DE60004704T2

DE60004704T2 - Kolloidale suspension von submikronischen teilchen als vektoren von aktiven prinzipien sowie deren herstellung

Info

Publication number: DE60004704T2
Application number: DE60004704T
Authority: DE
Inventors: Franck Touraud; Nathan Bryson
Original assignee: Flamel Technologies SA
Current assignee: Flamel Technologies SA
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2020-10-12
Also published as: MXPA02005191A; PT1239836E; US7226618B1; FR2801226B1; CN1823744A; AU7798600A; DE60004704D1; JP5095896B2; EP1239836B1; FR2801226A1; ATE247460T1; JP2003514844A; DK1239836T3; WO2001037809A1; CN1399541A; KR20020067040A; ES2206311T3; BR0015690A; US20070248686A1; HK1052642A1

Description

Technisches Gebiet
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist dasjenige der Vektorisierungspartikel (VP), die für die Verabreichung von Wirkstoffen (WS) verwendet werden. Diese letzteren sind vorzugsweise Medikamente oder Nährstoffe für die Verabreichung in einen tierischen oder menschlichen Organismus über einen oralen oder nasalen, vaginalen, okularen, subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intradermischen, intraperitonealen, intracerebralen, parenteralen etc. Weg. . . . Es handelt sich aber auch um kosmetische Produkte oder Pflanzenschutzprodukte wie etwa Herbizide, Pestizide, Insektizide, Fungizide etc. In Begriffen der chemischen Natur sind die WS, die von der Erfindung betroffen sind, insbesondere, aber nicht beschränkend beispielsweise: Proteine, Glycoproteine, Peptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Oligonucleotide, Polynucleide und organische Moleküle.
Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung kalloidale Suspensionen von Vektorisierungspartikeln, vorteilhafterweise vom submikronen Typ, auf Basis von Polyaminosäuren (PAS). Die vorliegende Erfindung zielt gleichermaßen insofern auf reine Partikel sowie auf WS Vektorsysteme, die aus den mit dem (oder den) betroffenen WS beladenen Partikeln gebildet sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf diese VPs umfassenden pulverförmigen Feststoffe. Die Erfindung betrifft gleichermaßen Verfahren zur Herstellung der genannten kolloidalen Partikelsuspensionen, mit oder ohne WS.
Stand der Technik
Die Einkapselung des WS in die VPs hat insbesondere zum Ziel, ihre Wirkdauer zu modifizieren und/oder sie zum Behandlungsort zu leiten oder die Bioverfügbarkeit der besagten WS zu fördern. Zahlreiche Einkapselungstechniken sind bereits vorgeschlagen worden. Solche Techniken zielen einerseits darauf, den Transport von WS bis zu seinem therapeutischen Wirkort zu gestatten, wobei er gegen Angriffe des Organismus (Hydrolyse, enzymatischer Abbau, etc.) geschützt ist und andererseits auf ein Steuern der Freisetzung des WS an seinem Wirkort, um die für den Organismus verfügbare Menge auf gewünschtem Niveau zu halten. Die von diesen Transportvehikeln und dem Aufenthalt im Organismus betroffenen WS sind beispielsweise Proteine, können jedoch gleichermaßen sonstige Stoffe sein, organische Moleküle synthetischen oder natürlichen Ursprungs. Der Artikel von M. J. Humphrey (Delivery system for peptide drugs, Herausgeber S. Davis und L. Illum, Plenum Press, N.Y., 1986) legt die die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen betreffende Problematik und das Interesse an Systemen der Vektorisierung und der kontrollierten Freisetzung dar.
Von allen zum Ausbilden von VPs vorstellbaren Materialien sind die Polymere aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften die die immer mehr eingesetzten. Hinsichtlich eines Lastenheftes, das man für die VPs zu erhalten wünscht, ist dieses besonders anspruchsvoll und umfasst im Besonderen die folgenden Spezifikationen.

1. Die erste für die VPs gesuchte Spezifikation wird sein, dass die Polymere, weiche die VPs bilden, biokompatibel, eliminierbar (durch Exkretion) und/oder biodegradierbar sind und noch besser, dass sie vom Organismus zu nicht-toxischen Produkten metabolisierbar sind. Überdies ist es zweckmäßig, dass die Biodegradierung im Organismus von hinreichend kurzer Dauer ist.
2. Die VPs sollten den Vorteil haben, ohne die Hilfe von organischen Lösungsmitteln und/oder Netzmitteln eine stabile wässrige Suspension bilden zu können.
3. Es ist gleichermaßen vorteilhaft, dass die VPs eine hinreichend kleine Größe aufweisen, um, in einer Flüssigkeit suspendiert, einer sterilisierenden Filtration durch ein Filter unterworfen zu werden, dessen Porendurchmesser kleiner oder gleich 0,2 μm ist.
4. Es ist wünschenswert, dass die VPs und die VP-WS-Systeme durch ein für den WS nicht denaturierendes Verfahren erhalten werden können.
5. Die VPs sollten vorteilhafterweise das Steuern der Geschwindigkeit der Freisetzung des WS gestatten.
6. Eine andere wichtige Spezifikation wäre, dass die VP-WS-Systeme exzellente injizierbare Medikamente bilden können. Diese verbesserte "Injizierbarkeits"-Fähigkeit zur Verabreichung durch Injektion, beispielsweise intravenös oder intramuskulär, ist gekennzeichnet durch: (i) ein vermindertes injiziertes Volumen (für eine gegebene therapeutische Dosis) (ii) eine schwache Viskosität. Diese zwei Eigenschaften sind erfüllt, wenn die therapeutische Dosis des WS mit einer Minimalmenge an VP verbunden ist. Anders ausgedrückt, müssen die VPs eine starke Ladungsrate an WS haben.
7. Die Eigenkosten an VPs in einer injizierbaren Präparation sollten vermindert werden und da passt es, dass die VPs eine starke Beladungsrate an WS aufweisen. Letztendlich sind die kleine Größe und eine starke Ladungsrate die hauptsächlich für die VPs gewünschten Spezifikationen.
8. Es ist gleichermaßen vorteilhaft, wenn das die VPs bildende Polymer keine Immunantwort hervorruft.

Die unten beschriebenen Vorschläge des Standes der Technik haben versucht, die Gesamtheit dieser Spezifikation zu erfüllen. Zu illustrativen Zwecken werden die vorbekannten Vorschläge (a) bis (h) zitiert:

(a) Das Patent US-A-5 286 495 betrifft ein Verfahren zur Einkapselung durch Vaporisierung von Proteinen in wässriger Phase mit der Hilfe von entgegengesetzte Ladungen aufweisenden Materialien, und zwar: Alginat (negative Ladung) und Polylysin (positiv geladen). Dieses Herstellverfahren gestattet das Erzeugen von Partikeln einer Größe über 35 μm.
(b) Anderweitig werden die Emulsionstechniken häufig zum Herstellen von mit WS beladenen Mikropartikeln verwendet. Beispielsweise offenbaren die Patentanmeldungen WO 91/06286, WO 91/06287 und WO 89/08449 solche Emulsionstechniken, in welchen man sich organischer Lösungsmittel zum Solubilisieren von Polymeren bedient hat, z. B. vom polyiactischen Typ. Aber es hat sich herausgestellt, dass die Lösungsmittel denaturierend sein können, namentlich für peptidische oder polypeptidische WS.
(c) Gleichermaßen kennt man biokompatible VPs, genannt Proteinoide, beschrieben 1970 durch X. Fox und K. Dose in "Molecular Evolution and the origin of Life", Herausgeber Marcel Dekker Inc. (1977). Daher schlägt die Patentanmeldung WO 88/01213 ein System auf Basis einer Mischung von synthetischen Polypeptiden vor, deren Löslichkeit vom pH abhängt. Um die Matrixenmikropartikel gemäß dieser Erfindung zu erhalten, lösen sie die Polypeptidmischung; mit einer pH-Wertänderung rufen sie dann die Präzipitation von proteinoiden Partikeln hervor. Wenn sich die Präzipitation in Anwesenheit eines WS abspielt; wird dieser in dem Partikel eingekapselt.
(d) Es wird gleichermaßen zur Erinnerung das Patent US 4,351,337 erwähnt, das sich mit einem anderen Gebiet beschäftigt als der der Erfindung eigenen Vektorisierung von WS. Dieses Patent offenbart Massenimplantate, die an recht präzisen Orten des Organismus fixiert und lokalisiert sind. Diese Implantante sind Röhren oder hohle Kapseln von mikroskopischer Weite (160 μm und einer Länge von bis zu 2.000 μm), die aus Copolymeren von Copolyaminosäuren, beispielsweise Poly(Glutaminsäure-Leucin) oder Poly(Benzylglutamin-Leucin) bestehen, die durch Copolymerisation von Monomeren von N-Carboxyanhydriden von Aminosäuren (NCA) erhalten werden. Das Einschließen eines WS geschieht durch eine Verdampfungstechnik des Lösungsmittels einer Mischung von Polymer und WS. Das Patent US 4 450 150 gehört zur selben Familie wie das oben beschriebene Patent US 4 351 337 und hat im wesentlichen dieselbe Aufgabe. Die bildenden PAS sind Poly(Glutaminsäure-Ethylglutamat).
(e) Die PCT/FR-Patentanmeldung WO 97/02810 offenbart eine Zusammensetzung zur kontrollierten Freisetzung von Wirkstoffen, umfassend eine Mehrzahl von lamellaren Partikeln eines bioabbaubaren zumindest teilweise kristallinen Polymers (Milchsäurepolymer), und einen auf den besagten Partikeln absorbierten WS. In diesem Fall geschieht die Freisetzung des Wirkstoffs durch Desorption.
(f) Die Veröffentlichung "Chemistry Letters 1995, 707, Akiyoshi et al." betrifft die Stabilisierung von Insulin durch supramolekulare Komplexierung mit hydrophobisierten Polysacchariden durch Cholesterin-Pfropfung.
(g) Der in "Macromolecules 1997, 30, 4013–4017" erschienene Artikel beschreibt aus einem Blockpolypeptid auf Basis von L-Phenylalanin, Benzyl-L-Glutamat oder O-(Tetra-O-Acetyl-D-Glucopyranosyl)-L-serin und aus einem synthetischen Block wie etwa Poly(2-Methyl-2-Oxazolin) oder Poly(2-Phenyl-2-Oxazolin) bestehende Copolymere. Polymere aggregieren in wässrigem Milieu zum Ausbilden von Partikeln von 400 nm, die in der Lage sind, sich mit einem Enzym, Lipase, zu assoziieren. Der Ausdruck "Assoziieren" kennzeichnet hier, dass das Protein auf den Partikeln durch ein physikalisches Phänomen (nicht durch kovalente Bindung) adsorbiert.
(h) Die Patentanmeldung FR 2 746 035 beschreibt besonders auf Seite 28, Z. 3 bis 16, eine kolloidale Suspension von Gelkomposit-Mikropartikeln, das aus einer Polyaminosäure des Typs Natriumpolypolyleucin/Glutamat, fraktioniertem Cocosöl (Miglyol^®) und deionisiertem Wasser oder gepufferter Kochsalzlösung (Phosphatpuffer pH 7,4 bei 25°C) erhalten wird. Der mittlere Referenzdurchmesser D[4.3] dieser Gelkompositmikropartikel ist 2.800 nm. Dies gilt für alle Beispiele der FR 2 746 035, wobei der kleinste mittlere Referenzdurchmesser D[4.3] gleich 1.900 nm ist. Zudem können sich diese Gelkompositmikropartikel nicht im nicht-gelösten Zustand in der kolloidalen Suspension mit Insulin verbinden, gemäß einer Ladung Ta ≥ 7%. Unter diesen Bedingungen zeigt sich, dass die Gelkompositmikropartikel nicht das Lastenheft erfüllen und namentlich nicht die Spezifikation in Bezug auf die Injizierbarkeit und die Verbindungskapazität und die Freisetzung bezüglich Insulin. Überdies setzt das Verfahren gemäß der FR 2 746 035 keine polaren nicht-aromatischen Lösungsmittel ein und die Bildung von Mikropartikeln geschieht im wässrigen Milieu nicht spontan, sondern geschieht durch das Einsetzen einer gründlichen Homogenisierung mit Hilfe einer Vorrichtung vom Rotor-/Stator-Typ.
(i) Die PCT-Anmeldung WO 96/29991 behandelt für die Vektorisierung von WS verwendete Polyaminosäurepartikel. Diese Partikel haben eine Größe zwischen 10 und 500 nm, vorzugsweise zwischen 30 und 400 nm. In den Beispielen dieser PCT-Anmeldung wird die Partikelgröße durch den Kreisradius gemessen. Der Kreisradius der in diesen Beispielen erhaltenen Partikel variiert von 55 bis 280 nm. Es gibt andere Techniken der Messung der Kolloidalpartikelgröße. Die Bestimmung eines mittleren hydrodynamischen Durchmessers (Dh) von Partikeln durch quasi-elastische Streuung des Lichts (QELS) ist ein Beispiel einer üblichen Messmethode. In der gesamten Beschreibung nimmt man als Referenz eine Verfahrensweise Md der Messung von Dh. Md wird weiter unten beschrieben. Gleichermaßen erweitert sich der Dh der Partikel gemäß den Beispielen der PCT WO 96/29991 von 150 nm bis 750 nm. Man sollte anmerken, dass die VPs, von denen hier die Rede ist, aus einem hydrophoben Kern gebildet werden, der von einem hydrophilen Schweif umgeben ist. Der hydrodynamische Durchmesser dieser Objekte ist kleiner als das Doppelte ihres Kreisdurchmessers, wie es z.B. in den Werken "Dynamic Light Scattering", B. J. Berue und R. Pecaran (Wiley 1976) und "Physicochemical Hydrodynamics", R. F. Probstein (Wiley 1994) beschrieben ist. Die Ladungsrate Ta der Partikel wird bequem durch das Verhältnis der Insulinmasse zur Trockenmasse des VP ausgedrückt. Gemäß den Beispielen der WO 96/29991, mit einem aus Insulin bestehenden WS, ist es zumindest 0,065 mg/mg, demgemäss 6,5% Trockengewicht Insulin im Verhältnis zur Masse von PAS. Ta wird gemäß der Verfahrensweise Ma gemessen, die weiter unten beschrieben ist. Die Partikel gemäß WO 96/29991 bilden sich spontan beim Inkontaktbringen von PAS mit einer wässrigen Lösung. Die PAS umfassen neutrale und hydrophobe Aminosäurenmonomere AAO und ionisierbare und hydrophile Monomere AAI. Diese PAS werden durch Copolymerisation von NCA von Vorläufern von AAI (z.B. Glu-OMe) und von NCA von AAO (z.B. Leu) in Lösung in einer Dioxan/Toluol-Mischung hergestellt. Das in Lösung erhaltene Copoly(Glu-OMe)(Leu) wird durch Präzipitation in Luft, Filtration und Trocknung wiedergewonnen. Dieses Copolymer wird also einer sauren Hydrolyse unterworfen, indem es in Trifluoressigsäure (TFA) eingetaucht wird, in welcher es sich löst. Ein Copolymer (Glu-O-Na)(Leu) wird Neutralisation, Dialyse, Filtration und Lyophilisation wieder gewonnen. Dieses coPAA wird in einer wässrigen Natriumchloridlösung dispergiert, und es bildet sich spontan eine Suspension von Nanopartikeln. Wie oben angezeigt, sind die letzteren von einer Größe Dh größer als 150 nm und einer Ladungsrate mit Insulin Ta von 6,50%.

Es ergibt sich daher aus dem Vorstehenden, dass die vorbekannten oben beschriebenen technischen Vorschläge, und namentlich der Vorschlag (i), die Spezifikationen des oben angegebenen neuen Lastenhefts unvollständig erfüllen und insbesondere eine Fähigkeit zur Sterilisation durch Filtration, eine höhere Degradationsgeschwindigkeit, eine Anpassbarkeit an die Beschränkungen der Medikamentengabe durch Injektion, niedrige Kosten und eine hohe Ladungsrate an WS.
Bezüglich der Fähigkeit zur Sterilfiltrierung ist es wichtig, dass die VP-Partikel hinreichend klein sind, um in Suspension in einer Flüssigkeit durch die Filter hindurchzugehen, deren Sperrschwelle kleiner oder gleich 0,2 μm ist, ohne sie zu verstopfen. Solche Fähigkeit und Effizienz der Sterilisation durch Filtration sind besonders für injizierbare Medikamente erwünscht.
Betreffend die Eignung zur Injektion von VPs ist es für eine gegebene Dosis von WS praktisch, kleine Volumina von Flüssigsuspension injizieren zu können und dass diese Suspension wenig viskos ist. Es handelt sich um das Vermindernkönnen der Grundmassenmenge (VP) im Verhältnis zur angepeilten therapeutischen Dosis an WS und zum Bereitstellen von VPs, die eine möglichst weit reduzierte Größe haben, alles zum Fördern der Ladungskapazität an WS.
Bezüglich der Anforderung an Biodegradierbarkeit von VPs wird es noch besser sein, dass die Größe von VPs vermindert ist und ihre rasche Beseitigung gestattet.
Überdies wird es geschätzt, die Grundmassenmenge (VP) aus ökonomischen Gründen und zum Verbessern der Toleranz gegenüber dem injizierbaren Medikament verringern zu können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Bei diesem Sachverhalt ist eine essentielle Aufgabe, neue VPs bereitstellen zu können, die sich spontan und ohne die Hilfe von Netzmitteln oder organischen Lösungsmitteln aus stabilen wässrigen Suspensionen von VP bilden können: Eine andere essentielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen von neuen VPs in kolloidaler stabiler wässriger Lösung oder in pulvriger Form und auf Basis von Polyaminosäuren (PAS), wobei diese neuen VPs am besten die Spezifikationen 1 bis 8 des oben angegebenen Lastenhefts erfüllen müssen.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist das Perfektionieren der in der PCT-Anmeldung WO 96/29991 offenbarten Partikel.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen VP-Suspension, mit der man perfekt die Eigenschaften meistern kann, namentlich in Begriffen der Ladungsrate an WS und Begriffen der Steuerung der Freisetzungskinetik des WS.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von injizierbaren medikamentösen Suspensionen. Die für solche Suspensionen notwendigen Spezifikationen sind ein kleines Injektionsvolumen und eine schwache Viskosität. Es ist wichtig, dass die Masse der kolloidalen Partikel pro Injektionsdosis kleinstmöglich ist und dies ohne beschränkender Menge des Wirkstoffs WS, der von diesen Partikeln transportiert wird, um nicht die therapeutische Effektivität zu beeinträchtigen.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer wässrigen kolloidalen Suspension oder eines pulverförmigen Feststoffs, die Wirkstoffvektorisierungspartikel umfassen, welche die oben angepeilten Spezifikationen erfüllen und die eine galenisch-geeignete und für eine Verabreichung für Mensch oder Tier bequeme Form bilden, beispielsweise oral.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer kolloidalen Suspension, die Wirkstoffvektorisierungspartikel umfasst, die zum Zwecke der Sterilisation durch Filter von 0,2 μm filtrierbar sind.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der Herstellung von Partikeln (trocken oder in Suspension in einer Flüssigkeit) aus PAS vorzuschlagen, die namentlich als Vektoren des Wirkstoffs nützlich sind, wobei der besagte Prozess leichter umsetzbar sein muss, nicht für die Wirkstoffe denaturierend sein darf und im übrigen eine feine Beherrschung der mittleren Granulometrie der erhaltenen Partikel gestatten muss.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung der oben genannten Partikel in wässriger Suspension oder fester Form für die Herstellung:

– von Medikamenten (z.B. Vakzinen), insbesondere für die Verabreichung, namentlich oral, nasal, vaginal, okular, subkutan, intravenös, intramuskulär, intradermisch, intraperitoneal, intracerebral oder parenteral, wobei die aktiven Wirkstoffe dieser Medikamente, namentlich Proteine, Glycoproteine, Peptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Oligonucleotide und Polynucleotide sein können;
– und/oder von Nährstoffen,
– und/oder von kosmetischen oder Pflanzenschutzprodukten,
– und/oder von medikamentösen organischen Molekülen.

Eine andere essentielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von submikronen VP-Suspensionen auf Basis von PAS, die einer Verwendung als Vektor eines WS zugänglich sind, insbesondere medikamentös, für die Verabreichung genannten WS einem humanen oder Tierorganismus, oder noch eines Ernährungs-, Pflanzenschutz- oder kosmetischen WS.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Medikaments vom Typ des Systems zur verzögerten Freisetzung von Wirkstoffen, die einfach und ökonomisch herzustellen sind und die zudem biokompatibel und fähig sind, ein sehr hohes Niveau an Bioverfügbarkeit von WS sicherzustellen.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Vektorisierungssystems für Vakzin, das intrinsisch und in Kombination mit einem oder mehreren Antigenen nicht immunogen ist.
Die Produkte betreffenden Aufgaben (neben anderen) werden durch die vorliegende Erfindung erzielt, die zuallererst eine stabile kolloidale Suspension aus submikronen strukturierten Partikeln betrifft, die namentlich für die Vektorisierung von Wirkstoffen) (WS) verwendet werden können, wobei diese Partikel individualisierte (diskrete) supramolekulare Anordnungen sind:

– auf Basis amphiphiler, linearer, peptidisch verketteter Polyaminosäuren (PAS) und zumindest zwei verschiedene Arten von wiederholt auftretenden hydrophilen AAI-Aminosäuren und neutralen hydrophoben AAO-Aminosäuren umfassend, wobei die Aminosäuren jeder Art identisch oder voneinander verschieden sind,
– und geeignet, sich in kolloidaler Suspension in nicht-gelöstem Zustand mit zumindest einem WS zu assoziieren und diesen besonders in vitro in lang anhaltender und/oder verzögerter Weise freizusetzen, gekennzeichnet:

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Verfahrensweisen Md und Ma für die Messungen von Dh und Ta sind nachfolgend detailliert beschrieben.
Verfahrensweise Md
Das pulverisierte PAS-Pulver wird in einer wässrigen Lösung von 0,15 M Natriumchlorid bei pH 7,4, 25°C, und in einer Konzentration an Polymer zwischen 0,1 und 0,5 g/l und vorzugsweise gleich 0,1 g/l, suspendiert. Diese Suspension wird für 4 h bewegt, danach in die Diffusionskammer eines Lichtstreuungsapparates vom Typ Brookhaven eingeführt, der mit einem vertikal polarisierten Laserstrahl einer Wellenlänge von 488 nm funktioniert. Der hydrodynamische Durchmesser wird anhand der Autokorrelationsfunktion des elektrischen Feldes durch die Methode der Kumulanten berechnet, wie in dem Werk "Surfactant Science Series", Band 22, Surfactant Solutions, Herausgeber R. Zana, Kapitel 3, M. Dekker, 1984, beschrieben.
Verfahrensweise Ma

(a) Herstellung einer wässrigen Insulinlösung: Lyophilisiertes remkombinantes menschliches Insulin (Sigma Nr. 10259) wird in eine 0,1 N HCI-Lösung während 5 min bei 25°C eingefüllt. Diese Lösung wird dann in eine Phosphat-gepufferte Lösung gegeben, die schließlich durch Zugabe von 0,1 N NaOH neutralisiert wird. Die Lösung wird danach 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann über eine Acrodisc-Membran von 0,8–0,2 μm filtriert. Die Insulinmasse wird als Funktion des gewünschten Volumens an Lösung berechnet, um eine Konzentration von 60 Ul/ml zu erzielen.
(b) Dispersion der Vektorisierungspartikel aus PAS zum Assoziieren der Insulinlösung: Die lyophilisierten VPs werden der Insulinlösung in einer Menge von 10 mg VP/ml Lösung zugegeben. Diese Mischung wird auf dem Mixer zwei- oder dreimal bewegt, dann einen Korbschüttler bei Umgebungstemperatur für 18 h platziert. Die kolloidale Suspension wird dann bei 4°C aufbewahrt.
(c) Trennung des freien Insulins von assoziiertem Insulin und Dosierung des freien Insulins: Die Insulin und VP enthaltende Lösung wird 1 h bei 60.000 g bei 20°C zentrifugiert. Der Überstand wird in mit einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschlussgröße 100.000 Dalton) versehene Röhrchen gefüllt und bei 3.000 g 2 h bei 20°C zentrifugiert. Das Insulin im Filtrat wird durch CLHP bestimmt.

Eine der Erfindungsgrundlagen dieser neuen Vektorisierungspartikel VP in stabiler kolloidaler wässriger Lösung oder im Zustand pulverförmigen Feststoffs hängt an der eigenständigen Auswahl einer Gruppe von Polymeren und einer eigenständigen Methodologie, die es gestatten, Partikel von submikroner Größe zu erhalten, die eine kolloidale, wässrige, stabile Suspension in Abwesenheit von Netzmitteln oder Lösungsmitteln bilden.
Eine andere Erfindungsgrundlage dieser neuen Vektorisierungspartikel VP in wässriger, kolloidaler, stabiler Suspension oder im Zustand pulverförmigen Feststoffes beruht auf der eigenständigen Auswahl einer durch ihre Ladungsrate Ta ≥ 7% und ihre Größe Dh ≤ 150 nm besonderen Gruppe von strukturierten submikronen Partikeln. Diese Auswahl ist die wichtigste Frucht langer Untersuchungen an dem Verfahren des Erhaltens von Partikeln. Tatsächlich ist die Verminderung der Größe und die Förderung der Ladungskapazität der Polyaminosäurenpartikel a priori nicht evident. Folglich wird beim Ausführen des Verfahrens zum Erhalten von Polyaminosäure-Nanopartikeln, wie in der PCT-Anmeldung WO 96/29991 gelehrt, der Fachmann nicht "nach Maß" Partikel erhalten können, die dem neuen Lastenheft, wie oben definiert, entsprechen.
Beim Spielen mit den Polymerzusammensetzungen und ihren Betriebsbedingungen war es schließlich, dass die Erfinder diese strukturierten Partikel sehr kleiner Größe isolieren konnten, die auf Basis von PAS sind und die in völlig überlegener und unerwarteter Weise eine Ladungskapazität Ta für Insulin zeigen, die bis zum Dreifachen mehr sein kann als diese Eigenschaft bei Partikeln gemäß der WO 96/29991.
Vorzugsweise ist die Suspension gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet,
dass die submikronen Partikel ihren Zusammenhalt nicht aus den folgenden drei Verbindungen beziehen:

I) Öl
II) wässrige Phase
III) und zumindest eine lineare, nicht verzweigte synthetische Copolyaminosäure, die zumindest zwei verschiedene Arten von hydrophilen Aminosäurecomonomeren AAI und hydrophoben Aminosäurecomonomeren AAO umfasst,

Die Struktur der PAS-Polymere und die Natur der Aminosäuren werden so ausgewählt, dass:

– die Polymerketten sich spontan in Form von Partikeln (VP) kleiner Größe strukturieren,
– die Partikel eine stabile kolloidale Suspension in Wasser und in einem physiologischen Milieu bilden,
– sich die VPs mit Proteinen oder anderen WS in wässrigem Milieu verbinden, über einen spontanen und für das Protein nicht-denaturierenden Mechanismus,
– die VPs die WS in physiologischem Milieu freisetzen und genauer gesagt in vivo; die Kinetik der Freisetzung ist eine Funktion der Natur des PAS-Polymer-Vorläufers von VPs.

Folglich kann man durch Spielen mit der bestimmten Struktur von PAS die Phänomene der Verbindung und Freisetzung von WS nach Plan kinetisch und quantitativ steuern.
Es ist Verdienst der Anmelderin, als bildendes Material der VPs eine besondere Zusammensetzung von Polyaminosäuren gewählt zu haben, die amphiphil sind und die daher die Eigenschaften von VPs aus PAS besitzen, d. h.:

– Möglichkeit des spontanen Ausbildens von kolloidalen Suspensionen aus mit dem pH im angetroffenen physiologischen Milieu bei den angepeilten therapeutischen Anwendungen kompatiblem VP,
– spontane Assoziierung von WS mit VPs in Abwesenheit anderer Agenzien als Wasser, das ihnen als Lösungsmittel dient und das im Fall von Proteinen nicht denaturierend ist,
– Möglichkeit des Freisetzens des WS aus dem Assoziationskomplex WS-VP unter physiologischen Bedingungen mit pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Profilen, die interessante Anwendungen auf therapeutischem Gebiet (WS-Vektorisierung) voraussehen lassen,

– Filtrierbarkeit mit Ausschlussgröße kleiner oder gleich 0,2 μm zur Sterilisierung,
– verbesserte Biodegradierbarkeit,
– Eignung für eine optimierte Injektion.

Diese neuen Eigenschaften konnten dank der primären technischen Funktionen der VPs erhalten werden, welche die kleinen nanometrische Größe und die große Ladungsrate sind.
Um diese PAS ein wenig mehr zu definieren, kann man anzeigen, dass sie vom üblichen Typ, sequentiell alternierend (Blöcke), oder vom unorganisierten Typ, zufallsbedingt sequentiell (statistisch) sein können. Folglich sind gemäß einer ersten Ausführungsform von VPs gemäß der Erfindung die bildenden PAS vom Typ "Block" und sind gekennzeichnet durch ein molares Verhältnis AAO/(AAI + AAO), für welche:
– 10% ≤ AAO/(AAI + AAO) ≤ 70%,
– vorzugsweise 20% = AAO/(AAI + AAO) ≤ 60% , und noch bevorzugter 35% ≤ AAO/(AAI + AAO) ≤ 50% ist.
Vorzugsweise ist die absolute Länge jedes AAO-Blocks, ausgedrückt als Anzahl von AAO. so dass:

– vorzugsweise AAO > 10,
– und noch bevorzugter 20 ≤ AAO ≤ 100.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform von VPs gemäß der Erfindung sind die konstitutiven PAS vom Typ "statistisch", d.h. durch gleichzeitige Copolymerisation von Monomeren von AAI und AAO hergestellt, und das molare Verhältnis AAO/(AAO + AAI) ist solcher Art:

– AAO/(AAO + AAI) > 10%,
– und vorzugsweise AAO/(AAO + AAI) ≥ 20%,
– noch bevorzugtererweise, 30% ≤ AAO/(AAI + AAO) ≤ 70%.

Vorzugsweise ist die molare Masse Mw dieser statistischen PAS so, dass:

– Mw ≥ 2.000 g/mol,
– vorzugsweise Mw ≥ 5.500 g/mol,
– und noch bevorzugtererweise 5.500 g/mol ≤ Mw ≤ 200.000 g/mol.

Einer bevorzugten Eigenschaft der Erfindung folgend, weisen die Block- oder statistischen, die Partikel bildenden PAS einen Polymerisationsgrad DP von zwischen 30 und 600, vorzugsweise zwischen 50 und 200 und noch bevorzugtererweise zwischen 60 und 150 auf. Vorzugsweise sind die bildenden PAS von VP-Partikeln "Doppelblock"-PAS.
Die vorliegende Erfindung zielt nicht allein auf Suspensionen von reinen Partikeln, wie sie oben definiert worden sind, sondern gleichermaßen auf Partikel, die zumindest einen Wirkstoff WS umfassen. Vorzugsweise ist die Suspension gemäß der Erfindung wässrig und stabil. Diese Partikel, beladen mit WS oder nicht, sind vorzugsweise in einer in einer Flüssigkeit (Suspension) dispergierten Form, vorzugsweise wässrig, können jedoch gleichermaßen im Zustand eines pulverförmigen Feststoffs, vorliegen, der aus der oben definierten VP-Suspension erhalten wird.
Von wo es sich ergibt, dass die Erfindung außer einer kolloidalen Suspension (vorzugsweise wässrig) aus VP einen pulverförmigen Feststoff betrifft, der VPs umfasst und aus der Suspension gemäß der Erfindung erhalten wird.
Eine andere essentielle Aufgabe der Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von ausgewählten Partikeln (wie solchen oben beschriebenen) ebenso gut in Form einer kolloidalen Suspension wie in Form eines pulverförmigen Feststoffs. Das erwogene Herstellverfahren besteht im wesentlichen aus Synthetisieren von PAS-Vorläufern und ihrer Umwandlung in strukturierte Partikel.
Genauer gesagt handelt es sich zunächst um ein Herstellverfahren für submikrone strukturierte Partikel, die einer Verwendung zugänglich sind, namentlich für die Vektorisierung von Wirkstoff(en), wobei diese Partikel diskrete supramolekulare Anordnungen sind:

– auf Basis von amphiphilen linearen Polyaminosäuren (PAS) in Verkettungen (-AAI-hydrophile und AAO-hydrophobe), wobei die Aminosäuren jeder Art identisch oder unter sich unterschiedlich sein können;
– vom mittleren Durchmesser Dh, ausgedrückt in nm und gemessen gemäß einer Verfahrensweise Md, so dass: 10 ≤ Dh ≤ 150 vorzugsweise 20 ≤ Dh ≤ 100;
– einerseits geeignet, eine stabile kolloidale Suspension aus einer einfachen Mischung in einem wässrigen Milieu zu bilden, ohne dass es notwendig ist, ein Lösungsmittel oder ein Vernetzungsmittel zuzugeben;
– andererseits geeignet, sich in flüssigem Milieu mit zumindest einem PS und insbesondere mit Insulin gemäß einer Ladungsrate Ta zusammen zu lagern, die in % ausgedrückt und gemäß einer Verfahrensweise Ma gemessen wird, so dass: 7 ≤ Ta, vorzugsweise 8 ≤ Ta ≤ 25 und andererseits zum Freisetzen namentlich in vivo in verlängerter und gesteuerter Weise.

Das Verfahren ist kennzeichnet durch:

1) Herstellen eines Copolymerisats aus Monomeren, das aus Anhydriden von N-Carboxyaminosäuren (NCA) von zumindest zwei verschiedenen Arten gebildet wird, zum einen aus NCA-pAAI (wobei pAAI Vorläufer von AAI bezeichnet), und zum anderen aus NCA-AAO, in Anwesenheit – zumindest eines polaren, nicht aromatischen Lösungsmittels, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die umfasst: n-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid (DMAc), Pyrrolidon, wobei NMP besonders bevorzugt ist; – und optional zumindest eines Co-Lösungsmittels, das ausgewählt ist aus den aprotischen Lösungsmitteln (vorzugsweise Dioxan-1,4) und/oder den protischen Lösungsmitteln (vorzugsweise Pyrrolidon) und/oder Wasser und/oder Alkoholen, wobei Methanol besonders bevorzugt ist;
2) Umwandeln der in Schritt 1 erhaltenen, wiederholt auftretenden Copolymer-pAAI-Muster, in wiederholt auftretende AAI-Muster unter Verwendung einer – vorzugsweise sauren – Hydrolyse, für welche das in Schritt 1 erhaltene Copolymer mit einer wässrigen Säure + Wasser-Hydrolysephase zusammengebracht wird;
3) Neutralisieren des Reaktionsansatzes;
4) Optional Dialysieren des Reaktionsansatzes zum Reinigen der wässrigen Suspension der strukturierten Partikel;
5) Optional Konzentrieren dieser Suspension aus Schritt 4;
6) Optional Entziehen des wässrigen Milieus zum Gewinnen , des die Partikel umfassenden pulverförmigen Feststoffs.

Der erste Schritt des Verfahrens leitet sich von bekannten Polymerisationstechniken für N-Carboxy-(Aminosäurenanhydride) (NCA) ab, wie beispielsweise im Artikel "Biopolymers, 15, 1869 (1976)" und im Werk von H. R. Kricheldorf "(Aminoacid-N-carboxy Anhydride and Related Heterocycles" Springer Verlag (1987) beschrieben. Das Verwenden von geeignet ausgewählten aprotischen, nicht-aromatischen, polaren Copolymerisationslösungsmitteln unter Vermeidung jeglicher Präzipitation und der Tatsache des Durchgeführthabens einer sauren Hydrolyse in Anwesenheit von Wasser und organischem, polarem, nicht-aromatischem Lösungsmittel bilden die neuen und erfinderischen Modalitäten, die zu den strukturierten diskreten und submikronen Partikeln verbesserter Ladungsrate an WS führen, und die eine kolloidale stabile Suspension in wässrigem Milieu bilden. Diese Partikel sind überhaupt nicht mit einem agglomerierten mikroskopischen Präzipitat der Art vergleichbar, die zuvor anhand des bekannten Vorschlags (d) erzeugt worden sind.
Einer Variante folgend wird am Ende von Schritt 1 das erhaltene Poly(AOO)(pAAI)-Copolymer vorzugsweise in Wasser präzipiert und dieses Präzipitat gesammelt. Diese Variante entspricht einem diskontinuierlichen Modus zur Herstellung von Partikeln, bei dem man das Poly(AAO)(pAAI)-Copolymer in Form eines ein stabiles Zwischenprodukt bildenden Präzipitats isoliert. Das Präzipitat kann beispielsweise gefiltert, gewaschen und getrocknet werden.
In noch bevorzugterer Weise sind die NCA-pAAI aus NCA Glutaminsäure oder O-alkylierter Asparaginsäure, beispielsweise NCA-Glu-O-Me, NCA-Glu-O-Et oder NCA-Glu-O-Bz (Me = Methyl, Et = Ethyl, Bz = Benzyl).
In bekannter Weise läuft die Copolymerisation bei einer Temperatur zwischen 20 und 120°C ab, bei Atmosphärendruck und in Anwesenheit eines aminierten Starters, beispielsweise NH₃.
Andere experimentelle Parameter, wie die Konzentration an NCA und/oder Polymer im polaren, nicht-aromatischen Lösungsmittel (vorzugsweise NMP) und/oder der Konzentration oder der Natur des protischen Co-Lösungsmittels werden zur Zeit der Synthese gemäß den gewünschten Effekten und wie dem Fachmann bekannt eingestellt.
Die saure Hydrolyse (Schritt 2) wird mit Hilfe von Wasser und zumindest einer Mineralsäure wie Phosphorsäure oder Salzsäure, wobei die letztere bevorzugt ist, und/oder einer organischen Säure wie Trifluoressigsäure (TFA), Essigsäure, Dichloressigsäure oder den Organosulfonsäuren realisiert.
Die Wasser/Säure-Verhältnisse, ausgedrückt in Gew.-Teilen, in einer wässrigen Säurehydrolysephase sind vorzugsweise:

– von 60/1 bis 2/1,
– vorzugsweise 40/1 bis 2/1,
– und noch bevorzugtererweise 20/1 bis 2/1.

Die Verhältnisse der wässrigen Hydrolysesäurephase zu NMP, ausgedrückt in Gewichtsteilen, sind vorzugsweise:

– von 5/100 bis 200/100,
– vorzugsweise 10/100 bis 100/100
– und noch bevorzugtererweise von 20/100 bis 80/100.

Andere Parameter, wie die Polymerkonzentration, die Temperatur der Reaktionsmischung, die Art des Zugebens der wässrigen Hydrolysesäurephase, der Einsatz verminderten Drucks, die Reaktionsdauer etc. . . . werden gemäß den gewünschten Effekten und wie dem Fachmann wohl bekannt eingestellt.
Die Neutralisation (Schritt 3) bedient sich praktischerweise beispielsweise der Hilfe von Soda.
Danach wird das während der Neutralisation gebildete Salz eliminiert, wie auch das Lösungsmittel, durch nur geeignete physischer Trennungsbehandlung, beispielsweise durch Diafiltration (Dialyse) (Schritt 4), Filtration, pH-Änderung, Chromatographie . . . .
Das führt zu einer wässrigen Suspension strukturierter Partikel, die konzentriert werden kann, beispielsweise durch Destillation oder jegliches anderes geeignete physikalische Mittel: Ultrafiltration, Zentrifugation.
Zum Trennen in Schritt 6 der Partikel von ihrem Suspensions-Flüssigmilieu wird optional die wässrige Phase eliminiert, z.B. durch Trocknen (z.B. im Trockenofen), durch Lyophilisieren oder jegliches andere geeignete physische Mittel: Ultrafiltration, Zentrifugation. Man erhält im Verlaufe von diesem Schritt 6 einen pulverförmigen Feststoff von weißer Farbe.
Gemäß einer Variante kann der Konzentrationsschritt durch eine chemische Behandlung ausgeführt werden, wie durch Erniedrigung des pHs, was den hydrophilen Teil der Glutamat-Monomere ins Saure überführt, was sie in Wasser unlöslich macht. Diese PAS-Säurezwischenstufen können gefiltert, gewaschen und getrocknet werden. Die besagten Säurezwischenschritte können mit einer chemischen Base in einem abschließenden Schritt neutralisiert werden, um eine Partikelsuspension zu erhalten.
Es sollte angemerkt werden, dass die Umsetzung der Schritte, 1, 2, 3, 4 und schließlich 5 des obigen Verfahrens einer Herstellung einer kolloidalen Suspension von submikronen Partikeln und von starker Beladungsrate mit den WS entspricht.
Seit dieser Herstellung der kolloidalen Suspension werden die amphiphilen Poly(AAO)(AAI)-PAS aus Schritt 2 in einem wässrigen Mileu platziert, in welchem zumindest ein Teil der AAI löslich ist und zumindest ein Teil der AAO unlöslich ist. Die PAS existieren in Form von Nanopartikeln in diesem wässrigen Milieu.
Eine Alternative zur Herstellung einer Suspension von VP gemäß der Erfindung besteht im Zusammenbringen des pulverförmigen Feststoffs, wie dem oben beschriebenen und wie durch sein Herstellverfahren produziert, mit einem wässrigen, für AAOs nicht lösenden Milieu.
Um die Assoziation einer oder mehrerer WS mit Partikeln zu bewirken, ist es möglich, verschiedene der Erfindung entsprechende Verfahren einzusetzen. Beispielhaft und nicht beschränkend sind diese Verfahren unten stehend aufgelistet.
Gemäß einem ersten Verfahren bewirkt man die Assoziation von WS mit Partikeln durch Zusammenbringen einer flüssigen Phase (wässrig oder nicht), die den WS enthält, mit der kolloidalen Partikelsuspension.
Gemäß einem zweiten Verfahren bewirkt man die Assoziation von WS mit Partikeln durch Zusammenbringen eines WS im festen Zustand mit einer kolloidalen Partikelsuspension. Der feste WS kann beispielsweise in Form eines Lyophilisats, Präzipitats, Pulver oder anders vorliegen.
Gemäß einem dritten Verfahren bringt man den pulverförmigen Feststoff (PAS), wie den oben beschriebenen, und wie durch seine Herstellcharakteristika produziert, mit einer flüssigen Phase (wässrig oder nicht), welche den WS enthält, zusammen.
Gemäß einem vierten Verfahren bringt man den pulverförmigen Feststoff, wie den oben beschriebenen und wie durch seine Herstellcharakteristika erzeugt, mit dem WS in fester Form zusammen. Man dispergiert dann diese Feststoffmischung in einer flüssigen Phase, vorzugsweise einer wässrigen Lösung.
Bei allen diesen Verfahren kann der verwendete WS in reiner oder vorformulierter Form sein.
Unter Berücksichtigung der nanometrischen Größe der Partikel kann die Suspension auf Sterilfiltern, filtriert werden, was es gestattet, leicht und zu geringen Kosten sterile injizierbare medikamentöse Flüssigkeiten zu erhalten. Die Tatsache, dank der Erfindung die Größe von Partikeln steuern zu können und Werte für Dh zwischen 25 und 100 nm erreichen zu können, ist ein wichtiger Vorteil.
Die vorliegende Erfindung zielt gleichermaßen auf neue Zwischenprodukte des oben beschriebenen Verfahrens, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikelvorläufer PAS-Copolymer bestehen.
Industrielle Anwendung
Gemäß einem anderen ihrer Aspekte betrifft die Erfindung eine Suspension und/oder einen pulverförmigen Feststoff, wie oben definiert und/oder wie durch das oben präsentierte Verfahren erhalten, wobei die Suspension und der Feststoff zumindest einen Wirkstoff umfassen, der vorzugsweise ausgewählt ist aus
– Vakzinen,
– Proteinen und/oder Peptiden, unter welchen die bevorzugtesten sind: Hämoglobine, Cytochrome, Albumine, Interferone, Antigene, Antikörper, Erythropoetin, Insulin, Wachstumshormone, Faktoren VIII und IX, Interleukine oder ihre Mischungen, Aktivierungsfaktoren der Hämatopoese,
– Polysaccharide, wobei insbesondere Heparin ausgewählt wird,
– Nukleinsäuren und vorzugsweise RNA und/oder DNA-Oligonukleotide,
– Nicht-Peptid-Protein-Moleküle, die zu verschiedenen Klassen von Anti-Krebs-Chemotherapie gehören und insbesondere Anthracycline und Taxoide,
– und ihre Mischungen.
Die Erfindung zielt gleichermaßen auf eine Suspension und/oder einen pulverförmigen Feststoff, der mit einem Nahrungs-, Pflanzenschutz- oder Kosmetikwirkstoff beladen ist.
Schließlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische, Ernährungs-, Pflanzenschutz- oder kosmetische Spezialität, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Suspension und/oder einen pulverförmigen Feststoff umfasst, die mit WS beladen ist, wie oben definiert.
Gemäß einer anderen ihrer Aufgaben zielt die Erfindung gleichermaßen auf die Verwendung dieser VPs (in Suspension oder in fester Form), beladen mit WS, für die Herstellung von Medikamenten vom kontrollierten WS-Freisetzungssystemtyp.
Im Falle von Medikamenten kann es sich beispielsweise um solche verabreichbaren handeln, vorzugsweise auf oralem, nasalem, vaginalem, okularem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intradermischem, intraperitonealem, intracerebralem oder parenteralem Weg.
Die vorstellbaren kosmetischen Anwendungen sind beispielsweise eine, mit VPs gemäß der Erfindung verbundenen WS umfassende und auf transdermischem Weg anwendbare Zusammensetzung.
Die betroffenen Pflanzenschutzprodukte können beispielsweise Herbizide, Pestizide, Insektizide, Fungizide, etc. sein.
Die Beispiele, die folgen, ermöglichen es, die Erfindung in ihren unterschiedlichen Produkt-/Verfahrens-/Anwendungs-Aspekten besser zu verstehen. Diese Beispiele illustrieren die Herstellung der mit Wirkstoff beladenen oder nicht beladenen Polyaminosäureartikel und sie zeigen die Strukturcharakteristika und die Eigenschaften dieser Partikel.
Figurenlegenden
1: Nanopartikel entsprechend einem Copolymerblock Ia: Leucin 50/Glutamat 50, gemäß der Lehre des Patents WO 96/29991 erhalten.
2: Mit dem Copolymerblock gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Nanopartikel (Beispiel 2). Man beachte, dass der Maßstab hier nicht mehr als 50 Nanometer repräsentiert.
3: Entwicklung der Glukosekonzentration (Mittelwert in % basal bei 4 Hunden) nach Injektion einer mit Insulin im Verhältnis von 2 Ul/kg beladenen VP-Formulierung.
4: Entwicklung der Serumsinsulinkonzentration (Mittelwert aus vier Hunden) nach Injektion einer mit Insulin im Verhältnis von 2 Ul/kg beladenen VP-Formulierung.
Beispiele
Beispiel 1
Erhalten von Vektorisierungspartikeln in stabiler kolloidaler wässriger Suspension und in pulverförmiger Festform aus einem Polyaminosäureblock, dem Poly(Leu/Glu) 40/80 Doppelblock
In einem 1-Liter-Thermostatreaktor bei 20°C werden unter Schütteln 112,4 g NCA-GluOMe (0,60 Mol) und 449 g N-Methyl Pyrrolidin-on-2 (NMP) eingeführt. Nach Auflösen werden 21,38 g einer 0,34 molaren Ammoniaklösung in Dioxan-1,4 (1,25 Mol-%/NCA) zugegeben. Die Polymerisation wird durch Messen des freigesetzten Kohlendioxids in einer Gasglocke verfolgt und durch Verschwinden der für NCA charakteristischen Schwingungsbänder bei 1860 und 1790 cm^–1 verifiziert. Nach 30 Minuten wird eine Lösung von 47,17 g der NCA Leucin (0,30 Mol) in 631 g NMP eingeführt. Nach 10 Minuten Reaktion wird die Temperatur auf 60 °C erhöht. Die Polymerisation wird wie vorstehend verfolgt und ist nach zwei Stunden abgeschlossen. Die Temperatur des erhaltenen Reaktionsgemischs wird auf 80°C erhöht. Zu 350 g des erhaltenen Reaktionsgemisches am Ende von Schritt 1 werden 31,5 g wässrige konzentrierte Salzsäure (35%, 12M) unter mechanischer Bewegung in 30 Minuten zugegeben. Dann wird der Reaktor für 6 Stunden unter auf 600 mbar eingestellten Unterdruck gebracht. Eine Mischung von 31,5 g 35%-iger Salzsäure und 126 g Wasser wird dann über 60 Minuten zugegeben, gefolgt von einer zweiten Phase Vakuum bei 250 mbar für 18 Stunden. In diesem Beispiel ist das Gesamtverhältnis von Wasser und reiner Salzsäure 7,6/l Masse und das Massenverhältnis von saurer wässriger Phase zu NMP 60/100.
Die Reaktionsmischung wird danach auf 50 °C abgekühlt, dann durch wässriges Soda (35 Masse-%) neutralisiert. NMP und während der Neutralisierung gebildetes Natriumchlorid werden durch Diafiltration gegen 20 Volumen Milli Q Wasser an Membran mit MWCO von 1000 Dalton eliminiert (Pellicon II-System, Millipor). Man erhält somit eine wässrige stabile kolloidale Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln. Die Nanopartikelsuspension wird schließlich lyophilisiert.
Der Gehalt an Leucinresten wird durch Protonenkernresonanzmagnetismus bestimmt (Signale bei 2,10, 2,22 und 2,58 ppm für 4H von Glu und bei 0,85 ppm für 6H von Leu). Der mittlere hydrodynamische Durchmesser (Dh) ist 70 nm (gemäß Md).
Beispiel 2
Assoziation von Insulin an Poly(Leu/Glu) 40/80 Nanopartikeln
Man verwendet die Verfahrensweise Ma. Die Konzentration von freiem Insulin, durch CLHP-Chromatographie bestimmt, ist gleich 0,59 mg/ml und man leitet aus ihr die assoziierte Insulinkonzentration mit 1,51 mg/ml ab. Die Beladungskapazität einer kolloidalen Lösung von 10 mg/ml erreicht 1,51 mg/ml Insulin. Folglich ist das Verhältnis der Insulinmasse, die mit der bLE(TA)assoziiert ist, 15,1%.
Beispiel 3
Erhaltung von Vektorisierungspartikeln aus einem PAS Blockpoly(Leu/glu) 25/70 Doppelblock in wässriger kolloidaler stabiler Suspension und in pulverisierter Festform
146,4 g der NCA GluOMe werden in 586 g NMP gelöst, denen 18,43 g einer 0,48 M Ammoniaklösung in Methanol zugesetzt werden. Wenn die Polymerisation von NCA GluOMe vollständig ist, wird eine Lösung von 43,9 g NCA Leu in 708 g NMP eingeführt und die Polymerisation von NCA Leu wird bis zum Verschwinden der Monomere fortgesetzt. Das Milieu wird dann auf 80°C gebracht und man fügt hier peux à peux während 30 Minuten bis 1 Stunde 129,4 g 35%-ige HCI zu. Ein Vakuum von 600 mbar wird für 6 Stunden angelegt, danach werden 129,4 g 35%-ige zusätzliche NCI mit 517,5 g Wasser der Mischung zugegeben. Ein Vakuum von 2.50 mbar wird dann für 18 Stunden angelegt. Nach diesem Schritt wird die Temperatur auf 50°C reduziert, 1 Liter Wasser wird eingeführt, danach 280 ml 35%-iges NaOH, um den pH auf 7,4 zurückzubringen. Die Suspension wird daraufhin filtriert (5 μm) in Wasser dialysiert (Ausschlussgröße 1.000 Da), um das Lösungsmittel und die Salze zu eliminieren, und zuletzt gefiltert (0,22 μm). Diese Suspension kann direkt oder nach abschließenden Behandlungen verwendet werden, wie etwa Destillation des Wassers (Schritt 5) oder Lyophilisierung (Schritt 6).
Der mittlere hydrodynamische Durchmesser Dh (gemäß Md) ist 14,8%. Die Beladungsrate Ta mit Insulin bestimmt gemäß der Verfahrensweise Ma ist 35 nm.
Beispiel 4
Erhaltung in kolloidaler wässriger stabiler Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln aus einem Polyamidblock des Poly(Leu/Glu) 50/70 Doppelblocks und Charakteristika der Nanopartikel
In einen Thermostatreaktor von 0,5 Litern bei 30°C werden unter Bewegung 38,9 g NCA-GluOMe (0,208 Mol) und 156 g N-Methyl-Pyrrolidin-on-2 (NMP) eingeführt. Nach Auflösung werden 5,79 g einer 0,407 M Ammoniaklösung in Methanol (1,25% Mol/NCA) zugegeben. Die Polymerisation wird durch die Messung freigesetzten Kohlendioxids in einer Gasglocke verfolgt und durch Verschwinden der für NCA charakteristischen Schwingungsbanden bis 1.860 und 1.790 cm^–1 verifiziert. Nach 30 Minuten wird eine Lösung von 23,3 g NCA Leucin (0,148 Mol) in 263 g NMP eingeführt. Nach 10 Minuten Reaktion, wird die Temperatur auf 60°C erhöht. Die Polymerisation wird wie zuvor verfolgt und ist nach 1–2 Stunden abgeschlossen. Die Temperatur des vorstehenden erhaltenen Reaktionsgemisches wird auf 80°C erhöht. 41,9 g wässrige Salzsäure (35 Masse-%) werden unter mechanischem Rühren in 30 Minuten dem Reaktionsmilieu zugegeben. Der Reaktor wird dann unter auf 600 mbar reguliertem Unterdruck für 6 Stunden gesetzt. Eine Mischung von 41,9 g 35%-iger Salzsäure und 167,5 g Wasser wird dann über 60 Minuten zugegeben, gefolgt von einer zweiten Vakuumphase bei 250 mbar während 18 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird daraufhin auf 50°C wieder abgekühlt, dann durch wässriges Soda (35 Masse-%) neutralisiert. NMP und während der Neutralisation gebildetes Natriumchlorid werden durch Diafiltration von 20 Volumen Milli Q Wasser an einer Membran mit MWCO von 1.000 Dalton (System Pellicon II, Millipor) eliminiert. Man erhält folglich eine kolloidale wässrige stabile Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln. Die Suspension von Nanopartikeln wird schließlich lyophilisiert.
Der hydrodynamische mittlere Durchmesser Dh wird gemäß Md an den wässrigen Lyophilisatsuspensionen gemessen. Die Beladungsrate Ta an Insulin wird gemäß der Verfahrensweise Ma bestimmt.
Beispiel 5 – Erhaltung in kolloidaler wässriger stabiler Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln aus einem Polyamidblock des Poly(Leu/Glu) 25/35 Doppelblocks und Charakteristika der Nanopartikel.
In einen Thermostatreaktor von 0,5 Litern bei 30°C werden unter Bewegung 38,9 g NCA-GluOMe (0,208 Mol) und 156 g N-Methyl-Pyrrolidin-on-2 (NMP) eingeführt. Nach Auflösung werden 5,78 g einer 0,452 M Ammoniaklösung in Methanol (1,25% Mol/NCA) zugegeben. Die Polymerisation wird durch die Messung freigesetzten Kohlendioxids in einer Gasglocke verfolgt und durch Verschwinden der für NCA charakteristischen Schwingungsbanden bis 1.860 und 1.790 cm^–1 verifiziert. Nach 30 Minuten wird eine Lösung von 23,3 g NCA Leucin (0,149 Mol) in 5 219 g NMP eingeführt. Nach 10 Minuten Reaktion, wird die Temperatur auf 60°C erhöht. Die Polymerisation wird wie zuvor verfolgt und ist nach 1–2 Stunden abgeschlossen. Die Temperatur des vorstehend erhaltenen Reaktionsgemisches wird auf 80°C erhöht. 42 g wässrige Salzsäure (35 Masse-%) werden unter mechanischem Rühren in 30 Minuten dem Reaktionsmilieu zugegeben. Der Reaktor wird dann unter auf 600 mbar reguliertem Unterdruck für 6 Stunden gesetzt. Eine Mischung von 42 g 35%-iger Salzsäure und 167,9 g Wasser wird dann über 60 Minuten zugegeben, gefolgt von einer zweiten Vakuumphase bei 250 mbar während 18 Stunden. Das Reaktionsgemisch wird daraufhin auf 50°C wieder abgekühlt, dann durch wässriges Soda (35 Masse-%) neutralisiert. NMP und während der Neutralisation gebildetes Natriumchlorid werden durch Diafiltration von 20 Volumen Milli Q Wasser an einer Membran mit MWCO von 1.000 Dalton (System Pellicon II, Millipor) eliminiert. Man erhält folglich eine kolloidale wässrige stabile Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln. Die Suspension von Nanopartikeln wird schließlich lyophilisiert.
Die Ausbeute von Leucinresten wird durch Protonenkernresonanzmagnetismus bestimmt (Signale bei 2,10, 2,22 und 2,58 ppm für 4H von Glu und bei 0,85 ppm von 6H von Leu). Der hydrodynamische mittlere Durchmesser Dh wird gemäß Md an den wässrigen Lyophilisatsuspensionen gemessen. Die Beladungsrate Ta an Insulin wird gemäß der Verfahrensweise Ma bestimmt.
Beispiel 6
Erhaltung in kolloidaler wässriger stabiler Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln aus einem Polyamidblock des Poly(Leu/Glu) 50/150 Doppelblocks und Charakteristika der Nanopartikel
In einen Thermostatreaktor von 0,5 Litern bei 30°C werden unter Bewegung 46,4 g NCA-GluOMe (0,248 Mol) und 186 g N-Methyl-Pyrrolidin-on-2 (NMP) eingeführt. Nach Auflösung werden 6,90 g einer 0,19 M Ammoniaklösung in Methanol (1,25% Mol/NCA) zugegeben. Die Polymerisation wird durch die Messung freigesetzten Kohlendioxids in einer Gasglocke verfolgt und durch Verschwinden der für NCA charakteristischen Schwingungsbanden bis 1.860 und 1.790 cm^–1 verifiziert. Nach 30 Minuten wird eine Lösung von 12,97 g NCA Leucin (0,083 Mol) in 218 g NMP eingeführt. Nach 10 Minuten Reaktion wird die Temperatur auf 60°C erhöht. Die Polymerisation wird wie zuvor verfolgt und ist nach 1–2 Stunden abgeschlossen. Die Temperatur des vorstehenden erhaltenen Reaktionsgemisches wird auf 80°C erhöht. 40,3 g wässrige Salzsäure (35 Masse-%) werden unter mechanischem Rühren in 30 Minuten dem Reaktionsmilieu zugegeben. Der Reaktor wird dann unter auf 600 mbar reguliertem Unterdruck für 6 Stunden gesetzt. Eine Mischung von 40,3 g 35-iger Salzsäure und 161,3 g Wasser wird dann über 60 Minuten zugegeben, gefolgt von einer zweiten Vakuumphase bei 250 mbar während 18 Stunden.
Das Reaktionsgemisch wird daraufhin auf 50°C wieder abgekühlt, dann durch wässriges Soda (35 Masse-%) neutralisiert.
NMP und während der Neutralisation gebildetes Natriumchlorid werden durch Diafiltration von 20 Volumen Milli Q Wasser an einer Membran mit MWCO von 1.000 Dalton (System Pellicon II, Millipor) eliminiert. Man erhält folglich eine kolloidale wässrige stabile Suspension von Vektorisierungsnanopartikeln. Die Suspension von Nanopartikeln wird schließlich lyophilisiert.
Die Ausbeute von Leucinresten wird durch Protonenkernresonanzmagnetismus bestimmt (Signale bei 2,10, 2,22 und 2,58 ppm für 4H von Glu und bei 0,85 ppm von 6H von Leu). Der hydrodynamische mittlere Durchmesser Dh wird gemäß Md gemessen.
Beispiel 7
Vergleichsbeispiel zur Natur von nach der Lehre des PCT-Patents WO 96/29991 gebildeten Partikel
Die gemäß der Lehre des Patents WO 96/29991 erhaltenen Partikel sind die in der 1 gezeigten. Vorteilhaft sind die Partikel gemäß der Erfindung diejenigen, die in der anhängenden 2 erscheinen, entsprechend einer mit einem Transmissionselektronenmikroskop ausgenommenen Fotografie.
Die Unterschiede in der Morphologie und der Größe erscheinen in deutlicher Weise beim Vergleichen einerseits von 1, welche VPs gemäß dem Stand der Technik repräsentiert, und andererseits der 2, welche VPs gemäß der Erfindung zeigt. Man konstatiert hier einen bemerkenswerten morphologischen Unterschied. Die VPs der 2 sind derart, dass die Mehrheit der Partikel größerer Größe eine längliche Form zeigen.
Beispiel 8
Test der Stabilität einer kolloidalen Suspension, die gemäß Beispiel 2 mit dem Polymer Poly(Leu/Glu) 40/80 hergestellt worden ist
Der pulverförmige Puder des Beispiels 2 wird in einem Verhältnis von 60 mg/ml Pulver in einem Phosphatpuffer aufgelöst. Der pH ist auf 7,3 eingestellt worden und die Osmolarität der Suspension ist mit Hilfe einer Lösung von 5M NaCl auf 300 mOsm/kg eingestellt worden. Die Lösung ist gefiltert (0,22 μm) worden, bevor sie zu je 5 ml in sterile Flakons von 10 ml verteilt worden ist. Die Stabilität der Proben ist über eine Zeitdauer von 4 Monaten evaluiert worden. Die Mehrheit der Proben ist bei 4°C (± 2°C) aufbewahrt worden, während die anderen Proben bei Labortemperatur aufbewahrt worden sind: 25°C (± 5°C). Zu vorgegebenen Zeitpunkten sind die Proben ihrem Lagerort entnommen worden und vor der Analyse 1 h bei Raumtemperatur equilibriert worden. Die analytischen Methoden werden beschrieben, die Ergebnisse werden in Form von zwei Tabellen präsentiert.

1) Verifikation der Homogenität der kolloidalen Lösung: Ohne Bewegen der Suspension führt man drei Entnahmen von 100 μl zum Repräsentieren des Zustands der Lösung von oben, aus der Mitte und von unten aus dem Flakon durch. Der refraktive Index jeder Entnahme wird bei 25°C auf einem Abbe-Refraktometer gemessen, das im Verhältnis zu reinem Wasser geeicht worden ist. Drei Ablesungen werden für jede Entnahme durchgeführt und ihre drei Mittelwerte verglichen. Jede Variation in der Konzentration der Lösung führt zu einem Unterschied im refraktiven Index.
2) Messung des hydrodynamischen Durchmessers: Eine Entnahme von 100 μl der zu analysierenden Lösung wird mittels einer 0,15M NaCl-Lösung 120-fach verdünnt und der Dh der kolloidalen Partikel wird gemäß dem Protokoll Md gemessen.
3) Messung der Viskosität: Die Messungen werden an Entnahmen von 0,75 ml mit Hilfe eines AR1000 Rheometers (TA Instruments) durchgeführt, das mit einer Konus/Ebenen-Geometrie (Konus 4 cm/2°C) ausgerüstet ist, bei einer Temperatur von 20,0°C+/– 0,1°C (Pelletiereffekt-reguliert). Die Viskositätskurve als Funktion des Schergradienten wird für verschiedene Gradienten von 1 bis 100 s^–1 registriert. Bei diesen Konzentrationen sind die Lösungen leicht rheofluid, und der Wert der zurückbehaltenen Viskosität wird für einen Gradienten von 10 s^–1 genommen.

Die nach Alterung bei 4°C und 25°C erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen I und II zusammengestellt. Tabelle I Alterung bei 4°C
Tabelle II Alterung bei 25°C
Beispiel 9
Test der Insulinfreisetzung in einem Tier nach Verabreichung einer das Insulin enthaltenen Partikelsuspension
Eine Zusammensetzung wird aus VP (aus Beispiel 3) und Insulin hergestellt, wobei deren Mengen nach den Messungen der Assoziierungsrate (Ma) bestimmt werden.
Eine Gruppe von vier Beagle-Hunden (Männchen und Weibchen), die zwischen 10 und 12 kg wiegen, werden für 18 h fasten gelassen. Ein Präparat wird formuliert und setzt sich aus 80 UI Insulin und 56 mg VP in 1 ml PBS-Puffer zusammen. Die Hunde empfangen dann eine subkutane Verabreichung dieser Insulinpräparation im Verhältnis von 2 Ul/kg Gewicht. Das entnommene Blut für eine Bestimmung von Glucose und Insulin vor (–2 h, –1 h und 0 h) und nach (1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h, 48 h) der Injektion. Die Glucosekonzentrationen werden in den Entnahmen durch das Glucoseoxidaseverfahren gemessen und das Seruminsulin wird unter Verwendung eines radioimmunologischen Verfahrens festgestellt. 3 gibt das Mittel der Entwicklung der Glucose für diese Zusammensetzung. 4 gibt das Mittel der Entwicklung des Seruminsulins für diese Zusammensetzung.
Das Beispiel zeigt, trotz der biologischen Aktivität, die Nicht-Denaturierung des Proteins sowie auch die Möglichkeit der Verlängerung der Freisetzung auf > 24h, zwei vorteilhafte Aspekte der vorliegenden Erfindung.

Claims

Kolloidale Suspension submikroner Partikel, die einer Verwendung insbesondere für die Vektorisierung von Wirkstoff(en) (WS) zugänglich sind, wobei diese Partikel supramolekulare, individualisierte Anordnungen sind: auf Basis amphiphiler, linearer, alpha-peptidisch verketteter Polyaminosäuren (PAS) und zumindest zwei verschiedene Arten von wiederholt auftretenden hydrophilen AAI Aminosäuren und neutralen hydrophoben AAO Aminosäuren umfassend, wobei die Aminosäuren jeder Art identisch oder voneinander verschieden sind, und geeignet, sich in kolloidaler Suspension in nicht gelöstem Zustand mit zumindest einem WS zu assoziieren und diesen, insbesondere in vivo, in lang anhaltender und/oder verzögerter Weise freizusetzen, gekennzeichnet: dadurch, dass die AAI aus Aminosäuren mit ionisierbarer Seitenkette ausgewählt ist/sind, wobei die natürlichen Aminosäuren Glu und Asp in Carboxy-Form und/oder in Salzform besonderes bevorzugt sind; dadurch, dass die AAO aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, welche neutrale natürliche Aminosäure umfasst, vorzugsweise solche, die zur Leu, Ile, Val, Ala, Pro, Phe umfassenden Untergruppe gehören; dadurch, dass sie bei einem pH von 4 bis 13 in Abwesenheit von oberflächenaktivem Stoff(en) stabil ist; durch eine Beladungsrate Ta mit Insulin, ausgedrückt in Masse-% angelagerten Insulins im Verhältnis zur Masse und gemessen gemäß einer Verfahrensweise Ma, wobei Ta: – 7 ≤ Ta, – vorzugsweise 8 ≤ Ta ≤ 50, – und noch bevorzugtererweise 10 ≤ Ta ≤ 30, ist und durch einen mittleren hydrodynamischen Durchmesser Dh, ausgedrückt in nm und gemessen gemäß einer Verfahrensweise Md, wobei Dh – 10 nm ≤ Dh ≤ 150nm, – vorzugsweise 20 nm ≤ Dh ≤ 100 nm, ist.
Suspension gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die submikronen Partikel ihren Zusammenhalt nicht aus den folgenden drei Verbindungen beziehen: I) Öl II) wässrige Phase III) und zumindest eine lineare, nicht verzweigte synthetische Copolyaminosäure, die zumindest zwei verschiedene Arten von hydrophilen Aminosäurecomonomeren AAI und hydrophoben Aminosäurecomonomeren AAO umfasst.
Suspension gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Partikel bildenden PAS "Block"-PAS sind, für welche das molare Verhältnis AAO/(AAI + AAO), ausgedrückt in %, – 10% ≤ AAO/(AAI + AAO) ≤ 70%, – vorzugsweise 20% ≤ AAO/(AAI + AAO) ≤ 60% ist, und für welche der Polymerisationsgrad DP der Kette zwischen 30 und 600, vorzugsweise zwischen 50 und 100, und noch bevorzugterweise zwischen 60 und 150 liegt.
Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die die Partikel bildenden PAS "Doppelblock"-PAS sind.
Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie wässrig und stabil ist.
Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel zumindest einen WS umfassen.
Pulverförmiger Feststoff, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten ist.
Verfahren zur Herstellung pulverförmigen Feststoffs gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet durch: 1) Herstellen eines Copolymerisats aus Monomeren, das aus Anhydriden von N-Carboxyaminosäuren (NCA) von zumindest zwei verschiedenen Arten gebildet wird, zum einen aus NCA-pAAI (wobei "pAAI" Vorläufer von AAI bezeichnet), und zum anderen aus NCA-AAO, in Anwesenheit – zumindest eines polaren, nicht aromatischen Lösungsmittels, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die umfasst: n-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid (DMAc), Pyrrolidon, wobei NMP besonders bevorzugt ist; – und optional zumindest eines Co-Lösungsmittels, das ausgewählt ist aus den aprotischen Lösungsmitteln (vorzugsweise Dioxan-1,4) und/oder den protischen Lösungsmitteln (vorzugsweise Pyrrolidon) und/oder Wasser und/oder Alkoholen, wobei Methanol besonders bevorzugt ist; 2) Umwandeln der in Schritt 1 erhaltenen, wiederholt auftretenden Copolymer-pAAI-Muster, in wiederholt auftretende AAI-Muster unter Verwendung einer – vorzugsweise sauren – Hydrolyse, für welche das in Schritt 1 erhaltene Copolymer mit einer wässrigen Säure + Wasser-Hydrolysephase zusammengebracht wird; 3) Neutralisieren des Reaktionsansatzes; 4) Optional Dialysieren des Reaktionsansatzes zum Reinigen der wässrigen Suspension der strukturierten Partikel; 5) Optional Konzentrieren dieser Suspension aus Schritt 4; 6) Entziehen des wässrigen Milieus zum Gewinnen des die Partikel umfassenden pulverförmigen Feststoffs.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach Abschluss von Schritt 1 das erhaltene Poly (AAO)(pAAI) Copolymer – vorzugsweise in Wasser – präzipitiert und das Präzipitat gewonnen wird.
Verfahren zur Herstellung der Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein nicht AAO lösendes wässriges Lösungsmittel, den pulverförmigen Feststoff gemäß Anspruch 7 und/oder den durch das Verfahren gemäß Anspruch 8 erhaltenen pulverförmigen Feststoff zusammenbringt.
Verfahren zur Herstellung der Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte 1, 2, 3, 4, und optional 5 des Verfahrens gemäß Anspruch 8 umfasst.
Verfahren zur Herstellung der Suspension gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Assoziierung des WS mit den Partikeln durch Zusammenbringen einer den WS enthaltenden Flüssigphase mit der kolloidalen Partikelsuspension bewirkt.
Verfahren zur Herstellung der Suspension gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Assoziierung des WS mit den Partikeln durch Zusammenbringen eines WS im festen Zustand mit der kolloidalen Partikelsuspension bewirkt.
Verfahren zur Herstellung der Suspension gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man den pulverförmigen Feststoff gemäß Anspruch 7 und/oder den durch das Verfahren gemäß Anspruch 8 erhaltenen pulverförmigen Feststoff mit einer den WS enthaltenden Flüssigphase zusammenbringt.
Verfahren zur Herstellung der Suspension gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man den pulverförmigen Feststoff gemäß Anspruch 7 und/oder den durch das Verfahren gemäß Anspruch 8 erhaltenen pulverförmigen Feststoff mit dem WS in fester Form zusammenbringt, und dadurch, dass man dieses Gemisch von Feststoffen in einer Flüssigphase, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, auflöst.
Zwischenprodukte des Verfahrens gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Partikelvorläufer-PAA-Copolymeren bestehen.
Suspension gemäß Anspruch 6 und/oder erhalten durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 und/oder pulverförmiger Feststoff gemäß Anspruch 7, umfassend zumindest einen Wirkstoff, der vorzugsweise ausgewählt ist aus: – Vakzinen, – Proteinen und/oder Peptiden, unter welchen die bevorzugtesten sind: Hämoglobine, Cytochrome, Albumine, Interferone, Antigene, Antikörper, Erythropoetin, Insulin, Wachstumshormone, Faktoren VIII und IX, Interleukine oder ihre Mischungen, Aktivierungsfaktoren der Hämatopoese, – Polysaccharide, wobei insbesondere Heparin ausgewählt wird, – Nukleinsäuren und vorzugsweise RNA und/oder DNA-Oligonukleotide, – Nicht-Peptid-Protein-Moleküle, die zu verschiedenen Klassen von Anti-Krebs-Chemotherapie gehören und insbesondere Anthracycline und Taxoide, – und ihre Mischungen.
Suspension gemäß Anspruch 6 und/oder erhalten durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 und/oder pulverförmiger Feststoff gemäß Anspruch 7, umfassend zumindest einen Ernährungs-, Pflanzenschutz- oder Kosmetik-Wirkstoff.
Pharmazeutik-, Ernährungs-, Pflanzenschutz- oder Kosmetikspezialität, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Suspension und/oder einen pulverförmigen Feststoff gemäß Anspruch 17 oder 18 umfasst.