DE60014676T2

DE60014676T2 - Vorrichtung und verfahren zur analyse flüssiger proben

Info

Publication number: DE60014676T2
Application number: DE2000614676
Authority: DE
Inventors: E. Kurt PETERSEN; T. Michael TAYLOR; Farzad Pourahmadi; A. William McMILLAN; Ronald Chang; H. Stanley SAKAI; Jesus Ching; Phillip Belgrader; Allen M. NORTHRUP; B. Douglas DORITY
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-30
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: US20020019060A1; EP1180135A2; AU5301000A; US9156032B2; CA2373249C; US20080057572A1; CA2374423A1; JP2003501018A; EP1180135B1; US9789481B2; AU5170700A; CA2374423C; US6783736B1; US20040166031A1; AU782343B2; WO2000073413A9; JP4022069B2; WO2000073412A2; US8580559B2; DE60022025T2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Analyse klinischer oder der Umwelt entnommener Fluidproben erfordert gewöhnlich eine Reihe chemischer, optischer, elektrischer, mechanischer oder thermischer Verarbeitungsschritte an den Proben. Ein wesentlicher Schritt bei vielen Proben-Präparationsprotokollen ist das Aufbrechen (Lysieren) von Zellen oder Viren in der Probe, um die Zellbestandteile (z.B. Nucleinsäure) für eine anschließende Analyse freizusetzen. Ein Verfahren zur Freisetzung von Nucleinsäuren aus Zellen ist in US-Patent 5,374,522 offenbart. Das Verfahren umfasst die Schritte des Einbringens einer die Zellen enthaltenden Flüssigkeit in einen Behälter mit Kügelchen und des Anordnens des Behälters in einem Ultraschallbad. Die Zellen werden Ultraschallenergie von dem Bad ausgesetzt, um eine Lyse der Zellen zu bewirken. US-Patent 5,652,141 offenbart ein anderes Verfahren zur Isolation von Nucleinsäuren durch Lyse intakter Zellen, die in einer porösen Matrix mit Ionenaustauscheigenschaften immobilisiert sind. Jede der Poren in der Matrix besitzt eine ausreichende Größe, um eine der Zellen einzufangen. Die eingefangenen Zellen werden durch Ultraschallwellen, Scherkräfte, Detergenzien, Enzyme, osmotischen Schock oder Kombinationen davon lysiert. Die zum Vorschein kommenden Nucleinsäuren werden auf der Matrixoberfläche durch Ionenaustausch fixiert und anschließend eluiert.
In den letzten Jahren gibt es ein wachsendes Interesse an der Entwicklung von Einmalkartuschen zur Durchführung der Probenpräparation und Analyse biologischer Proben für verschiedene Diagnose- und Monitoringzwecke. US-Patent 5,587,128 zum Beispiel offenbart Vorrichtungen zum Amplifizieren eines vorgewählten Polynucleotids in einer Probe durch die Durchführung einer Polynucleotid-Amplifikationsreaktion. US-Patent 5,922,591 beschreibt ein miniaturisiertes, integriertes Nucleinsäure-Diagnosegerät und -system. Das Gerät ist dafür bestimmt, einen oder mehrere Arbeitsgänge der Probenbeschaffung und -präparation in Verbindung mit einem oder mehreren Analysegängen durchzuführen. Die Veröffentlichung WO 99/09042 offenbart eine mikrofluidische Vorrichtung und ein Verfahren zur Trennung einer gewünschten Substanz wie Nucleinsäure von anderen Substanzen in einer Fluidprobe. Die Vorrichtung besitzt eine Kammer mit inneren Bindungsoberflächen zum Einfangen der gewünschten Substanz, während die Fluidprobe durch die Kammer strömt. Die eingefangene Substanz wird dann zur anschließenden Analyse eluiert. Die Vorrichtung wird vorzugsweise in Verbindung mit einer Kartusche verwendet, die einen Vorverarbeitungsort (z.B. einen zell-lysierenden Ort) für die Fluidprobe aufweist und/oder einen Nachverarbeitungsort (z.B. einen Detektionsbereich) für die eluierte Substanz aufweist.
Trotz dieser Fortschritte im Stand der Technik bleibt ein Bedarf an einer Kartusche, die eine effizientere Verarbeitung einer Probe gestattet, um den genauen Nachweis niederkonzentrierter Analyten zu ermöglichen. Von besonderem Interesse ist der Nachweis von Analyten (z.B. Nucleinsäuren), die in vielen Proben in geringen Konzentrationen vorkommen. Zum Beispiel können beim Nachweis infektiöser Erkrankungen gramnegative Bakterien mit weniger als 10 Kopien pro Milliliter Blut vorhanden sein, Cryptosporidium tritt gewöhnlich in nur wenigen Kopien pro Gallone Trinkwasser auf, Agenzien mit hohem Biobedrohungspotential (z.B. Anthrax) mit weniger als 100 Kopien pro Milliliter Wasser, und nahrungsmittelvergiftende Agenzien wie E. coli und Salmonella können in weniger als 10 Kopien pro Gramm Nahrungsmittel manifestiert sein.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Analyse einer Fluidprobe bereit, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten in der Probe zu bestimmen. Die Vorrichtung umfasst eine Kartusche zum Trennen eines gewünschten Analyten von der Probe und zum Halten des Analyten für eine chemische Reaktion und optische Detektion. Die Erfindung stellt außerdem ein Instrument zur Aufnahme der Kartusche für die Probenverarbeitung bereit. Der gewünschte Analyt ist typischerweise intrazelluläres Material (z.B. Nucleinsäure, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Bakterien oder intrazelluläre Parasiten). Bei einer bevorzugten Anwendung ist der Analyt Nucleinsäure, welche die Kartusche von der Fluidprobe trennt und für eine Amplifikation (z.B. mittels PCR) und optische Detektion festhält.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist die Kartusche eine Probenöffnung zum Einführen einer Probe in die Kartusche und einen Probenströmungsweg auf, der sich von der Probenöffnung erstreckt. Die Kartusche weist außerdem eine Lysierungskammer im Probenströmungsweg auf. Die Lysierungskammer enthält zumindest ein Filter zum Einfangen von Zellen oder Viren aus der Probe, während die Probe durch die Lysierungskammer strömt. Ebenfalls in der Lysierungskammer angeordnet sind Kügelchen zum Aufbrechen der Zellen oder Viren, um den Analyten aus diesen freizusetzen. Die Kartusche enthält außerdem eine Abfallkammer, die über den Probenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht, um die übrige Probe nach dem Strömen der Probe durch die Lysierungskammer aufzunehmen. Die Kartusche enthält ferner einen Analytenströmungsweg, der sich von der Lysierungskammer erstreckt. Der Analytenströmungsweg weicht vom Probenströmungsweg ab. Bei einer Ausführungsform führt der Analytenströmungsweg zu einer Reaktionskammer, um den Analyten chemisch zur Reaktion zu bringen und optisch nachzuweisen. Die Kartusche enthält auch wenigstens eine Strömungssteuerung (z.B. Ventile) zum Leiten der Probe in die Abfallkammer, nachdem die Probe durch die Lysierungskammer geflossen ist, und zum Leiten des von der Probe getrennten Analyten in den Analytenströmungsweg. Die Konstruktion der Kartusche gestattet die effiziente Verarbeitung großer Probenvolumen, um den genauen Nachweis niederkonzentrierter Analyten zu ermöglichen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine isometrische Ansicht einer Kartusche zur Analyse einer Fluidprobe gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung.
2 ist eine isometrische Unteransicht der Kartusche von 1.
3 ist eine Explosionsansicht der Kartusche von 1.
4 ist eine weitere Explosionsansicht der Kartusche von 1.
5 ist eine teilweise geschnittene Ansicht eines Ultraschallhorns, das mit einer Wand einer in der Kartusche von 1 ausgebildeten Lysierungskammer gekoppelt ist.
6 ist eine Explosionsansicht eines Filterstapels, der in der Lysierungskammer der Kartusche von 1 angeordnet ist.
7 ist eine Draufsicht der Kartusche von 1.
8 ist eine Unteransicht der Kartusche von 1.
9 ist ein schematisches Blockdiagramm der Kartusche von 1.
10 ist eine isometrische Ansicht eines Instruments, in das die Kartusche von 1 zur Verarbeitung eingesetzt wird.
11 ist eine isometrische Ansicht der Kartusche von 1 in dem Instrument von 10.
12 ist eine teilweise geschnittene Ansicht der Kartusche von 1 in dem Instrument von 10.
13 ist eine schematische Draufsicht eines optischen Sensors, der angeordnet ist, um Flüssigkeitspegel in der Kartusche von 1 zu erfassen.
14 ist eine teilweise geschnittene schematische Seitenansicht eines optischen Schlitzsensors, der angeordnet ist, um den Flüssigkeitspegel in einer Sensorkammer der Kartusche von 1 zu erfassen.
15A ist eine Querschnittansicht eines Teils des Körpers der Kartusche von 1, die zwei verschiedene Typen von Ventilen in der Kartusche darstellt.
15B ist eine Querschnittansicht der Ventile von 15A in einer geschlossenen Stellung.
16A ist eine weitere Querschnittansicht eines der Ventile von 15A in einer offenen Stellung.
16B ist eine Querschnittansicht des Ventils von 16A in einer geschlossenen Stellung.
17–19 erläutern ein Ventilbetätigungssystem zum Öffnen und Schließen der Ventile von 15A.
20 ist eine Querschnittansicht eines alternativen Ventilstellers zum Öffnen und Schließen der Ventile in der Kartusche von 1. 20 zeigt außerdem eine Drucklieferdüse, die luftdicht mit einer in der Kartusche von 1 ausgebildeten Drucköffnung verbunden ist.
21 ist eine teilweise explodierte isometrische Ansicht eines Reaktionsbehälters der Kartusche von 1.
22 ist einer Vorderansicht des Behälters von 21.
23 ist eine Seitenansicht des Behälters von 21, eingeschoben zwischen zwei Heizplatten.
24 ist eine Vorderansicht einer der Heizplatten von 23.
25 ist eine Vorderansicht eines alternativen Reaktionsbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung.
26 ist eine Vorderansicht eines weiteren Reaktionsbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung.
27 ist eine andere Vorderansicht des Behälters von 21.
28 ist eine Vorderansicht des Behälters von 21, eingesetzt in ein Wärmetauschmodul des Instruments von 10.
29 ist eine Explosionsansicht einer Halterungskonstruktion zum Halten der Platten von 23.
30–31 sind Montageansichten der Halterungskonstruktion von 29.
32 ist eine isometrische Ansicht, welche das Äußere einer der Optikgruppen in dem Wärmetauschmodul von 28 zeigt.
33 ist eine isometrische Ansicht der Platten von 23 in Kontakt mit der Optikgruppe von 32.
34 ist eine teilweise geschnittene isometrische Ansicht des Reaktionsbehälters von 21, eingeschoben zwischen die Platten von 23. Nur der untere Teil des Behälters ist in der Figur enthalten.
35 ist ein schematisches Blockdiagramm der Elektronik des Wärmetauschmoduls von 28.
36 ist eine isometrische Ansicht einer Vorrichtung zum Aufbrechen von Zellen oder Viren gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung.
37 ist eine Querschnittansicht der Vorrichtung von 36
38 ist eine Explosionsansicht eines in der Vorrichtung von 36 verwendeten Behälters.
39 ist eine Querschnittansicht des Behälters von 38.
40 ist ein schematisches Blockdiagramm eines fluidischen Systems, das die Vorrichtung von 36 enthält.
41 ist eine Querschnittansicht eines anderen Behälters zur Verwendung in der Vorrichtung von 36. Ein Ultraschallhorn berührt eine Wand des Behälters, die sich nach außen zum Horn hin wölbt.
42 ist eine Querschnittansicht der Wand von 41.
43A–43B sind isometrische Ansichten gegenüberliegender Seiten einer anderen Wand, die sich zur Verwendung in einem Behälter zum Halten von aufzubrechenden Zellen oder Viren eignet.
44 ist eine teilweise geschnittene isometrische Ansicht eines Behälters, der die Wand von 43A–43B umfasst.
45 ist eine Unteransicht des Behälters von 44.
GENAUE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Analyse einer Fluidprobe bereit. In einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Kartusche zum Trennen eines gewünschten Analyten von einer Fluidprobe und zum Halten des Analyten für eine chemische Reaktion bereit. Die Fluidprobe kann eine Lösung oder Suspension sein. Bei einer speziellen Anwendung kann die Probe eine Körperflüssigkeit (z.B. Blut, Urin, Speichel, Sputum, Samenflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Schleim oder andere Körperflüssigkeiten) sein. Alternativ kann die Probe ein Feststoff sein, der in einer Flüssigkeit aufgelöst oder suspendiert wurde, oder die Probe kann eine Umweltprobe wie Grund- oder Abwasser, Bodenextrakte, Pestizidrückstände oder luftgetragene Sporen sein, die in eine Flüssigkeit eingebracht wurden. Ferner kann die Probe mit einer/einem oder mehreren Chemikalien, Reagenzien, Verdünnungsmitteln oder Puffern gemischt sein. Die Probe kann vorbehandelt sein, zum Beispiel mit Chemikalien gemischt, zentrifugiert, pelletiert etc., oder die Probe kann in Rohform vorliegen.
Der gewünschte Analyt ist typischerweise intrazelluläres Material (z.B. Nucleinsäure, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Bakterien oder intrazelluläre Parasiten). Bei einer bevorzugten Anwendung ist der Analyt Nucleinsäure, welche die Kartusche von der Fluidprobe trennt und für eine Amplifikation (z.B. mittels PCR) und optische Detektion festhält. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Nucleinsäure" jede synthetische oder natürlich vorkommende Nucleinsäure wie DNA oder RNA in jeder möglichen Konfiguration, d.h. in Form doppelsträngiger Nucleinsäure, einzelsträngiger Nucleinsäure oder jeder Kombination davon.
1 zeigt eine isometrische Ansicht einer Kartusche 20 gemäß der bevorzugten Ausführungsform. Die Kartusche 20 ist dafür ausgelegt, Nucleinsäure von einer Fluidprobe zu trennen und die Nucleinsäure für eine Amplifikation und Detektion festzuhalten. Die Kartusche 20 weist einen Körper auf, der ein Oberteil 22, ein Mittelteil 24 und ein Unterteil 26 umfasst. Eine Einlassöffnung zum Einführen einer Fluidprobe in die Kartusche ist im Oberteil 22 ausgebildet und durch eine Kappe 30 verschlossen. Sechs Drucköffnungen 32 sind ebenfalls im Oberteil 22 ausgebildet. Die Drucköffnungen 32 dienen zur Aufnahme von Düsen von Druckquellen, z.B. Pumpen oder Vakuen. Die Kartusche umfasst ferner Ausrichtungsfüße 28, die sich zwecks Positionierung der Kartusche 20 in einem Instrument (unten unter Bezugnahme auf 10 beschrieben) vom Unterteil 26 erstrecken. Im Ober- und Mittelteil 22, 24 sind Einbuchtungen oder Vertiefungen 38A, 38B und 38C ausgebildet. Die Einbuchtungen dienen zur Aufnahme optischer Sensoren, welche den Fluidstrom in der Kartusche 20 erfassen. Die Kartusche 20 enthält außerdem Entlüftungsöffnungen 34, 36. Jede Drucköffnung und Entlüftungsöffnung enthält vorzugsweise eine hydrophobe Membran, die den Durchtritt von Gas, aber nicht von Flüssigkeit in die oder aus den Entlüftungs- und Drucköffnungen gestattet. Modifizierte Acrylcopolymer-Membranen sind im Handel z.B. von Gelman Sciences (Ann Arbor, MI) erhältlich, und Particle-track-etched-Polycarbonatmembranen sind von Poretics, Inc. (Livermore, CA) erhältlich.
2 ist eine isometrische Ansicht, welche die Unterseite der Kartusche 20 zeigt. Neun Löcher 60 sind im Unterteil 26 zur Aufnahme von Ventilstellern ausgebildet, die Ventile in der Kartusche 20 öffnen und schließen. Ein Loch 62 zur Aufnahme eines Wandlers (nachstehend unter Bezugnahme auf 5 ausführlich beschrieben) ist ebenfalls im Unterteil 26 ausgebildet. Die Kartusche 20 umfasst auch einen Reaktionsbehälter 40, der sich von dem Körper der Kartusche nach außen erstreckt. Der Behälter 40 weist eine Reaktionskammer 42 zum Halten eines Reaktionsgemisches (z.B. Nucleinsäure, gemischt mit Amplifikationsreagenzien und Fluoreszenzsonden) für eine chemische Reaktion und optische Detektion auf. Einer der Strömungswege in der Kartusche trägt das Reaktionsgemisch zur Kammer 42 für eine chemische Reaktion und optische Detektion. Der Behälter 40 erstreckt sich vom Körper der Kartusche 20 nach außen, so dass der Behälter 40 ohne die Notwendigkeit einer Trennung des Behälters 40 vom Rest der Kartusche 20 zwischen ein Paar gegenüberliegende Thermoplatten (zum Heizen und Kühlen der Kammer 42) geschoben werden kann. Dies verringert die Gefahr einer Kontamination und/oder eines Verschüttens beträchtlich. Der Behälter 40 kann mit dem Körper der Kartusche einstückig geformt (z.B. in einem Stück mit dem Mittelteil 24 gegossen) sein. Es wird gegenwärtig jedoch bevorzugt, den Behälter 40 als gesondertes Element herzustellen, das während der Erzeugung der Kartusche mit dem Körper verbunden wird.
3–4 zeigen Explosionsansichten der Kartusche. Wie in 3 dargestellt, weist das Mittelteil 24 mehrere darin ausgebildete Kammern auf. Das Mittelteil 24 enthält insbesondere eine Probenkammer 65 zum Halten einer durch die Einlassöffnung 64 eingeführten Fluidprobe, eine Waschkammer 66 zum Halten einer Waschlösung, eine Reagenskammer 67 zum Halten eines Lysierungsreagens, eine Abfallkammer 68 zur Aufnahme von gebrauchter Probe und Waschlösung, eine Neutralisiererkammer 70 zum Halten eines Neutralisierungsmittels, und eine Mastermixkammer 71 zum Halten eines Mastermixes (z.B. Amplifikationsreagenzien und Fluoreszenzsonden) und zum Mischen der Reagenzien und Sonden mit dem von der Fluidprobe getrennten Analyten. Die Probenkammer 65 enthält fakultativ ein Seitenabteil 155 mit geringfügig niedrigeren Wänden als die Probenkammer 65. Das Seitenabteil 155 dient dazu, einem Benutzer optisch anzuzeigen, wann der Probenkammer 65 genügend Probe zugefügt wurde, d.h., wann der Flüssigkeitspegel in der Kammer 65 hoch genug ist, um in das Abteil 155 überzulaufen.
Das Oberteil 22 enthält die Entlüftungsöffnungen 34, 36 und die sechs Drucköffnungen 32, wie zuvor beschrieben. Zwischen den Teilen 22, 24 ist eine Elastomermembran oder -dichtung 61 angeordnet und zusammengepresst, um die verschiedenen Kanäle und Kammern, die in den Teilen ausgebildet sind, abzudichten. Das Mittelteil 24 umfasst vorzugsweise mehrere Dichtlippen, um sicherzustellen, dass die Dichtung 61 eine angemessene Abdichtung bildet. Das Mittelteil 24 umfasst insbesondere vorzugsweise Dichtlippen 73, die jede der Kammern 65, 66, 67, 68, 70 und 71 umgeben. Das Mittelteil 24 umfasst außerdem Stützwände 75 am Umfang und dazwischenliegende Dichtlippen 76. Die Dichtlippen 73 und 76 und die Stützwände 75 drücken die Dichtung 61 örtlich zusammen und erzielen eine Abdichtung.
Wie in 4 dargestellt, hat das Mittelteil 24 in seiner Unterseite verschiedene Kanäle ausgebildet, von denen einer zu einer Lysierungskammer 86 führt. Die Kammer 86 ist mit dem Loch 62 in dem Unterteil 26 ausgerichtet, so dass ein Wandler (z.B. ein Ultraschallhorn) durch das Loch 62 eingeführt werden kann, um in der Lysierungskammer 86 Druckwellen zu erzeugen. Das Mittelteil 24 weist außerdem neun Ventilsitze 84 auf, die in seiner Unterseite ausgebildet sind. Die Ventilsitze 84 sind mit den neun Löchern 60 in dem Unterteil 26 ausgerichtet, so dass Ventilsteller durch die Löcher 60 in die Ventilsitze 84 eingeführt werden können.
Zwischen den Teilen 24, 26 ist eine Elastomermembran oder -dichtung 63 angeordnet und zusammengepresst, um die verschiedenen Kanäle, Ventilsitze und Kammern, die in dem Mittelteil 24 ausgebildet sind, abzudichten. Das Mittelteil 24 umfasst vorzugsweise mehrere Dichtlippen, um sicherzustellen, dass die Dichtung 63 eine angemessene Abdichtung bildet. Das Mittelteil 24 umfasst insbesondere vorzugsweise Dichtlippen 73, welche die Lysierungskammer 86, Ventilsitze 84 und verschiedenen Kanäle umgeben. Das Mittelteil 24 umfasst außerdem Stützwände 75 an seinem Umfang und dazwischenliegende Dichtlippen 76. Die Dichtlippen 73 und 76 und die Stützwände 75 drücken die Dichtung 63 örtlich zusammen und erzielen eine Abdichtung. Neben der Abdichtung verschiedener Kanäle und Kammern fungiert die Dichtung 63 auch als ein Ventilschaft, indem sie bei Betätigung durch eines der Löcher 60 in einen entsprechenden Ventilsitz 84 gepresst wird und somit einen der Strömungskanäle im Mittelteil 24 verschließt. Diese Ventilwirkung wird unten unter Bezugnahme auf 15–16 genauer beschrieben.
Die Dichtung 63 bildet auch die untere Wand der Lysierungskammer 86, an der ein Wandler angeordnet wird, um ein Aufbrechen von Zellen oder Viren in der Kammer 86 zu bewirken. Jede der Dichtungen 61, 63 besteht vorzugsweise aus einem Elastomer. Geeignete Dichtungsmaterialien sind Siliconkautschuk, Neopren, EPDM oder jedes andere nachgiebige Material. Jede der Dichtungen 61, 63 besitzt vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,005 bis 0,125 Inch (0,125 bis 3,175 mm) und bevorzugter im Bereich von 0,01 bis 0,06 Inch (0,25 bis 1,5 mm) bei einer gegenwärtig bevorzugten Dicke von 0,031 Inch (0,79 mm). Die Dicke wird so gewählt, dass sichergestellt ist, dass die Dichtung nachgiebig genug ist, um die Kanäle und Kammern abzudichten, in die Ventilsitze 84 gepresst zu werden und sich zwecks Berührung des Wandlers unter Druck auszudehnen.
Wie in 3 dargestellt, enthält das Mittelteil 24 einen Schlitz 79, durch den der Reaktionsbehälter 40 beim Zusammenbau der Kartusche eingeschoben wird. Der Behälter 40 besitzt zwei Fluidöffnungen 41, 43 zum Zugeben und Entfernen von Fluid aus dem Behälter. Wenn das Oberteil 22 über die Dichtung 61 dicht mit dem Mittelteil 24 verbunden wird, werden die Öffnungen 41, 43 in Fluidkommunikation mit den Kanälen 80 bzw. 81 gebracht, die in dem Oberteil 22 ausgebildet sind (siehe 4). Die Dichtung 61 dichtet die jeweiligen fluidischen Schnittstellen zwischen den Öffnungen 41, 43 und den Kanälen 80, 81 ab. Ober-, Mittel- und Unterteil 22, 24, 26 sind vorzugsweise spritzgegossene Teile aus polymerem Material wie Polypropylen, Polycarbonat oder Acryl. Obwohl Guss zur Massenfertigung bevorzugt wird, ist es auch möglich, das Ober-, Mittel- und Unterteil 22, 24, 26 durch spanabhebende Bearbeitung herzustellen. Die Teile 22, 24, 26 können durch Schrauben oder Bolzen zusammengehalten werden. Alternativ könnten Ultraschallbonding, Quellschweißen oder Rastkonstruktionen zum Zusammenbau der Kartusche eingesetzt werden.
4 zeigt außerdem einen Filterring 88. Der Filterring 88 presst einen Stapel von Filtern zusammen und hält ihn in der Lysierungskammer 86. 6 zeigt eine Explosionsansicht eines Filterstapels 87. Der Zweck des Filterstapels 87 ist es, Zellen oder Viren aus einer Fluidprobe einzufangen, während die Probe durch die Lysierungskammer 86 fließt. Die eingefangenen Zellen oder Viren werden dann in der Kammer 86 aufgebrochen (lysiert). Die Zellen können tierische oder pflanzliche Zellen, Sporen, Bakterien oder Mikroorganismen sein. Die Viren können jede Art von Infektionserreger mit einem Proteinmantel sein, der einen RNA- oder DNA-Kern umgibt.
Der Filterstapel 87 umfasst eine Dichtung 93, ein erstes Filter 94, eine Dichtung 95, ein zweites Filter 97 mit einer kleineren Porengröße als das erste Filter 94, eine Dichtung 98, ein drittes Filter 100 mit einer kleineren Porengröße als das zweite Filter 97, eine Dichtung 101, ein Gewebesieb 102 und eine Dichtung 103. Der Filterstapel umfasst außerdem vorzugsweise einen ersten Satz von Kügelchen 96, die zwischen dem ersten und dem zweiten Filter 94 und 97 angeordnet sind, und einen zweiten Satz von Kügelchen 99, die zwischen dem zweiten und dem dritten Filter 97 und 100 angeordnet sind. Der Filterring 88 presst den Filterstapel 87 in die Lysierungskammer 86, so dass die Dichtung 93 gegen das Filter 94 gedrückt wird, das Filter 94 gegen die Dichtung 95 gedrückt wird, die Dichtung 95 gegen das Filter 97 gedrückt wird, das Filter 97 gegen die Dichtung 98 gedrückt wird, die Dichtung 98 gegen das Filter 100 gedrückt wird, das Filter 100 gegen die Dichtung 101 gedrückt wird, die Dichtung 101 gegen das Sieb 102 gedrückt wird, das Sieb 102 gegen die Dichtung 103 gedrückt wird und die Dichtung 103 gegen den äußeren Umfang der Bodenwand der Lysierungskammer 86 gedrückt wird. Die Dichtung 95 ist dicker als der mittlere Durchmesser der Kügelchen 96, so dass sich die Kügelchen frei in dem Raum zwischen den Filtern 94 und 97 bewegen können. Desgleichen ist die Dichtung 98 dicker als der mittlere Durchmesser der Kügelchen 99, so dass sich die Kügelchen 99 frei in dem Raum zwischen den Filtern 97 und 100 bewegen können. Eine Fluidprobe, die durch den Kanal 106 in die Lysierungskammer 86 strömt, fließt zunächst durch Filter 94, dann durch Filter 97, als nächstes durch Filter 100 und zuletzt durch das Sieb 102. Nach dem Durchströmen des Filterstapels 87 fließt die Probe an den Strömungsrippen 91 entlang, die in der Oberseite der Lysierungs kammer 86 ausgebildet sind, und durch einen Auslasskanal (in 6 nicht dargestellt).
Laut 5 werden Zellen oder Viren, die in dem Filterstapel (zwecks Übersichtlichkeit der Abbildung in 5 nicht dargestellt) eingefangen sind, lysiert, indem ein Wandler 92 (z.B. ein Ultraschallhorn) direkt mit der Wand der Lysierungskammer 86 gekoppelt wird. Bei dieser Ausführungsform wird die Wand der Lysierungskammer 86 von der elastischen Dichtung 63 gebildet. Der Wandler 92 sollte eine Außenfläche der Wand direkt berühren. Der Ausdruck "Außenfläche" soll eine Oberfläche der Wand bedeuten, die sich außerhalb der Lysierungskammer 86 befindet. Der Wandler 92 ist eine vibrierende oder oszillierende Vorrichtung, die aktiviert wird, um Druckwellen in der Kammer 86 zu erzeugen. Die Druckwellen bewegen die Kügelchen 96, 99 (6) hin und her, und die Bewegung der Kügelchen bricht die eingefangenen Zellen oder Viren auf. Im allgemeinen kann der Wandler zum Berühren der Wand der Lysierungskammer 86 ein Ultraschallwandler, ein piezoelektrischer, magnetostriktiver oder elektrostatischer Wandler sein. Der Wandler kann auch eine elektromagnetische Vorrichtung mit einer Spule wie zum Beispiel ein Schwingspulenmotor oder eine Solenoidvorrichtung sein. Es wird gegenwärtig bevorzugt, dass der Aktuator ein Ultraschallwandler wie ein Ultraschallhorn ist. Geeignete Hörner sind im Handel von Sonics & Materials, Inc. erhältlich, mit einem Büro in 53 Church Hill, Newton, Connecticut, 06470–1614 USA. Alternativ kann der Ultraschallwandler eine piezoelektrische Scheibe oder jede andere Art eines mit dem Behälter koppelbaren Ultraschallwandlers umfassen. Es wird gegenwärtig bevorzugt, ein Ultraschallhorn zu verwenden, da die Hornkonstruktion hochresonant ist und eine wiederholbare und scharfe Anregungsfrequenz und starke Bewegung der Hornspitze gewährleistet.
Wie zuvor in 6 beschrieben, umfasst der Filterstapel an beiden seiner Enden eine Dichtung. Wie in 5 dargestellt, weist das mittlere Kartuschenteil 24 eine Dichtlippe 90 auf, gegen welche die Dichtung an dem einem Ende des Filterstapels gepresst wird. Die Dichtung an dem anderen Ende des Filterstapels wird von dem Filterring 88 zusammengepresst, um eine Abdichtung zu bilden. Das Dichtungsmaterial kann sich in den Aussparungsbereich außerhalb der Dichtlippe 90 aus dehnen. Die Breite der Dichtlippe 90 ist gering (typischerweise 0,5 mm), so dass keine übermäßige Kraft erforderlich ist, um eine ausreichende Abdichtung zu erzielen.
Der Filterring 88 wird zwischen dem Filterstapel und der Kartuschendichtung 63 gehalten. Die Kartuschendichtung 63 wird zwischen dem Mittelteil 24 und dem Unterteil 26 durch eine Dichtlippe 406 gehalten. Kraft wird daher von dem Unterteil 26 durch die Dichtung 63 auf den Filterring 88 und letztlich auf den Filterstapel übertragen. Der Filterring 88 enthält eine Kontaktlippe 404, welche die Dichtung 63 berührt. Die Kontaktlippe 404 ist keine primäre Dichtlippe (obwohl sie abdichten wird), sondern ein Kraftübertragungsmechanismus. Die Breite der Kontaktlippe 404 ist größer als die Breite der Dichtlippe 90, um sicherzustellen, dass Deformation und Dichtwirkung in dem Filterstapel erfolgt und nicht beim Quetschen der Kartuschendichtung 63 absorbiert wird. Das Kartuschenmittelteil 24 weist ebenfalls eine Dichtlippe 406 auf, die den Filterring 88 umgibt. Dies ist ein aktiver Dichtungsbereich, der nicht durch die Anwesenheit des Filterringes 88 beeinträchtigt werden sollte. Aus diesem Grund besteht zwischen der Dichtlippe 406 und der Kontaktlippe 404 auf dem Filterring 88 eine Lücke 407. Die Lücke 407 ist vorgesehen, um eine Verdrängung der Dichtung 63 in die Lücke 407 zu ermöglichen, wenn sie von der Dichtlippe 406 und der Kontaktlippe 404 zusammengepresst wird. Falls die Kontaktlippe 404 eine andere Höhe erreicht als die Dichtlippe 406, wird die Abdichtung wegen der Lücke 407 und des Abstands zwischen den Lippen 404 und 406 nicht beeinträchtigt werden.
Wieder bezugnehmend auf 6 ist der Filterstapel 87 wirksam für das Einfangen von Zellen oder Viren, während eine Fluidprobe durch den Stapel 87 strömt, ohne dass eines der Filter 94, 97, 100 im Stapel verstopft. Das erste Filter 94 (mit der größten Porengröße) filtert grobes Material wie Salzkristalle, Zelltrümmer, Haare, Gewebe etc. aus. Das zweite Filter 97 (mit der mittleren Porengröße) fängt Zellen oder Viren in der Fluidprobe ein. Das dritte Filter 100 (mit der kleinsten Porengröße) fängt kleinere Zellen oder Viren in der Probe ein. Der Filterstapel 87 ermöglicht somit das gleichzeitige Einfangen verschieden großer Probenkomponenten ohne Ver stopfen der Filter. Die mittlere Porengröße des ersten Filters 94 wird so ausgewählt, dass sie genügend klein ist, um grobes Material aus der Fluidprobe zu filtern (z.B. Salzkristalle, Zelltrümmer, Haare, Gewebe), jedoch groß genug, um den Durchtritt der Zielzellen oder -viren zu gestatten, welche den gewünschten Analyten (z.B. Nucleinsäure oder Proteine) enthalten. Allgemein sollte die Porengröße des ersten Filters 94 im Bereich von etwa 2 bis 25 μm liegen, bei einer gegenwärtig bevorzugten Porengröße von etwa 5 μm.
Die mittleren Porengrößen des zweiten und des dritten Filters werden in Abhängigkeit von der mittleren Größe der Zielzellen oder -viren, welche den/die gewünschten Analyten enthalten, ausgewählt. Bei einer Ausführungsform wird der Filterstapel 87 zum Beispiel verwendet, um Gonorrhoe- (GC-) und Chlamydia-(Ct-)Organismen einzufangen, um das Vorhandensein der Erkrankungen in der Fluidprobe zu bestimmen. Die GC- und Ct-Organismen besitzen verschiedene mittlere Durchmesser, etwa 1 bis 2 μm für GC-Organismen und etwa 0,3 μm für Ct-Organismen. Bei dieser Ausführungsform weist das zweite Filter 97 eine mittlere Porengröße von etwa 1,2 μm auf, während das dritte Filter 100 eine mittlere Porengröße von etwa 0,22 μm hat, so dass die meisten GC-Organismen von dem zweiten Filter 97 eingefangen werden, während die meisten Ct-Organismen von dem dritten Filter 100 eingefangen werden. Der Filterstapel ermöglicht somit das gleichzeitige Einfangen verschieden großer Zielorganismen und tut dies ohne Verstopfen der Filter. Die Porengröße der Filter 97, 100 kann dafür ausgewählt werden, gewünschte Zellen oder Viren jeder Größe einzufangen, und der Umfang der Erfindung ist nicht auf das gegebene spezifische Beispiel beschränkt.
Der Filterstapel 87 dient auch zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren, um daraus das intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) freizusetzen. Der erste und der zweite Satz Kügelchen 96, 99 erfüllen in dieser Hinsicht zwei praktische Zwecke. Erstens werden die Kügelchen durch die vom Wandler erzeugten Druckwellen hin- und herbewegt. Die Bewegung der Kügelchen bricht die eingefangenen Zellen oder Viren auf. Zweitens können die Kügelchen die aus den lysierten Zellen oder Viren freigesetzte Nucleinsäure scheren, so dass die Nucleinsäurestränge kurz genug sind, um durch die Filter und aus der Lysierungskammer 86 zu strömen. Geeignete Kügelchen zum Aufbrechen der Zellen oder Viren umfassen Borsilicatglas-, Kalkglas, Silica- und Polystyrol-Kügelchen.
Die Kügelchen können porös oder porenfrei sein und besitzen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von 1 bis 200 μm. Der mittlere Durchmesser der Kügelchen 96, 99 wird in Abhängigkeit von den Zielzellen oder -viren ausgewählt, die von den Kügelchen aufgebrochen werden sollen. Der mittlere Durchmesser der Kügelchen 96 im ersten Satz kann dem mittleren Durchmesser der Kügelchen 99 im zweiten Satz entsprechen. Wenn dagegen der erste Satz Kügelchen 96 dazu verwendet wird, eine Zielzellen- oder Virenart aufzubrechen, die sich von der vom zweiten Satz Kügelchen 99 aufzubrechenden Zell- oder Virenart unterscheidet, ist es vorteilhaft, den mittleren Durchmesser der Kügelchen so auszuwählen; dass sich der mittlere Durchmesser der Kügelchen 96 im ersten Satz vom mittleren Durchmesser der Kügelchen 99 im zweiten Satz unterscheidet. Wenn zum Beispiel der Filterstapel dazu verwendet wird, wie oben beschrieben GC- und Ct-Zellen einzufangen, sind die Kügelchen 96 Borsilicatglas-Kügelchen von 20 μm Durchmesser zum Aufbrechen der GC-Organismen und sind die Kügelchen 99 Natronkalkglas-Kügelchen von 106 μm Durchmesser zum Aufbrechen der Ct-Organismen. Jede der Silicondichtungen 95, 98 sollte ausreichend dick sein, um den Kügelchen 96, 99 Raum zum Bewegen und Aufbrechen der Zellen oder Viren zu gewähren.
Das Sieb 102 erfüllt ebenfalls zwei praktische Zwecke. Erstens bietet das Sieb dem Filterstapel 87 Stütze. Zweitens zerteilt das Sieb Luftblasen, so dass die Blasen durch die Strömungsrippen 91 und aus der Lysierungskammer 86 geschleust werden können. Um die Größe der Luftblasen wirksam zu zerteilen oder zu verringern, weist das Sieb 102 vorzugsweise eine geringe Porengröße auf. Vorzugsweise ist es ein Polypropylengewebesieb mit einer mittleren Porengröße von etwa 25 μm. Um sicherzustellen, dass die Luftblasen aus der Lysierungskammer 86 entweichen können, ist es wünschenswert, die Kartusche in einer Orientierung zu verwenden, in welcher die Flüssigkeit nach oben (bezogen auf die Schwerkraft) durch den Filterstapel 87 und die Lysierungskammer 86 strömt. Der Aufwärtsstrom durch die Kam mer 86 unterstützt den Strom von Luftblasen aus der Kammer 86. Somit sollte die Einlassöffnung zum Eintritt von Fluida in die Kammer 86 im allgemeinen am niedrigsten Punkt in der Kammer liegen, während die Austrittsöffnung am höchsten liegen sollte.
Viele verschiedene Ausführungsformen des Filterstapels sind möglich. Bei einer alternativen Ausführungsform weist der Filterstapel zum Beispiel nur zwei Filter und einen Satz von Kügelchen auf, die zwischen den Filtern angeordnet sind. Das erste Filter besitzt die größte Porengröße (z.B. 5 μm) und filtert grobes Material wie Salzkristalle, Zelltrümmer, Haare, Gewebe etc. aus. Das zweite Filter besitzt eine kleinere Porengröße als das erste Filter und etwas kleiner als die einzufangenden Zielzellen oder -viren. Solch ein Filterstapel wird unten unter Bezugnahme auf 38 beschrieben. Bei einer anderen Ausführungsform der Kartusche ist das Filter mit der größten Porengröße (zum Ausfiltern des groben Materials) in einer Filterkammer (nicht dargestellt) angeordnet, die sich stromaufwärts der Lysierungskammer 86 befindet. Ein Kanal verbindet die Filterkammer mit der Lysierungskammer 86. Bei dieser Ausführungsform strömt eine Fluidprobe zunächst durch das Grobfilter in der Filterkammer und dann durch ein zweites Filter in der Lysierungskammer, um die Zielzellen oder -viren in der Lysierungskammer einzufangen.
Ferner können die Kügelchen in dem Filterstapel eine Bindungsaffinität für die Zielzellen oder -viren in der Fluidprobe aufweisen, um das Einfangen der Zielzellen oder -viren zu erleichtern. Zum Beispiel können Antikörper oder bestimmte Rezeptoren auf die Oberflächen der Kügelchen aufgebracht werden, um Zielzellen in der Probe zu binden. Überdies kann die Lysierungskammer 86 zwei verschiedene Arten von Kügelchen zur Wechselwirkung mit Zielzellen oder -viren enthalten. Die Lysierungskammer kann zum Beispiel einen ersten Satz Kügelchen enthalten, der mit Antikörpern oder Rezeptoren zur Bindung von Zielzellen oder -viren beschichtet ist, und einen zweiten Satz Kügelchen (gemischt mit dem ersten Satz) zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren. Die Kügelchen in der Lysierungskammer 86 können auch eine Bindungsaffinität für das aus den aufgebrochenen Zellen oder Viren freigesetzte intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) aufweisen. Solche Kü gelchen dienen zur Isolation von Zielnucleinsäure für eine anschließende Elution und Analyse. Die Lysierungskammer kann zum Beispiel Silicakügelchen zur Isolation von DNA oder Cellulosekügelchen mit Oligo-dT zur Isolation von Boten-RNA für eine RT-PCR enthalten. Die Lysierungskammer 86 kann auch Kügelchen zur Entfernung unerwünschten Materials (z.B. Proteine, Peptide) oder unerwünschter Chemikalien (z.B. Salze, Metallionen oder Detergenzien) aus der Probe enthalten, welche die PCR hemmen könnten. Die Kammer 86 kann zum Beispiel Ionenaustausch-Kügelchen zur Entfernung von Proteinen enthalten. Alternativ werden Kügelchen mit Metallionen-Chelatoren wie Iminodiessigsäure Metallionen aus biologischen Proben entfernen.
21–22 erläutern den Reaktionsbehälter 40 genauer. 21 zeigt eine teilweise explodierte Ansicht des Behälters 40, und 22 zeigt eine Vorderansicht des Behälters 40. Der Behälter 40 enthält die Reaktionskammer 42 (bei dieser Ausführungsform rautenförmig) zum Halten eines Reaktionsgemisches. Der Behälter 40 ist für eine optimale Wärmeübertragung zu und von dem Reaktionsgemisch und für eine effiziente optische Beobachtung des Gemisches ausgelegt. Die schmale Gestalt des Behälters trägt zur optimalen Thermokinetik durch Bereitstellung großer Oberflächen zur Wärmeleitung und zur Berührung von Thermoplatten bei. Zudem bieten die Wände des Behälters optische Fenster in die Kammer 42, so dass das gesamte Reaktionsgemisch optisch abgefragt werden kann. Bei genauerer Betrachtung von 21-22 umfasst der Reaktionsbehälter 40 einen starren Rahmen 46, der die Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B der Reaktionskammer 42 definiert. Der Rahmen 46 definiert auch eine Einlassöffnung 41 und einen Kanal 50, der die Öffnung 41 mit der Kammer 42 verbindet. Der Rahmen 46 definiert außerdem eine Auslassöffnung 43 und einen Kanal 52, der die Öffnung 43 mit der Kammer 42 verbindet. Die Einlassöffnung 41 und der Kanal 50 werden verwendet, um der Kammer 42 Fluid zuzuführen, und der Kanal 52 und die Auslassöffnung 43 werden für den Austritt von Fluid aus der Kammer 42 verwendet. Ausrichtungsstifte 44A, 44B werden verwendet, um den Behälter 40 beim Zusammenbau der Kartusche richtig zu positionieren.
Wie in 21 dargestellt, umfasst der Behälter 40 auch dünne, flexible Platten, die an gegenüberliegenden Seiten des starren Rahmens 46 befestigt sind, um gegenüberliegende Hauptwände 48 der Kammer zu bilden. (Die Hauptwände 48 sind in 1 zwecks Übersichtlichkeit der Abbildung von dem starren Rahmen 46 weggesprengt dargestellt.) Die Reaktionskammer 42 wird somit von den starren Seitenwänden 57A, 57B, 59A, 59B des Rahmens 46 und von den gegenüberliegenden Hauptwänden 48 definiert. Die gegenüberliegenden Hauptwände 48 sind an gegenüberliegende Seiten des Rahmens 46 gesiegelt, so dass die Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B die Hauptwände 48 miteinander verbinden. Die Wände 48 erleichtern eine optimale Wärmeleitfähigkeit zum in der Kammer 42 enthaltenen Reaktionsgemisch. Jede der Wände 48 ist ausreichend flexibel, um eine jeweilige thermische Oberfläche zu berühren und sich an diese anzuschmiegen und somit einen optimalen thermischen Kontakt und Wärmetransfer zwischen den thermischen Oberflächen und dem in der Kammer 42 enthaltenen Reaktionsgemisch zu gewährleisten. Überdies schmiegen sich die flexiblen Wände 48 weiterhin an die thermischen Oberflächen an, falls sich die Gestalt der Oberflächen infolge thermischer Ausdehnung oder thermischer Schrumpfung während des Ablaufs des Wärmetauschvorgangs ändert.
Wie in 23 dargestellt, werden die thermischen Oberflächen zum Berühren der flexiblen Wände 48 vorzugsweise von einem Paar gegenüberliegender Platten 190A, 190B gebildet, die dafür angeordnet sind, die Kammer 42 zwischen sich aufzunehmen. Wenn die Kammer 42 des Behälters 40 zwischen die Platten 190A, 190B eingeschoben ist, berühren die Innenflächen der Platten die Wände 48 und die flexiblen Wände schmiegen sich an die Oberflächen der Platten an. Die Platten sind vorzugsweise in einem Abstand voneinander angeordnet, welcher der Dicke T der Kammer 42 entspricht, wie sie von der Dicke des Rahmens 46 definiert wird. In dieser Position sind nur minimale oder keine Lücken zwischen den Plattenoberflächen und den Wänden 48 zu finden. Die Platten können durch verschiedene thermische Elemente geheizt oder gekühlt werden, um in der Kammer 42 Temperaturänderungen zu induzieren, wie dies unten genauer beschrieben ist.
Die Wände 48 sind vorzugsweise flexible Folien oder polymeres Material wie Polypropylen, Polyethylen, Polyester oder andere Polymere. Die Folien können entweder geschichtet sein, z.B. Laminate, oder die Folien können homogen sein. Schichtfolien werden bevorzugt, weil sie im allgemeinen eine bessere Festigkeit und strukturelle Integrität als homogene Folien aufweisen. Gegenwärtig werde_qn insbesondere Polypropylen-Schichtfolien bevorzugt, da Polypropylen die PCR nicht hemmt. Alternativ können die Wände 48 jedes andere Material umfassen, das zu einer dünnen, flexiblen Platte geformt werden kann und das eine schnelle Wärmeübertragung erlaubt. Für eine gute Wärmeleitfähigkeit beträgt die Dicke jeder Wand 48 vorzugsweise zwischen etwa 0,003 bis 0,5 mm, bevorzugter zwischen 0,01 und 0,15 mm und meistbevorzugt zwischen 0,025 und 0,08 mm.
Wieder bezugnehmend auf 22 umfasst der Behälter 40 vorzugsweise auch optische Fenster für eine optische In-situ-Abfrage des Reaktionsgemisches in der Kammer 42. Bei der bevorzugten Ausführungsform sind die optischen Fenster die Seitenwände 57A, 57B des starren Rahmens 46. Die Seitenwände 57A, 57B sind optisch durchlässig, um eine Anregung des Reaktionsgemisches in der Kammer 42 durch die Seitenwand 57A und eine Detektion von aus der Kammer 42 emittiertem Licht durch die Seitenwand 57B zu ermöglichen. Die Pfeile A stellen Beleuchtungsstrahlen dar, die durch die Seitenwand 57A in die Kammer 42 eintreten, und die Pfeile B stellen emittiertes Licht (z.B. Fluoreszenzemission von markierten Analyten im Reaktionsgemisch) dar, das die Kammer 42 durch die Seitenwand 57B verlässt.
Die Seitenwände 57A, 57B sind vorzugsweise voneinander winkelversetzt. Es wird gewöhnlich bevorzugt, dass die Wände 57A, 57B um einen Winkel von etwa 90° voneinander versetzt sind. Ein 90°-Winkel zwischen Anregungs- und Detektionswegen stellt sicher, dass eine minimale Menge der durch die Wand 57A eintretenden Anregungsstrahlung durch die Wand 57B austritt. Zudem ermöglicht der 90°-Winkel, dass eine maximale Menge an emittiertem Licht (z.B. Fluoreszenz) durch die Wand 57B aufgefangen wird. Die Wände 57A, 57B sind vorzugsweise so miteinander verbunden, dass sie sich am Boden der Kammer 42"V"-förmig schneiden. Alternativ müssen die gewinkelten Wände 57A, 57B nicht direkt miteinander verbunden sein, sondern können durch ein Zwischenstück wie eine andere Wand oder verschiedene mechanische oder fluidische Einrichtungen getrennt sein, die nicht das thermische und optische Verhalten des Behälters stören. Zum Beispiel können die Wände 57A, 57B an einer Öffnung zusammentreffen, die zu einem anderen Verarbeitungsbereich führt, der mit der Kammer 42 in Kommunikation steht, wie zum Beispiel ein integrierter Kapillarelektrophoresebereich. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich ein Fixierzapfen 58 von dem Rahmen 46 unter dem Schnittpunkt der Wände 57A, 57B. Der Zapfen 58 wird verwendet, um den Behälter 40 korrekt in einem Wärmetauschmodul zu positionieren, der nachstehend unter Bezugnahme auf 28 beschrieben wird.
Optimale optische Empfindlichkeit kann erreicht werden, indem man die optische Weglänge der Lichtstrahlen, welche den markierten Analyten im Reaktionsgemisch anregen, und des emittierten Lichts, das detektiert wird, maximiert, wie von der folgenden Gleichung dargestellt: Io/Ii=C*L*Awobei I_o die abgegebene Beleuchtungsleistung des emittierten Lichts in Volt, Photonen oder dergleichen ist, C die Konzentration des nachzuweisenden Analyten ist, I_i die eingestrahlte Beleuchtungsleistung ist, L die Weglänge ist und A das intrinsische Absorptionsvermögen des zur Markierung des Analyten verwendeten Farbstoffs ist.
Der schmale, flache Reaktionsbehälter 40 der vorliegenden Erfindung optimiert die Nachweisempfindlichkeit durch Bereitstellung einer maximalen optischen Weglänge pro Einheit Analytenvolumen. Bezugnehmend auf 23 und 27 ist der Behälter 40 vorzugsweise so konstruiert, dass jede der Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B der Kammer 42 eine Länge L im Bereich von 1 bis 15 mm hat, die Kammer eine Breite W im Bereich von 1,4 bis 20 mm hat, die Kammer eine Dicke T im Bereich von 0,5 bis 5 mm hat und das Verhältnis von der Breite W der Kammer zur Dicke T der Kammer wenigstens 2:1 beträgt. Diese Parameter werden gegenwärtig bevorzugt, um einen Behälter mit einer relativ großen mittleren optischen Weglänge durch die Kammer, d.h. durchschnittlich 1 bis 15 mm, bereitzustellen, während die Kammer noch ausreichend schmal gehalten wird, um ein äußerst schnelles Erwärmen und Abkühlen des darin enthaltenen Reaktionsgemisches zu ermöglichen. Die mittlere optische Weglänge der Kammer 42 ist der Abstand von der Mitte der Seitenwand 57A zur Mitte der Kammer 42 plus dem Abstand von der Mitte der Kammer 42 bis zur Mitte der Seitenwand 57B.
Bevorzugter ist der Behälter 40 so konstruiert, dass jede der Seitenwände 57A, 57B, 59A, 59B der Kammer 42 eine Länge L im Bereich von 5 bis 12 mm hat, die Kammer eine Breite W im Bereich von 7 bis 17 mm hat, die Kammer eine Dicke T im Bereich von 0,5 bis 2 mm hat und das Verhältnis von der Breite W der Kammer zur Dicke T der Kammer wenigstens 4:1 beträgt. Diese Bereiche werden mehr bevorzugt, da sie einen Behälter mit sowohl einer größeren mittleren optischen Weglänge (d.h. 5 bis 12 mm) als auch einer Volumenkapazität im Bereich von 12 bis 100 μl bereitstellen, während die Kammer noch ausreichend schmal gehalten wird, um ein äußerst schnelles Erwärmen und Abkühlen eines Reaktionsgemisches zu ermöglichen. Die relativ große Volumenkapazität gewährleistet eine gesteigerte Empfindlichkeit beim Nachweis niederkonzentrierter Analyten wie Nucleinsäuren.
Bei der bevorzugten Ausführungsform weist der Reaktionsbehälter 40 eine rautenförmige Kammer 42 auf, die von den Seitenwänden 57A, 57B, 59A, 59B definiert wird, hat jede der Seitenwände eine Länge von etwa 10 mm, hat die Kammer eine Breite von etwa 14 mm, hat die Kammer eine Dicke T von 1 mm, wie durch die Dicke des Rahmens 46 definiert, und besitzt die Kammer eine Volumenkapazität von etwa 100 μl. Dieser Reaktionsbehälter gewährleistet eine relativ große mittlere optische Weglänge von 10 mm durch die Kammer 42. Zudem ermöglicht die schmale Kammer ein äußerst schnelles Erwärmen und/oder Abkühlen des darin enthaltenen Reaktionsgemisches. Die Rautenform der Kammer 42 hilft eine Bildung von Luftblasen in der Kammer zu verhindern, wenn diese mit dem Reaktionsgemisch gefüllt wird, und hilft auch bei der optischen Abfrage des Gemisches.
Wieder bezugnehmend auf 22 ist der Rahmen 46 vorzugsweise aus einem optisch durchlässigen Material, z.B. einem Polycarbonat oder klarmodifiziertem Polypropylen, gefertigt, so dass die Seitenwände 57A, 57B optisch durchlässig sind. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck optisch durchlässig, dass eine oder mehrere Lichtwellenlängen durch die Wände fallen können. Bei der bevorzugten Ausführungsform sind die optisch durchlässigen Wände 57A, 57B im wesentlichen transparent. Außerdem können sich ein oder mehrere optische Elemente auf den optisch durchlässigen Seitenwänden 57A, 57B befinden. Die optischen Elemente können zum Beispiel dafür vorgesehen sein, das Gesamtvolumen an Lösung, das von einer Lichtquelle beleuchtet wird, zu maximieren, das Anregungslicht auf einen spezifischen Bereich der Kammer 42 zu fokussieren oder möglichst viel Fluoreszenzsignal aus einem möglichst großen Teil des Kammervolumens aufzufangen. Bei alternativen Ausführungsformen können die optischen Elemente Beugungsgitter zum Auswählen spezifischer Wellenlängen, Filter, um den Durchtritt nur bestimmter Wellenlängen zu gestatten, oder farbige Linsen zur Gewährleistung von Filterfunktionen umfassen. Die Wandflächen können beschichtet sein oder Materialien wie Flüssigkristalle zur Steigerung der Absorption bestimmter Wellenlängen enthalten. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform sind die optisch durchlässigen Wände 57A, 57B im wesentlichen durchsichtige, flache Fenster mit einer Dicke von etwa 1 mm.
Die Seitenwände 59A, 59B umfassen bevorzugt reflektierende Flächen 56, die Licht, das versucht, die Kammer 42 durch die Seitenwände 59A, 59B zu verlassen, intern reflektieren. Die reflektierenden Flächen 56 sind so angeordnet, dass aneinandergrenzende Flächen um etwa 90° zueinander winkelversetzt sind. Überdies definiert der Rahmen 46 freie Räume zwischen den Seitenwänden 59A, 59B und den Stützrippen 53. Die freien Räume werden von Umgebungsluft ausgefüllt, die einen anderen Brechungsindex besitzt als das den Rahmen bildende Material (z.B. Kunststoff). Aufgrund des Unterschieds in den Brechungsindizes sind die reflektierenden Flächen 56 wirksam hinsichtlich der internen Reflexion von Licht, das versucht, die Kammer durch die Wände 59A, 59B zu verlassen, und gewährleisten eine vermehrte Erfassung von optischem Signal durch die Wände 57A, 57B. Vorzugsweise definieren die optisch durchlässigen Seitenwände 57A, 57B den unteren Teil der rautenförmigen Kammer 42 und definieren die retroreflektierenden Seitenwände 59A, 59B den oberen Teil der Kammer.
Unter Bezugnahme auf 21–22 wird nun ein bevorzugtes Verfahren zur Fertigung des Reaktionsbehälters 40 beschrieben werden. Der Reaktionsbehälter 40 kann hergestellt werden, indem zunächst der starre Rahmen 46 unter Anwendung bekannter Spritzgusstechniken geformt wird. Der Rahmen 46 wird vorzugsweise in einem Stück aus polymerem Material, z.B. klarmodifiziertem Polypropylen, gegossen. Nachdem der Rahmen 46 hergestellt ist, werden dünne, flexible Platten zugeschnitten und an gegenüberliegende Seiten des Rahmens 46 gesiegelt, um die Hauptwände 48 der Kammer 42 zu bilden. Die Hauptwände 48 sind vorzugsweise gegossene oder extrudierte Folien aus polymerem Material, z.B. Polypropylenfolien, die zugeschnitten und mittels des folgenden Verfahrens an dem Rahmen 46 befestigt werden. Ein erstes Stück Folie wird über eine Seite des Rahmens 46 gelegt. Der Rahmen 46 umfasst vorzugsweise einen Heftsteg 47 zum Ausrichten der Oberkante der Folie. Die Folie wird so über den unteren Teil des Rahmens 46 gelegt, dass die Oberkante der Folie mit dem Heftsteg 47 ausgerichtet ist und dass die Folie den unteren Teil des Rahmens 46 unter dem Heftsteg 47 vollständig bedeckt. Die Folie sollte größer sein als der untere Teil des Rahmens 46, so dass sie leicht gehalten und glatt über den Rahmen gezogen werden kann. Die Folie wird dann zugeschnitten, um dem Umriss des Rahmens zu entsprechen, indem der Teil der Folie, der den Rahmen abdeckt, an den Rahmen geklemmt wird und die Teile der Folie, die sich über die äußere Begrenzung des Rahmens hinaus erstrecken, anhand z.B. eines Lasers oder Stempels weggeschnitten werden. Die Folie wird dann an den Rahmen heftgeschweißt, vorzugsweise mittels eines Lasers.
Die Folie wird dann an den Rahmen 46 gesiegelt, vorzugsweise durch Heißsiegeln. Heißsiegeln wird gegenwärtig bevorzugt, da es eine starke Verschweißung schafft, ohne dem Behälter potentielle Verunreinigungen zuzuführen, wie es die Anwendung von Klebstoff oder Quellschweißtechniken tun könnte. Heißsiegeln ist außerdem einfach und billig. Das Heißsiegeln kann zum Beispiel mittels einer heißen Pressplatte durchgeführt werden. Ein identisches Verfahren kann verwendet werden, um eine zweite Platte zuzuschneiden und an die gegenüberliegende Seite des Rahmens 46 zu siegeln, um die Kammer 42 fertigzustellen. Viele Varianten dieses Fertigungsverfahrens sind möglich. Bei einer alternativen Ausführungsform wird zum Beispiel die Folie über den unteren Teil des Rahmens 46 gezogen und dann vor dem Zuschneiden der Folie an den Rahmen gesiegelt. Nach dem Siegeln der Folie an den Rahmen werden die Teile der Folie, die sich über die äußere Begrenzung des Rahmens hinaus erstrecken, anhand z.B. eines Lasers oder Stempels weggeschnitten.
Obwohl gegenwärtig bevorzugt wird, den Rahmen 46 in einem Stück zu gießen, ist es auch möglich, den Rahmen aus mehreren Teilen herzustellen. Zum Beispiel können die Seitenwände 57A, 57B, welche die gewinkelten optischen Fenster bilden, aus Polycarbonat gegossen sein, das eine gute optische Transparenz aufweist, während der Rest des Rahmens aus Polypropylen gegossen ist, das billig und mit PCR kompatibel ist. Die einzelnen Teile können in einem zweiten Schritt miteinander verbunden werden. Zum Beispiel können die Seitenwände 57A, 57B mit dem übrigen Teil des Rahmens 46 verrastet und/oder verschweißt werden. Anschließend können die flexiblen Wände 48 wie zuvor beschrieben an gegenüberliegenden Seiten des Rahmens 46 angebracht werden.
Wieder bezugnehmend auf 3 wird gegenwärtig bevorzugt, eine Dichtung 61 zum dichten Anschluss der Öffnungen 41, 43 des Behälters 40 an entsprechende Kanäle 80, 81 (4) in dem Kartuschenkörper zu verwenden. Alternativ können fluidische Dichtungen mittels einer Luer-Verbindung, Schneidringverbindung oder Pressarmatur hergestellt werden. Bei einer anderen Ausführungsform sind der Kartuschenkörper und der Rahmen des Behälters 40 in einem Stück gegossen, und die flexiblen Hauptwände des Behälters sind an gegenüberliegende Seiten des Rahmens heißgesiegelt.
Wieder bezugnehmend auf 22 wird die Kammer 42 gefüllt, indem Flüssigkeit (z.B. ein Reaktionsgemisch) zwangsbewegt wird, um durch die Öffnung 41 und den Kanal 50 in die Kammer 42 zu strömen. Die Flüssigkeit kann mittels Differenzdruck zwangsbewegt werden, um in die Kammer 42 zu strömen (d.h., indem entweder die Flüssigkeit durch die Einlassöffnung 41 gedrückt oder die Flüssigkeit durch Anlegen eines Vakuums an die Auslassöffnung 43 angesaugt wird). Während die Flüssigkeit die Kammer 42 füllt, verdrängt sie Luft in der Kammer. Die verdrängte Luft verlässt die Kammer 42 durch den Kanal 52 und die Öffnung 43. Für eine optimale Detektion des Analyten in der Kammer 42 sollte die Kammer keine Luftblasen enthalten. Um ein Verfangen von Luftblasen in der Kammer 42 vermeiden zu helfen, sollte die Verbindung zwischen der Kammer 42 und dem Auslasskanal 52 am höchsten Punkt (hinsichtlich der Schwerkraft) in der Kammer 42 liegen. Dies ermöglicht ein Entweichen von Luftblasen in der Kammer 42, ohne dass sie sich verfangen. Folglich ist der Behälter 40 dafür vorgesehen, in der in 22 dargestellten vertikalen Ausrichtung verwendet zu werden
25 zeigt einen anderen Behälter 206, der dafür ausgelegt ist, in einer horizontalen Ausrichtung verwendet zu werden. Der Behälter 206 besitzt eine Einlassöffnung 41 und einen Einlasskanal 50, der die Einlassöffnung 41 mit dem Boden der Kammer 42 verbindet. Der Behälter besitzt außerdem eine Auslassöffnung 43 und einen Auslasskanal 50, der die Auslassöffnung 43 mit der Oberseite der Kammer 42 verbindet. Somit können jegliche Luftblasen in der Kammer 42 durch den Auslasskanal 52 entweichen, oder sich zu verfangen. 26 zeigt einen weiteren Behälter 207 mit zwei Einlassöffnungen 41, 45 und einer Auslassöffnung 43. Einlasskanäle 50, 54 verbinden die jeweiligen Einlassöffnungen 41, 45 mit der Kammer 42, und ein Auslasskanal 52 verbindet die Kammer 42 mit der Auslassöffnung 43. Viele andere abweichende Ausführungsformen des Behälters sind ebenfalls möglich. Bei jeder Ausführungsform ist es wünschenswert, die Kammer 42 vom höchsten Punkt (hinsichtlich der Schwerkraft) in der Kammer aus zu entleeren und Flüssigkeit von einem tieferen Punkt aus in die Kammer einzuleiten.
15A–15B Berläutern zwei Arten von Ventilen, die in der Kartusche verwendet werden. Wie in 15A dargestellt, gibt es zwei Arten von grundlegendem Konzept für die Wirkungsweise der Ventile und folglich zwei Typen von Ventilen. Das erste Ventil verwendet einen kegelförmigen oder konischen Ventilsitz 160, der im mittleren Kartuschenteil 24 ausgebildet ist. Der Ventilsitz 160 ist eine Vertiefung, Aussparung oder Aushöhlung, die durch Guss oder spanabhebende Bearbeitung in dem Mittelteil 24 geformt wurde. Der Ventilsitz 160 steht durch eine Öffnung oder einen Kanal 157, der die Mitte des konischen Ventilsitzes 160 durchschneidet, mit einer Kammer 167 in Fluidkommunikation. Wie in 15B dargestellt, wird ein Ventilsteller 164 mit einer sphärischen Oberfläche gegen die elastische Membran 63 und in den Ventilsitz 160 gepresst, wodurch ein kreisförmiger Kontaktring zwischen der Membran 63 und dem Ventilsitz 160 geschaffen wird. Das kinematische Prinzip ist das einer in einem Kegel sitzenden Kugel. Die die von der Membran 63 und dem Ventilsitz 160 gebildete kreisförmige Dichtung verhindert einen Strom zwischen dem Kanal 157 (und damit der Kammer 167) und einem Seitenkanal 158, der sich von einer Seite des Ventilsitzes 160 erstreckt. Der Seitenkanal 158 wird von der Membran 63 und dem mittleren Kartuschenteil 24 definiert.
Wie in 15A dargestellt, steuert der andere Ventiltyp den Querstrom zwischen dem Kanal 158 und einem weiteren Seitenkanal 159, der zwischen der Membran 63 und dem mittleren Kartuschenteil 24 ausgebildet ist. In diesem Fall wäre ein kreisförmiger Kontaktring unwirksam. Stattdessen umfasst das zweite Ventil eine Vertiefung, Aussparung oder Aushöhlung 161, die in dem mittleren Kartuschenteil 24 ausgebildet ist. Die Aushöhlung 161 trennt die Kanäle 158, 159 voneinander. Ein Ende des Kanals 158 ist auf einer Seite der Aushöhlung 161 angeordnet, und ein Ende des Kanals 159 ist auf der gegenüberliegenden Seite der Aushöhlung 161 angeordnet. Die Aushöhlung 161 wird durch eine erste gewölbte Oberfläche 162A, die an das Ende des Kanals 158 angrenzt, eine zweite gewölbte Oberfläche 162B, die an das Ende des Kanals 159 angrenzt, und eine dritte Oberfläche 163 zwischen der ersten und der zweiten gewölbten Oberfläche 162A, 162B definiert. Wie in 15B dargestellt, gewährleisten die gewölbten Oberflächen zwei Ventilsitze, die der primäre Kontaktbereich für die Membran 63 zum Unterbrechen des Stroms zwischen den Kanälen 158 und 159 sind. Das kinematische Prinzip ist das einer Kugel (oder eines sphärischen Endes an einem Ventilsteller oder -aktuator), die von drei Kontaktpunkten gehalten wird, der Aufwärtskraft auf den Steller und den beiden Ventilsitzen 162A und 162B.
Wie in 16A dargestellt, sind die erste und die zweite gewölbte Oberfläche 162A, 162B vorzugsweise konzentrische sphärische Oberflächen. Der Ventilsteller 164 weist ebenfalls eine sphärische Oberfläche zum festen Pressen der Membran 63 gegen die Oberflächen 162A, 162B auf. Überdies besitzt jede der Oberflächen 162A, 162B vorzugsweise einen sphärischen Krümmungsradius R1, der dem kombinierten Krümmungsradius R2 des Ventilstellers 164 plus der Dicke T der Membran 63 entspricht. Wenn zum Beispiel der Krümmungsradius R2 der Oberfläche des Ventilstellers 164 0,094 Inch beträgt und die Membran 63 eine Dicke T von 0,031 besitzt, dann beträgt der Krümmungsradius R1 jeder der Oberflächen 162A, 162B 0,125 Inch. Allgemein hängt die Dimension und der Krümmungsradius der Ventilsitze von der Dimension der Kanäle in der Kartusche ab. Die Ventile sind vorzugsweise gerade groß genug gemacht, um die Kanäle wirksam zu verschließen, jedoch nicht größer, so dass das Tonvolumen in der Kartusche minimiert ist.
Wie in 16B dargestellt, ist die dritte Oberfläche 163 von der ersten und der zweiten Oberfläche 162A, 162B zurückspringend, um einen Spalt 166 zwischen der Membran 63 und der dritten Oberfläche 163 zu schaffen, wenn die Membran 63 gegen die erste und die zweite Oberfläche 162A, 162B gepresst wird. Anders ausgedrückt, sind die Oberflächen 162A, 162B von der Oberfläche 163 erhoben oder erhöht. Der Spalt 166 stellt sicher, dass die Membran 63 in erster Linie die Ventilsitze 162A, 162B berührt anstatt die gesamte Oberfläche der Aushöhlung 161, so dass ein maximaler Druck von der Membran 63 auf die Ventilsitze 162A und 162B ausgeübt wird. Dies gewährleistet eine sehr starke Abdichtung bei einer minimalen erforderlichen Stellerkraft.
Wieder bezugnehmend auf 15B definiert bei beiden Ventiltypen das jeweilige kinematische Prinzip die Lage der Berührungsflächen. Sowohl beim Kugel-in-Kegel-Konzept als auch beim Kugel-gegen-zwei-sphärische-Oberflächen-Konzept ist es der Kugel oder dem sphärisch geformten Ventilsteller gestattet, sich selbst zu positionieren, während sie/er gegen den oder die Ventilsitze) gedrückt wird. Es besteht ein absichtliches Spiel (z.B. 0,01 bis 0,03 Inch) zwischen dem Ventilsteller und dem Loch in dem unteren Kartuschenteil 26, in dem sich der Steller 164 bewegt, so dass nur die Wirkung des Ventilsitzes die Lage der Berührungsflächen definiert.
Die Ventilsteller (Ventilaktuatoren) können durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen gesteuert werden. 17–19 erläutern einen solchen Mechanismus. Wie in 17 dargestellt, weist ein Ventilsteller 172 eine sphärische Oberfläche zum Pressen der Dichtung 63 in einen Ventilsitz auf. Der Steller 172 weist außerdem einen Flansch 177 an seinem Unterteil auf. Die Kartusche enthält einen elastischen Körper wie eine Feder 174, die gegen eine vorspringende Kante in dem unteren Kartuschenteil 26 drückt, um den Ventilsteller gegen die Dichtung 63 vorzubelasten. Die Feder 174 ist stark genug, um das Ventil zu schließen, sofern nicht eine absichtliche Kraft angelegt wird, um den Steller 172 nach unten zu ziehen. Die Ventile in der Kartusche können auf diese Weise für den Transport und die Lagerung geschlossen gehalten werden, bevor die Kartusche verwendet wird. Somit kann die Kartusche bei der Herstellung mit den erforderlichen Reagenzien und Waschlösungen zur Analyse einer Fluidprobe vorgefüllt werden, ohne dass die Fluida während des Transports und der Lagerung aus der Kartusche auslaufen.
Der Niederzieh-Mechanismus für den Steller befindet sich gewöhnlich in einem Instrument, in das die Kartusche zur Probenanalyse eingesetzt wird (ein solches Instrument wird unten unter Bezugnahme auf 10 ausführlich beschrieben). Der Mechanismus umfasst eine Gleitführung 175, die ein angelenktes Niederzieh-Element 180 schwenkt, das ein Maul 181 zur Aufnahme des Flansches 177 des Stellers 172 aufweist. Wie in 18 dargestellt, schwenkt die Gleitführung 175 das angelenkte Niederzieh-Element 180, bis der Flansch 177 in dem Maul 181 plaziert ist. Wie in 19 dargestellt, zieht ein Elektromagnet 146 das Element 180 und folglich den Ventilsteller 172 nach unten, so dass die Dichtung 63 vom Ventilsitz gelöst wird, wodurch das Ventil geöffnet und ein Fluidstrom zwischen den Kanälen 170 und 171 ermöglicht wird.
20 erläutert die Art und Weise, auf welche ein Fluidstrom in die und aus der Probenkammer, Waschkammer, Neutralisiererkammer und den Reagenskammern in der Kartusche gesteuert wird. Wie durch eine Kammer 414 in 20 veranschaulicht, ist jede dieser Kammern von einer hydrophoben Membran 410 bedeckt, welche den Durchtritt von Gas, jedoch nicht von Flüssigkeit gestattet. Die hydrophobe Membran 410 ist zwischen der Kammer 414 und einer Drucköffnung 32 angeordnet. Die Drucköffnung 32 ist in dem oberen Kartuschenteil 22 ausgebildet und über der Kammer 414 angeordnet. Während des Transports und der Lagerung der Kartusche hält die Membran 410 Flüssigkeiten in der Kammer 414, auch wenn die Kartusche auf den Kopf gestellt wird. Die Drucköffnung 32 ist dafür dimensioniert, eine Druckdüse 182 aufzunehmen, die mit einer Druckquelle (z.B. einer Vakuumpumpe oder pneumatischen Pumpe) verbunden ist, die sich gewöhnlich in dem externen Instrument befindet. Die Düse 182 umfasst einen O-Ring 184 und einen Flansch 415. Eine Feder 185 drückt gegen den Flansch 415, um die Düse 182 in die Drucköffnung 32 zu pressen, so dass der O-Ring 184 eine Dichtung um die Öffnung 32 bildet. Im Betrieb wird ein positiver Luftdruck oder ein Vakuum durch die Drucköffnung 32 an die Kammer 414 angelegt, um Flüssigkeit aus der bzw. in die Kammer 414 zu treiben.
Im mittleren Kartuschenteil 24 ist unter der Kammer 414 ein konischer Ventilsitz 160 (zuvor unter Bezugnahme auf 15A–15B beschrieben) ausgebildet, um den Flüssigkeitsstrom zwischen der Kammer 414 und einem Verbindungskanal 411 zu steuern. Das Ventil wird von einem Ventilsteller 188 geöffnet und geschlossen, der einen Flansch 187 und eine gegen den Flansch drückende Feder 188 aufweist, um das Ventil geschlossen zu halten, bis an den Steller 186 eine Abwärtskraft angelegt wird. Die Abwärtskraft wird vorzugsweise von einem Elektromagneten geliefert, der den Steller 186 zum Öffnen des Ventils nach unten zieht. Der Ventilsteller 186 und der Elektromagnet befinden sich vorzugsweise in dem Instrument.
7–8 zeigen eine Draufsicht bzw. Unteransicht der Kartusche. 9 ist ein schematisches Blockdiagramm der Kartusche. Wie in jeder der 7–9 dargestellt, enthält die Kartusche eine Probenkammer 65 mit einer Öffnung für die Zugabe einer Fluidprobe zur Kartusche und einen Probenströmungsweg, der sich von der Probenkammer 65 erstreckt. Der Probenströmungsweg erstreckt sich von der Probenkammer 65 durch ein Ventil 107 und in einen Kanal 106. Der Kanal 106 umfasst einen Sensor-Bereich 136, in dem der Kanal 106 einen flachen Boden aufweist, der eine leichte optische Erfassung der Anwesenheit von Flüssigkeit in dem Kanal ermöglicht. Der Probenströmungsweg führt weiter von dem Kanal 106 in die Lysierungskammer 86 und durch den Filterstapel 87. Der Probenströmungsweg umfasst außerdem einen Kanal 109 für den Austritt von Fluid aus der Lysierungskammer 86, einen Kanal 110 mit einem flachbödigen Detektionsbereich 137, ein Ventil 111 und einen Kanal 112, der durch ein Ventil 114 zu der Abfallkammer 68 mit Entlüftung führt.
Die Kartusche enthält außerdem die Waschkammer 66 zum Halten von Waschflüssigkeit und die Reagenskammer 67 zum Halten von Lysierungsreagens. Die Waschkammer 66 ist mit der Lysierungskammer 86 durch ein Ventil 115, einen Kanal 117 und den Kanal 106 verbunden. Die Reagenskammer 67 ist mit der Lysierungskammer 86 durch ein Ventil 119, den Kanal 117 und den Kanal 106 verbunden. Probenkomponenten (z.B. Zellen oder Viren in der Probe) werden in dem Filterstapel 87 eingefangen und in der Kammer 86 lysiert, um einen Zielanalyten (z.B. Nucleinsäure) aus den Probenkomponenten freizusetzen. Die Kartusche umfasst auch einen Analytenströmungsweg , der sich von der Lysierungskammer 86 erstreckt, um den von der Fluidprobe getrennten Analyten zur chemischen Reaktion und optischen Detektion zum Reaktionsbehälter 40 zu befördern. Der Analytenströmungsweg verläuft von der Kammer 86 durch den Kanal 109, den Kanal 110 und das Ventil 111. Nach dem Durchlaufen des Ventils 111 weicht der Analytenströmungsweg vom Probenströmungsweg ab. Während der Probenströmungsweg durch den Kanal 112 in die Abfallkammer 68 verläuft, biegt der Analytenströmungsweg in den U-förmigen Kanal 122 ab. Der Analytenströmungsweg erstreckt sich dann durch ein Ventil 124 in die und aus der Neutralisiererkammer 70. Der Analytenströmungsweg führt außerdem durch ein Ventil 126 in die und aus der Mastermixkammer 71. Von der Mastermixkammer 71 erstreckt sich der Analytenströmungsweg entlang dem Kanal 122, durch ein Ventil 127, durch den Kanal 80 und durch die Öffnung 41 in den Reaktionsbehälter 40.
Der Reaktionsbehälter 40 umfasst die Öffnung 41 für die Zufuhr eines Reaktionsgemisches zum Behälter und die Öffnung 43 für den Austritt von Fluida (z.B. Luft oder überschüssiges Reaktionsgemisch) aus dem Behälter. Die Kartusche enthält auch den Kanal 81, der in Fluidkommunikation mit der Öffnung 43 steht. Der Kanal 81 umfasst einen flachbödigen Detektionsbereich 130, um die Anwesenheit von Flüssigkeit in dem Kanal zu erfassen. Der Kanal 81 ist mit einem Kanal 131 verbunden (Kanal 131 verläuft in der Draufsicht von 7 senkrecht zur Seite direkt nach unten). Kanal 131 ist mit einem Kanal 132 verbunden, der wiederum durch ein Ventil 133 mit einem Kanal 134 verbunden ist (Kanal 134 verläuft in der Draufsicht von 7 senkrecht zur Seite direkt nach oben). Der Kanal 134 führt zur Entlüftungsöffnung 36, die eine hydrophobe Membran aufweist, um ein Entweichen von Gas, jedoch nicht von Flüssigkeit aus der Kartusche zu ermöglichen. Die Kanäle, die Entlüftungsöffnung und das Ventil, die sich stromabwärts vom Reaktionsbehälter 40 befinden, werden dazu verwendet, die Kammer 42 des Behälters unter Druck zu setzen, wie dies im nachstehenden Abschnitt "Betrieb" beschrieben ist.
Die Kartusche enthält außerdem eine erste Drucköffnung 105, die über der Probenkammer 65 angeordnet ist, eine zweite Drucköffnung 116, die über der Waschkammer 66 angeordnet ist, eine dritte Drucköffnung 118, die über der Reagenskammer 67 angeordnet ist, eine vierte Drucköffnung 123, die über der Neutralisiererkammer 70 angeordnet ist, eine fünfte Drucköffnung 125, die über der Mastermixkammer 71 angeordnet ist, und eine sechste Drucköffnung 128, die am Ende des U-förmigen Kanals 122 angeordnet ist. Die Kartusche umfasst ferner Sensorkammern 120 und 121, die in Fluidkommunikation mit der Abfallkammer 68 stehen. Die Sensorkammern 120 und 121 zeigen an, wenn vorbestimmte Flüssigkeitsvolumina in der Abfallkammer 68 aufgenommen wurden, wie unten ausführlich beschrieben wird.
Bezugnehmend auf 10 wird die Kartusche vorzugsweise in Kombination mit einem Instrument 140 verwendet, das dafür vorgesehen ist, eine oder mehrere Kartuschen aufzunehmen. Zwecks Übersichtlichkeit der Abbildung nimmt das in 10 dargestellte Instrument 140 nur eine Kartusche auf. Es versteht sich jedoch, dass das Instrument dafür ausgelegt sein kann, mehrere Kartuschen gleichzeitig zu. verarbeiten. Das Instrument 140 enthält eine Kartuschenaufnahme 141, in welche die Kartusche zur Verarbeitung eingesetzt wird. Das Instrument 140 enthält auch den Wandler 92 (z.B. ein Ultraschallhorn) zur Erzeugung von Druckwellen in der Ly sierungskammer der Kartusche, neun Ventilsteller 142 zum Betätigen der neun Ventile in der Kartusche, neun entsprechende Elektromagnete 146 zum Niederziehen der Ventilsteller und sechs Druckdüsen 145 zur Verbindung mit sechs entsprechenden in der Kartusche ausgebildeten Drucköffnungen. Überdies enthält das Instrument bzw. ist es verbunden mit einer oder mehreren geregelten Druckquellen zum Anlegen von Druck an die Kartusche durch die Druckdüsen 145. Geeignete Druckquellen umfassen Spritzenpumpen, Druckluftquellen, pneumatische Pumpen oder Verbindungen mit externen Druckquellen. Das Instrument umfasst außerdem drei optische Schlitzsensoren 143 und drei optische Reflexionssensoren 144.
13 erläutert die optischen Schlitzsensoren 143, die dafür angeordnet sind, Flüssigkeit in den Sensorkammern 120, 121 und in der Reagenskammer 67 zu erfassen. Jeder Sensor 143 enthält eine eingebaute LED und Photodiode, die auf gegenüberliegenden Seiten des Sensors angeordnet sind. Die LED sendet einen Strahl aus, der von der Photodiode detektiert wird, wenn der Strahl nicht wesentlich gebrochen wird. Solche optischen Schlitzsensoren sind im Handel von mehreren Lieferfirmen erhältlich. Die Kartusche ist so geformt, dass die optischen Schlitzsensoren um die Kammern 67, 120 und 121 passen. Die Funktionsweise jedes Sensors ist wie folgt. Wenn keine Flüssigkeit in der vom Sensor umgebenen Kammer vorhanden ist, wird der Strahl von der LED durch Luft in der Kammer und die gewölbten Innenwände der Kammer stark gebrochen, und es wird, wenn überhaupt, nur ein schwaches Signal von der Photodiode erfasst, da Luft einen Brechungsindex besitzt, der dem der Kunststoffkartusche nicht nahe entspricht. Wenn jedoch Flüssigkeit in der Kammer vorhanden ist, bricht der Strahl von der LED nicht oder wird nur geringfügig gebrochen und erzeugt ein viel stärkeres, von der Photodiode detektiertes Signal, da die Flüssigkeit einen Brechungsindex besitzt, der dem der Kunststoffkartusche nahe entspricht. Die optischen Sensoren 143 sind daher zur Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Flüssigkeit in den Kammern 67, 120 und 121 brauchbar.
14 zeigt eine schematische seitliche Schnittansicht der Sensorkammer 120, die mit der Abfallkammer 68 in Fluidkommunikation steht und von dem optischen Schlitz sensor 143 umgeben ist. Die Sensorkammer 120 und der Sensor 143 werden dazu verwendet, anzuzeigen, wann ein vorbestimmtes Flüssigkeitsvolumen in der Abfallkammer 68 vorhanden ist. Die Sensorkammer 120 ist durch eine Wand 151 mit einem Überlaufrand 152 teilweise von der Abfallkammer 68 getrennt. Die Höhe der Wand ist so gewählt, dass, wenn das vorbestimmte Flüssigkeitsvolumen in der Abfallkammer 68 aufgenommen ist, die Flüssigkeit über den Überlaufrand 152 und in die Sensorkammer 120 läuft. Die Flüssigkeit in der Sensorkammer 120 wird dann von dem Sensor 143 erfasst.
Wieder bezugnehmend auf 13 kann die Kartusche auch eine zweite Sensorkammer 121 enthalten, die mit der Abfallkammer 68 in Fluidkommunikation steht. Die zweite Sensorkammer 121 ist ebenfalls durch eine Wand 153 mit einem Überlaufrand von der Abfallkammer 68 getrennt. Die Wand 153 ist höher als die Wand 152, so dass erst dann Flüssigkeit über die Wand 153 läuft, wenn zusätzlich zum ersten vorbestimmten Fluidvolumen ein zweites vorbestimmtes Fluidvolumen in der Abfallkammer 68 aufgenommen worden ist. Die Sensorkammern 120, 121 und die optischen Sensoren 143 dienen zur Steuerung des Betriebs der Kartusche. Die Höhe der Wand 152 ist vorzugsweise so gewählt, dass, wenn ein bestimmtes Volumen an Fluidprobe aus der Probenkammer 65 durch den Probenströmungsweg zur Abfallkammer 68 geflossen ist, die Probenflüssigkeit in die Sensorkammer 120 überläuft und erfasst wird. Die Detektion in Kammer 120 triggert die Freisetzung von Waschlösung aus der Waschkammer 66, die durch den Probenströmungsweg zur Abfallkammer 68 fließt. Wenn ein zusätzliches Volumen der Waschlösung in der Kammer 68 aufgenommen ist, läuft Flüssigkeit über die Wand 153 in die Sensorkammer 121 und wird erfasst. Die Detektion von Flüssigkeit in der Kammer 121 triggert dann die Freisetzung von Lysierungsreagens aus der Kammer 67. Der die Kammer 67 umgebende Sensor 143 kann dann dafür verwendet werden, anzuzeigen, wann die Kammer 67 leer ist, und den Beginn der Ultraschall-Lyse zu triggern. Bei einer alternativen Ausführungsform kann die Kartusche zwei Abfallkammern aufweisen, eine für die Probe und eine für Waschflüssigkeit, wobei jede Abfallkammer eine jeweilige mit ihr verbundene Sensorkammer besitzt.
Optische Inline-Reflexionssensoren 144 werden dazu verwendet, die Anwesenheit oder Abwesenheit von Flüssigkeit in den flachbödigen Detektionsbereichen 130, 136, 137 der Kanäle 81, 106 bzw. 110 zu bestimmen (7). Jeder Sensor 144 besitzt einen eingebauten Emitter und Detektor, die über einem flachbödigen Detektionsbereich angeordnet sind. Der Emitter sendet einen Strahl aus, der von der Kartusche reflektiert und von dem Detektor erfasst wird. Der Sensor erfasst eine Veränderung im Signal, wenn eine Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche den Detektionsbereich durchläuft. Fakultativ können optische Doppelemitter-Reflexionssensoren für einen zuverlässigegen Detektionsbetrieb Verwendung finden. Beide Arten optischer Reflexionssensoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und im Handel erhältlich.
Wieder bezugnehmend auf 10 umfasst das Instrument 140 auch ein Wärmetauschmodul 147 mit einem Schlitz 148 zur Aufnahme des Reaktionsbehälters der Kartusche. Das Modul 147 wird unten unter Bezugnahme auf 28 ausführlich beschrieben. Das Instrument 140 umfasst ferner einen Schnappmechanismus 149 zum Verrasten eines Deckels 150 über einer Kartusche. Die Kartuschenaufnahme 141 enthält Ausrichtungslöcher 401 zur Aufnahme der Füße der Kartusche. Die Ausrichtungslöcher 401 gewährleisten eine korrekte Positionierung der Kartusche in der Aufnahme 141, so dass sich die Druckdüsen 145, der Wandler 92 und die Ventilsteller 142 in die entsprechenden Öffnungen in der Kartusche einfügen und so dass sich der Reaktionsbehälter in den Schlitz 148 einfügt. Der Wandler 92 sollte in dem Instrument 140 so angeordnet sein, dass der Wandler, wenn die Kartusche in die Aufnahme 141 eingesetzt wird, die Bodenwand der Lysierungskammer 86 berührt, wie dies in der Schnittansicht von 5 dargestellt ist. Außerdem kann das Instrument eine Feder oder einen ähnlichen Mechanismus zur Vorbelastung des Wandlers 92 gegen die Wand der Lysierungskammer 86 enthalten.
Das Instrument 140 enthält auch verschiedene herkömmliche, in 10 nicht dargestellte Ausrüstungsteile, einschließlich einer Hauptplatine mit einem Mikrokontroller zur Steuerung des Betriebs der Elektromagnete 146, des Wandlers 92, des Wärmetauschmoduls 147 und der optischen Sensoren 143, 144. Das Instrument umfasst auch eine Stromversorgung zur Versorgung des Instruments mit Energie und eine pneumatische Pumpe zur Lieferung von Luftdruck durch die Düsen 145 oder ist mit solchen verbunden. Das Instrument 140 ist vorzugsweise computergesteuert, z.B. mittels des Mikrokontrollers, der dafür programmiert ist, die unten im Abschnitt "Betrieb" beschriebenen Funktionen durchzuführen. Alternativ kann das Instrument von einem separaten Computer gesteuert werden oder durch eine Kombination aus separatem Computer und einem Onboard-Mikrokontroller gesteuert werden.
11 zeigt eine isometrische Ansicht der Kartusche 20, wie sie in das Instrument 140 zur Verarbeitung eingesetzt ist. 12 zeigt eine teilweise geschnittene Ansicht des Instruments 140 bei geschlossenem Deckel 150. Wieder bezugnehmend auf 11 kann ein Speicher- oder Mikroprozessorchip fakultativ als Teil der Kartusche 20 eingebaut sein. Dieser Chip enthält vorzugsweise Informationen wie den Kartuschentyp, Programminformationen wie spezifische Protokolle zur Verarbeitung der Kartusche, Toleranzen für die Annahme oder Rückweisung, Seriennummern und Loscodes zur Qualitätsverfolgung und Vorkehrungen zur Speicherung der Ergebnisse der Verarbeitung. Ein integrierter elektronischer Speicher auf der Kartusche 20 ermöglicht eine schnelle, leichte und fehlerfreie Einstellung des Instruments 140 für verschiedene Verarbeitungsprotokolle. Wenn die Kartusche 20 in das Instrument 140 eingesetzt ist, kann das Instrument den Speicher auf der Kartusche elektronisch adressieren und somit automatisch den entsprechenden Satz von Instruktionen zur Steuerung des Zeitablaufs der mit der eingesetzten Kartusche durchzuführenden fluidischen Arbeitsgänge empfangen. Das Instrument 140 kann einfach sequentiell jeden Schritt im Kartuschenspeicher abrufen und durchführen oder dessen Inhalt herunterladen, so dass der Benutzer z.B. mittels des Steuercomputers die Sequenz editieren kann.
Falls ein geeigneter Speicher auf der Kartusche miteingeschlossen ist, wie zum Beispiel ein beschreibbarer Speicher (z.B. ein löschbarer und programmierbarer Festspeicher (EPROM), elektrisch löschbarer und programmierbarer Festspeicher (EEPROM) etc.), könnten Zwischen- und Endergebnisse auf der Grundlage der in die Kartusche eingeführten Probe zwecks einer ortsgleichen Aufbewahrung mit der physikalischen Probe nach der Verarbeitung von dem Instrument in den Kartuschen speicher geschrieben werden. Dies ist besonders vorteilhaft bei Anwendungen, bei denen eine Archivierung von Proben und Ergebnissen notwendig ist, wie zum Beispiel Forensik. Außerdem können weitere Informationen im Speicher auf der Kartusche gespeichert werden, in unveränderbarer (oder veränderbarer) Form. Zum Beispiel könnten Kartuschen-Seriennummer, Losfertigungsinformationen und ähnliche Informationen vorprogrammiert und unveränderbar sein. Benutzerdaten, Identifikationsnummer des Technikers, Testdatum, Testort und Instrumenten-Seriennummer könnten unveränderbar in die Kartusche geschrieben werden. Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung der "Chain-of-Custody" (Verarbeitungskette) bei der Verarbeitung einer Probe. Ingenieure, die Fachleute für Datenspeicherung sind, werden erkennen, dass andere Speichermittel als elektronische verwendet werden können, wie z.B. optisch adressierte gedruckte Bereiche (z.B. Tintenstrahl oder thermisch), Magnetstreifen etc.
28 zeigt das Wärmetauschmodul 147 des Instruments, in das der Reaktionsbehälter 40 zwecks thermischer Verarbeitung und optischer Detektion von Zielanalyt(en) in dem Reaktionsgemisch eingesetzt wird. Das Modul 147 umfasst vorzugsweise ein Gehäuse 208 zum Halten der verschiedenen Bauteile des Moduls. Das Modul 147 umfasst außerdem die oben beschriebenen Thermoplatten 190. Das Gehäuse 208 enthält einen Schlitz (in 28 nicht dargestellt) über den Platten 190, so dass die Reaktionskammer des Behälters 40 durch den Schlitz und zwischen die Platten geschoben werden kann. Das Wärmetauschmodul 147 umfasst außerdem vorzugsweise ein Kühlsystem wie einen Ventilator 212. Der Ventilator 212 ist dafür angeordnet, Kühlluft über die Oberflächen der Platten 190 zu blasen, um die Platten zu kühlen und damit das Reaktionsgemisch im Behälter 40 zu kühlen. Das Gehäuse 208 definiert vorzugsweise Kanäle zum Leiten der Kühlluft über die Platten 190 und aus dem Modul 147.
Das Wärmetauschmodul 147 umfasst ferner eine Baugruppe zur optischen Anregung 216 und eine Baugruppe zur optischen Detektion 218, um das in dem Behälter 40 enthaltene Reaktionsgemisch optisch abzufragen. Die Anregungsgruppe 216 umfasst eine erste Leiterplatte 220 zum Halten ihrer elektronischen Bauelemente, und die Detektionsgruppe 216 umfasst eine zweite Leiterplatte 222 zum Halten ihrer elektronischen Bauelemente. Die Anregungsgruppe 216 enthält eine oder mehrere Lichtquellen (z.B. eine LED, einen Laser oder eine Glühlampe) zur Anregung von fluoreszenzmarkierten Analyten in dem Behälter 40. Die Anregungsgruppe 216 enthält auch eine oder mehrere Linsen zum Kollimieren des Lichts von den Lichtquellen, sowie Filter zum Auswählen der Anregungswellenlängenbereiche von Interesse. Die Detektionsgruppe 218 enthält einen oder mehrere Detektoren (z.B. eine Photodiode, einen Sekundärelektronenvervielfacher oder ein CCD-Element) zur Erfassung des vom Behälter 40 ausgesendeten Lichts. Die Detektionsgruppe 218 enthält auch eine oder mehrere Linsen zum Fokussieren und Kollimieren des ausgesendeten Lichts sowie Filter zum Auswählen der Emissionswellenlängenbereiche von Interesse. Geeignete optische Anregungs- und Detektionsgruppen zur Verwendung im Wärmetauschmodul 147 sind in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 99/60380 (internationale Anmeldung Nr. PCT/US99/11182), veröffentlicht am 25. November 1999, beschrieben.
Die Optikgruppen 216, 218 sind so in dem Gehäuse 208 angeordnet, dass, wenn die Kammer des Behälters 40 zwischen die Platten 190 eingeschoben ist, die Anregungsgruppe 216 durch die optisch durchlässige Seitenwand 57A (siehe 22) mit der Kammer 42 in optischer Kommunikation steht und die Detektionsgruppe 218 durch die optisch durchlässige Seitenwand 57B (siehe 22) mit der Kammer in optischer Kommunikation steht. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die Optikgruppen 216, 218 mit den optisch durchlässigen Seitenwänden in optische Kommunikation gebracht, indem die Optikgruppen 216, 218 einfach an den Unterkanten der Platten 190 angeordnet werden, so dass die Optikgruppen 216, 218 bei Anordnung der Kammer des Behälters zwischen den Platten die Seitenwände direkt berühren oder sich in unmittelbarer Nähe derselben befinden.
34 zeigt eine teilweise geschnittene isometrische Ansicht der Kammer des Behälters, eingeschoben zwischen die Platten 190A, 190B (der obere Teil des Behälters ist abgeschnitten). Der Behälter weist vorzugsweise einen winkeligen unteren Teil (z.B. dreieckig) auf, der von den optisch durchlässigen Seitenwänden 57A, 57B gebildet wird. Jede der Platten 190A, 190B weist einen entsprechend geformten unteren Teil auf. Der untere Teil der ersten Platte 190A besitzt eine erste Unterkante 250A und eine zweite Unterkante 250B. Desgleichen besitzt der untere Teil der zweiten Platte 190B eine erste Unterkante 252A und eine zweite Unterkante 252B. Die erste und die zweite Unterkante jeder Platte sind vorzugsweise um den gleichen Winkel zueinander winkelversetzt, um den die Seitenwände 57A, 57B zueinander winkelversetzt sind (z.B. 90°). Zudem sind die Platten 190A, 190B vorzugsweise dafür angeordnet, die Kammer des Behälters so zwischen sich aufzunehmen, dass die erste Seitenwand 57A im wesentlichen angrenzend an und parallel zu jeder der ersten Unterkanten 250A, 252A positioniert ist und dass die zweite Seitenwand 57B im wesentlichen angrenzend an und parallel zu jeder der zweiten Unterkanten 250B, 252B positioniert ist. Diese Anordnung gewährleistet einen leichten optischen Zugang zu den optisch durchlässigen Seitenwänden 57A, 57B und damit zur Kammer des Behälters. Fakultativ kann ein Gel oder Fluid verwendet werden, um die optische Kommunikation zwischen jeder Optikgruppe und den Seitenwänden 57A, 57B herzustellen oder zu verbessern. Das Gel oder Fluid sollte einen Brechungsindex nahe den Brechungsindizes der von ihm verbundenen Elemente besitzen.
Wieder bezugnehmend auf 28 sind die Optikgruppen 216, 218 vorzugsweise so angeordnet, dass sie einen 90°-Winkel zwischen dem Anregungs- und dem Detektionsweg schaffen. Der 90°-Winkel zwischen dem Anregungs- und dem Detektionsweg stellt sicher, dass eine minimale Menge der Anregungsstrahlung, die durch die erste Seitenwand der Kammer eintritt, durch die zweite Seitenwand austritt. Außerdem ermöglicht der 90°-Winkel, dass eine maximale Menge an emittierter Strahlung durch die zweite Seitenwand aufgefangen wird. Bei der bevorzugten Ausführungsform umfasst der Behälter 40 einen Fixierzapfen 58 (siehe 22), der in einen zwischen den Optikgruppen 216, 218 gebildeten Schütz passt, um die richtige Positionierung des Behälters 40 zur optischen Detektion zu gewährleisten. Für eine verbesserte Detektion umfasst das Modul 147 außerdem vorzugsweise einen lichtundurchlässigen Deckel (nicht dargestellt), der über dem oberen Teil des Behälters 40 angeordnet und lichtdicht am Gehäuse 208 angebracht wird, nachdem der Behälter zwischen die Platten 190 eingeschoben ist.
Obwohl gegenwärtig bevorzugt wird, die Optikgruppen 216, 218 nahe an den Unterkanten der Platten 190 zu positionieren, sind viele andere Anordnungen möglich. Zum Beispiel kann die optische Kommunikation zwischen den Optikgruppen 216, 218 und den Wänden des Behälters 40 über optische Fasern, Lichtleiter, Wellenleiter oder ähnliche Vorrichtungen hergestellt werden. Ein Vorteil dieser Vorrichtungen ist, dass sie die Notwendigkeit, die Optikgruppen 216, 218 physisch angrenzend an die Platten 190 anzuordnen, beseitigen. Dies lässt mehr Raum um die Platten zur Zirkulation von Kühlluft oder Kältemittel, so dass die Kühlung verbessert werden könnte.
Das Wärmetauschmodul 147 enthält auch eine gedruckte Leiterplatte 226 zum Halten von elektronischen Bauelementen des Moduls und eine Steckerleiste 224 zum Anschließen des Moduls 147 an das Instrument 140 (10). Die Heizelemente und Temperaturfühler auf den Platten 190 sowie die optischen Leiterplatten 220, 222 sind durch Flexkabel (zwecks Übersichtlichkeit der Abbildung in 28 nicht dargestellt) mit der gedruckten Leiterplatte 226 verbunden. Das Modul 147 kann auch einen Erdungsstrang 228 zur Abschirmung der optischen Detektionsschaltung enthalten. Das Modul 147 kann fakultativ eine Anzeigevorrichtung wie eine LED 214 umfassen, um einem Benutzer den gegenwärtigen Zustand des Moduls wie "Heizen", "Kühlen", "beendet" oder "Störung" anzuzeigen.
Das Gehäuse 208 kann aus einem starren Hochleistungskunststoff oder einem anderen herkömmlichen Material geformt sein. Die primären Aufgaben des Gehäuses 208 sind die Bereitstellung eines Rahmens zum Halten der Platten 190, der optischen Gruppen 216, 218, des Ventilators 212 und der gedruckten Leiterplatte 226. Außerdem bietet das Gehäuse 208 vorzugsweise Strömungskanäle und Öffnungen zum Leiten von Kühlluft von dem Ventilator 212 über die Oberflächen der Platten 190 und aus dem Gehäuse. Bei der bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gehäuse 208 komplementäre Teile (nur ein Teil ist in der schematischen Seitenansicht von 28 dargestellt), die sich aneinanderfügen, um die Bauteile des Moduls 147 zwischen sich einzuschließen.
Wieder bezugnehmend auf 23 können die Platten 190A, 190B aus verschiedenen thermisch leitenden Materialien einschließlich Keramik oder Metallen hergestellt sein. Geeignete keramische Werkstoffe umfassen Aluminiumnitrid, Aluminiumoxid, Berylliumoxid und Siliciumnitrid. Weitere Werkstoffe, aus denen die Platten hergestellt sein können, umfassen z.B. Galliumarsenid, Silicium, Siliciumnitrid, Siliciumdioxid, Quarz, Glas, Diamant, Polyacryle, Polyamide, Polycarbonate, Polyester, Polyimide, Vinylpolymere und halogenierte Vinylpolymere wie Polytetrafluorethylene. Weitere mögliche Plattenmaterialien umfassen Chrom/Aluminium, Superlegierungen, Zirkaloy, Aluminium, Stahl, Gold, Silber, Kupfer, Wolfram, Molybdän, Tantal, Messing, Saphir oder irgendeinen der anderen zahlreichen auf dem Fachgebiet verfügbaren keramischen, metallischen oder polymeren Werkstoffe.
Keramische Platten werden gegenwärtig bevorzugt, da ihre Innenflächen praktischerweise zwecks einer hohen Verschleißfestigkeit, einer hohen chemischen Beständigkeit und eines guten thermischen Kontakts mit den flexiblen Wänden des Reaktionsbehälters maschinell bis zu einer sehr hohen Glätte bearbeitet werden können. Zwecks einer geringen thermischen Masse können keramische Platten auch sehr dünn gefertigt werden, vorzugsweise zwischen 0,6 und 1,3 mm, um äußerst schnelle Temperaturwechsel zu gewährleisten. Eine Platte aus Keramik ist sowohl ein guter Wärmeleiter als auch ein elektrischer Isolator, so dass die Temperatur der Platte gut mittels eines mit der Platte verbundenen Heizwiderstandes geregelt werden kann.
Verschiedene thermische Elemente können verwendet werden, um die Platten 190A, 190B aufzuheizen und/oder zu kühlen und somit die Temperatur des Reaktionsgemisches in der Kammer 42 zu regeln. Allgemein umfassen geeignete Heizelemente zum Aufheizen der Platten leitende Heizgeräte, Konvektionsheizgeräte oder Strahlungsheizgeräte. Beispiele für leitende Heizgeräte umfassen Heizwiderstände oder induktive Heizelemente, die mit den Platten verbunden sind, z.B. Widerstände oder thermoelektrische Vorrichtungen. Geeignete Konvektionsheizgeräte umfassen Umluft-Heizgeräte oder Fluid-Wärmetauscher, um Fluida über die Platten strömen zu lassen. Geeignete Strahlungsheizgeräte umfassen Infrarot- oder Mikrowellenheizgeräte. Desgleichen können verschiedene Kühlelemente zur Kühlung der Platten verwendet werden. Zum Beispiel können verschiedene Konvektionskühlelemente wie ein Ventilator, eine Peltier-Vorrichtung, eine Kühlvorrichtung oder eine Strahldüse verwendet werden, um Kühlfluida über die Oberflächen der Platten strömen zu lassen. Alternativ können verschiedene leitende Kühlelemente verwendet werden, wie etwa eine Wärmesenke, z.B. ein gekühlter Metallblock, in direktem Kontakt mit den Platten.
Bezugnehmend auf 24 weist jede Platte 190 vorzugsweise einen Heizwiderstand 206 auf, der an ihrer Außenfläche angeordnet ist. Der Heizwiderstand 206 ist vorzugsweise eine Dick- oder Dünnschicht und kann direkt auf jede Platte 190 sieb gedruckt werden, insbesondere auf Platten, die einen keramischen Werkstoff wie Aluminiumnitrid oder Aluminiumoxid umfassen. Siebdruck gewährleistet eine hohe Zuverlässigkeit und einen geringen Querschnitt für eine effiziente Wärmeübertragung in die Reaktionskammer. Auf die Außenflächen der Platten können Dick- oder Dünnschichtwiderstände mit wechselnden geometrischen Mustern aufgebracht werden, um eine gleichmäßigere Erwärmung zu gewährleisten, zum Beispiel durch Vorhandensein dichterer Widerstände an den Enden und spärlicherer Widerstände in der Mitte. Obwohl gegenwärtig bevorzugt wird, ein Heizelement an der Außenfläche jeder Platte aufzubringen, kann ein Heizelement alternativ an der Innenfläche jeder Platte eingebrannt werden, insbesondere wenn die Platten keramisch sind. Das Heizelement 206 kann Metalle, Wolfram, Polysilicium oder andere Werkstoffe umfassen, die sich erwärmen, wenn eine Spannungsdifferenz durch das Material angelegt wird. Das Heizelement 206 weist zwei Enden auf, die mit jeweiligen Kontakten 204 verbunden sind, die wiederum an eine Spannungsquelle (in 24 nicht dargestellt) angeschlossen sind, um zu bewirken, dass ein Strom durch das Heizelement fließt. Jede Platte 190 umfasst außerdem vorzugsweise einen Temperaturfühler 192 wie ein Thermoelement, einen Thermistor oder RTD, der durch zwei Leiterzüge 202 mit jeweiligen Kontakten 204 verbunden ist. Der Temperaturfühler 192 wird dazu verwendet, die Temperatur der Platte 190 in einem Rückkopplungs-Regelkreis zu überwachen.
Die Platten besitzen eine geringe thermische Masse, um ein schnelles Aufheizen und Kühlen der Platten zu ermöglichen. Insbesondere wird gegenwärtig bevorzugt, dass jede der Platten eine thermische Masse von weniger als etwa 5 J/°C, bevorzugter weniger als 3 J/°C und am meisten bevorzugt weniger als 1 J/°C aufweist. Wie hier verwendet, ist der Ausdruck thermische Masse einer Patte als spezifische Wärmekapazität der Platte, multipliziert mit der Masse der Platte, definiert. Außerdem sollte jede Platte groß genug sein, um eine jeweilige Hauptwand der Reaktionskammer abzudecken. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform besitzt zum Beispiel jede der Platten eine Breite X im Bereich von 2 bis 22 mm, eine Länge Y im Bereich von 2 bis 22 mm und eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 5 mm. Die Breite X und Länge Y jeder Platte werden so gewählt, dass sie etwas größer als die Breite und Länge der Reaktionskammer sind. Überdies weist jede Platte vorzugsweise einen winkeligen unteren Teil auf, welcher der Geometrie des unteren Teils der Reaktionskammer entspricht, wie zuvor unter Bezugnahme auf 34 beschrieben. Auch ist bei der bevorzugten Ausführungsform jede der Platten aus Aluminiumnitrid mit einer spezifischen Wärmekapazität von etwa 0,75 J/g °C gefertigt. Die Masse jeder Platte liegt vorzugsweise im Bereich von 0,005 bis 5,0 g, so dass jede Platte eine thermische Masse im Bereich von 0,00375 bis 3,75 J/°C aufweist.
Die gegenüberliegenden Platten 190 sind dafür angeordnet, die Kammer des Behälters 40 so zwischen sich aufzunehmen, dass die flexiblen Hauptwände der Kammer die Innenflächen der Platten berühren und sich an diese anschmiegen. Es wird gegenwärtig bevorzugt, dass die Platten 190 mittels z.B. Stützen, Halterungen, Aufnahmen in einer gegenüberliegenden Beziehung zueinander gehalten werden. Alternativ können die Platten 190, wie in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 98/38487 beschrieben, gegeneinander federvorbelastet sein. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine der Platten in einer festen Position gehalten, und die zweite Platte wird gegen die erste Platte federvorbelastet. Wenn eine oder mehrere Federn verwendet werden, um die Platten gegeneinander vorzubelasten, sollten die Federn ausreichend steif sein, um sicherzustellen, dass die Platten mit genügend Kraft gegen die flexiblen Wände des Behälters gedrückt werden, um zu bewirken, dass sich die Wände an die Innenflächen der Platten anschmiegen.
29–30 erläutern eine bevorzugte Halterungskonstruktion 209 zum Halten der Platten 190A, 190B in einer gegenüberliegenden Beziehung zueinander. 29 zeigt eine Explosionsansicht der Konstruktion, und 30 zeigt eine Montageansicht der Konstruktion. Zwecks Übersichtlichkeit der Abbildung sind die Halterungskonstruktion 209 und die Platten 190A, 190B in Bezug auf ihre normale Orientierung in dem Wärmetauschmodul von 28 auf dem Kopf stehend dargestellt. Bezugnehmend auf 29 umfasst die Halterungskonstruktion 209 eine Montageplatte 210 mit dem darin ausgebildeten Schlitz 148. Der Schlitz 148 ist ausreichend groß, um ein Einschieben der Kammer des Behälters durch diesen zu ermöglichen. Von der Montageplatte 210 erstrecken sich auf gegenüberliegenden Seiten des Schlitzes 148 Abstandsstützen 230A, 230B. Die Abstandsstütze 230A weist Vertiefungen 232 auf, die auf gegenüberliegenden Seiten derselben ausgebildet sind (nur eine Seite in der isometrischen Ansicht von 29 sichtbar), und die Abstandsstütze 230B weist Vertiefungen 234 auf, die auf gegenüberliegenden Seiten derselben ausgebildet sind (nur eine Seite in der isometrischen Ansicht von 29 sichtbar). Die Vertiefungen 232, 234 in den Abstandsstützen dienen zur Aufnahme der Ränder der Platten 190A, 190B. Zum Zusammenbau der Konstruktion werden die Platten 190A, 190B so an gegenüberliegenden Seiten der Abstandsstützen 230A, 230B angeordnet, dass die Ränder der Platten in den Vertiefungen 232, 234 positioniert sind. Die Ränder der Platten werden dann mittels geeigneter Haltemittel in den Vertiefungen gehalten. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die Platten durch Halteklemmen 236A, 236B gehalten. Alternativ können die Platten 190A, 190B durch Klebverbindungen, Schrauben, Bolzen, Klammern oder andere geeignete Mittel gehalten werden Die Montageplatte 210 und die Abstandsstützen 230A, 230B sind vorzugsweise einstöckig als ein einziges Spritzgussteil aus Kunststoff ausgebildet. Der Kunststoff sollte ein Hochtemperatur-Kunststoff wie Polyetherimid sein, der sich nicht verformen oder schmelzen wird, wenn die Platten 190A, 190B erwärmt werden. Die Halteklemmen 230A, 230B sind vorzugsweise nichtrostender Stahl. Die Montageplatte 210 kann fakultativ Vertiefungen 240A, 240B zur Aufnahme von Flexkabeln 238A bzw. 238B enthalten, welche die auf den Platten 190A, 190B angeordneten Heizelemente und Temperaturfühler mit der gedruckten Leiterplatte 226 des Wärme tauschmoduls 147 (28) verbinden. Der an die Platte 190A angrenzende Teil der Flexkabel 238A wird durch ein Stück Klebeband 242A in der Vertiefung 240A gehalten, und der an die Platte 190B angrenzende Teil der Flexkabel 238B wird durch ein Stück Klebeband 242B in der Vertiefung 240B gehalten.
31 ist eine isometrische Ansicht der zusammengebauten Halterungskonstruktion 209. Die Montageplatte 210 umfasst vorzugsweise Zungen 246, die sich von gegenüberliegenden Seiten derselben zwecks Befestigung der Konstruktion 209 an dem Gehäuse des Wärmetauschmoduls erstrecken. Wieder bezugnehmend auf 28 umfasst das Gehäuse 208 vorzugsweise Schlitze 210 zur Aufnahme der Zungen, um die Montageplatte 210 sicher an ihrem Platz zu halten. Alternativ kann die Montageplatte 210 mittels z.B. einer Klebverbindung, Schrauben, Bolzen, Klammern oder irgendwelcher anderen herkömmlichen Befestigungsmitteln an dem Gehäuse 208 angebracht sein.
Wieder bezugnehmend auf 29 hält die Halterungskonstruktion 209 die Platten 190A, 190B vorzugsweise so, dass ihre Innenflächen ganz geringfügig zueinander gewinkelt sind. Bei der bevorzugten Ausführungsform weist jede der Abstandsstützen 230A, 230B eine Wand 244 auf, die leicht konisch zuläuft, so dass die Innenflächen der Platten, wenn die Platten 190A, 190B gegen gegenüberliegende Seiten der Wand gedrückt werden, leicht zueinander gewinkelt sind. Wie am besten in 23 gezeigt, stehen die Innenflächen der Platten 190A, 190B in einem solchen Winkel zueinander, dass sie einen leicht V-förmigen Schlitz bilden, in den die Kammer 42 eingeschoben wird. Das Ausmaß, in dem die Innenflächen zueinander gewinkelt sind, ist sehr gering, vorzugsweise etwa 1° von der Parallele. Die Flächen sind so zueinander gewinkelt, dass sich die unteren Teile der Platten vor dem Einschieben der Kammer 42 zwischen die Platten 190A, 190B etwas näher aneinander befinden als die oberen Teile. Diese leichte Winkelstellung der Innenflächen ermöglicht, dass die Kammer 42 des Behälters leichter zwischen die Platten eingeschoben und aus den Platten herausgezogen werden kann. Alternativ könnten die Innenflächen der Platten 190A, 190B parallel zueinander gehalten werden, das Einschieben und Entfernen des Behälters 40 wäre jedoch schwieriger.
Außerdem sind die Innenflächen der Platten 190A, 190B vorzugsweise in einem Abstand voneinander angeordnet, welcher der Dicke des Rahmens 46 entspricht. Bei Ausführungsformen, bei denen die Innenflächen zueinander gewinkelt sind, sind die Mittelpunkte der Innenflächen vorzugsweise in einem der Dicke des Rahmens 46 entsprechenden Abstand angeordnet und sind die unteren Teile der Platten anfänglich in einem Abstand angeordnet, welcher etwas geringer ist als die Dicke des Rahmens 46. Wenn die Kammer 42 zwischen die Platten 190A, 190B eingeschoben wird, zwingt der starre Rahmen 46 die unteren Teile der Platten auseinander, so dass die Kammer 42 fest zwischen die Platten eingefügt wird. Der Abstand, um den die Platten 190A, 190B durch den Rahmen 46 auseinandergekeilt werden, ist gewöhnlich sehr gering, z.B. etwa 0,035 mm, wenn die Dicke des Rahmens 1 mm beträgt und die Innenflächen um 1 ° zueinander gewinkelt sind.
Wieder bezugnehmend auf 30 sollten die Halteklemmen 236A, 236B elastisch genug sein, um sich dieser leichten Auswärtsbewegung der Platten 190A, 190B anzupassen, jedoch steif genug, um die Platten während des Einschiebens und Entfernens des Behälters innerhalb der Aussparungen in den Abstandsstützen 230A, 230B zu halten. Das Verkeilen des Behälters zwischen den Platten 190A, 190B gewährleistet eine anfängliche Vorbelastung gegen die Kammer und stellt sicher, dass die flexiblen Hauptwände der Kammer, wenn diese unter Druck gesetzt wird, einen guten thermischen Kontakt mit den Innenflächen der Platten herstellen.
Wieder bezugnehmend auf 28 können, um das Ausmaß zu begrenzen, in dem die Platten 190 infolge der Unterdrucksetzung des Behälters 40 auseinandergedrückt werden, Anschläge in die Gehäuse der Optikgruppen 216, 218 geformt sein. Wie in 32 dargestellt, umfasst das Gehäuse 249 der Optikgruppe 218 klauenartige Anschläge 247A, 247B, die sich von dem Gehäuse nach außen erstrecken. Wie in 33 dargestellt, wird das Gehäuse 249 so angeordnet, dass die Unterkanten der Platten 190A, 190B zwischen die Anschläge 147A, 247B geschoben werden. Die Anschläge 247A, 247B verhindern somit, dass sich die Platten 190A, 190B weiter als um einen vorbestimmten Maximalabstand auseinanderbewegen. Obwohl zwecks Übersichtlichkeit der Abbildung in 33 nicht dargestellt, besitzt die Optikgruppe 216 (siehe 28) ein Gehäuse mit entsprechenden Anschlägen, um zu verhindern, dass sich die anderen Hälften der Platten weiter als um den vorbestimmten Maximalabstand auseinanderbewegen. Wieder bezugnehmend auf 23 sollte der Maximalabstand, den die Anschläge den Innenflächen der Platten 190A, 190B voneinander einzunehmen erlauben, der Dicke des Rahmens 46 nahe entsprechen. Vorzugsweise ist der Maximalabstand der Innenflächen der Platten 190A, 190B geringfügig größer als die Dicke des Rahmens 46, um die Toleranzabweichungen beim Behälter 40 und bei den Platten 190A, 190B aufzufangen. Zum Beispiel ist der Maximalabstand vorzugsweise um etwa 0,1 bis 0,3 mm größer als die Dicke des Rahmens 46.
35 ist ein schematisches Blockdiagramm der elektronischen Bauelemente des Wärmetauschmoduls 147. Das Modul umfasst einen Steckverbinder 224 oder ein Flexkabel für den Anschluss an die Hauptplatine des Instruments. Das Modul umfasst außerdem Heizplatten 190A, 190B, die jeweils wie oben beschrieben einen Heizwiderstand aufweisen. Die Platten 190A, 190B sind parallel verdrahtet, um Stromzufuhr 253 von dem Instrument zu erhalten. Die Platten 190A, 190B umfassen ferner Temperaturfühler 192A, 192B, die analoge Temperatursignale an einen Analog-Digital-Wandler 264 ausgeben. Der Wandler 264 wandelt die analogen Signale in digitale Signale um und leitet sie durch den Steckverbinder 224 an den Mikrokontroller in dem Instrument weiter.
Das Wärmetauschmodul umfasst auch ein Kühlsystem wie einen Ventilator 212 zum Kühlen der Platten 190A, 190B und des Reaktionsgemisches, das in dem zwischen die Platten geschobenen Behälter enthalten ist. Der Ventilator 212 wird durch Schalten eines Leistungsschalters 272 in Betrieb gesetzt, der wiederum von einem Steuerlogikblock 270 gesteuert wird, welcher Steuersignale von dem Mikrokontroller empfängt. Das Modul umfasst ferner vier Lichtquellen wie LEDs 200 zur Anregung von markierten Analyten im Reaktionsgemisch und vier Detektoren 198, vorzugsweise Photodioden, zur Erfassung von Fluoreszenzemissionen aus dem Reaktionsgemisch. Das Modul umfasst auch eine regelbare Stromquelle 255 zur Lieferung einer veränderlichen Strommenge (z.B. im Bereich von 0 bis 30 mA) an jede LED, um die Helligkeit der LED zu verändern. Zwischen die regelbare Stromquelle 255 und den Mikrokontroller ist ein Digital-Analog-Wandler 260 geschaltet, um es dem Mikrokontroller zu ermöglichen, die Stromquelle digital zu regeln.
Die regelbare Stromquelle 255 wird vorzugsweise dazu verwendet, sicherzustellen, dass jede LED bei Aktivierung etwa dieselbe Helligkeit aufweist. Aufgrund von Herstellungsabweichungen besitzen viele LEDs unterschiedliche Helligkeiten, wenn sie mit der gleichen Strommenge versorgt werden. Daher wird gegenwärtig bevorzugt, die Helligkeit jeder LED bei der Herstellung des Wärmetauschmoduls zu prüfen und die Justierdaten in einem Speicher 268 des Moduls zu speichern. Die Justierdaten geben die richtige Strommenge an, mit der jede LED zu versorgen ist. Der Mikrokontroller liest die Justierdaten aus dem Speicher 268 und regelt die Stromquelle 255 entsprechend.
Das Modul umfasst zudem einen Signalkonditionierungs-/Verstärkungswähl-/Offsetabgleich-Block 262, bestehend aus Verstärkern, Schaltern, elektronischen Filtern und einem Digital-Analog-Wandler. Der Block 262 stellt die Signale von den Detektoren 198 ein, um Verstärkung, Offset zu erhöhen und Rauschen zu verringern. Der Mikrokontroller steuert den Block 262 durch ein digitales Ausgaberegister 266. Das Ausgaberegister 266 empfängt Daten von dem Mikrokontroller und gibt Steuerspannungen an den Block 262 aus. Der Block 262 gibt die eingestellten Detektorsignale durch den Analog-Digital-Wandler 264 und den Steckverbinder 224 an den Mikrokontroller aus. Das Modul umfasst ferner den Speicher 268, vorzugsweise einen seriellen EEPROM, zum Speichern von modulspezifischen Daten wie Justierdaten für die LEDs 200, Thermoplatten 190A, 190B und Temperaturfühler 192A, 192B.
Es wird nun der Betrieb der Kartusche und des Instruments beschrieben werden. Wie in 3 dargestellt, wird der Probenkammer 65 durch die Probenöffnung 64 eine zu analysierende Fluidprobe zugesetzt und die Kappe 30 in die Öffnung 64 geschraubt, um die Öffnung dicht zu verschließen. Bezugnehmend auf 10 wird die Kartusche 20 anschließend zur Verarbeitung in die Kartuschenaufnahme 141 des Instruments 140 eingesetzt. Sämtliche Ventile in der Kartusche 20 sind anfänglich geschlossen, wenn die Kartusche in das Instrument 140 eingesetzt wird. Wenn die Kartusche im Instrument angeordnet ist, berührt der Wandler 92, wie in 5 dargestellt, eine Außenfläche der elastischen Dichtung 63, welche die Bodenwand der Lysierungskammer 86 bildet.
Wieder bezugnehmend auf 10 wird das Instrument 140 vorzugsweise computergesteuert, um die im folgenden Abschnitt beschriebenen Funktionen durchzuführen, z.B. Öffnen und Schließen von Ventilen in der Kartusche mittels Ventilstellern 142, Lieferung von Druck an die Kartusche durch die Düsen 145, Einschalten des Wandlers 92, Abfühlen von Flüssigkeitsanwesenheit oder Flüssigkeitspegeln mittels optischer Sensoren 143 und 144 und Steuerung des Moduls 147 für Wärmeaustausch und optische Detektion. Ein Programmierer mit üblichem Fachwissen wird in der Lage sein, auf der Grundlage der folgenden Beschreibung einen Mikrokontroller und/oder Computer zur Durchführung dieser Funktionen zu programmieren.
Bezugnehmend auf 9 werden Flüssigkeiten vorzugsweise mittels Differenzdruck zwangsbewegt, um durch die Kartusche zu strömen. Obwohl hier ein positiver Druck beschrieben wird, kann auch ein negativer Druck (Vakuum) zur Steuerung des Fluidstromes in der Kartusche eingesetzt werden. Der Höchstbetrag an positivem Druck, der angelegt werden kann, wird gewöhnlich durch die hydrophoben Membranen begrenzt, die über 30 psi (207 kPa) den Flüssigkeitsdurchbruch-Druck erreichen können. Die untere Druckgrenze wird durch die Notwendigkeit begrenzt, die Probe und andere Fluida ausreichend schnell durch die Kartusche zu bewegen, um Testziele zu erreichen. Unter 1 psi (6,9 kPa) könnte zum Beispiel Probe nicht effizient durch den Filterstapel 87 strömen. Ein Druck im Bereich von 6 bis 20 psi (41 bis 138 kPa) ist im allgemeinen zweckmäßig. Der Probendurchfluss durch die Kartusche liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 30 ml/Minute. Der Waschflüssigkeitsdurchfluss kann langsamer sein, z.B. 6 bis 18 ml/Minute, so dass die Waschflüssigkeit die Lysierungskammer 86 wirksam spült.
Es wird nun unter Bezugnahme auf 9 ein spezifisches Protokoll beschrieben werden, um den Betrieb der Kartusche zu erläutern. Es versteht sich, dass dies lediglich ein Beispiel für ein mögliches Protokoll ist und den Bereich der Erfindung nicht einschränken soll. Zunächst wird die Kartusche vorzugsweise mit Waschlösung aus der Waschkammer 66 gefüllt, bevor die Fluidprobe zwangsbewegt wird, um aus der Probenkammer 65 zu strömen. Zum Füllen der Kartusche werden die Ventile 111 und 115 geöffnet, und es wird für etwa zwei Sekunden durch die Drucköffnung 116 ein Druck von 10 psi (69 kPa) an die Kammer 66 angelegt. Ein kleiner Teil der Waschlösung strömt durch die Kanäle 117 und 106, durch die Lysierungskammer 86, durch die Kanäle 109 und 110, in den U-förmigen Kanal 122 und bis hin zur hydrophoben Membran unter der Drucköffnung 128.
Nach dem Füllen werden Ventil 115 und Drucköffnung 116 geschlossen und die Ventile 107 und 114 geöffnet. Zugleich wird für etwa 15 Sekunden durch die Drucköffnung 105 ein Druck von 20 psi (138 kPa) an die Probenkammer 65 angelegt, um die Probe durch den Kanal 106, durch den Filterstapel 87 in die Kammer 86, durch die Kanäle 110, 111, 112 und in die Abfallkammer 68 mit Entlüftung zu treiben. Während die Probe den Detektionsbereich 136 im Kanal 106 passiert, kann der optische Reflexionssensor 144 (13) dazu verwendet werden, zu ermitteln, wann die Probenkammer 65 geleert worden ist. Während die Probenflüssigkeit durch den Filterstapel 87 strömt, werden Zielzellen oder -viren in der Probe eingefangen. Wenn ein vorbestimmtes Probenvolumen die Abfallkammer 68 erreicht, läuft etwas Flüssigkeit in die Sensorkammer 120 über und triggert den nächsten Schritt im Protokoll. Statt Rückmeldung von optischen Sensoren zum Auslösen von Ereignissen zu verwenden, könnten alternativ die Schritte in einem vorbestimmten Protokoll einfach zeitlich definiert sein, z.B. durch Anlegen vorbestimmter Drücke für eine vorbestimmte Zeitdauer, um bekannte Fluidvolumina mit bekannten Durchflussraten zu bewegen.
Das Durchflussdesign der Lysierungskammer 86 gestattet die Konzentrierung von Zielzellen oder -viren von einem relativ großen Probenvolumen zu einem viel kleineren Volumen zur Amplifikation und Detektion. Dies ist wesentlich für den Nach weis niederkonzentrierter Analyten in der Probe wie Nucleinsäuren. Insbesondere beträgt das Verhältnis des Volumens der zum Durchströmen der Lysierungskammer 86 zwangsbewegten Probe zur Volumenkapazität der Kammer 86 vorzugsweise wenigstens 2:1 und bevorzugter wenigstens 5:1. Das Volumen der zum Durchströmen der Kammer 86 zwangsbewegten Probe beträgt vorzugsweise wenigstens 100 μl und bevorzugter wenigstens 1 ml. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform wird ein Probenvolumen von 5 ml zwangsbewegt, um durch die Lysierungskammer 86 zu strömen, und die Kammer 86 besitzt eine Volumenkapazität von etwa 0,5 ml, so dass das Verhältnis 10:1 beträgt. Zudem kann die Lysierungskammer 86 beschallt werden (z.B. mittels eines Ultraschallhorns, das mit einer Wand der Kammer gekoppelt ist), während die Probe zum Durchströmen der Kammer zwangsbewegt wird. Beschallung der Kammer 86 dient dazu, ein Verstopfen des Filterstapels 87 zu vermeiden, wodurch ein gleichmäßigerer Strom durch die Kammer 86 gewährleistet wird. Insbesondere dienen die Schallwellen dazu, partikuläre Substanz oder die Kügelchen in dem Filterstapel daran zu hindern, ein oder mehrere Filter zu verstopfen.
Im nächsten Schritt werden die Ventile 111, 114, 115 geöffnet, und es wird für etwa sieben Sekunden ein Druck von 20 psi (138 kPa) an die Waschkammer 66 angelegt, um die Waschlösung durch die Kanäle 117 und 106 in die Lysierungskammer 86 zu treiben. Die Waschlösung spült PCR-Inhibitoren und Kontaminanten aus der Lysierungskammer 86 und transportiert sie durch die Kanäle 109, 110 und 112 in die Abfallkammer 68. Eine Vielzahl verschiedener geeigneter Waschlösungen von unterschiedlichem pH, unterschiedlicher Lösungsmittelzusammensetzung und Ionenstärke kann zu diesem Zweck verwendet werden und ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Ein geeignetes Waschreagens ist zum Beispiel eine Lösung aus 80 mM Kaliumacetat, 8,3 mM Tris-NCl, pH 7,5, 40 μm EDTA und 55% Ethanol. Die Lysierungskammer 86 kann beschallt werden (z.B. mittels eines Ultraschallhorns, das mit einer Wand der Kammer gekoppelt ist), während die Waschlösung zum Durchströmen der Kammer zwangsbewegt wird. Beschallung der Kammer 86 dient dazu, ein Verstopfen des Filterstapels 87 zu vermeiden, wodurch ein gleichmäßigerer Strom durch die Kammer 86 gewährleistet wird, wie dies zuvor beschrieben wurde. Zudem können die Schallwellen dazu dienen, das wegzuspülende Material aufzulockern. Wenn das zusätzliche Volumen an Waschlösung die Abfallkammer 68 erreicht, läuft etwas Flüssigkeit in die Sensorkammer 121 über und triggert den nächsten Schritt im Protokoll.
Im nächsten Schritt wird Ventil 115 geschlossen, und Ventil 119 wird geöffnet, während für etwa drei Sekunden durch die Drucköffnung 118 ein Druck von 15 psi (103 kPa) an die Reagenskammer 67 angelegt wird. Der Druck zwingt das Lysierungsreagens dazu, aus der Kammer 67 durch die Kanäle 117, 106 in die Lysierungskammer 86 und in den Kanal 110 zu strömen. Die Kammer 86 wird so mit Flüssigkeit gefüllt. Geeignete Lysierungsreagenzien umfassen zum Beispiel Lösungen, die ein chaotropes Salz wie Guanidin-HCl, Guanidinthiocyanat, Guanidinisothiocyanat, Natriumiodid, Harnstoff, Natriumperchlorat und Kaliumbromid enthalten. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform wird ein Lysierungsreagens verwendet, das nicht inhibitorisch für die PCR ist. Das Lysierungsreagens enthält 10 mM Tris, 5% Tween-20, 1 mM Tris-(2-carboxyethyl-phosphin-hydrochlorid), 0,1 mM Ethylenglykol-bis-(b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure. Nachdem die Lysierungskammer 86 mit Lysierungsreagens gefüllt worden ist, werden die Ventile 111, 114 geschlossen. Ventil 119 bleibt offen, und es wird an die Drucköffnung 118 ein Druck von 20 psi (138 kPa) angelegt. Der statische Druck in der Lysierungskammer 86 wird daher als Vorbereitung für die Lyse der in dem Filterstapel 87 gefangenen Zellen oder Viren auf 20 psi (138 kPa) erhöht.
Wieder bezugnehmend auf 5 ist die Unterdrucksetzung der Lysierungskammer 86 wesentlich, da sie eine wirksame Kopplung zwischen dem Wandler 92 und der flexiblen Wand 63 der Lysierungskammer 86 sicherstellt. Um die Zellen oder Viren in der Kammer 86 aufzubrechen, wird der Wandler 92 aktiviert (d.h. in schwingende Bewegung versetzt). Die flexible Wand 63 der Lysierungskammer 86 überträgt die schwingende Bewegung des Wandlers 92 auf die Flüssigkeit in der Kammer 86, indem sie leichte Durchbiegungen zulässt, ohne in der Wand hohe Spannungen zu erzeugen. Die Wand 63 kann, wie zuvor beschrieben, von der elastomeren Membran gebildet werden. Alternativ kann die Wand eine Dünn- oder Dickfolie aus polymerem Material (z.B. eine Polypropylenfofie) sein, die vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,025 bis 0,1 mm aufweist. Der Wandler 92 ist vorzugsweise ein Ultraschallhorn zum Beschallen der Kammer 86. Die Kammer 86 wird vorzugsweise für 10 bis 40 Sekunden mit einer Frequenz im Bereich von 20 bis 60 kHz beschallt. In dem Beispielprotokoll wird die Kammer für 15 Sekunden mit einer Frequenz von 47 kHz beschallt. Die Amplitude der Hornspitze liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 25 μm (gemessen Peak zu Peak).
Während die Spitze des Wandlers 92 schwingt, stößt sie wiederholt gegen die flexible Wand 63. Bei ihrem Vorwärtsstoß (in 6 in der Aufwärtsrichtung) drückt die Spitze des Wandlers 92 gegen die Wand 63 und erzeugt einen Druckimpuls oder eine Druckwelle in der Kammer 86. Bei ihrer Rückbewegung (in 5 nach unten) trennt sich die Spitze des Wandlers 92 gewöhnlich von der flexiblen Wand 63, da sich die flexible Wand 63 nicht mit der gleichen Frequenz wie der Wandler bewegen kann. Bei ihrem nächsten Vorwärtsstoß stößt die Spitze des Wandlers 92 erneut gegen die Wand 63 in einer Frontalkollision, da sich Spitze und Wand aufeinander zu bewegen. Weil sich der Wandler 92 und die Wand 63 trennen, wenn der Wandler 92 schwingt, ist der effektive Vorwärtsstoß des Wandlers geringer als seine Peak-zu-Peak-Amplitude. Der effektive Vorwärtsstoß bestimmt den Beschallungspegel in der Kammer 86. Es ist daher wichtig, den statischen Druck in der Lysierungskammer 86 zu erhöhen, so dass die flexible Wand 63 bei Zurückweichen der Spitze des Wandlers 92 nach außen gedrückt wird, um die Spitze bei ihrem Rücklauf zu treffen. Der statische Druck in der Kammer 86 sollte ausreichend sein, um sicherzustellen, dass der effektive Vorwärtsstoß des Wandlers 92 Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer 86 erzeugt. Es wird gegenwärtig bevorzugt, den statischen Druck in der Kammer 86 auf wenigstens 5 psi (34 kPa) über dein Umgebungsdruck außerhalb der Kartusche zu erhöhen und bevorzugter auf einen Druck im Bereich von 15 bis 25 psi (103 bis 172 kPa) über dem Umgebungsdruck.
Bei jedem Vorwärtsstoß verleiht der Wandler 92 der Flüssigkeit in der Kammer 86 Geschwindigkeit und erzeugt so eine Druckwelle, die schnell durch die Kammer 86 flutet. Die Kügelchen in dem Filterstapel 87 (6) werden durch die Druckwellen in der Kammer 86 hin- und herbewegt. Die Druckwellen treiben die Kügelchen zu heftiger Bewegung in der Kammer 86 an, und die Kügelchen brechen die Zellen oder Viren mechanisch auf, um die Substanz (z.B. Nucleinsäure) aus diesen freizusetzen. Es ist anzumerken, dass einige Zellarten wie z.B. Blutzellen relativ schwach sind und lediglich mittels Druckwellen (z.B. Ultraschallwellen) ohne die Verwendung von Kügelchen aufgebrochen werden können. Andere Zellarten (insbesondere Sporen) haben hochfeste Zellwände, und es sind für eine wirksame Lyse gewöhnlich Kügelchen erforderlich.
Wieder bezugnehmend auf 9 werden nach Aufbrechen der Zellen oder Viren die Ventile 111, 124 geöffnet, und es wird für etwa 4 Sekunden durch die Drucköffnung 118 ein Druck von 12 psi (83 kPa) an die Reagenskammer 67 geliefert. Der Druck zwingt das Lysierungsreagenz dazu, die Nucleinsäure aus dem Filterstapel 87 zu eluieren und mit der Nucleinsäure in die Neutralisierungskammer 70 zu strömen. Die Lysierungskammer 86 kann während der Elution der Nucleinsäure beschallt werden (z.B. mittels eines Ultraschallhorns, das mit einer Wand der Kammer gekoppelt ist). Beschallen der Kammer 86 kann dazu dienen, ein Verstopfen des Filterstapels 87 zu verhindern, wie dies zuvor beschrieben wurde. Die Kammer 70 ist teilweise (z.B. zur Hälfte) mit einem Neutralisierungsmittel wie einem Detergens zur Neutralisierung des Lysierungsmittels gefüllt. Wenn ein für die PCR nicht inhibitorisches Lysierungsmittel verwendet wird, ist das Neutralisierungsmittel fakultativ.
Im nächsten Schritt wird das Ventil 124 geschlossen, um das Lysierungsreagens, den Analyten und das Neutralisierungsmittel in der Kammer 70 zu halten. Das Ventil 114 wird geöffnet, und es wird für etwa drei Sekunden durch die Drucköffnung 128 ein Druck von 15 psi (103 kPa) angelegt, um jegliche Flüssigkeit in dem U-förmigen Kanal 122 in die Abfallkammer 68 zu treiben. Als nächstes werden die Ventile 124 und 126 geöffnet, und es wird für etwa fünf Sekunden durch die Drucköffnung 123 an der Oberseite der Neutralisiererkammer 70 ein Druck von 15 psi (103 kPa) angelegt. Der Druck zwingt das neutralisierte Lysierungsreagens und die Nucleinsäure in der Kammer 70 dazu, in den Kanal 122 und in die Mastermixkammer 71 zu strömen. Das Ventil 126 zur Mastermixkammer 71 wird dann geschlossen. Die Mastermixkammer enthält PCR-Reagenzien und Fluoreszenzsonden, die sich mit dem neutralisierten Lysierungsreagenz und der Nucleinsäure vermischen, um ein Reaktionsgemisch zu bilden.
Im nächsten Schritt wird der Kanal 122 durch Öffnen des Ventils 114 zur Abfallkammer 68 und Anlegen eines Drucks von 15 psi (103 kPa) für etwa eine Sekunde an die Drucköffnung 128 geleert. Im nächsten Schritt wird das in der Mastermixkammer 71 gebildete Reaktionsgemisch folgendermaßen in den Reaktionsbehälter 40 befördert. Die Ventile 126, 127 und 133 werden geöffnet, und es wird für etwa sechs Sekunden an die Drucköffnung 125 an der Oberseite der Mastermixkammer 71 ein Druck von 15 psi (103 kPa) angelegt, um das Reaktionsgemisch zu zwingen, durch den Kanal 122, das Ventil 127 und den Kanal 80 durch die Öffnung 41 in den. Reaktionsbehälter 40 zu strömen. Das Reaktionsgemisch füllt die Kammer 42 des Behälters, wobei es Luft in der Kammer verdrängt, die durch den Auslasskanal 52 austritt. Die durch den Auslasskanal 52 entweichende Luft bewegt sich im Kanal 81 über den Sensorbereich 130 hinaus und in den Kanal 131. Aus dem Kanal 131 strömt die Luft in den Kanal 132, durch das Ventil 133, den Kanal 134 und verlässt die Kartusche durch die Entlüftungsöffnung 36. Wenn ein zur Füllung der Kammer 42 ausreichendes Volumen an Reaktionsgemisch in den Behälter geströmt ist, verlässt überschüssiges Reaktionsgemisch den Behälter durch den Auslasskanal 52. Das überschüssige Reaktionsgemisch strömt in den Kanal 81 und wird im Sensorbereich 130 optisch erfasst. Wenn das Reaktionsgemisch erfasst wird, wird das Ventil 133 geschlossen, während van der Drucköffnung 125 her Druck angelegt wird, um die Reaktionskammer 42 unter Druck zu setzen.
Wieder bezugnehmend auf 23 dehnt die Unterdrucksetzung der Kammer 42 die flexiblen Hauptwände 48 des Behälters. Insbesondere zwingt der Druck die Hauptwände 48 dazu, die Innenflächen der Platten 190A, 190B zu berühren und sich an diese anzuschmiegen. Dies gewährleistet eine optimale Wärmeleitfähigkeit zwischen den Platten 190A, 190B und dem Reaktionsgemisch in der Kammer 42. Es wird gegenwärtig bevorzugt, die Kammer 42 bis zu einem Druck im Bereich von 2 bis 30 psi (14 bis 207 kPa) über dem Umgebungsdruck unter Druck zu setzen. Dieser Bereich wird gegenwärtig bevorzugt, da 2 psi (14 kPa) im allgemeinen genug Druck ist, um ein Anschmiegen der Wände 48 an die Oberflächen der Platten 190A, 190B zu gewährleisten, wohingegen Drücke von über 30 psi (207 kPa) ein Reißen der Wände 48, eine Verformung des Rahmens 46 oder der Platten 190A, 190B oder ein Reißen der hydrophoben Membranen in der Kartusche bewirken können. Bevorzugter wird die Kammer 42 bis zu einem Druck im Bereich von 8 bis 15 psi (55 bis 103 kPa) über dem Umgebungsdruck unter Druck gesetzt. Dieser Bereich wird stärker bevorzugt, da er sich zuverlässig innerhalb der oben beschriebenen praktischen Grenzen befindet. Wenn die Kammer 42 unter Druck gesetzt ist, wird das Reaktionsgemisch in dem Behälter 40 thermisch verarbeitet und optisch abgefragt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielanalyten in dem Gemisch zu bestimmen.
Wieder bezugnehmend auf 35 wird das Reaktionsgemisch -mittels Standard-Proportional-Integral-Differential-(PID-)Regelung anhand von Solltemperaturen und Rückführsignalen von den Temperaturfühlern 192A, 192B thermisch zwischen den Platten 190A, 190B verarbeitet. Proportionierung kann entweder durch Veränderung des Verhältnisses von "An"-Zeit zu "Aus"-Zeit oder vorzugsweise mit analogen Proportionalausgängen erreicht werden, welche die entweder an die Heizelemente auf den Platten 190A, 190B oder an den Ventilator 212 gelieferte durchschnittliche Energie verringern, wenn sich die tatsächliche Temperatur der Platten 190A, 190B der gewünschten Sollwert-Temperatur annähert. PID-Regelung kombiniert den Proportionalmodus mit einer automatischen Rücksetz-Funktion (Integration des Abweichsignals bezüglich der Zeit) und Vorhalt (Summierung des Integrals und des Abweichsignals, um das Proportionalband zu verschieben). Standard-PID-Regelung ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und braucht hier nicht weiter beschrieben zu werden. Alternativ kann das Reaktionsgemisch mittels einer in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 99/48608 (Anmeldenummer PCT/US99/06628) beschriebenen modifizierten Version von PID-Regelung thermisch verarbeitet werden.
Während das Reaktionsgemisch zwischen den Heizplatten 190A, 190B thermisch zykliert wird, um eine oder mehrere Ziel-Nucleinsäuresequenzen im Gemisch zu amplifizieren, wird das Gemisch optisch abgefragt, vorzugsweise am niedrigsten Temperaturpunkt in jedem Zyklus. Optische Abfrage erfolgt durch sequentielle Aktivierung jeder der LEDs 200 zur Anregung verschiedener fluoreszenzmarkierter Analyten in dem Gemisch und durch Detektion des aus der Kammer 42 emittierten Lichts (Fluoreszenzabgabe) mittels der Detektoren 198. Wieder bezugnehmend auf 22 werden Anregungsstrahlen vorzugsweise durch die optisch durchlässige Seitenwand 57A zur Kammer 42 geleitet, während Fluoreszenzemission durch die Seitenwand 57B detektiert wird.
Ein Vorteil der Kartusche der vorliegenden Erfindung ist, dass sie es ermöglicht, das intrazelluläre Material aus einem relativ großen Volumen an Fluidprobe, z.B. mehreren Millilitern oder mehr, von der Probe zu trennen und es zu einem viel geringeren Volumen an Reaktionsfluid, z.B. 100 μl oder weniger, aufzukonzentrieren. Die Kartusche gestattet außergewöhnliche Konzentrationsfaktoren durch effiziente Extraktion von Material aus Millilitermengen an Fluidprobe. insbesondere weist die Probenkammer 65 vorzugsweise eine Volumenkapazität im Bereich von 100 μl bis 12 ml auf. Bevorzugter weist die Probenkammer 65 eine Volumenkapazität von wenigstens 1 ml auf. Die untere Grenze von 1 ml wird gegenwärtig bevorzugt, da wenigstens 1 ml Probe analysiert werden sollte, um niederkonzentrierte Analyten wie Nucleinsäure nachzuweisen. Die obere Grenze von 12 ml wird bevorzugt, da ein Probenvolumen von über 12 ml eine viel größere Kartusche erfordern würde und wahrscheinlich den Filterstapel verstopfen würde. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform besitzt die Probenkammer eine Volumenkapazität von 5,5 ml zum Halten von 5 ml Probe.
Die Waschkammer 66 besitzt eine Volumenkapazität proportional zum Volumen der Lysierungskammer 86. Insbesondere hält die Waschkammer 66 vorzugsweise ein Volumen an Waschflüssigkeit, das wenigstens dem Ein- bis Zweifachen des Volumens der Lysierungskammer 86 entspricht, um sicherzustellen, dass genug Waschlösung vorhanden ist, um PCR-Inhibitoren und Trümmer aus der Kammer 86 zu spülen. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumen der Lysierungskammer 86 etwa 0,5 ml, und das Volumen der Waschkammer 66 beträgt 2,5 ml zum Halten von 2 ml Waschlösung. Das Lysierungskammervolumen von 0,5 ml ist ein Kompromiss zwischen einer Größe, die groß genug ist, um ein Verstopfen des Filterstapels 87 zu vermeiden, und einer Größe, die klein genug ist, um den Analyten für eine verbesserte Amplifikation und Detektion zu einem geringen Volumen aufzukonzentrieren.
Die Reagenskammer 67 hält vorzugsweise ein Volumen an Lysierungsreagens, das wenigstens dem Ein- bis Zweifachen des Volumens der Lysierungskammer 86 entspricht, um sicherzustellen, dass genug Lysierungsreagens vorhanden ist, um die Kammer unter Druck zu setzen und Nucleinsäure aus der Kammer zu eluieren. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform besitzt die Kammer 67 eine Volumenkapazität von 1,5 ml zum Halten von etwa 1 bis 1,5 ml Lysierungsreagens. Die Abfallkammer 68 besitzt eine Volumenkapazität, die ausreicht, um die Probe, die Waschlösung und ungebrauchtes Lysierungsreagenz zu halten. Die Abfallkammer 68 ist bei der bevorzugten Ausführungsform mit einer Volumenkapazität von 9,5 ml dimensioniert.
Die Größe der Neutralisierungskammer 70 hängt vom Volumen der Lysierungskammer 86 ab, da das Neutralisierungsmittel in der Kammer 70 das die Lysierungskammer 86 füllende Volumen an Lysierungsreagens neutralisiert. Es wird gegenwärtig bevorzugt, dass die Lysierungskammer ein Volumen von 0,5 ml aufweist, so dass die Kammer 70 eine Volumenkapazität von 1,0 ml zum Halten von etwa 0,5 ml Neutralisierungsmittel, das mit 0,5 ml des Lysierungsreagens und eluiertem Analyten gemischt ist, aufweist. Die Volumenkapazität der Mastermixkammer 71 sollte ausreichend sein, um ein Reaktionsgemisch zu erzeugen, welches den Behälter 40 und die zum Behälter führenden Kanäle 122, 127 füllt. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform besitzt die Mastermixkammer eine Volumenkapazität von 200 μl zum Halten einer anfänglichen Ladung von 100 μl Mastermix, der 100 μl an neutralisiertem Lysierungsreagens und eluiertem Analyten zugesetzt werden, um das Reaktionsgemisch zu bilden.
Die Strömungskanäle in der Kartusche sind im Querschnitt allgemein D-förmig (wobei die Dichtung 63 die flache Seite des Kanals bildet) und besitzen vorzugs weise eine Breite oder einen Durchmesser im Bereich von 1/64 bis 1/8 Inch (0,4 bis 3,2 mm) und bevorzugter eine Breite von 1132 bis 1/16 Inch (0,8 bis 1,6 mm). Diese Bereiche werden gegenwärtig bevorzugt, um zu vermeiden, dass man zu schmale Kanäle hat (was eine Drosselung der Strömung erzeugt), und um zu vermeiden, dass man zu breite Kanäle hat (was zu ungenutzten Flüssigkeitsvolumina im Strömungsweg führt).
Viele Modifikationen an der Konstruktion und Arbeitsweise der Kartusche und des Instruments sind in alternativen Ausführungsformen möglich. Obwohl Amplifikation durch PCR gegenwärtig bevorzugt wird, können zum Beispiel die Kartusche und das Instrument dazu verwendet werden, Nucleinsäuresequenzen mittels eines beliebigen Amplifikationsverfahrens zu amplifizieren, einschließlich sowohl Amplifikationsverfahren mit thermischer Zyklierung als auch isothermer Amplifikationsverfahren. Geeignete Verfahren mit thermischer Zyklierung umfassen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; US-Patent Nr. 4,683,202, 4,683,195 und 4,965,188); ReverseTranskriptase-PCR (RT-PCR); DNA-Ligase-Kettenreaktion (LCR; Internationale Patentanmeldung Nr. WO 89/09835) und transkriptions-basierte Amplifikation (D. Y. Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173–1177), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Geeignete isotherme Amplifikationsverfahren, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, umfassen Rolling-Circle-Amplifikation; Strangverdrängungsamplifikation (SDA; Walker et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392–396); Q-Beta-Replikase (Lizardi et al. 1988, Bio/Technology 6, 1197–1202); nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA; R. Sooknanan und L. Malek 1995, Bio/Technology 13, 563–65) und selbstunterhaltende Sequenzreplikation (3SR; Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874–1878), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Überdies können die Kartusche und das Instrument dazu verwendet werden, andere chemische Reaktionen als Nucleinsäureamplifikation durchzuführen. Außerdem können, obwohl Fluoreszenzanregung und Emissionsdetektion bevorzugt werden, auch optische Detektionsverfahren wie jene, die bei direkter Absorption und/oder Transmission mit einachsigen Geometrien eingesetzt werden, zur Erfassung von Analyt in der Kartusche verwendet werden. Ein weiteres mögliches Detektionsverfahren ist die Fluoreszenzabklingzeit. Zudem ist die Kartusche nicht auf Detektion beschränkt, die auf Fluoreszenzmarkierungen beruht. Die Detektion kann zum Beispiel auf Phosphoreszenzmarkierungen, Chemilumineszenzmarkierungen oder Elektrochemilumineszenzmarkierungen beruhen.
Eine Fluidprobe kann durch eine Vielzahl verschiedener Mittel, manuell oder automatisiert, in die Kartusche eingebracht werden. Für die manuelle Zufuhr kann ein abgemessenes Volumen an Material durch eine Beschickungsöffnung in einen Aufnahmebereich der Kartusche eingebracht werden, und es wird dann eine Kappe über der Öffnung angeordnet. Alternativ kann der Kartusche eine größere Menge an Probenmaterial zugeführt werden, als für die Analyse erforderlich ist, und Mechanismen innerhalb der Kartusche können die genaue, für das spezifische Protokoll erforderliche Zumessung und Aliquotierung der Probe durchführen. Es kann wünschenswert sein, bestimmte Proben wie Gewebebiopsie-Material, Boden, Fäzes, Exsudate und andere komplexe Materialien in eine weitere Vorrichtung oder ein Zubehörteil einzubringen und dann die Zusatzvorrichtung oder das Zubehörteil in die Kartusche zu geben. Zum Beispiel kann ein Gewebestück in das Lumen einer Zusatzvorrichtung eingebracht werden, die als Kappe für die Beschickungsöffnung der Kartusche dient. Wenn die Kappe in die Öffnung gepresst wird, wird das Gewebe durch ein Sieb gedrückt, welches das Gewebe zerschneidet oder anderweitig zerteilt.
Zur automatisierten Probeneinbringung werden zusätzliche Konstruktionsbesonderheiten der Kartusche verwendet und verleihen in vielen Fällen eine Funktionalität des direkten Probeneintritts in die Kartusche. Bei bestimmten Proben wie solchen, die für den Bediener oder die Umgebung eine Gefährdung darstellen, wie z.B. humane retrovirale Pathogene, kann der Transfer der Probe zur Kartusche eine Gefahr bilden. So kann bei einer Ausführungsform eine Spritze in eine Vorrichtung integriert werden, um ein Mittel zur direkten Beförderung externer fluidischer Proben in die Kartusche bereitzustellen. Alternativ können eine Venenpunktionsnadel und ein evakuiertes Blutröhrchen an der Kartusche angebracht sein, um eine Anordnung zu bilden, die zur Gewinnung einer Blutprobe verwendet werden kann. Nach dem Sammeln werden das Röhrchen und die Nadel entfernt und verworfen, und die Kartusche wird dann in ein Instrument eingesetzt, um die Verarbeitung durchzuführen. Der Vorteil einer solchen Lösung ist, dass der Bediener oder die Umgebung keinen Pathogenen ausgesetzt wird.
Die Beschickungsöffnung kann unter Berücksichtigung entsprechender menschlicher Faktoren als Funktion der Beschaffenheit der vorgesehenen Probe konstruiert sein. Respiratorische Proben können zum Beispiel aus den unteren Atemwegen als Auswurf von Husten oder als Abstrich- oder Pinselprobe aus dem hinteren Rachen oder den Nasenöffnungen gewonnen werden. Im ersteren Fall kann die Beschickungsöffnung so konstruiert sein, dass sie es dem Patienten ermöglicht, direkt in die Kartusche zu husten, oder auf andere Weise das Spucken, der abgehusteten Probe in die Kartusche erleichtert. Für Pinsel- oder Abstrichproben wird die Probe in die Beschickungsöffnung eingebracht, wo besondere Eigenschaften der Öffnung und des Verschlusses das Abbrechen und Zurückbehalten des Tupfer- oder Pinselendes in dem Kartuschenaufnahmebereich erleichtern.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die Kartusche Beschickungs- und Abgaberöhrchen, die in einem Probenpool von sehr großem Volumen, wie z.B. einem fließenden Wasserstrom, angeordnet werden können, so dass das Probenrnaterial durch die Kartusche fließt. Alternativ kann ein hydrophiles saugfähiges Material als Wechselwirkungsbereich dienen, so dass die gesamte Kartusche direkt in die Probe getaucht und eine ausreichende Probenmenge in das saugfähige Material aufgenommen werden kann. Die Kartusche wird dann entfernt und kann zum Labor transportiert oder direkt mittels eines tragbaren Instruments analysiert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann Schlauchmaterial verwendet werden, so dass ein Ende des Schlauchs in direkter Kommunikation mit der Kartusche steht, um eine fluidische Schnittstelle mit wenigstens einem Wechselwirkungsbereich zu gewährleisten, und das andere Ende für die äußere Umgebung zugänglich ist, um als Aufnehmer für die Probe zu dienen. Der Schlauch kann dann in eine Probe eingebracht werden und als Sauger dienen. Die Kartusche selbst kann ebenfalls als faktische Probensammelvorrichtung dienen, wodurch Handhabung und Unbequem fichkeit verringert werden. Im Folie von Proben, die bei Rechtsstreitigkeiten oder strafrechtlichen Untersuchungen eine Rolle spielen, ist ein direkter Eintritt des Testmaterials in die fluidische Kartusche vorteilhaft, da die Verarbeitungskette zweckmäßig und zuverlässig beibehalten wird.
Wieder bezugnehmend auf 9 können Reagenzien vor dem Gebrauch exogen in die Kartusche eingeführt werden, z.B. durch verschließbare Öffnungen in der Reagenskammer 67, Neutralisiererkammer 70 und Mastermixkammer 71. Alternativ können die Reagenzien während der Herstellung in die Kartusche eingebracht werden, z.B. als wässerige Lösungen oder getrocknete Reagenzien, die eine Rekonstitution erfordern. Das spezielle Format wird auf der Grundlage vielfältiger Parameter gewählt, einschließlich der Tatsache, ob die Wechselwirkung in Lösungsphase oder Festphase erfolgt, der inneren thermischen Stabilität des Reagens, der Rekonstitutionsgeschwindigkeit und der Reaktionskinetik. Reagenzien, die Verbindungen enthalten, welche thermisch instabil sind, wenn sie in Lösung sind, können durch Trocknung mittels Techniken wie Lyophilisation stabilisiert werden. Vor dem Trocknen können dem Reagens Zusätze wie einfache Alkoholzucker, Methylcellulose und Füllproteine zugesetzt werden, um die Stabilität oder Rekonstituierbarkeit zu erhöhen.
Wieder bezugnehmend auf 21 erfordert der Reaktionsbehälter 40 nicht zwei flexible Folien, welche gegenüberliegende Hauptwände 48 der Reaktionskammer 42 bilden. Bei einer alternativen Ausführungsform weist zum Beispiel der Behälter 40 nur eine flexible Folie auf, die eine Hauptwand der Kammer bildet. Der starre Rahmen 46 definiert die andere Hauptwand der Kammer sowie die Seitenwände der Kammer. Bei dieser Ausführungsform sollte die von dem Rahmen 46 gebildete Hauptwand eine Mindestdicke von etwa 0,05 Inch (1,25 mm) haben, was typischerweise die praktische Mindestdicke für Spritzguss ist, während die flexible Folie 0,0005 Inch (0,0125 mm) dünn sein kann. Der Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass die Herstellung des Reaktionsbehälters 40 vereinfacht wird und daher weniger kostspielig ist, da nur eine flexible Folie an dem Rahmen 46 befestigt werden muss. Der Nachteil ist, dass die Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten des Reaktions gemisches voraussichtlich langsamer sind, da die von dem Rahmen 46 gebildete Hauptwand wahrscheinlich keine so hohe Wärmeübertragungsrate zulässt wie die dünne flexible Folie.
Bezugnehmend auf 28 benötigt das Wärmetauschmodul 147 nur eine thermische Oberfläche zum Berühren einer flexiblen Wand des Reaktionsbehälters 40 und ein thermisches Element zum Heizen und/oder Kühlen der thermischen Oberfläche. Der Vorteil der Verwendung einer thermischen Oberfläche und eines thermischen Elements ist, dass die Vorrichtung billiger hergestellt werden kann. Der Nachteil ist, dass die Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeiten wahrscheinlich doppelt so langsam sind. Ferner kann, obwohl bevorzugt wird, dass die thermischen Oberflächen von den wärmeleitenden Platten 190 gebildet werden, jede thermische Oberfläche von irgendeiner starren Struktur bereitgestellt werden, die einen Kontaktbereich zum Berühren einer Wand des Behälters 40 aufweist. Die thermische Oberfläche umfasst vorzugsweise ein Material mit einer hohen Wärmeleitfähigkeit wie Keramik oder Metall. Überdies kann die thermische Oberfläche die Oberfläche des thermischen Elements selbst umfassen. Zum Beispiel kann die thermische Oberfläche die Oberfläche einer thermoelektrischen Vorrichtung sein, welche die Wand berührt, um die Kammer zu heizen und/oder zu kühlen.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, den Wandler in das Instrument 140 einzubauen. Bei einer anderen Ausführungsform kann jedoch der Wandler in die Kartusche eingebaut sein. Zum Beispiel kann zum Beschallen der Lysierungskammer eine piezoelektrische Platte in die Kartusche eingebaut sein. Alternativ kann eine Lautsprecheroder elektromagnetische Spulenvorrichtung in die Kartusche eingebaut sein. Bei diesen Ausführungsformen umfasst die Kartusche geeignete elektrische Steckverbinder zum Anschluss des Wandlers an eine Stromversorgung. Bei Ausführungsformen, bei denen der Wandler in die Kartusche eingebaut ist, sollte vermieden werden, dass der Wandler die Fluidprobe direkt berührt, z.B. sollte der Wandler laminiert oder durch eine Kammerwand von der Probe getrennt sein. Ferner kann die Lyse der Zellen oder Viren mittels eines Heizgeräts anstelle von oder in Kombination mit einem Wandler durchgeführt werden. Das Heizgerät kann ein Heizwiderstand sein, der Teil der Kartusche ist, oder das Heizgerät könnte in das Instrument eingebaut sein, das die Kartusche aufnimmt. Bei dieser Ausführungsform werden die Zellen oder Viren aufgebrochen, indem die Lysierungskammer auf eine hohe Temperatur (z.B. 95°C) erwärmt wird, um die Zellwände aufzubrechen.
36–46 zeigen eine weitere Vorrichtung 350 zum Aufbrechen von Zellen oder Viren gemäß der vorliegenden Erfindung. 36 zeigt eine isometrische Ansicht der Vorrichtung 350, und 37 zeigt eine Querschnittansicht der Vorrichtung 350. Wie in 36–37 dargestellt, umfasst die Vorrichtung 350 eine Kartusche oder einen Behälter 358 mit einer Kammer 367 zum Halten der Zellen oder Viren. Der Behälter umfasst eine flexible Wand 440, welche die Kammer 367 abgrenzt. Bei dieser Ausführungsform ist die flexible Wand 440 die Bodenwand der Kammer 367. Die flexible Wand 440 ist vorzugsweise eine Dick- oder Dünnfolie aus polymerem Material (z.B. eine Polypropylenfolie), und die Wand 440 weist vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,025 bis 0,1 mm auf. Die Vorrichtung 350 umfasst außerdem einen Wandler 314 wie z.B. ein Ultraschallhorn zum Berühren einer Außenfläche der flexiblen Wand 440 (d.h. einer Oberfläche der Wand 440, die außerhalb der Kammer 367 liegt). Der Wandler 314 sollte zu einer schwingenden Bewegung fähig sein, die ausreicht, um in der Kammer 367 Druckwellen zu erzeugen. Geeignete Wandler schließen Ultraschallwandler, piezoelektrische, magnetostriktive oder elektrostatische Wandler ein. Der Wandler kann auch eine elektromagnetische Vorrichtung mit einer Spule wie zum Beispiel ein Schwingspulenmotor oder eine Solenoidvorrichtung sein.
Die Vorrichtung 350 umfasst außerdem eine Stützstruktur 352, um den Behälter 358 und den Wandler 314 so gegeneinander zu halten, dass der Wandler 314 die Wand 440 der Kammer 367 berührt, und um eine im wesentlichen konstante Kraft an den Behälter 358 oder an den Wandler 314 anzulegen, um den Wandler 314 und die Wand 440 der Kammer aneinanderzupressen. Die Stützstruktur 352 umfasst eine Sockelstruktur 354 mit einem Ständer 356. Der Wandler 314 ist mittels einer Führung 364 verschiebbar an der Sockelstruktur 354 montiert. Die Führung 364 ist entweder einstückig mit der Sockelstruktur 354 ausgebildet oder fest an der Sockelstruktur angebracht. Die Stützstruktur 352 umfasst außerdem eine an der Sockelstruktur 354 befestigte Halterung 360 zum Halten des Behälters 358. Die Halterung 360 besitzt einen U-förmigen unteren Teil, der Zugang zur flexiblen Wand 440 der Kammer 367 gewährt. Die Führung 364 und die Halterung 360 sind dafür angeordnet, den Wandler 314 bzw. den Behälter 358 so zu halten, dass die Außenfläche der Wand 440 den Wandler 314 berührt. Die Stützstruktur 352 umfasst außerdem eine Aufnahme 362 für den oberen Teil des Behälters 358. Die Aufnahme 362 ist O-förmig, um Zugang zu einer in dem Behälter 358 ausgebildeten Austrittsöffnung 444 zu gewähren.
Die Stützstruktur 352 umfasst ferner einen elastischen Körper wie eine Feder 366 zum Anlegen einer Kraft an den Wandler 314, um den Wandler 314 gegen die Wand 440 zu pressen. Wenn der Wandler 314 mit der Wand 440 in Berührung steht, ist die von der Feder 366 gelieferte Kraft konstant, was eine gleichbleibende Kopplung zwischen dem Wandler 314 und der Wand 440 gewährleistet. Die Feder 366 ist zwischen einer Federführung 372 und der Basis eines Kopplers 368 angeordnet, der den unteren Teil des Wandlers 314 trägt. Wie in 36 dargestellt, weist der Koppler 368 vorzugsweise ein Fenster 370 auf, durch das die Anschlussleitung (nicht dargestellt) des Wandlers 314 geführt werden kann. Bolzen oder Schrauben 376 halten die Federführung 372 in Einstellnuten 374, die in der Sockelstruktur 354 ausgebildet sind. Die Größe der von der Feder 366 gelieferten Kraft kann durch Änderung der Vorbelastung der Feder eingestellt werden. Um die Vorbelastung der Feder 366 einzustellen, werden die Bolzen 376, welche die Federführung 372 halten, gelöst, wird die Führung 372 in eine neue Position bewegt und werden die Bolzen 376 wieder angezogen, um die Führung 372 in der neuen Position zu halten. Sobald die Vorbelastung der Feder 366 eingestellt ist, um eine geeignete Kopplungskraft zwischen dem Wandler 314 und der Wand 440 zu gewährleisten, ist es wünschenswert, die Vorbelastung von einem Gebrauch der Vorrichtung 350 bis zum nächsten konstant zu halten, so dass zulässige Vergleiche zwischen verschiedenen von der Vorrichtung aufgebrochenen Proben angestellt werden können.
Die Größe der Kraft, die von der Feder 366 geliefert wird, um den Wandler 314 und die Wand 440 aneinanderzupressen, ist wesentlich für die Erzielung einer gleichbleibenden Energieübertragung zwischen dem Wandler 314 und der Kammer 367. Wenn die Kraft zu schwach ist, wird der Wandler 314 nur leicht gegen die Wand 440 gehalten, was zu einer schlechten Übertragung schwingender Bewegung vom Wandler 314 auf die Wand 440 führt. Wenn die Kraft zu stark ist, können der Behälter 358 oder die Wand 440 während der Beschallung beschädigt werden. Eine mittlere Kraft ergibt die beständigste und reproduzierbarste Übertragung schwingender Bewegung vom Wandler 314 auf die Wand 440. Es wird gegenwärtig bevorzugt, dass die Feder 366 eine Kraft im Bereich von 1 bis 5 Pfund (4,4 bis 22N) liefert, wobei eine Kraft von etwa 2 Pfund (8,9 N) am bevorzugtesten ist.
38 zeigt eine Explosionsansicht des Behälters 358, und 39 zeigt eine Ansicht des Behälters 358 im zusammengebauten Zustand. Wie in 38–39 dargestellt, weist der Behälter 358 einen Körper auf, der ein Oberteil 448, ein Mittelteil 450 und ein Unterteil 452 umfasst. Das Mittelteil 450 definiert eine Einlassöffnung 442 zur Kammer 367, und das Oberteil 448 definiert eine Auslassöffnung 444 zur Kammer. Die Öffnungen 442, 444 sind dafür angeordnet, den kontinuierlichen Strom einer Fluidprobe durch die Kammer 367 zu ermöglichen. Die flexible Wand 440 wird mit Hilfe von Dichtungen 453, 454 zwischen dem Mittel- und dem Unterteil 450 bzw. 452 gehalten. Alternativ kann die flexible Wand 440 einfach an das Mittelteil 450 heißgesiegelt sein, so dass das Unterteil 452 und die Dichtungen 453, 454 entfallen können.
Der Behälter 358 umfasst außerdem einen Filterstapel 446 in der Kammer 367 zum Einfangen von Probenkomponenten (z.B. Zielzellen oder -viren), während die Probe durch die Kammer 367 strömt. Der Filterstapel umfasst (in 38–39 von unten nach oben) eine Dichtung 456, ein erstes Filter 458, eine Dichtung 460, ein zweites Filter 464 mit einer kleineren mittleren Porengröße als das erste Filter 458 und eine Dichtung 466. Der Filterstapel wird zwischen dem Ober- und dem Mittelteil 448, 450 des Behälters 358 gehalten. Der Filterstapel enthält außerdem Kügelchen 462, die zwischen dem ersten und dem zweiten Filter 458 und 464 angeordnet sind. Die Dichtung 460 beabstandet das erste Filter 458 von dem zweiten Fitter 464. Die Dichtung 460 sollte dick genug sein, um den Kügelchen eine freie Bewegung in dem Raum zwischen den Filtern 458, 464 zu ermöglichen. Eine durch die Kammer 367 strömende Fluidprobe fließt zunächst durch das Filter 458 und dann durch das Filter 466. Nach Durchströmen des Filterstapels fließt die Probe an Rippen 468 (38} entlang, die in dem die Kammeroberseite definierenden Teil des Oberteils 448 ausgebildet sind, und durch die Auslassöffnung 444 (39).
Der Filterstapel ist wirksam für das Einfangen von Zellen oder Viren, während eine Fluidprobe durch die Kammer 367 strömt, ohne diese zu verstopfen. Das erste Filter 458 (mit der größten Porengröße) filtert grobes Material wie Salzkristalle, Zell trümmer, Haare, Gewebe etc. aus. Das zweite Filter 464 (mit einer kleineren Porengröße) fängt Zielzellen oder -viren in der Fluidprobe ein. Die mittlere Porengröße des ersten Filters 458 wird so ausgewählt, dass sie genügend klein ist, um grobes Material aus der Fluidprobe zu filtern (z.B. Salzkristalle, Zelltrümmer, Haare, Gewebe), jedoch groß genug, um den Durchtritt der Zielzellen oder -viren zu gestatten. Allgemein sollte die mittlere Porengröße des ersten Filters 458 im Bereich von etwa 2 bis 25 μm liegen, bei einer gegenwärtig bevorzugten Porengröße von etwa 5 μm. Die mittlere Porengröße des zweiten Filters 464 wird so ausgewählt, dass sie etwas kleiner ist als die mittlere Größe der einzufangenden Zielzellen oder -viren (typischerweise im Bereich von 0,2 bis 5 μm).
Die Kügelchen 462 dienen zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren, um daraus das intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) freizusetzen. Bewegung der Kügelchen 462 bricht die an dem Filter 464 eingefangenen Zellen oder Viren auf. Geeignete Kügelchen zum Aufbrechen der Zellen oder Viren umfassen Borsilicatglas-, Kalkglas-, Silica- und Polystyrol-Kügelchen. Die Kügelchen können porös oder porenfrei sein und besitzen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im Bereich von 1 bis 200 μm. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform sind die Kügelchen 462 Polystyral-Kügelchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 100 μm.
Die Kügelchen 462 können eine Bindungsaffinität für die Zielzellen oder -viren in der Fluidprobe aufweisen, um das Einfangen der Zielzellen oder -viren zu erleichtern. Zum Beispiel können Antikörper oder bestimmte Rezeptoren auf die Oberfläche der Kügelchen 462 aufgebracht werden, um Zielzellen in der Probe zu binden. Überdies kann die Kammer 367 zwei verschiedene Arten von Kügelchen zur Wechselwirkung mit Zielzellen oder -viren enthalten. Die Kammer kann zum Beispiel einen ersten Satz Kügelchen enthalten, der mit Antikörpern oder Rezeptoren zur Bindung von Zielzellen oder -viren beschichtet ist, und einen zweiten Satz Kügelchen (gemischt mit dem ersten Satz) zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren. Die Kügelchen in der Kammer können auch eine Bindungsaffinität für das aus den aufgebrochenen Zellen oder Viren freigesetzte intrazelluläre Material (z.B. Nucleinsäure) aufweisen. Solche Kügelchen können zur Isolation von Zielnucleinsäure für eine anschließende Elution und Analyse dienen. Die Kammer 367 kann zum Beispiel Silicakügelchen zur Isolation von DNA oder Cellulosekügelchen mit Oligo-dT zur Isolation von Boten-RNA für eine RT-PCR enthalten. Die Kammer 367 kann auch Kügelchen zur Entfernung unerwünschten Materials (z.B. Proteine, Peptide) oder unerwünschter Chemikalien (z.B. Salze, Metallionen oder Detergenzien} aus der Probe enthalten, welche die PCR hemmen könnten.
Um sicherzustellen, dass die Luftblasen aus der Kammer 367 entweichen können, ist es wünschenswert, den Behälter 358 in einer Orientierung zu verwenden, in welcher die Flüssigkeit nach oben (bezogen auf die Schwerkraft) durch die Filter 458, 464 und die Kammer 367 strömt. Der Aufwärtsstrom durch die Kammer 367 unterstützt den Strom von Luftblasen aus der Kammer. Somit sollte die Einlassöffnung 442 zum Eintritt von Fluida in die Kammer 367 im allgemeinen auf einer niedrigeren Höhe liegen als die Auslassöffnung 444. Die Volumenkapazität der Kammer 367 liegt gewöhnlich im Bereich von 50 bis 500 μl. Die Volumenkapazität der Kammer 367 wird so gewählt, dass eine Aufkonzentrierung des von einer Fluidprobe abgetrennten Analyten gewährleistet ist, ohne dass die Kammer so klein ist, dass die Filter 458, 464 verstopft werden.
Die Teile 448, 450, 452, welche den Körper des Behälters 358 bilden, sind vorzugsweise gegossene polymere Teile (z.B. Polypropyien, Polycarbonat, Acryl etc.). Obwohl Guss zur Massenfertigung bevorzugt wird, ist es auch möglich, das Ober-, Mittel- und Unterteil 448, 450, 452 durch spanabhebende Bearbeitung herzustellen. Die Teile 448, 450, 452 können durch Schrauben oder Bolzen zusammengehalten werden. Alternativ könnten Ultraschallbonding, Quellschweißen oder Rastkonstruktionen zum Zusammenbau des Behälters 358 eingesetzt werden. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung des Behälters 358 ist das Gießen des Körpers in einem einzigen Stück und das Heißsiegeln der flexiblen Wand 440 und der Filter 458, 464 an den Körper.
40 zeigt ein fluidisches System zur Verwendung mit der Vorrichtung. Das System umfasst eine Flasche 470. zum Halten von Lysierungspuffer, eine Flasche 472, die Waschlösung enthält, und einen Probenbehälter 474 zum Halten einer Fluidprobe. Die Flaschen 470, 472 und der Probenbehälter 474 sind über Schläuche mit den Ventilöffnungen einer Spritzenpumpe 476 verbunden. Die Einlassöffnung des Behälters 358 ist ebenfalls mit der Spritzenpumpe 476 verbunden. Die Auslassöffnung des Behälters 358 ist mit der gewöhnlichen Öffnung eines Verteilerventils 478 verbunden. Das System umfasst außerdem ein Sammelröhrchen 480 zur Aufnahme von intrazellulärem Material, das aus der Probe entfernt wurde, einen Abfallbehälter 482 zur Aufnahme von Abfall und eine Druckquelle wie eine Pumpe 484. Das Sammelröhrchen 480, der Abfallbehälter 482 und die Pumpe 484 sind mit jeweiligen peripheren Öffnungen des Verteilerventils 478 verbunden. Ein Druckregler 486 reguliert den von der Pumpe 484 gelieferten Druck.
Es wird nun unter Bezugnahme auf 39–40 ein spezifisches Protokoll beschrieben werden, um den Betrieb des Behälters 358 zu erläutern. Es versteht sich, dass dies lediglich ein Beispiel für ein mögliches Protokoll ist und den Bereich der Erfindung nicht einschränken soll. Die Spritzenpumpe 476 pumpt eine Fluidprobe aus dem Probenbehälter 474 durch den Behälter 358 und in den Abfallbehälter 482. Während die Fluidprobe zwangsbewegt wird, um durch die Filter in der Kammer 367 zu strömen, wird von dem Filter 458 grobes Material ausgefiltert und werden von dem Filter 464 Zielzellen oder -viren in der Probe eingefangen. Die Kammer 367 kann beschallt werden, während die Probe zum Durchströmen der Kammer zwangsbewegt wird, um ein Verstopfen der Filter vermeiden zu helfen. Als nächstes pumpt die Spritzenpumpe 476 Waschlösung aus der Flasche 472 durch den Behälter 358 und in die Abfallkammer 482. Die Waschlösung spült PCR-Inhibitoren und Kontaminanten aus der Kammer 367.
Im nächsten Schritt pumpt die Spritzenpumpe 476 Lysierungspuffer aus der Flasche 470 in den Behälter 358, so dass die Kammer 367 mit Flüssigkeit gefüllt wird. Der Lysierungspuffer sollte ein Medium sein, durch das Druckwellen übertragen werden können. Der Lysierungspuffer kann zum Beispiel entionisiertes Wasser zum Halten der Zellen oder Viren in Suspension oder Lösung sein. Alternativ kann der Lysierungspuffer ein oder mehrere Lysierungsmittel enthalten, die beim Aufbrechen der Zellen oder Viren helfen. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist jedoch, dass für ein erfolgreiches Aufbrechen der Zellen oder Viren keine harten Lysierungsmittel erforderlich sind. Als nächstes wird das Verteilerventil der Spritzenpumpe 476 stromaufwärts des Behälters 358 geschlossen, und das Verteilerventil 478 wird geöffnet. Die Pumpe 484 setzt nun die Kammer 367 durch die Auslassöffnung 444 unter Druck, vorzugsweise bis etwa 20 psi (138 kPa) über dem Umgebungsdruck. Das Verteilerventil 478 stromabwärts des Behälters 358 wird dann geschlossen. Der statische Druck in der Kammer 367 wird daher als Vorbereitung für das Aufbrechen der an dem Filter 464 gefangenen Zellen oder Viren auf etwa 20 psi (138 kPa) erhöht.
Wieder bezugnehmend auf 37 ist die Unterdrucksetzung der Kammer 367 wesentlich, da sie eine wirksame Kopplung zwischen dem Wandler 314 und der flexiblen Wand 440 sicherstellt. Um die Zellen oder Viren in der Kammer 367 aufzubrechen, wird der Wandler 314 aktiviert (d.h. in schwingende Bewegung versetzt). Die flexible Wand 440 überträgt die schwingende Bewegung des Wandlers 314 auf die Flüssigkeit in der Kammer 367, indem sie leichte Durchbiegungen zulässt, ohne in der Wand hohe Spannungen zu erzeugen. Der Wandler 314 ist vorzugsweise ein Ultraschallhorn zum Beschallen der Kammer 367. Die Kammer 367 wird vorzugsweise für 10 bis 40 Sekunden mit einer Frequenz im Bereich von 20 bis 60 kHz beschallt. In dem Beispielprotokoll wird die Kammer für 15 Sekunden mit einer Frequenz von 40 kHz beschallt. Die Amplitude der Hornspitze liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 25 μm (gemessen Peak zu Peak).
Während die Spitze des Wandlers 314 schwingt, stößt sie wiederholt gegen die flexible Wand 440. Bei ihrem Vorwärtsstoß (in 37 in der Aufwärtsrichtung) drückt die Spitze des Wandlers 314 gegen die Wand 440 und erzeugt einen Druckimpuls oder eine Druckwelle in der Kammer 367. Bei ihrer Rückbewegung (in 37 nach unten) trennt sich die Spitze des Wandlers 314 gewöhnlich von der flexiblen Wand 440, da sich die flexible Wand 440 nicht mit der gleichen Frequenz wie der Wandler bewegen kann. Bei ihrem nächsten Vorwärtsstoß stößt die Spitze des Wandlers 31.4 erneut gegen die Wand 440 in einer Frontalkollision, da sich Spitze und Wand aufeinander zu bewegen. Weil sich der Wandler 314 und die Wand 440 trennen, wenn der Wandler 314 schwingt, ist der effektive Vorwärtsstoß des Wandlers geringer als seine Peak-zu-Peak-Amplitude. Der effektive Vorwärtsstoß bestimmt den Beschallungspegel in der Kammer 367. Es ist daher wichtig, den statischen Druck in der Kammer 367 zu erhöhen, so dass die flexible Wand 440 bei Zurückweichen der Spitze des Wandlers 314 nach außen gedrückt wird, um die Spitze bei ihrem Rücklauf zu treffen. Der statische Druck in der Kammer 367 sollte ausreichend sein, um sicherzustellen, dass der effektive Vorwärtsstoß des Wandlers 314 die erforderlichen Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer erzeugt, um ein Aufbrechen der Zellen zu bewirken. Es wird gegenwärtig bevorzugt, den statischen Druck in der Kammer 367 auf wenigstens 5 psi (34 kPa) über dem Umgebungsdruck zu erhöhen und bevorzugter auf einen Druck im Bereich von 15 bis 25 psi (103 bis 172 kPa) über dem Umgebungsdruck.
Bei jedem Vorwärtsstoß verleiht der Wandler 314 der Flüssigkeit in der Kammer 367 Geschwindigkeit und erzeugt so eine Druckwelle, die schnell durch die Kammer flutet. Die Kügelchen 462 in dem Filterstapel 446 (38) werden durch die Druckwellen in der Kammer 367 hin- und herbewegt. Die Druckwellen treiben die Kügelchen zu heftiger Bewegung an, und die Kügelchen brechen die Zellen oder Viren mechanisch auf, um den Analyten (z.B. Nucleinsäure) aus diesen freizusetzen. Wieder bezugnehmend auf 40 pumpt die Spritzenpumpe 476 nach dem Aufbrechen der Zellen oder Viren das freigesetzte intrazelluläre Material aus dem Behälter 358 in das Sammelröhrchen 480.
41 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei welcher der Behälter 358 eine feste Wand 488 zum Berühren des Wandlers 314 aufweist. Die feste Wand 488 unterscheidet sich von der flexiblen Wand 440, die zuvor unter Bezugnahme auf 37 beschrieben wurde. Während die flexible Wand typischerweise eine dünne Folie ist, die unter ihrem Eigengewicht durchbiegt und nicht ihre Form hält, sofern sie nicht an ihren Rändern gehalten wird, hält die feste Wand 488 ihre Form, wenn sie ungestützt ist. Der Vorteil der Verwendung einer festen Wand zum Berühren des Wandlers 314 ist, dass keine Notwendigkeit besteht, die Kammer 367 unter Druck zu setzen, um eine wirksame Kopplung zwischen der Wand 488 und dem Wandler 314 sicherzustellen. Die feste Beschaffenheit der Wand 488 gewährleistet die erforderliche Kopplung zwischen der Wand und dem Wandler 314. Jedoch ist die richtige Ausführung der festen Wand 488 erforderlich, so dass die Wand nicht von den schwingenden Bewegungen des Wandlers 314 beschädigt (z.B. geschmolzen) wird.
Insbesondere sollte die feste Wand 488 eine Eigenfrequenz aufweisen, die höher ist als die Schwingungsfrequenz, bei welcher der Wandler 314 betrieben wird. Zudem sollte die Wand 488 nicht so starr sein, dass sie die Schwingungsbewegung des Wandlers nicht auf die Flüssigkeit in der Kammer 367 übertragen kann. Es wird bevorzugt, dass die Wand 488 zu einer Peak-zu-Peak-Durchbiegung von wenigstens 20 μm imstande ist, wenn der Wandler 314 eine Kraft im Bereich von 1 bis 5 Pfund (4,4 bis 22N) an die Außenfläche der Wand 488 anlegt. Um diese Kriterien zu erreichen, ist die Wand 488 kuppelförmig und erstreckt sich nach außen zum Wandler 314 hin. Der Vorteil der kuppelförmigen Ausführung der Wand 488 ist, dass die Kuppelform die Eigenfrequenz der Wand erhöht (im Vergleich zu einer ebenen Wand), ohne zu bewirken, dass die Wand so steif ist, dass sie die Schwingungsbewegungen des Wandlers 314 nicht auf die Kammer 367 übertragen kann.
42 zeigt eine Querschnittansicht der Wand 488. Der kuppelförmige Teil 495 der Wand weist vorzugsweise einen Krümmungsradius R von etwa 9,5 mm und einen Durchmesser D1 von etwa 10 mm auf. Der Gesamtdurchmesser D2 der Wand einschließlich des ebenen Außenrandes 497 beträgt vorzugsweise etwa 14,3 mm. Die Dicke T der Wand liegt vorzugsweise im Bereich von 0,25 bis 1 mm. Wenn sie weniger als 0,25 mm dick ist, ist die Wand schwer zu gießen. Wenn die Wand eine Dicke von über 1 mm aufweist, könnte die Wand zu steif sein, um sich als Reaktion auf die Schwingungsbewegungen des Wandlers zweckgemäß durchzubiegen. Bei der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform besitzt die Wand 488 eine Dicke T von etwa 0,5 mm. Die Wand 488 ist vorzugsweise ein Kunststoff-Spritzgussteil. Geeignete Materialien für die Wand 488 umfassen Delrin^® (Acetalharze oder Polymethylenoxid), Polypropylen oder Polycarbonat.
Es wird nun unter Bezugnahme auf 41 die Wechselwirkung des Wandlers 314 mit der festen Wand 488 beschrieben werden. Vor Einschalten des Wandlers werden Zielzellen oder -viren an dem Filter 490 eingefangen, indem eine Fluidprobe zum Durchströmen der Kammer 367 zwangsbewegt wird (z.B. mittels des zuvor unter Bezugnahme auf 40 beschriebenen fluidischen Systems). Außerdem wird die Kammer 367 wie zuvor beschrieben mit einer Flüssigkeit (z.B. Lysierungspuffer) gefüllt. Im Gegensatz zu den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen wird jedoch die Kammer 367 nicht unter Druck gesetzt. Stattdessen wird der Umgebungsdruck in der Kammer beibehalten. Der Wandler 314 wird mit der Außenfläche der Wand 488 in Kontakt gebracht, vorzugsweise mittels einer Stützstruktur, wie sie zuvor unter Bezugnahme auf 37 beschrieben wurde. Insbesondere drückt vorzugsweise eine Feder den Wandler mit einer Kraft im Bereich von 1 bis 5 Pfund (4,4 bis 22N) gegen die Wand 488.
Um die Zellen oder Viren in der Kammer 367 aufzubrechen, wird der Wandler 314 aktiviert (d.h. in schwingende Bewegung versetzt). Während die Spitze des Wandlers 314 schwingt, biegt sie die Wand 488 durch. Bei ihrem Vorwärtsstoß (in 41 in der Aufwärtsrichtung) drückt die Spitze des Wandlers 314 gegen die Wand 488 und erzeugt einen Druckimpuls oder eine Druckwelle in der Kammer 367. Bei ihrer Rück bewegung (in 41 nach unten) bleibt die Wand 488 mit der Spitze des Wandlers 314 in Kontakt, da die Wand 488 eine höhere Eigenfrequenz als die Schwingungsfrequenz des Wandlers aufweist. Bei Ausführungsformen, bei denen der Wandlers ein Ultraschallhorn zum Beschallen der Kammer 367 ist, wird die Kammer 367 vorzugsweise für 10 bis 40 Sekunden mit einer Frequenz im Bereich von 20 bis 40 kHz beschallt. In dem Beispielprotokoll wird die Kammer für 15 Sekunden mit einer Frequenz von 40 kHz beschallt. Die Amplitude der Hornspitze liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 25 μm (gemessen Peak zu Peak), und die Eigenfrequenz der Wand 488 beträgt wenigstens 40 kHz.
Ein Vorteil der Verwendung der eine feste Grenzfläche bildenden Wand 488 ist, dass starke Druckabfälle in der Kammer 367 erzielt werden können, solange der statische Druck in der Kammer niedrig ist. Bei Atmosphärendruck kann zum Beispiel Kavitation (das Entstehen und Zusammenbrechen von mikroskopischen Blasen) in der Kammer 367 auftreten. Wenn diese Blasen oder Hohlräume auf Resonanzgröße anwachsen, kollabieren sie heftig, wobei sie sehr hohe örtliche Druckänderungen erzeugen. Die Druckänderungen liefern einen mechanischen Stoß an die Zellen oder Viren, was deren Aufbrechen zur Folge hat. Das Aufbrechen der Zellen oder Viren kann auch durch scharfe Druckanstiege bewirkt werden, die durch die Schwingungsbewegung des Wandlers 314 entstehen. Überdies kann das Aufbrechen der Zellen oder Viren durch die heftige Bewegung der Kügelchen 462 in der Kammer 367 bewirkt werden. Die Kügelchen werden durch die dynamischen Druckimpulse in der Kammer hin- und herbewegt und brechen die Zellen oder Viren auf. Bei experimentellen Untersuchungen haben die Anmelder festgestellt, dass es zum Aufbrechen bestimmter Zellarten (insbesondere Sporen) mit hochfesten Zellwänden gewöhnlich erforderlich ist, Kügelchen einzusetzen. Andere Zellarten wie Blutzellen sind leichter aufzubrechen und können oft ohne den Einsatz von Kügelchen 462 aufgebrochen werden.
Obwohl die Verwendung eines Ultraschallwandlers als eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, versteht sich, dass andere Arten von Wandlern bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Der Wandler sollte imstande sein, Druckimpulse oder Druckwellen in der Kammer 367 zu erzeugen.
Zudem sollte der Wandler imstande sein, der Flüssigkeit in der Kammer Stöße von hoher Geschwindigkeit zu vermitteln. Geeignete Wandler schließen Ultraschallwandler, piezoelektrische, magnetostriktive oder elektrostatische Wandler ein. Der Wandler kann auch eine elektromagnetische Vorrichtung mit einer Spule wie zum Beispiel ein Schwingspulenmotor oder eine Solenoidvorrichtung sein. Die Schwingungsfrequenz des Wandlers kann im Ultraschallbereich (d.h. über 20 kHz) oder unter dem Ultraschallbereich, z.B. im Bereich von 60 bis 20.000 Hz, liegen. Der Vorteil der Verwendung höherer Frequenzen ist, dass das Aufbrechen der Zellen sehr schnell erfolgt und oft in 10 bis 20 Sekunden abgeschlossen sein kann. Der Nachteil ist, dass Ultraschallwandler oft teurer sind als einfache mechanische Schwingungserzeuger, z.B. eine Lautsprecher- oder elektromagnetische Spulenvorrichtung. Bei einer alternativen Ausführungsform wird zum Beispiel die feste Wand 488 in Kombination mit einer Lautsprecher- oder elektromagnetischen Spulenvorrichtung verwendet, die mit einer Betriebsfrequenz im Bereich von 5 bis 10 kHz schwingt.
43A–43B erläutern eine andere feste Wand 500 zum Berühren eines Wandlers gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie in 43A dargestellt, weist eine Seite der Wand 500 einen Mittelteil 502 und eine Vielzahl von Versteifungsrippen 504 auf, die sich radial von dem Mittelteil 502 erstrecken. Die Wand weist außerdem Aussparungen 506 auf, die zwischen den Rippen 504 ausgebildet sind. Wie in 43B dargestellt, besitzt die andere Seite der Wand 500 eine ebene Oberfläche 508. 44 zeigt eine teilweise geschnittene isometrische Ansicht des Behälters 358 mit der Wand 500. Die Wand 500 ist vorzugsweise so angeordnet, dass sich die Wandseite mit der ebenen Oberfläche im Innern der Kammer 367 befindet und sich die Wandseite mit den Rippen 504 außerhalb der Kammer befindet. Die Rippen 504 sind vorteilhaft, da sie die Eigenfrequenz der Wand erhöhen, ohne zu bewirken, dass die Wand so steif ist, dass sie die Schwingungsbewegungen des Wandlers nicht auf die Kammer 367 übertragen kann.
45 zeigt eine Unteransicht des Behälters 358 mit der Wand 500. Der Mittelteil 502 stellt die Außenfläche der Wand 500 zum Berühren eines Wandlers bereit. Die Wechselwirkung der Wand 500 mit dem Wandler ist analog zur Wechselwirkung der Wand 488 mit dem Wandler, welche zuvor unter Bezugnahme auf 41 beschrieben wurde. Insbesondere bleibt die Wand 500 mit der Spitze des Wandlers in Kontakt, da die Wand 500 eine höhere Eigenfrequenz als die Schwingungsfrequenz des Wandlers aufweist. Folglich ist eine Unterdrucksetzung nicht erforderlich, und es kann Kavitation erzielt werden. Die unter Bezugnahme auf 41–45 beschriebenen festen Wände 488, 500 können in dem Behälter 358 verwendet werden, oder die Wände 488, 500 können in einer voll integrierten Kartusche wie der in 1 dargestellten Kartusche verwendet werden.

Claims

Vorrichtung zum Trennen eines Analyten von einer Fluidprobe, wobei die Vorrichtung eine Kartusche umfasst, die Folgendes aufweist: a) einen Probenströmungsweg; b) eine Lysierungskammer im Probenströmungsweg, worin die Lysierungskammer zumindest ein Filter zum Einfangen von Zellen oder Viren aus der Probe enthält, während die Probe durch die Lysierungskammer strömt; c) in der Lysierungskammer angeordnete Kügelchen zum Aufbrechen der Zellen oder Viren, um den Analyten aus diesen herauszulösen; d) eine Abfallkammer, die über den Probenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht, zur Aufnahme des gebrauchten Probenfluids, das durch die Lysierungskammer geströmt ist; e) einen Analytenströmungsweg, der sich von der Lysierungskammer erstreckt, worin der Analytenströmungsweg vom Probenströmungsweg abweicht; und f) zumindest eine Strömungssteuerung zum Leiten des gebrauchten Probenfluids in die Abfallkammer, nachdem die Probe durch die Lysierungskammer geflossen ist, und zum Leiten des von der Probe getrennten Analyten in den Analyten-strömungsweg.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kügelchen eine Bindungsaffinität zu den aufzubrechenden Zellen oder Viren aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kügelchen eine Bindungsaffinität zum Analyten aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Lysierungskammer weiters Kügelchen zum Einfangen von unerwünschtem Material in der Probe umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Lysierungskammer einen ersten Satz an Kügelchen zum Binden der Zellen oder Viren und einen zweiten Satz an Kügelchen zum Aufbrechen der Zellen oder Viren umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kartusche ein erstes Filter im Probenströmungsweg zum Herausfiltrieren von Grobmaterial aus der Probe und ein zweites Filter in der Lysierungskammer beinhaltet, wobei das zweite Filter eine kleinere mittlere Porengröße aufweist als das erste Filter.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kartusche weiters Folgendes einschließt: a) eine erste Sensorkammer, die in Fluidkommunikation mit der Abfallkammer steht, zum Anzeigen, wenn die Abfallkammer ein erstes vorbestimmtes Flüssigkeits-volumen erhalten hat; und b) eine erste Überlaufwand mit einem ersten Überlaufrand, die zwischen der Abfallkammer und der ersten Sensorkammer angeordnet ist, um zu verhindern, dass Flüssigkeit von der Abfallkammer in die Sensorkammer strömt, bis die Flüssigkeit in der Abfallkammer den Pegelstand des ersten Überlaufrands erreicht hat.
Vorrichtung nach Anspruch 7, worin die Kartusche weiters Folgendes einschließt: a) eine zweite Sensorkammer, die in Fluidkommunikation mit der Abfallkammer steht; und b) eine zweite Überlaufwand mit einem zweiten Überlaufrand, die zwischen der Abfallkammer und der zweiten Sensorkammer angeordnet ist, wobei der zweite Überlaufrand relativ zum Boden der Abfallkammer an einem anderen Pegelstand als der erste Überlaufrand positioniert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kartusche zumindest eine Wand umfasst, die die Lysierungskammer definiert, wobei die Wand eine Oberfläche außerhalb der Lysierungskammer aufweist, und die Vorrichtung weiters einen Wandler zum Kontaktieren der Außenoberfläche der Wand umfasst, um Druckimpulse oder Druckwellen in der Lysierungskammer zu erzeugen.
Vorrichtung nach Anspruch 13, worin der Wandler ein Ultraschallhorn umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, worin die Wand eine höhere Eigenfrequenz als die Schwingungsfrequenz des Wandlers aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin die Wand zu einer Durchbiegung von 20 Mikrometer imstande ist, wenn der Wandler eine Kraft im Bereich von 1 bis 5 Pfund (4,4 bis 22N) an die Wand anlegt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin die Wand kuppelförmig und in Bezug auf den Wandler konvex ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin die Wand Versteifungsrippen besitzt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, weiters umfassend eine Reaktionskammer zur Aufnahme des von der Probe getrennten Analyten, worin die Reaktionskammer über den Analytenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kartusche weiters eine Mischungskammer zum Mischen des Analyten mit einem Reagens einschließt, worin die Mischungskammer über den Analytenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht.
Vorrichtung nach Anspruch 16, worin die Kartusche weiters eine Reaktionskammer in Fluidkommunikation mit der Mischungskammer zur Amplifikation des Analyten beinhaltet.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kartusche weiters eine Reaktionskammer, die über den Analytenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht, zur Amplifikation des Analyten und zum Halten des Analyten für einen optischen Nachweis einschließt, worin die Kartusche mit einem Instrument kombiniert ist, das mit einer Heizung zum Erhitzen der Reaktionskammer und mit zumindest einem optischen Detektor zum Nachweisen des Analyten ausgestattet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Kartusche weiters Folgendes umfasst: i) eine Reaktionskammer, die über den Analytenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht, zur Amplifikation des Analyten; ii) einen Kapillarelektrophorese-Bereich, der in Kommunikation mit der Reaktionskammer steht.
Verfahren zum Trennen eines Analyten von einer Fluidprobe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Einführen der Probe in eine Kartusche, die Folgendes aufweist: i) einen Probenströmungsweg; ii) eine Lysierungskammer im Probenströmungsweg, worin die Lysierungskammer zumindest ein Filter zum Trennen der Zellen oder Viren von der Probe enthält; iii) Kügelchen in der Lysierungskammer zum Aufbrechen der Zellen oder Viren; und iv) einen sich von der Lysierungskammer erstreckenden Analytenströmungsweg, worin der Analytenströmungsweg vom Probenströmungsweg abweicht; b) Zwangsbewegen der Probe zum Strömen durch den Probenströmungsweg, wodurch die Zellen oder Viren mit dem zumindest einen Filter eingefangen werden, wenn die Probe durch die Lysierungskammer fließt; c) In-Bewegung-Versetzen der Kügelchen in der Lysierungskammer zum Aufbrechen der eingefangenen Zellen oder Viren, wodurch der Analyt aus den Zellen oder Viren herausgelöst wird; und d) Zwangsbewegen des Analyten zum Strömen von der Lysierungskammer in den Analytenströmungsweg.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das Verhältnis des Volumens der zum Durchströmen der Lysierungskammer zwangsbewegten Probe zur Volumenkapazität der Lysierungskammer zumindest 2:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das Volumen der zum Durchströmen der Lysierungskammer zwangsbewegten Probe zumindest 1 ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, weiters umfassend den Schritt der Beschallung der Lysierungskammer, während die Probe zum Durchströmen der Lysierungskammer zwangsbewegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, worin der Schritt des Aufbrechens der Zellen oder Viren auf jenen Schritt folgt, bei dem ein Waschfluid zum Durchströmen der Lysierungskammer zwangsbewegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24, weiters umfassend den Schritt der Beschallung der Lysierungskammer, während der Analyt zum Strömen aus der Lysierungskammer zwangsbewegt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, weiters umfassend den Schritt des Bindens der Zellen oder Viren an die Kügelchen.
Verfahren nach Anspruch 20, umfassend den Schritt des Bindens des Analyten an die Kügelchen, bevor der Analyt zum Strömen aus der Lysierungskammer zwangsbewegt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Lysierungskammer einen ersten Satz an Kügelchen zum Binden der Zellen oder Viren und einen zweiten Satz an Kügelchen zum Aufbrechen der Zellen oder Viren beinhaltet, und das Verfahren die Schritte des Bindens der Zellen oder Viren an den ersten Satz an Kügelchen und des Aufbrechens der Zellen oder Viren mithilfe des zweiten Satzes an Kügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, worin: i) die Kartusche eine Abfallkammer, die über den Probenströmungsweg mit der Lysierungskammer in Fluidkommunikation steht, zur Aufnahme der restlichen Probe, nachdem die Probe durch die Lysierungskammer geströmt ist, umfasst; ii) der Analytenströmungsweg zu einer dritten Kammer zur Aufnahme des von der Probe getrennten Analyten führt; iii) das Verfahren weiters die Schritte des Zwangsbewegens der restlichen Probe, nachdem die Probe durch die Lysierungskammer geströmt ist, um in die Abfallkammer zu strömen und des Zwangsbewegens des Analyten, um in die dritte Kammer zu strömen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29, weiters umfassend den Schritt des Mischens des Analyten mit einem Reagens in der dritten Kammer.
Verfahren nach Anspruch 29, weiters umfassend den Schritt der Amplifikation und des Nachweisens des Analyten in der dritten Kammer.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Kartusche zumindest eine Wand, die die Lysierungskammer definiert, umfasst und worin die Kügelchen durch Kontaktieren einer Außenoberfläche der Wand mit einem Wandler zur Erzeugung von Druckimpulsen oder Druckwellen in der Lysierungskammer in Bewegung versetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 32, worin die Wand eine höhere Eigenfrequenz als die Schwingungsfrequenz des Wandlers aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 32 oder 33, worin der Wandler die Wand um zumindest 20 Mikrometer biegt, wenn der Wandler eine Kraft im Bereich von 1 bis 5 Pfund (4,4 bis 22N) an die Wand anlegt.