DE4419140B4

DE4419140B4 - Method for finding antimicrobial compounds

Info

Publication number: DE4419140B4
Application number: DE4419140A
Authority: DE
Inventors: Tsung Chain Yung-May Chang; Hui Cheng Tou-Fen Chen
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1994-05-30
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2014-05-31
Also published as: NL194335B; GB2289946A; NL9400872A; DE4419140A1; GB2289946B; NZ260609A; FR2720409B1; US5591599A; NL194335C; GB9410623D0; FR2720409A1

Abstract

Verfahren zum Bestimmen der Konzentration einer antimikrobischen Verbindung in einer Probe mit den Stufen:
– Zugeben der Probe zu einem Kulturmedium;
– Wachsenlassen eines Mikroorganismus in dem Kulturmedium, wobei das Wachstum des Mikroorganismus gegenüber der Inhibierung durch die Verbindung empfindlich ist;
– Messen eines elektrischen Parameters des Kulturmediums über einen Zeitraum;
– Bestimmen eines ersten Zeitpunkts, bei dem eine beschleunigte Änderung des elektrischen Parameters auftritt, wobei die Änderung vom Wachstum des Mikroorganismus herrührt; und
– Vergleichen des ersten Zeitpunkts mit mehreren anderen Zeitpunkten, um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, wobei jeder der anderen Zeitpunkte wie der erste Zeitpunkt bestimmt wird, mit dem Unterschied, dass die Verbindung in dem Kulturmedium in einer bekannten Konzentration vorhanden ist und weiterhin eine lineare Beziehung zwischen den anderen Zeitpunkten und ihren entsprechenden Konzentrationen besteht.Method for determining the concentration of an antimicrobial compound in a sample having the steps:
Adding the sample to a culture medium;
Growing a microorganism in the culture medium, wherein the growth of the microorganism is sensitive to inhibition by the compound;
- measuring an electrical parameter of the culture medium over a period of time;
Determining a first time at which an accelerated change of the electrical parameter occurs, the change resulting from the growth of the microorganism; and
Comparing the first time with a plurality of other times to determine the concentration of the compound, each of the other times being determined as the first time, with the difference that the compound is present in the culture medium at a known concentration and further a linear one Relationship between the other times and their respective concentrations.

Description

Antimikrobische Verbindungen wie Antibiotika und Medikamente wurden als Teil der Milchviehhaltung über viele Jahrzehnte eingesetzt. Leider können in diesen Behandlungen verwendete antimikrobische Verbindungen in die Milchversorgung gelangen. Wenn sie einmal in Milch vorhanden sind, können sie schwer beseitigt werden; ihr Vorhandensein betrifft die öffentliche Gesundheit.Antimicrobial Compounds such as antibiotics and medications have been used as part of Dairy farming over used for many decades. Unfortunately, in these treatments used antimicrobial compounds enter the milk supply. Once they are present in milk, they can be hard to eliminate; their presence affects the public Health.

Geschätzte 5% bis 10% der amerikanischen Erwachsenen sind gegen Antibiotika hypersensibel. Nach Aufnahme von lediglich 0,003 IE Penicillin G können allergische Reaktionen auftreten. Antibiotische Rückstände können gleichfalls eine Umgebung schaf fen, die für resistente Bakterienstämme vorteilhaft ist. In Milch vorhandene Antibiotika führten gleichfalls zu Problemen in der milchverarbeitenden Industrie, wie unzureichende Milchgerinnung, nicht ordnungsgemäßes Käsereifen und verringerte Säure oder Geschmackseinbußen. Über eine 50%ige Inhibierung von Käse und Joghurt Startkulturen durch 0,2 IE/ml Penicillin wurde berichtet. Das FDA sieht mit Antibiotika kontaminierte Milch als verfälscht an. Daher ist der Test auf antimikrobische Verbindungen wie Antibiotika in Milch wichtig für die milchverarbeitende Industrie.Estimated 5% Up to 10% of American adults are hypersensitive to antibiotics. After taking up only 0.003 IU penicillin G may be allergic Reactions occur. Antibiotic residues can also create an environment sheep for resistant bacterial strains is advantageous. Antibiotics present in milk also resulted to problems in the dairy industry, such as insufficient milk clotting, improper cheese tire and reduced acidity or loss of taste. Over a 50% inhibition of cheese and yogurt start cultures by 0.2 IU / ml penicillin has been reported. The FDA sees milk contaminated with antibiotics as being adulterated. Therefore, the test for antimicrobial compounds such as antibiotics important in milk for the milk processing industry.

Die Empfindlichkeiten einer Reihe derzeit verwendeter Verfahren zum Auffinden von Penicillin G in Milch sind im Sarcinia lutea Zylinderplattenverfahren 0,02 IE/ml, im Penzymetest 0,01 IE/ml, in der Bacillus stearothermophilus Plattenuntersuchung 0,005 IE/ml, im Charmtest 0,005 IE/ml und im Delvotest-P 0,005 IE/ml. Zum Auffinden von Rückstandsspuren (< 0,005 IE/ml) des Penicillins G in Milch wird ein empfindlicheres und bevorzugt automatisches Verfahren benötigt.The Sensitivities of a number of currently used methods for Finding penicillin G in milk are in the Sarcinia lutea cylinder plate method 0.02 IU / ml, in the penzyme test 0.01 IU / ml, in Bacillus stearothermophilus Plate examination 0.005 IU / ml, in Charmtest 0.005 IU / ml and in Delvotest-P 0.005 IU / ml. To detect traces of residue (<0.005 IU / ml) of the Penicillin G in milk becomes a more sensitive and preferably automatic Procedure needed.

Die Änderungen der elektrischen Eigenschaften der Kulturmedien wurden zum schnellen Abschätzen der gesamten mesophilen und psychrotrophischen Zählungen, von Coliformen, Salmonellen, abnormer Milch und Bakteriophagen bei der Cheddarkäse Herstellung ausgenutzt. Die elektrische Änderung wurde gleichfalls als ein Wachstumsindex für Milchsäurebakterien in Milch verwendet.The changes The electrical properties of culture media became fast Estimating the total mesophilic and psychrotrophic counts, of coliforms, salmonella, abnormal milk and bacteriophages in cheddar cheese production exploited. The electrical change was also used as a growth index for lactic acid bacteria in milk.

Okigbo und Richardson berichteten über ein Impedanzverfahren, das ein Baktometer 123 Impendanzinstrument zum Auffinden von Streptomycin oder Penicillin G in mit 5% aktiver oder 5% inaktiver Lactic-Kultur geimpfter steriler Milch verwendet. Okigbo, O.N. und G.H. Richardson (1985), Detection of penicillin and streptomycin in milk by impedance microbiology, J. Food Protection, 48 979. Obwohl der Test empfindlicher (0,001 IE/ml) als die zuvor erwähnten Tests ist, konnten keine quantitativen Ergebnisse erhalten werden.Okigbo and Richardson reported about an impedance method using a Baktometer 123 Impendanzinstrument to find streptomycin or penicillin G in 5% more active or 5% inactive Lactic culture of inoculated sterile milk. Okigbo, O.N. and G.H. Richardson (1985), Detection of penicillin and streptomycin in milk by impedance microbiology, J. Food Protection, 48 979. Although the test more sensitive (0.001 IU / ml) than before mentioned Tests, no quantitative results could be obtained.

Aus der US 4 946 777 und der US 4 381 343 sind Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antibiotika in einem Medium bekannt.From the US 4,946,777 and the US 4,381,343 For example, methods are known for determining the presence of antibiotics in a medium.

Gemäß DE 30 40 329 A1 wird die Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden in einem Medium gemessen. Eine deutliche Änderung der Potentialdifferenz entspricht einem bestimmten Grad an Wachstum der Mikroorganismen in dem Medium. Der Zeitpunkt, zu dem diese deutliche Änderung der Potentialdifferenz auftritt, kann zur Identifizierung der Art der Mikroorganismen und zur Bestimmung der Wirkung von Arzneimitteln auf die Mikroorganismen verwendet werden.According to DE 30 40 329 A1 the potential difference between two electrodes in a medium is measured. A significant change in the potential difference corresponds to a certain degree of growth of the microorganisms in the medium. The time when this significant change in potential difference occurs can be used to identify the nature of the microorganisms and to determine the effect of drugs on the microorganisms.

Die DE 26 57 150 A1 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses eines antimikrobiellen Mittels oder Ereignisses auf wachsende Mikroorganismen. Das Verfahren basiert auf der Messung der Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden, die mit einem Medium in Kontakt stehen, welches die Mikroorganismen und das antimikrobielle Mittel enthält. Die Änderung der Potentialdifferenz stellt ein Maß für den Einfluss des antimikrobiellen Mittels auf die Mikroorganismen dar.The DE 26 57 150 A1 discloses a method for determining the effect of an antimicrobial agent or event on growing microorganisms. The method is based on the measurement of the potential difference between two electrodes in contact with a medium containing the microorganisms and the antimicrobial agent. The change of the potential difference is a measure of the influence of the antimicrobial agent on the microorganisms.

Die US 4 160 205 lehrt die Bestimmung der resistiven Komponente der Impedanz eines Mediums. Der Wert dieser resistiven Komponente korreliert mit der Menge an Mikroorganismen in dem Medium.The US 4,160,205 teaches the determination of the resistive component of the impedance of a medium. The value of this resistive component correlates with the amount of microorganisms in the medium.

Die US 4 156 180 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Aktivität in einem Medium. Bei dem Verfahren gemäß US 4 156 180 wird in das Medium ein Strom eingeprägt, wodurch ein bestimmter Spannungsabfall über das Medium induziert wird, der dann als Referenzwert dient. Als Antwort auf eine metabolische Aktivität in dem Medium verändert sich der Spannungsabfall über das Medium. Durch Veränderung der Stromstärke kann der Spannungsabfall wieder auf den Referenzwert eingestellt werden. Das Ausmaß der Veränderung der Stromstärke korreliert mit der metabolischen Aktivität in dem Medium.The US 4,156,180 discloses a method for determining metabolic activity in a medium. In the method according to US 4,156,180 A current is impressed into the medium, whereby a certain voltage drop across the medium is induced, which then serves as a reference value. In response to metabolic activity in the medium, the voltage drop across the medium changes. By changing the current, the voltage drop can be set back to the reference value. The magnitude of the change in current correlates with the metabolic activity in the medium.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von antimikrobischen Verbindungen in einer Probe mit den Schritten Zugeben der Probe zu einem Kulturmedium, Wachsenlassen eines Mikroorganismus in dem Kulturmedium, wobei das Wachstum des Mikroorganismus gegenüber der Inhibierung durch die Verbindung empfindlich ist, Messen eines elektrischen Parameters des Kulturmediums über einen Zeitraum, Bestimmen eines ersten Zeitpunkts, bei dem eine beschleunigte Änderung des elektrischen Parameters auftritt, wobei die Änderung vom Wachstum des Mikroorganismus herrührt und Vergleichen des ersten Zeitpunkts mit mehreren anderen Zeitpunkten, um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, wobei jeder der anderen Zeitpunkte wie der erste Zeitpunkt bestimmt wird, mit dem Unterschied, dass die Verbindung in dem Kulturmedium in einer bekannten Konzentration vorhanden ist und weiterhin eine lineare Beziehung zwischen den anderen Zeitpunkten und ihren entsprechenden Konzentrationen besteht.The The present invention relates to a method for determining the concentration of antimicrobial compounds in a sample with the steps Adding the sample to a culture medium, growing a microorganism in the culture medium, wherein the growth of the microorganism against the Inhibition by the compound is sensitive, measuring an electrical Parameters of the culture medium over a period of time, determining a first time at which a accelerated change the electrical parameter occurs, with the change from the growth of the microorganism due and comparing the first time with several other times, to determine the concentration of the compound, each of the other times as the first time is determined with the Difference that the compound in the culture medium in a known Concentration exists and continues to be a linear relationship between the other times and their respective concentrations consists.

In einer bevorzugten Ausführungsform des obigen Verfahrens wird der erste Zeitpunkt weiterhin mit einem zweiten Zeitpunkt verglichen, der wie der erste Zeitpunkt bestimmt ist, jedoch mit dem Unterschied, daß ein die antimikrobische Wirkung der Verbindung aufhebendes Reagens dem Kulturmedium zugesetzt wird, wodurch das Vorhandensein der Verbindung bestätigt wird. Wenn beispielsweise die aufzufindende Verbindung ein Lactamantibiotikum (beispielsweise Penicillin G) ist, kann β-Lactamase zum Inaktivieren jedes im Kulturmedium vorhandenen Lactamantibioti kums verwendet werden, bevor der zweite Zeitpunkt bestimmt wird. Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zum Testen der Resistenz eines Mikroorganismus (beispielsweise Bakteriums) gegenüber einer antimikrobischen Verbindung mit den folgenden Stufen: (i) Wachsen lassen eines zu testenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine Verbindung in einer gegebenen Konzentration enthält; (ii) Messen eines elektrischen Parameters des Kulturmediums, beispielsweise Leitfähigkeit, über einen Zeitraum; (iii) Bestimmen einer ersten Zeit, die für das Auftreten einer beschleunigten Änderung des elektrischen Parameters notwendig ist (Detektionszeit, oder "DT"), die vom Wachstum des zu testenden Mikroorganismus herrührt; und (iv) Vergleichen der ersten Zeit mit einer zweiten Zeit, die wie die erste Zeit bestimmt ist, jedoch mit dem Unterschied, daß die Verbindung im Kulturmedium fehlt. Der getestete Mikroorganismus wird als gegen die Verbindung resistent definiert, wenn die erste Zeit gleich der zweiten Zeit bei einer gegebenen Konzentration der Verbindung ist, und wird als gegen die Verbindung nicht resistent bezeichnet, wenn die erste Zeit größer als die zweite Zeit ist.In a preferred embodiment of the above method, the first time will continue with a second time, which is determined as the first time is, with the difference that one the antimicrobial effect the compound repealing reagent is added to the culture medium, whereby the presence of the compound is confirmed. If, for example the compound to be found is a lactam antibiotic (e.g. Penicillin G), can be β-lactamase for inactivating any lactam antibiotic present in the culture medium be used before the second time is determined. Another inventive aspect relates to a method for testing the resistance of a microorganism (for example Bacterium) an antimicrobial compound having the following steps: (i) waxing leave a microorganism to be tested in a culture medium, which contains a compound in a given concentration; (Ii) Measuring an electrical parameter of the culture medium, for example Conductivity, over one Period; (iii) determining a first time for occurrence an accelerated change of the electrical parameter is necessary (detection time, or "DT"), which depends on the growth of the resulting in microorganism to be tested; and (iv) comparing the first time with a second time, which is determined as the first time is, but with the difference that the compound in the culture medium is missing. The tested microorganism is considered to be against the compound Defined resistant when the first time equals the second time at a given concentration of the compound, and is called not resistant to the compound when called the first Time greater than the second time is.

Das Verfahren zum Auffinden einer antimikrobischen Verbindung kann zum Auffinden von Lactamantibiotika bei einer Konzentration von lediglich 0,00016 IE/ml verwendet werden, was etwa 30 mal empfindlicher als bei verschiedenen, derzeit verwendeten Verfahren. Zusätzlich ist die Messung der elektrischen Parameter vollautomatisch; viele Proben (beispielsweise 120 oder 240) können gleichzeitig analysiert werden.The A method for finding an antimicrobial compound can be used for Finding lactam antibiotics at a concentration of only 0.00016 IU / ml, which is about 30 times more sensitive than in various currently used methods. In addition is the measurement of electrical parameters fully automatically; many samples (for example, 120 or 240) analyzed simultaneously.

Andere erfindungsgemäße Vorteile und Merkmale werden anhand der folgenden Zeichnungen und Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, sowie aus den beigefügten Ansprüchen deutlich.Other Advantages of the invention and features will become apparent from the following drawings and description the preferred embodiments, as well as from the attached claims clear.

1 zeigt ein Diagramm mit Leitfähigkeitskurven, wobei vier verschiedene Medien mit Bazillus Stearothermophilus-Sporen verwendet wurden. 1 shows a graph of conductivity curves using four different media with Bacillus stearothermophilus spores.

2 zeigt ein Diagramm mit Leitfähigkeitskurven, wobei ein PM Indikatoragar mit drei Impfstoffkonzentrationen des Bazillus Stearothermophilus-Sporen verwendet wurden. 2 Figure 11 is a graph of conductivity curves using a PM indicator agar with three vaccine concentrations of Bacillus stearothermophilus spores.

3 zeigt ein Diagramm der Leitfähigkeitskurven zubereiteter nicht-fetter Trockenmilchproben mit verschiedenen Penicillin G-konzentrationen. 3 Figure 12 shows a graph of the conductivity curves of prepared non-fat dry milk samples with different penicillin G concentrations.

4 zeigt ein Diagramm mit einer linearen Beziehung zwischen Detektionszeit ("DT") und Penicillin G Konzentration in nicht-fetten Trockenmilchproben. 4 Figure 11 shows a graph with a linear relationship between detection time ("DT") and penicillin G concentration in non-fat dry milk samples.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Auffinden antimikrobischer Verbindungen beruht auf der inhibierenden Wirkung einer antimikrobischen Verbindung auf das Wachstum eines Mikroorganismus. Die Änderung eines elektrischen Parameters in einem Kulturmedium mit der Probe und dem Mikroorganismus wurde kontinuierlich durch einen mikrobiologischen Analysator angezeigt, wobei die Detektionszeit (d.h. den Wendepunkt der Kurve, die durch Auftragen des elektrischen Parameters als Funktion der Zeit gewonnen wird) verzögert wird, wenn eine antimikrobische Verbindung in der Probe vorhanden ist. Die DT kann entweder automatisch durch Software oder von Hand aus einer elektrischer-Parameter/Zeit-Kurve bestimmt werden. Allgemein gilt, je höher die Konzentration der antimikrobischen Verbindung, um so größer die DT. Innerhalb eines bestimmten Bereichs besteht in der Tat ein linearer Zusammenhang zwischen der DT und der Konzentration der antimikrobischen Verbindung.The inventive method for finding antimicrobial compounds is based on the inhibiting effect of an antimicrobial compound on the growth of a microorganism. The change of an electrical parameter in a culture medium with the sample and the microorganism was continuously indicated by a microbiological analyzer, with the detection time (ie, the inflection point of the curve obtained by plotting the electrical parameter as a function of time) being delayed antimicrobial compound is present in the sample. The DT can be determined either automatically by software or by hand from an electrical parameter / time curve. general My rule is, the higher the concentration of the antimicrobial compound, the greater the DT. Within a certain range, there is indeed a linear relationship between the DT and the concentration of the antimicrobial compound.

Das obige Verfahren ist hochempfindlich. Jedoch ist es möglich die Empfindlichkeit dieses Verfahrens durch Verändern der Untersuchungsbedingungen (beispielsweise Medien, Mikroorganismuskonzentrationen, Inkubationstemperaturen oder Testmikroorganismen) zu vermindern, um eine geringere Empfindlichkeit für die praktische Anwendung in der milchverarbeitenden Industrie zu erhalten. Dieses Verfahren kann gleichfalls als ein schneller Übersichtstest durch Festlegen einer entsprechenden DT für nega tive Proben verwendet werden; Proben mit einem höheren DT als der voreingestellte DT werden dann als eine antimikrobische Verbindung haltige Probe angesehen. Natürlich sollte ein Pufferbereich beim Einstellen einer derartigen DT Schwelle berücksichtigt werden, um experimentelle Ungenauigkeiten zuzulassen.The The above procedure is highly sensitive. However it is possible that Sensitivity of this method by changing the examination conditions (For example, media, microorganism concentrations, incubation temperatures or test microorganisms) to lower sensitivity for the practical Application in the dairy industry. This Procedure can also be defined as a quick overview test by setting a corresponding DT for Negative samples are used; Samples with a higher DT as the default DT are then considered an antimicrobial Compound containing sample considered. Of course, there should be a buffer area when setting such a DT threshold to be considered experimental Inaccuracies.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren kann dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Mikroorganismus gegen eine gegebene antimikrobische Verbindung resistent ist, in dem die beim Wachsen der Mikroorganismen erhaltenen DTs mit und ohne der antimikrobischen Verbindung entsprechend verglichen werden.One another method according to the invention can be used to determine if a microorganism resistant to a given antimicrobial compound, in the DTs obtained with the growth of the microorganisms with and without comparing the antimicrobial compound accordingly.

In folgendem Beispiel wird eine Leitfähigkeitsmessung zum Auffinden von Penicillin G in Milch mit einem Malthus 2000 mikrobiologischen Analysator (Malthus Instruments Limited, Crawley, England) mit B. Stearothermophilus als Testorganismus durchgeführt. Jedoch ist die Messung der Impedanz oder Kapazitanz anstelle der Leitfähigkeit gleichfalls möglich. Beispielsweise kann ein Baktometer von Vitek Systems, Hazelwood, MS, U.S.A. zum Messen der Leitfähigkeit, Kapazität und Impedanz verwendet werden. In gleicher Weise kann das im folgenden Beispiel als Testmikroorganismus verwendete B. Stearothermophilus durch bestimmte andere Mikroorganismen ersetzt werden. Beispielsweise ist von Sarcinia Lutea bekannt, gegen Antibiotika der Lactamfamilie (beispielsweise Cephaprin, Cloxicillin und Penicillin) empfindlich zu sein, und kann daher gleichfalls zum Auffinden von Penicillin G oder dessen Analoga verwendet werden. Die erfindungsgemäße Untersuchungsanordnung ist zum Auffinden aller Arten antimikrobischer Verbindungen geeignet, solange geeignete Testmikroorganismen und Testbedingungen gewählt werden.In The following example shows a conductivity measurement for finding of penicillin G in milk with a Malthus 2000 microbiological Analyzer (Malthus Instruments Limited, Crawley, England) with B. Stearothermophilus performed as a test organism. However, the measurement is the impedance or capacitance instead of the conductivity also possible. For example For example, a Bactometer from Vitek Systems, Hazelwood, MS, U.S.A. Measuring the conductivity, capacity and impedance are used. In the same way, this can be done below Example as a test microorganism used B. stearothermophilus be replaced by certain other microorganisms. For example is known by Sarcinia Lutea against antibiotics of the lactam family (For example, cephaprin, cloxicillin and penicillin) sensitive and therefore can also be used to find penicillin G or its analogs are used. The examination arrangement according to the invention is suitable for finding all types of antimicrobial compounds, as long as suitable test microorganisms and test conditions are selected.

In diesem Zusammenhang sollte darauf hingewiesen werden, daß, da B. Stearothermophilus gleichfalls gegen andere antimikrobische Verbindungsfamilien, wie der Tetracyclin- (beispielsweise Tetracyclin, Chlortetracyclin und Oxytetracyclin), der Erythromycin- (beispielsweise Erythromycin, Lincomycin und Clindamycin), der Aminoglycosid- (beispielsweise Streptomycin), der Novobiocin- (beispielsweise Novobiocin), der Chloramphenicol- (beispielsweise Chloramphenicol) und der Sulfonamidfamilie (beispielsweise Sulfamethazin, Sulfamethoxazol und Sulfisoxazol) empfindlich ist [siehe Charm, S.E. und Chi, R., 1988, Microbial receptor assay for rapid detection and identification of seven families of antimicrobial drugs in milk: Zusammenarbeitsstudie, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 304] sensitiv ist, die erfindungsgemäße Untersuchung gleichfalls zum Auffinden dieser Verbindungen in Proben unter Einsatz von B. Stearothermophilus als Testmikroorganismus verwendet werden kann.In In this context it should be pointed out that since B. Stearothermophilus also against other antimicrobial compound families, such as the tetracycline (for example tetracycline, chlortetracycline and oxytetracycline), erythromycin (for example, erythromycin, Lincomycin and clindamycin), the aminoglycoside (e.g. Streptomycin), novobiocin (e.g. novobiocin), chloramphenicol (e.g. Chloramphenicol) and the sulfonamide family (for example, sulfamethazine, Sulfamethoxazole and sulfisoxazole) is sensitive [see Charm, S.E. and Chi, R., 1988, Microbial receptor assay for rapid detection Identification of seven families of antimicrobial drugs in milk: Collaboration Study, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 304] is, the investigation of the invention also used to find these compounds in samples B. Stearothermophilus be used as a test microorganism can.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert.The Invention will be explained in more detail with reference to the following example.

Materialienmaterials

Trypticase Sojaagar und Trypticase Sojabrühe wurden von BBL (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) bezogen. SPYE-Brühe (Katalog Nr. 490-001) war ein Produkt von Malthus Instruments (Crawley, England). Bacillus Stearothermophilus ATCC 10149 Sporensuspension (Katalog Nr. 1801-60-6), Bacto-PM Positivkontrollmedium (fettarme Trockenmilch mit 0,12 IE Kaliumpenicillin; Katalog Nr. 1802-33-9), Bacto-PM Negativ-Kontrollmedium (inhibitorfreie nicht-fette Trockenmilch; Katalog Nr. 1803-63-1), Bacto-PM Indikatoragar (Katalog Nr. 1800-15-3) und Penicillin G wurden von Difco Laboratories (Detroit, MI) bezogen. β-Lactamase (EC 3.5.-2.6; Katalog Nr. P-0389) war ein Produkt von Sigma (St. Louis, MO).trypticase Soya agar and trypticase soy broth were obtained from BBL (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). SPYE broth (catalog No. 490-001) was a product of Malthus Instruments (Crawley, England). Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 spore suspension (Catalog No. 1801-60-6), Bacto-PM positive control medium (low-fat dry milk with 0,12 IU of potassium penicillin; Catalog No. 1802-33-9), Bacto-PM Negative Control Medium (Inhibitor-free non-fat dry milk, Catalog No. 1803-63-1), Bacto-PM Indicator Agar (catalog no. 1800-15-3) and penicillin G were purchased from Difco Laboratories (Detroit, MI). β-lactamase (EC 3.5.-2.6; Catalog No. P-0389) was a product of Sigma (St. Louis, MO).

Optimierung der Bedingungen der LeitfähigkeitsmessungOptimization of conditions the conductivity measurement

Ein erfolgreiches Leitfähigkeitsmeßverfahren hängt von der Qualität der Kurven ab, die durch die spezifische Proben und Medienkombinationen beeinflußt werden. Eine Leitfähigkeitskurve guter Qualität sollte eine stabile Grundlinie aufweisen, gefolgt von einer stark zunehmenden Steigung und einem hohen Peak-Wert. Siehe Firstenberg-Eden, R., und G. Eden (1984) Impedance Microbiology, John Wiley & Sons Inc., New York, NY. Da einige Metabolitendprodukte ein stärkeres Leitfähigkeitssignal ergeben, ist die Wahl eines geeigneten Mediums entscheidend.A successful conductivity measurement method depends on the quality of the curves that are affected by the specific samples and media combinations. A good quality conductivity curve should have a stable baseline, followed by a sharply increasing slope and a high peak value. See Firstenberg-Eden, R., and G. Eden (1984) Impedance Microbiology, John Wiley & Sons Inc., New York, NY. Since some metabolite end products give a stronger conductivity signal, the choice is one decisive medium.

In diesem Beispiel werden die in Microsiemens (μS) gemessenen Leitfähigkeitsänderungen automatisch aufgezeichnet und graphisch durch ein Software Paket von einem Malthus 2000 Microbiological Analyzer (Malthus Instruments Limited, Crawley, England) dargestellt. Um eine Leitfähigkeitskurve guter Qualität zu erhalten, (d.h. eine Kurve mit einer stabilen Grundlinie, einer scharfen Steigung und einem hohen Leitfähigkeitswert) wurden vier verschiedene Medien (Trypticase Sojabrühe, Trypticase Sojaagar, SPYE-Brühe und Bacto-PM Indikatoragar) für die Impfung von B. Stearothermophilus Sporen verwendet. Die Medien wurden bei 121°C über 15 min. im Autoklaven behandelt und mit Sporen versetzt, um eine Konzentration von 1% (1 ml der Grundsporensuspension wurde zu 100 ml sterilem Medium gegeben, Endkonzentration etwa 10⁶ Sporen/ml) zu ergeben. Die Sporen enthaltenden Medien wurden anschließend in Mengen von 2 ml in Leitfähigkeitszellen mit 5 ml Fassungsvermögen aufgeteilt und danach bei 55°C in einem Wasserbad des Malthus 2000 Microbiological Analyzer inkubiert. Die Leitfähigkeitswerte jeder Zelle wurde alle 6 min. über 24 Stunden genommen. Die Ergebnisse wurden numerisch als Leitfähigkeitsdaten oder graphisch als Leitfähigkeitszunahmekurven erhalten. Die Detektionszeit ("DT") wurde für jede Zelle automatisch durch die Instrumentsoftware bestimmt, sobald die Leitfähigkeitswerte um 1 μS oder mehr in drei aufeinanderfolgenden Messungen anstiegen. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.In this example, the conductivity changes measured in microsiemens (μS) are automatically recorded and graphically represented by a software package from a Malthus 2000 Microbiological Analyzer (Malthus Instruments Limited, Crawley, England). To obtain a good quality conductivity curve (ie, a curve with a stable baseline, a sharp slope, and a high conductivity value), four different media (Trypticase Soy Broth, Trypticase Soy Agar, SPYE Broth, and Bacto-PM Indicator Agar) were used to inoculate B Stearothermophilus spores used. The media was heated at 121 ° C for 15 min. autoclaved and spiked to give a concentration of 1% (1 ml of the spore suspension was added to 100 ml of sterile medium, final concentration about 10 ⁶ spores / ml). The media containing spores were then split into 2 ml conductivity cells of 5 ml capacity and then incubated at 55 ° C. in a water bath of the Malthus 2000 Microbiological Analyzer. The conductivity values of each cell were measured every 6 min. taken over 24 hours. The results were obtained numerically as conductivity data or graphically as conductivity increase curves. The detection time ("DT") for each cell was automatically determined by the instrument software as the conductivity values increased by 1 μS or more in three consecutive measurements. The results are in 1 shown.

Vier Leitfähigkeitsänderungskurven in 1 (A, B, C und D) wurden beim Einsatz des PM Indikatoragars, der Trypticase Sojabrühe, des tryptic Sojaagars bzw. der SPYE-Brühe als Medien erhalten. Die Buchstaben a, b und c bezeichnen die Detektionszeiten der Kurven A, B und C; Kurve D besitzt keine meßbare Detektionszeit. Wie in 1 gezeigt, entspricht PM Indikatoragar den Anforderungen einer qualitativ guten Kurve. Zusätzlich ist die durch den PM Indikatoragar erzeugte Leitfähigkeitsamplitude mindestens zweimal so groß wie die durch die anderen drei Medien erhaltenen. Daher wurde der PM Indikatoragar als Medium für weitere Tests gewählt.Four conductivity change curves in 1 (A, B, C, and D) were obtained using the PM indicator agar, trypticase soy broth, tryptic soy agar, and SPYE broth, respectively, as media. The letters a, b and c denote the detection times of the curves A, B and C; Curve D has no measurable detection time. As in 1 shown, PM indicator agar meets the requirements of a good quality curve. In addition, the conductivity amplitude generated by the PM indicator agar is at least twice that obtained by the other three media. Therefore, the PM indicator agar was chosen as the medium for further testing.

Obwohl 1% (etwa 10⁶ Sporen/ml) der Sporensuspension allgemein für die B. Stearothermophilus Plattenuntersuchung empfohlen wird, kann diese Konzentration für das Leitfähigkeitsverfahren nicht geeignet sein. Drei Impfstoffkonzentrationen wurden in den PM Indikatoragar zur Bestimmung des Impfstoffeinflusses auf die Leitfähigkeitskurven verwendet; die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Kurven A, B, und C in 2 stehen für Leitfähigkeitsänderungen von PM Indikatoragar mit drei Impfmittelkonzentrationen der Bazillus Stearothermophilus Sporen: A, 1% (10⁶ Sporen/ml); B, 0,1% (10⁵ Sporen/ml); und C, 0,01% (10⁴ Sporen/ml). Die Buchstaben a, b und c sind die entsprechenden Detektionszeiten der Kurven A, B und C. Wie in 2 dargestellt, besaß die Sporenkonzentration wenig Einfluß auf die Kurvenqualität, abgesehen davon, daß die DT umgekehrt proportional zu den verwendeten Sporenkonzentrationen war. Die DTs betrugen 3,3; 3,9 und 4,2 Stunden für die Sporenkonzentrationen 1; 0,1 und 0,01%. Jedoch zeigten die drei Leitfähigkeitskurven den gleichen Trend des Leitfähigkeitswechsels und besaßen unabhängig von der ursprünglichen Sporenmenge gleiche Leitfähigkeitspeakwerte. Da Zeit ein wichtiger Faktor für die Qualitätskontrolle von Milch ist, wurde eine Sporenkonzentration von 1% in den folgenden Experimenten verwendet.Although 1% (about 10 ⁶ spores / ml) of the spore suspension is generally recommended for B. Stearothermophilus plate examination, this concentration may not be suitable for the conductivity method. Three vaccine concentrations were used in the PM Indicator Agar to determine the vaccine impact on the conductivity curves; the results are in 2 shown. Curves A, B, and C in 2 stand for conductivity changes of PM indicator agar with three inoculum concentrations of Bacillus stearothermophilus spores: A, 1% (10 ⁶ spores / ml); B, 0.1% (10 ⁵ spores / ml); and C, 0.01% (10 ⁴ spores / ml). The letters a, b and c are the corresponding detection times of the curves A, B and C. As in 2 As shown, the spore concentration had little influence on the quality of the curve, except that the DT was inversely proportional to the spore concentrations used. The DTs were 3.3; 3.9 and 4.2 hours for spore concentrations 1; 0.1 and 0.01%. However, the three conductivity curves showed the same trend of conductivity change and had the same conductivity peak values regardless of the original spore quantity. Since time is an important factor in the quality control of milk, a spore concentration of 1% was used in the following experiments.

Beziehung zwischen Detektionszeit und Penicillin G KonzentrationRelationship between detection time and penicillin G concentration

Die Experimente wurden durchgeführt, um den Einfluß von Penicillin G auf die Leitfähigkeitskurven und die Empfindlichkeit dieses Leitfähigkeitsverfahrens zu bestimmen.The Experiments were carried out to the influence of penicillin G on the conductivity curves and the sensitivity of this conductivity method to determine.

Das positive Kontrollmedium mit 0,12 IE Penicillin G (Difco) wurde der Reihe nach zweifach mit dem negativen Kontrollmedium (Difco) verdünnt, um Proben mit abnehmenden Antibiotikakonzentrationen zu erhalten. Nach Zugabe von 1 ml des jeweiligen verdünnten positiven Kontrollmediums in die Leitfähigkeitszelle (sechs) wurden 2 ml 50°C PM Indikatoragar mit 1% Sporensuspension in jede Zelle gegeben, gründlich gemischt und bei 55°C zum Aufzeichnen der Leitfähigkeitsänderung inkubiert. Die Empfindlichkeit des Leitfähigkeitsversuchs wurde definiert als die Konzentration des Penicillin G, die einen höheren DT-Wert, als der negative Vergleich bei einem signifikanten Wert von 0,01 unter Einsatz des t-Tests besaß. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.The positive control medium containing 0.12 IU of penicillin G (Difco) was serially diluted 2-fold with the negative control (Difco) medium to obtain samples of decreasing antibiotic concentrations. After adding 1 ml of the respective diluted positive control medium into the conductivity cell (six), 2 ml of 50 ° C PM indicator agar containing 1% spore suspension was added to each cell, mixed thoroughly and incubated at 55 ° C to record the change in conductivity. The sensitivity of the conductivity test was defined as the concentration of penicillin G which had a higher DT value than the negative comparison at a significant value of 0.01 using the t-test. The results are in 3 shown.

In 3 entsprechen die Kurven A, B, C, D, E und F den. Proben mit 0 IE/ml, 0,00008 IE/ml, 0,00016 IE/ml, 0,00031 IE/ml, 0,00062 IE/ml, 0,00125 IE/ml, 0,0025 IE/ml und 0,005 IE/ml Penicillin G. Die Buchstaben a, b, c, d, e und f bezeichnen entsprechend die Detektionszeit der Kurven A, B, C, D, E und F. Es ist offensichtlich, daß die DT mit zunehmender Penicillin G Konzentration länger wird. Der negative Vergleich besaß eine DT von 3,1 Stunden. Wenn die Antibiotikakonzentration stieg, war die DT länger und die Steigung der Leitfähigkeitskurve geringer. Wenn die Penicillin G Konzentration ≥ 0,0025 IE/ml war, (3; Kurven G und H), war die Inhibierung des B. Stearothermophiluswachstums so stark, daß eine annähernd horizontal verlaufende Kurve erhalten wurde. Unter diesen Bedingungen konnte keine DT während einer 24stündigen Inkubation erhalten werden. Bei einer Penicillin G Konzentration von 0,0012 IE/ml (3; Kurve F) war die Steigung der Kurve so gering, daß es schwierig war, eine korrekte DT festzulegen. Zwangsläufig können die negativen und positiven Vergleiche einem Wandel unterliegen, da der physiolo gische Zustand und die Konzentration der Sporensuspension schwierig auf festen Werten zwischen Chargen und zwischen Experimenten gehalten werden kann. Jedoch betrug der DT negativer Vergleiche in vielen getrennten Experimenten zwischen 2,6 und 3,2 Stunden.In 3 Correspond to the curves A, B, C, D, E and F the. Samples with 0 IU / ml, 0.00008 IU / ml, 0.00016 IU / ml, 0.00031 IU / ml, 0.00062 IU / ml, 0.00125 IU / ml, 0.0025 IU / ml and 0.005 IU / ml penicillin G. Letters a, b, c, d, e and f respectively designate the detection time of curves A, B, C, D, E and F. It is evident that the DT becomes longer with increasing penicillin G concentration becomes. The negative comparison had a DT of 3.1 hours. As the antibiotic concentration increased, the DT was longer and the slope of the conductivity curve was lower. If the penicillin G concentration was ≥ 0.0025 IU / ml, ( 3 ; Curves G and H), was the inhibition of B. stearothermophilus growth was so strong that an approximately horizontal curve was obtained. Under these conditions no DT could be obtained during a 24-hour incubation. At a penicillin G concentration of 0.0012 IU / ml ( 3 ; Curve F), the slope of the curve was so small that it was difficult to establish a correct DT. Inevitably, the negative and positive comparisons may undergo change because the physiological state and the concentration of the spore suspension can be kept difficult at fixed values between batches and between experiments. However, the DT of negative comparisons in many separate experiments was between 2.6 and 3.2 hours.

Beim Testen einer Verdünnungsreihe positiver Proben konnten die DTs der Proben mit mehr als 0,005 IE/ml Penicillin G nicht vollständig auf den negativen Vergleichswert durch Behandlung mit β-Lactamase (Endkonzentration 15 U/ml) bei 37°C über 30 min. zurückgeführt werden. Dieses kann an der unvollständigen Verdauung des Penicillin G durch das Enzym unter den verwendeten Bedingungen liegen. Vollständige Umkehrung konnte durch ordnungsgemäße Verdünnung der Proben mit Penicillin G Konzentrationen von > 0,005 IE/ml erreicht werden.At the Testing a dilution series positive samples could be given to the DTs of the samples at more than 0.005 IU / ml Penicillin G not complete on the negative comparison value by treatment with β-lactamase (Final concentration 15 U / ml) at 37 ° C for 30 min. to be led back. This may be due to the incomplete Digestion of penicillin G by the enzyme used among the Conditions are. full Reversal could be achieved by proper dilution of the samples with penicillin G concentrations of> 0.005 IU / ml be achieved.

Die Empfindlichkeit der Leitfähigkeitsuntersuchung für Penicillin G betrug 0,00016 IE/ml; bei dieser Konzentration betrug DT 3,38 Stunden (Mittelwert aus sechs Wiederholungen), was signifikant höher (α = 0,01) als bei dem negativen Vergleich (DT) 3,11 Stunden) war.The Sensitivity of the conductivity test for penicillin G was 0.00016 IU / ml; at this concentration, DT was 3.38 Hours (mean of six repetitions), which was significantly higher (α = 0.01) than in the negative comparison (DT) was 3.11 hours).

In 4 ist eine lineare Regressionsgerade (r = 0,99), in der die DT (in Stunden; sechs Wiederholungen) und die Konzentration (internationale Einheiten pro ml) des Penicillin G zueinander in Verhältnis gesetzt werden: A, 0,00008 IE/ml (DT 3,18 ± 0,07 Stunden); B, 0,00015 IE/ml (DT 3,38 ± 0,18 Stunden); C, 0,00031 IE/ml (DT 3,98 ± 0,38 Stunden) und D, 0,00062 IE/ml (DT 5,33 ± 0,44 Stunden). Der für die quantitative Bestimmung von Penicillin G geeignete Bereich liegt zwischen 0,00016 und 0,00062 IE/ml. Folgende Gleichung für die Regressionslinie wurde erhalten: DT = 4000 × (Penicillin G) + 2,8. Die Genauigkeit der Leitfähigkeitstechnik (6 Wiederholungen) war hoch; die Varianzkoeffizienten betrugen 2,2; 5,3; 9,5 und 8,3% für die entsprechenden Penicillin G Konzentrationen von 0,00008; 0,00016; 0,00031 und 0,00062 IE/ml. Der erhöhte Varianzkoeffi zient bei höheren Antibiotikakonzentrationen kann zum Teil auf die wesentlich geringeren Steigungen der Leitfähigkeitskurven (3, Kurven D, E und F) zurückgeführt werden. Die geringen Steigungen erschwerten die genaue DT Bestimmung, was zu größeren Fehlern und somit zu höheren Varianzkoeffizienten führt. Jedoch betrugen die Varianzkoeffizienten aller Konzentrationen im quantitativen Bereich (0,00016 bis 0,00062 IE/ml) weniger als 10%, was für die Spurenanalyse akzeptabel ist. Auf jeden Fall sollten aufgrund der hohen Empfindlichkeit und des vergleichsweise kleinen Bereichs für die quantitative Analyse beim Leitfähigkeitsverfahren (4) Milchproben mit Penicillin G Konzentrationen von > 0,00062 IE/ml zur quantitativen Bestimmung geeignet verdünnt werden.In 4 is a linear regression line (r = 0.99) in which the DT (in hours, six repetitions) and the concentration (international units per ml) of penicillin G are related to each other: A, 0.00008 IU / ml ( DT 3.18 ± 0.07 hours); B, 0.00015 IU / ml (DT 3.38 ± 0.18 hours); C, 0.00031 IU / ml (DT 3.98 ± 0.38 hours) and D, 0.00062 IU / ml (DT 5.33 ± 0.44 hours). The range suitable for the quantitative determination of penicillin G is between 0.00016 and 0.00062 IU / ml. The following equation for the regression line was obtained: DT = 4000 × (penicillin G) + 2.8. The accuracy of the conductivity technique (6 repetitions) was high; the coefficients of variance were 2.2; 5.3; 9.5 and 8.3% for the corresponding penicillin G concentrations of 0.00008; 0.00016; 0.00031 and 0.00062 IU / ml. The increased coefficient of variance at higher concentrations of antibiotics may be due in part to the much lower slopes of the conductivity curves ( 3 , Curves D, E and F) are returned. The small slopes made the exact DT determination difficult, resulting in larger errors and thus higher coefficients of variance. However, the variance coefficients of all concentrations in the quantitative range (0.00016 to 0.00062 IU / ml) were less than 10%, which is acceptable for trace analysis. In any case, due to the high sensitivity and the relatively small range for the quantitative analysis in the conductivity method ( 4 ) Milk samples with penicillin G concentrations of> 0.00062 IU / ml can be suitably diluted for quantitative determination.

Bestimmung von Penicillin G in 12 MilchprobenDetermination of penicillin G in 12 milk samples

Nach Festlegen der Leitfähigkeitsmessungsbedingungen wurde dieses Verfahren zum Testen von 12 auf dem Markt erhältlichen Milchprodukten eingesetzt, wobei es sich um sechs Trockenmilchpulver und sechs Säuglingsformulierungen handelte.To Set the conductivity measurement conditions This method was used to test 12 available on the market Used dairy products, which are six dry milk powder and six infant formulas acted.

10 g des jeweiligen Produkts wurden zu 90 ml entionisiertem Wasser gegeben und der Reihe nach zweifach mit dem negativen Vergleichsmedium (Difco) verdünnt. Jede verdünnte Probe wurde in zwei Portionen aufgeteilt, wovon eine Portion (1 ml) über 3 min. bei 82°C erwärmt, anschließend unverzüglich in einem Eisbad gekühlt und mit 0,1 ml β-Lactamase (165 U/ml) bei 37°C über 30 min. behandelt wurde. Anschließend wurde 1 ml jeder Probe (positive und negative Vergleichsproben und enzymbehandelte und unbehandelte Proben) in die Leitfähigkeitszelle gegeben; 2 ml PM Indikatoragar mit 1% B. Stearothermophilus Spore wurde zugesetzt und gründlich gemischt. Die Zellen wurden bei 55°C zum Messen der Leitfähigkeitsänderung inkubiert. Penicillin G in Milchprodukten wurde gleichfalls durch die B. Stearothermophilus Plattenuntersuchung bestimmt. Siehe Bishop, J. R., G. F. Senyk, und S. E. Duncan (1992), "Detection of antibiotic/drug residues in milk and dairy products" in Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16. Aufl., R. T. Marshall, Am. Publ. Health Assoc., Washington, DC..10 g of each product were added to 90 ml of deionized water and in turn twice with the negative comparison medium (Difco). Each diluted Sample was divided into two portions, of which one portion (1 ml) 3 min. at 82 ° C heated subsequently immediately cooled in an ice bath and with 0.1 ml of β-lactamase (165 U / ml) at 37 ° C for 30 min. was treated. Subsequently was 1 ml of each sample (positive and negative controls and enzyme treated and untreated samples) are added to the conductivity cell; 2 ml PM indicator agar with 1% B. Stearothermophilus spore was added and thoroughly mixed. The cells were at 55 ° C to measure the conductivity change incubated. Penicillin G in dairy products was also passed through determined the B. stearothermophilus plate examination. See Bishop, J.R., G.F. Senyk, and S.E. Duncan (1992), "Detection of antibiotic / drug residues in milk and dairy products "in Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16th ed., R.T. Marshall, Am. Publ. Health Assoc., Washington, DC.

Wie in Tabelle 1 aufgeführt, waren sechs Proben (3 Trockenmilchprodukte und drei Säuglingsformulierungen, d.h. Milchpulver A, B und C und Säuglingsformulierungen A, D und E) mit β-Lactamantibiotika in einem Bereich von 0,01 bis 0,08 IE/g (Wirksamkeitsäquivalent zu Penicilling G) kontaminiert, was durch die Behandlung mit β-Lactamase bestätigt wurde. Die drei anderen Proben (Milchpulver E und F und Säuglingsformulierung F) waren mit anderen Inhibitoren als β-Lactamantibiotika kontaminiert, da die DT nicht nach der Behandlung mit β-Lactamase zurückgeführt oder verkürzt werden konnten. Jedoch aufgrund der relativ geringen Empfindlichkeit des B. Stearothermophilus Plattenversuchs (Detektionsgrenze 0,005 IE/ml; d.h. 0,05 IE/g Milchpulver) war lediglich eine Probe (Säuglingsformulierung E) zum Erzeugen von Inhibierungszonen durch den Plattenversuch in der Lage. Es ist offensichtlich, daß das vorliegendes Leitfähigkeitsverfahren niedrige Penicillin G Konzentrationen in Milchprodukten erkennen kann, die durch die derzeit verwendeten Untersuchungen nicht erkannt würden. Tabelle 1 Auffinden von Penicillin G in Milchpulvern und Säuglingsformulierungen

As shown in Table 1, six samples (3 dry milk products and 3 infant formulas, ie milk powder A, B and C and infant formulas A, D and E) with β-lactam antibiotics ranged from 0.01 to 0.08 IU / g ( Efficacy equivalent to penicillin G), as confirmed by treatment with β-lactamase. The three other samples (Milk Powder E and F and Infant Formula F) were contaminated with inhibitors other than β-lactam antibiotics because the DT did not respond to Be could be recycled or shortened with β-lactamase. However, due to the relatively low sensitivity of the B. stearothermophilus plate test (detection limit 0.005 IU / ml, ie 0.05 IU / g milk powder), only one sample (infant formula E) was capable of generating inhibition zones by the plate trial. It is apparent that the present conductivity method can detect low levels of penicillin G in dairy products that would not be detected by the studies currently used. Table 1 Finding penicillin G in milk powders and infant formulas

Claims

Method for determining the concentration of a antimicrobial compound in a sample with the steps: - Add the sample to a culture medium; - growing a microorganism in the culture medium, wherein the growth of the microorganism against the Inhibition by the compound is sensitive; - Measure up an electrical parameter of the culture medium over a period of time; - Determine a first time when an accelerated change the electrical parameter occurs, with the change from the growth of the microorganism originates; and - To compare of the first time with several other times, about the concentration to determine the connection, each of the other times how the first time is determined, with the difference that the compound in the culture medium in a known concentration exists and continues to have a linear relationship between the other times and their corresponding concentrations.

The method of claim 1, wherein the microorganism is a bacterium.

The method of claim 2, wherein the bacterium is Bacillus Stearothermophilus is.

The method of claim 3, wherein the compound of β-lactam, tetracycline, erythromycin, aminoglycoside, novobiocin, chloramphenicol or the sulfonamide family.

The method of claim 4, wherein the compound of the β-lactam family comes.

The method of claim 5, wherein the compound is penicillin G is.

A method according to claim 5, further comprising the step in which the first time compared with a second time which is determined as the first time, with the difference that β-lactamase was added to the culture medium, whereby the presence of a lactam antibiotic confirmed becomes.

The method of claim 5, wherein the sensitivity of the method is 0.00016 IU / ml.

The method of claim 1, wherein the electrical Parameter conductivity is.

The method of claim 2, wherein the electrical Parameter conductivity is.

The method of claim 3, wherein the electrical Parameter conductivity is.

The method of claim 5, wherein the electrical Parameter conductivity is.

The method of claim 8, wherein the electrical Parameter conductivity is.

The method of claim 1, further comprising the step comparing the first time with a second time, which is determined as the first time, with the difference that a reagent, that to cancel the antimicrobial effect of the compound in capable of being added to the culture medium, thereby reducing the presence confirmed the connection becomes.

The method of claim 14, wherein the microorganism is a bacterium.

The method of claim 15, wherein the electrical Parameter conductivity is.

Method for testing the resistance of a microorganism across from an antimicrobial compound with the steps To let something grow of a microorganism to be tested in a culture medium containing at the connection; Measuring an electrical parameter of the Culture medium over a period; Determine a first time for the occurrence an accelerated change the electrical parameter necessary for the growth of the microorganism to be tested; and Compare the first time with a second time, which is determined as the first time is, with the difference that the Compound lacking in the culture medium, wherein the tested microorganism as resistant to The connection is valid if the first time coincides with the second time and as opposed the connection is not labeled resistant when the first time greater than the second time is.

The method of claim 17, wherein the tested Microorganism is a bacterium.

The method of claim 17, wherein the electrical Parameter conductivity is.

The method of claim 18, wherein the electrical Parameter conductivity is.