DE60012485T2 - Salicylamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker - Google Patents

Salicylamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker Download PDF

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Description

  • Es gibt einen kontinuierlichen und steigenden Bedarf für schnelle, hochspezifische Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung chemischer, biochemischer und biologischer Substanzen als zu analysierender bzw. analytisch zu bestimmender Stoffe in Mischungen im Bereich der Forschung und Diagnostik. Von besonderem Wert sind Verfahrensweisen zur Messung kleiner Mengen von Nucleinsäuren, Peptiden, pharmazeutischen Stoffen, Metaboliten, Mikroorganismen und anderer Materialien von diagnostischem Wert. Beispiele solcher Materialien schließen ein: kleine molekulare bioaktive Materialien (z.B. Narkotika und Gifte, für therapeutische Zwecke verabreichte Arzneimittel, Hormone), pathogene Mikroorganismen und Viren, Antikörper und Enzyme sowie Nucleinsäuren, besonders diejenigen, die in Krankheitszustände impliziert sind.
  • Das Vorhandensein einer speziellen, zu analysierenden Substanz kann oft nachgewiesen werden durch Bindungsverfahren, die den hohen Grad an Spezifität ausnutzen, der viele biochemische und biologische Systeme kennzeichnet. Häufig angewendete Verfahrensweisen basieren beispielsweise auf Antigen-Antikörper-Systemen, Nucleinsäure-Hybridisierungs-Techniken und Protein-Ligand-Systemen. Bei diesen Verfahren wird das Vorhandensein eines Komplexes von diagnostischem Wert typischerweise angezeigt durch das Vorhandensein oder Fehlen eines beobachtbaren „Labels" bzw. einer beobachtbaren Markierung, die an eines oder mehrere der in Wechselwirkung zueinander tretenden Materialien gebunden wurde. Das gewählte spezielle Markierungsverfahren diktiert oft die Nützlichkeit und Vielseitigkeit eines speziellen Systems zum Nachweis einer zu analysierenden Substanz von Interesse. Bevorzugte Markierungen sind preiswert, sicher und sind in der Lage, wirksam an eine große Vielzahl von chemischen, biochemischen und biologischen Materialien gebunden zu werden, ohne signifikant die wichtigen charakteristischen Bindungs-Eigenschaften dieser Materialien zu verändern.
  • Die Markierung sollte ein hochgradig charakteristisches Signal ergeben und sollte selten, vorzugsweise nie, in der Natur gefunden werden. Die Markierung sollte stabil und in wässrigen Systemen über Zeiträume nachweisbar sein, die bis hinauf zu Monaten reichen. Ein Nachweis der Markierung ist vorzugsweise schnell, empfindlich und ohne das Erfordernis teurer, spezialisierter Anlagen oder die Notwendigkeit spezieller Vorsichtsmaßnahmen zum Schutz von Personen reproduzierbar. Die quantitative Bestimmung der Markierung ist vorzugsweise relativ unabhängig von Variablen wie Temperatur und Zusammensetzung der zu untersuchenden Mischung.
  • Eine große Vielzahl von Markierungen wurde entwickelt, jede mit besonderen Vorteilen und Nachteilen. Beispielsweise sind radioaktive Markierungen recht vielseitig und können in sehr niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden; solche Markierungen sind jedoch teuer, gefährlich, und ihre Verwendung erfordert hochentwickelte Anlagen und trainiertes Personal. Damit besteht ein großes Interesse an nicht-radioaktiven Markierungen, besonders an Markierungen, die durch spektrophotometrische-, Kernspin-, Resonanz- und Lumineszenz-Verfahren beobachtbar sind, und an reaktiven Materialien wie beispielsweise Enzymen, die solche Moleküle produzieren.
  • Markierungen, die unter Anwendung von Fluoreszenz-Spektroskopie nachweisbar sind, sind von besonderem Interesse, und zwar wegen der großen Zahl solcher Markierungen, die im Stand der Technik bekannt sind. Darüber hinaus ist die Literatur voll mit Synthesen von Fluoreszenz-Markierungen, die so derivatisiert sind, dass sie ein einfaches Binden an andere Moleküle erlauben, und viele derartige Fluoreszenz-Markierungen sind im Handel erhältlich.
  • Über die Tatsache hinaus, dass sie direkt nachgewiesen werden können, arbeiten viele Fluoreszenz-Markierungen derart, dass sie die Fluoreszenz einer benachbarten zweiten Fluoreszenz-Markierung quenchen. Wegen seiner Abhängigkeit von der Entfernung und der Größe der Wechselwirkung zwischen dem Quencher und dem Fluorophor liefert das Quenchen einer Fluoreszenz-Spezies einen empfindlichen Nachweis einer molekularen Konformation oder von Bindungs-Wechselwirkungen oder anderen Wechselwirkungen.
  • Ein ausgezeichnetes Beispiel der Verwendung von Fluoreszenz-Reporter-Quencher-Paaren wird gefunden beim Nachweis und der Analyse von Nucleinsäuren.
  • Ein alternatives Nachweis-Schema, das theoretisch empfindlicher als eine Autoradiographie ist, ist die Zeit-aufgelöste Fluorimetrie. Gemäß diesem Verfahren wird ein chelatisiertes Lanthaniden-Metall mit einer langen Strahlungs-Lebensdauer an ein Molekül von Interesse gebunden. Eine Impuls-Anregung, kombiniert mit einem gegateten Nachweis-System, ermöglicht eine wirksame Diskriminierung gegenüber einer kurzlebigen Hintergrund-Emission. Beispielsweise wurde unter Verwendung dieses Ansatzes der Nachweis und die quantitative Bestimmung von DNS-Hybriden über einen mit Europium markierten Antikörper gezeigt (Syvanen et al., Nucleic Acids Research 14: 1017 – 1028 (1986)). Darüber hinaus wurde eine biotinylierte DNS in Mikrotiter-Plattenvertiefungen unter Verwendung von mit Eu markiertem Strepavidin gemessen (Dahlen, Anal. Biochem. 164: 78 – 83 (1982)). Jedoch ist es ein Nachteil dieser Arten von Assays, dass die Markierung von der Nachweis-Sonde gewaschen werden und ihre Fluoreszenz in einer Verstärkungs-Lösung entwickelt werden muss. Ein weiterer Nachteil war die Tatsache, dass die erzeugte Fluoreszenz nur im Bereich von Nanosekunden (ns) lag; dies ist ein allgemein unannehmbar kurzer Zeitraum für einen adäquaten Nachweis der markierten Moleküle und für eine Diskriminierung gegenüber einer Hintergrund-Fluoreszenz.
  • Im Hinblick auf die voraussagbaren praktischen Vorteile wurde es allgemein gewünscht, dass die verwendeten Lanthaniden-Chelate eine verzögerte Fluoreszenz mit Zerfallszeiten von mehr als 10 μs zeigen sollten. Die Fluoreszenz vieler der bekannten Fluoreszenz-Chelate neigt dazu, durch Wasser inhibiert zu werden. Da Wasser allgemein in einem Assay zugegen ist, insbesondere in einem Immunoassay-System, werden Lanthaniden-Komplexe, die einer Inhibierung der Fluoreszenz in Gegenwart von Wasser unterliegen, als in gewisser Weise unvorteilhaft oder unpraktisch für viele Anwendungen angesehen. Darüber hinaus werden die kurzen Fluoreszenz-Zerfallszeiten als Nachteil dieser Verbindungen angesehen. Diese Inhibierung beruht auf der Affinität der Lanthaniden-Ionen gegenüber koordinierenden Wasser-Molekülen. Wenn das Lantha niden-Ion koordinierte Wasser-Moleküle aufweist, wird die absorbierte Licht-Energie (Anregungs-Energie) von dem Komplex auf das Lösungsmittel übertragen und wird nicht als Fluoreszenz emittiert.
  • Damit sind Lanthaniden-Chelate, insbesondere koordinativ gesättigte Chelate, die ausgezeichnete Fluoreszenz-Eigenschaften aufweisen, in hohem Maße erwünscht. Alternativ dazu sind auch koordinativ ungesättigte Lanthaniden-Chelate, die annehmbare Fluoreszenz in Gegenwart von Wasser zeigen, ebenfalls vorteilhaft. Derartige Chelate, die derivatisiert werden, um ihre Konjugation an eine oder mehrere Komponenten eines Assays zu ermöglichen, finden Verwendung in einem Bereich unterschiedlicher Assay-Formate. Die vorliegende Erfindung stellt diese und andere derartige Verbindungen und Assays unter Verwendung dieser Verbindungen bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Lumineszenz- (einschließlich Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-) Marker finden eine große Vielzahl von Anwendungen in der Wissenschaft, Medizin und Technik. In vielen Situationen liefern diese Marker kompetitiven Ersatz für Radiomarkierungen, chromogene, strahlungsdichte Farbstoffe usw. Darüber hinaus haben Verbesserungen der fluorimetrischen Messinstrumente erreichbare Empfindlichkeiten erhöht und erlaubte quantitative Analysen verbessert.
  • Die Verwendung von Lanthaniden-Chelaten in Kombination mit der Zeit-aufgelösten Fluoreszenz-Spektroskopie ist ein allgemein akzeptiertes immunochemisches Werkzeug. Derzeit bevorzugte Lanthaniden-Ionen schließen ein: Dy3+, Sm3+, Tb3+, Er3+ und Eu3+ sowie Nd3+ und Yb3+. Andere Lanthaniden-Ionen wie beispielsweise La3+, Gd3+ und Lu3+ sind nützlich, jedoch allgemein weniger bevorzugt.
  • Die vorliegende Erfindung stellte Lanthaniden-Komplexe bereit, die extrem lumineszent sind und viele Merkmale besitzen, die für Fluoreszenz-Marker und -Sonden zum Gebrauch in Fluoreszenz-Assay-Systemen erwünscht sind. Unter diesen Vorteilen sind: 1) Liganden, die sowohl als Chelatoren als auch als Chromophor-Energieübertragungs-Einrichtungen dienen; 2) sehr hohe Quanten-Ausbeuten der Lanthaniden-Ionen-Fluoreszenz der vorliegenden Komplexe in Wasser ohne äußere Verstärkung, wie beispielsweise durch Micellen oder Fluorid; 3) hohe Stabilität und Löslichkeit dieser Komplexe in Wasser; 4) eine extrem leichte Synthese, die preiswerte Ausgangsmaterialien einsetzt; und 5) leichter Zugang zu vielen Derivaten zum Verknüpfen dieser Lumineszenz-Sonden mit beispielsweise einem immunoreaktiven Mittel oder festen Träger (z.B. Polymer).
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Lanthaniden-komplexierenden Liganden bereit, die Salicylamid-Einheiten in ihre Strukturen einschließen, sowie lumineszierende Metallkomplexe dieser Liganden. Die Verbindungen gemäß der Erfindung schließen zweizähnige, vierzähnige und andere höher mehrzähnige Liganden auf Salicylamid-Basis ein. Die Verbindungen gemäß der Erfindung werden leicht in guten Ausbeuten hergestellt.
  • So stellt in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung ein lumineszierendes Lanthaniden-Metall-Chelat bereit, das ein Metall-Ion der Lanthaniden-Reihe und ein komplexierendes Mittel umfasst, das wenigstens eine Salicylamidyl-Einheit umfasst.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung bereit, die eine Struktur gemäß Formel I aufweist:
  • Figure 00050001
  • In der Formel I sind R1 und R2 Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Halogen und -OR6, worin R6 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung; R4, R5, R7, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituierten Alkyl-Gruppen; R2, R8 und R9 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl und substituierten Alkyl-Gruppen; R11, R12, R13, R21, R22 und R23 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR14R15, -NO2, -OR16, -COOR17, worin R14, R15, R16 und R17 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R12 gegebenenfalls einen Ring mit R11, R13 oder beiden bilden kann und R22 gegebenenfalls einen Ring mit R21, R23 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-, substituierten cyclischen Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Heterocyclyl- und gesättigten Heterocyclyl-Ringsystemen. Q1 für -OR18 steht; Q2 für -OR19 steht; worin R18 und R19 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung; die Buchstaben a und z unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus 0 und 1, mit der Maßgabe, dass dann, wenn a gleich 0 ist, N1' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 1' gebunden ist, und dann, wenn z gleich 0 ist, N2' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 2' gebunden ist.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein beispielhaftes Synthese-Schema für die Herstellung des TRENSAM-Liganden gemäß der Erfindung.
  • 2 ist ein übereinandergelegter Plot von Spektren, die von der spetktrophotometrischen Batch-Titration des Liganden TRENSAM durch TbCl3 in MeOH erhalten wurden.
  • 3 ist ein übereinandergelegter Plot eines berechneten Spektrums von MILI und eines beobachteten Spektrums für TRENSAM.
  • 4A–B sind Ansichten der Röntgenkristall-Struktur von Tb[TRENSAM]2 + : (A) Vollständige Ansicht (von oben); und (B) : Teil-Ansicht (von unten);
  • 5 ist eine Ansicht der Polyeder-Koordination um Tb3+ in Tb[TRENSAM]2 +;
  • 6A–B sind Strukturfomeln beispielhafter Dendrimere gemäß Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung;
  • 7 ist ein Synthese-Schema, das zu einem vielseitigen Intermediat für die Synthese von Liganden gemäß der Erfindung führt;
  • 8 ist ein Synthese-Schema, das zu Liganden gemäß der Erfindung mit Grundgerüsten unterschiedlicher Länge führt;
  • 9 ist ein schematisches Diagramm eines Multiplex-Assays gemäß der vorliegenden Erfindung;
  • 10 ist eine Tabelle repräsentativer Strukturen für beispielhafte Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungsformen
  • Abkürzungen
  • Gemäß der Verwendung in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen bezieht sich „SL" auf von Salicylamid abgeleitete Liganden gemäß der Erfindung. „SL" umfasst die Liganden gemäß der Erfindung sowohl im freien Zustand als auch dann, wenn sie an eines oder mehrere Metall-Ion(en) komplexiert wurden. Darüber hinaus schließt „SL" Liganden ein, die eine oder mehrere Salicylamidyl-Gruppen in Kombination mit einer oder mehreren Phthalamidyl-Gruppen einschließen („SPL").
  • Definitionen
  • Solange nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet werden, allgemein dieselben Bedeutungen, wie sie allgemein von einem Fachmann mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich verstanden werden, zu dem die vorliegende Erfindung gehört. Allgemein sind die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche verwendete Nomenklatur und die Labor-Verfahren im molekularbiologischen, organisch-chemischen und Nucleinsäure-chemischen Bereich sowie im Hybridisierungsbereich, wie sie nachfolgend beschrieben werden, die wohlbekannten und in diesem technischen Bereich allgemein verwendeten Standard-Verfahrensweisen zur Nucleinsäure-Synthese und Peptid-Synthese. Allgemein werden enzymatische Reaktionen und Reinigungs-Schritte nach den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. Die Techniken und Verfahrensweisen werden allgemein durchgeführt entsprechend in diesem technischen Bereich herkömmlichen Verfahrensweisen und verschiedenen allgemeinen Druckschriften (siehe allgemein: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), die im Rahmen des vorliegenden Dokuments geliefert werden. Die in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendete Nomenklatur und die Labor-Verfahren im Bereich der analytischen Chemie und organischen Synthese, wie sie nachfolgend beschrieben werden, sind diejenigen, die bekannt sind und in diesem technischen Bereich eingesetzt werden. Standard-Verfahrensweisen oder deren Modifikationen werden für chemische Synthesen und chemische Analysen verwendet.
  • Der Begriff „zu analysierende Substanz", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet irgendeine Verbindung oder irgendein Molekül von Interesse, für das ein diagnostischer Test durchgeführt wird, wie beispielsweise ein Biopolymer oder ein kleines molekulares bioaktives Material. Eine zu analysierende Substanz kann beispielsweise ein Protein, Peptid, Kohlehydrat, Polysaccharid, Glycoprotein, Hormon, ein Rezeptor, ein Antigen, ein Antikörper, ein Virus, ein Substrat, ein Metabolit, ein Übergangszustand-Analoges, ein Cofaktor, ein Inhibitor, ein Arzneimittel, ein Farbstoff, ein Nährstoff, ein Wachstumsfaktor usw. sein, ohne dass dies eine Beschränkung darstellt.
  • Der Begriff „Energie-Übertragung", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf das Verfahren, durch das die Fluoreszenz-Emission einer fluoreszierenden Gruppe durch eine die Fluoreszenz modifizierende Gruppe verändert wird. Wenn die die Fluoreszenz modifizierende Gruppe eine Quenching-Gruppe ist, dann wird die Fluoreszenz-Emission von der fluoreszierenden Gruppe abgeschwächt (gequencht). Eine Energie-Übertragung kann stattfinden durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung oder durch direkte Energie-Übertragung. Die exakten Energie-Übertragungs-Mechanismen in diesen beiden Fällen sind unterschiedlich. Es versteht sich, dass irgendeine Bezugnahme auf „Energie-Übertragung" in der vorliegenden Anmeldung alle diese hinsichtlich ihres Mechanismus voneinander unterscheidbaren Phänomene umfasst.
  • Der Begriff „Energie-Übertragungs-Paar", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf zwei beliebige Moleküle, die an einer Energie-Übertragung teilnehmen. Typischerweise dient eines der Moleküle als fluoreszierende Gruppe, und das andere dient als die Fluoreszenz-modifizierende Gruppe. Das bevorzugte Energie-Übertragungs-Paar gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine fluoreszierende Gruppe und eine Quenching-Gruppe gemäß der Erfindung. Es gibt keine Beschränkung hinsichtlich der Identität der einzelnen Mitglieder des Energie-Übertragungs-Paars in dieser Anmeldung. Alles, was erforderlich ist, ist, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften des Energie-Übertragungs-Paars als Ganzes in gewisser messbarer Weise ändern, wenn sich die Entfernung zwischen den einzelnen Gliedern um einen kritischen Betrag ändert.
  • Der Begriff „Energie-Übertragungs-Paar" wird verwendet, um sich auf eine Gruppe von Molekülen zu beziehen, die einen einzelnen Komplex bilden, innerhalb dessen eine Energie-Übertragung stattfindet. Solche Komplexe können beispielsweise umfassen: zwei Fluoreszenz-Gruppen, die von einander verschieden sein können, und eine Quenching-Gruppe, zwei Quenching-Gruppen und eine Fluoreszenz-Gruppe, oder mehrere Fluoreszenz-Gruppen und mehrere Quenching-Gruppen. In Fällen, in denen es mehrere Fluoreszenz-Gruppen und/oder mehrere Quenching-Gruppen gibt, können die einzelnen Gruppen voneinander verschieden sein.
  • Der Ausdruck „die Fluoreszenz modifizierende Gruppe", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül gemäß der Erfindung, das in irgendeiner Weise die Fluoreszenz-Emission von einer Fluoreszenz-Gruppe verändern kann. Eine die Fluoreszenz modifizierende Gruppe bewirkt dies allgemein durch einen Energie-Übertragungs-Mechanismus. In Abhängigkeit von der Identität der die Fluoreszenz modifizierenden Gruppe kann die Fluoreszenz-Emission eine Anzahl von Veränderungen eingehen, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Abschwächung, vollständiges Quenching, Verstärkung, Verschiebung der Wellenlänge, Verschiebung der Polarität und Änderung der Fluoreszenz-Lebensdauer. Ein Beispiel einer die Fluoreszenz modifizierenden Gruppe ist eine Quenching-Gruppe.
  • Der Begriff „Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung" oder „FRET" wird austauschbar mit dem Begriff „FET" verwendet und bezieht sich auf Energie-Übertragungs-Phänomen, bei dem das Licht, das von der angeregten Fluoreszenz-Gruppe emittiert wird, wenigstens teilweise von einer die Fluoreszenz modifizierenden Gruppe gemäß der Erfindung absorbiert wird. Wenn die die Fluoreszenz modifizierende Gruppe eine Quenching-Gruppe ist, dann strahlt diese Gruppe vorzugsweise einen wesentlichen Bruchteil der absorbierten Energie nicht als Licht einer unterschiedlichen Wellenlänge ab und leitet ihn vorzugsweise als Wärme ab. Die Erscheinung der FRET hängt von einer Überlappung zwischen dem Emissions-Spektrum der Fluoreszenz-Gruppe und dem Absorptions-Spektrum der Quenching-Gruppe ab. FRET hängt auch von der Entfernung zwischen der Quenching-Gruppe und der Fluoreszenz-Gruppe ab.
  • Der Begriff „Einheit" bezieht sich auf das Radikal bzw. den Rest eines Moleküls, der/das an eine andere Einheit gebunden ist.
  • Der Begriff „Nucleinsäure", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet DNS, RNS, einsträngig, doppelsträngig oder höher aggregierte Hybridisierungs-Motive und irgendwelche chemischen Modifikationen davon. Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf solche, die chemische Gruppen liefern, die in die Nucleinsäure-Ligand-Basen oder in den Nucleinsäure-Ligand als Ganzes zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoff-Bindung, elektrostatische Wechselwirkung und Fluktuierung einschließen. Solche Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Peptid-Nucleinsäuren, Phosphodiester-Gruppen-Modifikationen (z.B. Phosphorothioate, Methylphosphonate), Zucker-Modfikationen in 2'-Position, Pyrimidin-Modifikationen in 5-Position, Purin-Modifikationen in 8-Modifikation, Modifikation an exocyclischen Aminen, Substitution von 4-Thiouridin, Substitution von 5-Brom- oder 5-Iod-Uracil, Grundgerüst-Modifikationen, Methylierungen, unübliche Basen-Paarungs-Kombinationen wie beispielsweise die Isobasen, Isocytidin und Isoguanidin und dergleichen. Modifikationen können auch Modifikationen in 3'- und 5'-Position wie beispielsweise das Capping mit einer SL, einem Fluorophor oder einer anderen Einheit einschließen.
  • Der Begriff „Quenching-Gruppe", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf irgendeine die Fluoreszenz modifizierende Gruppe gemäß der Erfindung, die wenigstens teilweise das Licht abschwächen kann, das von einer Fluoreszenz-Gruppe emittiert wird. Diese Abschwächung wird nachfolgend als „Quenching" bezeichnet. Damit führt die Illumination der Fluoreszenz-Gruppe in Gegenwart der Quenching-Gruppe zu einem Emissions-Signal, das weniger intensiv als erwartet oder sogar vollständig abwesend ist. Ein Quenching tritt üblicherweise durch Energie-Übertragung zwischen der Fluoreszenz-Gruppe und der Quenching-Gruppe auf.
  • Der Begriff „Peptid" bezieht sich auf ein Polymer, indem die Monomere Aminosäuren sind und über Amid-Bindungen miteinander verbunden sind und das alternativ auch als „Polypeptid" bezeichnet wird. Wenn die Aminosäuren α-Aminosäuren sind, kann entweder das optische L-Isomer oder das optische D-Isomer verwendet werden. Zusätzlich sind auch unnatürliche Aminosäuren wie beispielsweise β-Alanin, Phenylglycin und Homoarginin eingeschlossen. Allgemein angetroffene Aminosäuren, die nicht Gen kodiert sind, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Alle Aminosäuren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können entweder das D- oder das L-Isomer sein. Die L-Isomere sind allgemein bevorzugt. Darüber hinaus sind auch andere Peptidomimetica nützlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Für eine allgemeine Übersicht wird verwiesen auf „A. F. Spatola; in: Chemistry and Biochemistry of Aminoacids, Peptides and Proteins; B. Weinstein (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, Seite 267 (1983)".
  • Der Begriff „Alkyl" wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche verwendet, um sich auf verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte einwertige Kohlenwasserstoff-Reste zu beziehen, die allgemein von etwa 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatome aufweisen und vorzugsweise von 4 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen und noch mehr bevorzugt von 6 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Wenn die Alkyl-Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wird sie als „Niederalkyl" bezeichnet. Geeignete Alkyl-Reste schließen beispielsweise Strukturen ein, die einen oder mehrere Methylen-, Methen- und/oder Methin-Gruppen aufweisen. Verzweigte Strukturen weisen ein Verzweigungsmotiv auf, das ähnlich in Resten i-Propyl, t-Butyl, i-Butyl, 2-Ethylpropyl usw. ist. Der Begriff, wie er im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche verwendet wird, umfasst auch „substituierte Alkyl-Reste" und „cyclische Alkyl-Reste".
  • Der Begriff „substituiertes Alkyl" bezieht sich auf Alkyl-Reste, wie sie gerade vorher beschrieben wurden, die einen oder mehrere Substituenten einschließen, wie beispielsweise Niederalkyl, Aryl, Acyl, Halogen (d.h. Alkylhalogen-Reste, z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Thioamido, Acyloxy, Aryloxy, Aryloxyalkyl, Mercapto, Thia, Aza, Oxo, sowohl gesättigte als auch ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffe, Heterocyclen und dergleichen. Diese Gruppen können an irgendein Kohlenstoffatom oder einen Substituenten der Alkyl-Einheit gebunden sein. Darüber hinaus können diese Gruppen von der Alkyl-Kette ausgehen oder integral in diese eingebunden sein.
  • Der Begriff „Aryl" wird in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet wird, um sich auf einen aromatischen Substituenten zu beziehen, der ein einzelner aromatischer Ring oder mehrere aromatische Ringe sein kann, die miteinander annelliert sind, kovalent aneinander gebunden sind oder an eine gemeinsame Gruppe wie beispielsweise eine Methylen- oder Ethylen-Einheit gebunden sind. Die gemeinsame Bindungs-Gruppe kann auch eine Carbonyl-Gruppe sein, wie beispielsweise in Benzophenon. Der/die aromatische(n) Ring(e) kann/können einschließen: Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Diphenylmethyl und Benzophenon, unter anderen Resten. Der Begriff „Aryl" umfasst auch „Arylalkyl" und „substituiertes Aryl".
  • Der Begriff „substituiertes Aryl" bezieht sich auf Aryl-Reste, wie sie gerade oben beschrieben wurden, einschließlich einer oder mehrerer funktioneller Gruppe(n) wie beispielsweise Niederalkyl, Acyl, Alkylhalogen-Reste (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Phenoxy, Mercapto und sowohl gesättigte als auch ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffe, die an den/die aromatischen Ring(e) annelliert sind, kovalent gebunden sind oder an eine gemeinsame Gruppe wie beispielsweise eine Methylen- oder Ethylen-Einheit gebunden sind. Die verbindende Gruppe kann auch ein Carbonyl-Rest sein, wie beispielsweise in Cyclohexylphenylketon. Der Begriff „substituiertes Aryl" umfasst auch „substituiertes Arylalkyl".
  • Der Begriff „Arylalkyl" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf einen Untersatz von Resten der Definition „Aryl" zu beziehen, in denen die Aryl-Gruppe an eine andere Gruppe über eine Alkyl-Gruppe gebunden ist, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert wurde.
  • Der Begriff „substituiertes Arylalkyl" definiert einen Untersatz von Gruppen mit der Bezeichnung „substituiertes Aryl", in denen die substituierte Aryl-Gruppe an eine andere Gruppe über eine Alkyl-Gruppe gebunden ist, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert wurde.
  • Der Begriff „Acyl" wird verwendet, um einen Keton-Substituenten zu beschreiben, -C(O)R, worin R für Alkyl oder substituiertes Alkyl, ein Aryl oder substituiertes Aryl steht, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert sind.
  • Der Begriff „Halogen" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf Fluor-, Brom-, Chlor- und Iod-Atome zu beziehen.
  • Der Begriff „Hydroxy" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf die Gruppe -OH zu beziehen.
  • Der Begriff „Amino" wird verwendet für -NRR', worin R und R' unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl oder substituierte Analoge davon sind.
  • Der Begriff „Amino" umfasst „Alkylamino", was sekundäre und tertiäre Amine bezeichnet, und „Acylamino", was die Gruppe RC(O)NR' bezeichnet.
  • Der Begriff „Alkoxy" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf die -OR-Gruppe zu beziehen, worin R Alkyl oder ein substituiertes Analog davon ist. Geeignete Alkoxy-Reste schließen beispielsweise Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy usw. ein.
  • Der Begriff „Aryloxy", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezeichnet aromatische Gruppen, die an eine andere Gruppe direkt über ein Sauerstoff-Atom gebunden sind. Dieser Begriff umfasst „substituierte Aryloxy"-Einheiten, in denen die aromatische Gruppe substituiert ist, wie dies oben für „substituiertes Aryl" beschrieben wurde. Beispielhafte Aryloxy-Einheiten schließen Phenoxy, substituiertes Phenoxy, Benzyloxy, Phenethyloxy, usw. ein.
  • Der Begriff „Aryloxyalkyl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, definiert aromatische Gruppen, die über ein Sauerstoffatom an eine Alkyl-Gruppe gebunden sind, wie sie oben definiert wurde. Der Begriff „Aryloxyalkyl" umfasst „substituierte Aryloxyalkyl"-Einheiten, in denen die aromatische Gruppe substituiert ist, wie dies für „substituiertes Aryl" beschrieben wurde.
  • Der Begriff „Mercapto", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, definiert Einheiten der allgemeinen Struktur -S-R, worin R für H, Alkyl, Aryl oder heterocyclische Reste steht, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert sind.
  • Der Begriff „gesättigter cyclischer Kohlenwasserstoff" bezeichnet Gruppen wie beispielsweise die Gruppen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl usw. und substituierte Analoge dieser Strukturen. Diese cyclischen Kohlenwasserstoffe können Ein-Ring- oder Mehr-Ring-Strukturen sein.
  • Der Begriff „ungesättigter cyclischer Kohlenwasserstoff" wird verwendet zur Beschreibung einer einwertigen nicht-aromatischen Gruppe mit wenigstens einer Doppelbindung, wie beispielsweise Cyclopenten, Cyclohexen usw. und substituierte Analoge davon. Diese cyclischen Kohlenwasserstoffe können Ein- oder Mehr-Ring-Strukturen sein.
  • Der Begriff „Heteroaryl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf aromatische Ringe, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) des/der aromatischen Ring(e)s durch ein Heteroatom wie beispielsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ersetzt sind. „Heteroaryl" bezieht sich auf Strukturen, die ein einzelner aromatischer Ring, mehrere aromatische Ringe oder ein oder mehrere aromatische Ringe, gebunden an einen oder mehrere nichtaromatische(n) Ring(e), sein können. In Strukturen mit mehreren Ringen können die Ringe miteinander annelliert, kovalent aneinander gebunden oder an eine gemeinsame Gruppe wie beispielsweise eine Methylen- oder Ethylen-Einheit gebunden sein. Die gemeinsame Verbindungs-Gruppe kann auch eine Carbonyl-Gruppe sein, wie beispielsweise in Phenylpyridylketon. Entsprechend der Verwendung in der Beschreibung und in den Patentansprüchen werden Ringe wie beispielsweise Thiophen, Pyridin, Isox azol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, Furan usw. oder Bezo-annellierte Analoge dieser Ringe durch den Begriff „substituiertes Heteroaryl" definiert.
  • Der Begriff „Heteroarylalkyl" definiert einen Untersatz der Reste mit der Bezeichnung „substituiertes Heteroaryl", in denen eine Alkyl-Gruppe, wie sie oben definiert wurde, die Heteroaryl-Gruppe an eine andere Gruppe bindet.
  • Der Begriff „substituiertes Heteroaryl" bezieht sich auf Heteroaryl-Reste, wie sie gerade oben beschrieben wurden, in denen der Heteroaryl-Kern mit einer oder mehreren funktionellen Gruppe(n) substituiert ist, wie beispielsweise Niederalkyl, Acyl, Halogen, Alkylhalogen-Reste (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Mercapto usw. Damit werden substituierte Analoge von heteroaromatischen Ringen wie beispielsweise Thiophen, Pyridin, Isoxazol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, Furan usw. oder Bezo-annellierte Analoge dieser Ringe durch den Begriff „substituiertes Heteroaryl" definiert.
  • Der Begriff „substituiertes Heteroarylalkyl" bezieht sich auf einen Untersatz der Substituenten mit der Bezeichnung „substituiertes Heteoaryl", wie sie oben beschrieben wurden, in denen eine Alkyl-Gruppe, wie sie oben definiert wurde, die Heteroaryl-Gruppe an eine andere Gruppe bindet.
  • Der Begriff „heterocyclisch" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um eine einwertige gesättigte oder ungesättigte nichtaromatische Gruppe zu beschreiben, die einen einzelnen Ring oder mehrere kondensierte Ringe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Heteroatomen aufweist, die gewählt sind aus Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff innerhalb des Rings. Solche Heterocyclen sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin usw..
  • Der Begriff „substituiert heterocyclisch", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, beschreibt einen Untersatz von Substituenten mit der Bezeichnung „heterocyclisch", in denen der Heterocyclen-Kern mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert ist, wie beispielsweise Niederalkyl, Acyl, Halogen, Alkylhalogen-Reste (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Mercapto usw.
  • Der Begriff „Heterocycloalkyl" definiert einen Untersatz von Gruppen mit der Bezeichnung „heterocyclisch", in denen eine Alkyl-Gruppe, wie sie oben definiert wurde, die heterocyclische Gruppe an eine andere Gruppe bindet.
  • Einführung
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Klasse von lumineszierenden Sonden, die auf Metall-Chelaten von Liganden auf Salicyclamidyl-Basis („SL") basieren, insbesondere Chelate der Lanthaniden-Reihe. Andere Verbindungen gemäß der Erfindung schließen sowohl Salicylamidyl-Einheiten als auch Phthalamidyl-Einheiten in einem einzigen Liganden („SPL") ein. Die Verbindungen gemäß der Erfindung emittieren Licht, oder sie können verwendet werden, um Licht zu absorbieren, das von einem Reporter-Fluorophor emitiert wird. Die Fluorophore gemäß der Erfindung können als kleine Moleküle in Lösungs-Assays verwendet werden, oder sie können verwendet werden als Markierung, die an eine zu analysierende Substanz oder eine Spezies gebunden wird, die mit einer zu analysieren Substanz in Wechselwirkung tritt und einen Nachweis und/oder eine quantitative Bestimmung der zu analysierenden Substanz erlaubt.
  • Fluoreszenz-Markierungen haben den Vorteil, dass sie wenig Vorsichtsmaßnahmen bei ihrer Handhabung erfordern und für Hoch-Durchlauf-Visualisierungstechniken zugänglich sind (optische Analyse, die eine Digitalisierung des Bildes zur Analyse in einem integrierten System einschließt, das einen Computer umfasst). Bevorzugte Markierungen sind typischerweise gekennzeichnet durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: hohe Empfindlichkeit, hohe Stabilität, geringer Hintergrund, lange Lebensdauern, geringe Umgebungs-Empfindlichkeit und hohe Spezifität bei der Markierung.
  • Die Fluorophore gemäß der Erfindung können mit anderen Fluorophoren oder Quenchern als Komponenten von Energie-Übertragungs-Sonden verwendet werden. Viele Fluoreszenz-Markierungen sind nützlich in Kombination mit den SL und SPL gemäß der Erfindung. Viele derartige Markierungen sind im Handel erhältlich von beispielsweise den Firmen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz) und Applied Biosystems (Foster City, CA) sowie viele andere kommerzielle Quellen, die Fachleuten in diesem Bereich bekannt sind. Weiter erkennen Personen mit Sachverstand in diesem technischen Bereich, wie man ein passendes Fluorophor für eine spezielle Anwendung auswählt und sind dann, wenn diese nicht einfach im Handel erhältlich ist, in der Lage, den erforderlichen Fluorophor de novo zu synthetisieren oder im Handel erhältliche Fluoreszenz-Verbindungen synthetisch zu modifizieren und so zu der gewünschten Fluoreszenz-Markierung zu kommen.
  • Zusätzlich zu Fluorophoren in Form kleiner Moleküle sind natürlich vorkommende Fluoreszenz-Proteine und durch Molecular Engineering hergestellte Analoge solcher Proteine nützlich mit den SLs und SPLs gemäß der vorliegenden Erfindung. Solche Proteine schließen beispielsweise ein: Grün-Fluoreszenz-Proteine von Önidarien (Ward et al., Photochem. Photobiol. 35: 803–808 (1982); Levine et al., Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77–85 (1982)), Gelb-Fluoreszenz-Protein von dem Stamm Vibrio fischeri (Baldwin et al, Biochemistry, 29: 5509–5515 (1990)), Peridinin-Chlorophyll von dem Dinoflagellaten Symbiodinium sp. (Morris et al., Plant Molecular Biology, 24 : 673–677 (1994)), Phycobili-Proteine von marinen Cyanobakterien wie beispielsweise Synechococcus, z.B. Phycoerythrin und Phycocyanin (Wilbanks et al., J. Biol. Chem, 268: 1226–1235 (1993)) und dergleichen.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können verwendet werden als Sonden, als Werkzeuge zum Trennen spezieller Ionen von anderen gelösten Substanzen, als Sonden in der Mikroskopie, Enzymologie, klinischen Chemie, Molekularbiologie und Medizin. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind auch nützlich als therapeutische Mittel in Modalitäten, wie beispielsweise photodynamische Therapie, und als diagnostische Mittel in Abbildungs-Verfahren wie beispielsweise der Magnetresonanz-Bildgebung. Darüber hinaus sind die Verbindungen gemäß der Erfindung nützlich als Komponente optischer Verstärker von Licht, Wave Guides und dergleichen. Weiter können die Verbindungen gemäß der Erfindung in Tinten und Farbstoffe wie beispielsweise solche eingearbeitet werden, die beim Drucken von Geldscheinen oder anderen handelbaren Instrumenten verwendet werden.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können zur Lumineszenz gebracht werden, indem man sie in irgendeiner Weise anregt, die in diesem technischen Bereich bekannt ist, einschließlich beispielsweise eine Anregung mit Licht oder mit elektrochemischer Energie (siehe beispielsweise Kulmala et al., Analytica Chimica Acta, 386: 1 (1999)). Im Fall chiraler Verbindungen gemäß der Erfindung kann die Lumineszenz circular polarisiert sein (siehe beispielsweise Riehl et al., Chem. Rev., 86: 1 (1986)).
  • Die Verbindungen, Sonden und Verfahren, die in den folgenden Abschnitten diskutiert werden, sind allgemein repräsentativ für die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung und die Verfahren, in denen solche Zusammensetzungen verwendet werden können. Die folgende Diskussion ist als beispielhaft für ausgewählte Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beabsichtigt und sollte nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend interpretiert werden.
  • Die Verbindungen
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Anordnung für Metall-chelatisierende Liganden („SL") auf Salicylamidyl-Basis, die wenigstens eine Salicylamidyl-Einheit innerhalb ihres Gitterwerks umfassen. Die SL-Verbindungen können auch eine oder mehrere Phthalamidyl-Einheiten) innerhalb ihres Rahmenwerks in Kombination mit einer oder mehreren Salicylamidyl-Einheiten) einschließen („SPL").
  • In einem Aspekt liefert die Erfindung einen lumineszenten Lanthaniden-Ionen-Komplex. Die chelatisierende Gruppe umfasst wenigstens eine Salicylamidyl-Gruppe, vorzugsweise zwischen 2 und 100 Salicylamidyl-Gruppen, noch mehr bevorzugt zwischen 3 und 75 Salicylamidyl-Gruppen und noch weiter bevorzugt zwischen 4 und 50 Salicylamidyl-Gruppen und noch mehr bevorzugt zwischen 5 und 25 Salicylamidyl-Gruppen. Der Komplex weist vorzugsweise auch eine Quantenausbeute von wenigstens 0,1 auf. Noch weiter bevorzugt ist das Lanthaniden-Ion des Komplexes ein Ion, das gewählt ist aus Europimum, Terbium und Kombinationen daraus.
  • Die wenigstens eine Salicylamidyl-Gruppe der chelatisierenden Gruppe kann substituiert sein mit einer oder mehreren Elektronen abziehenden und/oder Elektronen liefernden Gruppe(n). Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich verstehen, welche Substituenten Elektronen abziehende oder Elektronen liefernde Eigenschaften zeigen, wenn sie an einen aromatischen Ring gebunden werden. Tabellen von Substituenten, die zum Einschluss in die SLs gemäß der Erfindung geeignet sind, können in der Literatur gefunden werden. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften: „Hammett, J. Am. Chem. Soc., 59: 96 (1937), THE HAMMET EQUATION, Cambridge University Press, New York, 1973"; „Hansch et al., J. Med. Chem, 16: 1207 (1973)" und "Hansch et al., SUBSTITUENT CONSTANTS FOR CORRELATION ANALYSIS in CHEMISTRY AND BIOLOGY, Wiley, New York, (1979)".
  • Darüber hinaus können die Salicylamidyl-Gruppen des Komplexes mittels eines Grundgerüsts von im wesentlichen beliebiger Länge und chemischer Zusammensetzung verbunden sein, mit der Maßgabe, dass das Grundgerüst die Salicylamidyl-Ringe und andere Ringe in einer Weise orientieren sollte, die für ihre Komplexierung mit dem gewünschten Metall-Ion förderlich ist. Die Tatsache, dass das Grundgerüst bei den Bedingungen stabil ist, in denen der Komplex verwendet wird, ist ebenfalls allgemein bevorzugt. Als solches schließen beispielhafte Grundgerüste beispielsweise Alkyl-Gruppen, substituierte Alkyl-Gruppen, konjugierte ungesättigte Systeme, Aryl-Gruppen, Heteroaryl-Gruppen, Dendrimere, Polyether, Polyamide, Polyimine, Biopolymere und Grundgerüste ein, die eine Kombination aus mehr als einer dieser Gruppen sind. Andere nützliche Grundgerüst-Systeme sind Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich offensichtlich.
  • In einem zweiten Aspekt liefert die Erfindung eine Verbindung, die eine Struktur gemäß Formel I hat:
  • Figure 00210001
  • In Formel I sind R1 und R2 Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Halogen und -OR6, worin R6 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung. R4, R5, R7, R10 und R20 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituierten Alkyl-Gruppen. R3, R8 und R9 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl und substituierten Alkyl-Gruppen. R11, R12, R13, R21, R22 und R23 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR14R15, -NO2, -OR16, -COOR17, worin R14 R15 R16 und R17 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R12 gegebenenfalls einen Ring mit R11, R13 oder beiden bilden kann und R22 gegebenenfalls einen Ring mit R21, R23 oder beiden bilden kann. Diese Ringe sind Ringe, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die bestehen aus cyclischem Alkyl, substituiertem cyclischem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Heterocyclyl und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen. Q1 ist – OR18, und Q2 ist -OR19, worin R18 und R19 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe, und einer einzelnen negativen Ladung. Die Buchstaben a und z sind unabhängig voneinander gewählt aus der Gruppe, die besteht aus 0 und 1, mit der Maßgabe, dass dann, wenn a gleich 0 ist, N1' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 1' gebunden ist und das dann, wenn z gleich 0 ist, N2' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 2' gebunden ist.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung gemäß Formel I bereit, worin R8 für (CH2)P steht und P eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 einschließlich ist. R4 ist eine Alkyl-Gruppe, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel IV aufweist:
  • Figure 00220001
  • In Formel IV ist R29 eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Halogen und -OR7, worin R7 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen, Heteroaryl-Gruppen, heterocyclischen Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung. R46 ist eine Gruppe, die gewählt ist aus H, Alkyl und substituierem Alkyl. R31, R32 und R33 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR24R25, -NO2, -OR26, -COOR27, worin R24, R25, R26 und R27 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R32 gegebenenfalls einen Ring mit R31, R33 oder beiden bilden kann. Dabei sind die Ringe Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus cyclischem Alkyl, substituiertem cyclischem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Heterocyclyl und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen. R3 steht für (CH2)X, und X ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 einschließlich. Q ist -OR28, worin R28 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, die eine Struktur gemäß Formel V aufweist:
  • Figure 00230001
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung nach den Formeln I und IV in Kombination bereit, worin R4 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Gruppe substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel IV aufweist, und R5 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel VI aufweist:
  • Figure 00230002
  • In Formel VI ist R39 eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Halogen und -OR7, worin R7 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung. R45 ist eine Gruppe, die gewählt ist aus Alkyl und substituiertem Alkyl. R41, R42 und R43 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR34R35, -NO2, -OR36, -COOR37, worin R34, R35, R36 und R37 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R42 gegebenenfalls einen Ring mit R41, R43 oder beiden bilden kann. Die Ringe sind Ringe, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus cyclischem Alkyl, substituiertem cyclischem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Hereoaryl, substituiertem Heteroaryl, Heterocyclyl und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung mit einer Struktur gemäß Formel VII bereit:
  • Figure 00240001
  • In Formel VII sind M, N, P und Z Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich.
  • R-Gruppen
  • Zum Erreichen von Klarheit der Veranschaulichung wird die Diskussion der Identität der verschiedenen R-Gruppen (z.B. R1, R2, R3 usw.), wie sie in den obigen Formeln angegeben sind, in diesem Abschnitt gesammelt. Diese Diskussion ist in gleicher Weise auf jede der in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen angegebenen Formeln anwendbar. Darüber hinaus versteht es sich trotz der Tatsache, dass sich die Diskussion auf bestimmte repräsentative Formeln fokussiert, dass dies eine Ein richtung ist, die verwendet wird, um die Diskussion der R-Gruppen zu vereinfachen, und dass diese nicht dazu dient, den Umfang der R-Gruppen zu beschränken.
  • Während Bezug auf die Formeln I und II in Kombination und das resultierende Komplexierungsmittel mit drei Salicylamidyl-Ringen Bezug genommen wird, ist die folgende Diskussion allgemein für jede beliebige Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung relevant. Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich ist es offenbar, dass dann, wenn zusätzliche Salicylamidyl-Ringe, Verbindungs-Gruppen und Grundgerüste in eine Verbindung gemäß der Erfindung einbezogen werden, die folgende Diskussion in gleiche Weise für diese relevant ist.
  • Im gesamten Bereich der Verbindungen gemäß der Erfindung sind die Subtituenten an den Nicht-Amidyl-Carbonyl-Kohlenstoffatomen (z.B. R1, R2) vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, die besteht als Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Halogen und Alkoxy und Aryloxy-Einheiten der allgemeinen Struktur -OR7, worin R7 vorzugsweise eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroraryl, Heterocyclyl und einer einzelnen negativen Ladung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine oder mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, C1- bis C10-Alkyl und substituiertem C1- bis C10-Alkyl und ist noch mehr bevorzugt eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, C2- bis C6-Alkyl und substituiertem C2- bis C6-Alkyl.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine oder sind mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist/sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Aryl, substituiertem Aryl und Kombinationen daraus.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist eine oder sind mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist/sind aus der Gruppe, die besteht aus H und Alkyl, das mit polycyclischen Aryl-Gruppen substituiert ist, vorzugsweise mit Naphthyl-Gruppen.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine oder sind mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H und einem primären Alkylamin, vorzugsweise einer C1- bis C10-Alkyl-Kette, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt, noch mehr bevorzugt eine C2- bis C6-Alkyl-Kette, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine oder sind mehrere der oben genannten R-Gruppen ein Polyether, vorzugsweise eine Verbindung, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomere und Kombinationen daraus, die ein Molekulargewicht von 60 Dalton bis 10.000 Dalton aufweisen und noch mehr bevorzugt ein Molekulargewicht von 100 Dalton bis 1.000 Dalto aufweisen.
  • Repräsentative Substituenten auf Polyether-Basis schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die folgenden Strukturen:
    Figure 00260001
    worin j eine Zahl von 1 bis 100 einschließlich ist. Andere funktionelle Gruppen tragende Polyether sind Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt, und viele sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Shearwater Polymers, Inc. (Alabama).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst eine oder umfassen mehrere der oben genannten R-Gruppen eine reaktive Gruppe zum Konjugieren der Verbindung an eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Molekülen und Oberflächen. Repräsentative nützliche reaktive Gruppen werden nachfolgend weiter im Einzelnen in dem folgenden Abschnitt diskutiert. Weitere Informationen über nützliche reaktive Gruppen sind Fachleuten mit Sachverstand in diesem technischen Bereich bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschrift „Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, (1996)".
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine oder sind mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Gruppe, die gewählt ist aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus; noch mehr bevorzugt hat die R-Gruppe eine Struktur, gemäß Formel II:
  • Figure 00270001
  • In Formel II ist X eine Gruppe, die gewählt ist aus O, S und NR50. R50 ist vorzugsweise eine Gruppe, die gewählt ist aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl. Y ist vorzugsweise eine Gruppe, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und j und k sind vorzugsweise Zahlen, die unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat eine oder haben mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Struktur gemäß Formel III:
    Figure 00270002
    worin Y im wesentlichen die Bedeutung hat, wie sie oben für Formel II genannt wurde.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann einer oder können mehrere der R-Gruppen charakteristische Eigenschaften einer oder mehrerer der oben genannten Gruppen kombinieren. Beispielsweise kombiniert eine bevorzugte R-Gruppe sowohl die Attribute eines Polyethers als auch einer reaktiven Gruppe:
    Figure 00280001
    worin j eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 einschließlich ist. Andere derartige „chimäre" R-Gruppen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Einheiten wie beispielsweise Zucker (z.B. ein Polyol mit reaktiver Hydroxyl-Gruppe), Aminosäuren, Aminoalkohole, Carboxyalkohole, Aminothiole und dergleichen.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Verbindungen gemäß der Erfindung mehr als einen Typ von R-Gruppe in einem einzelnen Molekül. Beispielsweise kann ein einzelnes Molekül eine R-Gruppe, die ein Polyether ist, und eine R-Gruppe, die ein Amin ist, einschließen. Viele andere derartige Kombinationen von verschiedenen Substituenten sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offenbar. Repräsentative Strukturen gemäß dieser Ausführungsform werden nachfolgend aufgeführt:
    Figure 00280002
    Figure 00290001
    worin n eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 und vorzugsweise zwischen 1 und 3 ist und wenigstens ein Rest X' nicht Stickstoff oder substituierter Stickstoff ist. Bevorzugte Identitäten für X' schließen beispielsweise CH2, O und S ein.
  • Beispielhafte Lanthaniden-Chelate gemäß der Erfindung haben eine Struktur gemäß Struktur 1:
  • Bevorzugte Metall-Chelate haben die folgende Struktur:
    Figure 00290002
    worin n zwischen 1 und 5 liegt, R ein Amid ist und R', R", R''' und R'''' Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, OH, Alkyl und Halogen.
  • Beispielhafte Verbindungen gemäß der obigen Struktur sind in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1
    Figure 00300001
    • 3Li = 1,3-Diaminopropan;
    • 4Li = 1,4-Diaminopropan;
    • TREN = Tris(2-aminoethyl)amin;
    • Am32 = Poly(proylenimin)dendrimer, 4. Generation.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen gemäß der Erfindung mit einem weiteren Molekül durch eine schwache Wechselwirkung (z.B. van der Waals-Wechselwirkung) assoziiert und bilden so eine Spezies wie beispielsweise einen Einschluss-Komplex. Bevorzugte Moleküle, die mit den PLs in Wechselwirkung treten, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Dendrimere, Macrocyclen, Cyclodextrine und dergleichen.
  • Reaktive funktionelle Gruppen
  • Bestimmte Verbindungen gemäß der Erfindung tragen eine reaktive funktionelle Gruppe wie beispielsweise eine Komponente eines Bindungs-Arms, der an jeder beliebigen Position an irgendeinem Aryl-Kern oder an einer Kette angeordnet sein kann, wie beispielsweise eine Alkyl-Kette, die an den Aryl-Kern oder an das Grundgerüst des chelatisierenden Mittels gebunden ist. Diese Verbindungen werden nachfolgend bezeichnet als „reaktive Liganden". Wenn die reaktive Gruppe an eine Alkyl-Kette oder eine substituierten Alkyl-Kette gebunden ist, die ihrerseits an einen Aryl-Kern gebunden ist, ist die reaktive Gruppe vorzugsweise an einer terminalen Position einer Alkyl-Kette angeordnet. Reaktive Gruppen und Klassen von Reaktionen, die nützlich für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, sind allgemein diejenigen, die im technischen Bereich der Biokonjugat-Chemie wohlbekannt sind. Zur Zeit favorisierte Klassen von Reaktionen, die mit reaktiven Liganden gemäß der Erfindung erhältlich sind, sind diejenigen, die unter relativ milden Bedingungen ablaufen. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf nucleophile Substitutionen (z.B. Reaktionen von Aminen und Alkoholen mit Acylhalogeniden, aktiven Estern), elektrophile Substitutionen (z.B. Enamin-Reaktionen) und Additions-Reaktionen an Kohlenstoff-Kohlenstoff- und Kohlenstoff-Heteroatom-Mehrfachbindungen (z.B. Michael-Reaktion, Diels-Alder-Addition). Diese und andere nützliche Reaktionen werden beispielsweise diskutiert in dem Druckwerk „March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, 1985; in dem Druckwerk Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; und in dem Druckwerk Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS, Advances in Chemistry Series, Band 198, American Chemical Society, Washington, D.C., (1982)".
  • Nützliche reaktive funktionelle Gruppen schließen beispielsweise ein:
    • (a) Carboxyl-Gruppen und verschiedene Derivate davon, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf N-Hydroxysuccinimid-Ester, N-Hydroxybenztriazol-Ester, Säurehalogenide, Acylimidazole, Thioester, p-Nitrophenylester, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- und aromatische Ester;
    • (b) Hydroxyl-Gruppen, die in Ester, Ether, Aldehyde usw. umgewandelt werden können;
    • (c) Halogenalkyl-Gruppen, in denen das Halogenid später durch eine nucleophile Gruppe wie beispielsweise ein Amin, ein Carboxylat-Anion, ein Thiol-Anion, ein Carboxylgruppe-Anion oder ein Alkoxid-Ion ersetzt werden kann, was zur kovalenten Bindung einer neuen Gruppe an der Stelle des Halogen-Atoms führt;
    • (d) Dienophiele Gruppen, die in der Lage sind, an Diels-Alder-Reaktionen teilzunehmen, wie beispielsweise Maleimid-Gruppen;
    • (e) Aldehyd- oder Keton-Gruppe, so dass eine anschließende Derivatisierung möglich ist über die Bildung von Carbonyl-Derivaten wie beispielsweise von Iminen, Hydrazonen, Semicarbazonen oder Oximen oder über solche Mechanismen wie Grignard-Addition oder Alkyllithium-Addition;
    • (f) Sulfonylhalogenid-Gruppen für anschließende Reaktion mit Aminen, beispielsweise unter Bildung von Sulfonamiden;
    • (g) Thiol-Gruppen, die umgewandelt werden können in Disulfide oder umgesetzt werden können mit Acylhalogeniden;
    • (h) Amin- oder Sulfhydryl-Gruppen, die beispielsweise acyliert, alkyliert oder oxidiert werden können;
    • (i) Alkene, die beispielsweise Cycloadditionen, Acylierungs-Reaktionen, eine Michael-Addition usw. eingehen können;
    • (j) Epoxide, die beispielsweise mit Aminen und Hydroxyl-Verbindungen reagieren können; und
    • (k) Phosphoramidite und andere standardisierte funktionelle Gruppen, die in der Nucleinsäure-Synthese nützlich sind.
  • Die reaktiven funktionellen Gruppen können so gewählt werden, dass sie nicht an den Reaktionen teilnehmen oder diese nicht stören, die erforderlich sind, um den reaktiven Liganden aufzubauen. Alternativ kann eine reaktive funktionelle Gruppe davor, an der Reaktion teilzunehmen, durch die Gegenwart einer Schutzgruppe geschützt werden. Fachleute in diesem technischen Bereich verstehen, wie eine bestimmte funktionelle Gruppe so geschützt werden kann, dass sie einen gegebenen Satz von Reaktionsbedingungen nicht stört. Für Beispiele nützlicher Schutzgruppen wird beispielsweise verwiesen auf „Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, (1991)".
  • Donor- und Akzeptor-Einheiten
  • Einer der Vorteile der Verbindungen gemäß der Erfindung ist, dass sie mit einem großen Bereich von Energie-Donor- und -Akzeptor-Molekülen zur Konstruktion von Fluoreszenz-Energie-Übertragungs-Sonden verwendet werden können. Eine riesige Gruppe von Fluorophoren, die nützlich zur Verbindung mit den SLs sind, sind Fachleuten in diesem technischem Bereich bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Cardullo et al., Proc. Natl, Acad. Sci., USA, 85: 8790–8794 (1988)"; "Dexter, D. L., J. of Chemical Physics, 21: 836–850 (1953)"; "Hochstrasser et al., Biophysical Chemistry, 45: 133–141, (1992)"; "Selvin, P., Methods in Enzymology, 246: 300–334 (1995)"; "Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem, 40: 83–114 (1971);" „Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47: 819–846 (1978)"; „Wang et al., Tetrahedon Letters, 31: 6493–6496 (1990)"; „Wang et al., Anal. Chem., 67: 1197–1203 (1995)".
  • Eine nicht-beschränkende Liste von beispielhaften Donoren, die in Verbindung mit den Quenchern gemäß der Erfindung verwendet werden können, wird in Tabelle 2 angegeben.
  • Tabelle 2
  • Geeignete Einheiten, die als Donoren oder Akzeptoren in FET-Paaren gewählt werden können
    • 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure
    • Acridin und Derivate: Acridin Acridin Isothiocyanat
    • 5-(2'-Aminoethyl-)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS)
    • 4-Amino-N-[3-vinylsulfonylphenyl-]naphthalimid-3,5-disulfonat
    • N-(4-Anilino-1-naphthyl-)maleimid
    • Anthranilamid
    • BODIPY
    • Brilliant-Gelb
    • Coumarin und Derivate: Coumarin 7-Amino-4-methylcoumarin (AMC Coumarin 120) 7-Amino-4-trifluormethylcoumarin (Coumaran 151)
    • Cyanin-Farbstoffe
    • Cyanosin
    • 4',6-Diaminidino-2-phenylindol (DAPI)
    • 5',5"-Dibrompyrogallol-sulfonaphthalein (Brompyrogallol-Rot)
    • 7-Diethylamino-3-(4'-isothiocyanatophenyl-)4-methylcoumarin
    • Diethylentriaminpentaacetat
    • 4,4'-Diisothiocyanatodihydrostilben-2,2'-disulfonsäure
    • 4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure
    • 5-[Dimethylamino-]naphthalin-1-sulfonylchlorid (DNS, Dansylchlorid)
    • 4-(4'-Dimethylaminophenylazo-)benzoesäure (DABCYL)
    • 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-isothiocyanat (DABITC)
    • Eosin und Derivate: Eosin Eosinisothiocyanat
    • Erythrosin und Derivate: Erythrosin B Erythrosinisothiocyanat
    • Ethidium
    • Fluorescein und Derivate: 5-Carboxylfluorescin (FAM) 5-(4,6-Dichlortriazin-2-yl-)aminofluorescein (DTAF) 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE) Fluorescein Fluoresceinisothiocyanat QFITC (XRITC)
    • Fluorescamin
    • IR 144
    • IR1446
    • Malachit-Grün-isothiocyanat
    • 4-Methylumbelliferon
    • ortho-Cresolphthalein
    • Nitrotyrosin
    • Pararosanilin
    • Phenol-Rot
    • b-Phyctocoerythrin
    • o-Phthaldialdehyd
    • Pyren und Derivate: Pyren Pyrenbutyrat Succinimidyl-1-pyrenbutyrat
    • Quantum Dots
    • Reaktiv-Rot-4 (CibacronTM Brilliant-Rot 3B-A)
    • Rhodamin und Derivate: 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX) 6-Carboxyrhodamin (R6G) Lissamin-rhodamin-B-sulfonylchloridrhodamin (Rhod) Rhodamin B Rhodamin 123 Rhodamin-X-isothiocyanat Sulforhodamin B Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid-Derivat von Sulforhodamin 101 (Texas-Rot) N, N, N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) Tetramethylrhodamin Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)
    • Riboflavin
    • Rosolsäure
    • Lanthaniden-Chelat-Derivate
  • Es gibt eine große Zahl praktischer Anleitungen, die in der Literatur erhältlich ist, um passende Donor-Akzeptor-Paare für spezielle Sonden auszuwählen, wie sich beispielhaft anhand der folgenden Druckschriften ergibt: „Pesce et al., (Hrsg.), FLUORESCENCE SPECTOSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971)"; „White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970)"; und dergleichen. Die Literatur schließt auch Druckschriften ein, die erschöpfende Listen von fluoreszierenden und chromogenen Molekülen und ihre relevanten optischen Eigenschaften bereitstellen, um Reporter-Quencher-Paare auszuwählen (siehe beispielsweise: „Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2. Ausgabe (Academic Press, New York, 1971)"; "Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976)"; "Bishop, Hrsg., INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972)"; "Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992)"; "Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949)"; und dergleichen. Weiter gibt es extensive Anleitungen in der Literatur zum Derivatisieren von Reporter- und Quencher-Molekülen zur kovalenten Bindung über leicht erhältliche reaktive Gruppen, die an ein Molekül addiert werden können.
  • Die Vielfalt und Brauchbarkeit chemischer Wege, die dafür erhältlich sind, Fluorophore an andere Moleküle und Oberflächen zu konjugieren, wird beispielhaft angegeben durch den umfangreichen Bestand an Literatur zur Herstellung von mit Fluorophoren derivatisierter Nucleinsäuren. Es wird beispielsweise Bezug genommen auf „Haugland (a.a.O.)"; „Ullman et al., US-Patent Nr. 3,996,345"; „Khanna et al., US-Patent Nr. 4,351,760". Damit liegt es sehr wohl innerhalb der Fähigkeiten von mit diesem technischen Gebiet vertrauten Fachleuten, ein Energie-Austausch-Paar zur speziellen Anwendung auszuwählen und die Verbindungen dieses Paars an ein Sonden-Molekül zu kon jugieren, wie beispielsweise ein niedermolekulares bioaktives Material, eine Nucleinsäure, ein Peptid oder ein anderes Polymer.
  • In einem FET-Paar ist es allgemein bevorzugt, dass eine Absorptions-Bande des Akzeptors wesentlich mit einer Fluoreszenz-Emmissions-Bande des Donors überlappt. Wenn der Donor (das Fluorophor) eine Komponente einer Sonde ist, die Gebrauch von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung macht (FRET) werden die Donor-Fluoreszenz-Einheit und der Quencher (Akzeptor) gemäß der Erfindung vorzugsweise so gewählt, dass die Donor- und die Akzeptor-Einheit eine Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung zeigen, wenn die Donor-Einheit angeregt wird. Ein Faktor, der bei der Auswahl des Fluorophor-Quencher-Paars beachtet werden muss, ist die Effizienz der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung zwischen den beiden Gliedern des Paars. Vorzugsweise ist die Effizienz der FRET zwischen der Donor-Einheit und der Akzeptor-Einheit wenigstens 10 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 50 % und noch weiter bevorzugt wenigstens 80 %. Die Effizienz der FRET kann leicht empirisch getestet werden unter Anwendung der Verfahren, die sowohl in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind als auch aus dem Stand der Technik bekannt sind.
  • Die Effizienz der FRET zwischen dem Donor und dem Akzeptor des Paars kann auch eingestellt werden durch Ändern des Vermögens des Donors bzw. Akzeptors zur Dimerisierung oder nahen Assoziation. Wenn es bekannt ist oder bestimmt wird, dass die Donor-Einheit und die Akzeptor-Einheit eng miteinander assoziieren, kann eine Erhöhung oder Absenkung der Assoziation dadurch gefördert werden, dass man die Länge einer Verbindungs-Einheit oder Linker-Einheit oder der Sonde selbst zwischen den beiden Fluoreszenz-Proteinen entsprechend einstellt. Das Vermögen des Donor-Akzeptor-Paars zur Assoziation kann erhöht oder erniedrigt werden durch Einstellen der hydrophoben oder ionischen Wechselwirkungen oder der sterischen Abstossungen in dem Sonden-Konstrukt. So können die intramolekularen Wechselwirkungen, die für die Assoziation des Donor-Akzeptor-Paars verantwortlich sind, verstärkt oder abgeschwächt werden. So kann beispielsweise die Assoziation zwischen dem Donor-Akzeptor-Paar beispielsweise dadurch erhöht werden, dass man einen Donor, der eine insgesamt negative Ladung trägt, und einen Akzeptor mit einer insgesamt positiven Ladung verwendet.
  • Zusätzlich zu Fluorophoren, die direkt an eine Sonde gebunden sind, können die Fluorophore auch auf indirektem Wege gebunden werden. In dieser Ausführungsform wird vorzugsweise ein Liganden-Molekül (z.B. Biotin) kovalent an die Sonden-Spezies gebunden. Der Ligand wird dann an weitere Moleküle (z.B. ein Streptavidin-Molekül) gebunden, das entweder inhärent nachweisbar ist oder kovalent an ein Signal-System wie beispielsweise eine Fluoreszenz-Verbindung gemäß der Erfindung kovalent gebunden ist oder an ein Enzym gebunden ist, das eine Fluoreszenz-Verbindung durch Umwandlung einer nicht-fluoreszierenden Verbindung produziert. Nützliche Enzyme von Interesse als Markierungen schließen beispielsweise Hydrolasen, speziell Phopshatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreduktasen, insbesondere Peroxidasen ein. Fluoreszierende Verbindungen schließen ein: Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw., wie sie oben diskutiert wurden. Für eine Übersicht über verschiedene markierende oder ein Signal produzierende Systeme, die verwendet werden können, wird verwiesen auf das US-Patent Nr. 4,391,904.
  • Derzeit bevorzugte Fluorophore zur Verwendung im Zusammenhang mit den Komplexen gemäß der Erfindung schließen beispielsweise ein: Xanthen-Farbstoffe, einschließlich Fluoresceine, und Rhodamin-Farbstoffe. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen sind in weitem Umfang im Handel erhältlich, und zwar mit Substituenten an ihren Phenyl-Einheiten, die als Stelle zum Binden oder als Bindungs-funktionelle Gruppe zum Binden einer Nucleinsäure verwendet werden können. Eine andere Gruppe bevorzugter fluoreszierender Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Amino-Gruppe in der alpha- oder beta-Position aufweisen. Eingeschlossen bei solchen Naphthylamino-Verbindungen sind 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat. Andere Donoren schließen 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin, Acridine wie beispielsweise 9-Isothiocyanatoacridin und Acridin-Orange, N-(p-(2-Benzoxazolyl-)phenyl-)maleimid, Benzoxadiazole, Stilbene, Pyrene und dergleichen ein.
  • Aus Gründen der Klarheit der Veranschaulichung fokussiert sich die nachfolgende Diskussion auf das Binden der Komplexe gemäß der Erfindung und anderer Fluorophore an Nucleinsäuren. Das Fokussieren auf Nucleinsäure-Sonden soll nicht den Umfang der Sonden-Moleküle beschränken, an die die Komplexe gemäß der Erfindung gebunden werden können. Fachleute mit technischem Sachverstand in diesem Bereich erkennen, dass die Komplexe der Erfindung auch an kleine Moleküle (z.B. niedermolekulare bioaktive Mittel), Proteine, Peptide, synthetische Polymere, feste Träger und dergleichen unter Anwendung von Standard-Verfahren der synthetischen Chemie oder deren Modifikationen gebunden werden können.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform, bei der die Sonde eine Nucleinsäure-Sonde ist, ist das Akzeptor-Molekül ein Rhodamin-Farbstoff. Die Rhodamin-Einheit ist vorzugsweise entweder an das 3'-Ende oder das 5'-Ende der Nucleinsäure gebunden, obwohl auch innenliegende Stellen einer Derivatisierung von SLs zugänglich sind und Nutzen für ausgewählte Zwecke haben. An welches Ende das Rhodamin-Derivat auch gebunden ist, ist der Komplex gemäß der Erfindung allgemein an dessen Antipoden oder an eine Position im Inneren der Nucleinsäure-Kette gebunden. Der Rhodamin-Akzeptor wird vorzugsweise unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Amidits eingeführt. Verschiedene Donor-Gruppen gemäß der Erfindung werden auch vorzugsweise unter Verwendung eines reaktiven Derivats (z.B. eines Amidits) des Donors eingeführt. Alternativ dazu können die reaktive Gruppen (z.B. Isothiocyanate, aktive Ester usw.) umfassenden Donor-Gruppen über eine Reaktion mit einer reaktiven Einheit an einer Bindungsgruppe oder einem Verbindungsarm eingeführt werden, der an die Nucleinsäure gebunden ist (z.B. Hexylamin).
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Donor-Einheit am 3'-Terminus einer Nucleinsäure durch die Verwendung eines derivatisierten Synthese-Trägers gebunden werden. Beispielsweise wird ein Komplexierungsmittel gemäß der Erfindung an einen festen Träger gebunden, der mit einem Analog des Komplexes derivatisiert ist. Solche derivatisierten Träger sind in diesem technischen Bereich wohlbe kannt, und ein Beispiel dafür liefert ein TAMRA-Derivat (Tetramethylrhodamincarbonsäure-Derivat), das an einen Nucleinsäure-3'-Terminus unter Verwendung eines im Handel erhältlichen festen Trägers gebunden ist, der mit einem Analog des TAMRA-Fluorophors (Biosearch Technologies, Inc.) derivatisiert ist.
  • Im Hinblick auf die gut entwickelte Literatursammlung betreffend die Konjugation kleiner Moleküle an Nucleinsäuren, sind viele andere Verfahrensweisen der Bindung von Donor-/Akzeptor-Paaren an Nucleinsäuren Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich. Beispielsweise werden Rhodamin- und Fluoreszein-Farbstoffe passenderweise an das 5'-Hydroxyl-Ende einer Nucleinsäure beim Abschluss einer Festphasen-Synthese mittels Farbstoffen gebunden, die mit einer Phosphoramidit-Einheit derivatisiert sind (siehe dazu beispielsweise „Woo et al., US-Patent Nr. 5,231,191" und „Hobbs, Jr., US-Patent Nr. 4,997,928").
  • Noch spezieller gibt es viele Verbindungs-Einheiten und Verfahren zum Binden von Gruppen an das 5'- oder 3'-Ende von Nucleinsäuren, wie dies beispielhaft erläutert wird durch die folgenden Druckschriften: „Eckstein, Hrsg., Nucleic Acids and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991)"; „Zuckerman et al., Nucleic Acids Research, 15: 5305–5321 (1987) (3-thiol group on nucleic acid)"; „Sharma et al., Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3'-sulfhydryl)"; „Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2: 223–227 (1993)" und „Fung et al., US-Patent Nr. 4,757,141 (5'-phosphoamino group via Aminolink TM II, verfügbar durch P. E. Biosystems, CA.)"; „Stabinsky, US-Patent Nr. 4,739,044 (3-aminoalkylphosphoryl group)"; „Agrawal et al., Tetrathedron Letters, 31: 1543–1546 (1990) (attachment via phosphoramidate linkages)"; „Sproat et al., Nucleic Acids Reserach, 15: 4837 (1987) (5-mercapto group)", „Nelson et al., Nucleic Acids Research, 17: 7187–7194 (1989) (3'-amino group)" und dergleichen.
  • Mittel zum Nachweis von Fluoreszenz-Markierungen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. So können beispielsweise Fluoreszenz-Markierungen nachgewiesen werden durch Anregen des Fluorophors mit der passenden Licht- Wellenlänge und Nachweis der resultierenden Fluoreszenz. Die Fluoreszenz kann visuell, mittels eines photographischen Films, unter Verwendung elektronischer Detektoren wie beispielsweise ladungsgekoppelter Vorrichtungen (charge coupled devices; CCDs) oder Photovervielfachern und dergleichen nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen nachgewiesen werden durch Bereitstellen der passenden Substrate für das Enzym und Nachweisen des resultierenden Reaktionsprodukts.
  • Synthese
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung werden synthetisiert durch eine passende Kombination allgemein wohlbekannter synthetischer Verfahren. Techniken, die nützlich bei der Synthese der Verbindungen gemäß der Erfindung sind, sind Fachleuten in dem relevanten technischen Bereich sowohl in einfacher Weise offensichtlich als auch zugänglich. Die nachfolgende Diskussion wird angeboten, um bestimmte der diversen Methoden, die zur Anwendung beim Zusammenbau der Verbindungen gemäß der Erfindung verfügbar sind, zu illustrieren, und es ist nicht beabsichtigt, den Umfang der Reaktionen oder Reaktions-Sequenzen zu beschränken, die nützlich bei der Herstellung der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können hergestellt werden als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung von Stereoisomeren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen hergestellt als im wesentlichen ein einzelnes Isomer. Isomer-reine Verbindungen werden hergestellt unter Verwendung von synthetischen Zwischenstufen, die Isomer-rein sind, in Kombination mit Reaktionen, die entweder die Stereochemie an einem chiralen Zentrum unverändert lassen oder zu seiner vollständigen Umkehrung führen. Alternativ können das Endprodukt oder die Zwischenstufen entlang des Syntheseweges zu einem einzelnen Isomer geführt werden. Verfahrensweisen zum Umkehren oder Unverändert-Lassen eines speziellen sterischen Zentrums und Verfahrensweisen zum Auflösen von Mischungen von Stereoisomeren sind in diesem technischen Bereich wohlbekannt, und es liegt im Vermögen eines Fachmanns in diesem technischen Bereich, ein passendes Verfahren für eine spezielle Situation zu wählen. Allgemein wird verwiesen auf „Furniss et al. (Hrsg.), VOGEL'S ENCYCLOPE DIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5. Auflage, Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, Seiten 809–816" und "Heller, Acc. Chem. Res., 23: 128 (1990)".
  • Ein beispielhaftes Syntheseschema, das zu einem Komplexierungsmittel gemäß der Erfindung führt, ist in Schema 1 (1) angegeben. Methylsalicylat wird mit Tris-(2-aminoethyl-)amin gemischt und erhitzt und ergibt so Ligand 1.
  • Ein beispielhafter Syntheseweg zu einem vielseitigen aktivierten Salicylsäure-Startmaterial ist in Schema 2 angegeben (7). 3-Methylsalicylsäure wird in Verbindung 2 umgewandelt, in der die Carbonsäure in den entsprechenden Methylester umgewandelt wird und das Phenol-Hydroxid in den entsprechenden Methylether umgewandelt wird. Der Methylester wird unter basischen Bedingungen verseift und führt so zu Verbindung 3. Der Methyl-Substituent an dem Phenyl-Ring wird mit Permanganat zu der entsprechenden Carbonsäure 4 oxidiert. Verbindung 4 wird anschließend in den Bis-ethylester 5 umgewandelt, und eine der Ester-Gruppen wird unter Verwendung von einem Äquivalent Base verseift und führt so zur Herstellung von Verbindung 6. Die resultierende Carbonsäure wird in ein Säurechlorid 7 umgewandelt, das mit 2-Mercaptothiazolin unter Herstellung von Verbindung 8 umgesetzt wird.
  • Einige beispielhafte Liganden gemäß der Erfindung werden so hergestellt, wie dies in Schema 3 (8) ausgeführt ist. Die in Schema 3 gezeigten Verbindungen haben Grundgerüste unterschiedlicher Länge. So wird Verbindung 8 an ein Amin mit vier primären Amin-Einheiten und einem Grundgerüst einer ausgewählten Länge addiert und ergibt so die Verbindungen 9 (n = 1), 10 (n = 2) und 11 (n = 3). Die Verbindungen 9 bis 11 werden von ihren Schutzgruppen durch Behandlung mit BBr3 befreit und ergeben so die Liganden 12, 13 und 14.
  • Die oben angegebenen Synthese-Schemata sollen beispielhaft für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung sein. Fachleute in diesem technischen Bereich erkennen, dass viele andere Synthese-Strategien zur Herstellung der Liganden gemäß der Erfin dung erhältlich sind, ohne auf unnötig umfangreiches Experimentieren zurückgreifen zu müssen.
  • Die Substituenten an der Salicylamidyl-Gruppe und die Substituenten an dem Grundgerüst, die an die Salicylamidyl-Gruppen gebunden werden, können selbst chelatisierende Liganden umfassen, die von einer Salicylamidyl-Gruppe verschieden sind. Vorzugsweise umfassen diese Chelat-Bildner eine Mehrzahl anionischer Gruppen wie beispielsweise Carboxylat- oder Phosphonat-Gruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese chelatisierenden Mittel des Nicht-SL-Typs gewählt aus Verbindungen, die selbst in der Lage sind, als Lanthaniden-Chelatisierungsmittel zu funktionieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Chelat-Bildner Aminocarboxylate (d.h. EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA usw. und ihre Phosphonat-Analoga wie beispielsweise DTPP, EDTP, HDTP, NTP usw.).
  • Viele nützliche chelatisierende Gruppen, Kronenether, Cryptanden und dergleichen sind in diesem technischen Gebiet bekannt und können in die Verbindungen gemäß der Erfindung inkorporiert werden. Bezug genommen wird beispielsweise auf "Pitt et al., The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload", in "INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, Seiten 279–312"; „Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES, Cambridge University Press, Cambridge, 1989"; „Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, New York, 1989", und die darin in Bezug genommen Druckschriften.
  • Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Wegen, die das Anbinden chelatisierender Mittel, Kronenether und Cyclodextrine an andere Moleküle erlauben, Fachleuten in diesem technischen Bereich zugänglich. Siehe beispielsweise „Meares et al., Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides". In „MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS; Feeney et al., (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, Seiten 370–387"; „Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9: 108–117 (1998)"; „Song et al., Bioconjugate Chem., 8: 249–255 (1997)".
  • In anderen Ausführungsformen sind Substituenten an der Salicylamidyl-Gruppe oder an dem Grundgerüst Fluoreszenz-Sensibilisatoren. Beispielhafte Sensibilisatoren schließen ein: Rhodamin 560-, 575- und 590-Fluoresceine, 2- oder 4-Chinolone, 2- oder 4-Cumarine oder Derivate davon, beispielsweise Cumarin 445, 450, 490, 500, 503, 4-Trifluormethylcumarin (TFC), 7-Diethylaminocumarin-3-carbohydrazit usw. und speziell Carbostyril 124 (7-Amino-4-methyl-2-chinolon), Cumarin 120 (7-Amino-4-methyl-2-cumarin), Cumarin 124 (7-Amino-4-(trifluormethyl-)2-cumarin), Aminomethyltrimethylpsoralen, Naphthalin und dergleichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Sensibilisator eine Einheit, die eine Naphthyl-Einheit umfasst.
  • Nachdem das SL-Molekül gebildet und gereinigt wurde, wird der fluoreszierende Lanthaniden-Komplex synthetisiert, und zwar nach irgendeinem aus einer großen Zahl von im Stand der Technik bekannten Verfahrensweisen, einschließlich beispielsweise durch Inkubieren eines Salzes des Chelats mit einem Lanthaniden-Salz wie beispielsweise dem Lanthaniden-Trihalogenid, -Triacetat und dergleichen.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung und ihre unkonjugierte Form sind nützlich als Sonden, Indikatoren, Trennungsmedien und dergleichen. Darüber hinaus können die Verbindungen gemäß der Erfindung an eine große Vielzahl von Verbindungen zur Schaffung spezieller Markierungen, Sonden, diagnostischer und/oder therapeutischer Reagenzien usw. konjugiert werden. Beispiele von Spezies, an die die Verbindungen gemäß der Erfindung konjugiert werden können, schließen beispielsweise Biomoleküle wie Proteine (z.B. Antikörper, Enzyme, Rezeptoren usw.), Nucleinsäuren (z.B. RNS, DNS usw.), bioaktive Moleküle (z.B. Arzneimittel, Toxine usw.), feste Substrate wie beispielsweise Glas oder Polymer-Kugeln, -Platten, – Fasern, -Membranen (z.B. Nylon, Nitrocellulose), Träger (z.B. Glas, Quarz) und Sonden usw. ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Spezies, an die die Verbindung konjugiert wird, ein Biomolekül. Bevorzugte Biomoleküle sind solche, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Antikörpern, Nucleinsäuren, Enzymen, Haptenen, Kohlenhydraten und Antigenen.
  • Assays und SL-tragende Sonden
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine SL bereit, die an ein anderes Molekül wie beispielsweise ein Sonden-Molekül gebunden ist, und Assays, die von diesen Sonden Gebrauch machen.
  • Assays
  • Die folgende Diskussion ist allgemein relevant für die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Assays. Diese Diskussion soll die Erfindung durch Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen veranschaulichen und sollte nicht als den Umfang der Sonden und Assay-Typen limitierend interpretiert werden, bei denen die Verbindungen gemäß der Erfindung Anwendung finden. Andere Assay-Formate, die von den Verbindungen gemäß der Erfindung Gebrauch machen, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Assays, die auf spezifischen Bindungsreaktionen beruhen, werden zum Nachweis einer großen Vielzahl von Substanzen verwendet, wie beispielsweise von Arzneimitteln, Hormonen, Enzymen, Proteinen, Antikörpern und infektiösen Mitteln in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten und Gewebe-Proben. Im Allgemeinen bestehen die Assays aus einem zu bestimmenden Stoff, einer Erkennungs-Einheit für den zu bestimmenden Stoff und einer nachweisbaren Markierung. Kompetitive Assay-Ausführungsformen machen allgemein Gebrauch von einem Bindungs-Partner, zusätzlich zu diesen Komponenten. In einer beispielhaften Ausführungsform ist der Bindungs-Partner ein Molekül, das mit einer Erkennungs-Einheit unter Bildung eines Komplexes in Wechselwirkung tritt, der inhärent weniger stabil ist als ein ähnlicher Komplex, der zwischen der Erkennungs-Einheit und der zu analysierenden Substanz gebildet wird, und wird anschließend durch die dazukommende, zu analysierende Substanz verdrängt.
  • Da die Ergebnisse spezieller Bindungs-Wechselwirkungen häufig nicht direkt beobachtbar sind, wurde eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungen zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Wechselwirkung entwickelt. Die Fluorophore gemäß der Erfindung werden nachgewiesen durch Verwendung von Fluoreszenz-Spektroskopie oder mit dem bloßen Auge. Eine Einführung in Markierungen, Markierungs-Verfahren und Nachweis von Markierungen wie beispielsweise solche, die nützlich bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, findet sich in „Polak et al., INTRODUCTION TO MONOCYTOCHEMISTRY, 2. Auflage, Springer Verlag, New York, (1977)" und in „Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, ein kombiniertes Handbuch und Katalog, veröffentlicht von der Firma Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996)".
  • In bestimmten Ausführungsformen ist der Assay ein kompetitiver Assay. In der Praxis können die Komponenten des Assays (d.h. die Erkennungs-Einheit, der Bindungs-Partner und die zu analysierende Substanz) im wesentlichen jede beliebige chemische Struktur aufweisen. Jedoch sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Erkennungs-Einheit, der Bindungs-Partner und die zu analysierende Substanz Verbindungen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus niedermolekularen bioaktiven Mitteln, Biomolekülen und Kombinationen daraus. Wenn eine Komponente des Assays ein Biomolekül ist, ist das Biomolekül vorzugsweise eine Verbindung, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Haptenen, Antikörpern, Antigenen, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, Peptiden, Enzymen und Rezeptoren.
  • In einem kompetitiven Assay-Format wird eine oder werden mehr als eine der Komponenten mit einer Verbindung gemäß der Erfindung markiert. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform der Bindungs-Partner mit einer Verbindung gemäß der Erfindung markiert, und seine Verdrängung von einer immobilisierten Erkennungs-Einheit wird mittels des Erscheinens von Fluoreszenz in einer flüssigen Phase des Assay nach gewiesen. In einem anderen kompetitiven Assay-Format wird ein immobilisiertes Enzym mit einem Substrat komplexiert, das an eine Verbindung gemäß der Erfindung konjugiert ist. Der Komplex wird dann mit einem mutmaßlichen Antagonisten in Kontakt gebracht. Die Verdrängung von Fluoreszenz von dem immobilisierten Enzym in eine flüssige Phase des Assay ist ein Indikator einer Verdrängung des Substrats durch den mutmaßlichen Antagonisten. Diese Ausführungsformen werden nur beispielhaft angegeben, und es ist für einen Fachmann in diesem technischen Bereich einfach, dass viele andere kompetitive Assay-Formate von den Verbindungen gemäß der Erfindung Gebrauch machen und aus diesen Vorteile ziehen können.
  • Zusätzlich dazu, ein Bindungs-Ereignis sicherzustellen, ist es häufig erwünscht, die Größe der Affinität zwischen zwei oder mehreren Bindungs-Partnern quantitativ zu erfassen. So ist es auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, die im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche offenbarten Verbindungen als Träger für solche Assays zu verwenden.
  • Am meisten typisch wird die Menge einer zu analysierenden Substanz, die zugegen ist, dadurch gemessen, dass man quantitativ die Menge an Markierung erfaßt, die an einen Bindungs-Partner, an eine zu analysierende Substanz oder an eine Erkennungs-Einheit fixiert ist, und zwar im Anschluß an ein Bindungsereignis. Mittel zum Nachweis und zur quantitativen Erfassung von fluoreszierenden Markierungen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Affinität zwischen zwei oder mehr Assay-Komponenten dadurch gemessen, dass man eine Population quantitativ erfaßt, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus dem Komplex aus zu analysierender Substanz und Erkennungs-Einheit, einer freien, zu analysierenden Substanz, einem freien Bindungs-Partner, einem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit und Kombinationen daraus.
  • Das Format eines Assays zum Extrahieren von Affinitätsdaten für zwei Moleküle kann verstanden werden unter Bezugnahme auf eine Ausführungsform, in der ein Ligand, von dem es bekannt ist, dass er sich an einen Rezeptor bindet, durch einen Antagonisten zu dem Rezeptor verdrängt wird. Andere Variationen dieses Formats sind für Fachleute in diesem technischen Bereich offensichtlich. Das kompetitive Format ist Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Bezug genommen wird beispielsweise auf die US-Patentschriften Nrn. 3,654,090 und 3,850,752.
  • Das Binden eines Antagonisten an einen Rezeptor kann getestet werden durch ein kompetitives Bindungs-Verfahren unter Verwendung eines Liganden für den Rezeptor und den Antagonisten. Der Bindungs-Assay kann beispielsweise durchgeführt werden in einer 96 Vertiefungen aufweisenden Filtrationsplatten-Anordnung (Firma Millipore Corporation, Bedford, MA). Einer der drei Bindungs-Partner (d.h. der Ligand, ein Antagonist oder ein Rezeptor) wird allgemein an die Vertiefung oder ein in der Vertiefung enthaltendes teilchenartiges Material gebunden.
  • Kompetitons-Bindungsdaten können analysiert werden nach einer Anzahl von Verfahrensweisen einschließlich der Verfahrensweise des Einpassens an eine nicht-lineare Kurve der kleinsten Fehlerquadrate. Wenn der Ligand ein Antagonist für den Rezeptor ist, liefert dieses Verfahren den IC50-Wert des Antagonisten (Konzentration des Anatgonisten, die ein spezifisches Binden des Liganden zu 50 % im Gleichgewicht inhibiert). Der IC50-Wert wird in Beziehung zu der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante (Ki) des Antagonisten auf der Basis der Gleichung von Cheng und Prusoff gesetzt: Ki = IC50/(1 + L/Kd), worin L die Konzentration des Liganden, der in dem kompetitiven Bindungs-Assay verwendet wird, ist und Kd die Dissoziationskonstante des Liganden ist, bestimmt durch Scatchard-Analyse. Diese Assays sind beschrieben – neben anderen Stellen – in der Druckschrift „Maddox et al., J. Exp. Med., 158: 1211 (1983)"; „Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS, A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minnesota (1990)".
  • Die Assays gemäß der Erfindung können praktisch durchgeführt werden, wenn einige oder alle Komponenten in Lösung vorliegen. Alternativ dazu kann/können eine oder mehrere Komponente(n) im wesentlichen unlöslich in dem Assay-Medium sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine Verbindung oder mehrere Verbindungen, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus der Erkennungs-Einheit, dem Bindungs-Partner und der zu analysierenden Substanz, an eine Oberfläche gebunden. Nützliche Oberflächen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Glas oder Polymer-Kugeln, -Platten, -Fasern, -Membranen (z.B. aus Nylon, Nitrocellulose), Träger (z.B. aus Glas, Quarz) und dergleichen.
  • Der Assay kann auf einer großen Zahl von Wegen durchgeführt werden. Es liegt im Bereich des Vermögens eines in diesem technischen Bereich erfahrenen Fachmanns, beispielsweise zu wählen, wann der Fluoreszenz-Komplex durch Chelatisieren des Lanthanids gebildet werden soll, an welche Assay-Komponente das Chelat gebunden sein sollte, und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Fluoreszenz-Komplex vor dem Verdrängen des Bindungs-Partners aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit gebildet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Fluoreszenz-Komplex gebildet, nachdem der Bindungs-Partner aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit verdrängt wurde.
  • Im Anschluss an die Verdrängung des Bindungs-Partners aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit können die verbleibenden Schritte des Assays an der Mischung durchgeführt werden, die gebildet wurde durch die Verdrängung, oder es kann eine oder können mehrere der Komponenten der Mischung entfernt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter das Abtrennen des freien Bindungs-Partners aus einer Verbindung aus der Gruppe, die besteht aus dem Paar aus Erkennungs-Einheit und Bindungs-Partner, ein Paar aus zu analysierender Substanz und Erkennungs-Einheit und Kombinationen daraus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Assays gemäß der Erfindung immunologische Assays. Immunologische Assays schließen Reaktionen zwischen Immunoglo bulinen (Antikörpern) ein, die in der Lage sind, Bindungen mit spezifischen antigenen Determinanten verschiedener Verbindungen und Materialien (Antigenen) einzugehen. Andere Typen von Reaktionen schließen eine Bindung zwischen Avidin und Biotin, Protein A und Immunoglobulinen, Lectinen und Zucker-Einheiten und dergleichen ein. Verwiesen wird beispielsweise auf das US-Patent Nr. 4,313,734 (Leuvering), das US-Patent Nr. 4,435,504 (Zuk), die US-Patente Nr. 4,452,901 und 4,969,691 (Gordon) und das US-Patent Nr. 3,893,808 (Campbell).
  • Diese Assay-Verfahren liefern die Fähigkeit, sowohl das Vorhandensein als auch die Menge kleiner Mengen von zu analysierenden Substanzen nachzuweisen und sind beispielsweise nützlich bei der medizinischen Diagnose und forensischen Anwendungen. Bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die zu analysierende Substanz oder ihre Bindung an die Erkennungs-Einheit allgemein nachgewiesen durch die Verwendung einer Fluoreszenz-Markierung gemäß der Erfindung.
  • Immunologische Assays gehören drei allgemeinen Typen an. In einem beispielhaften kompetitiven Bindungs-Assay konkurrieren markierte Reagenzien und unmarkierte zu analysierende Verbindungen um Bindungsstellen an einem Bindungs-Material. Nach einer Inkubationsperiode werden nicht-gebundene Materialien herausgewaschen, und die Menge an markiertem Reagens, das an die Bindungsstelle gebunden ist, wird mit Referenz-Mengen zur Bestimmung der Konzentration an zu analysierender Substanz in der Probe-Lösung verglichen.
  • Ein zweiter Typ von immunologischem Assay ist bekannt als „Sandwich-Assay" und schließt allgemein ein In-Kontakt-Bringen einer eine zu analysierende Substanz umfassenden Probe-Lösung mit einer Oberfläche ein, die ein erstes Bindungs-Material umfasst, das immunologisch spezifisch für die zu analysierende Substanz ist. Eine zweite Lösung, die ein Bindungs-Material umfasst, das eine Verbindung gemäß der Erfindung desselben Typs (Antigen oder Antikörper) wie das erste Bindungs-Material umfasst, wird dann dem Assay zugesetzt. Das markierte Bindungs-Material bindet sich an eine beliebige zu analysierende Substanz, die an das erste Bindungs-Material gebunden ist.
  • Das Assay-System wird dann einem Wasch-Schritt unterzogen und so markiertes Bindungs-Material entfernt, das sich nicht mit der zu analysierenden Substanz verbunden hat, und die zurückbleibende Menge an marktiertem Material ist gewöhnlich proportional zur Menge an gebundener zu analysierender Substanz.
  • Ein dritter Typ von immunologischem Assay-Verfahren schließt Agglutinations-Reaktions-Verfahren ein, und ein Beispiel hierfür sind die wohlbekannten Assays für Blut-Antigene und Serum-Typen. Eine immunologische Kreuz-Reaktivität zwischen Antikörpern im Serum und Antigenen, die auf Oberflächen von roten Blutzellen präsentiert werden, wird angezeigt durch die Bildung eines dreidimensionalen vernetzten Netzwerks aus roten Blutzellen und Antikörpern. Die Agglutination der Mischung aus Serum und roten Blutzellen führt zur Bildung eines Pellets, das sichtbar sein kann für das bloße Auge, und zwar über die Fluoreszenz einer Verbindung gemäß der Erfindung, die an eine oder mehrere Komponenten des Assays gebunden ist.
  • Die oben aufgezählten Assay-Verfahren wurden ursprünglich durchgeführt nach Verfahren der Flüssigphasen-Immunchemie, worin Reaktionen zwischen Enzymen und radiomarkierten Substanzen in flüssiger Lösung in einer Vorrichtung wie beispielsweise in Mikrotiter-Platten durchgeführt wurden. Neuerdings wurden Techniken und Verfahrensweisen zur Durchführung von „Festphasen"-Assays angepasst, worin die Reaktionen zwischen Enzymen und immunologischen Komponenten in Lösung an immobilisierenden Substraten durchgeführt wurden.
  • Diese Typen von Assays, die allgemein als „immunochromatographische Immuno-Assays" bezeichnet werden, können in einer beliebigen Zahl von Formaten entwickelt werden, wobei die Prinzipien der Assays des kompetitiven Typs, des Sandwich-Typs oder des Agglutinations-Typs eingesetzt werden. Sie können auch entweder ein Strömen über das immobilisierende Substrat oder ein Strömen entlang des immobilisierten Substrats einschließen. Im allgemeinen zeigen diese Sandwich-Assays den größten Nutzen beim Nachweis zu analysierender Substanzen aus großen Proteinen oder Antikör pern. Die Assays des Überström-Typs wurden höchst extensiv in Assays des Sandwich-Typs verwendet.
  • Ein beispielhaftes immunochromatographisches Sandwich-Immuno-Assay-Verfahren unter Verwendung der Fluoreszenz-Mittel gemäß der Erfindung macht Gebrauch von einer porösen Oberfläche und einem Mittel gemäß der Erfindung als visuelle Markierung, die an eine Verbindung eines Bindungs-Paars gebunden ist (z.B. Antigen oder Antikörper). Die poröse Oberfläche ist allgemein eine flache Platte und besteht üblicherweise aus Nylon, Nitrocellulose, Glasfasern oder dergleichen. In einem typischerweise immunochromatographischen Format wird ein Bereich oder eine kleine Fläche der porösen Oberfläche eine die feste Phase haltende Oberfläche durch Immobilisieren einer Verbindung eines Bindungs-Paars direkt auf die Oberfläche einer porösen Membran oder durch indirektes Binden der Verbindung an Einfang-Teilchen (d.h. aus Latex oder Glas), die an der Oberfläche einer porösen Membran immobilisiert sind. Eine direkte Immobilisierung des Bindungs-Paars an einer porösen Membran oder an Einfangteilchen erfolgt über elektrostatische Wechselwirkung (d.h. Unterschiede in der Ionen-Ladung), hydrophobe Wechselwirkung oder kovalentes Binden. In den Fällen, in denen Einfang-Teilchen verwendet werden, kann die Immobilisierung von Einfang-Teilchen an porösen Membranen auch über dieselben Phänomene oder über Größenausschluß erfolgen, der ein Wandern der Teilchen durch die Poren oder Fasern der Membran verhindert. Viele andere Typen von Assays können unter Verwendung der Verbindungen gemäß der Erfindung durchgeführt werden.
  • In einem typischen nicht-kompetitiven immunochromatographischen Assay muss eine Test-Probe eines biologischen Fluids wie beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Speichel, Urin usw. in einem ausreichenden Volumen vorliegen und eine ausreichende Konzentration an zu analysierender Substanz aufweisen, um das Vorliegen einer ausreichenden Wechselwirkung zwischen der zu analysierenden Substanz von Interesse, den markierten Teilchen und der einfangenden festen Phase zu ermöglichen. Um die Reaktions-Kinetiken zu beschleunigen, wird die Konzentration an Teilchen-markierter Verbindung eines Bindungs-Paars und die Konzentration an Bindungs-Paar an der Oberfläche der porösen Membran oder der einfangenden Teilchen optimiert und so soviel spezifische Bindung wie möglich produziert und gleichzeitig irgendwelche nicht-spezifische Bindung minimiert. Die Konzentration an Teilchen-markierter Verbindung muss derart sein, dass sie keine Prozon-Phänomene im Bereich der Konzentrationen an zu analysierender Substanz produziert, die von Interesse sind. Eine derartige Konzentrations-Optimierung liegt im Bereich des Vermögens eines in diesem technischen Bereich erfahrenen Fachmanns.
  • Immunochromatographische Assays können in Form von Streifen oder Schichten aus den mehrschichtigen Materialien gemäß der Erfindung vorliegen, die Gebrauch von einem hydrophoben Träger machen (z.B. Mylar, Polystyrol, Polypropylen, Glas usw.), worin eine oder mehrere Verbindungen) gemäß der Erfindung oder mit einer Verbindung gemäß der Erfindung funktionalisierte Einheiten entweder direkt oder indirekt mit einem Bindemittel wie beispielsweise einem Leim an dem Träger fixiert ist/sind. Wenn es erwünscht ist, können hydrophobe Träger und Gehäuse verwendet werden, um eine Verdampfung der Fluid-Phase zu reduzieren, während die Immuno-Reagenzien miteinander in Kontakt gebracht werden.
  • In einem beispielhaften nicht-kompetitiven Assay in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung wird eine zu analysierende Substanz solubilisiert, abgeschieden und auf dem teilchenförmigen Material gebunden. Das teilchenförmige Material wird dann hydratisiert und anschließend mit primären Antikörpern und Enzym-konjugierten sekundären Antikörpern in Kontakt gebracht, die für die primären Antikörper spezifisch sind, wobei zwischendurch Wasch-Schritte stattfinden, wo dies geeignet ist. Enzym-Konzentrationen werden dann beispielsweise durch Substrat-Umwandlungs-Protokolle bestimmt, wie sie in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind, und die Menge an primären Antikörpern kann so unter Bezugnahme auf einen Standard gemessen werden, der parallel mitläuft.
  • Darüber hinaus kann eine Bindungs-Domain eines Rezeptors beispielsweise als Fokussierungs-Punkt für ein Arzneimittel-Entdeckungs-Assay dienen, bei dem beispielsweise der Rezeptor immobilisiert wird und sowohl mit Mitteln (d.h. Liganden), die bekannt dafür sind, mit der Bindungs-Domain in Wechselwirkung zu treten, und einer Menge eines speziellen Arzneimittels oder inhibitorischen Mittels, das getestet werden soll, inkubiert wird. Eine der Inkubations-Komponenten ist mit einer Verbindung gemäß der Erfindung markiert. Das Ausmaß, in dem sich das Arzneimittel an den Rezeptor bindet und damit die Bildung eines Komplexes aus Rezeptor und Ligand inhibiert, kann dann gemessen werden. Solche Möglichkeiten für Arzneimittel-Entdeckungs-Assays kommen erfindungsgemäß in Betracht und werden als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend angesehen. Andere Fokussierungspunkte und passende Assay-Formate sind für Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Die Verbindungen und Verfahrensweisen gemäß der Erfindung können auch zum Sequenzieren von Nucleinsäuren und Peptiden verwendet werden. Fluoreszenz-markierte Oligo-Nukleotid-Primer werden anstelle von radiomarkierten Primern für einen empfindlichen Nachweis von DNS-Fragmenten verwendet (US-Patent Nr. 4,855,225; Smith et al.). Darüber hinaus können DNS-Sequenzierungsprodukte mit fluoreszierenden Deoxy-Nucleotiden (US-Patent Nr. 5,047,519; Prober et al.) oder durch direktes Einarbeiten eines Fluoreszenz-markierten Deoxy-Nucleotids (Voss et al.; Nucl. Acids Res., 17: 2517 (1989)) markiert werden. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind nützlich in diesen beiden Formaten. Gemäß derzeitiger Praxis umgehen Fluoreszenz-Sequenzierungs-Reaktionen viele der mit der Verwendung von Radionucliden verbundenen Probleme.
  • Wie oben diskutiert, kann der fluoreszierende Komplex in im wesentlichen jedem Schritt des Assays gebildet werden. Dies trifft in gleicher Weise in denjenigen Ausführungsformen zu, in denen eine oder mehrere Komponente(n) der Assay-Mischung im Anschluß an die Verdrängung des Bindungs-Partners entfernt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Fluoreszenz-Komplex im Anschluß an die Abtrennung gebildet.
  • Verbindungen gemäß der Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge eines Enzyms in einer Mischung anzuzeigen. Beispielsweise ist in bestimmten Ausführungsformen Q1 eine enzymatisch labile Gruppe, und die Präsenz der labilen Gruppe an dem phenolischen Sauerstoff der Salicylamidyl-Gruppe verhindert die Bildung eines stabilen Komplexes eines Lanthaniden-Ions. Diese Situation wird umgekehrt, und ein stabiler Lanthaniden-Komplex wird gebildet, wenn das Salicylamidyl-Chelat in Kontakt mit einem Enzym gebracht wird, das in der Lage ist, die labile Gruppe abzuspalten und damit das phenolische Sauerstoff-Anion zu befreien. In ähnlicher Weise zu den Ausführungsformen, die oben diskutiert wurden, kann die Assay-Mischung mit dem Enzym zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Assay-Verfahrens in Kontakt gebracht werden. Darüber hinaus kann/können dann, wenn eine Komponente von der Reaktionsmischung abgetrennt wird (z.B. der befreite Bindungs-Partner), die separierte Komponente und/oder die zurückbleibende Komponente mit dem Enzym in Kontakt gebracht werden.
  • In einer bevorzugt Ausführungsform, in der Q1 eine enzymatisch labile Gruppe ist, schließt das Verfahren weiter das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung mit einem Enzym ein, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit, dem freien Bindungs-Partner und Kombinationen daraus, so dass dadurch die enzymatisch labile Gruppe entfernt wird.
  • Eine Anordnung von enzymatisch entfernbaren Gruppen ist in diesem technischen Bereich bekannt, und es liegt im Bereich des Vermögens eines in diesem technischen Bereich erfahrenen Fachmanns, eine passende enzymatisch labile Gruppe für eine spezielle Anwendung auszuwählen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die enzymatisch labile Gruppe eine Komponente einer Verbindung, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Phosphat-Gruppen, Sulfat-Gruppen, Acyl-Gruppen und Glycosid-Gruppen. Enzyme, die in der Lage sind, diese Gruppen zu entfernen, schließen beispielsweise Esterasen, Phosphatasen, Glycosidasen und dergleichen ein.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Entfernung der enzymatisch labilen Gruppe und die anschließende Bildung eines fluoreszierenden Komplexes dazu verwendet, die Gegenwart eines Enzyms nachzuweisen, das in der Lage ist, die enzymatisch labile Gruppe zu entfernen. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschrift „Drevin et al., US-Patent Nr. 5,252,462, erteilt am 12. Oktober 1993".
  • Obwohl die Verbindungen gemäß der Erfindung an jede beliebige Komponente des Assays gebunden werden können, werden sie am allgemeinsten an den Bindungs-Partner gebunden. In dieser Ausführungsform können die Verbindungen gemäß der Erfindung an den Bindungs-Partner über eine reaktive Gruppe an einer Salicylamidyl-Einheit, am Grundgerüst oder am Amid-Substituenten gebunden werden. Alternativ dazu können sie an den Bindungs-Partner über eine reaktive Gruppe an dem aromatischen Kern einer oder mehrerer Salicylamidyl-Einheiten der Verbindungen gebunden werden. Wie oben diskutiert, sind viele geeignete reaktive Gruppen Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt, und ein Fachmann mit Sachverstand in diesem Bereich ist in der Lage, ein Salicylamidyl-Chelat zu wählen und herzustellen, das passend mit einer funktionellen Gruppe für eine bestimmte Anwendung versehen ist.
  • Es ist allgemein bevorzugt, dass die Bindung zwischen den Salicylamidyl-Chelaten und dem Bindungs-Partner unter den Bedingungen des Assay stabil ist. Viele stabile Bindungen können zwischen dem Bindungs-Partner und dem Salicylamidyl-Chelat gebildet werden, einschließlich beispielsweise Amiden, Aminen, Ethern, Harnstoffen und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung zwischen dem Bindungs-Partner und einer Verbindung gemäß der Erfindung eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Amid-Bindungen, Thioamid-Bindungen, Thioharnstoff-Bindungen und Carbamat-Bindungen. Geeignete reaktive Gruppen und Verbindungen wurden oben im einzelnen diskutiert.
  • Im allgemeinen ist es zum Bestimmen der Konzentration eines Ziel-Moleküls wie beispielsweise einer Nucleinsäure bevorzugt, zuerst Referenz-Daten zu erhalten, bei denen konstante Mengen einer Sonde und eines Nucleinsäure-Liganden mit variierenden Mengen eines Ziel-Moleküls in Kontakt gebracht werden. Die Fluoreszenz-Emission jeder der Referenz-Mischungen wird dazu verwendet, eine Graphik oder eine Tabelle abzuleiten, in der eine Ziel-Konzentration mit einer Fluoreszenz-Emission verglichen wird. Beispielsweise könnte eine Sonde, die (a) mit einem Zielmolekül-freien Nucleinsäure-Liganden hybridisiert und (b) eine Stamm-Schleife-Architektur aufweist, wobei das 5'-Ende und 3'-Ende die Stellen der Fluoreszenz-Gruppe- und SL-Markierungen sind, zum Erhalt solcher Referenz-Daten verwendet werden. Eine derartige Sonde liefert ein charakteristisches Emissions-Profil, in dem die Fluoreszenz-Emission zurückgeht, wenn die Ziel-Molekül-Konzentration ansteigt, und zwar in Gegenwart einer konstanten Menge an Sonde und Nucleinsäure-Ligand. Anschließend wird eine Test-Mischung mit einer unbekannten Menge an Ziel-Molekül mit derselben Menge an erstem Nucleinsäure-Liganden und zweiter Sonde in Kontakt gebracht, und die Fluoreszenz-Emission wird bestimmt. Der Wert der Fluoreszenz-Emission wird dann mit den Bezugsdaten verglichen und so die Konzentration des Ziel-Moleküls in der Test-Mischung erhalten.
  • Vielfach-Analysen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Quencher gemäß der Erfindung als Komponente einer oder mehrerer Sonden verwendet, die in einem Assay verwendet werden, der so ausgelegt ist, dass man damit mehrere Spezies in einer Mischung nachweisen kann. Ein Assay, der zum Nachweis von zwei oder mehr Spezies verwendet wird, indem man wenigstens zwei Sonden verwendet, die unterschiedliche Fluorophore tragen, wird nachfolgend bezeichnet als „Mehrfach-Analyse" („multiplex analysis"). Ein schematisches Diagramm einer derartigen Mehrfach-Analyse unter Verwendung eines SL wird in 9 gezeigt.
  • Sonden, die die Verbindungen gemäß der Erfindung einschließen, sind auch nützlich bei der Durchführung von Analysen und Assays des Mehrfach-Typs. In einer typischen Mehrfach-Analyse werden zwei oder mehr einzelne Spezies (oder Bereiche von einer oder mehreren Spezies) unter Verwendung von zwei oder mehr Sonden nachgewiesen, wobei jede der Sonden mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert ist. Bevorzugte Mehrfach-Analysen, bei denen es auf einen Fluoreszenz-Energie-Transfers ankommt, erfüllen einige Kriterien. Die Fluoreszenz-Spezies sollte klar und spektral gut aufgelöst sein, und der Energie-Transfer zwischen der Fluoreszenz-Spezies und dem Akzeptor sollte effizient sein.
  • Aufgrund der guten Verfügbarkeit von SLs gemäß der Erfindung, die unterschiedliche charakteristische Emissions-Eigenschaften aufweisen, sind die Verbindungen gemäß der Erfindung besonders gut geeignet für eine Verwendung in Mehrfach-Anwendungen bzw. Mulitplex-Anwendungen. Der Zugang zu SLs mit einem Bereich von charakteristischen Absorptions-Eigenschaften ermöglicht das Anlegen von FET-Sonden, bei denen die Akzeptor-Absorptionseigenschaften und die SL-Emissionseigenschaften aufeinander abgestimmt sind, wodurch ein nützlicher Grad der spektralen Überlappung erreicht wird.
  • Die gleichzeitige Verwendung von zwei oder mehr Sonden unter Anwendung einer FET ist in diesem technischen Bereich bekannt. Beispielsweise wurden Mehrfach-Assays unter Verwendung von Nucleinsäure-Sonden mit unterschiedlichen speziellen Sequenz-Eigenschaften beschrieben. Fluoreszenz-Sonden wurden zur Bestimmung verwendet, ob ein Individuum für eine spezielle Mutation Wildtyp-homozygot, Mutanten-homozygot oder heterozygot ist. Beispielsweise ist es unter Verwendung einer molekularen Bake, die Fluorescein-gequencht ist und die Sequenz des Wildtyps erkennt, und einer anderen molekularen Bake, die Rhodamin-gequencht ist und ein Mutanten-Allel erkennt, möglich, Individuen hinsichtlich des β-Chemokin-Rezeptors Genotyp-mäßig einzuteilen (Kostrikis et al.; Science 279: 1228–1229 (1989)). Das Vorhandensein nur eines Fluorescein-Signals zeigt an, dass das Individuum eines des Wildtyps ist, und das Vorhandensein nur des Rhodamin-Signals zeigt an, dass das Individuum ein homozygoter Mutant ist. Das Vorhandensein sowohl des Rhodamin-Signals als auch des Fluorescein-Signals ist ein diagnostisches Zeichen für einen Heterozygoten. „Tyagi et al., Natural Biotechnology, 16: 49–53 (1998)" haben die gleichzeitige Verwendung von vier unterschiedlich markierten molekularen Baken zur Allelen-Diskriminierung beschrieben, und „Lee et al., Biotechniques, 27: 342–349 (1999)" haben den 7-Farben-Homogen-Nachweis von sechs PCR-Produkten beschrieben.
  • Die SLs gemäß der vorliegenden Erfindung können in Mehrfach-Assays verwendet werden, die dafür ausgelegt sind, im wesentlichen jede beliebige Spezies nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen, einschließlich beispielsweise ganzen Zellen, Viren, Proteine (z.B. Enzyme, Antikörper, Rezeptoren), Glycoproteine, Lipoproteine, subcelluläre Teilchen, Organismen (z.B. Salmonella), Nucleinsäuren (z.B. DNS, RNS und deren Analoge), Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Lipide, Fettsäuren, nichtbiologische Polymeren und kleine bioaktive Moleküle (z.B. Toxine, Arzneimittel, Pestizide, Metabolite, Hormone, Alkaloide, Steroide).
  • Erkennungs-Einheiten
  • Der Begriff „Erkennungs-Einheit", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die mit einer zu analysierenden Substanz über entweder anziehende oder abstoßende Mechanismen in Wechselwirkung treten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Erkennungs-Einheit an eine Verbindung gemäß der Erfingung konjugiert. In einer weiteren exemplarischen Ausführungsform bilden die zu analysierende Substanz und die Erkennungs-Einheit ein innig miteinander verbundenes Paar durch beispielsweise kovalente Bindung, Ionen-Bindung, Ionen-Paarung, van der Waals-Assoziierung und dergleichen. In einer weiteren exemplarischen Ausführungsform stehen die zu analysierende Substanz und die Erkennungs-Einheit in Wechselwirkung über einen Abstoßungs-Mechanismus wie beispielsweise inkompatible sterische charakteristische Eigenschaften, Ladungs-Ladungs-Abstoßung, hydrophil-hydrophob-Wechselwirkungen und dergleichen. Es versteht sich, dass es eine Überlappung zwischen den allgemeinen Begriffen „Erkennungs-Einheit" und „zu analysierende Substanz" gibt. In einer speziellen Anwendung kann eine Spezies eine zu analysierende Substanz sein, während in einer davon verschiedenen Anwendung die Spezies als Erkennungs-Einheit dient. In bestimmten Ausführungsformen dienen die Verbindungen gemäß der Erfindung als Erkennungs-Einheiten (z.B. wenn die zu analysierende Substanz ein Metall-Ion ist).
  • Erkennungs-Einheiten können gewählt sein aus einem großen Bereich kleiner bioaktiver Moleküle (z.B. Arzneimittel, Pestizide, Toxine usw.), organischer funktioneller Gruppen (z.B. Amine, Carbonyl-Verbindungen, Carboxylate usw.), Biomolekülen, Metallen, Metall-Chelaten und Metall-organischen Verbindungen.
  • Wenn die Erkennungs-Einheit ein Amin ist, geht die Erkennungs-Einheit in bevorzugten Ausführungsformen eine Wechselwirkung mit einer Struktur auf der zu analysierenden Substanz ein, die in der Weise reagiert, dass sie mit dem Amin (z.B. Carbonyl-Gruppen, Alkylhalogen-Gruppen) in Wechselwirkung tritt (z.B. eine Bindung eingeht oder einen Komplex bildet). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Amin durch eine saure Einheit auf der zu analysierenden Substanz von Interesse protoniert (z.B. eine Carbonsäure, eine Sulfonsäure).
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen geht dann, wenn die Erkennungs-Einheit eine Carbonsäure ist, die Erkennungs-Einheit eine Wechselwirkung mit der zu analysierenden Substanz beispielsweise durch Komplexierung ein (z.B. Metall-Ionen). In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform protoniert die Carbonsäure eine basische Gruppe auf der zu analysierenden Substanz (z.B. ein Amin).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit eine Arzneimittel-Einheit. Die Arzneimittel-Einheiten können Mittel sein, die bereits für eine klinische Anwendung akzeptiert sind, oder sie können Arzneimittel sein, deren Verwendung eine experimentelle Verwendung ist oder deren Aktivität oder Wirkungsmechanismus erforscht wird. Die Arzneimittel-Einheiten können eine bestätigte Wirkung in einem gegebenen Krankheits-Zustand aufweisen, oder es kann nur eine hypothetische Annahme sein, dass sie eine erwünschte Wirkung in einem gegebenen Krankheits-Zustand zeigen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Arzneimittel-Einheiten Verbindungen, die auf ihr Vermögen überprüft werden, mit einer zu analysierenden Substanz der Wahl eine Wechselwirkung einzugehen. Als solche schließen Arzneimittel-Einheiten, die nützlich als Erkennungs-Einheiten in der vorliegenden Erfindung sind, Arzneimittel von einem breiten Bereich von Arzneimittel-Klassen ein, die eine Vielzahl pharmakologischer Aktivitäten aufweisen.
  • Klassen nützlicher Mittel schließen beispielsweise ein: antiinflammatorische Arzneimittel des Nicht-Steroid-Typs (NSAIDS); das NSAIDS kann beispielsweise gewählt sein aus den folgenden Kategorien: (z.B. Propionsäure-Derivate, Essigsäure-Derivate, Fenaminsäure-Derivate, Biphenylcarbonsäure-Derivate und Oxicame); antiinflammatorische Arzneimittel des Steroid-Typs einschließlich Hydrocortison und dergleichen, Antihistamin-Arzeimittel (z.B. Chlorpheniramin, Triprolidin), Anti-Husten-Arzneimittel (z.B. Dextromethorphan, Codein, Carmiphen und Carbetapentan); gegen Juckreiz wirkende Arzneimittel (z.B. Methidilizin und Trimeprizin); anticholinerge Arzneimittel (z.B. Scopolamin, Atropin, Homatropin, Levadopa); antiemetische- und Antinausea-Arzeimittel (z.B. Cyclizin, Meclizin, Chlorpromazin, Buclizin); anorektische Arzneimittel (z.B. Benzphetamin, Phentermin, Chlorphentermin, Fenfluramin); zentral stimulierende Arzneimittel (z.B. Amphetamin, Methamphetamin, Dextroamphetamin und Methylphenidat); antiarrhythmische Arzneimittel (z.B. Propanolol, Procainamid, Disopyraminde, Quinidin, Encainid); β-adrenerge Blocker-Arzneimittel (z.B. Metoprolol, Acebutolol, Betaxolol, Labetalol und Timolol); kardiotone Arzneimittel (z.B. Milrinon, Amrinon und Dobutamin); antihypertensive Arzneimittel (z.B. Enalapril, Clonidin, Hydralazin, Minoxidil, Guanadrel, Guanethidin); diurethische Arzneimittel (z.B. Amilorid und Hydrochlorthiazid); Vasodilator-Arzneimittel (z.B. Diltazem, Amiodaron, Isosuprin, Nylidrin, Tolazolin und Verapamil); Vasoconstrictor-Arzneimittel (z.B. Dihydroergotamin, Ergotamin und Methylsergid); Anti-Ulcus-Arzneimittel (z.B. Ranitidin und Cimetidin); anästhetische Arzneimittel (z.B. Lidocain, Bupivacain, Chlorprocain, Dibucain); antidepressive Arzneimittel (z.B. Imipramin, Desipramin, Amitryptilin, Nortryptilin); Tranquilizer und sedative Arzneimittel (z.B. Chlordiazepoxid, Benacytyzin, Benzquinamid, Fluorazepam, Hydroxyzin, Loxapin und Promazin); antipsychotische Arzneimittel (z.B. Chlorprothixen, Fluphenazin, Haloperi dol, Molindon, Thioridazin und Trifluoperazin); antimikrobielle Arzneimittel (antibakterielle, Antipilz-, Antiprotozon- und Antiviren-Arzneimittel).
  • Antimikrobielle Arzneimittel, die zur Einarbeitung in die vorliegende Zusammensetzung bevorzugt sind, schließen beispielsweise pharmazeutisch annehmbare Salze von β-Lactam-Arzeimitteln, Chinolon-Arzneimitteln, Cipofloxacin, Norfloxacin, Tetracyclin, Erythromycin, Amikacin, Triclosan, Doxycyclin, Capreomycin, Chlorhexidin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Clindamycin, Ethambutol, Hexamidin, Isothionat, Metronidazol, Pentamidin, Gentamycin, Kanamycin, Lineomycin, Methacyclin, Methenamin, Minocyclin, Neomycin, Netilmycin, Paramomycin, Streptomycin, Tobramycin, Miconazol und Amanfadin ein.
  • Andere Arzneimittel-Einheiten zur Verwendung in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung schließen antineoplastische Arzneimittel (z.B. Antiandrogene, z.B. Leuprolid oder Flutamid), cytocidale Mittel (z.B. Andriamycin, Doxorubicin, Taxol, Cyclophosphamid, Busulfan, Cisplatin, α-2-Interferon), Anti-Östrogene (z.B. Tamoxifen), Anti-Metabolite (z.B. Fluoruracil, Methotrexat, Mercaptopurin, Thioguanin) ein.
  • Die Erkennungs-Einheit kann auch umfassen: Hormone (z.B. Medroxyprogesteron, Östradiol, Leuprolid, Megesterol, Octreotid oder Somatostatin); Muskeln-entspannende Mittel (z.B. Cinnamedrin, Cyclobenzaprin, Flavoxat, Orphenadrin, Papaverin, Mebeverin, Idaverin, Ritodrin, Dephenoxylat, Dantrolen und Azumolen); antispasmodische Arzeimittel, Knochen-aktive Arzneimittel (z.B. Diphosphonat und Phosphonoalkylphosphinat-Arzneimittel-Verbindungen), endocrin-modulierende Arzneimittel (z.B. Contraceptiva (z.B. Ethinodiol, Ethinyl, Östradiol, Norethindrone, Mestranol, Desogestrel, Medroxyprogesteron), Modulatoren für Diabetes (z.B. Glyburid oder Chlorpropamid); Anabolika wie beispielsweise Testolacton oder Stanozolol, Androgene (z.B: Methyltestosteron, Testosteron oder Fluoxymesteron), Antidiurethika (z.B. Desmopressin) und Calcitonine ein.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung finden Anwendung auch Östrogene (z.B. Diethylstilbesterol), Glucocorticoide (z.B. Triamcinolon, Betamethason usw.) und Progenstogene wie beispielsweise Norethindron, Ethynodiol, Norethindron, Levonorgestrel; Thyroid-Mittel (z.B. Liothyronin oder Levothyroxin) oder antithyroide Mittel (z.B. Methimazol); antihyperprolactinemische Arzneimittel (z.B. Cabergoline); Hormon-Supressoren (z.B. Danazol oder Goserelin), Oxytocin-Arzneimittel (z.B. Methylergonovin oder Oxytocin), und es können auch Prostaglandine wie beispielsweise Mioprostol, Alprostadil oder Dinoproston verwendet werden.
  • Andere nützliche Erkennungs-Einheiten schließen immunomodulierende Arzneimittel (z.B. Antihistamine), Mastzellen-Stabilisatoren wie beispielsweise Lodoxamid und/oder Cromolyn, Steroide (z.B. Triamcinolon, Beclomethazon, Cortison, Dexamethason, Prednisolon, Methylprednisolon, Beclomethason oder Clobetasol), Histamin-H2-Antagonisten (z.B. Famotidin, Cimetidin, Ranitidin), Immunosupressiva (z.B. Azathioprin, Cyclosporin) usw. ein. Gruppen mit enzündungshemmender Aktivität wie beispielsweise Sulindac, Etodolac, Ketoprofen und Ketorolac können ebenfalls verwendet werden. Andere Arzneimittel in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung sind für Fachleute in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Die oben aufgezählten (und andere) Moleküle können an die Verbindungen gemäß der Erfindung, an feste Substrate usw. gebunden werden, und zwar mittels Verfahrensweisen, die Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind. Breite Anleitung kann gefunden werden in der, beispielsweise, den Bereichen der Biokonjugat-Chemie und Arzneimittel-Verabreichung gewidmeten Literatur. Beispielsweise ist ein Fachmann mit Sachverstand in diesem technischen Bereich, der mit einem Arzneimittel konfrontiert ist, das ein zugängliches Amin umfaßt, in der Lage, aus einer Vielzahl von Amine derivatisierenden Reaktionen zu wählen, einen passend funktionalisierten Partner (z.B. ein mit einer Carbonsäure-Endgruppe versehenes Thiol) für die organische Schicht zu lokalisieren und die Partner unter Bedingungen umzusetzen, die so gewählt werden, dass sie die gewünschte Kopplung bewirken (z.B: dehydratisierende Mittel wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid). Bezug genommen wird beispielsweise auf „MODIFI CATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS; Feeney et al. (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, Seiten 370–387"; „POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, Dunn et al. (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1991".
  • Wenn die Erkennungs-Einheit ein chelatisierendes Mittel, Kronenether oder Cyclodextrin ist, dominiert eine Wirt-Gast-Chemie die Wechselwirkung zwischen der Erkennungs-Einheit und der zu analysierenden Substanz. Die Anwendung der Wirt-Gast-Chemie ermöglicht, dass ein hoher Grad von Spezifität zwischen Erkennungs-Einheit und zu analysierender Substanz in eine Verbindung oder ein Assay gemäß der Erfindung eingebaut wird. Die Verwendung dieser Verbindungen zum Binden spezifischer Verbindungen ist Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Bezug genommen wird beispielsweise auf „Pitt et al., „The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload, in INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE, Martell (Hrsg.); American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, Seiten 279–312"; "Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge, 1989"; "Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer Verlag, New York, 1989" und die darin zitierten Druckschriften.
  • Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Wegen, die das Binden chelatisierender Mittel, Kronenether und Cyclodextrine an andere Moleküle erlauben, Fachleuten in diesem technischen Bereich verfügbar. Siehe beispielsweise "Meares et al., Properties of In vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides, in: MODIFICATION OF PROTEINS, FOOD; NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS", "Feeney et al. (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, Seiten 370–387"; „Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9, 108–117 (1998)"; „Song et al., Bioconjugate Chem., 8, 249–255 (1997)".
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bildet die Erkennungs-Einheit einen Einschlußkomplex mit der zu analysierenden Substanz von Interesse. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit ein Cyclodextrin oder modi fiziertes Cyclodextrin. Cyclodextrine sind eine Gruppe von cyclischen Oligosacchariden, die durch zahlreiche Mikroorganismen produziert werden. Cyclodextrine haben eine Ringstruktur, die eine korbähnliche Form aufweist. Diese Form macht es möglich, dass Cyclodextrine viele Arten von Molekülen in ihren Innen-Hohlraum einschließen. Siehe beispielsweise „Szejtli, CYCLODEXTRINS AND THEIR INCLUSION COMPLEXES; Akademiai Klado, Budapest, 1982", und „Bender et al., CYCLODEXTRIN CHEMISTRY, Springer Verlag, Berlin, 1978".
  • Cyclodextrine sind in der Lage, Einschluß-Komplexe mit einer Anordnung bioaktiver Moleküle zu bilden, die beispielsweise Arzneimittel, Pestizide, Herbizide und Kampfmittel einschließen. Siehe „Tenjarla et al., J. Pharm., Sci., 87, 425–429 (1998)"; „Zughul et al., Pharm. Dev. Technol., 3, 43–53, (1998)"; und „Albers et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12, 311–337 (1995)". Wichtigerweise sind Cyclodextrine in der Lage, zwischen Enantiomeren von Verbindungen in ihren Einschluß-Komplexen zu unterscheiden. So liefert in einer Ausführungsform die Erfindung den Nachweis eines speziellen Enantiomers in einer Mischung von Enantiomeren; siehe „Koppenhöfer et al., J. Chromatogr. A, 793, 153–164 (1998))".
  • Das Cyclodextrin oder irgendeine andere Erkennungs-Einheit kann an eine Verbindung gemäß der Erfindung, einen festen Träger und dergleichen entweder direkt oder über einen Spacer-Arm gebunden werden. Siehe, „Yamamoto et al., J. Phys. Chem. B, 101, 6855–6860 (1997)". Verfahren zum Binden von Cyclodextrinen an andere Moleküle sind Fachleuten im Bereich der chromatographischen und pharmazeutischen Wissenschaften bekannt; siehe „Sreenivasan, K. J., Appl. Polym. Sci., 60, 2245–2249 (1996)".
  • In einer anderen beispielhaften Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit ein Polyaminocaboxylat-Chelatisierungsmittel wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Diese Erkennungs-Einheiten können beispielsweise an irgendeine Komponente einer Verbindung gemäß der Erfindung mit Amin-Endgruppen, in einen festen Träger oder einen Spacer-Arm gebunden werden, beispielsweise durch Verwendung des im Handel erhältlichen Dianhydrids (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI).
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit ein Biomolekül wie beispielsweise ein Protein, eine Nucleinsäure, ein Peptid oder ein Antikörper. Biomoleküle, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können von irgendeiner beliebigen Quelle abgeleitet werden. Die Biomoleküle können von natürlichen Quellen isoliert werden oder können durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Proteine können natürliche Proteine oder mutierte Proteine sein. Mutationen können bewirkt werden durch chemische Mutagenese, auf eine bestimmte Stelle gerichtete Mutagenese oder andere Mittel zum Induzieren von Mutationen, die Fachleuten mit Sachverstand in diesem technischen Bereich bekannt sind. Proteine, die nützlich bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, schließen beispielsweise Enzyme, Antigene, Antikörper und Rezeptoren ein. Antikörper können entweder polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Peptide und Nucleinsäuren können von natürlichen Quellen isoliert werden oder können vollständig oder teilweise synthetischen Ursprungs sein.
  • In diesen Ausführungsformen, in denen die Erkennungs-Einheit ein Protein oder Antikörper ist, kann das Protein an eine Verbindung gemäß der Erfindung, einen festen Träger oder ein Vernetzungsmittel gebunden werden, und zwar durch irgendeinen reaktiven Peptid-Rest, der auf der Oberfläche des Proteins verfügbar ist. In bevorzugten Ausführungsformen sind die reaktiven Gruppen Amine oder Carboxylate. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die reaktiven Gruppen e-Amin-Gruppen von Lysin-Resten.
  • Erkennungs-Einheiten, die Antikörper sind, können verwendet werden, um zu analysierende Substanzen zu erkennen, die Proteine, Peptide, Nucleinsäuren, Saccharide oder kleine bioaktive Materialien sind, wie beispielsweise Arzneimittel, Herbizide, Pestizide, Industrie-Chemikalien oder Kampfmittel. Verfahren zum Aufziehen von Antikörpern für spezielle Moleküle sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Es wird Bezug genommen auf das US-Patent Nr. 5,147,786 (erteilt an Feng et al. am 15.
  • September 1992), das US-Patent Nr. 5,334,528 (erteilt an Stanker et al. am 2. August 1994), das US-Patent Nr. 5,686,237 (erteilt an M.A.S. Al-Bayati am 11. November 1997) und das US-Patent Nr. 5,573,922 (erteilt an Hoess et al. am 12. November 1996). Verfahren zum Binden von Antikörper-Mitteln an Oberflächen sind in diesem technischen Bereich ebenfalls bekannt; es wird Bezug genommen auf „Delamarche et al., Langmuir, 12, 1944–1946 (1996)".
  • Eine Erkennungs-Einheit kann an eine Verbindung gemäß der Erfindung konjugiert werden durch irgendeines aus einer großen Zahl von in diesem technischen Bereich bekannten Anknüpfungsverfahren, wie sie oben diskutiert wurden. In einer Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit direkt an das Salicylamidyl-Chelat gebunden über eine Gruppe an dem aromatischen Salicylamidyl-Kern, dem Grundgerüst oder dem Amid-Substituenten. In einer weiteren beispielhaften Ausführungsform wird ein reaktives bifunktionelles Vernetzungsmittel an eine reaktive Gruppe auf einem SL gebunden, und dieses Konjugat wird anschließend an die Erkennungs-Einheit über die reaktive Gruppe an der Vernetzungs-Komponente und eine Gruppe komplementärer Reaktivität an der Erkennungs-Einheit gebunden. Viele nützliche Vernetzungs-Mittel können im Handel erworben werden (Pierce Rockford, IL) oder können synthetisiert werden unter Anwendung von Techniken, die in diesem technischen Bereich bekannt sind. Alternativ dazu sind die Erkennungs-Einheit und ein Vernetzungsmittel aneinander gebunden, bevor das Salicylamidyl-Chelat an die Erkennungs-Einheit gebunden wird.
  • Zu analysierende Substanzen
  • Die Materialien und Verfahrensweisen gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Nachweis irgendeiner zu analysierenden Substanz oder Klasse von zu analysierenden Substanzen verwendet werden, die mit einer Erkennungs-Einheit in einer nachweisbaren Weise in Wechselwirkung treten. Die Wechselwirkung zwischen der zu anaylsierenden Substanz und der Erkennungseinheit kann irgendeine physiko-chemische Wechselwirkung sein, einschließlich kovalenter Bindung, Ionen-Bindung, Wasserstoff-Bindung, van-der-Waals-Wechselwirkungen, elektronische abstoßende Wechselwirkungen, elektronische anziehende Wechselwirkungen und hydrophob-hydrophil-Wechselwirkungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wechselwirkung eine ionische Wechselwirkung. In dieser Ausführungsform ist eine Säure, eine Base, ein Metall-Ion oder ein Metall-Ionen bindender Ligand, die zu analysierende Substanz. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wechselwirkung eine Wasserstoff-Bindungs-Wechselwirkung. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die Hybridisierung einer Nucleinsäure an eine Nucleinsäure mit einer komplementären Sequenz nachgewiesen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wechselwirkung eine solche zwischen einem Enzym oder Rezeptor und einem kleinen Molekül oder Peptid, das sich daran bindet.
  • In einer anderen Ausführungsform konkurriert die zu analysierende Substanz um die Erkennungs-Einheit mit einem anderen Mittel, das an die Erkennungs-Einheit vor der Einführung der zu analysierenden Substanz von Interesse gebunden wurde. In dieser Ausführungsform ist es das Verfahren oder Ergebnis der das vorher gebundene Mittel verdrängenden zu analysierenden Substanz, das die nachweisbaren Werte der Fluoreszenz von der Verbindung gemäß der Erfindung hervorruft. Geeignete Kombinationen von Erkennungs-Einheiten und zu analysierenden Substanzen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • In derzeit bevorzugten Ausführungsformen ist die zu analysierende Substanz eine Verbindung, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Säuren, Basen, organischen Ionen, anorganischen Ionen, pharmazeutischen Substanzen, Herbiziden, Pestiziden und Biomolekülen. Jedes dieser Mittel kann – wo dies praktisch durchführbar ist – als Dampf oder als Flüssigkeit nachgewiesen werden. Diese Mittel können als Komponenten in Mischungen von strukturell nicht-verwandten Verbindungen, racemischen Mischungen von Stereoisomeren, nicht-racemischen Mischungen von Stereoisomeren, Mischungen von Diastereomeren, Mischungen von Positions-Isomeren oder als reine Verbindungen zugegen sein. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis einer speziellen zu analysierenden Substanz von Interesse ohne Störung von anderen Substanzen innerhalb einer Mischung.
  • Organische Ionen, die im wesentlichen nicht sauer und nicht basisch sind (z.B. quaternäre Alkylammonium-Salze) können nachgewiesen werden durch eine markierte Erkennungs-Einheit gemäß der Erfindung. Beispielsweise ist eine SL-markierte Erkennungs-Einheit mit Innenaustausch-Eigenschaften nützlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Ein spezielles Beispiel ist der Austausch eines Kations wie beispielsweise eines Dodecyltrimethylammonium-Kations gegen ein Metall-Ion wie beispielsweise Natrium. Erkennungs-Einheiten, die Einschluss-Komplexe mit organischen Ionen bilden, sind ebenfalls von Nutzen. Beispielsweise können Kronenether und Kryptanden zur Bildung von Einschluss-Komplexen mit organischen Ionen wie beispielsweise quaternären Ammonium-Kationen verwendet werden.
  • Anorganische Ionen wie beispielsweise Metall-Ionen und Komplex-Ionen (z.B. SO4 2-, PO4 3-) können auch unter Verwendung der SLs und Verfahren gemäß der Erfindung nachgewiesen werden. Metall-Ionen können beispielsweise nachgewiesen werden durch ihre Komplexierung oder Chelatisierung mit SLs oder chelatisierenden Mitteln, die an eine Verbindung gemäß der Erfindung gebunden sind. In dieser Ausführungsform kann die Erkennungs-Einheit eine einfache monovalente Einheit sein (z.B. Carboxylat, Amin, Thiol) oder kann ein strukturell mehr komplexes Mittel sein (z.B. Ethylendiaminpentaessigsäure, Kronenether, Aza-Kronen, Thia-Kronen).
  • Komplexe anorganische Ionen können über ihr Vermögen nachgewiesen werden, mit SLs um gebundene Metall-Ionen in Ligand-Metall-Komplexen zu konkurrieren. Wenn ein an eine SL gebundener Ligand einen Metall-Komplex mit einer thermodynamischen Stabilitäts-Konstante bildet, die geringer ist als diejenige des Komplexes zwischen dem Metall und dem Komplex-Ion, ruft das Komplex-Ion die Dissoziation des Metall-Ions von dem immobilisierten Liganden hervor. Wenn das Metall-Ion das komplexierte Lanthanid ist, geht die Fluoreszenz zurück. Verfahrensweisen zur Bestimmung von Sta bilitäts-Konstanten für Verbindungen, die zwischen Metall-Ionen und Liganden gebildet werden, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Unter Verwendung dieser Stabilitäts-Konstanten können Chelate, die für spezielle Ionen spezifisch sind, hergestellt werden. Verwiesen wird auf die Druckschrift „A.E. Martell, R. J. Motekaitis; DETERMINATION AND USE OF STABILITY CONSTANTS, 2. Auflage, VCH Publishers, New York, 1992".
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Affinität der zu analysierenden Substratstanz zu einem speziellen Metall-Ion dadurch ausgenutzt, dass man eine Verbindung gemäß der Erfindung verwendet, die das spezielle Metall-Ion einschließt. Das Metall-Ion muss allgemein wenigstens eine unbesetzte Koordinations-Stelle verfügbar haben, an die sich die zu analysierende Substanz binden kann. Alternativ dazu muss wenigstens eine Bindung zwischen dem Metall und dem das Metall immobilisierenden Mittel in Gegenwart der zu analysierenden Substanz ausreichend labil sein, um die Verdrängung von wenigstens einer Bindung des immobilisierenden Reagens durch die zu analysierende Substanz zu ermöglichen. Die Wechselwirkung zwischen der zu analysierenden Substanz und dem Metall-Ion kann nachgewiesen werden durch die Verwendung einer Anzahl von in diesem technischen Gebiet bekannten Verfahrensweisen, einschließlich, beispielsweise, UV/Vis-Spektroskopie und Fluoreszenz-Spektroskopie.
  • Andere Kombinationen von zu analysierenden Substanzen und Erkennungs-Einheiten sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Sonden
  • Die Erfindung liefert Sonden einschließlich SL-Einheiten, die mit, beispielsweise, einer Target-Spezies bzw. Ziel-Spezies, einem Liganden für eine Ziel-Spezies (z.B. Nucleinsäure, Peptid usw.), einem kleinen Molekül (z.B. Arzneimittel, Pestizid usw.) und dergleichen konjugiert sind.
  • Nucleinsäure-Sonden
  • Die SLs gemäß der Erfindung sind nützlich in Verbindung mit Nucleinsäure-Sonden, und sie können als Komponenten von Nachweis-Mitteln in einer Vielzahl von DNS-Vervielfältigungs-Strategien bzw. DNS-Quantifizierungs-Strategien verwendet werden, einschließlich beispielsweise 5'-Nuclease-Assay, Strand Displacement Amplification (SDA), Nucleinsäure-Sequenz-basierte Amplifikation (nucleic acid sequence-based amplification; NASBA), Rolling Circle Amplification (RCA) sowie zum direkten Nachweis von Ziel-Molekülen in Lösungs-Phase oder in fester Phase (z.B. Arrays) vorliegenden Assays. Weiter können die SL-derivatisierten Nucleinsäuren in Sonden von im wesentlichen jedem beliebigen Format verwendet werden, einschließlich beispielsweise eines Formats, das gewählt ist aus molekularen Baken, Skorpion-Sonden, Sunrise-Sonden, konformationsmäßig unterstützen Sonden (conformationally assisted probes), „Licht-an"-Sonden (light up probes) und TagManTM-Sonden.
  • So liefert in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz. Das Verfahren schließt ein: (a) das In-Kontakt-Bringen der Ziel-Sequenz mit einer Detektor-Nucleinsäure; (b) das Hybridisieren der Ziel-Bindungs-Sequenz mit der Ziel-Sequenz unter Verändern der Konformation der Nachweis-Nucleinsäure und Hervorrufen einer Änderung im Zusammenhang mit einem Fluoreszenz-Parameter; und (c) das Nachweisen der Änderung des Fluoreszenz-Parameters und dadurch Nachweisen der Nucleinsäure-Ziel-Sequenz.
  • In den in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verfahrensweisen schließt – so lange nichts anderes angemerkt wird – eine bevorzugte Nachweis-Nucleinsäure eine einzelsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz ein. Die Bindungs-Sequenz weist daran gebunden auf: (i) ein Fluorophor; und (ii) eine SL gemäß der Erfindung. Darüber hinaus ist vor ihrer Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz die Nachweis-Nucleinsäure vorzugsweise in einer Konformation, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Fluorophor und der SL ermöglicht, wenn das Fluorophor angeregt ist. Weiter wird in jedem der in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahren eine Änderung der Fluoreszenz nachgewiesen als Hinweis auf die Gegenwart der Ziel-Sequenz und die genannte Änderung der Fluoreszenz wird vorzugsweise in Echtzeit nachgewiesen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein weiteres Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz. Das Verfahren schließt ein: (a) das Hybridisieren einer Nachweis-Nucleinsäure, die eine einzelsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular assoziierte Sekundärstruktur in 5'-Position zu der Ziel-Bindungs-Sequenz aufweist, mit der Ziel-Sequenz, worin wenigstens ein Abschnitt der Ziel-Sequenz einen einzelsträngigen Schwanz ausbildet, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz zur Verfügung steht; (b) in einer Primer-Ausdehnungs-Reaktion das Synthetisieren eines komplementären Stranges unter Verwendung der intramolekular assoziierten Sekundärstruktur als Matrize und dadurch das Dissoziieren der intramolekular assoziierten Sekundärstruktur und das Produzieren einer Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter; (c) das Nachweisen der Änderung des Fluoreszenz-Parameters und dadurch das Nachweisen der Nucleinsäure-Ziel-Sequenz.
  • Bei diesem Verfahren – und solange nichts anderes angegeben wird, in den anderen Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden – kann die Nachweis-Nucleinsäure im wesentlichen jede beliebige intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur annehmen; jedoch ist diese Struktur vorzugsweise eine Struktur, die gewählt ist aus Haarnadeln, Stamm-Schleife-Strukturen, Pseudoknoten, Triple-Helices und konformationsmäßig unterstützen Strukturen. Darüber hinaus umfaßt die intramolekular Basen-gepaarte Sekundärstruktur vorzugsweise einen Abschnitt der Ziel-Bindungs-Sequenz. Darüber hinaus schließt die intramolekular assoziierte Sekundärstruktur vorzugsweise eine vollständig oder teilweise einsträngige Endonuclease-Erkennungs-Stelle ein.
  • Der komplementäre Strang kann hergestellt werden nach irgendeinem in diesem technischen Bereich anerkannten Verfahren zur Herstellung solcher Stränge, wird jedoch vorzugsweise in einer Ziel-Amplifikations-Reaktion synthetisiert und wird noch mehr be vorzugt synthetisiert durch Extension der Ziel-Sequenz unter Verwendung der Nachweis-Nucleinsäure als Matrize.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Amplifikation einer Ziel-Sequenz. Das Verfahren schließt die Verwendung einer Amplifikations-Reaktion einschließlich der folgenden Schritte ein: (a) Hybridisieren der Ziel-Sequenz und einer Nachweis-Nucleinsäure; die Nachweis-Nucleinsäure schließt eine einzelsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular assoziierte Sekundärstruktur in 5'-Stellung zu der Ziel-Bindungs-Sequenz ein; wenigstens ein Abschnitt der Ziel-Sequenz bildet einen einzelsträngigen Schwanz, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz zur Verfügung steht; (b) Ausdehnen der hybridisierten Nachweis-Nucleinsäure auf der Ziel-Sequenz mit einer Polymerase unter Herstellung eines Nachweis-Nucleinsäure-Ausdehnungs-Produkts und Abtrennen des Nachweis-Nucleinsäure-Ausdehnungsprodukts von der Ziel-Sequenz; (c) Hybridisieren eines Primers mit dem Nachweis-Nucleinsäure-Ausdehnungsprodukt und Ausdehnen des Primers mit der Polymerase, wodurch die intramolekular assoziierte Sekundärstruktur linearisiert wird, und Erzeugen einer Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter; und (d) Nachweis der Änderung des Fluoreszenz-Parameters, wodurch die Ziel-Sequenz nachgewiesen wird.
  • In noch einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Sicherstellung, ob eine erste Nucleinsäure und eine zweite Nucleinsäure miteinander hybridisieren. In diesem Verfahren schließt die erste Nucleinsäure eine SL gemäß der Erfindung ein. Das Verfahren schließt ein: (a) das In-Kontakt-Bringen der ersten Nucleinsäure mit der zweiten Nucleinsäure; (b) das Nachweisen einer Veränderung einer Fluoreszenz-Eigenschaft einer Verbindung, die gewählt ist aus der ersten Nucleinsäure, der zweiten Nucleinsäure und einer Kombination daraus, wodurch sichergestellt wird, ob die Hybridisierung stattfindet.
  • Eine Sonde, die sowohl eine SL als auch ein Fluorophor trägt, kann verwendet werden, oder alternativ dazu kann können eine oder mehrere der Nucleinsäuren einzeln mit einer SL oder einem Fluorophor markiert werden. Wenn eine Nucleinsäure, die einzeln mit einer SL markiert ist, die Sonde ist, kann die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Nucleinsäure nachgewiesen werden durch Beobachten des Quenchens der Fluoreszenz der nativen Nucleinsäure oder – noch mehr bevorzugt – des Quenchens der Fluoreszenz eines an die zweite Nucleinsäure gebundenen Fluorophors.
  • Zusätzlich zu ihrer allgemeinen Brauchbarkeit in Spezies, die dafür ausgelegt sind, eine Amplifikation, einen Nachweis und eine quantitative Bestimmung von Nucleinsäuren zu testen, können die vorliegenden SLs in im wesentlichen jedem beliebigen Nucleinsäure-Sonden-Format verwendet werden, das nun bekannt ist oder später entdeckt wird. Beispielsweise können die SLs gemäß der Erfindung eingearbeitet werden in Sonden-Motive wie beispielsweise Taqman Sonden („Held et al., Genome Res., 6, 986–994 (1996)", „Holland et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88, 7276–7280 (1991)", „Lee et al., Nucleic Acids Res., 21, 3761–3766 (1993)"), molekulare Baken („Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, 303–308 (1996)", „Jayasena et al., US-Patent No. 5,989,823", erteilt am 23. November 1999), Skorpion-Sonden („Whitcomb et al., Nature Biotechnology, 17, 804–807 (1999)"), Sunrise-Sonden („Nazarenko et al., Nucleic Acids Res., 25, 2516–2521 (1997)", konformationsmäßig unterstützte Sonden („R. Cook; parallel anhängige und auf denselben Anmelder übertragene provisorische US-Patentanmeldung Nr. 60/138,376, eingereicht am 9. Juni 1999"), „Licht-an"-Sonden auf Basis von Peptid-Nucleinsäuren (PNA) („Kubista et al., WO 97/45,539, Dezember 1997"), Doppelstrangspezifische DNS-Farbstoffe („Higuchi et al., Bio/Technology, 10, 413–417 (1992)", „Wittwer et al., Bio Techniques, 22, 130–138 (1997)") und dergleichen. Diese und andere Sonden-Motive, mit denen die vorliegenden SLs verwendet werden können, werden beschrieben in der Druckschrift „NONISOTOPIC DNA PROBE TECHNIQUES, Academic Press, Inc., 1992."
  • Die Nucleinsäuren zur Verwendung in den Sonden gemäß der Erfindung können irgendwelche geeignete Größe aufweisen, und ihre Größe liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt im Bereich von etwa 10 bis etwa 80 Nukleotiden und noch mehr bevorzugt im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 Nukleotiden. Die präzise Sequenz und Länge einer Nucleinsäure-Sonde gemäß der Erfindung hängt zum Teil von der Natur des Ziel-Polynukleotids ab, an die sie gebunden wird. Der Bindungs-Ort und die Länge können variiert werden, um passende Temper- und Schmelz-Eigenschaften für eine besondere Ausführungsform zu erzielen. Anleitungen zur Erreichung solcher Wahl-Möglichkeiten für die Zusammensetzung lassen sich in vielen in diesem technischen Bereich anerkannten Druckschriften finden.
  • Vorzugsweise wird das 3'-terminale Nukleotid der Nucleinsäure-Sonde blockiert oder einer Verlängerung durch eine Nucleinsäure-Polymerase unfähig gemacht. Ein derartiges Blockieren erfolgt herkömmlicherweise durch Binden eines Donor- oder Akzeptor-Moleküls an die terminale 3'-Position der Nucleinsäure-Sonde mittels einer Verbindungs-Einheit.
  • Die Nucleinsäure kann DNS, RNS oder chimäre Mischungen oder Derivate oder modifizierte Versionen davon umfassen. Sowohl die Sonde als auch die Ziel-Nucleinsäure können als Einzelstrang, Doppel-Strang, Dreifach-Strang usw. vorliegen. Zusätzlich dazu, mit einer Molekülenergie-Übertragungs-Donor-Einheit und einer Molekülenergie-Übertragungs-Akzeptor-Einheit markiert zu sein, kann die Nucleinsäure an der Basen-Einheit, Zucker-Einheit oder dem Phosphat-Grundgerüst mit anderen Gruppen wie beispielsweise radioaktiven Markierungen, „Minor Groove"-Bindemitteln, interkalierenden Mitteln und dergleichen modifiziert sein.
  • Beispielsweise kann die Nucleinsäure wenigstens eine modifizierte Basen-Einheit umfassen, die gewählt ist aus der Gruppe, die einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl-)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5- Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl-)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Nucleinsäure wenigstens eine modifizierte Zucker-Einheit, die gewählt ist aus der Gruppe, die einschließt, die jedoch nicht beschränkt ist auf Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Nucleinsäure wenigstens ein modifziertes Phosphat-Grundgerüst, das gewählt ist aus der Gruppe, die einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf ein Phosphorothioat, ein Phosphorodithioat, ein Phosphoramidothioat, ein Phosphoramidat, ein Phosphordiamidat, ein Methylphosphonat, einen Alkylphosphotriester, und ein Formacetal oder Analoges davon.
  • An Phosphodiester gebundene Nucleinsäuren gemäß der Erfindung können synthetisiert werden durch in diesem technischen Bereich bekannte Standard-Verfahren, beispielsweise durch Verwendung einer automatischen DNS-Synthese-Vorrichtung (wie beispielsweise einer solchen, wie sie im Handel erhältlich ist von der Firma P.E. Biosystems, usw.) unter Verwendung der im Handel erhältlichen Amidit-Chemie. Nucleinsäuren, die modifizierte Phosphodiester-Verknüpfungsgruppen enthalten, können nach in diesem technischen Bereich bekannten Verfahrensweisen synthetisiert werden. Beispielsweise können Phosphorothioat-Nucleinsäuren synthetisiert werden nach der Verfahrensweise von Stein et al. („Nucl. Acids. Res., 16, 3209 (1988)"), und Methylphosphonat-Nucleinsäuren können hergestellt werden unter Verwendung von Glas-Polymer-Trägern mit gesteuerter Porengröße („Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 7448–7451 (1988)"). Andere Verfahrensweisen zum Synthetisieren sowohl von an Phosphodiester als auch an modifizierte Phosphodiester geknüpfte Nucleinsäuren sind Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich offensichtlich.
  • Nucleinsäure-Sonden gemäß der Erfindung können nach einer Anzahl von Ansätzen synthetisiert werden, z.B. „Ozaki et al., Nucleic Acids Research, 20, 5205–5214 (1992)"; „Agrawal et al., Nucleic Acids Research, 18, 5419–5423 (1990)" oder dergleichen. Die Nucleinsäure-Sonden gemäß der Erfindung werden aus Gründen der Bequemlichkeit auf einer automatisierten DNS-Synthese-Vorrichtung synthetisiert, z.B. einer Vorrichtung der Firma P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Kalifornien), Modell DNS/RNS-Synthesizer 392 oder 394, und zwar unter Anwendung standardisierter chemischer Verfahren wie beispielsweise der Phosphoramidit-Chemie (diese wird beispielsweise offenbart in den folgenden Druckschriften: „Beaucage et al., Tetrahedron, 48, 2223–2311 (1992)"; „Molko et al., US-Patent Nr. 4,980,460"; „Koster et al., US-Patent Nr. 4,725,677"; „Caruthers et al., US-Patent Nrn. 4,415,732, 4,458,066 und 4,973,679". Alternative chemische Verfahrenswege, die zu nicht natürlichen Grundgerüst-Gruppen wie beispielsweise Phosphorothioat, Phosphoroamidat und dergleichen führen, können ebenfalls angewendet werden.
  • Wenn die Nucleinsäuren unter Verwendung einer automatischen Nucleinsäure-Synthesevorrichtung synthetisiert werden, werden die stabilisierende Einheit, die Energieübertragungs-Donor-Einheit und die Energieübertragungs-Akzeptor-Einheit vorzugsweise während der automatisierten Synthese eingeführt. Alternativ dazu kann eine oder können mehrere dieser Einheiten entweder vor oder nach dem Zeitpunkt eingeführt werden, zu dem das automatisierte Synthese-Verfahren begonnen hat. In einer weiteren beispielhaften Ausführungsform wird eine oder werden mehrere dieser Einheiten eingeführt, nachdem die automatisierte Synthese vollständig abgeschlossen wurde.
  • Die Donor-Einheit wird vorzugsweise von der SL um wenigstens etwa 10 Nukleotide und noch mehr bevorzugt um wenigstens etwa 15 Nukleotide getrennt. Die Donor-Einheit wird vorzugsweise entweder an das 3'-endständige Nukleotid oder das 5'endständige Nukleotid der Sonde gebunden. Die SL-Einheit wird ebenfalls vorzugsweise entweder an das 3'-endständige Nukleotid oder das 5'-endständigen Nukleotid der Sonde gebunden. Noch mehr bevorzugt werden die Donor- und Akzeptor-Einheiten an das 3'- und 5'-terminale Nukleotid oder das 5'- oder das 3' terminale Nukleotid der Sonde gebunden.
  • Sobald die gewünschte Nucleinsäure synthetisiert wurde, wird sie vorzugsweise von dem festen Träger, auf dem sie synthetisiert wurde, abgespalten und nach in diesem technischen Bereich bekannten Verfahrensweisen behandelt, um irgendwelche vorhandene Schutzgruppen zu entfernen (z.B. bei 60 °C für die Zeit von 5 h in konzentriertem Ammoniak). In solchen Ausführungsformen, in denen eine Basen-empfindliche Gruppe an die Nucleinsäuren gebunden ist (z.B. TAMRA), werden für die Entfernung der Schutzgruppe vorzugsweise mildere Bedingungen angewendet (z.B. Behandlung in Butylamin : Wasser, 1 : 3; 8 Stunden, 70 °C). Die Entfernung der Schutzgruppen unter diesen Bedingungen wird erleichtert durch die Verwendung von schnell Schutzgruppen abspaltenden Amiditen (z. B. dC-Acetyl, dG-dmf).
  • In Anschluss an die Abspaltung von dem Träger und die Entfernung der Schutzgruppen wird die Nucleinsäure nach irgendeiner Verfahrensweise, die in diesem technischen Bereich bekannt ist, gereinigt; dies schließt Verfahren der Chromatographie, Extraktion und Gel-Reinigung ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nucleinsäure unter Verwendung von HPLC gereinigt. Die Konzentration und Reinheit der isolierten Nucleinsäure wird vorzugsweise bestimmt durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm in einem Spektrophotometer.
  • Peptid-Sonden
  • Peptide, Proteine und Peptid-Nucleinsäuren, die mit einem Fluorophor und einer SL gemäß der Erfindung markiert sind, können sowohl in in vivo- als auch in vitro-Enzym-Assays verwendet werden.
  • So liefert in einem anderen Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Probe ein Enzym enthält. Das Verfahren umfaßt die Schritte, dass man (a) die Probe mit einem Peptid-Konstrukt in Kontakt bringt; (b) das Fluorophor anregt; und (c) eine Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe bestimmt, wobei die Präsenz des Enzyms in der Probe zu einer Änderung in der Fluoreszenz-Eigenschaft führt.
  • Peptid-Konstrukte, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung nützlich sind, schließen solche mit den folgenden Merkmalen ein: (i) ein Fluorophor; (ii) eine SL gemäß der Erfindung; und (iii) eine Spaltungs-Erkennungsstelle für das Enzym. Darüber hinaus ist das Peptid-Konstrukt vorzugsweise von einer Länge und Orientierung und liegt in einer Konformation vor, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Fluorophor und der SL erlaubt, wenn das Fluorophor angeregt wird.
  • Wenn die Sonde zum Nachweis eines Enzyms verwendet wird, wie beispielsweise eines abbauenden Enzyms (z.B. einer Protease) und ein Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung beobachtet wird, der niedriger ist als ein erwarteter Betrag, ist dies im allgemeinen ein Hinweis auf das Vorhandensein eines Enzyms. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung in der Probe kann beispielsweise bestimmt werden als Funktion der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit, der Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit, des Verhältnisses der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit zu derjenigen Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit oder der Anregungszustands-Lebensdauer der Donor-Einheit.
  • Der Assay ist auch nützlich zur Bestimmung der Menge an Enzym in einer Probe unter Bestimmung dieses Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung zu einer ersten und desjenigen zu einer zweiten Zeit nach Kontakt zwischen dem Enzym und dem Tandem-Konstrukt und Bestimmen der Differenz des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung. Die Differenz hinsichtlich des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung spiegelt die Menge an Enzym in der Probe wider.
  • Die Assay-Verfahren können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Verbindung die Aktivität eines Enzyms verändert, z.B. in Screening-Assays. So liefert in einem weiteren Aspekt die Erfindung Verfahrensweisen zum Bestimmen der Menge an Aktivität eines Enzyms in einer Probe von einem Organismus. Das Verfahren schließt die Schritte ein, dass man (a) eine Probe, die das Enzym und die Verbindung umfaßt, mit einem Peptid-Konstrukt in Kontakt bringt, wobei dies die Schritte umfaßt, dass man (b) das Fluorophor anregt und (c) eine Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe bestimmt, worin die Aktivität des Enzyms in der Probe zu einer Änderung der Fluoreszenz-Eigenschaft führt. Peptid-Konstrukte, die in diesem Aspekt der Erfindung nützlich sind, sind im wesentlichen ähnlich denjenigen, die unmittelbar vorher beschrieben wurden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an Enzym-Aktivität in der Probe bestimmt als Funktion des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung in der Probe, und die Menge an Aktivität in der Probe wird verglichen mit einer Standard-Aktivität für dieselbe Menge des Enzyms. Die Differenz zwischen der Menge an Enzym-Aktivität in der Probe und der Standard-Aktivität zeigt an, dass die Verbindung die Aktivität des Enzyms verändert.
  • Repräsentative Beispiele von Enzymen, mit denen die vorliegende Erfindung praktisch durchgeführt werden kann, schließen beispielsweise ein: Trypsin, Enterokinase, HIV-1-Protease, Prohormon-Konvertase, Interleukin-1b-umwandelndes Enzym, Adenovirus-Endopeptidase, Cytomegalovirus-Assemblin, Leishmanolysin, β-Secretase für ein Amyloid-Vorstufen-Protein, Thrombin, Renin, Angiotensin-umwandelndes Enzym, Cathepsin-D und Kininogenase sowie allgemein Proteasen.
  • Proteasen spielen wichtige Rollen in vielen Krankheitsprozessen wie beispielsweise Alzheimersche Krankheit, Bluthochdruck, Entzündungen, Apoptose und AIDS. Verbindungen, die ihre Aktivität blockieren oder erhöhen, haben Potential als therapeutische Mittel. Da die normalen Substrate von Peptidasen lineare Peptide sind und da etablierte Verfahrensweisen zur Herstellung von Nicht-Peptid-Analogen dafür existieren, sind Verbindungen, die die Aktivität von Proteasen beeinflussen, natürliche Subjekte der kombinatorischen Chemie. Ein Screening von Verbindungen, die im Rahmen der kombinatorischen Chemie produziert werden, erfordert einfache enzymatische Assays.
  • Die einfachsten Assays für Proteasen basieren auf einer Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung von einem Donor-Fluorophor zu einem Akzeptor, die an einander gegenüberliegenden Enden einer kurzen Peptid-Kette angeordnet sind, die die potentielle Spaltungsstelle enthält (siehe „C. G. Knight, Methods in Enzymol., 248, 18–34 (1995)"). Eine Proteolyse trennt das Fluorophor und den Akzeptor, was zu einer erhöhten Intensität bei der Emission des Donor-Fluorophors führt. Bestehende Protease-Assays machen Gebrauch von kurzen Peptid-Substraten, die unnatürliche chromophore Aminosäuren einschließen, die durch Festphasen-Peptidsynthese zusammengesetzt werden.
  • Assays gemäß der Erfindung sind ebenfalls nützlich zum Bestimmen und Charakterisieren von Substrat-Spaltungssequenzen von Proteasen oder zum Identifizieren von Proteasen wie beispielsweise von Orphan-Proteasen. In einer Ausführungsform schließt das Verfahren das Ersetzen einer definierten Linker-Einheit-Aminosäure-Sequenz durch eine solche ein, die eine statistisch bestimmte Auswahl von Aminosäuren enthält. Eine Bibliothek von Sonden, die fluoreszierende SL tragen, in denen das Fluorophor und die SL über eine statistisch bestimmte Peptid-Verknüpfungs-Einheit verknüpft sind, können unter Anwendung von Verfahrensweisen des Recombinant Engineerings oder von Verfahrensweisen der synthetischen Chemie erzeugt werden. Ein Screening der Mitglieder der Bibliothek kann bewirkt werden durch Messen eines mit der Spaltung in Verbindung stehenden Signals wie beispielsweise der Fluoreszenz-Energie-Übertragung, nach In-Kontakt-Bringen des Spaltungsenzyms mit jedem der Mitglieder der Bibliothek des Tandem-Konstrukts des Fluoreszenz-Peptids. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung, der niedriger ist als eine erwartete Menge, zeigt das Vorhandensein einer Verknüpfungs-Sequenz an, die durch das Enzym gespalten wird. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung in der Probe kann beispielsweise bestimmt werden als Funktion der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit, der Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit oder des Verhältnisses der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit zu der Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit oder der Lebensdauer des Anregungszustandes der Donor-Einheit.
  • In den Tandem-Konstrukten gemäß der Erfindung sind die Donor- und die Akzeptor-Einheit über eine Verknüpfungs-Einheit verbunden. Die Verknüpfungs-Einheit schließt vorzugsweise eine Peptid-Einheit ein, kann jedoch auch jede beliebige andere organische Molekül-Einheit sein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Verknüpfungs-Einheit eine Spaltungs-Erkennungs-Stelle ein, die spezifisch für ein Enzym oder ein anderes Spaltungsmittel von Interesse ist. Eine Spaltungs-Stelle in der Verknüpfungs-Einheit ist nützlich, da dann, wenn ein Tandem-Konstrukt mit dem Spaltungsmittel gemischt wird, die Verknüpfungs-Einheit ein Substrat für eine Spaltung durch das Spaltungs-Mittel ist. Das Abreißen der Verknüpfungs-Einheit führt zu einer Trennung des Fluorophors und der SL gemäß der Erfindung. Die Trennung ist meßbar als Änderung der FRET.
  • Wenn das Spaltungsmittel von Interesse eine Protease ist, kann die Verknüpfungs-Einheit ein Peptid umfassen, das eine Spaltungs-Erkennungs-Sequenz für die Protease enthält. Eine Spaltungs-Erkennungs-Sequenz für eine Protease ist eine spezielle Aminosäure-Sequenz, die von der Protease während der proteolytischen Spaltung erkannt wird. Viele Protease-Spaltungsstellen sind in diesem technischen Bereich bekannt, und diese und andere Spaltungsstellen können in die Verknüpfungseinheit eingeschlossen werden. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Matayoshi et al., Science, 247,954 (1990)"; „Dunn et al., Meth. Enzymol., 241, 254 (1994)"; „Seidah et al., Meth. Enzymol., 244, 175 (1994)"; „Thomberry, Meth. Enzymol., 244, 615 (1994)"; „Weber et al., Meth. Enzymol., 244, 595 (1994)"; „Smith et al., Meth. Enzymol., 244, 412 (1994)"; „Bouvier et al., Meth. Enzymol, 248, 614 (1995)", „Hardy et al., in AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT, AGING AND ALZHEIMER'S DISEASE, (Hrsg.) Masters et al., Seiten 190–198 (1994)".
  • Auf einem festen Träger immobilisierte SL-Analoge
  • Die SLs gemäß der Erfindung können auf im wesentlichen jedem beliebigen Polymer, Biomolekül und festem oder halb-festem Material immobilisiert werden, das irgendeine nützliche Konfiguration hat. Darüber hinaus kann jedes beliebige Konjugat, das eine oder mehrere SLs umfaßt, in ähnlicher Weise immobilisiert werden. Wenn der Träger ein Feststoff oder Halb-Feststoff ist, schließen Beispiele von bevorzugten Typen von Trägern zum Immobilisieren der Nucleinsäure-Sonde ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Glas mit gesteuerten Poren, Glasplatten, Polystyrol, mit Avidin beschichtete Polystyrol-Kugeln, Cellulose, Nylon, Acrylamid-Gel und aktiviertes Dextran. Diese festen Träger sind bevorzugt aufgrund ihrer chemischen Stabilität, Leichtigkeit, mit der sie funktionalisiert werden können, und ihrer wohldefinierten Oberfläche. Feste Träger wie beispielsweise Glas mit gesteuerten Poren (CPG; controlled pore glas; 500 Å, 1.000 Å) und nicht-quellendes, hochgradig vernetztes Polystyrol (1.000 Å) sind besonders bevorzugt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Oberfläche eines festen Trägers mit einer SL gemäß der Erfindung oder einer Spezies, die eine SL gemäß der Erfindung einschließt, funktionalisiert. Aus Gründen der Klarheit der Veranschaulichung fokussiert sich die folgende Diskussion darauf, eine reaktive SL an einen festen Träger zu binden. Die folgende Diskussion ist auch in breiter Weise relevant für das Binden einer Spezies, die innerhalb ihrer Struktur eine reaktive SL einschließt, an einen festen Träger und das Binden einer derartigen Spezies und von reaktiven SL-Analogen an andere Moleküle und Strukturen.
  • Die SLs werden vorzugsweise an einen festen Träger dadurch gebunden, daß man eine Bindung zwischen einer reaktiven Gruppe auf der SL und einer reaktiven Gruppe auf der Oberfläche des festen Trägers oder einer Verbindungsgruppe (Linker), die an den festen Träger gebunden ist, ausbildet und dadurch den festen Träger mit einem oder mehreren SL-Analogen derivatisiert. Die Bindung zwischen dem festen Träger und der SL ist vorzugsweise eine kovalente Bindung, obwohl auch ionische Bindungen, dative Bindungen oder andere derartige Bindungen genauso nützlich sind. Reaktive Gruppen, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind im Einzelnen oben diskutiert und schließen beispielsweise Amine, Hydroxyl-Gruppen, Carbonsäuren, Carbonsäure-Derivate, Alkene, Sulfhydryl-Verbindungen, Siloxane usw. ein.
  • Eine große Zahl von festen Trägern, die zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung passend sind, sind im Handel erhältlich und schließen beispielsweise ein: Peptidsynthese-Harze, sowohl mit als auch ohne gebundene Aminosäuren und/oder Peptide (z.B. Alkoxybenzylalkohol-Harz, Aminomethyl-Harz, Aminopolystyrol-Harz, Benzhydrylamin-Harz usw. (Bachem)), mit funktionellen Gruppen versehenes Glas mit gesteuerten Poren (BioSearch Technologies, Inc.) Ionenaustausch-Medien (Aldrich), funktionalisierte Membranen (z.B. -COOH-Membranen; Asahi Chemical Co., Asahi Glas Co. und Tukuyama Soda Co.) und dergleichen.
  • Darüber hinaus sind für Anwendungen, in denen ein passender fester Träger nicht im Handel erhältlich ist, eine große Vielzahl von Reaktionstypen für die Funktionalisierbarkeit einer Oberfläche eines festen Trägers verfügbar. Beispielsweise können Träger, die aus einem Kunststoff wie beispielsweise Polypropylen aufgebaut sind, an ihrer Oberfläche durch Chromoxid-Oxidation derivatisiert und anschließend in hydroxylierte oder Amino-methylierte Oberflächen umgewandelt werden. Der funktionalisierte Träger wird dann mit einer SL mit komplementärer Reaktivität umgesetzt, wie beispielsweise mit einem aktiven SL-Ester, einem entsprechenden Säurechlorid oder einem entsprechenden Sulfonat-Ester. Träger, die aus hochgradig vernetztem Divinylbenzol hergestellt sind, können an der Oberfläche durch Chlormethylierung und anschließende Behandlung der funktionellen Gruppen derivatisiert werden. Darüber hinaus können funktionalisierte Substrate hergestellt werden aus geätztem, reduziertem Polytetrafluorethylen.
  • Wenn der Träger aus einem silikatartigen Material wie beispielsweise Glas aufgebaut ist, kann die Oberfläche durch Umsetzen der Oberfläche mit Si-OH-Gruppen, SiO-H-Gruppen und/oder Si-Si-Gruppen mit einem funktionalisierenden Reagens derivatisiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, in der die Substrate aus Glas hergestellt sind, wird die kovalente Bindung der reaktiven Gruppe an die Glas-Oberfläche erreicht durch Umwandlung von Gruppen auf der Oberfläche des Substrats mit einem Siliciummodifizierenden Reagens wie beispielsweise: (RaO)3-Si-Rb-Xa (2)worin Ra eine Alkyl-Gruppe wie beispielsweise eine Methyl-Gruppe oder Ethyl-Gruppe ist, Rb eine verbindende Gruppe zwischen Silicium und Xa ist und Xa eine reaktive Gruppe oder eine geschützte reaktive Gruppe ist. Silan-Derivate, die Halogene oder andere Abgangs-Gruppen zusätzlich zu den gezeigten Alkoxy-Gruppen aufweisen, sind auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liefert das Reagens, das zum Funktionalisieren des festen Trägers verwendet wird, mehr als eine reaktive Gruppe pro Reagens-Molekül. Bei Verwendung von Reagenzien wie beispielsweise der nachfolgend genannten Verbindung wird jede reaktive Stelle auf der Substrat-Oberfläche im Grundsatz zu zwei oder mehr funktionellen Gruppen „vervielfältigt": (RaO)3-Si-Rb-(Xa)n (3)worin Ra eine Alkyl-Gruppe ist (z.B. eine Methyl-Gruppe oder Ethyl-Gruppe), Rb eine verbindende Gruppe zwischen Silicium und Xa ist, Xa eine reaktive Gruppe oder eine geschützte reaktive Gruppe ist und n eine ganze Zahl zwischen 2 und 50 und noch mehr bevorzugt zwischen 2 und 20 ist. Die Amplifikation einer SL durch ihr Binden an ein Silicium enthaltendes Substrat ist – den Absichten entsprechend – beispielhaft für das generelle Konzept der SL-Amplifikation. Diese Vervielfachungs- bzw. Amplifikations-Strategie ist in gleicher Weise anwendbar auf andere Aspekte der Erfindung, in denen ein SL-Analoges an irgendein anderes Molekül oder einen festen Träger gebunden wird.
  • Eine Zahl von Siloxan-funktionalisierenden Reagenzien kann verwendet werden, beispielsweise:
    • (1) Hydroxyalkyl-Soloxane (Silylieren der Oberfläche; Funktionalisieren mit Diboran; und Umsetzung mit H2O2, um zum Alkohol zu oxidieren); (a) Allyltrichlorsilan → → 3-Hydroxypropyl; (b) 7-Oct-1-enyltrichlorsilan → → 8-Hydroxypropyl;
    • (2) Diol-(dihydroxyalkyl-)siloxane (Silylieren der Oberfläche und Hydrolysieren zum Diol); (a) Glycidyltrimethoxysilan → → (2,3-Dihydroxypropyloxy-)propyl;
    • (3) Aminoalkylsiloxane (Amine, die keinen Zwischen-Funktionalisierungs-Schritt erfordern); (a) 3-Aminopropyltrimethoxysilan → Aminopropyl;
    • (4) Dimere sekundärer Aminoalkylsiloxane (a) Bis-(3-trimethoxysylylpropyl-)amin → Bis-(silyloxypropyl-)amin.
  • Für Fachleute in diesem technischen Bereich ist es offensichtlich, daß eine Anordnung von ähnlich nützlichen chemischen Funktionalisierungs-Wegen verfügbar ist, wenn von Siloxanen verschiedene Träger-Komponenten verwendet werden. So können beispielsweise Alkylthiole, die wie oben im Kontext der Siloxane-modifizierenden Reagenzien funktionalisiert wurden, an Metall-Filme gebunden und anschließend mit einer SL unter Herstellung der immobilisierten Verbindung gemäß der Erfindung umgesetzt werden.
  • R-Gruppen zur Verwendung als Gruppe Rb in den oben beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Alkyl-Gruppen, substituierte Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, Arylalkyl-Gruppen, substituierte Aryl-Gruppen, substituierte Arylalkyl-Gruppen, Acyl-Gruppen, Halogen-Gruppen, Hydroxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Alkylamino-Gruppen, Acylamino-Gruppen, Alkoxy-Gruppen, Acyloxy-Gruppen, Aryloxy-Gruppen, Aryloxyalkyl-Gruppen, Mercapto-Gruppen, gesättigte cyclische Kohlenwasserstoff-Gruppen, ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoff-Gruppen, Heteroaryl-Gruppen, Heteroarylalkyl-Gruppen, substituierte Heteroaryl-Gruppen, substituierte Heteroarylalkyl-Gruppen, heterocyclische Gruppen, substituierte heterocyclische Gruppen und Heterocycloalkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  • Nucleinsäure-Aufnahme-Sonden
  • In einer Ausführungsform wird eine eine SL umfassende immobilisierte Nucleinsäure als Aufnahme-Sonde verwendet. Die Nucleinsäure-Sonde kann direkt an einen festen Träger gebunden sein, beispielsweise durch Bindung des 3'-terminalen oder 5'-terminalen Nukleotids der Sonde an den festen Träger. Noch mehr bevorzugt ist jedoch die Sonde an den festen Träger über eine Verbindungs-Gruppe (Linker) (d.h. einen Spacer-Arm, siehe oben) gebunden. Die Bindungs-Gruppe dient dazu, einen Abstand der Sonden von dem festen Träger zu schaffen. Die Bindungs-Gruppe hat am meisten bevorzugt eine Länge von etwa 5 bis etwa 30 Atomen, noch mehr bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Atomen.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger auch als Synthese-Träger bei der Herstellung der Sonde verwendet. Die Länge und chemische Stabilität der Bindungs-Gruppe zwischen dem festen Träger und der ersten 3'-Einheit der Nucleinsäure spielt eine wichtige Rolle bei einer effizienten Synthese und Hybridisierung von Träger-gebundenen Nucleinsäuren. Der Linker-Arm sollte ausreichend lang sein, so daß eine hohe Ausbeute (> 97 %) während einer automatisierten Synthese erreicht werden kann. Die erforderliche Länge des Linkers bzw. Bindungsarms hängt ab von dem speziellen verwendeten festen Träger. Beispielsweise ist eine sechs Atome lange Bindungs-Gruppe allgemein ausreichend, um während einer automatisierten Synthese von Nucleinsäuren eine Ausbeute > 97 % zu erreichen, wenn ein hochgradig vernetztes Polystyrol als der feste Träger verwendet wird. Der Verbindungsarm ist vorzugsweise wenigstens 20 Atome lang, um eine hohe Ausbeute (> 97 %) während einer automatisierten Synthese zu erreichen, wenn CPG als der feste Träger verwendet wird.
  • Eine Hybridisierung einer an einem festen Träger immobilisierten Sonde macht es allgemein erforderlich, daß die Sonde von dem festen Träger um wenigstens 30 Atome entfernt ist, noch mehr bevorzugt um wenigstens 50 Atome. Um diese Entfernung zu erreichen, schließt die Bindungs-Gruppe allgemein einen zwischen der Bindungs- Gruppe und den 3'-Terminus angeordneten Spacer ein. Für eine Nucleinsäure-Synthese ist der Bindungsarm üblicherweise an der 3'-OH-Gruppe des 3'-Terminus über eine Ester-Bindung gebunden, die mit basischen Reagenzien gespalten werden kann, um die Nucleinsäure von dem festen Träger freizusetzen.
  • Eine große Vielzahl von Bindungs-Gruppen ist im Stand der Technik bekannt, die dazu verwendet werden kann, die Nucleinsäure-Sonde an den festen Träger zu binden. Die Bindungs-Gruppe kann aus irgendeiner Verbindung gebildet sein, die nicht signifikant die Hybridisierung der Ziel-Sequenz mit der Sonde stört, die an den festen Träger gebunden ist. Die Bindungs-Gruppe kann beispielsweise gebildet sein aus einer homopolymeren Nucleinsäure, die leicht an die Bindungs-Gruppe über automatisierte Synthese addiert werden kann. Alternativ können Polymere wie beispielsweise funktionalisiertes Polyethylenglycol als Bindungsgruppe verwendet werden. Solche Polymere sind derzeit gegenüber homopolymeren Nucleinsäuren bevorzugt, da sie nicht signifikant die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-Nucleinsäure stören. Polyethylenglycol ist besonders bevorzugt, da es im Handel erhältlich ist, sowohl in organischen als auch in wäßrigen Medien löslich ist, leicht zu funktionalisieren ist und vollständig stabil unter Nucleinsäure-Synthese-Bedingungen und Nach-Synthese-Bedingungen ist.
  • Die Bindungen zwischen dem festen Träger, der Bindungs-Gruppe und der Sonde werden vorzugsweise nicht während der Synthese oder Entfernung basischer Schutzgruppen unter basischen Bedingungen bei hoher Temperatur gespalten. Diese Bindungen können jedoch gewählt sein aus Gruppen, die unter einer Vielzahl von Bedingungen spaltbar sind. Beispiele derzeit bevorzugter Bindungen schließen Carbamat-Bindungen, Ester-Bindungen und Amid-Bindungen ein.
  • Auf Acrylamid immobilisierte Sonden
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine Spezies innerhalb einer Matrix wie beispielsweise einer Acrylamid-Matrix, und die Spezies trägt eine SL oder das Vorhandensein der immobilisierten Spezies wird gesichert unter Verwendung einer Sonde, die eine SL trägt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Immobilisierung bewirkt in Verbindung mit dem „Acrydite"-Prozess, der erfunden und auf den Markt gebracht wurde von der Firma Mosaic Technologies („Cambridge, MA; siehe „Rehman et al., Nucleic Acids Research, 27, 649–655 (1999)"). Die Acrydite-Methode ermöglicht die Immobilisierung von Alken-markierten Aufnahme-Sonden innerhalb eines polymerisierten Polyacrylamid-Netzwerks. Wenn Ziel-Mischungen unter Elektrophorese-Bedingungen über die immobilisierte Sonden-Bande hinaus laufengelassen werden, wird die Ziel-Nucleinsäure im wesentlichen quantitativ eingefangen. Jedoch erfordert der Nachweis dieses Ereignisses derzeit eine zweite Sonde. In einer Ausführungsform werden Sonden, die eine SL und/oder ein Fluorophor tragen, in einer Acrylamid-Matrix immobilisiert und anschließend mit der Ziel-Mischung in Kontakt gebracht. Bei Verwendung von Fluoreszenz-Sonden als Auffang-Sonden können Signale von den Ziel-Mischungen direkt in Realzeit nachgewiesen werden.
  • Mikro-Anordnungen
  • Die Erfindung stellt auch Mikro-Anordnungen bereit, die immobilisierte SLs und mit SLs funktionalisierte Verbindungen bereitstellen. Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahrensweisen zum Abfragen von Mikro-Anordnungen unter Verwendung von Sonden bereit, die mit SLs funktionalisiert sind. Die immobilisierte Spezies und die Sonden sind gewählt aus im wesentlichen jedem beliebigen Typ von Molekül, der einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf kleine Moleküle, Peptide, Enzyme, Nucleinsäuren und dergleichen.
  • Nucleinsäure-Mikro-Arrays bzw. -Mikro-Anordnungen, die aus einer Vielzahl von immobilisierten Nucleinsäuren bestehen, sind revolutionäre Werkzeuge für die Erzeugung von Genom-Informationen, siehe "Debouck et al., in der Ergänzung zu: Nature Genetics, 21, 48–50 (1999)". Die Diskussion, die hiernach folgt, fokussiert sich auf die Verwendung von SLs in Verbindung mit Nucleinsäure-Mikro-Arrays. Es ist beabsichtigt, daß diese Fokussierung veranschaulichend ist und nicht den Umfang von Materialien beschränkt, mit denen dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung praktisch durchgeführt werden kann.
  • So werden in einer anderen bevorzugten Ausführungsform die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Mikro-Array-Format verwendet. Die SLs oder Spezies, die SLs tragen, können selbst Komponenten eines Mikro-Arrays sein oder sie können alternativ dazu als Werkzeug zum Screening von Komponenten des Mikro-Arrays verwendet werden.
  • So liefert in einer bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening eines Mikro-Array. Das Verfahren schließt das In-Kontakt-Bringen der Verbindungen des Mikro-Arrays mit einer SL-tragenden Sonde und das Abfragen des Mikro-Arrays auf Bereiche von Fluoreszenz ein. Die Fluoreszenz-Bereiche sind ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Wechselwirkung zwischen der SL-tragenden Sonde und einer Mikro-Array-Komponente. In einer weiteren Version dieses Verfahrens wird das Mikro-Array auf Bereiche abgefragt, in denen Fluoreszenz gequencht wird, was wiederum das Vorhandensein einer Wechselwirkung zwischen der eine SL-tragenden Sonde und einer Komponente des Mikro-Array zeigt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Array immobilisierte, SL-tragende FET-Sonden als die abfragenden Spezies. In dieser Ausführungsform schaltet sich die Sonde an, wenn sie mit ihrem Ziel-Molekül hybridisiert wird. Solche Arrays werden leicht hergestellt und gelesen und können so angelegt werden, daß sie quantitative Ergebnisse bringen. SL-tragende Sonden umfassende Arrays sind wertvolle Werkzeuge für die Expressionsanalyse und das Genom-Screening im klinischen Bereich.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die immobilisierte, SL-tragende Sonde keine FET-Sonde. Ein auf einem derartigen Format basierendes Mikro-Array kann verwendet werden, um Tests auf das Vorhandensein von Wechselwirkungen zwischen einer zu analysierenden Substanz und der immobilisierten Sonde beispielsweise dadurch durchzuführen, daß man das Quenchen einer Fluoreszenz der zu analysierenden Substanz bei Wechselwirkung zwischen der Sonde und einer zu analysierenden Substanz beobachtet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Mikro-Arrays n Sonden, die identische oder verschiedene Nucleinsäure-Sequenzen umfassen. Alternativ dazu kann das Mikro-Array eine Mischung aus n Sonden umfassen, die Gruppen von identischen und verschiedenen Nucleinsäure-Sequenzen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist n eine Zahl von 2 bis 100, noch mehr bevorzugt von 10 bis 1.000 und noch weiter bevorzugt von 100 bis 10.000. In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform werden die n Sonden mustermäßig auf einem Substrat als n unterscheidbare Orte in einer Weise aufgebracht, die es ermöglicht, die Identität jedes der n Orte abzusichern.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Mikro-Arrays von n SL-tragenden Sonden. Das Verfahren schließt das Binden von SL-tragenden Sonden an ausgewählte Bereiche eines Substrats ein. Eine Vielzahl von Verfahrensweisen ist derzeit verfügbar, um Arrays von biologischen Makromolekülen herzustellen, wie beispielsweise Arrays von Nucleinsäure-Molekülen. Die folgende Diskussion konzentriert sich auf die Anordnung eines Mikro-Arrays von SL-tragenden Sonden; diese Fokussierung erfolgt jedoch aus Gründen der Kürze, und es ist beabsichtig, daß diese veranschaulichend und nicht beschränkend ist.
  • Ein Verfahren zur Herstellung geordneter Arrays von SL-tragenden Sonden auf einem Substrat ist ein „Dot-Blot"-Ansatz. Bei diesem Verfahren überträgt ein Vakuum-Verteiler eine Mehrzahl von z.B. 96 wässrigen Proben aus Sonden von Vertiefungen (wells) mit einem Durchmesser von 3 Millimeter auf ein Substrat. Die Sonde wird auf der porösen Membran dadurch immobilisiert, daß man die Membran erhitzt oder sie UV-Strahlung aussetzt. Eine übliche Variante dieser Verfahrensweise ist ein „Slot Blot"-Verfahren, in dem die Vertiefungen stark längliche ovale Form aufweisen.
  • Eine weitere Verfahrensweise, die zur Herstellung geordneter Arrays von Sonden verwendet wird, macht Gebrauch von einem Array von Stäbchen, die in die Vertiefungen (wells) eingetaucht sind, z.B. in die 96 Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte, und zwar zum Übertragen eines Arrays von Proben auf ein Substrat wie beispielsweise auf eine poröse Membran. Ein Array schließt Stäbchen ein, die so vorgesehen sind, daß sie eine Membran in versetzter Weise tüpfeln und so eine Anordnung von 9.216 Tüpfelchen in einem Bereich von 22 × 22 cm schaffen. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Lehrach et al., HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SEQUENCING, GENOME ANALYSIS, Band 1, Davies et al. (Hrgs.), Cold Spring Harbor Press, Seiten 39–81 (1990)".
  • Eine alternative Verfahrensweise zur Schaffung geordneter Arrays von Sonden ist analog zu der Verfahrensweise, die beschrieben wurde von Pirrung et al. (US-Patent Nr. 5,143,854; erteilt 1992) und auch von Fodor et al. (Science, 251, 767–773 (1991)). Dieses Verfahren schließt das Synthetisieren verschiedener Sonden in verschiedenen gesonderten Bereichen eines Teilchens oder eines anderen Substrats ein. Dieses Verfahren wird vorzugsweise angewendet mit relativ kurzen Sonden-Molekülen, z.B. weniger als 20 Basen. Ein verwandtes Verfahren wurde beschrieben von Southern et al. (Genomics, 13, 1008–1017 (1992)).
  • Khrapko et al., DNA Sequence, 1, 375–388 (1991) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäure-Matrix durch Tüpfeln von DNS auf eine dünne Schicht aus Polyacrylamid. Das Tüpfeln erfolgt manuell mit einer Mikropipette.
  • Das Substrat kann auch mit einem Muster versehen werden, indem man Verfahrensweisen wie beispielsweise die Photolithographie („Kleinfield et al., J. Neurosci., 8, 4098-4120 (1998)"), Photoätzen, chemisches Ätzen und Mikrokontakt-Drucken („Kumar et al., Langmuir, 10, 1498 – 1511 (1994)") anwendet. Andere Verfahrensweisen zum Ausbilden von Mustern auf einem Substrat sind Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich völlig offensichtlich.
  • Die Größe und Komplexität des Musters auf dem Substrat ist nur durch das Auflösungsvermögen der angewendeten Verfahrensweise und den Zweck, für den das Muster beabsichtigterweise erzeugt wird, beschränkt. Beispielsweise werden bei Anwendung der Verfahrensweise des Mikrokontakt-Druckens Merkmale mit einer geringen Größe wie beispielsweise 200 nm schichtmäßig auf das Substrat aufgebracht. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Xia Y., J. Am. Chem. Soc., 117, 3274–75 (1995)". In ähnlicher Weise werden bei Anwendung der Photolithographie Muster mit Merkmalen einer geringen Größe wie beispielsweise 1 μm erzeugt. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Hickman et al., J. Vac. Sci. Technol., 12, 607–616 (1994)". Muster, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen solche ein, die Merkmale wie beispielsweise Vertiefungen, Einschlüsse, Abtrennungen, Einschnitte, Einläße, Ausläße, Kanäle, Tröge, Beugungsgitter und dergleichen einschließen.
  • In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform wird die Erstellung des Musters dafür angewendet, um ein Substrat mit einer Mehrzahl von benachbarten Vertiefungen, Einschnitten oder Löchern zum Enthalten der Sonden zu erzeugen. Im allgemeinen ist jedes dieser Substrat-Merkmale von den anderen Vertiefungen mittels einer erhobenen Wandung oder Abtrennung isoliert, und die Vertiefungen stehen nicht fließmäßig in Verbindung. So bleibt ein Teilchen oder eine andere Substanz, die in einer besonderen Vertiefung angeordnet wird, im wesentlichen auf die Vertiefung beschränkt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erlaubt der Musteraufbau die Schaffung von Kanälen durch die Vorrichtung, wodurch eine zu analysierende Substanz oder eine andere Substanz in die Vorrichtung eintreten und/oder aus dieser austreten kann.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die Sonden dadurch immobilisiert, daß man sie direkt auf ein Substrat „druckt", oder es kann alternativ dazu eine „Lift Off"-Technik (Abhebe-Technik) angewendet werden. Bei der Lift-Off-Technik wird ein mustermäßiges Resist auf das Substrat aufgelegt, eine organische Schicht wird in den Bereichen abgelegt, die nicht von dem Resist bedeckt sind, und das Resist wird anschließend entfernt. Resists, die zur Verwendung mit den Substraten der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschrift „Kleinfield et al., J. Neurosci., 8, 4098–4120 (1998)". Im Anschluß an das Entfernen des Photoresists kann eine zweite CAP, die eine von der ersten Sonde verschiedene Struktur aufweist, an das Substrat in den Bereichen gebunden werden, die anfänglich von dem Resist bedeckt waren. Unter Verwendung dieser Verfahrensweise können Substrate mit Mustern von Sonden mit unterschiedlichen charakteristischen Eigenschaften erzeugt werden. Ähnliche Substrat-Konfigurationen sind durch Mikro-Printen einer Schicht mit den gewünschten charakteristischen Eigenschaften direkt auf das Substrat zugänglich. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Mrkish et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 55–78 (1996)".
  • Spacer-Gruppen
  • Der Begriff „Spacer-Gruppe", wie er in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf Komponenten der SL-tragenden Sonden. Die Spacer-Gruppe verknüpft Donor- und/oder Akzeptor-Einheiten und andere Gruppen mit der Nucleinsäure, dem Peptid oder einer anderen polymeren Komponente der Sonde. Die Spacer-Gruppen können hydrophil sein (z.B. Tetraethylenglycol, Hexaethylenglycol, Polyethylenglycol), oder sie können hydrophob sein (z.B. Hexan, Decan usw.).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das immobilisierte Konstrukt einen Spacer zwischen der reaktiven Gruppe des festen Trägers und dem SL-Analog ein. Die Verknüpfungs-Gruppe ist vorzugsweise gewählt aus C6-bisC30-Alkyl-Gruppen, substitutierte C6-bisC30-Alkyl-Gruppen, Polyolen, Polyethern (z.B. Polyethylenglycol), Polyaminen, Polyaminosäuren, Polysacchariden und Kombinationen daraus.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, eine Einheit der Sonde an die polymere Komponente über eine Gruppe gebunden zu haben, die Flexibilität und Abstand von der polymeren Komponente liefert. Unter Verwendung derartiger Spacer-Gruppen werden die Eigenschaften der Einheit, die der polymeren Komponente benachbart ist, moduliert. Eigenschaften, die nützlicherweise gesteuert werden, schließen beispielswei se ein: Hydrophobizität, Hydrophilizität, Oberflächen-Aktivität, die Entfernung des Donors und/oder der SL-Einheit von der Nucleinsäure und die Entfernung des Donors von der SL.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform dient der Spacer dazu, eine Entfernung der SL von einer Nucleinsäure zu schaffen. Spacer mit dieser charakteristischen Eigenschaft haben einige Anwendungen. Beispielsweise kann eine SL, die zu eng an der Nucleinsäure gehalten wird, nicht mit der Donor-Gruppe in Wechselwirkung treten, oder sie kann nur mit einem zu geringen Wert der Affinität in Wechselwirkung treten. Wenn eine SL selbst sterisch anspruchsvoll ist, kann die Wechselwirkung, die zu einem Quenchen führt, in unerwünschter Weise geschwächt werden, oder sie kann überhaupt nicht auftreten, und zwar aufgrund einer sterisch induzierten Behinderung der Annäherung der beiden Komponenten zueinander.
  • Wenn das die SL umfassende Konstrukt durch Bindung beispielsweise an einen festen Träger immobilisiert wird, kann das Konstrukt auch eine Spacer-Einheit zwischen der reaktiven Gruppe des festen Trägers und dem SL-Analog oder einer anderen Sonden-Komponente einschließen, die an den festen Träger gebunden ist.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Spacer-Gruppe, die in den Sonden gemäß der Erfindung verwendet wird, mit einer Gruppe versehen, die abgespalten werden kann, um eine gebundene Einheit von der polymeren Komponente freizusetzen, wie beispielsweise eine SL, ein Fluorophor, ein Klein-Rillen-Bindemittel, eine interkalierende Einheit und dergleichen.
  • Viele abspaltbare Gruppen sind in diesem technischen Bereich bekannt. Bezug genommen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Jung et al., Biochem. Biophys. Acta, 761, 152–162 (1983)"; „Joshi et al., J. Biol. Chem., 265, 14518–14525 (1990)"; „Zarling et al., J. Immunol., 124, 913–920 (1980)"; „Bouizar et al., Eur. J. Biochem., 155, 141-147 (1986)"; „Park et al., J. Biol. Chem., 261, 205–210 (1986)"; „Browning et al., J. Immunol., 143, 1859–1867 (1989)". Darüber hinaus ist ein großer Bereich abspaltbarer, bifunktioneller (sowohl homobifunktioneller als auch heterobifunktioneller) Spacer-Arme im Handel erhältlich von Lieferanten-Firmen wie beispielsweise von der Firma Pierce.
  • Eine beispielhafte Ausführungsform, die von Spacer-Gruppen Gebrauch macht, ist in den oben angegebenen Formeln VII und VIII gezeigt. In diesen Formeln ist Rb entweder stabil, oder die Gruppe kann durch chemische oder photochemische Reaktionen abgespalten werden. Beispielsweise können Rb-Gruppen, die Ester- oder Disulfid-Bindungen umfassen, durch Hydrolyse bzw. Reduktion abgespalten werden. Auch im Bereich des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Rb-Gruppen, die durch Licht abgespalten werden, wie beispielsweise Nitrobenzyl-Derivate, Phenacyl-Gruppen, Benzoin-Ester usw. Andere derartige abspaltbare Gruppen sich Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt.
  • Kits
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Kits bereit, die eine oder mehrere der SLs oder der SL-tragenden Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten. In einer Ausführungsform schließt ein Kit ein reaktives SL-Derivat und Anleitungen zum Binden dieses Derivats an ein anderes Molekül ein. In einer anderen Ausführungsform schließt das Kit eine SL-markierte Nucleinsäure, die gegebenenfalls auch mit einem zweiten Fluorophor oder Quencher markiert ist, und Anweisungen zur Verwendung dieser Nucleinsäure in einem oder mehreren Assay-Format(en) ein. Andere Formate für Kits sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Die Erfindung liefert Kits zur praktischen Durchführung der oben beschriebenen Verfahren. Die Kits können irgendwelche der oben beschriebenen Zusammensetzungen einschließen und schließen gegebenenfalls weiter zusätzliche Komponenten wie beispielsweise Anweisungen zur praktischen Durchführung der Verfahren, einen oder mehrere Behälter oder Kompartimente (z.B. zum Halten der Assay-Komponenten, Nuclein säuren, Antikörper, Inhibitoren oder dergleichen), eine Roboter-Armatur zum Mischen von Kit-Komponenten oder dergleichen ein.
  • Die Erfindung stellt auch integrierte Systeme zur Durchführung der Verfahrensweisen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen offenbart sind, bereit. Beispielsweise wird bei der Durchführung von Assays in einer Ausführungsform das Liefern individueller Verbindungen oder Verbindungs-Komponenten bewirkt mittels einer Roboter-Armatur, die Fluid aus einer Quelle zu einem Bestimmungsort überträgt, eine Steuer-Einrichtung, die die Roboter-Armatur steuert, einen Markierungs-Detektor, eine Datenspeicher-Einheit, die den Markierungs-Nachweis aufzeichnet, und eine Assay-Komponente wie beispielsweise eine Mikrotiter-Platte, die eine Vertiefung umfaßt. Wenn eine markierte Verbindung verwendet wird, wird sie mittels der Markierungs-Nachweis-Einheit nachgewiesen.
  • Eine Zahl von Roboter-Fluid-Übertragungs-Systemen ist erhältlich oder kann einfach aus bestehenden Komponenten hergestellt werden. Beispielsweise kann eine automatisierte Roboter-Einheit mit der Bezeichnung Zymate XP (Firma Zymark Corporation, Hopkinton, MA) unter Verwendung einer Mikrolab 2200-Pipettier-Station (Firma Hamilton, Reno, NV) zum Übertragen von parallelen Proben in mit 96 Vertiefungen versehene Mikrotiter-Platten verwendet werden, um einige parallel ablaufende gleichzeitige Ligations-Reaktionen in Gang zu setzen.
  • Optische Amplifikation
  • Optische Signale sind wichtig zur Übertragung von Information. Jedoch tritt immer dann, wenn ein optisches Signal durch eine optische Faser übermittelt wird, in bestimmtem Umfang eine Abschwächung ein, so daß es nötig ist, das Signal nach einer bestimmten Distanz (typischerweise in der Größenordnung von etwa 50 bis 100 km) zu verstärken bzw. zu amplifizieren. Üblicherweise wird für diesen Zweck eine elektronische Verstärker-Einheit verwendet. In der Verstärker-Station muß das optische Signal dann in ein elektrisches Signal umgewandelt werden, das in einer elektronischen Ver stärker-Einheit verstärkt wird, wonach das verstärkte elektrische Signal zurück in ein optisches Signal umgewandelt wird. Dies schließt nicht nur den Nachteil ein, daß eine Verstärker-Station eine ziemlich komplizierte Struktur mit einer recht großen Zahl von Teilen aufweist unter denen Konverter von optischen in elektrische Signale und Konverter von elektrischen in optische Signale sind, sondern dies impliziert auch, daß die Bandbreite und Bit-Rate des Gesamt-Systems durch die elektronischen Komponenten beschränkt ist. Daher wurden jüngst Verstärker mit optischen Fasern entwickelt, d.h. Verstärker, die das optische Signal direkt verstärken und nicht eine Umwandlung in ein elektrisches Signal erfordern. Solche Vorrichtungen sind beispielsweise offenbart in dem US-Patent Nr. 5,982,973, Patentinhaber Yan et al., erteilt am 9. November 1999; US-Patent Nr. 5,928,222, erteilt an Kleinerman, erteilt am 27. Juli 1999, sowie die Druckschriften „Desurvire, Physics Today, Januar 1994, Seiten 20–27" und „Sloof et al., J. Appl. Phys., 83, 497 (1998)."
  • So stellt in einer weiteren Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Substrat für die Übertragung und Verstärkung (Amplifikation) von Licht bereit, wobei das Substrat eine Verbindung gemäß der Erfindung umfaßt. Die Verbindung gemäß der Erfindung kann in das Substrat in jeder beliebigen An und Weise einbezogen werden, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) kovalente Bindung, Beschichtung, Dotierung und dergleichen. Dieses Substrat ist auch nützlich zur Umwandlung von UV-Licht in sichtbares Licht.
  • Das Substrat kann irgendein Material einschließen, das für eine besondere Anwendung nützlich ist, einschließlich (nicht jedoch beschränkt auf) Glas, organische Polymere, anorganische Polymere und Kombinationen daraus.
  • Bereitgestellt wird auch ein Verfahren zur Verstärkung (bzw. Amplifikation) von Licht, das durch das Substrat übertragen wird, das mit einer Verbindung der Erfindung derivatisiert wurde, wie dies oben beschrieben ist. Das Verfahren umfaßt das Übertragen von Licht durch ein Substrat, wodurch das Licht verstärkt wird.
  • Die Substrate und Verfahrensweisen der Erfindung können in Faser-optischen Vorrichtungen, Sensoren (siehe beispielsweise Kopelman et al., US-Patent Nr. 5,627,922; und Pinkel et al., US-Patent Nr. 5,690,894), Faser-optischen „Kühlschränken" und dergleichen verwendet werden.
  • Medizinische Anwendungen
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können auch verwendet werden, um maligne Tumore über eine photodynamische Therapie (photodynamic therapy; PDT) zu behandeln. Darüber hinaus können die Komplexe gemäß der Erfindung in vivo und in vitro als chelatisierende Mittel verwendet werden für (1) bestimmte paramagnetische Metall-Ionen zur Erreichung von höherem Kontrast bei Magnetresonanz-Bildgebungsverfahren (magnetic resonance imaging; MRI); und (2) radioaktive Metall-Ionen für die Bildgebung bei Tumoren in der Ein-Photonen-Emissions-Tomographie (single photon emission tomography; SPECT) oder der Positions-Emissions-Tomographie (position emission tomography; PET) und/oder bei einer Radioisotop-vermittelten Strahlungstherapie. So können passend radiomarkierte Salicylamidyl-Chelate nicht-invasiv in der Nuklearmedizin abgebildet werden, wofür man SPECT oder PET verwendet. Verwiesen wird beispielsweise auf Margerum et al., US-Patent Nr. 6,010,681; und Woodburn et al., US-Patent Nr. 6,022,526.
  • Trennungen
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Spezifität der Verbindungen gemäß der Erfindung für besondere Ionen in Lösung ausgenutzt, um diese Ionen von anderen gelösten Substanzen, einschließlich Ionen, abzutrennen, für die eine Verbindung gemäß der Erfindung eine niedrigere Affinität oder Spezifität hat. Viele Beispiele von Ionen-selektiven oder Ionen-spezifischen Chelatisierungsmitteln sind im Stand der Technik bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Izatt et al., SYNTHESIS OF MACROCYCLES, Wiley-Interscience, New York, 1987" und „Mar tell et al., DETERMINATION AND USE OF STABILITY CONSTANTS, 2. Ausgabe, VCH Publishers, New York, 1992".
  • Die Materialien, Verfahrensweisen und Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden weiter durch Beispiele veranschaulicht, die folgen. Diese Beispiele werden angegeben, um die beanspruchte Erfindung zu veranschaulichen, nicht jedoch um sie zu beschränken.
  • Beispiele
    • Beispiel 1 beschreibt die Synthese und die Metalligierung des Liganden TRENSAM.
    • Beispiel 2 beschreibt die spektrophotometrische Titration von TRENSAM.
    • Beispiel 3 beschreibt die Röntgenstruktur-Bestimmung von Tb-TRENSAM.
    • Beispiel 4 beschreibt die Synthese eines vielseitigen Ausgangsmaterials für die Liganden gemäß der Erfindung.
    • Beispiel 5 beschreibt die Synthese von einigen Liganden gemäß der Erfindung, die Grundgerüste variabler Länge aufweisen.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt detailliert die Synthese und die Metallisierung des Liganden TRENSAM. Diese Synthese ist in 1 aufgezeichnet.
  • 1.1 Materialien und Verfahrensweisen
  • Solange nichts anderes angegeben ist, wurden die Ausgangsmaterialien von kommerziellen Lieferanten erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Eine Flash-Säulen-Chromatographie wurde durchgeführt unter Verwendung des Materials Silica Gel 40 – 70 mesh der Firma Merck. Mikroanalysen wurden vom Mikroanalytical Services Laboratory des College of Chemistry der University of Kalifornia, Berkeley, durchgeführt. Massenspektren wurden aufgezeichnet im Maß Spectrometry Laboratory des College of Chemistry der University of Kalifornia, Berkeley. 1H- und 13C-NMR-Spektren wurden aufgezeichnet auf einem Gerät der Bezeichnung AMX 300- oder AMX 400-Bruker-Superconducting Fourier Transform Spectrometer oder auf einem Gerät mit der Bezeichnung DRX 500-Bruker Superconducting Digital Spectrometer. Infrarot-Spektren wurden gemessen unter Verwendung eines Geräts mit der Bezeichnung Nicolet magna IR 550 Fourier Transform Spectrometer.
  • 1.2 Synthese von Tris[(2-hydroxybenzoyl-)2-aminoethyl-]amin (TRENSAM), 1
  • Methylsalicylat (78 mMol) wurde mit destilliertem TREN (17 mMol) gemischt. Die Mischung wurde in ein verschlossenes Gefäß gegeben und bei 100 °C über Nacht erhitzt. Das resultierende dicke Öl wurde auf einer Kieselgel-Säule gereinigt und mit 0 – 4 % MeOH in CH2Cl2 eluiert, was nach Entfernen des Lösungsmittels zu einem weißen Pulver führte. Trocknen über Nacht im Vakuum ergab ein farbloses Glas. Ausbeute: 47 %. IR (KBr) 1.543, 1.590, 1.636 cm–1. 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, 25°C), 2,78 (t, 3J = 6,2 Hz, 6H, CH2), 3,49 (t, 3J = 6,2 Hz, 6H, CH2), 6,68 (t, 3J = 7,2 Hz, 3H, ArH), 6,80 (d, 3J = 7,4 Hz, 3H, ArH), 7,23 (t, 3J = 5,8 Hz, 3H, ArH), 7,63 (d, 3J = 6,4 Hz, 3H, ArH), 8,44 (t, br, 3H, NH), 13C-NMR (400 MHz, CD3OD, 25°C), 39,0 (CH2), 54,6 (CH2), 117,1 (Ar), 118,4 (Ar), 120,2 (Ar), 129,0 (Ar), 134,7 (Ar), 160,9 (ArCO), 170,9 (C=O), Analyse: berechnet (gefunden) für C27H30N4O6: C, 64,02 (63,94); H, 5,97 (5,97); N, 11,06 (11,01).
  • 1.3 Synthese von Tb-TRENSAM
  • TRENSAM (0,12 mMol) wurde in 5 ml MeOH gelöst, und dem wurde das Lanthanid (0,06 mMol; TbCl3) als Salz zugesetzt, gefolgt von einem Überschuß an Pyridin (0,3 ml). Der Zusatz des Tb3+ ergab eine stark grün gefärbte Lösung, wenn sie mit UV-Licht (254 und 365 nm) bestrahlt wurde. Nach Rühren für 15 h wurde die Lösung mit Et2O (50 ml) verdünnt, und es schied sich ein weißer Feststoff (42 mg) ab, der durch Filtration gewonnen wurde.
  • Eine Synthese der Metall-Komplexe wurde durchgeführt unter Suspendieren des Liganden in Methanol und anschließende Zugabe des geeigneten Lanthaniden-Salzes. Nach Mischen wurde ein Überschuß Base zugesetzt (Pyridin), und die Reaktionsmischung wurde für einige weitere Stunden gerührt. Die Bildung der Metallkomplexe kann überwacht werden durch Bestrahlen der wässrigen Reaktionsmischungen mit einer UV-Lampe (254 und 365 nm). Bei Bestrahlen emittiert die Reaktionsmischung des Tb3+-Komplexes hellgrünes Licht. Die Farbe ist in einfacher Weise mit dem bloßen Auge sichtbar. Die Lumineszenz des Tb3+-Komplexes bleibt sehr hell nach Isolieren und Trocknen der Verbindung.
  • 1.4 Verhalten in Lösung
  • Die mit dem Liganden TRENSAM gebildeten Komplexe haben eine geringere Wasserlöslichkeit, verglichen mit denjenigen, die mit zweifach gecapptem TRENSAM gebildet werden. Aus diesem Grund wurde die Stabilität und die Natur der gebildeten Komplexe in Methanol aus praktischen Gründen gemessen. Die Komplexe sind nichtsdestoweniger löslich in Wasser, wie durch die sehr stark grüne Lumineszenz des Komplexes in Wasser offengelegt wurde, die mit dem bloßen Auge beobachtet werden kann. Diese Beobachtung wurde gemacht als Teil der spektrometrischen Titration, die in Beispiel 2 beschrieben ist.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel erläutert im einzelnen die spektrophotometrische Titration von TRENSAM.
  • 2.1. Materialien und Verfahrensweisen
  • Batch-Titrations-Proben wurden in MeOH (analytische Reinheit) hergestellt. Die Proben wurden bei 37 °C 15 h lang vor der Messung inkubiert, um sicherzustellen, daß ein thermodynamisches Gleichgewicht erreicht worden war. Die Liganden-Konzentration betrug bei allen Proben 2,18 × 10–5 M, und das TbCl3 wurde von 0 bis 2,3 Äquivalenten titriert. Die Spektren wurden auf einem Doppelstrahl-Perkin-Elmer-Lambda 9 UV-Visible-Spektrophotometer in einer 1,0 cm-Quarz-Suprasil-Zelle aufgezeichnet. Die Proben wurden bei einer konstanten Temperatur von 25,0 ± 0,2 °C unter Verwendung eines Neslab-RTE-111-Wasserbades gehalten. Die Behandlung der Daten erfolgte unter Verwendung des Software-Pakets SPECFIT 2.10 (Gampp et al., Talanta, 33, 943 (1986)).
  • 2.2 Ergebnisse
  • Das Experiment wurde in Form einer Batch-Titration durchgeführt. Die Faktor-Analyse der erhaltenen Spektren ist besonders klar und zeigt ohne irgendwelche Zweideutigkeit das Vorhandensein von nur zwei absorbierenden Spezies an, was anzeigt, daß nur eine An von Komplex in Lösung mit diesem Ligand gebildet wird. Das Passen der Daten in Übereinstimmung mit dem Modell von Gleichung (1) bestätigt das Vorhandensein von nur einem Typ von Komplex in Lösung und erlaubt die Identifizierung als ML-Spezies. Die Stabilität dieses Komplexes ist niedrig.
  • Figure 01030001
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel erläutert im Detail die Röntgen-Struktur-Bestimmung von Tb-TRENSAM.
  • 3.1 Materialien und Verfahrensweisen
  • Alle Röntgenstruktur-Datensätze wurden auf einem Siemens SMART Area Detector Diffractometer (SMART; Area-Detector-Software package, Siemens Industrial Automation, Inc.; Madison, 1994) gesammelt. Kristalle wurden auf Quarz-Kapillaren in Paratone-Öl montiert und wurden in einem Stickstoffstrom auf dem Diffraktometer gekühlt. Eine Peak-Integration erfolgte unter Verwendung des Siemens SAINT-Softwarepackets (SAINT; SAX Area Detector Integration Program, Version 4.024; Firma Siemens Industrial Automation, Inc., Madison, 1994). Bestimmungen der Raumgruppen erfolgten mit der Software XPREP. Die Strukturen wurden gelöst durch direkte Verfahren und wurden verfeinert unter Verwendung des SHELXTL-Software-Pakets (PC- Version SHELXTL; Crystal Structure Analysis Determination Package, Firma Siemens Industrial Automation, Inc., Madison, 1994). Alle Wasserstoff-Atome wurden an den berechneten Positionen fixiert, und ihre thermischen Parameter wurden isotrop verfeinert. Alle Nicht-Wasserstoff-Atome wurden anisotrop verfeinert.
  • 3.2 Ergebnisse
  • Während der Kristallisations-Versuche wurde der Komplex Tb[TRENSAM]2 + erhalten durch Co-Präzipitation mit Tb(NO3)3.
  • Überraschenderweise offenbarte die gelöste Struktur einen ML2-Komplex mit vielen Ähnlichkeiten zur Struktur von [Eu(bicapped TRENSAM)2]+. Das Tb3+-Metall-Zentrum ist achtzähnig und in einer mehr verzerrten, quadratisch antiprismatischen Geometrie koordiniert. Die nicht-chelatisierten Salicylat-Arme zeigen von dem Kation weg und schützen es nicht weiter gegen Koordination durch Lösungsmittel.
  • Wie im Fall von [Eu(bicapped TRENSAM)2]+ arrangieren sich die beiden Liganden nicht in orthogonaler Weise. Es gibt vier Möglichkeiten, die beiden Liganden um das Metall-Ion zu arrangieren, um eine Koordinationszahl von 8 zu haben: Zwei orthogonale Anordnungen, eine Möglichkeit, in der die beiden Grundgerüste um ein Inversionszentrum übereinander gelagert sind, das auf dem Tb3+-Atom lokalisiert ist, und eine Möglichkeit, bei der die beiden Grundgerüste nächstmöglich zusammen sind. Ein Beispiel der zuletzt beschriebenen Möglichkeit wurde mit dem Komplex [Tb(TRENSAM)2]+ gefunden, bei dem die Nähe der beiden dreifüßigen Grundgerüste jedes Liganden die sterischen Wechselwirkungen zwischen den beiden nichtchelatisierenden Armen maximiert. Die Erklärung kann in der Wiedergabe der Kristallstruktur gefunden werden, die die beiden copräzipitierten Tb(NO3)3-Moleküle einschließt. Jedes Tb3+-Atom dieses Nitrats präsentiert zwei Wechselwirkungen mit dem phenolischen koordinierenden Sauerstoff eines koordinierten Liganden des ML2-Komplexes. Diese besonderen Wechselwirkungen sind wahrscheinlich hauptsächlich verantwortlich für die Orientierung eines Liganden im Vergleich zu dem anderen.
  • Die Röntgenkristall-Struktur entspricht nicht der Hauptspezies, die in Lösung zugegen ist, sondern dem am meisten unlöslichen Komplex, der unter speziellen experimentellen Bedingungen isoliert wurde.
  • Beispiel 4
  • Beispiel 4 beschreibt die Synthese eines vielseitigen Ausgangsmaterials für Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 4.1 Methyl-2-methoxy-3-methylbenzoat, 2
  • Einer Mischung von 3-Methylsalicylsäure (1,32 Mol) und wasserfreiem Kaliumcarbonat (3,6 Mol), gelöst in 3,5 1 trockenen Acetons in einem 5 l-Rundboden-Kolben wurde Dimethylsulfat (2,2 Mol) in mehreren Schritten zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht am Rückfluß erhitzt, und die Reaktion wurde durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) überwacht. Nach Filtration der Reaktionsmischung wurden die Lösungsmittel des Filtrats verdampft, und 2,15 g eines blaßgelben dicken Öls wurden als Rohprodukt erhalten; Ausbeute: 91 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 2,263 (s, 3H, CH3), 3,782 (s, 3H, OCH3), 3,854 (s, 3H, OCH3), 6,984 (t, J = 7,5, 1H, ArH), 7,276 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 7,582 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 15,72, 51,81, 61,17, 123,26, 124,36, 128,86, 132,46, 134,88, 158,16, 166,61.
  • 4.2 2-Methoxy-3-methyl-benzoesäure, 3
  • Einer Lösung von 2 (1,19 Mol) in einer Mischung von Methanol (2 l) und Wasser (0,5 l) wurden Kaliumhydroxid-Pellets (100 g; 1,5 Mol) unter Kühlung zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht am Rückfluß erhitzt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (0,5 l) gelöst und mit 6 N HCl angesäuert. Das Produkt wurde ausgefällt, und 1,89 g des Produktes wurden in Form weißer Kristalle gewonnen. Ausbeute: 95 %. 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 2,234 (s, 3H, CH3), 3,717 (s, 3H, OCH3), 7,062 (t, J = 7,5, 1H, ArH), 7,365 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 7,496 (d, J = 7,5, 1H, ArH).
  • 4.3 2-Methoxy-isophthalsäure, 4
  • 3 (0,45 Mol) wurde in 4 l Wasser in einem 5 l-Kolben suspendiert, der mit einem mechanischen Rührer und einem Heizmantel ausgerüstet war. Unter Zugabe von Natriumhydroxid (0,5 Mol) wandelte sich die Reaktionsmischung in eine klare Lösung um. Die Lösung wurde dann auf 75 °C erhitzt, und Kaliumpermanganat (1 Mol) wurde in kleinen Mengen über einen Zeitraum von 6 h zugesetzt. Die resultierende braune Aufschlämmung wurde über Nacht gerührt, und die Temperatur der Reaktionsmischung wurde im Bereich von 80 – 85 °C gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wurde durch Protonen-NMR überwacht (in D2O-NaOD). Die Aufschlämmung wurde dann filtriert und so MnO2 entfernt, und das Filtrat wurde mit konzentrierter HCl angesäuert. Ein kristallines Produkt begann langsam auszufallen. 75 g eines reinen Produkts wurden durch Filtration in Form schneeweißer Kristalle gewonnen; Ausbeute: 85 %. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C) δ: 3,79 (s, 3H, CH3), 7,243 (t, J = 7,5, 1H, ArH), 7,794 (d, J = 7,5, 2H, ArH).
  • 4.4 Dimethyl-2-methoxyisophthalat, 5
  • 4 (0,75 Mol) und wasserfreies Kaliumcarbonat (3,0 Mol) wurden in 3,5 1 trockenen Acetons in einem 5 l-Rundboden-Kolben gegeben. Dimethylsulfat (2,5 Mol) wurden in einigen Schritten zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht am Rückfluß erhitzt, und die Reaktion wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) überwacht. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, und die Lösungsmittel des Filtrats wurden verdampft. Es wurden 153 g eines blaßgelben dicken Öls als Rohprodukt erhalten; Ausbeute: 91 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 3,922 (s, 6H, OCH3), 3,926 (s, 3H, OCH3), 7,197 (t, J = 7,5, 1H, ArH), 7,913 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 52,17, 63,45, 123,25, 126,38, 159,41, 165,85.
  • 4.5 Monomethyl-2-methoxyisophthalsäure, 6
  • Eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid (5 M, 100 ml) wurde unter Kühlung einer Lösung von 5 (0,5 Mol) in Methanol (1,5 l) zugesetzt. Die Mischung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in heißem Aceton (2 l) gelöst. Eine dicke Paste fiel aus der Aceton-Lösung über Nacht aus (Raumtemperatur). Dünnschicht-Chromatographie (TLC) ergab, daß die obere Aceton-Lösung hauptsächlich den Ausgangs-Diester und das Mono-Natriumsalz der Säure enthielt und daß die untere Paste eine Mischung aus dem Mono-Natrium- und dem Dinatrium-Salz der Säure war. Aceton wurde von beiden Fraktionen entfernt, und die chromatographische Trennung auf einer mit einem Gradienten versehenen Flash-Silicagel-Säule (0 – 3 % Methanol in CH2Cl2) beider Fraktionen ergab 40 g des gewünschten Produkts; Ausbeute: 63 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 3,913 (s, 3H, OCH3), 3,982 (s, 3H, OCH3), 7,252 (t, J = 7,75, 1H, ArH), 7,991 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 8,166 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C), δ: 52,48, 64,09, 124,10, 125,67, 136,38, 136,49, 159,76, 165,46, 167,69.
  • 4.6 Methyl-2-methoxy-1-(2-mercaptothiazolid-isophthalamid), 8
  • Eine Aufschlämmung von 6 (10,5 g; 0,05 Mol) in Toluol (100 ml) wurden Oxalylchlorid (9,1 g; 0,08 Mol) und ein Tropfen DMF unter Rühren zugesetzt. Die Mischung veränderte sich zu einer klaren Lösung, die unter Rühren 6 h lang gehalten wurde. Die flüchtigen Komponenten wurden unter verringertem Druck entfernt, und das rohe Methyl-2-methoxy-1-(2-mercaptodiazolid-)isophthalsäuremonochlorid wurde in Form eines blaß-gelben Öls erhalten, und dieses wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Einer Lösung dieses Monosäure-Chlorids in trockenem THF (100 ml) wurden 2-Mercaptothiozalin (7,2 g; 0,6 Mol) und 20 ml Triethylamin in 100 ml trockenem TAF tropfenweise unter Rühren und Kühlung zugesetzt. Die resultierende gelbe Aufschlämmung wurde zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde mit 1 N HCl und 1 N KOH aufeinanderfolgend extrahiert. 14 g des reinen Monothiazolids wurden nach Flash-Silicagel-Reinigung erhalten; Ausbeute: 89 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 3,377 (t, J = 7,5, 2H, CH2), 3,850 (s, 3H, OCH3), 3,869 (s, 3H, OCH3), 4,604 (t, J = 7,5, 2H, CH2), 7,137 (t, J = 7,5, 1H, ArH), 7,421 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 7,862 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 29,97, 52,21, 55,40, 63,16, 123,41, 124,14, 130,55, 132,66, 133,84, 156,98, 165,63, 167,17, 201,12. Analyse berechnet (gefunden) für C13H13NO4S2 · H2O (MW: 329,396): C, 47,40 (47,02); H, 3,98 (3,78): N, 4,25 (4,11).
  • Beispiel 5
  • Beispiel 5 veranschaulicht die Synthese einiger Liganden gemäß der Erfindung, in denen die Grundgerüste der Liganden von variabler Länge sind, und die Bildung von Lanthaniden-Komplexen dieser Liganden.
  • 5.1 Me8H22IAMC, 9
  • 8 (4,8 Mol) wurde einer Lösung von H(2,2)-Amin (1 mMol) in CH2Cl2 (50 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde gerührt, und der Fortschritt der Reaktion wurde durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) überwacht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit einem Gradienten versehene Flash-Silicagel-Säule aufgebracht (2 – 7 % CH3OH in CH2Cl2), und die passenden Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft. 0,8 g Produkt wurde in Form eines weißen Schaums gewonnene Ausbeute: 79 %. MS (FAB+, m/e) 1.001,6. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 2,699 (s, 4H, CH2), 2,718 (t, 8H, J = 6,4, CH2), 3,479 (q, J = 6,4 8H, CH2), 3,771 (s, 12H, CH3), 3,798 (s, 12H, CH3), 7,109 (t, 3H, J = 7,5, ArH), 7,770 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 7,900 (d, 4H, J = 5,4, Amid-H), 7,985 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 37,59, 51,74, 52,12, 53,25, 63,21, 123,94, 124,80, 128,24, 134,11, 135,10, 157,73, 164,74, 165,53.
  • 5.2 Me8H32IAMC, 10
  • Diese Verbindung wurde nach derselben Verfahrensweise wie Verbindung 9 hergestellt, mit der Ausnahme, daß H(3,2)-Amin anstelle von H(2,2)-Amin verwendet wurde; Ausbeute: 79 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 1,789 (quint, J = 6,5, 4H, CH2), 2,675, (t, 4H, J = 7,5, CH2), 2,801 (t, 8H, J = 6,5, CH2), 3,583 (q, J = 6,5, 8H, CH2), 3,823 (s, 9H, CH3), 3,854 (s, 9H, CH3), 3,896 (s, 3H, CH3), 3,922 (s, 3H, CH3), 7,154 (t, 3H, J = 7,5, ArH), 7,178 (t, 1H, J = 7,5, ArH), 7,824 (d, 3H, J = 7,5, ArH), 7,906 (d, 1H, J = 7,5, ArH), 7,9 – 8,1 (m, 8H, ArH + Amid-H), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 37,35, 51,91, 52,29, 52,39, 52,78, 63,39, 63,86, 123,99, 124,11, 125,03, 125,22, 128,45, 134,29, 135,13, 135,26, 135,78, 157,95, 165,11, 165,72.
  • 5.3 Me8H42IAMC, 11
  • Diese Verbindung wurde nach derselben Verfahrensweise wie Verbindung 10 hergestelltstellt, mit der Ausnahme, daß H(4,2)-Amin anstelle von H(3,2)-Amin verwendet wurde; Ausbeute: 82 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 1,483 (s, br, 4H, CH2), 2,597, (s, br, 4H, CH2), 2,753 (t, 8H, J = 6,5, CH2), 3,549 (q, J = 6,5, 8H, CH2), 3,832 (s, 9H, CH3), 3,866 (s, 9H, CH3), 3,909 (s, 3H, CH3), 3,943 (s, 3H, CH3), 7,172 (t, 4H, J = 7,5, ArH), 7,837 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 7,959 (t, 4H, J = 5,5, Amid-H), 8,067 (d, J = 7,5, 4H, ArH), 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ: 24,15, 37,67, 52,30, 52,41, 52,84, 53,37, 53,84, 63,39, 63,91, 124,07, 124,14, 125,18, 128,36, 134,35, 135,37, 135,87, 157,97, 158,89, 164,97, 165,66, 165,71.
  • 5.3. H22IAMC, 12
  • Mc8H(2,2)IAMC (1,0 g; 1 mMol) wurde gelöst in trockenem, gasfreiem CH2Cl2 (40 ml). Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und BBr3 (2 ml; 23 mMol) wurde über eine Spritze unter Stickstoff zugesetzt. Die resultierende blass-gelbe Aufschlämmung wurde für 96 h gerührt, wonach die flüchtigen Komponenten unter Vakuum entfernt wurden und der Rückstand mit Methanol gequencht wurde (30 ml). Die Methanol-Lösung wurde mit Wasser (40 ml) verdünnt und unter Sieden erhitzt, bis eine transparente Lösung erhalten wurde. Die Lösung wurde filtriert, und ein weißer Niederschlag setzte sich bei Kühlen ab, der durch Filtration gewonnen und im Vakuum getrocknet wurde; Ausbeute: 50 %. 1H-NMR (500 MHz, D2O-NaOD, 25 °C) δ: 2,757 (t, 12H, J = 7,2, NCH2), 3,269 (t, 8H, J = 7,2, NCH2), 6,220 (t, J = 7,5, 4H, ArH), 7,045 (d, J = 7,5, 4H, ArH), 7,508 (d, J = 7,5, 4H, ArH).
  • 5.4 H32IAMC, 13
  • Diese Verbindung wurde nach demselben BBr3-Schutzgruppen-Entfernungs-Verfahren hergestellt wie Verbindung 12, mit der Ausnahme, daß Me8H32IAMC anstelle von Me8H22IAMC verwendet wurde; Ausbeute: 65 %. MS (FAB+, m/e) 903, 1H-NMR (500 MHz, D2O-NaOD, 25 °C) δ: 1,575 (s, br, 2H, CH2), 2,453 (t, J = 7,2, 4H, CH2), 2,636 (t, 8H, J = 7,2, NCH2), 3,358 (t, 8H, J= 7,2, NCH2) 6,324 (t, J = 7,5, 4H, ArH), 7,148 (d, J = 7,5, 4H, ArH), 7,611 (d, J = 7,5, 4H, ArH), 13C-NMR (500 MHz, D2O- NaOD, 25 °C) δ: 24,35, 36,19, 52,32, 111,71, 118,86, 129,92, 131,52, 133,14, 166,59, 170,81, 178,98.
  • 5.5. H42IAMC, 14
  • Diese Verbindung wurde nach dem BBr3-Schutzgruppen-Entfernungsverfahren wie Verbindung 12 hergestellt, mit der Ausnahme, daß Me8H42IAMC anstelle von Me8H22IAMC verwendet wurde; Ausbeute: 61 %. 1H-NMR (500 MHz, D2O-NaOD, 25 °C) δ: 1,349 (s, br, 4H, CH2), 2,349 (s, br, 4H, CH2), 2,651 (t, 8H, J = 7,2, NCH2), 3,428 (t, 8H, J = 7,2, NCH2), 6,442 (t, J = 7,5, 4H, ArH), 7,250 (d, J = 7,5, 4H, ArH), 7,732 (d, J = 7,5, 4H, ArH).
  • 5.6 Tb[H42IAMC]
  • 12 wurde in 17 ml einer Lösung aus MeOH suspendiert, die Tb(NO3)3 · 6H2O enthielt (0,047 mMol, 99,999 %). Die Suspension wurde unter Rückfluß erhitzt. 45 Tropfen Pyridin wurden der Suspension zugesetzt, und es erschien ein Niederschlag, der die Menge an Feststoff in der Reaktionsmischung erhöhte. Eine starke Grün-Emission der Lösung wurde bei UV-Bestrahlung beobachtet. Nach 6 Stunden der Behandlung am Rückfluß wurde das Lösungsmittel entfernt. 18 ml H2O und 10 Tropfen Pyridin wurden dem Feststoff zugesetzt, und die resultierende Suspension wurde unter Rückfluß 15 h lang gerührt. Das Produkt wurde filtriert und mit Et2O gewaschen. Nach Abkühlen, Filtration und Trocknen des Feststoffs (Vakuumofen) wurden 42 mg des Produkts gewonnen; Ausbeute: 72 %. Analyse berechnet (gefunden) für TbC44H45N6O16(HBr) · 3CH3OH: C 45,17 (45,20); H 4,68 (4,99); N 6,72 (6,88).

Claims (112)

  1. Lumineszierendes Lanthanidenmetall-Chelat, umfassend ein Metall-Ion der Lanthaniden-Reihe und ein komplexierendes Mittel, das wenigstens eine Salicylamidyl-Einheit umfaßt.
  2. Chelat nach Anspruch 1 mit einer Quantenausbeute von wenigstens 0,1.
  3. Chelat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Lanthanidenmetall-Ion ein aus Europium, Terbium und Kombinationen daraus gewähltes Mitglied ist.
  4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend weiter wenigstens eine Phthalamidyl-Einheit.
  5. Verbindung mit einer Struktur gemäß Formel I:
    Figure 01110001
    worin – R1 und R2 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Halogen und -OR6, worin R6 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung; – R4, R5, R7, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituierten Alkyl-Gruppen; – R2, R8 und R9 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl und substituierten Alkyl-Gruppen; – R11, R12, R13, R21, R22 und R23 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR14R15, -NO2, -OR16, -COOR17, worin R14, R15, R16 und R17 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R12 gegebenenfalls einen Ring mit R11 , R13 oder beiden bilden kann und R22 gegebenenfalls einen Ring mit R21, R23 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-, substituierten cyclischen Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Heterocyclyl- und gesättigten Heterocyclyl-Ringsystemen; und – Q1 für-OR18 steht; – Q2 für -OR19 steht; – worin R18 und R19 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung; und – a und z unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus 0 und 1; – mit der Maßgabe, dass dann, wenn a 0 ist, N1' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 1' gebunden ist, und dann, wenn z 0 ist, N2' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 2' gebunden ist.
  6. Verbindung nach Anspruch 5, worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C1- bis C10-Alkyl und substituiertem C1- bis C10-Alkyl.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C2- bis C6-Alkyl und substituiertem C2- bis C6-Alkyl.
  8. Verbindung nach Anspruch 5, worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit Aryl substituiertem Alkyl, mit substituiertem Aryl, substituiertem Alkyl und Kombinationen daraus.
  9. Verbindung nach Anspruch 5, worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit einer polycyclischen Aryl-Gruppe substituiertem Alkyl.
  10. Verbindung nach Anspruch 5, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 und Kombinationen daraus, ein primäres Alkylamin ist.
  11. Verbindung nach Anspruch 10, worin das primäre Alkylamin eine C1- bis C10-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in ω-Position trägt.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, worin das primäre Alkylamin eine C2- bis C6-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  13. Verbindung nach Anspruch 5, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 und Kombinationen daraus ein Polyether ist.
  14. Verbindung nach Anspruch 13, worin der Polyether eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomeren und Kombinationen daraus, worin der Polyether ein Molekulargewicht von 60 Dalton bis 10.000 Dalton aufweist.
  15. Verbindung nach Anspruch 14, worin der Polyether ein Molekulargewicht von 100 Dalton bis 1.000 Dalton aufweist.
  16. Verbindung nach Anspruch 5, worin R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10 und R20 und Kombinationen daraus Gruppen sind, die gewählt sind aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  17. Verbindung nach Anspruch 16, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel II aufweist:
    Figure 01140001
    worin – X eine Gruppe ist, die gewählt ist aus O, S und NR50, worin R50 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl; – Y eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und – j und k Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  18. Verbindung nach Anspruch 17, worin die Verbindung nach Anspruch 17, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel III aufweist:
    Figure 01140002
  19. Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 18, worin sowohl a als auch z 0 sind.
  20. Verbindung nach Anspruch 5, worin R3 ein linearer C1- bis C6-Kohlenwasserstoff ist.
  21. Verbindung nach Anspruch 5, worin z 0 ist.
  22. Verbindung nach Anspruch 21, worin – R8 für (CH2)P steht; – R4 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel IV aufweist:
    Figure 01150001
    worin – R19 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Halogen und -OR7, worin R7 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung; – R46 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus Alkyl und substituiertem Alkyl; – R31, R32 und R33 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR24R25, -NO2, -OR26, -COOR27, worin R24, R25, R26 und R27 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R32 gegebenenfalls einen Ring mit R31, R33 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ringsystemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-, substituierten cyclischen Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Heterocyclyl- und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen; – R3 für (CH2)X steht; – Q3 für -OR28 steht, worin R28 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung; und – P und X Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus den ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich.
  23. Verbindung nach Anspruch 22 mit einer Struktur gemäß Formel V:
    Figure 01160001
  24. Verbindung nach Anspruch 22, worin R29 und R46 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C1- bis C10-Alkyl und substituiertem C1- bis C10-Alkyl.
  25. Verbindung nach Anspruch 24, worin R29 und R46 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C2- bis C6-Alkyl und substituiertem C2- bis C6- Alkyl.
  26. Verbindung nach Anspruch 22, worin R29 und R46 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit Aryl, substituiertem Alkyl, mit substituiertem Aryl, substituiertem Alkyl und Kombinationen daraus.
  27. Verbindung nach Anspruch 22, worin R29 und R46 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit einer polycyclischen Aryl-Gruppe substituiertem Alkyl.
  28. Verbindung nach Anspruch 22, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R29 und R46 und Kombinationen daraus, ein primäres Alkylamin ist.
  29. Verbindung nach Anspruch 28, worin das primäre Alkylamin eine C1- bis C10-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  30. Verbindung nach Anspruch 29, worin das primäre Alkylamin eine C2- bis C6-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  31. Verbindung nach Anspruch 22, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R29 und R46 und Kombinationen daraus, ein Polyether ist.
  32. Verbindung nach Anspruch 31, worin der Polyether eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomeren und Kombinationen daraus, worin der Polyether ein Molekulargewicht von 60 Dalton bis 10.000 Dalton aufweist.
  33. Verbindung nach Anspruch 32, worin der Polyether ein Molekulargewicht von 100 bis 1.000 Dalton aufweist.
  34. Verbindung nach Anspruch 22, worin R29 und R46 und Kombinationen daraus Gruppen sind, die gewählt sind aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  35. Verbindung nach Anspruch 34, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel II aufweist:
    Figure 01180001
    worin – X eine Gruppe ist, die gewählt ist aus O, S und NR50, worin R50 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl; – Y eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und – j und k Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  36. Verbindung nach Anspruch 35, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Strukur gemäß Formel III aufweist:
    Figure 01180002
  37. Verbindung nach Anspruch 5, worin R4 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Gruppe substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel IV aufweist; R5 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel VI aufweist:
    Figure 01180003
    worin – R39 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Halogen und -OR7, worin R7 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, substituierten Alkyl-Gruppen und einer einzelnen negativen Ladung; – R45 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus Alkyl und substituiertem Alkyl; – R41, R42 und R43 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR34R35, -NO2, -OR36, -COOR37, worin R34, R35, R36 und R37 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl, und substituiertem Alkyl, worin R42 gegebenenfalls einen Ring mit R41, R43 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ringsystemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-, substituierten cyclischen Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Heterocyclyl- und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen.
  38. Verbindung nach Anspruch 37 mit einer Struktur gemäß Formel VII:
    Figure 01190001
    worin – M, N, P und Z Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich.
  39. Verbindung nach Anspruch 37, worin R39 und R45 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C1- bis C10-Alkyl und substituiertem C1- bis C10-Alkyl.
  40. Verbindung nach Anspruch 39, worin R39 und R45 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C2- bis C6-Alkyl und substituiertem C2- bis C6-Alkyl.
  41. Verbindung nach Anspruch 37, worin R39 und R45 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit Aryl substituiertem Alkyl, mit substituiertem Aryl substituiertem Alkyl und Kombinationen daraus.
  42. Verbindung nach Anspruch 37, worin R39 und R45 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit einer polycyclischen Aryl-Gruppe substituiertem Alkyl.
  43. Verbindung nach Anspruch 37, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R39 und R45 und Kombinationen daraus, ein primäres Alkylamin ist.
  44. Verbindung nach Anspruch 37, worin das primäre Alkylamin eine C1- bis C10-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  45. Verbindung nach Anspruch 44, worin das primäre Alkylamin eine C2- bis C6-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  46. Verbindung nach Anspruch 37, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R39 und R45 und Kombinationen daraus, ein Polyether ist.
  47. Verbindung nach Anspruch 46, worin der Polyether eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomeren und Kombinationen daraus, worin der Polyether ein Molekulargewicht von 60 Dalton bis 10.000 Dalton aufweist.
  48. Verbindung nach Anspruch 46, worin der Polyether ein Molekulargewicht von 100 Dalton bis 1.000 Dalton aufweist.
  49. Verbindung nach Anspruch 37, worin R39 und R45 und Kombinationen daraus Gruppen sind, die gewählt sind aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  50. Verbindung nach Anspruch 49, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel II aufweist:
    Figure 01210001
    worin – X eine Gruppe ist, die gewählt ist aus O, S und NR50, worin R50 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl; – Y eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und – j und k Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  51. Verbindung nach Anspruch 50, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel III aufweist:
    Figure 01220001
  52. Verbindung nach Anspruch 37 mit einer Struktur gemäß Formel VIII:
    Figure 01220002
  53. Verbindung nach Anspruch V, worin R eine Komponente eines Dendrimers umfaßt.
  54. Verbindung nach Anspruch 53 mit einer Struktur gemäß Formel IX:
    Figure 01220003
    worin – D ein Dendrimer ist; und – w eine Zahl ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 4 bis 100 einschließlich.
  55. Verbindung nach Anspruch 54, worin das Dendrimer ein Polypropylenimin-Dendrimer ist.
  56. Verbindung nach Anspruch 54, worin das Dendrimer von einer Generation ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Generation 2 bis Generation 10 einschließlich.
  57. Verbindung nach Anspruch 54, worin w eine Zahl ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen zwischen 8 und 50 einschließlich.
  58. Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 57, worin die Verbindung kovalent an ein Träger-Molekül gebunden ist.
  59. Verbindung nach Anspruch 58, worin das Träger-Molekül eine Verbindung ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus synthetischen Polymeren und Biomolekülen.
  60. Verbindung nach Anspruch 59, worin das Biomolekül eine Verbindung ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Antikörpern, Antigenen, Peptiden, Nucleinsäuren, Enzymen, Haptenen, Kohlenhydraten und pharmakologisch aktiven Mitteln.
  61. Komplex, gebildet zwischen einem Metall-Ion und der Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 60.
  62. Komplex nach Anspruch 61, worin der Komplex Lumineszenz emittiert.
  63. Komplex nach Anspruch 62, worin die Lumineszenz circular polarisierte Lumineszenz ist.
  64. Komplex nach Anspruch 62 oder Anspruch 63, worin die Lumineszenz durch elektrochemische Anregung des Komplexes produziert wird.
  65. Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 64, worin das Metall-Ion ein Ion der Lanthaniden-Reihe ist.
  66. Komplex nach Anspruch 65, worin das Lanthaniden-Ion ein Mitglied ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Terbium, Samarium, Europium, Dysprosium und Neodym.
  67. Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66, worin die Verbindung kovalent an ein Träger-Molekül gebunden ist.
  68. Verbindung nach Anspruch 67, worin das Träger-Molekül ein Molekül ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus synthetischen Polymeren und Biomolekülen.
  69. Verbindung nach Anspruch 68, worin das Biomolekül ein Molekül ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Antikörpern, Antigenen, Peptiden, Nucleinsäuren, Enzymen, Haptenen, Kohlenhydraten und pharmakologisch aktiven Mitteln.
  70. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe ein Enzym enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) die Probe mit einem Peptid-Konstrukt in Kontakt bringt, das umfaßt: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66; (ii) einen Quencher für Licht-Energie mit einer Absorptions-Bande, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt; und (iii) eine Spaltungs-Erkennungs-Stelle für das Enzym; worin sich das Peptid in einer Konformation befindet, die eine Fluoreszenz-Energie- Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) den Komplex anregt; und (c) eine Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe bestimmt, worin das Vorhandensein des Enzyms in der Probe zu einer Änderung der Fluoreszenz-Eigenschaft führt.
  71. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung die Aktivität eines Enzyms verändert, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) eine Probe, die das Enzym und die Verbindung umfaßt, mit einem Peptid-Konstrukt in Kontakt bringt, das umfaßt: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66; (ii) einen Quencher für Licht-Energie mit einer Absorptions-Bande, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt; und (iii) eine Spaltungs-Erkennungs-Stelle für das Enzym, worin sich das Peptid in einer Konformation befindet, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) den Komplex anregt; und (c) eine Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe bestimmt, worin die Aktivität des Enzyms in der Probe zu einer Änderung der Fluoreszenz-Eigenschaft führt.
  72. Verfahren zur Bestimmung einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) die Ziel-Sequenz mit einem Detektor-Oligonucleotid in Kontakt bringt, das eine einsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz umfaßt, wobei das Detektor-Oligonucleotid daran gebunden aufweist, (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66; (ii) einen Quencher für Licht-Energie, der eine Absorptions-Bande aufweist, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt, worin sich die Detektor-Nucleinsäure in einer Konformation befindet, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) die Ziel-Bindungs-Sequenz mit der Ziel-Sequenz hybridisiert und dadurch die Konformation des Detektor-Oligonucleotids ändert, was eine Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter hervorruft; und (c) die Änderung des Fluoreszenz-Parameters nachweist, wobei man dadurch die Nucleinsäure-Ziel-Sequenz nachweist.
  73. Verfahren nach Anspruch 72, worin das Detektor-Oligonucleotid ein Format aufweist, das gewählt ist aus molekularen Baken (molecular beacons), Skorpion-Sonden (scorpion probes), Sonnenaufgangs-Sonden (sunrise probes), Lichtan-Sonden (light up probes) und TagManTM-Sonden.
  74. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) mit der Ziel-Sequenz ein Detektor-Oligonucleotid hybridisiert, das eine einsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekulare assoziierte Sekundär-Struktur in 5'-Stellung zu der Ziel-Bindungs-Sequenz umfaßt, worin wenigstens ein Teil der Ziel-Sequenz einen einsträngigen Schwanz bildet, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz verfügbar ist, wobei das Detektor-Oligonucleotid daran gebunden aufweist (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66; (ii) einen Quencher für Licht-Energie, der eine Absorptions-Bande aufweist, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt, worin die Detektor-Nucleinsäure in einer Konformation vorliegt, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) in einer Primer-Ausdehnungs-Reaktion einen komplimentären Strang unter Verwendung der intramolekular assoziierten Sekundär-Struktur als Schablone synthetisiert und so die intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur dissoziiert und eine Änderung bei einem Fluoreszenz-Parameter hervorruft; (c) die Änderung des Fluoreszenz-Parameters nachweist und dadurch die Nucleinsäure-Ziel-Sequenz nachweist.
  75. Verfahren nach Anspruch 74, worin die intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur eine Struktur ist, die gewählt ist aus Haarnadeln (hair pins), Stamm-Schleife-Strukturen (stem-loop structures), Pseudoknoten (pseudoknots), Triple-Helices und konformationsmäßig unterstützten Strukturen.
  76. Verfahren nach Anspruch 74 oder Anspruch 75, worin der komplimentäre Strang in einer Ziel-Amplifikations-Reaktion synthetisiert wird.
  77. Verfahren nach Anspruch 74 oder Anspruch 75, worin der komplementäre Strang durch Ausdehnung der Ziel-Sequenz unter Verwendung des Detektor-Oligonucleotids als Schablone synthetisiert wird.
  78. Verfahren nach Anspruch 74, worin die intramolekular assoziierte Sekundärstruktur eine ganz oder teilweise einsträngige Endonuclease-Erkennungsstelle umfaßt.
  79. Verfahren nach einem der Ansprüche 74 bis 78, worin die Änderung der Fluoreszenz als Indikator der Gegenwart der Ziel-Sequenz nachgewiesen wird.
  80. Verfahren nach einem der Ansprüche 74 bis 79, worin der Fluoreszenz-Parameter in Real-Zeit nachgewiesen wird.
  81. Verfahren nach einem der Ansprüche 74 bis 80, worin die intramolekular Basengepaarte Sekundärstruktur einen Teilabschnitt der Ziel-Bindungs-Sequenz umfaßt.
  82. Verfahren zum Nachweis einer Amplifikation einer Ziel-Sequenz, umfassend in einer Amplifikationsreaktion die Schritte, dass man (a) mit der Ziel-Sequenz ein Detektor-Oligonucleotid hybridisiert, das eine einsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur in 5'-Stellung zu der Ziel-Bindungs-Sequenz umfaßt, wobei wenigstens ein Teil der Ziel-Sequenz einen einsträngigen Schwanz ausbildet, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz verfügbar ist, wobei das Detektor-Oligonucleotid daran gebunden aufweist, (i) einen Komplex nach Anspruch 61; (ii) einen Quencher für Licht-Energie, der eine Absorptions-Bande aufweist, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt, worin die Detektor-Nucleinsäure in einer Konformation vorliegt, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) das hybridisierte Detektor-Oligonucleotid auf der Ziel-Sequenz mit einer Polymerase ausdehnt und so ein Detektor-Oligonucleotid-Ausdehnungs-Produkt herstellt und das Detektor-Oligonucleotid-Ausdehnungs-Produkt von der Ziel-Sequenz abtrennt; (c) einen Primer mit dem Detektor-Oligonucleotid-Ausdehnungs-Produkt hybridisiert und den Primer mit der Polymerase ausdehnt und so die intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur linearisiert und eine Änderung eines Fluoreszenz-Parameters hervorruft; und (d) die Änderung des Fluoreszenz-Parameters nachweist und so die Ziel-Sequenz nachweist.
  83. Verfahren nach Anspruch 82, worin die Ziel-Sequenz nach einem Verfahren amplifiziert wird, das gewählt ist aus Strang-Verdrängungs-Amplifikation (strand displacement amplification), Polymerase-Kettenreaktion, 3SR, TMA und NASBA.
  84. Verfahren nach Anspruch 82 oder Anspruch 83, worin die Sekundärstruktur weiter eine partiell oder gänzlich einsträngige Restriktions-Endonuclease-Stelle umfaßt.
  85. Verfahren nach einem der Ansprüche 82 bis 84, worin eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität nachgewiesen wird.
  86. Verfahren nach Anspruch 85, worin die Änderung der Fluoreszenz-Intensität in Real-Zeit nachgewiesen wird.
  87. Verfahren nach einem der Ansprüche 82 bis 86, worin die intramolekular Basengepaarte Sekundärstruktur einen Teilabschnitt der Ziel-Bindungssequenz umfaßt.
  88. Verfahren zum Sicherstellen, ob eine erste Nucleinsäure und eine zweite Nucleinsäure hybridisieren, wobei die erste Nucleinsäure einen Komplex nach Anspruch 61 umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) die erste Nucleinsäure mit der zweiten Nucleinsäure in Kontakt bringt; (b) eine Änderung einer Fluoreszenz-Eigenschaft einer Verbindung nachweist, die gewählt ist aus der ersten Nucleinsäure, der zweiten Nucleinsäure und einer Kombination daraus, und so sicherstellt, ob die Hybridisierung stattfindet.
  89. Verfahren nach Anspruch 88, worin die zweite Nucleinsäure einen Quencher für Licht-Energie kovalent daran gebunden umfaßt.
  90. Microanordnung bzw. Microarray, umfassend einen Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66, wobei der Quencher direkt an einen festen Träger oder an ein Träger-Molekül konjugiert ist, das an dem festen Träger gebunden ist.
  91. Microarray nach Anspruch 90, worin das Trägermolekül ein Molekül ist, das gewählt ist aus Nucleinsäure, Peptid, Petid-Nucleinsäure und Kombinationen daraus.
  92. Microarray nach Anspruch 90, worin der feste Träger in einen ersten Bereich und einen zweiten Bereich geteilt ist, wobei der erste Bereich daran gebunden einen ersten Komplexe aufweist, der an ein ersten Träger-Molekül gebunden ist, und der zweite Bereich daran gebunden einen zweiten Komplex aufweist, der an ein zweites Träger-Molekül gebunden ist.
  93. Microarray nach Anspruch 92, worin die ersten und zweiten Träger-Moleküle Moleküle sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Nucleinsäuren, Peptiden und Peptid-Nucleinsäuren.
  94. Microarray nach Anspruch 92, worin der erste Quencher für Licht-Energie und der zweite Komplex unterschiedliche Strukturen aufweisen.
  95. Verfahren zum Testen eines Microarrays auf das Vorhandensein einer Verbindung, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) das Microarray mit einer Sonde in Kontakt bringt, die in Wechselwirkung mit der Verbindung tritt, wobei die Sonde einen Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66 umfaßt; (b) einen Unterschied einer Fluoreszenz-Eigenschaft einer Verbindung nachweist, die gewählt ist aus der Sonde, der Verbindung und Kombinationen daraus, und so die Gegenwart der Verbindung sicherstellt.
  96. Verfahren nach Anspruch 95, worin die Verbindung eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Nucleinsäuren, Peptiden, Peptid-Nucleinsäuren und Kombinationen daraus.
  97. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 61 bis 66 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Strahlen-Therapie, wobei der Komplex Radiosensibilisierungs-Eigenschaften aufweist.
  98. Verwendung eines photoempfindlichen Komplexes nach einem der Ansprüche 61 bis 66 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der photodynamischen Therapie einer Läsion oder einer durch melanodermes Gewebe verborgenen Läsion eines Subjekts.
  99. Verwendung nach Anspruch 98, worin die Licht-Einstrahlung eine Einstrahlung mit Licht eines Wellenlängen-Bereichs von 700 bis 900 Nanometern ist.
  100. Verwendung nach Anspruch 99, worin die Lichteinstrahlung eine Einstrahlung mit Licht eines Wellenlängen-Bereichs von 730 bis 770 Nanometern ist.
  101. Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66, worin die Verbindung eine Komponente einer Tinte oder einen Farbstoff umfaßt.
  102. Komplex nach einem der Ansprüche 61 bis 66, worin die Verbindung eine Komponente eines Substrats für die Transmission und Amplifikation von Licht umfaßt.
  103. Komplex nach Anspruch 102, worin das Substrat ein Material umfaßt, das gewählt ist aus Glas, organischen Polymeren, anorganischen Polymeren und Kombinationen daraus.
  104. Verfahren zum Amplifizieren von Licht, das von einem Substrat durchgelassen wird, wobei das Verfahren das Durchlassen von Licht durch ein Substrat nach Anspruch 102 und das dadurch erfolgende Amplifizieren bzw. Verstärken des Lichts umfaßt.
  105. Verfahren zur Durchführung eines Fluoreszenz-Assays einer zu analysierenden Substanz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, dass man (a) mit der zu analysierenden Substanz einen Bindungs-Partner aus einem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit verdrängt und so einen Komplex aus zu analysierender Substanz und Erkennungs-Einheit und einen freien Bindungs-Partner bildet, wobei der Bindungs-Partner und der freie Bindungs-Partner eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfassen; (b) einen Fluoreszenz-Komplex zwischen einem Lanthaniden-Ion und einer Verbindung bildet, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus dem Bindungs-Partner, dem freien Bindungs-Partner und Kombinationen daraus; und (c) den Fluoreszenz-Komplex nachweist.
  106. Verfahren nach Anspruch 105, worin die Erkennungs-Einheit, der Bindungs-Partner und die zu analysierende Substanz Verbindungen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus bioaktiven Materialien, Biomolekülen und Kombinationen daraus.
  107. Material nach Anspruch 106, worin das Biomolekül eine Verbindung ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Haptenen, Antikörpern, Antigenen, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, Peptiden, Enzymen und Rezeptoren.
  108. Verfahren nach einem der Ansprüche 105 bis 107, worin eine oder mehrere Verbindungen, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Erkennungs- Einheit, dem Bindungs-Partner und der zu analysierenden Substanz, an eine Oberfläche gebunden sind.
  109. Verfahren nach einem der Ansprüche 105 bis 108, worin der Fluoreszenz-Komplex vor dem Verdrängen des Bindungs-Partners aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit gebildet wird.
  110. Verfahren nach einem der Ansprüche 105 bis 108, worin der Fluoreszenz-Komplex nach dem Verdrängen des Bindungs-Partners aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit gebildet wird.
  111. Verfahren nach einem der Ansprüche 105 bis 110, welches weiter den Schritt umfaßt, dass man den freien Bindungs-Partner aus einer Verbindung der Gruppe abtrennt, die besteht aus dem Paar Erkennungs-Einheit-Bindungs-Partner, zu analysierendes Substanz-Erkennungs-Einheit und Kombinationen daraus.
  112. Verfahren nach Anspruch 111, worin der Fluoreszenz-Komplex im Anschluß an die Abtrennung gebildet wird.
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