, z.B., F(ab'), F(ab')2 oder F(v) Fragmente. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalent oder divalent sein, und sie können durch Hybridoma-Technologie hergestellt werden oder synthetischen Ursprungs sein, durch rekombinante-DNA-Technologien oder chemische Synthese. Einzelkettenantikörper könnten beispielsweise benutzt werden. Der Antikörper könnte gerichtet oder abgeleitet sein gegen von jeder der Kohlenwasserstoffkomponenten oder -strukturen, die die Kohlenwasserstoffketten der glykosilierten Transferrin-Varianten bilden. So könnte zum Beispiel ein Antikörper verwendet werden, der reaktiv auf oder selektiv für Sialinsäurereste ist. Solch ein Antikörper wird in dem Sialinsäure-Defizienten-Enzym-Immunoassay (SDT-EIA) verwendet, der bei Medichem, Stuttgart, Deutschland erhältlich und in WO 97/19355 beschrieben ist.
Mehr bevorzugt könnte das Kohlenwasserstoff bindende Protein ein Lektin sein, das alleine oder in Kombination mit anderen Lektinen verwendet oder mit anderen Typen von Kohlenwasserstoff bindenden Proteinen, beispielsweise Antikörpern. Jedes im Stand der Technik bekannte Lektin könnte in dem Assay-Verfahren der Erfindung verwendet werden. Es könnte pflanzlichen, tierischen, mikrobiologischen oder irgendeines anderen Ursprungs sein. Die Literatur enthält zahlreiche Referenzen über unterschiedliche Lektine, die verwendet werden könnten, und viele können kommerziell erhalten werden, beispielsweise von Sigma.
D.h. der Begriff "Lektin", wie er hier verwendet wird, umfasst zusätzlich zu den klassischen Pflanzenlektinen wie Concanavalin A (Con A) Kohlenwasserstoff bindende Proteine von Mikroorganismen (z.B. virales Hämagglutinin) und höherer Organismen, beispielsweise Invertebraten und Säuger. Solche Kohlenwasserstoff bindenden Proteine von Säugern schließen Selektin und andere Säuger-Lektine oder Zelladhäsionsmoleküle ein (siehe beispielsweise Varki (1992) Current Opinion in Cell Biology 4:257–266).
Beispiele für geeignete Lektine sind RCA-I (Ricinus communis Agglutinin), das endständig Galaktose bindet (Kornfeld u.a. (1981) J. Biol. Chemical 256:6633), oder ConA (Concanavalin A), das bekannterweise Asparagin-verbundene Oligosaccharide mit hohem Mannose-Anteil bindet. Andere Möglichkeiten sind Lektin aus Crotalaria juncea, das Galaktosereste bindet (Ersson (1977) Biochim. Biophys. Acta 494:51–60), Weizenkeim-Agglutinin oder Lektin aus Limulus polyphenus, das Sialinsäure bindet (Mandal and Mandal (1990) Experientia 46:433–441) oder Sambucus nigra Agglutinin L, das Neu5Ac/(∝2–6)Gal/GalNAc bindet (Shibuya u.a. (1987) J. Biol. Chemical 262:1596). Als Beispiel für ein aus einem Mikroorganismus erhaltenes Lektin wurde kürzlich ein Sialin säure-spezifisches Lektin aus dem Darm-bewohnende Organismus Helicobacter pylori gereinigt (Lelwala-Guruge u.a. (1993) APMIS 101:695–702).
Lektine variabler Selektivität und Spezifizität sind bekannt. Während einige Lektine an einen einzelnen Zuckerrest an einem bestimmten Ort auf einer Oligosaccharidekette binden könnten, beispielsweise bindet RCA-I (from Ricinus communis) nur endständigen Galactosereste, könnten einige an komplexe Oligosacchariddeterminanten binden, beispielsweise Sambucus nigra L, das NeuSAc/(∝2- 6)Gal/GalNAc bindet. Alle sind vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst.
Sialinsäurebindende Lektine und anderen Proteine stellen eine Klasse Kohlenwasserstoff bindender Proteine von besonderem Nutzen in der vorliegenden Erfindung dar (siehe das Folgende, beispielsweise die Listen von geeigneten Lektinen und ihrer Quellen: Mandal und Mandal(1990) Experientia 46:433–441); Zeng (1992) Z. Naturforsch, 47c:641–653 und Reuter und Schauer in Methods in Enzymology, Vol. 230, Kapitel 10, Seiten 196–198).
Eine besondere Erwähnung könnte bezüglich Sambucus nigra L. Lektin, Sambucus sielbodiana Lektin Weizenkeim-Agglutinin, Maackia amurensis Lektin, und E. coli K99 Lektin gemacht werden. S. nigra L. Lektin ist besonders effektiv, wenn es alleine verwendet wird, obwohl es genauso effektiv in Kombination mit anderen Lektinen, z.B. ConA, verwendet werden könnte.
Einige besondere Kombinationen von Kohlenwasserstoff bindenden Liganden, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Lektine von Helicobacter pylori und Ricinus communis; Lektine von Ricinus communis und Sambuccus nigra; Lektine von Crotalaria junctae und Sambuc cus nigra; Lektine von Crotalaria junctae und Helicobacter pylori und Lektine von Ricinus communis und Anti-Sialinsäure-Antikörper. Die am meisten bevorzugten dieser Kombinationen sind die, die Galaktose bindende und Sialinsäure bindende Liganden einschließen.
Den bindenden Schritten folgend kann zweckmäßig eine Fraktion gesammelt werden, die nicht bindet und das CDT enthält. Die Sammlung könnte durch jedes geeignete Mittel, beispielsweise Niederschlag (Präzipitation), Zentrifugation, Filtrierung, chromatographische Methoden, usw., gemacht werden. Wo unterschiedliche Kohlenwasserstoff bindende Liganden individuell verwendet werden, könnten für jeden individuellen Bindungsschritt verschiedene Trennungs-/Sammlungsformate benutzt werden.
Der Niederschlag Kohlenwasserstoff enthaltender Reste in der Probe kann durch die Verwendung von Lektinen erreicht werden, die bekannte "Niederschlags"-Eigenschaften haben, d.h. Lektine, die in der Lage sind, die Präzipitation der Reste, an die sie binden, herbeizuführen. Kombinationen von Lektinen können für solch ein Niederschlagsverfahren vorteilhaft verwendet werden, weil unterscheidbare Lektinspezifitäten die Zahl verfügbarer Bindungsstellen erhöhen. Die nicht-bindende (CDT) Fraktion könnte dann leicht gesammelt werden, beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtrierung, um die Niederschläge zu trennen.
In alternativen Ausführungsformen könnte der (die) Kohlenwasserstoff bindende(n) Ligand(en) zweckmäßig immobilisiert werden, um die Trennung und Sammlung der nichtbindenden Fraktion zu erleichtern. Die Immobilisierung Kohlenwasserstoff bindender Liganden, wie Lektinen, für den Zweck der Trennung, beispielsweise über Chromatographiesäulen, ist im Stand der Technik wohl bekannt und jede Lektin-Affinitäts- Chromatographie nach dem Stand der Technik könnte zum Beispiel verwendet werden (siehe beispielsweise Cummings (1994) Methods in Enzymology 230:66–86).
Die Kohlenwasserstoff bindenden Liganden könnten durch Bindung oder Kopplung an jede der wohl bekannten festen Unterlagen oder Matrizen, die momentan allgemein für Immobilisierung oder Trennung usw. verwendet oder vorgeschlagen sind, immobilisiert werden. Diese könnten die Form von Partikeln, Lagen, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern oder Kapillaren oder Mikrotiterstreifen, Röhrchen oder Platten oder "wells" usw. haben und zweckmäßig aus Glas, Kieselerde (Silika), Latex oder einem Polymermaterial gemacht sein. Techniken für die Bindung des Liganden an die festen Unterlagen sind ebenfalls wohlbekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben. Beispielsweise könnten die verwendeten Kohlenwasserstoff bindenden Liganden zweckmäßig kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose oder N-Hydroxysuccinimidaktivierte Unterlagen gekoppelt werden, optional in Anwesenheit eines Haptens mit niedrigem Molekulargewicht, um die Kohlenwasserstoffbindungsstellen auf dem Liganden zu schützen. Im Stand der Technik sind andere Kopplungsmethoden für Proteine wohlbekannt.
Chargentrennungen, die immobilisierte Kohlenwasserstoff bindende Liganden benutzen, könnten durch Verwendung einer Reihe verschiedener Formate durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Bei einer anderen Ausführungsform, obwohl diese weniger bevorzugt wird, könnte der immobiliserte Kohlenwasserstoff bindende Ligand in eine Säule gepackt oder in einer Säule angeordnet sein. Die Transferrin umfassende Körperflüssigkeit könnte auf die Säulen aufgetragen und die Transferrinvarianten darin mit den Kohlenwasserstoff bindenden Ligan den in Kontakt gebracht werden. Die ungebundene Fraktion, die CDT umfasst, wird von der gebundenen Fraktion getrennt und gesammelt.
Die Form und Geometrie solch einer Säule könnte, abhängig von den verwendeten Kohlenwasserstoff bindenden Liganden, variieren. Wenn beispielsweise Lektine als Kohlenwasserstoff bindende Liganden verwendet werden, wird bei niedrigen Lektinkonzentration eine lange, dünne Säule immobilisierten Lektins bevorzugt. Bei höheren Lektinkonzentrationen ist die Säulengeometrie weniger entscheidend.
Säulen können unter Verwendung jeder im Stand der Technik bekannten Methode konstruiert werden. Wenn Lektine als Kohlenwasserstoff bindende Liganden verwendet werden sollen, können die Säulen entweder in Glasröhren oder bevorzugt in Wegwerf-Plastikpipetten jeder gewünschten Kapazität konstruiert werden. Kleinere Volumen werden aufgrund ökonomischer Überlegungen jedoch bevorzugt. Säulen werden vor der Verwendung vorzugsweise bei ungefähr 4° C gelagert.
Die Säule kann mit einem Eluant durchgespült werden, um die Sammlung der nicht gebundenen Fraktion zu erlauben oder zu erleichtern, wobei das Eluant vorzugsweise durch Verwendung einer kalibrierten Mikropipette aufgetragen werden sollte, um zu gewährleisten, dass das richtige Volumen aufgetragen wird. Das aufgetragene Volumen ist vorzugsweise innerhalb 3% des gewünschten (d.h. Kalibrierungs-) Volumen, mehr bevorzugt innerhalb 1 oder 2%. Da die Bindungsrate an Oligosaccharide vergleichsweise langsam ist, besonders bei pflanzlichen Lektinen, ist zu bevorzugen, dass langsame Flussraten angewendet werden, um die Lektin/Kohlenwasserstoff-Wechselwirkung zu maximieren. Das Eluant wird im allgemeinen bei einer Temperatur innerhalb 5° C des gewünsch ten (Kalibrierungs-) Wertes, z.B. 25° C, sein und mehr bevorzugt innerhalb 1° C.
Wenn Kombinationen von Kohlenwasserstoff bindenden Liganden in einem Säulenformat eingesetzt werden, können entweder sequenzielle Säulen, die verschiedene Liganden benutzen, verwendet werden oder verschiedene Liganden können in demselben Säulenmaterial verwendet werden, entweder als Mischung oder in einer Säule, die verschiedene Schichten umfasst, wobei jede Schicht einen anderen Liganden trägt.
Bei einer alternativen Ausführungsform kann der Kohlenwasserstoff bindende Ligand an einer besonderen Festphase, beispielsweise Latex, Kieselerde oder Polymerkügelchen, immobilisiert sein. Um Handhabung und Trennung zu unterstützen, können magnetische Kügelchen verwendet werden. Der Begriff "magnetisch", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Unterlage in der Lage ist, ein magnetisches Moment zu haben, das ihr verliehen wird, wenn sie in ein magnetisches Feld gebracht wird. Mit anderen Worten, eine Unterlage, die magnetische Partikel umfasst, könnte durch magnetische Zusammenlagerung leicht entfernt werden, was eine schnelle, einfache und effiziente Weise der Trennung der Fraktionen nach dem Kohlenwasserstoff bindenden Schritt zur Verfügung stellt.
So können die magnetischen Partikel mit angehängten Nicht-Zielvariantenresten auf einer geeigneten Oberfläche durch Anwendung eines Magnetfeldes, beispielsweise durch Verwendung eines Dauermagneten, entfernt werden. Es ist üblicherweise ausreichend, einen Magneten auf der Seite des Gefäßes, das die Probenmischung enthält, anzuwenden, um die Partikel an der Wand des Gefäßes anzuhäufen und den Rest der Probe zu sammeln, der die "nichtbindende CDT enthalten de Fraktion" umfassen wird, die für die weitere Analyse zurückgebracht wird.
Besonders bevorzugt sind superparamagnetische Partikel, die beispielsweise solche wie von Sintef in EP-A-106873 beschriebene einschließen, da die magnetische Ansammlung und Verklumpung der Partikel während der Reaktion vermieden werden kann. Magnetische Partikel sind kommerziell bei einer Anzahl von Quellen verfügbar, beispielsweise eingeschlossen Advanced Magnetics Inc., (USA), Amersham (GB), Bang Particles (USA) und Dynal AS (Oslo, Norwegen).
Funktionalisierte beschichtete Partikel für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können durch Modifikation der Körner hergestellt werden, beispielsweise in Übereinstimmung mit den US Patenten 4336173, 4459378 und 4654267. So können Partikel (Beads) oder andere Unterlagen für das Anhängen eines gewünschten Kohlenwasserstoff bindenden Liganden mit unterschiedlichen Typen einer funktionalisierten Oberfläche hergestellt werden.
Trennungen, die auf Zentrifugation und/oder Filtrierung basieren, sind zweckmäßig. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können ein Zentrifugenröhrchen (z.B. Eppendorf-Röhrchen) und ein "Filter-Cup"-Format verwendet werden. Solche Formate sind leicht kommerziell verfügbar, beispielsweise von Millipore. Auf diese Weise können die Probe und der Kohlenwasserstoff bindende Ligand dem Cup in dem Röhrchen zugefügt werden, um zu binden. Das Röhrchen (sowie das Cup) werden dann geschleudert, und der nicht bindende Überstand sammelt sich im Röhrchen. Der Kohlenwasserstoff bindende Ligand kann die Präzipitation der gebundenen Kohlenwasserstoffreste herbeiführen oder er könnte immobilisiert sein, beispielsweise als ein Schlamm bzw. "Slurry" z.B. ein Gel oder auf Partikeln. In jedem Fall wird die gebundene Kohlenwasserstoff bindende Fraktion im Cup zurückbehalten.
Als eine Variation solch einer "Röhrchen und Cup"-Anordnung, könnte der Cup mit einer oder mehreren "Scheiben" oder Filtern ausgestattet werden, die immobilisierte Kohlenwasserstoff bindende Liganden tragen.
Dem Bestimmungsschritt oder Trennungsschritt folgend wird der Gesamtgehalt an Transferrin in der abgetrennten Fraktion bestimmt. Dies könnte durch jedes im Stand der Technik bekannte Standardverfahren für einen Transferrinassay getan werden, beispielsweise durch jede Standard-Immunoassay-Technik, z.B. ELISA oder die Radioimmunoassay-Technik. Methoden für die Bestimmung der Transferrine werden beispielsweise in US-A-4626355 (Joustra) beschrieben.
Ein Beispiel für eine ELISA-Methode könnte ein "Sandwich-Assay" einschließen, bei dem ein immobilisierter Antikörper spezifisch für Transferrinvarianten, die im wesentlichen frei von Tri- und höher sialierten Transferrinen sind, mit der Probe in Kontakt gebracht wird, und dann enzymmarkierte Anti-Transferrin-Antikörper (verfügbar bei Dako AS, Dänemark) verwendet werden, um das gebundene Transferrin nachzuweisen. Solch ein immobilisierter Antikörper ist der Antikörper, der in EP 0605627 beschrieben ist, und in solch einem Fall wird man erkennen, dass die abgetrennte Fraktion die Fraktion des Antikörper gebundenen Transferrins ist und dass das Enzymsignal proportional zum Gesamtgehalt an Transferrin dieser Fraktion sein wird, was erlaubt, das Gesamt-Transferrin dieser Fraktion zu bestimmen.
Viele kommerzielle Assays für Transferrin sind verfügbar und wurden in der Literatur beschrieben. Beispielsweise ist von Hoechst ein RID-Assay (Radioimmunodiffusionsassay) ver fügbar, der auf der Methode von Mancini basiert (siehe Mancini u.a. Immunochemistry, 2:235–254 (1965)). Eine Raketen-Immunoelektrophorese-Methode wurde von Laurell im Scand. J. Clin. Laboratory Invest. 29 (Suppl. 124): 21–37 (1972) beschrieben. Besonders erwähnt werden könnte ebenfalls die Partikelbasierte-Immunoassay-Methode von Muller u.a. in Laboratory Med. 15:278 (1991). Dies ist eine sehr sensitive Technik, die auf einer erweiterten turbidometrischen Methode basiert, die turbidometrische Signale verwendet aber sensitiver als traditionelle turbidometrische Methoden ist.
Für beide, die turbidimetrischer wie die nephelometrischer Transferrinbestimmung, wird Lichtundurchlässigkeit im allgemeinen erzeugt durch In-Kontakt-Bringung der aufgetrennten Fraktion oder eines Aliquots derselben mit einem Anti-Transferrin-Antikörper oder einem Antikörperfragment, z.B. einen Kaninchen Anti-human-Transferrin Antikörper, so wie er kommerziell bei Dako aus Kopenhagen, Dänemark, verfügbar ist. Die Antikörper von Dako sind spezifisch für Transferrin und zeigen keine Kreuzreaktion mit anderen Blutproteinen, die in dem Eluat vorhanden sein könnten. Die Menge des verwendeten Antikörpers sollte natürlich gegenüber Transferrin enthaltende Standardproben optimiert sein, da die Lichtundurchlässigkeit von einem Hakeneffekt stammt, wobei eine multiple Transferrinbindung Zentren der Lichtundurchlässigkeit erzeugt.
Im Fall der beispielsweise oben beschriebenen "Röhrchen und Cup" Ausführungsform, könnten die Anti-Tansferrin-Antikörper einfach dem Röhrchen nach der Zentrifugation zugefügt werden.
Wie bei turbidimetrischen und nephelometrischen Routineassays wird vorzugsweise ein polymerischer Lichtundurchläs sigkeits-Verstärker, wie bspw. Polyethylenglykol, ebenfalls dem Eluat zugegeben.
Bei der Bestimmung des Transferringehalts über die Nutzung solcher Messtechniken könnte natürlich ein kinetischer Lesemodus verwendet werden.
Bevor die nephelometrische oder turbidimetrische Bestimmung gemacht wird, können die Fraktion, der Antikörper und der Verstärker für eine kurze Zeit inkubiert werden, z.B. 5 Minuten bis zu einer Stunde, für Endpunktmessungen, vorzugsweise ungefähr 10 Minuten.
Das Licht, das bei der Bestimmung der Lichtundurchlässigkeit verwendet wird, sollte eine geeignete Wellenlänge haben. In diesem Zusammenhang haben wir herausgefunden, dass die Verwendung eines 405 nm Filters oder bevorzugter eines 340 nm Filters besonders gute Ergebnisse liefert.
Wo eine Trennungsmethode vermieden werden soll und stattdessen ein direkter Bestimmungsschritt verwendet werden soll, ist eine geeignete Methode, den Vorteil einer Proximitäts-Wechselwirkungs-Technik zu nutzen. In dieser Ausführungsform der Erfindung meist bevorzugt wird ein spezifischer Bindungspartner für die Ziel-Transferrinvarianten in einem Proximitäts-Assay verwendet, um eine direkte Bestimmung des Gehalts an Zielvarianten (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) in der(den) zu bestimmenden Fraktion(en) zu erhalten. Ein Beispiel eines geeigneten spezifischen Bindungspartners ist der Anti-Transferrin-Antikörper, der selektiv mit Transferrinhomologen reagiert, die bei Alkoholikern gefunden werden aber nicht bei Nicht-Alkoholikern, wie in EP 0605627 beschrieben.
Eine andere Möglichkeit, einen passenden spezifischen Bindungspartner mit geeigneter Spezifität für die Ziel-Transferrinvarianten, die bestimmt werden sollen, herzustellen, ist, einen Antikörper gegen ein Peptidimmunogen zu ziehen, das die N-Glykan-Bindungsstelle auf dem Transferrinmolekül imitiert, beispielsweise wenn die Peptidsequenz mit der Aminosäuresequenz des humanen Transferrins korreliert. Die Aminosäuresequenz des humanen Transferrins ist bekannt und publiziert, beispielsweise in Yang u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 2752–2756 (1984) oder unter der Zugriffsnummer PO 2787 in der Swiss Prot Datenbank.
Beispiele geeigneter Techniken, welche die Ermittlung eines Signals abhängig von Proximitäts-Wechselwirkungen zwischen Molekülen erlauben, sind in der Literatur beschrieben. Solche Techniken schließen Fluoreszenz-Polarisation-Immunoassay Technologien (FPIA), Fluoreszenz-dämpfende Techniken, Proximitäts-Scintillationsassays und die EMIT Technologie ein.
FPIA Techniken werden beispielsweise in Dandliker u.a., Immunochemistry 7: 799–828, (1970) und in Wei u.a., Anal. Chemical 65: 3372–3377 (1993)) beschrieben.
Fluoreszenz dämpfende Techniken werden beispielsweise in US-A-3996345 von Ullmann u.a. beschrieben, bei dem ein Bindungspartner einen fluoreszierenden Rest trägt und der andere einen Dämpfer.
Proximitäts-Scintillationsassays werden beispielsweise in US-A-4568649 und EP 0154734 von Bertoglio-Matte beschrieben. In diesen Assays emittiert einer der Bindungspartner ein kurzwelliges energiereiches radioaktives Signal, typischerweise β-Strahlen, und wenn die Proximitäts-Wechselwirkung mit dem anderen Bindungspartner auftritt, wird ein Fluorophore, die mit dem zweiten Bindungspartner verbunden ist, durch die radioaktive Energie angeregt und ein fluoreszierendes Signal wird erzeugt.
Ein weiterer, komplexerer Typ des Fluoreszenz-Proximitäts-Assays wurde in US-A-5763189 von Buechler u.a. beschrieben, der auf der Messung des "Stokes-Wechsels" basiert (Unterschied in der Wellenlänge des Lichtes, das emittiert wird im Vergleich zur anregenden Wellenlänge).
Die EMIT-Technologie ist beispielsweise in US-A-3852157 von Rubenstein u.a. beschrieben und diese Technik ist angewiesen auf die Konkurrenz zwischen dem Analyt-Molekül und dem Enzym markierten Analyt-Analogen (dem "Reaktanden") um einen Rezeptor (der "spezifische Bindungspartner") in der Assaylösung.
Weitere Signalermittlungstechniken schließen die Turbidimetrie und Nephelometrie wie hier vorher beschrieben ein in Verbindung mit Trennungsmethoden.
Im allgemeinen werden, abgesehen von der untersuchten Probe, Kalibrierungsproben mit bekanntem Transferringehalt ebenfalls bei der Durchführung der Assaymethode der Erfindung bestimmt. Solche Ermittlungen können verwendet werden, um eine Kalibrierungskurve aufzuzeichnen, aus welcher der Transferringehalt der untersuchten Probe bestimmt werden kann. Vorzugsweise werden Kalibrierungsproben mit einem Transferringehalt von bis zu 0,05 mg/ml (d.h. 0,002, 0,01, 0,02 und 0,03 mg(ml) verwendet.
In der Assaymethode der Erfindung wird vorzugsweise der Gesamtgehalt an Transferrin der bestimmten oder aufgetrennten Fraktion, welche die Zielvarianten enthält, bestimmt. Durch Benutzung eines Algorhitmus, wie er hierin beschrieben ist, kann dies dann verwendet werden, um den Gehalt an Asialo- oder Disialo-Transferrin, oder den CDT-Gehalt der Probe, mit einem höheren Grad an Genauigkeit zu bestimmen. Der Gehalt an Asialo- oder Disialo-Transferrin oder CDT kann als ein Prozentwert des Gesamt-Transferrins bestimmt werden. Dies kann ein genauerer Marker für die Alkoholaufnahme sein als Gesamt-Transferrin, und ein Schwellenwert, beispielsweise 1%, könnte gesetzt werden. Alternativ könnte die Anwesenheit jeder Transferrinvariante als konkrete Konzentration beurteilt werden (d.h. eine Masse pro Einheit Volumen).
Betrachtet unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Ausrüstung bzw. ein Kit für einen erfindungsgemäßen diagnostischen Assay bereit, wobei das Kit umfasst:
Mittel zur Behandlung einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Bestimmungsschritt oder einer Trennungsmethode, die/der in der Lage ist, den Gehalt einer Fraktion herzustellen oder zu bestimmen, die im wesentlichen frei von Tri- und höher sialierten Transferrinen ist;
Mittel für die Ermittlung von Transferrin; und
Mittel für eine Bestimmung des Gehalts jeder Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten in einer Körperflüssigkeitsprobe, die der besagten Trennungsmethode oder dem Bestimmungsschritt unterzogen wird.
Zweckmäßigerweise könnte das Kit auch einen Transferrin-Standard oder Standards als Referenz umfassen. So könnte das Kit der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform umfassen:
Mindestens zwei Transferrin-Lösungen mit bekannten Asialo- und Disialo-Konzentrationen;
Mittel zur Behandlung einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Bestimmungsschritt oder einer Trennungsmethode, die/der in der Lage ist, den Gehalt einer Fraktion herzustellen oder zu bestimmen, die im wesentlichen frei von Tri- und höher sialierten Transferrinen ist;
Mittel für die Ermittlung von Transferrin; und
Mittel für eine Bestimmung des Gehalts jeder Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten in einer Körperflüssigkeitsprobe, die der besagten Trennungsmethode oder Bestimmungsschritt unterzogen wird.
Die Erfindung wird jetzt mit den folgenden nichtbegrenzenden Beispiele und den begleitenden Figuren dargestellt:
1 zeigt die hohe Korrelation (R²=0.9153) zwischen der Konzentration von Asialo- und Disialo-Transferrin-Varianten in einer Serumprobe, die in Übereinstimmung mit der Methode des Beispiels 1 bestimmt wurde.
2 zeigt die hohe Korrelation (R²=0.9336) zwischen den von Asialo- und Disialo-Transferrin-Varianten in einer Serumprobe, die in Übereinstimmung mit der Methode des Beispiels 1 bestimmt wurde.
3 zeigt die Trennung von Transferrin-Isoformen durch HPLC.
4A und 4B zeigen die Korrelation von Asialo gegen Monosialo, in A bestimmt in % Transferrin, in B bestimmt in μg/mL.
5A und 5B zeigen die Korrelation von Asialo gegen Disialo, in A bestimmt in % Transferrin, in B bestimmt in μg/mL.
6 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Asialo-Transferrin, in Masseeinheit (μg/mL) bestimmt.
7 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Disialo-Transferrin, in Masseeinheit (μg/mL) bestimmt.
8 zeigt die Korrelation von Asialo-Transferrin mit (Monosialo- und Disialo-) Transferrin, in % Transferrin bestimmt.
9 zeigt die Korrelation von Asialo- mit Trisialo-Transferrin, in % Transferrin bestimmt.
10 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Asialo-Transferrin, in % Transferrin bestimmt.
11 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Disialo-Transferrin, in % Transferrin bestimmt.
Beispiel 1
Referenzmethode – Bestimmung des Asialo-, Monosialo-, Disialo- und Trisialo-Transferrinsgehalts in Serumproben
Der Transferrinvariantengehalt an fettfreien, eisenbehandelten Serumproben wurde unter Verwendung einer kombinier ten HPLC-RIA Methode analysiert. Die Anteile der unterschiedlichen Sialinsäure-Isoformen wurden erst durch Trennung auf HPLC mit einer Ionen-Austausch-Säule bestimmt. Die Asialo-, Monosialo-, Disialo- und Trisialo-Transferrin-Fraktionen wurden in separaten Röhrchen gesammelt. Die höheren Isoformen, Tetrasialo-, Pentasialo- und Hexasialo-Transferrine, wurden in einem separaten Röhrchen gesammelt. Der % der verschiedenen Fraktionen wurde zuerst unter Verwendung von HPLC bestimmt, dann wurde die Konzentration der Fraktionen auf einem Gammazähler unter Verwendung von einem wie unten skizzierter Immunoassay-Verfahren bestimmt.
Reagenzien:

Dextransulfat Natrium Salz
Calciumchlorid Dihydrat
Eisenchlorid, FeCl₃, 6H₂O, min. 99,0%
Essigsäure >99%
2-Propanol
Nitrilotriacetische Säure Trinatriumsalz Monohydrat >98% BisTris (bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan) >99.5%
NaCl p.a.
2 M NaCl, p.a.
2 M NaOH, p.a.
5% Essigsäure
75% Essigsäure
Mobile phase A: 20 mM BisTris buffer, pH 6.5
Mobile phase B: 20 mM BisTris buffer, pH 6.5, 0.5M NaCl
Mobile phase C: 20 mM BisTris buffer, pH 5,8
Mobile phase D: Wasser

Ausstattung:

– 2 ml Spritze
– 0.2 μm Filter für die Filterung der Serumproben (Gelman Acrodisc 13)
– Säule: Pharmacia Resource Q 1 mL, Code 17-1177-01 oder Pharmacia Source 15Q 1 mL
– Vor-Säule: HP Pre-Säule Patronenhalter 4,0 mm innerer Durchmesser, gefüllt mit HQ50 in "slurry"-Form
– Transferrin, in Lösung und markiert mit and labelled with 125I
– Anti-Transferrin-Antikörper Lösung (aus Kaninchen)
– Schaaf Anti-Kaninchen-Antikörper (Dekontierlösung)
– Kalibrierer 0, 5, 20, 50, 100 and 300 U CDT/L (1 U/L=0.034 μg/ml)
– Transferrin-Kalibrierer (basierend auf Seronorm kalibriertem Serum, bezogen von Sero AS, Norwegen, verdünnt in Mobiler Phase A) 0, 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.5 μg/ml
– HPLC Degaser: Degaser Mod. G1322A
– HPLC Pumpe: Quartär-Pumpe Mod. G1311A
– HPLC Injektor: Autosampler Mod. G1313A, modifiziert mit einer 900 μl Injektorschleife
– HPLC Thermostat: Säulenthermostat Mod. G1316A, mit einem Reodyne Multiport
– HPLC Detektor: Dioden Aufstellungs-Detektor Mod. G1315A
– Datenbearbeitung: HP ChemStation
– pH Meter: Hanna Instruments 8417
– Zentrifuge: Minifuge RF, Z-924
– Gamma-Zähler: RIASTAR
– Fraktionensammler: GradiFRAC von Pharmacia

HPLC
150 μl von jeder Serumprobe wurde zu 30 μl FeNTA hinzugefügt (eine wässerige Lösung aus 2,751 g/l nitrilotriaceti schem Trisodiummonohydrate und 2,703 g/l FeCl3.6H20, eingestellt auf einen pH von 6,5 unter Verwendung von 2M NaOH) und gevortext. Die resultierende Lösung wurde dann zu 10 μl Dextran Sulfat (20 mg/ml) and 10 μl Kaliumchlorid (147 mg/ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde für 30 min. auf 2–8° C herunter gekühlt. Die Probe wurde dann für 10 min. bei 3800 rpm zentrifugiert. 150 μl des Überstands wurden pipettiert und zu 900 μl HPLC Puffer A hinzugefügt. Die Probe wurde auf einem Acrodisc-Filter filtriert und dann in einem 800 μl Aliquot indie HPLC injiziert. Die Transferrin-Isoformen wurden durch eine ionenchromatographische Gradientenmethode aufgetrennt. Das Transferrin wurde selektiv spektrophotometrisch bei 470 nm durch die HP ChemStation nachgewiesen.
Fünf Transferrinfraktionen wurden von der HPLC in Röhrchen in genauen Mengen gesammelt. Die Asialo- bis Trisialotransferrin-Fraktionen wurden separat gesammelt. Die Tetrasialobis Hexasialo-Transferrine wurden in einer separaten Fraktion gesammelt. Die Asialo- und Monosialo-Fraktionen wurden nicht weiter verdünnt. Die Disialo- und Trisialo-Fraktionen wurden 1:1 verdünnt und die Fraktion, die die Tetrasialo- und Hexasialo-Transferrine beinhaltete, wurde 1:4 mit Mobiler Phase A verdünnt.
Um den Transferrinsgehalt jeder isolierten eluierten Fraktion zu quantifizieren, wurden die Schritte D1–D8 der folgenden Immunoassay-Verfahrens durchgeführt. In Beziehung zu der Asialofraktion wurde die Konzentration in D8 unter Verwendung von Kalibratoren von 0–2,5 μg/ml bestimmt. In Beziehung zu den verbleibenden Fraktionen wurden die Schritten D1 bis D8 mit den CDTect-Kalibratoren durchgeführt.
Immunoassay Verfahren

D1: 500 μl Kalibrator wurde pipettiert. Die Kalibratoren sind Verdünnungen menschlichen Transferrins (von Intergen erhalten) in PBS, die 1 % BSA, 0, 1 % Tween 20 at pH 7.0) beinhalten.
D2: 500 μl Probe wurde pipettiert.
D3: 50 μl Transferrin ¹²⁵I wurde der Probe hinzugefügt. Die ¹²⁵I-Transferrinlösung wurde durch Verdünnung von ¹²⁵I-markiertem menschlichen Transferrin (erhalten von Isopharma AS, Kjeller, Norwegen) auf eine für Gamma-Zählen geeigneten Konzentration hergestellt, in wässeriger gepufferter Lösung mit 0,037 M Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat, 0,013 M Natriumdihydrogen phosphatmonohydrat, 1 % BSA, 0,1 % Tween 20 und 0,03 % Patent Blue.
D4: 50 μl Antikörper wurde hinzugefügt. Die Antikörperlösung wurde von Kaninchen Anti-human-Transferrin Antiserum hergestellt (erhalten von BioCell, Produktnummer 01090) 1:450 verdünnt in 0,4M Natriumphosphatpuffer mit 1 % BSA, 0,1 % Tween 20 bei pH 7,0.
D5: 2000 μl dekantierte Suspension wurde zugefügt. Die dekantierende Suspension ist eine Lösung von Sekundär Anti-Kaninchen-Antikörpern (erhalten von Pharmacia & Upjohn, Produktnummer 30-3794-00)
D6: Inkubation für 1 Stunde
D7: Zentrifugation von 10 min bei 1500xg und Entfernung des Überstands
D8: Bestimmung der Radioaktivität

Die Konzentration und die % Verteilung der Transferrinvarianten, bestimmt in einer gegebenen Serumprobe, ist in Tabelle 1 unten gezeigt (150 μl Serum ist auf 1,1 ml verdünnt und 800 μl wurde auf HLC injiziert; Verdünnungsfaktor:
1.1/0.15·1/0.8 = 9.17):
Tabelle 1
Beispiel 2
Korrelation zwischen Asialo- und Disialo-Transferrinen und Fehlen von Monosialo-Transferrin
Unter Verwendung der HPLC/RIA-Methode in Beispiel 1, wurden sehr niedrige Monosial-Transferrinanteile gefunden. Zusätzlich wurden Asialo- und Disialo-Transferrinanteile gefunden, um wie folgt zu korrelieren: D = A.a + b(wobei
D den Disialo-Transferringehalt einer Serumprobe wiedergibt,
A den Asialo-Transferringehalt einer Serumprobe wiedergibt,
a = 22,2, und
b = 36 mg/l)
Dies stellt einen karierten Korrelationskoeffizient von 0,9153 dar (siehe beiliegende 1).
Unter Verwendung von relative Einheiten (%-Gesamttransferrin-Koeffizienten), wurden die folgenden Werten für a und b bestimmt:
a = 22,25
b = 1,05% (0,0105)
Dies stellt einen quadrierten Korrelationskoeffizient von 0,9336 dar (siehe beiliegende 2).
Beispiel 3
Bestimmung eines Algorithmus, um Asialo-Transferrin-, Disialo-Transferrin- und CDT-Anteile in einer Serumprobe zu berechnen.
Mindestens zwei Lösungen mit bekanntem Gehalt an Asialo- und Disialo-Transferrin wurden eine Trennungsmethode unterzogen, die in der Lage ist, im wesentlichen alle der Tri- und höher sialierten Sialo-Transferrine (z.B. auf Lektin- oder Ionenaustauschmatrizen basierend) zu entfernen. Danach wurde der Gesamttransferringehalt der isolierten Transferrinfraktion (z.B. mit einer Radioimmunoassay-Methode für Transferrin-Quantifizierung) bestimmt. Auf der zuvor bestimmte Korrelation zwischen der Asialo- und Disialo- Transferrinanteilen und des niedrigen Monosialotransferrinanteils basierend, können folgenden Beziehungen hergestellt werden: T1 = c.A1 + d.D1 T2 = c.A2 + d.D2 T3 = c.A3 + d.D3usw.
(wobei
T1, T2, T3, usw. für den gemessenen Gesamt-Transferringehalt jeder Probe nach der Trennung stehen,
A1, A2, A3, usw. für den bekannten Asialo-Transferringehalt in jeder Probe steht;
D1, D2, D3, usw. für den bekannten Disialo-Transferringehalt in jeder Probe steht; und c und d Konstanten sind).
Berechnung des Asialo-Transferrin-, Disial-Transferrin-, und CDT-Gehalts in jeder Probe der Teilmessungen von T:
Für jede getestete Probe: T = c.A + d.Dund D = a.A + b(wobei
T für gemessenen Gesamttransferringehalt steht;
A für den tatsächlichen Asialo-Transferringehalt in der Probe steht;
D für den tatsächlichen Disialo-Transferringehalt in der Probe steht; und
a, b, c und d alle Konstanten sind).
Es folgt, dass A = (T – d.b)/(c + d.a); D = b + a(T – d.b)/(c + d.a); und CDT = A + D = b + (a + 1)(T – d.b)/(c + d.a)(wobei CDT für den Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin-Gesamtgehalt in der Probe steht).
Beispiel 4
Quantifizierung des Transferringehalts mittels Anionenaustausch und Lektinbindung
20 μl einer Serumprobe wurde mit 50 μl einer Lösung von 10 mM bis-tris, 3,1 mM Natriumsäure, 0,05 % Tween 20, 1 M HCl ad pH 7.0, 0,8 mM Tris Base, 0,15 mM FeCl3, 0,15 M Natriumcitrat und 0,4 mM Maleinsäure gemischt. Die resultierende Lösung wurde zu 0,5 ml von 25 % vorgequollenem Whatmann QA52 Ionenaustausch-Harz, das in 20 mM Bis-Tris Puffer ((2-hydroxy)amino- tris(hydroxymethyl)methan) pH=6.3 suspendiert wurde, hinzugefügt. Der Chloridgehalt des Mediums wurde vorsichtig eingestellt, um im wesentlichen alle Transferrinmoleküle mit mehr als zwei Sialinsäureresten zu rückzuhalten (dies könnte durch HPLC oder isoelektrische Fokussierung überwacht werden). Danach wurde 0,25 ml einer 25% Suspension von Holunderbeerrinden-Lektin (Vector Laboratories, USA) hinzugefügt (dies sichert ein kompletteres Aufwischen der sialierten Transferrinmoleküle), und die Suspension wurde vorsichtig gemischt. Die Suspension wird danach durch Zentrifugieren in einer Millipore Ultra-Free UFC3 OHV Filtertüte gefiltert und das Filtrat wird aufgefangen. 200 μl des Filtrats werden vermischt mit 200 μl einer Transferrin-Antikörper-Lösung (Dako), verdünnt 1:10 in 0,27 M Tris, 4,5 % PEG 8000, 4,3 mM Natriumazid, pH = 7,4. Die Konzentration des Transferrins in dem Filtrat wird bestimmt durch Einfügen des nephelometrischen Signals in eine Standardkurve, die durch Standards von bekannten Konzentrationen von humanem Transferrin ausgebildet wird.
Mit dieser Trennungsmethode, ist c = 0,93 und d = 0,45.
Beispiel 5
Quantifizierung von Transferringehalt mittels eines Anionenaustauschs
20 μl einer Serumprobe werden gemischt mit 50 μl einer Lösung aus 10 mM bis-tris, 3,1 mM Natriumazid, 0,05 % Tween 20, 1 M HCl ad pH 7,0, 0,8 mM Tris Base, 0,15 mM FeCl3, 0,15 M Natriumzitrat und 0,4 mM Maleinsäure. Der entstehenden Lösung wird 0,5 ml eines 25 % vorgequollenen Whatman QA52 Ionenaustausch-Granulats zugefügt, das in einem 20 mM Bis-Tris-Puffer ((2-hydroxy)amino-tris(hydroxymethyl)methan) pH = 6,3 gelöst ist. Der Chloridgehalt des Agenz ist sorgfältig eingestellt um im wesentlichen alle Transferrin-Moleküle mit mehr als zwei Sialinsäurereste zu binden (das kann überwacht werden durch HPLC oder isoelektrische Fokus sierung). Die Lösung wird dann durch Zentrifugieren in einer Millipore Ultra-Free UFC3 OHV Filtertüte gefiltert, wobei das Filtrat aufgefangen wird. 200 μl des Filtrats wird mit 200 μl einer Transferrin-Antikörper-Lösung (Dako) gemischt, die 1:10 in 0,27 M Tris, 4,5 % PEG 8000, 4,3 mM Natriumazid, pH = 7,4, verdünnt ist. Die Konzentration des Transferrins in dem Filtrat wird durch Einfügen des nephelometrischen Signals in eine Standardkurve bestimmt, die durch Standards von bekannten Konzentrationen von humanem Transferrin abgeleitet ist.
Beispiel 6
Quantifizierung von Transferringehalt mittels eines immobilisierten Lektins von Sambuccus nigra in einem Säulenformat.

a. 10 μl Serumproben werden gemischt mit 0,5 ml Bindungspuffer 20 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, der 150 mM Natriumclorid enthält.
b. Jede verdünnte Serumprobe wird durch eine Säule von 0,5 ml Agarosegel Holunderrinden-Lektin (Sambuccus nigra) (geliefert durch Vector Laboratories, Burlingame, USA) geleitet, das in einem 20 mM Tris-HCl Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst ist und 150 mM Natriumchlorid enthält, und weitere 1,0 ml desselben Puffers werden durch die Säule geleitet.
c. Man mischt 200 μl der eluierten Lösung mit 200 μl einer Anti-Transferrin-Antikörper-Lösung, die aus 0,27 M Tris, 4,5 % PEG 8000, 4,3 mM Natriumazid, in einer Verdünnung 1:10 von Dako Anti-Human-Transferrin- Antikörpern Q0327 und HCl mit einem pH-Wert von 7,4 besteht.
d. Man liest das Trübungstitrations-/nephelometrische Signal ab.

Mit der Trennungsmethode ist c = 0,98 und d = 0,08.
Beispiel 7
Ausstattung

– Säulen (7 mm innerer Durchmesser), die 0,5 ml POROS HQ50 (Perseptive Biosystems) zwischen Polyethylen höher und niedriger durchlässiger Fritte (Porex, Atlanta, Ga, USA) enthalten – die Säulen werden von Pierce Company, USA bezogen
– vier Kalibratoren
– Pipetten, die ein Fassungsvermögen von 4 μl bis 3 ml haben Alternativ: Multipipetten mit einem Fassungsvermögen von 100 μl, 200 μl, 2 ml und 3 ml
– Ständer (für Röhren (75 × 12 mm))
– Mikrotiterplatten, 405 nm Filter

Tabelle 2

(Kalibrator C1 ist durch die Verdünnung von Kalibrator C3 mit Lösung 2 hergestellt.)

Reagenzien-Lösung 1:

10 mM BisTris (bis(2-Hydroxyethyl)Amino-tris-(Hydroxymethyl)Methan)
3,1 mM Natriumazid
0,05 % Tween 20
1M HCl ad pH 7,0
0,8 mM Tris Base (Tris(hydroxymethyl)Aminomethan)
0,15 mM FeCl₃
0,15 mM Natriumzitrat
0,4 mM Maleinsäure
entionisiertes Wasser g.s.

Lösung 2:

50 mM BisTris (bis(2-hydroxyethyl)Amino-tris-(Hydroxymethyl)Methan
3,1 mM Natriumazid
0,05 % Tween 20
1 M HCl ad pH 6,00
ca. 3 mM NaCl zugefügt
entionisiertes Wasser g.s.

Trübungstitrationsreagens:

900 μl 0,3 M Tris/PEG pH 7,4
100 μl Kaninchen-Anit-Serum-Transferrin

Die 0,3 M Tris/PEG pH 7,4 enthalten:

0,3 m Tris. HCl
6 % Polyethylenglycol (PEG 8000)
3,1 mM Natriumazid
2 M NaOH ad pH 7,4
entionisiertes Wasser g.s.

Vorbereitung der Säulen:
Man benutzt eine Säule pro zu testender Probe. Man eluiert überflüssige Transportpuffer, indem man zuerst den oberen und dann den unteren Verschluss entfernt, wegwirft und eluiert. Vorbereitete Säulen sollten innerhalb von zwei Stunden benutzt werden.
Ablauf der Prüfung der Proben:

– Vorgehensweise mit den Proben 1. Man fügt 100 μl Serum zu 500 μl Lösung 1 in ein Reagenzglas. Man vermische. 2. Man inhubiere dies für 5 – 10 Minuten bei Raumtemperatur.
– Säulentrennung 1. Alle hinzugefügten Lösungen müssen ungehindert aus der Säule eluieren. 2. Man fügt 500 μl inhubierte Probe in eine Säule. 3. Man lässt die Probe in den oberen Filter sinken bevor man 1,0 ml von Lösung 2 zufügt. 4. Man lässt Lösung 2 in den oberen Filter sinken. Man wechselt die Reagenzgläser unter den Säulen. Die bis jetzt eluierte Lösung sollte weggeworfen werden. Man fügt 2,0 ml von Lösung 2 zu jeder Säule hinzu. Man fängt 2,0 ml auf und eluiert 2,0 ml.
– Messung 1. Man fügt 200 μl jedes Kalibrators and 200 μl von Eluat 2 von der Säulentrennung hinzu, um Gefäße ("wells") von der Mikrotiterplatte zu trennen. Man liest bei 405 nm ab. 2. Man fügt 100 μl Trübuntgstiterreagens zu jedem well hinzu. 3. Man bebrüte es für 15 Minuten bei Raumtemperatur. 4. Man liest die Ergebnisse mittels eines Lesegeräts bei 405 nm ab, filtert und subtrahiert den Hintergrund in Schritt 1. 5. Man ermittelt eine Kalibrierungskurve durch Nutzung von nichtlinearem Rückgang. 6. Der Transferringehalt in der Serumprobe wird aus der Kalibrierungskurve ermittelt.

Mit dieser Trennungsmethode ist c = 0,98 und d = 0,66.
Beispiel 8
Unterscheidung von Asialo- und Disialo-Transferrin und einer Kombination von Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin durch Nutzung einer kombinierten HPLC-RIA-Methode.
Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, um die Korrelation zu bestimmen zwischen

1) Asialo- und Monosialo-Transferrin-Isoformen in Serumproben,
2) Asialo- und Disialo-Transferrin-Isoformen in Serumproben,
3) (Asialo-, Monosialo- und Disialo-) und Asiolo-Transferrin-Isoformen in Serumproben, und
4) (Asialo-, Monosialo- und Disialo-) und Disialo-Transferrin-Isoformen in Serumproben.

Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Zuverlässigkeit der Beziehung zwischen dem Inhalt des Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin (siehe Punkten 1 – 4) in Serumproben von einer Zahl von verschiednen Individuen zu überprüfen.
Reagenzien, Materialien, Instrumente und Ausstattung:
Das Experiment wurde durchgeführt unter Nutzung von den gleichen Reagenzien, Materialien, Instrumenten und der gleichen Ausstattung, wie im Beispiel 1 beschrieben.
Das Experiment:
Transferrin in flüssigkeitsgestripptem, mit Eisen behandeltem Serum wurde durch zwei kombinierte Methoden, HPLC und RIA, analysiert. Die verschiedenen Sialinsäure-Isoformen wurden bestimmt, zuerst durch Trennung auf einer HPLC mit einer Ionenaustausch-Säule. Die % der verschiedenen Fraktionen werden zuerst mittels HPLC bestimmt, dann wurde die Konzentration auf einem Gammazähler bestimmt durch Nutzung von Teilen von CDTect^TM.
Ergebnisse und Diskussion:
14 Serumproben wurden von 14 Individuen genommen und in jeder dieser Proben wurden die Asialo-, Mono- und Disialo-Transferrin-Teile einzeln getrennt und aufgefangen. Für jede Probe wurde die Konzentration jedes Teils in Prozent des gesamten Transferrins, unter Nutzung der RIA-Methode (% CDT-RIA) und HPLC-Methode (% CDT-HPLC), bestimmt, wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Konzentration des Asialo-, Mono- und Disialo-Transferrins wurde ebenfalls in μg/mL für die RIA-Methode (CDT RIA μg/ML) bestimmt. Diese Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 aufgezeigt.
Tabelle 3
3 zeigt die Trennung von Transferrin-Isoformen durch HPLC. Die Trennung von Monosialo und Disialo ist nicht vollständig, wie zwischen der 9. und 10. Minute ersichtlich.
4A und 4B zeigen die Korrelation von Asialo gegen Disialo. Bei A ist Transferrin in % angegeben, bei B in μg/mL. Der quadrierte Korrelations-Koeffizient, der auf Prozentsatzbestimmung basiert, war 0,5235. Basierend auf Masseeinheiten (4A) war der quadrierte Korrelations-Koeffizient 0,3339. Die Darstellung wurde aufgrund der RIA-Methode hergestellt.
Deshalb zeigte das Asialo- gegen das Monosialo-Transferrin keine Korrelation, für keine der Bestimmungen. Einer der Gründe dafür könnte sein, dass für die höheren Asialo-Werte der Disialo-Höchstwert das Monosialo zu überragen scheint. Das kann 3 entnommen werden.
5A und 5B zeigen eine Korrelation von Asialo gegen Disialo, bei A ins Transferrin dargestellt, bei B in μg/mL. Die Kurven sind aus Daten der RIA-Methode entstanden.
Der quadrierte Korrelations-Koeffizient, der auf einer Bestimmung in Prozent (relative Einheiten) basiert, war 0,9501 (siehe 5A). Der quadrierte Korrelations-Koeffizient basierend auf Masseeinheiten (5B) war 0,8603.
Die Korrelation von Asialo- gegen Disialo-Transferrin war, wie erwartet, besser für die Prozent-Bestimmung als für die in μg/mL. Dies resultiert aus der Berichtigung für viel und wenig Gesamttransferrin für einen hohen bzw. niedrigen Gesamt-Transferrin-Gehalt, in der % Isoform Bestimmung.
6 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Asialo-Transferrin, bestimmt in Masseeinheiten (μg/mL). Der quadrierte Korrelations-Koeffizient war 0,8797. Die Kurve resultiert aus Daten aus der RIA-Methode.
7 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Disialotransferrin, das in Masseeinheiten bestimmt ist (μg/mL). Der quadrierte Korrelations-Koeffizient war 0,9176. Die Kurve resultiert aus Daten aus der RIA-Methode.
Derzeit ist die Genauigkeit einer Asial-Transferrin-Bestimmung geringer als z.B. bei Asial-Transferrin (wegen wesentlich geringerer Konzentration) und deshalb ist der Korrelations-Koeffizient für Asialo-Transferrin geringer. Der Korrelations-Koeffizient für Asialo-Transferrin ist je doch wesentlich höher als man davor für möglich gehalten hätte.
Beispiel 9
Bestimmung von Asialo, Monosialo, Disialo und Trisialo und Kombinationen von Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin unter Nutzung einer kombinierten HPLC-RIA-Methode.
Ein weiteres Experiment wurde zur Bestimmung der Korrelation durchgeführt zwischen

1) Asialo- und (Monosialo- und Disialo-)Transferrin-Isoformen in Serumproben,
2) Asialo- und Trisialo-Transferrin-Isoformen in Serumproben,
3) (Asialo-, Monosialo- und Disialo-) und Asialo-Transferrin-Isoformen in Serumproben und
4) (Asialo-, Monosialo- und Disialo-) und Disialo-Transferrin-Isoformen in Serumproben.

Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Sicherheit/Beständigkeit der Verbindung/des Verhältnisses zwischen dem Gehalt an Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin (in den oben aufgeführten Kombinationen 1 – 4) in Serumproben von einer Zahl von verschiedenen Individuen zu testen.
Reagenzien, Materialien, Instrumente und Ausrüstung:
Das Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung derselben Reagenzien, Materialien, Instrumente und Ausrüstung, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das Experiment:
Transferrin in flüssigkeitsgestrippem, mit Eisen behandeltem Serum wurde durch zwei kombinierte Methoden, HPLC und RIA, analysiert. Die verschiedenen Sialinsäure-Isoformen wurden bestimmt, zuerst durch Trennung an einer HPLC mit einer Ionenaustausch-Säule. Die % der verschiedenen Fraktionen werden zuerst mittels HPLC bestimmt, dann wurde die Konzentration auf einem Gammazähler durch Nutzung von Teilen von CDTect^TM.
Ergebnisse und Diskussion:
26 Serumproben wurden von 26 Individuen genommen. Die Mono- und Disialo-Transferrin-Fraktionen wurden jedoch zusammen als einzelne Fraktion genommen. Die Konzentrationen jeder fraction wurden jeweils durch die RIA- und HPLC-Methode bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgezeigt:
Tabelle 4
8 zeigt die Korrelation von Asialo-Transferrin mit (Monosialo- und Disialo-) Transferrin, bestimmt in % Transferrin. Eine begründete Korrelation wurde erlangt. Der quadrierte Korrelations-Koeffizient war 0,8596. Die Kurven resultieren aus Daten aus der RIA-Methode.
9 zeigt die Korrelation zwischen Asialo- mit Trisialo-Transferrin, bestimmt in % Transferrin. Wie erwartet wurde keine Korrelation gefunden. Der quadrierte Korrelations-Koeffizient lag sehr niedrig bei 0,01754. Die Kurve resultiert aus Daten der RIA-Methode.
10 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Asialo-Transferrin, das in Transferrin bestimmt ist. Der quadrierte Korrelations-Koeffizient lag bei 0,9278. Die Kurve resultiert aus Daten der RIA-Methode.
11 zeigt die Korrelation von (Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin) mit Disialo-Transferrin, das in Transferrin bestimmt ist. Der quadrierte Korrelations-Koeffizient lag bei 0,9906. Die Kurve resultiert aus Daten der RIA-Methode.
Zusammenfassung:
Aus den Beispielen 8 und 9 ergibt sich, dass eine Korrelation sowohl zwischen Asialo- und Mono- und Disialo-Transferrin als auch zwischen Asialo- und Disialo-Transferrin und entweder Asialo- oder Disialo-Transferrin und CDT (Asialo- und Monosialo- und Disialo-Transferrin) besteht. Beachtenswert ist, dass die Monosialo-Fraktion im Gegensatz zu Disialo gering ist und wird deshalb nur eine kleine Rolle in der Korrelations-Studie spielt. Dies weist darauf hin, dass sowohl Asialo- als auch Disialo-Isoformen von Transferrin als Parameter für die Kontrolle von Krankheiten, die durch Alkohol ausgelöst werden, genutzt werden können. Bei Trisialo konnte man keine Korrelation zu Asialo finden, weshalb es wahrscheinlich kein guter Marker ist. Deshalb ist der klinische Wert dieser Untersuchung gemäß der Erfindung nachgewiesen und Kombinationen von Transferrin-Varianten, die für die Herstellung des Algorithmus entsprechend der Erfindung angemessen sind, wurden gefunden.
Darüber hinaus zeigt 9, dass die vollständige Trennung des Disialo-Transferrins nicht nötig ist, da die Präsenz der Monosialo-Variante in der bestimmten oder getrennten Fraktion für die Korrelationsergebnisse nicht schädlich/nachteilig ist.

Claims

Verfahren zum Erzeugen eines Algorithmus zum Bestimmen des Gehalts einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in einer Probe einer Körperflüssigkeit, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten von zumindest zwei Lösungen, von denen jede einen bekannten Gehalt einer Asialo- (A1, A2, A3 usw.) und eines Disialotransferrins (D1, D2, D3 usw.) umfasst, (b) Bestimmen des Gehalts in jeder der Proben einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvariantbruchteilen, die im wesentlichen frei von drei- oder höher-sialylierten Transferrinen sind, (c) Bestimmen des Gesamttransferrinvariantgehalts (T1, T2, T3 usw.) dieser Bruchteile, und (d) Erzeugen eines Algorithmus, der geeignet ist, den Gehalt irgendeiner Transferrinvariante oder Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise eine CDT-Variante oder eine Kombination von CDT-Varianten, in irgendeiner gegebenen Probe einer Körperflüssigkeit zu bestimmen, die dem Bestimmungsschritt b) ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bestimmungsschritt b) den Schritt des Aussetzens jede der Lösungen einem Separationsschritt umfasst, wodurch Bruchteile, die im wesentlichen frei von drei- oder höher-sialylierten Transferrinen sind, separiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Algorithmus geeignet ist, den tatsächlichen Gehalt oder Betrag von Asialo- oder Disialotransferrin zu bestimmen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Algorithmus geeignet ist, den tatsächlichen Gehalt oder Betrag von Asialo-, Monosialo- und Disialotransferrinen zu bestimmen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Algorithmus auf einer Bewertung bzw. Quantifizierung jedes der Isoformen von Transferrin mit null, einem oder zwei Sialsäureresten pro Molekül basiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der Algorithmus auf der Basis der hohen Korrelation zwischen dem Gehalt von Asialo- und Disialotransferrinen in einer Probe erzeugt wird, vorzugsweise auch des geringen Levels von Monosialotransferrin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Algorithmus durch zumindest eine der folgenden Gleichungen definiert ist: A = (T – d.b)/(c + d.a) D = b + a (T – d.b)/(c + d.a) CDT = A + D = b + (a + 1) (T – d.b)/(c + d.a) (wobei T den bestimmten Gesamttransferringehalt in dem bestimmten Bruchteil wiedergibt, A den tatsächlichen Asialotransferringehalt in der Probe wiedergibt, D den tatsächlichen Disialotransferringehalt in der Probe wiedergibt, CDT den tatsächlichen Gesamtgehalt von Asioalo-, Monosialo- und Disialotransferrinen in der Probe wiedergibt, a und b Konstanten sind, die die Korrelation zwischen A und D in einer beliebigen Serumprobe wiedergeben, und c und d Konstanten sind, die dem Bestimmungsschritt spezifisch sind).
Verfahren zum Bestimmen des Gehalts einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise einer CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in einer Körperflüssigkeit zur Verwendung bei der Abschätzung eines Alkoholkonsums, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bestimmen des Gehalts in einer Probe einer Körperflüssigkeit einer Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten eines Bruchteils, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist, (b) Bestimmen des Gesamttransferrinvariantgehalts in dem Bruchteil, und (c) Bestimmen des Gehalts irgendeiner Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten, vorzugsweise den Gehalt irgendeiner CDT-Variante oder einer Kombination von CDT-Varianten, in der Probe unter Verwendung eines Algorithmus, der gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Bestimmungsschritt a) den Schritt des Aussetzens eine Probe der Körperflüssigkeit einem Separationsverfahren umfasst, das geeignet ist, einen Bruchteil zu separieren, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Körperflüssigkeit Blut oder eine blutabgeleitete Probe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem der Bruchteil, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist, zumindest 60 % der Asialo- und Monosialotransferrinvarianten umfasst, die in der Probe vor der Separation vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem der Bruchteil, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist, einen Disialotransferringehalt von zumindest 20 % umfasst, vorzugsweise bis zu 60 bis 70 % des Gesamtdisialotransferringehalts der Probe vor der Separation.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem der Bruchteil, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist, weniger als 20 % Asialotransferrin, weniger als 5 % Monosialotransferrin und 70 bis 80 % Disialotransferrin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem zumindest 70 bis 80 % der Transferrinmoleküle in dem Bruchteil, der im wesentlichen frei von drei- und höhersialylierten Transferrinen ist, eine Kohlenhydratkette oder ein Rest bzw. Residuum davon tragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7 und 9 bis 14, bei dem das Separationsverfahren die Schritte des Kontaktierens einer Probe der Körperflüssigkeit mit einem Kohlenhydratbindeligand, vorzugsweise ein Lectin oder eine Mischung aus Lectinen, gefolgt von der Separation eines Bruchteils, der nicht an dem Ligand gebunden ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Kohlenhydratbindeligand ein Sialinsäurebindelectin ist.
Ausrüstung für eine Diagnoseprobe für die Bewertung eines Alkoholkonsums, wobei die Ausrüstung aufweist: Mittel, um eine Probe einer Körperflüssigkeit einem Bestimmungsschritt auszusetzen, der geeignet ist, den Gehalt von Zieltransferrinvarianten in einem Bruchteil zu bestimmen, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist, Mittel für die Erfassung von Transferrin, und Mittel zum Bestimmen des Gehalts irgendeiner Transferrinvariante oder einer Kombination von Transferrinvarianten in einer Probe einer Körperflüssigkeit, die dem Bestimmungsschritt ausgesetzt ist.
Ausrüstung nach Anspruch 17, bei dem die Ausrüstung weiterhin zumindest zwei Transferrinlösungen mit bekannten Asialo- und Disialokonzentrationen umfasst.
Ausrüstung nach Anspruch 17, bei dem das Mittel zum Bestimmen des Gehalts eines Bruchteils, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist, Mittel, um eine Probe einer Körperflüssigkeit einem Separationsverfahren auszusetzen, umfasst, das geeignet ist, einen Bruchteil zu erzeugen, der im wesentlichen frei von drei- und höher-sialylierten Transferrinen ist.