DE4430023A1 - Elektrochemischer Sensor - Google Patents

Elektrochemischer Sensor

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Erhard Kopetzki
Petra Rueger
Dorothee Dipl Biol D Ambrosius
Bernd Dipl Biol Dr Schmidt
Peter Dipl Chem Dr Sluka
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Description

Die Erfindung betrifft einen elektrochemischen Sensor, enthal­ tend ein Trägermaterial, das eine Edelmetalloberfläche auf­ weist, und ein an die Edelmetalloberfläche adsorptiv gebundenes enzymatisch aktives Protein.
Der Einsatz von Enzymsensoren zur Bestimmung eines Analyten durch elektrochemische Messung ist bekannt (siehe z. B. Turner et al., Biosensors, Fundamentals and Application (1987), Oxford University Press).
Die Immobilisierung von Enzymen auf der Sensoroberfläche er­ folgte bisher in allgemeinen durch Einschluß hinter und in Membranen, Bindung an Polymere und Quervernetzung mit bifunk­ tionellen Reagenzien. Diese Methoden haben den Nachteil, daß sich die Enzymmoleküle statistisch verteilt in einer dicken Schicht auf der Festphase befinden. Damit ist die Diffusion des Analyten zum reaktiven Zentrum des Enzyms sowie die Diffusion des Produkts zur Elektrode gehemmt, die Reaktionszeit des Sensors ist lang und die Empfindlichkeit ist gering. Ein weite­ rer Nachteil dieser Art der Immobilisierung ist, daß es bei kovalenter Bindung des Enzyms an die Sensoroberfläche oft zu Aktivitätsverlusten aufgrund von Veränderungen des aktiven Zentrums kommt. Die obengenannten Methoden zur Bindung des Enzyms an die Festphase sind beispielsweise bei A. Wiseman (Handbook of Enzyme Biotechnology, Alice Horwood, Chichester (1985), 2.Aufl., 166 ff.) oder O. Zaborsky (Immobilised Enzy­ mes, CRC Press, Cleveland Ohio (1974), 2. Aufl.) beschrieben.
Seit einiger Zeit ist die Herstellung von definierten dünnen Monoschichten auf Festphasen und die Verwendung dieser Mono­ schichten zur Immobilisierung von biologischen Komponenten bekannt. So beschreiben z. B. Lee et al. (Sens. Act. B, 12 (1993), 153-158) Langmuir-Blodgett-Membranen zur Adsorption von Avidin, an das anschließend eine mit Biotin markierte Glucose- Oxidase gebunden werden kann. FR-A-2682765 offenbart das ge­ meinsame Aufbringen von Glucose-Oxidase und amphiphilen Molekü­ len im Langmuir-Blodgett-Verfahren. Die Verwendung von Lipid- Doppelschichten in Sensoren ist auch bei Tien et al. (Crit. Rev. Biomed. Eng., 18 (1991) 323-340) beschrieben. Ein Nachteil dieser Langmuir-Blodgett-Schichten besteht in ihrer geringen Stabilität.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung molekularer dünner Schichten ist die sogenannte SAM (selbst-assemblierende Mono­ schicht)-Technik, die von Bain und Whitesides (Ang. Chem. 101 (1988), 522-528) beschrieben wurde. Solche selbst-assemblieren­ den Monoschichten entstehen beispielsweise durch Adsorption langkettiger Thiole auf Goldoberflächen. Von Sawaguchi et al. (Bioelectrochemistry and Bioenergetics 29 (1992), 127-133) und Willner et al. (J. Am. Chem.Soc. 114 (1992), 10965-10966) wurde die Immobilisierung von Diaphorase und Gluthationreduktase an eine Metalloberfläche über Thiole beschrieben. Collinson und Bowden (Langmuir 8 (1992), 1247-1250) offenbaren die Immobili­ sierung von cytochrom C an eine Metalloberfläche unter Ver­ wendung von 16-Mercaptohexadecansäure und 11-Mercaptoundecan­ säure. Es wurde gefunden, daß nur ein Drittel der Oberfläche mit Cytochrom C belegt ist. Kinnear und Monbouquette (Langmuir 9 (1993), 2255-2257) beschreiben den Einbau eines direkt auf der Metalloberfläche absorbierten Enzyms in eine selbst-assem­ blierende Monoschicht.
Die bisher beschriebenen Methoden zur Immobilisierung von Enzymen in selbst-assemblierenden Monoschichten haben den Nachteil einer geringen Belegungsdichte des Enzyms und einer geringen Leitfähigkeit und damit verbunden einer geringen Sensitivität der resultierenden Monoschicht. Insbesondere sind die Probleme dadurch bedingt, daß bei Verwendung langkettiger Thiole der Abstand von Enzym zur Metalloberfläche zu groß ist und bei Verwendung kurzkettigerer Thiole die Homogenität der Oberfläche stark abnimmt. Auch die direkte Adsorption des Enzyms auf der Metalloberfläche führt nicht zu einer ausrei­ chend homogenen Schicht und überdies kann bei der direkten Adsorption auf dem Metall eine teilweise Denaturierung der Proteine erfolgen.
Aus WO 92/10757 ist eine Bindematrix bekannt, enthaltend ein Trägermaterial und einen daran über Ankergruppen adsorbierten Festphasenreaktanten, der mit mindestens einem freien Reak­ tionspartner bindefähig ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Festphasenreaktant eine verdünnte und im wesentlichen lateral homogene Bindeschicht auf der Oberfläche des Trägermaterials bildet. Die in WO 92/10757 beschriebenen Festphasen-Reaktanten sind beispielsweise Biotin oder Haptene. Es sind keine Bei­ spiele beschrieben, in denen Enzyme als Festphasenreaktanten verwendet werden.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Problem bestand darin, einen elektrochemischen Sensor bereit zustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest weitgehend beseitigt sind. Insbesondere sollte der Sensor eine hohe Bele­ gungsdichte des Enzyms verbunden mit einer hohen Leitfähigkeit und Sensitivität liefern.
Das erfindungsgemäße Problem wird gelöst durch einen elektro­ chemischen Sensor, enthaltend ein Trägermaterial, das eine Edelmetalloberfläche aufweist, eine adsorptiv an das Trägerma­ terial gebundene und im wesentlichen lateral homogene Mono­ schicht auf der Oberfläche des Trägermaterials, wobei die Monoschicht Bindemoleküle umfaßt, die über Ankergruppen an das Trägermaterial gebunden sind, wobei die Bindemoleküle über eine ionische Bindung, eine kovalente Bindung oder eine Metallche­ latbindung mit einem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind und wobei der Belegungsgrad der Bindemoleküle auf dem Trägerma­ terial geringer als der maximale Belegungsgrad ist.
Der Belegungsgrad der Bindemoleküle ist geringer als der maxi­ male Belegungsgrad, d. h. es liegt eine bezüglich der Bindemole­ küle verdünnte Monoschicht vor. Über den Belegungsgrad der Bindemoleküle kann die Belegung der Festphase mit dem enzyma­ tisch aktiven Protein optimiert werden. Im Optimum ist eine dichtgepackte Enzymschicht realisiert. Der Belegungsgrad der Monoschichten mit den Bindemolekülen ist kleiner als 100% und günstigerweise 1-99%, bevorzugt 2-98% und besonders bevorzugt 5-95%.
Der erfindungsgemäße elektrochemische Sensor enthält aufgrund der auf dem Trägermaterial adsorbierten verdünnten Schicht an Bindemolekülen eine monomolekulare Schicht von vorzugsweise einheitlich ausgerichteten enzymatisch aktiven Proteinen bzw. Enzymen mit maximaler Belegungsdichte auf der Festphase, wo­ durch die Ansprechzeit des Sensors verringert und die Signal­ ausbeute pro Fläche erhöht wird. Ein weiterer Vorteil des Sensors besteht darin, daß die Monoschicht durch ein einfaches Tauchverfahren aufgebracht werden kann. Außerdem eignet sich der erfindungsgemäße Sensor aufgrund der kovalenten Bindung der Enzyme auch sehr gut zur Mehrfach- und Dauermessung.
Das Trägermaterial des erfindungsgemäßen Sensors weist eine Edelmetalloberfläche auf, wobei grundsätzlich alle Edelmetalle oder Edelmetallgemische bzw. Edelmetall-Legierungen mit einem Standard-Elektrodenpotential (d. h. einem Potential gegenüber einer Normalwasserstoffelektrode Pt/H₂ (1 atm)/H⁺ (a = 1)) als Bezugselektrode, das positiver als das Potential einer Silber­ elektrode ist. Beispiele für geeignete Edelmetalle sind Au, Pt, Pd, etc . . Besonders bevorzugt weist das Trägermaterial eine Gold- oder Palladiumoberfläche auf.
Die Herstellung eines Trägermaterials mit einer Edelmetallober­ fläche geschieht beispielsweise durch Bedampfen von Glas mit Chrom als Haftvermittler, wobei eine ca. 0,1-10 nm dicke Schicht entsteht. Diese Chromschicht wird anschließend mit dem Edelmetall, z. B. Gold, bedampft, wobei eine Schicht entsteht, welche die Oberfläche des Trägermaterials darstellt. Diese Edelmetallschicht hat vorzugsweise eine Dicke zwischen 10-200 nm. Bei einem Trägermaterial aus Kunststoff (z. B. Polycarbonat) ist auch ein direktes Aufdampfen des Edelmetalls auf den Träger möglich.
Die Adsorption der Moleküle an die Oberfläche des Trägermateri­ als wird durch Ankergruppen vermittelt. Die Art der Ankergrup­ pen hängt von der jeweiligen Oberfläche des Trägermaterials ab. Als Ankergruppen sind insbesondere Thiol-, Disulfid-, oder/und Phosphingruppen geeignet. Thiol- oder/und Disulfidgruppen sind beispielsweise als Ankergruppen für eine Goldoberfläche und Phosphingruppen als Ankergruppen für eine Palladiumoberfläche besonders geeignet.
Für unterschiedliche Methoden zur Herstellung verdünnter Binde­ schichten wird auf WO 92/10757 verwiesen. In einer ersten Ausführungsform besteht die Monoschicht aus einer einzigen Molekülsorte, wobei die Oberfläche mit Ankergruppen nicht vollständig belegt ist. Die Herstellung einer derartigen Schicht kann beispielsweise durch Eintauchen der Oberfläche in eine Lösung erfolgen, die eine sehr geringe Konzentration (z. B. < 1 × 10-5 mol/l) an Bindemolekülen enthält. Auf diese Weise wird ein verdünnter Film von Bindemolekülen auf der Oberfläche erhalten, auf dem anschließend das Enzym immobilisiert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Monoschicht neben den Bindemolekülen noch weiterhin Verdün­ nungsmoleküle, die über Ankergruppen adsorptiv an das Trägerma­ terial gebunden und nicht mit einem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind. Die Herstellung einer monomolekularen Schicht aus Binde- und Verdünnungsmolekülen erfolgt durch Eintauchen der Oberfläche in eine Lösung, die Binde- und Verdünnungsmole­ küle in gewünschten molaren Anteilen enthält. Auf dieser be­ schichteten Oberfläche kann anschließend die Immobilisierung des Enzyms erfolgen.
Vorzugsweise ist bei der Herstellung des Sensors das molare Verhältnis von Bindemolekülen zu Verdünnungsmolekülen im Be­ reich von 1 : 100 bis 100 : 1, besonders bevorzugt von 1 : 50 bis 50 : 1 und am meisten bevorzugt von 1 : 20 bis 20 : 1. In bestimmten Anwendungen des erfindungsgemäßen Sensors kann es bevorzugt sein, daß das molare Verhältnis von Bindemolekülen zu Verdün­ nungsmolekülen größer als 1 : 1 und insbesondere 5 : 1 bis 20 : 1 ist.
Durch den Einsatz von Verdünnungsmolekülen wird nicht nur eine Optimierung der Enzymbelegung erreicht, sondern auch die Leit­ fähigkeit der Schicht wird überraschenderweise wesentlich erhöht, was für elektrische Anwendungen ein wesentliches Krite­ rium ist. Weiterhin führen die Verdünnungsmoleküle zu einer verringerten unspezifischen Bindung von Komponenten aus einer mit dem Sensor in Kontakt stehenden Probelösung.
Das enzymatisch aktive Protein, das über eine ionische Bindung, eine kovalente Bindung oder eine Metallchelatbindung mit dem Bindemolekül verknüpft ist, wird vorzugsweise aus der Gruppe der Enzyme ausgewählt, die eine Reaktion katalysieren, bei der Verbindungen entstehen oder/und verbraucht werden, die elek­ trochemisch detektierbar sind. Eine derartige Reaktion kann elektrochemisch, z. B. potentiometrisch oder amperometrisch, verfolgt werden. Vorzugsweise sind dies Enzyme, die Reaktionen katalysieren, bei denen Ionen entstehen oder/und verbraucht werden, bei denen H₂O₂ entsteht oder/und bei denen elektroche­ mische Mediatoren umgesetzt werden. Beispiele für derartige Enzyme sind Oxidoreduktasen, d. h. Enzyme, die ein Substratmole­ kül oxidieren oder/und reduzieren können. Es sind aber auch Hydrolasen und solche Enzyme geeignet, bei deren Reaktion eine pH-Änderung erfolgt.
Ein bevorzugtes Beispiel für ein geeignetes Enzym ist eine Glucose-Oxidase (EC 1.1.3.4). Glucose-Oxidase aus dem Mikroor­ ganismus Aspergillus niger ist beispielsweise kommerziell von der Firma Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BRD, erhältlich.
Das enzymatisch aktive Protein kann jedoch auch ein rekombinan­ tes Enzym sein, d. h. ein Enzym, das aus einer heterologen Wirtszelle gewonnen wird. Der Vorteil derartiger rekombinanter Enzyme ist, daß sie durch genetische Manipulation in modifi­ zierter Form eingesetzt werden können, wodurch eine bessere Immobilisierung an der Sensoroberfläche möglich wird. Beispiele für geeignete Modifikationen sind N- oder/und C-terminale Anfügungen von einem oder mehreren Aminosäureresten, ausgewählt aus basischen Aminosäuren, wie etwa Arginin oder Lysin, sauren Aminosäuren wie etwa Aspartat oder Glutamat, chelatbildenden Aminosäuren, wie etwa Histidin, oder Cystein.
Das Enzym kann kovalent, ionisch oder über eine Metallchelat­ bindung mit dem Bindemolekül verknüpft sein. Eine ionische Bindung des Enzyms kann auf der Chemie von Anionen- bzw. Katio­ nen-Austauschern basieren. In dieser Ausführungsform der Erfin­ dung sind die Bindemoleküle über eine ionische Bindung mit dem enzymatisch aktiven Protein verknüpft, wobei die Bindung zwi­ schen einer geladenen Endgruppe des Bindemoleküls und einem entgegengesetzt geladenen Bereich des enzymatisch aktiven Proteins erfolgt. So kann die geladene Endgruppe des Bindemole­ küls beispielsweise mindestens eine Aminofunktion umfassen und der entgegengesetzt geladene Bereich des enzymatisch aktiven Proteins mindestens einen sauren Aminosäurerest, vorzugsweise eine Serie von z. B. 2 bis 8 Aspartat- oder Glutamatresten umfassen. Andererseits kann die geladene Endgruppe des Bindemo­ leküls mindestens eine Carboxylat- oder/und vorzugsweise Sulfo­ natfunktion umfassen und der entgegengesetzt geladene Bereich des Enzyms kann mindestens einen basischen Aminosäurerest, vorzugsweise eine Serie von z. B. 2 bis 8 Arginin- oder/und Lysinresten umfassen. Ein Vorteil der Immobilisierung von Enzymen auf diese Weise besteht darin, daß eine gerichtete Bindung des Enzyms an die Festphase ermöglicht wird. Ein weite­ rer Vorteil ist, daß das aktive Zentrum des Enzyms nicht beein­ trächtigt wird, wenn der mit dem Bindemolekül reagierende Bereich ein am N- oder/und C-Terminus des Enzyms angefügter Abschnitt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Enzym kovalent mit dem Bindemolekül verknüpft sein, wobei die Bindung zwischen einer reaktiven Endgruppe des Bindemoleküls und einer reaktiven Gruppe des enzymatisch aktiven Proteins erfolgt. Ein bevorzugtes Beispiel für eine reaktive Endgruppe des Bindemole­ küls ist eine Maleimidgruppe, die min einem Cysteinrest des Enzyms reagieren kann. Ein weiteres Beispiel für eine kovalente Bindung ist die Bindung von Phenolresten des Enzyms an eine Diazonium-Gruppe im Bindemolekül. Auch die Kopplung von oxi­ dierten Zuckerresten des Enzyms an Amino-Endgruppen der Binde­ moleküle ist möglich. Eine ausführliche Übersicht über mögliche kovalente Immobilisierungsmittel, die bei den erfindungsgemäßen Sensoren eingesetzt werden könne, findet sich in den bereits genannten Literaturstellen Wiseman und Zaborsky. Auf diese Offenbarung wird hiermit Bezug genommen.
Auch die Bindung über Metallchelate ist zur Immobilisierung von Enzymen möglich, wobei die Bindung zwischen einer chelatbil­ denden Endgruppe des Bindemoleküls, einem Metallion und einem chelatbildenden Bereich des enzymatisch aktiven Proteins er­ folgt.
Die chelatbildende Endgruppe des Bindemoleküls kann beispiels­ weise eine Di- oder Tricarboxylatgruppe umfassen und der che­ latbildende Bereich des enzymatisch aktiven Proteins kann eine Serie von benachbarten Histidinresten umfassen. Beispiele für geeignete chelatbildende Metallionen sind z. B. Nickel-, Eisen-, Kobalt-, Kupfer- und Zinkionen. Auch bei der Bindung über Metall-Chelate ist eine gerichtete Bindung von Enzymen an die Festphase möglich.
Für einen erfindungsgemäßen Sensor ist weiterhin bevorzugt, daß das Bindemolekül zwischen der Ankergruppe und der zur Bindung mit dem enzymatisch aktiven proteinfähigen Endgruppe einen Spacer enthält. Die Länge des Spacers zwischen der Ankergruppe und der Bindestelle zum Enzym kann auf die Funktion des Sensors erheblichen Einfluß ausüben. Eine Variation der Länge kann die Leitfähigkeit sowie die Zugänglichkeit der Bindestellen für das Enzym beeinflussen. Vorzugsweise ist der Spacer eine gegebenen­ falls Heteroatome, z. B. S-, N- oder/und O-Atome, enthaltende Alkylenkette mit einer Länge von 4-30 Atomen. Besonders bevor­ zugt enthält der Spacer 1-4 C₂-C₄-Alkylenoxideinheiten, vorzugs­ weise 1-4 Ethylenoxideinheiten.
Die Verdünnungsmoleküle enthalten ebenso wie die Bindemoleküle eine zur Adsorption an die Festphase geeignete Ankergruppe, d. h. eine Thiol-, Disulfid-, oder/und Phosphingruppe. Die andere Endgruppe der Verdünnungsmoleküle ist vorzugsweise eine hydrophile Funktion, z. B. eine Hydroxyl-, eine C₁-C₄-Alkoxy, eine Amino-, eine Carboxyl-, eine Carbonsäureester- oder eine Carbonsäureamidfunktion. Zwischen der Endgruppe und der Anker­ gruppe der Verdünnungsmoleküle befindet sich vorzugsweise ebenfalls ein Spacer wie oben definiert. Besonders bevorzugt enthält der Spacer für die Verdünnungsmoleküle bis zu 15 Atome und mindestens eine Ethylenoxideinheit.
Die Herstellung von genetisch modifizierten Proteinen, die aufgrund einer Modifizierung insbesondere am C- oder/und N- Terminus einheitlich ausgerichtet an eine Festphase gebunden werden können, sowie eine Festphase mit dem ausgerichtet immo­ bilisierten Protein wird in WO 92/08788 offenbart. Eine Metall­ chelat-Bindung oder eine ionische Bindung als mögliche Immobi­ lisierungsmethode von Enzymen wird nicht offenbart. Stayton et al. (J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 9298-9299) beschreiben die gerichtete Bindung von Cytochrom C durch genetische Modifika­ tion und direkte Bindung des an die Oberfläche des Enzyms eingeführten Cysteinrests an eine Goldoberfläche. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß keine andere Gruppe an der Oberfläche des Enzyms vorhanden sein darf, die eine Adsorption auf der Metalloberfläche zeigt. Da aber hydrophobe Oberflächen wie Metalle oft eine starke unspezifische Adsorption von Pro­ teinen zeigen, dürfte die Anwendung der obengenannten Enzymsen­ soren große Nachteile aufweisen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein elektrochemi­ scher Sensor enthaltend ein Trägermaterial, das eine Edelme­ talloberfläche aufweist, eine adsorptiv an das Trägermaterial gebundene und im wesentlichen lateral homogene Monoschicht auf der Oberfläche des Trägermaterials, wobei die Monoschicht Bindemoleküle umfaßt, die über Ankergruppen an das Trägermate­ rial gebunden sind, wobei die Bindemoleküle über eine ionische Bindung mit mindestens einem und vorzugsweise einer Serie von geladenen Aminosäureresten am N- oder/und C-Terminus eines enzymatisch aktiven Proteins verknüpft sind.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein elektrochemischer Sensor enthaltend ein Trägermaterial, das eine Edelmetalloberfläche aufweist, eine adsorptiv an das Trä­ germaterial gebundene und im wesentlichen lateral homogene Monoschicht auf der Oberfläche des Trägermaterials, wobei die Monoschicht Bindemoleküle umfaßt, die über Ankergruppen an das Trägermaterial gebunden sind, wobei die Bindemoleküle über eine Metallchelatbindung mit mindestens einem und vorzugsweise einer Serie von benachbarten chelatbildenden Aminosäureresten am N- oder/und C-Terminus eines enzymatisch aktiven Proteins verknüpft sind.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probelösung, wobei man die Probelösung mit einem erfindungsgemäßen Sensor inkubiert, unter Bedingungen, die zu einer elektrochemisch nachweisbaren Reak­ tion des Analyten führen, und die Reaktion des Analyten durch eine elektrochemische Messung, z. B. durch eine potentiome­ trische oder amperometrische Messung bestimmt.
Ein bevorzugtes Beispiel für einen Analyten ist Glucose, wobei in diesem Fall ein Sensor mit einer immobilisierten Glucose- Oxidase zur Bestimmung verwendet wird. Besonders bevorzugt wird eine durch rekombinante DNA-Technologie modifizierte Glucose- Oxidase mit einer N- oder/und C-terminalen Anfügung von sauren, basischen, chelatbildenden Aminosäureresten oder/und Cysteinre­ sten verwendet.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der allgemeinen Formel
A-(Sp-X)n (I),
worin A eine HS- oder H₂P-Gruppe und n 1 bedeutet oder A eine -SS-Gruppe und n 2 bedeutet, Sp einen Spacer mit einer Kettenlänge von 4-30 Atomen bedeutet und X eine Maleimidgruppe oder eine Gruppe mit mindestens zwei positiven oder negativen Ladungen, z. B. eine Guanidiniumgruppe oder eine Gruppe der Formel (II)
ist.
Derartige Verbindungen werden vorzugsweise zur Herstellung von elektrochemischen Sensoren verwendet.
Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Abb. 1-7 erläutert.
Es zeigen:
Abb. 1: a) ein Verdünnermolekül (Verbindung A)
b) ein Bindemolekül mit Biotingruppe (Verbindung B)
c) ein Bindemolekül mit einer chelatbildenden End­ gruppe (Verbindung C)
d) ein Bindemolekül mit einer reaktiven Maleimid- Endgruppe (Verbindung D),
Abb. 2: ein Cyclovoltammogramm der Sensoren
a) beschichtet mit reiner Verbindung B
b) beschichtet mit einem Gemisch aus den Verbindun­ gen A und B (10 : 1),
Abb. 3: ein Cyclovoltammogramm der Sensoren
a) beschichtet mit reiner Verbindung C
b) beschichtet mit einem Gemisch aus den Verbindun­ gen A und C (1 : 10),
Abb. 4: die Ergebnisse einer amperometrischen Bestimmung bei Bindung von Glucose-Oxidase-His₄ an unbeschichtete Goldoberflächen, an mit Verdünnungsmolekülen (Ver­ bindung A) beschichtetes Gold und an mit einem che­ latbildenden Bindemolekül (Verbindung C) beschichte­ tes Gold,
Abb. 5: die Abhängigkeit des Stromsignals von der Glucosekon­ zentration bei einem Sensor gemäß Beispiel 6,
Abb. 6: die Reproduzierbarkeit aufeinanderfolgender Messungen bei einem Sensor gemäß Beispiel 6,
Abb. 7: ein Cyclovoltammogramm der Sensoren
a) beschichtet mit reiner Verbindung D
b) beschichtet mit einem Gemisch aus den Verbindun­ gen A und D (1 : 10),
Abb. 8: die Abhängigkeit des Stromsignals von der Glucosekon­ zentration bei einem Sensor gemäß Beispiel 7.
Beispiel 1 Herstellung von modifizierten Glucose-Oxidase-(GOD)-Molekülen 1.1 Konstruktion des Plasmids YEpL/AD-GOD
Das Expressionsplasmid YEpL/AD-GOD leitet sich von dem Plasmid YEpL/GOD (Herstellung und Beschreibung, siehe DE-A-43 01 904, Beispiel 1.1-1.5) ab. Das Plasmid YEpL/GOD enthält das GOD-Gen aus Aspergillus niger und eignet sich zur rekombinanten Ex­ pression und Sekretion von GOD in Saccharomyces cerivisiae.
Aus konstruktionstechnischen Gründen wurde das nicht essen­ tielle positive Regulatorgen MAL2-8cp in YEpL/GOD (stimuliert den für die GOD-Expression verwendeten α-Glucosidase Promotor) durch einen Polylinker ersetzt. Dies ermöglicht die Konstruk­ tion von C-terminalen GOD-Fusionsproteinen mittels einer nun singulär vorhandenen Sphl Restriktionsschnittstelle.
Dazu wurde das Plasmid YEpL/GOD mit den Restriktionsendonuklea­ sen BamHl und Mlul verdaut, das ca. 10,2 kBp lange BamHl/Mlul- YEpL/GOD-Vektorfragment isoliert und mit dem folgenden, aus 2 Oligonukleotiden durch Hybridisierung hergestellten, DNA-Linker ligiert.
Das gewünschte Plasmid YEpL/AD-GOD wurde durch Restriktions­ kartierung identifiziert und weiter analysiert.
1.2 Herstellung von GOD-(HIS)₄
Das Expressionsplasmid YEpL/GOD-(His)₄ enthält ein GOD-Gen mit 4 zusätzlichen C-terminalen His-Resten. Die Isolierung und enzy­ matische Charakterisierung von GOD-(His)₄ sind in DE-A-43 01 904 (Beispiele 4, 7 und 8) beschrieben.
1.3 Herstellung von GOD-(HIS)₄Cys 1.3.1. Konstruktion des Plasmids YEpL/GOD-(His)₄Cys
Das Plasmid enthält ein modifiziertes GOD Gen, das für eine GOD Enzymvariante kodiert, die C-terminal zusätzlich 4 Histidin­ reste und einen Cysteinrest besitzt.
Das Plasmid YEpL/GOD-(His)₄Cys wurde entsprechend wie das Plas­ mid GOD-(His)₄ mittels 2 komplementärer Oligonukleotide aus dem Plasmid YEpL/AD-GOD hergestellt.
Dazu wurde das Plasmid YEpL/AD-GOD mit SphI und PvuII gespal­ ten, das ca. 10,2 kBp lange SphI/PvuII-YEpL/GOD-Vektorfragment isoliert und mit dem folgenden, aus 2 Oligonukleotiden durch Hybridisierung hergestellten, DNA Linker ligiert.
Das gewünschte Plasmid YEpL/GOD-(His)₄Cys wurde durch Restrik­ tionskartierung (neue EcoRI Schnittstelle) identifiziert und durch partielle Sequenzierung (C-terminale Bereich des GOD Strukturgens) weiter analysiert.
1.3.2. Expression, Reinigung und enzymatische Charakterisie­ rund von GOD-(His)₄Cys
Die Expression, Reinigung und enzymatische Charakterisierung erfolgte entsprechend wie für GOD-(His)₄ in DE-A-43 01 904, (Beispiele 4, 7 und 8) beschrieben.
1.4. Herstellung von GOD-Cys 1.4.1 Konstruktion des Plasmids YEpL/GOD-Cys
Das Plasmid enthält ein modifiziertes GOD Gen, das für eine GOD Enzymvariante kodiert, die C-terminal zusätzlich einen Cystein­ rest besitzt.
Das Plasmid YEpL/GOD-Cys wurde entsprechend wie das Plasmid GOD-(His)₄Cys mittels 2 komplementärer Oligonukleotide aus dem Plasmid YEpL/AD-GOD hergestellt.
Dazu wurde das Plasmid YEpL/AD-GOD mit SphI und PvuII gespal­ ten, das ca. 10,2 kBp lange SphI/PvuII-Fragment isoliert und mit dem folgenden, aus 2 Oligonukleotiden durch Hybridisierung hergestellten, DNA Linker ligiert.
Das gewünschte Plasmid YEpL/GOD-Cys wurde durch Restriktions­ kartierung identifiziert (neue EcoRI Schnittstelle) und durch partielle Sequenzierung (C-terminaler Bereich des GOD Struktur­ gens) weiter analysiert.
1.4.2. Exoression Reinigung und enzymatische Charakterisie­ rung von GOD-(His)₄Cys
Die Expression, Reinigung und enzymatische Charakterisierung erfolgte entsprechend wie für GOD-(His)₄ in der DE-A-43 01 904, (Beispiele 4, 7 und 8) beschrieben.
Die C-terminalen GOD-Fusionsproteine GOD-(His)₄, GOD-(His)₄-Cys und GOD-Cys verhalten sich in Hefe (in Wildtyp und glycosylie­ rungsdefekten Hefestämmen) hinsichtlich Sekretion, Glycosylie­ rung, Kohlenhydratanteil, spezifischer Aktivität, Thermo- und pH-Stabilität wie das nicht modifizierte GOD Enzym.
Beispiel 2 Herstellung eines Verdünnungsmoleküls A. 2 (S-Acetyl)mercaptopropionsäure-2-(2-hydroxyethoxy)ethylamid
Eine Lösung von 5 g (20 mmol) N-Succinimidyl-S-acetylthiopro­ pionat (Herstellung vgl. Beispiel 28 von WO-A-92/10757) in 50 ml THF wurden tropfenweise zu einer Lösung von 2,14 g (20 mmol) 2-(2-Aminoethoxy)ethanol in 25 ml THF im Zeitraum von 15 Min. zugegeben und für 2 Stunden bei 20°C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion (DC-Kontrolle) wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und durch Chromatographie an Silicagel gereinigt.
Ausbeute 2,7 g
DC: Kieselgel 60
Eluens: Ethylacetat/Methanol = 7 : 3 + 1% Essigsäure
RF = 0,67
MS (Pos FAB) : MH⁺ = 236.
B. 2-Mercaptopropionsäure-[2-(2-hydroxyethoxy)]ethylamid
600 ml einer 1 mol/l Lösung von Hydroxylamin in Methanol wurden zu 2,7 g (8,7 mmol) der unter Punkt A hergestellten Verbindung gegeben und für eine Stunde bei 20°C gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Es wurden 1,5 g eines öligen Rohprodukts erhalten und durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Diese Verbindung ist als Verdünnungsmole­ kül einsetzbar.
Ausbeute: 0,86 g (farbloses Öl)
DC: Kieselgel 60,
Eluens: Dichlormethan/Methanol = 9/1
RF = 0,45
MS (pos. FAB) : MH⁺ = 194.
C. Aus der unter Punkt B hergestellten Thiolverbindung wurde durch Oxidation die Disulfidverbindung (Verbindung A) hergestellt.
Beispiel 3 Herstellung eines chelatbildenden Bindemoleküls (Verbindung C)
28 g Bromessigsäure wurden in 75 ml 2 N NaOH gelöst und auf 0°C abgekühlt. N-Boc-L-Lysin wurde in 75 ml 2 N NaOH gelöst und langsam zur Bromessigsäure getropft. Nach dem Zutropfen wurde das Eisbad entfernt, auf 70°C erwärmt und weitere 2 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf das halbe Volumen eingeengt und anschließend mit 300 ml 1 N HCl versetzt. Dabei bildete sich ein weißer Niederschlag. Der Ansatz wurde 3-4 Stunden bei 4°C stehengelassen, abgesaugt und der Rückstand 1 × mit Eiswasser gewaschen und getrocknet. Die Substanz (15,3 g) wurde anschlie­ ßend in 100 ml Chloroform suspendiert. 20 ml Trifluoressigsäure wurden zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Chloroform und Trifluoressigsäure wurden am Hochvakuum abgezo­ gen und der zähe Rückstand wurde mit 100 ml Ether versetzt und gerührt, bis sich ein weißer Feststoffabschied. Die Substanz wurde abgesaugt, gewaschen und getrocknet (Ausbeute 15,3 g). 1,5 g dieser Substanz wurden in 30 ml Methanol und 1,62 g Triethylamin gelöst. Unter Rühren wurden 0,92 g N-Succinimidyl- S-acetylthioacetat zugegeben. 3 Stunden wurde bei Raumtempera­ tur gerührt und anschließend das Lösungsmittel abgezogen. Das Produkt wurde über eine Kieselgelsäule gereinigt (Ausbeute 2 g). Dieses Produkt wurde anschließend unter Stickstoff in 40 ml 12,5%iger Ammoniaklösung gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde am Hochvakuum eingeengt und das Produkt anschließend säulenchromatographisch isoliert (Ausbeute 500 mg).
Beispiel 4 Herstellung eines Bindemoleküls mit einer reaktiven Maleimid­ gruppe (Verbindung D)
10,9 g Dithiodipropionsäure, 12,7 g N-Hydroxysuccinimid und 22,7 g Dicyclohexylcarbodiimid wurden in 100 ml DMF und 100 ml Dioxan gelöst und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. An­ schließend wurde der Niederschlag abgesaugt und das Lösungs­ mittel abgezogen. Man erhielt 18,5 g eines öligen Rückstandes. 2,06 g des Produkts wurden in 100 ml Dioxan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2,78 g Mono-N-Boc-1,8-diamino-3,6-dioxaoctan gegeben und bei Raumtemperatur 12 Stunden gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 2,2 ml Trifluoressigsäure versetzt, am Rotationsverdampfer bis auf ca. 20 ml eingeengt und säulen­ chromatographisch gereinigt. Man erhielt nach Abziehen des Lösungsmittels ca. 4 g eines öligen Produkts. Dieses Produkt wurde in 50 ml Dioxan gelöst und zu dieser Lösung wurden 3,1 g Maleimidohexanoyl-N-hydroxy-succinimidester in 10 ml Dioxan gegeben. Der Ansatz wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur ge­ rührt, anschließend das Lösungsmittel abgezogen und säulen­ chromatographisch gereinigt. Vom Produkt wurden 190 mg als weißes Pulver erhalten.
Beispiel 5 (Vergleich)
Auf Polycarbonatträger wurden nacheinander 2 × 40 nm Gold aufgedampft. Die Träger wurden anschließend in 5 · 10-4 mol/l eines Gemisches aus der Biotinverbindung B (Synthese: siehe Beispiel 29 von W0-A-92/10757) und Verbindung A (Synthese: siehe Beispiel 2) im molaren Verhältnis von 1 : 10 in Wasser 1 h lang inkubiert. Nach gründlichem Waschen in Wasser wurde im Argonstrom getrocknet.
Die elektrochemische Umsetzung von 1 mmol/l K₄[Fe(CN)₆] und N,N-Dimethylnitrosoanilin wurde mit Hilfe der Cyclovoltam­ metrie charakterisiert. Während eine unverdünnte SAM aus der reinen Verbindung B die Umsetzung von Hexacyanoferrat nahezu vollständig verhinderte, wurde durch das Aufbringen einer Mischschicht eine gute Leitfähigkeit der Oberfläche hergestellt (Abb. 2). Oberflächenplasmonen-Resonanz- und Kontaktwinkelmes­ sungen wiesen auf eine dichte Belegung der Oberfläche hin.
Die mit Bindemolekül (Verbindung B) und Verdünner (Verbindung A) beschichtete Elektrode wurde anschließend 1 h lang in eine Lösung von Streptavidin (1 mg/ml) in 0,1 mol/l Kaliumphosphat­ puffer pH 7,0 getaucht, mit Puffer gespült und 1 h in einer Lösung von biotinylierter Glucoseoxidase in oben genanntem Puffer (1 mg/ml) inkubiert. Nach erneutem gründlichem Spülen mit Puffer und Wasser war der Sensor einsatzfähig.
Die Bestimmung des Analyten, in diesem Fall Glucose (10 mmol/l), erfolgte amperometrisch. Der Probelösung wurde Media­ tor, z. B. N-Nitrosoanilin in einer Konzentration von 1·10-3 mol/l, zugegeben und nach einer Inkubationszeit von 2 min. der Strom bei entsprechend dem Mediator angelegten Potential, hier 240 mV, gemessen.
Es wurden mit diesem Sensor nur sehr geringe Ströme bei Gluco­ sezusatz erzielt, obwohl die GOD-Aktivität photometrisch nach­ weisbar war. Die in WO-A-92/10757 beschriebene Universalbinde­ phase ist somit für elektrochemische Enzymsensoren nicht opti­ mal. Die nächsten Beispiele beschreiben die Veränderung des Bindemoleküls, um zu einem für elektrochemische Anwendungen ge­ eigneten Aufbau zu kommen.
Beispiel 6
Die Goldträger entsprachen denen aus Beispiel 5. Die Träger wurden in 2·10-3 mol/l eines Gemisches aus Verbindung C (Mercap­ tonitrilotriessigsäure) und Verbindung A in Methanol 1 h lang inkubiert. Nach gründlichem, aufeinanderfolgendem Waschen in reinem Methanol und Wasser wurde 10 min. in einer 0,2%igen Lösung von NiCl₂ in Wasser inkubiert, wieder mehrmals in Wasser gewaschen und im Argonstrom getrocknet.
Die Schicht wurde mit Hilfe der Cyclovoltammetrie charakteri­ siert (vgl. Beispiel 5). Während beim Aufbringen der reinen Verbindung C der Umsatz redoxaktiver Substanzen wie K₄[(Fe(CN)₆] sehr stark erschwert war, führte die zusätzliche Bindung der Verbindung A auf der Goldoberfläche zu einer guten Reaktion des Mediators an der Elektrode (Abb. 3).
Auf Genebene modifizierte Glucoseoxidase, die C-terminal mit Histidinresten verlängert ist (vgl. Beispiel 1), wurde über Metallchelatbindung an die Festphase gebunden, indem man den modifizierten Träger 1 h in eine Lösung des Enzyms in 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 tauchte.
Die funktionsabhängige Bewertung fand wie in Beispiel 5 be­ schrieben mit einer 10 mmol/l Glucoselösung, N,N-Dimethyl-4- nitrosoanilin als Mediator und einem Potential von 240 mV statt. Abb. 4 und Tab. 1 zeigen, daß der gewählte Sensoraufbau zu einer deutlich höheren Sensitivität führte als die direkte Immobilisierung des Enzyms auf der Goldoberfläche und die Immobilisierung auf der reinen Verbindung C. Ein molares Ver­ hältnis der Verbindungen C und A von 10 : 1 erwies sich als am günstigsten. Im Gegensatz dazu kam es nicht zu einer Bindung des Enzyms an Oberflächen der reinen Verbindung A. Das Signal an einem Sensor, der mit einem Gemisch der Verbindungen A und C beschichtet war, verhielt sich proportional zum Gehalt der Glucose in der Probelösung (Abb. 5). Zudem war das Signal bei mehreren aufeinanderfolgenden Messungen stabil (Abb. 6).
Beispiel 7
Die Goldträger entsprachen denen aus Beispiel 1. Sie wurden 1 h in einer Lösung der Verbindung D ("Maleimidlinker") und Ver­ bindung A im molaren Verhältnis von 10 : 1 (beste Ergebnisse) und in einer Gesamtkonzentration von 1·10-3 mol/l in Methanol inku­ biert. Nach gründlichem Waschen in Methanol und Wasser wurde im Argonstrom getrocknet.
Das Cyclovoltammogramm mit 1 mmol/l K₄[Fe(CN)₆] zeigt, daß die dicht gepackte Schicht der reinen Verbindung D den Umsatz von N,N-Dimethylnitrosoanilin stark verringerte. Durch einen Zusatz der Verbindung A wurde diese Barriere aufgehoben, und die Ober­ fläche verhielt sich bezüglich der Redoxreaktion ähnlich aktiv wie reines Gold (Abb. 7).
Anschließend erfolgte eine einstündige Inkubation des Trägers in einer Lösung von SH-modifizierter Glucoseoxidase GOD-Cys (1 mg/ml) in 0,1 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7,0. Dabei wurde das Enzym kovalent über die Thiolgruppen an die Maleimid-End­ gruppe des Linkers gebunden. Die Bestimmung des Analyten wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Abb. 8 zeigt die Zunahme des Stromes mit der Analytkonzentration.

Claims (29)

1. Elektrochemischer Sensor, enthaltend ein Trägermaterial, das eine Edelmetalloberfläche auf­ weist,
eine adsorptiv an das Trägermaterial gebundene und im wesentlichen lateral homogene Monoschicht auf der Ober­ fläche des Trägermaterials, wobei die Monoschicht Bindemo­ leküle umfaßt, die über Ankergruppen an das Trägermaterial gebunden sind,
wobei die Bindemoleküle über ein ionische Bindung, eine kovalente Bindung oder eine Metallchelatbindung mit einem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind und wobei der Belegungsgrad der Bindemoleküle auf dem Trägermaterial geringer als der maximale Belegungsgrad ist.
2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial eine Gold- oder Palladiumoberfläche aufweist.
3. Sensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankergruppen Thiol-, Disulfid-, oder/und Phosphin­ gruppen sind.
4. Sensor nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Monoschicht weiterhin Verdünnungsmoleküle umfaßt, die über Ankergruppen adsorptiv an das Trägermaterial gebunden und nicht mit einem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind.
5. Sensor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von Bindemolekülen zu Verdün­ nungsmolekülen im Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1 ist.
6. Sensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von Bindemolekülen zu Verdün­ nungsmolekülen im Bereich von 1 : 50 bis 50 : 1 ist.
7. Sensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von Bindemolekülen zu Verdün­ nungsmolekülen im Bereich von 1 : 20 bis 20 : 1 ist.
8. Sensor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymatisch aktive Protein aus der Gruppe der Enzyme ausgewählt ist, die eine Reaktion katalysieren, bei der Verbindungen entstehen oder/und verbraucht werden, die elektrochemisch detektierbar sind.
9. Sensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymatisch aktive Protein eine Oxidoreductase oder Hydrolase ist.
10. Sensor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymatisch aktive Protein eine Glucose-Oxidase (E.C.1.1.3.4) ist.
11. Sensor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymatisch aktive Protein ein rekombinantes Enzym ist.
12. Sensor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das enzymatisch aktive Protein durch N- oder/und C- terminale Anfügung von einem oder mehreren Aminosäurere­ sten, ausgewählt aus basischen Aminosäuren, sauren Amino­ säuren, chelatbildenden Aminosäuren oder Cysteinresten modifiziert ist.
13. Sensor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindemoleküle über eine ionische Bindung mit dem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind, wobei die Bindung zwischen einer geladenen Endgruppe des Bindemole­ küls und einem entgegengesetzt geladenen Bereich des enzy­ matisch aktiven Proteins erfolgt.
14. Sensor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die geladene Endgruppe des Bindemoleküls mindestens eine Aminofunktion umfaßt und der entgegengesetzt geladene Bereich des enzymatisch aktiven Proteins mindestens einen Aspartat- oder/und Glutamatrest umfaßt.
15. Sensor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die geladene Endgruppe des Bindemoleküls mindestens eine Carboxylat- oder/und Sulfonatfunktion umfaßt und der entgegengesetzt geladene Bereich des enzymatisch aktiven Proteins mindestens einen Arginin- oder/und Lysinrest umfaßt.
16. Sensor nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindemoleküle über eine kovalente Bindung mit dem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind, wobei die Bindung zwischen einer reaktiven Endgruppe des Bindemole­ küls und einer reaktiven Gruppe des enzymatisch aktiven Proteins erfolgt.
17. Sensor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Endgruppe des Bindemoleküls eine Malei­ midgruppe umfaßt und die reaktive Gruppe des enzymatisch aktiven Proteins einen Cysteinrest umfaßt.
18. Sensor nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindemoleküle über eine Metallchelatbindung mit dem enzymatisch aktiven Protein verknüpft sind, wobei die Bindung zwischen einer chelatbildenden Endgruppe des Bin­ demoleküls, einem Metallion und einem chelatbildenden Bereich des enzymatisch aktiven Proteins erfolgt.
19. Sensor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die chelatbildende Endgruppe des Bindemoleküls eine Di- oder Tricarboxylatgruppe umfaßt und der chelatbildende Bereich des enzymatisch aktiven Proteins mindestens einen Histidinrest umfaßt.
20. Sensor nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallion ein Nickel-, Eisen-, Kobalt-, Kupfer- oder Zinkion ist.
21. Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemolekül zwischen der Ankergruppe und der zur Bindung mit dem enzymatisch aktiven Protein fähigen End­ gruppe einen Spacer enthält.
22. Sensor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer eine gegebenenfalls Heteroatome enthaltende Alkylenkette mit einer Länge von 4-30 Atomen ist.
23. Elektrochemischer Sensor enthaltend ein Trägermaterial, das eine Edelmetalloberfläche auf­ weist, eine adsorptiv an das Trägermaterial gebundene und im wesentlichen lateral homogene Monoschicht auf der Ober­ fläche des Trägermaterials, wobei die Monoschicht Bindemo­ leküle umfaßt, die über Ankergruppen an das Trägermaterial gebunden sind, wobei die Bindemoleküle über eine ionische Bindung mit mindestens einem geladenen Aminosäurerest am N- oder/und C-Terminus eines enzymatisch aktiven Proteins verknüpft sind.
24. Elektrochemischer Sensor enthaltend ein Trägermaterial, das eine Edelmetalloberfläche auf­ weist, eine adsorptiv an das Trägermaterial gebundene und im wesentlichen lateral homogene Monoschicht auf der Ober­ fläche des Trägermaterials, wobei die Monoschicht Bindemo­ leküle umfaßt, die über Ankergruppen an das Trägermaterial gebunden sind, wobei die Bindemoleküle über eine Metall­ chelatbindung mit mindestens einem chelatbildenden Amino­ säurerest am N- oder/und C-Terminus eines enzymatisch aktiven Proteins verknüpft sind.
25. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probelö­ sung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probelösung mit einem Sensor nach einem der Ansprüche 1-24 unter Bedingungen, die zu einer elektroche­ misch nachweisbaren Reaktion des Analyten führen, kontak­ tiert und die Reaktion des Analyten durch eine elektroche­ mische Messung bestimmt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man Glucose als Analyten bestimmt.
27. Verbindung der allgemeinen Formel A-(Sp-X)n (I),worin A eine HS- oder H₂P-Gruppe und n 1 bedeutet oder A eine -SS-Gruppe und n 2 bedeutet,
Sp einen Spacer mit einer Kettenlänge von 4-30 Atomen bedeutet und X eine Maleimidgruppe oder eine Gruppe mit mindestens zwei positiven oder negativen Ladungen bedeu­ tet.
28. Verbindung nach Anspruch 27, worin X eine Guanidiumgruppe oder eine Gruppe der Formel (II) ist.
29. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 27 oder 28 zur Herstellung eines elektrochemischen Sensors.
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