DE4318692A1

DE4318692A1 - Test for blood serum samples containing antigens - is fully automatic with calibration of holes in gel plate with comparison against standard samples and mask adjustment

Info

Publication number: DE4318692A1
Application number: DE4318692A
Authority: DE
Inventors: Ralph Dipl Ing Dittler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-06-06
Filing date: 1993-06-04
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2013-06-05
Also published as: DE4318692C2

Abstract

Process for testing blood serum samples, containing antigens, comprises comparison of standard samples containing antigens in stampled holes in a gel plate containing antibodies. The location of the stamped hole in the field is set by interative sliding of a softeware-related mask on the X-Y plane, and a sigle establishment of the hole size by altering the mask up to the max. possible cover with the hole. The size of the precipitate ring is set by interative mask size and position change round the indentified hole and the covering precipitate ring. The image measure is calibrated by the known size of the hole and the size of the precipitate ring of the blood serum sample tested for comparison with the size of the precipitate ring of the standard sample. The iterative change for the position and size of the mask is related to a bright hole and covering precipitate ring until the masked image section has a max. grey value at the max. possible surface. A number of holes with standard samples are scanned for calibration of the system, and the results stored, for standard samples to be selected at random. The electronic imaging unit is a flatbed scanner using a monochrome CCD camera (5) with a macro-zone lens. After each field image has been taken, the plate (1) is moved to present a new hole field to the camera (5). A plotter (2) has a clampled quadrilateral slide (4) to position the plate (1) against the plotter pen. A PC gives control, image processing and statistical evaluation. USE/ADVANTAGE - The technique is for testing blood serum samples, containing antigens, with simple radial immune diffusion.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Untersuchung von antigenhaltigen Blutserumproben mittels einfacher radialer Immundiffusion (RID).The invention relates to a method for testing of antigen-containing blood serum samples using simple radial Immunodiffusion (RID).

Bei einem radialen Immundiffusions-Test wird antigenhaltiges Untersuchungsmaterial in Stanzlöcher einer etwa 1 mm dicken an tikörperhaltigen Agarosegelschicht gefüllt, mit der eine Pro benplatte präpariert ist. Bei der im Anschluß beginnenden Dif fusion wandern die gelösten Antigene solange radial in die Um gebung der Stanzlöcher, bis im Äquivalenzbereich mit den Anti körpern ein Antigen-Antikörper-Immunkomplex als unlösliches, sichtbares Präzipitat ausfällt. Je höher die Antigenkonzentra tion der Probe ist, desto ein größerer Präzipitatring entsteht um das Stanzloch. Die Auswertung der Serumproben, d. h. die Quantifizierung des Antigens im Serum, kann somit über das bei geeigneten Verhältnissen meßbare Quadrat des Ringdurchmessers bzw. Durchmessers innerhalb des Präzipitatrings im Vergleich zu Standardproben vorgenommen werden.A radial immunodiffusion test reveals antigen Test material in punch holes approximately 1 mm thick filled with agarose gel layer, with which a Pro benplatte is prepared. In the subsequent Dif fusion migrate the dissolved antigens radially into the environment the punch holes until in the equivalence range with the anti form an antigen-antibody immune complex as an insoluble, visible precipitate fails. The higher the antigen concentration tion of the sample, the larger the ring of precipitate around the punch hole. The evaluation of the serum samples, i. H. the Quantification of the antigen in the serum can thus be done via the suitable ratios measurable square of the ring diameter or diameter within the precipitate ring compared to Standard samples are made.

Das Ausmessen der etwa im Durchmesser 10 mm großen Präzipitat ringe erfolgt für gewöhnlich unter Vergrößerungsgeräten durch Fachpersonal. Dabei wird in der Regel mit einer Meßlupe jede Probe einzeln ausgemessen und deren Meßwert und Position no tiert.The measurement of the precipitate approximately 10 mm in diameter rings usually take place under enlargers Skilled personnel. As a rule, each with a magnifying glass Measure the sample individually and its measured value and position no animals.

Nach der DE 31 19 269 A1 ist auch schon anstelle einer Meßlupe die Verwendung eines umgebauten Mikrofilm-Lesegerätes zum Aus messen erwähnt worden.According to DE 31 19 269 A1 is already in place of a magnifying glass the use of a converted microfilm reader for off measure has been mentioned.

Ähnlich arbeitet ein Gerät nach der US 4 021 200, in das eine scheibenförmige Gelplatte mit kreisförmig angeordneten Proben eingelegt wird. Die beleuchtbare Platte kann durch einen durch sichtigen Deckel betrachtet werden. Mit einem motorisch ver stellbaren Fadenkreuzpaar werden nacheinander die Durchmesser der Präzipitatringe visuell eingegrenzt und die Ergebnisse der Messung digital angezeigt. Die Meßwerte werden notiert.A device according to US Pat. No. 4,021,200 works in a similar way disk-shaped gel plate with samples arranged in a circle is inserted. The illuminable plate can be through a visible cover. With a motorized ver adjustable crosshairs are successively the diameter of the precipitate rings visually narrowed and the results of the Measurement displayed digitally. The measured values are noted.

Das Ausmessen wird jeweils erschwert durch eine relativ schlechte Bildqualität. So sind die Ringe kontrastarm und be sitzen verschwommene sowie unregelmäßige, zusammenhanglose Kon turen. Mitunter bilden sich auch regelrechte Ausläufe, wodurch es zu deutlichen Abweichungen von der idealen Kreisform kommt. Deshalb führt die Auswertung zu stark subjektiv gefärbten Er gebnissen. Hinzu kommen die üblichen Fehlerquellen visueller Meßtätigkeit, also Ablese- und Notationsfehler. Nicht verschwie gen werden darf letztlich die starke Belastung der Augen bei permanenter Durchführung dieser Arbeiten.The measurement is made difficult by a relative bad picture quality. So the rings are low contrast and be there are blurred and irregular, incoherent cones doors. From time to time, regular outlets are formed, which means there are significant deviations from the ideal circular shape. Therefore, the evaluation leads to strongly subjective Er results. In addition, there are the usual visual sources of error Measuring activity, i.e. reading and notation errors. Not forgotten Ultimately, the heavy strain on the eyes may be added permanent implementation of this work.

Zur weiteren Auswertung müssen die notierten Meßwerte über eine Tastatur einem Rechner eingegeben werden, was wiederum Ablese- und Eingabefehler in sich birgt.For further evaluation, the measured values noted must be entered via a Keyboard can be entered into a computer, which in turn makes reading and contains input errors.

Alles in allem sind die bekannten Methoden nicht sehr genau, ergonomisch belastend, zeitaufwendig und personalbindend (GIT Labormedizin 7-8/90, S. 362).All in all, the known methods are not very precise, ergonomically stressful, time-consuming and personnel-binding (GIT Laboratory medicine 7-8 / 90, p. 362).

An sich liegt es nahe, die Messung und Auswertung mittels elek tronischer Bildverarbeitungsverfahren zu automatisieren, zumal Verfahren zur photogrammetrischen Erfassung statischer Aufnah meobjekte mittels opto-elektronischer Festkörper-Flächensenso ren seit einiger Zeit bekannt sind. Bei einem solchen Verfahren (DE 38 11 837 A1) wird das Aufnahmeobjekt in geometrischen Be zug zu einem Raster gesetzt und beide digital abgespeichert. Ein kontrastreicher Randbereich des körperlich ausgedehnten Ob jekts wird durch entsprechende unterschiedlich fokussierte Teilbilder angestrebt.In itself, it makes sense to measure and evaluate using elec Automate tronic image processing, especially Process for the photogrammetric recording of static images objects using opto-electronic solid-state sensors ren have been known for some time. With such a procedure (DE 38 11 837 A1) the recording object is in geometric loading train set to a grid and both stored digitally. A contrasting border area of the physically extensive ob project is differently focused by corresponding Target images.

Ein solches Verfahren läßt sich zur Messung der einfachen ra dialen Immundiffusion aber nicht anwenden.Such a method can be used to measure simple ra Dialen immunodiffusion but do not use.

Zum einen würde eine unterschiedliche Fokussierung zur Bestim mung der unscharfen Zonengrenzen nicht führen. Zum anderen wür den Ausläufer oder Ausfransungen nicht unterdrückt werden. Zu bedenken sind weiterhin Störquellen, die durch Kratzer, Staub- und Schmutzpartikel, Beschriftungen oder Schlieren im Gel oder in der Probenplatte gebildet werden und im praktischen Betrieb unausbleiblich sind.On the one hand, a different focus would become a determinant the unsharp zone boundaries. On the other hand the foothills or fraying are not suppressed. To concerns are also sources of interference caused by scratches, dust and dirt particles, labels or streaks in the gel or are formed in the sample plate and in practical operation are inevitable.

Nach der DE 40 13 180 A1 wird eine Testflüssigkeit zum Nachweis von Hämolyse dahingehend bildverarbeitend untersucht, ob durch sie ein auf eine Mikroplatte aufgemaltes Bild (Dreieck) anhand seiner Randschärfe erkannt wird oder durch Partikel in der Testflüssigkeit bezüglich eines Schwellenwertes unscharf und damit nicht relevant wird. Ein Ausmessen eines größenvariablen, gestörten Objekts erfolgt nicht.According to DE 40 13 180 A1, a test liquid is used for detection of hemolysis examined image processing whether using a picture (triangle) painted on a microplate its edge sharpness is recognized or by particles in the Test fluid out of focus with a threshold and so it doesn't become relevant. Measuring a size variable, disturbed object does not take place.

Auch ein Verfahren, basierend auf einer Konturenverfolgung mit tels Differenzieren der Bildinformationen nach der DE 40 40 726 A1 muß aufgrund der genannten Störungsvielfalt ausscheiden, da es zu völlig falschen bzw. nicht auszuwertenden Ergebnissen führen würde. Indem das Variationsverhältnis der Lichtintensi tät an den Grenzen des vorhandenen Musters gemessen wird, wür den, gleichgültig, ob das Muster zu dem zu bestimmenden Objekt gehört oder zu Störungen, unvermeidlich Objektmißbildungen und Störobjekte in die Konturenbildung einbezogen werden.Also a process based on contour tracking differentiating the image information according to DE 40 40 726 A1 must be eliminated due to the variety of disturbances mentioned, since it leads to completely wrong or non-evaluable results would lead. By the variation ratio of the light intensity is measured at the limits of the existing pattern, Wür regardless of whether the pattern corresponds to the object to be determined belongs or to disturbances, inevitable object malformations and Interference objects are included in the contour formation.

Nach der US 4 794 450 ist eine Hochgeschwindigkeitsapparatur zum bildverarbeitenden Erkennen von Agglutinationsmustern für diagnostische Untersuchungen bekannt. Mehrere Hundert Proben werden analysiert, je nach Befund unterschiedlich gekennzeich net ausgeplottet und das gewonnene Bild ausgewertet. Die Unter scheidung verschiedener Muster in störungsarmer Umgebung ist jedoch nicht Gegenstand der Erfindung.According to US 4,794,450 is a high speed apparatus for image processing recognition of agglutination patterns for known diagnostic examinations. Several hundred samples are analyzed, depending on the findings, marked differently net plotted and the image obtained evaluated. The sub different patterns in a low-interference environment but not the subject of the invention.

Die erste mit der Erfindung zu überwindende Schwierigkeit ist die, daß bei den in Betracht kommenden Gelplatten die einzeln mit Hand eingebrachten Stanzlöcher zwar einen ausreichend exak ten Durchmesser besitzen, aber ihre Lage pro Lochfeld nicht ge nau genug positioniert werden kann. Es kann zwar sichergestellt werden, daß je Lochfeld nur ein Stanzloch eingebracht ist, aber dieses kann sich an verschiedenen Orten innerhalb dieses Feldes befinden. Dieser Ort muß durch die Bildverarbeitung gefunden werden.The first problem to be overcome with the invention is that that in the gel plates in question are individually punched holes made by hand are sufficiently precise th diameter, but their location per hole field is not correct can be positioned precisely enough. Although it can be ensured be that only one punch hole is made per hole field, but This can be found in different locations within this field are located. This place must be found through image processing become.

Als weitere Schwierigkeit kommen Störobjekte, wie Beschriftun gen, Kratzer, Schlieren, Fingerabdrücke, Fremdpartikel und Ris se im Gel hinzu. Sie lassen sich auch bei äußerster Behutsam keit nicht zuverlässig vermeiden.Interference objects such as labeling are another difficulty scratches, streaks, fingerprints, foreign particles and risks se in the gel. They can also be used with extreme care Avoid reliable avoidance.

Drittens bilden die Bildpunkte, die zu der Probe gehören, nur im Idealfall einen konzentrischen, geschlossenen Ring um das Stanzloch im Gel. Wie die Praxis zeigt, sind von dieser Ideal ausbreitung mannigfache Abweichungen eher die Regel. Die Kreise sind eben nicht immer konzentrisch. Sie sind auch oft nicht ge schlossen, sondern lediglich halbkreisartig. Die Kreisperiphe rie kann-auch so aussehen, daß kleine, nicht zusammenhängende Teilkreisbögen vorhanden sind. Weiterhin treten Ausbeulungen auf, also Deformierungen der idealen Kreisform oder gar Aus buchtungen, also kleine Fortsetzungen, die am Kreisrand hängen. Zusätzlich sind die Kreise von unterschiedlicher Qualität, sie sind mehr oder weniger verschwommen, kontrastarm und von Stör quellen überlagert.Third, the pixels that belong to the sample only form ideally a concentric, closed ring around that Punch hole in the gel. As practice shows, these are ideal spread multiple deviations rather the rule. The circles are not always concentric. Often they are not closed, but only semicircular. The circular periphery rie can also look like small, unrelated Pitch arcs are available. Bumps also occur on, i.e. deformations of the ideal circular shape or even off Bays, i.e. small continuations that hang on the edge of the circle. In addition, the circles are of different quality, they are more or less blurry, low-contrast and sturgeon sources superimposed.

Alle diese den verschiedensten Umständen geschuldeten Abwei chungen vom Idealfall verursachen ein dermaßen stark gestörtes Bild, daß bisher eine radiale Immundiffusionsmessung mittels Bildverarbeitung unmöglich war.All these rejections due to the most varied of circumstances The ideal case results in something so disturbed Image that previously a radial immunodiffusion measurement using Image processing was impossible.

Der im Anspruchs 1 angegebenen Erfindung liegt somit das Pro blem zu Grunde, ein Verfahren zur vollautomatischen Auswertung von Blutserumproben nach dem einfachen radialen Immundiffu sionstest anzugeben, das weitestgehend unempfindlich gegen ei nen hohen Störbildanteil und unvollkommene Bildinformationen ist und unter Einbeziehung von Vergleichsproben eine zuverläs sige Aussage zur Probenqualität ohne menschliches Zutun lie fert.The invention specified in claim 1 is therefore the pro underlying a method for fully automatic evaluation of blood serum samples after simple radial immunodiffusion sion test to indicate that largely insensitive to egg high noise content and imperfect image information is reliable and including comparative samples statement on sample quality without human intervention finished.

Durch die Erfindung wird, ausgehend von einer bekannten idealen Geometrie des Meßobjekts, das Meßobjekt, das diese Geometrie nur teilweise sichtbar aufweist, aus Bildbestandteilen, die echten Objektteilen angehören und solchen ähnlicher Qualität, die auf Störobjekten beruhen, gefunden und rekonstruiert, um anschließend in bekannter Weise seine Fläche auszumessen.The invention is based on a known ideal Geometry of the measurement object, the measurement object that this geometry only partially visible, from parts of the picture that belong to real object parts and of a similar quality, which are based on interference objects, found and reconstructed to then measure its area in a known manner.

Die erfindungsgemäßen Arbeitsschritte: Vereinzelung der Meßob jekte, Detektierung eines oder mehrerer Objektteile und Rekon struktion des Gesamtobjektes aus den erkennbaren mutmaßlichen Objektbegrenzungen und größenmäßiges Inbeziehungsetzen zu Stan dardobjekten lassen erstmalig eine zuverlässige, automatische Auswertung nach dem Single-Radial-Immundiffusionstest möglich werden. Nach der beschriebenen Methode sind Ergebnisse beacht lich schneller und genauer als durch visuelle Auswertung und ohne ergonomische Belastungen für das Personal zu gewinnen.The work steps according to the invention: separation of the measuring ob objects, detection of one or more object parts and recon structure of the entire object from the recognizable presumed Object boundaries and size related to Stan For the first time, standard objects leave a reliable, automatic Evaluation possible after the single radial immunodiffusion test become. Results are observed using the method described faster and more precisely than through visual evaluation and without gaining ergonomic strain on the staff.

Nach der Erfindung wird iterativ versucht, sich zunächst der Lage des in Form und Größe genügend genau bekannten Stanzloches mit vorgebbarer Genauigkeit zu nähern, indem es mit einer kreisförmigen Maske als Referenzfläche in gegebenenfalls Größe (zur einmaligen Kalibrierung des Bildverarbeitungssystems) und Lage so zur Deckung gebracht wird, daß dessen mittlerer Grau wert ein Minimum ergibt.According to the invention, it is attempted iteratively to first look at Location of the punching hole, which is well known in terms of shape and size approach with predeterminable accuracy by using a circular mask as a reference surface in size if necessary (for a single calibration of the image processing system) and Location is so congruent that its medium gray worth a minimum.

Ist die genaue Lage eines Stanzlochs gefunden und damit eine Grobpositionierung bezüglich der Probe erreicht, erfolgen Ver suche, die um das Stanzloch erkannten Präzipitatteile, zu einem Kreis zu ergänzen. Jeder Bildpunkt wird nach bekanntem Verfah ren in Lage und Intensität erfaßt. Sie stammen entweder von dem auszumessenden Präzipitatring oder von Störobjekten. Ein PC speichert alle Bildpunkte als Gesamtheit und ermittelt deren Schwerpunkt. Um diesen Schwerpunkt wird wiederum eine Maske in Kreisform gelegt und ständig wiederholend die Lage und Größe dieser Maske so lange verändert, bis eine optimale Deckung mit den Ringbestandteilen gefunden ist. Durch dieses Verfahren wer den praktisch nur Präzipitatteile verwertet, die der Probe zu zurechnen sind und von Störobjekten abgegrenzt. Ist auf diese Weise Lage und Größe der Probe bis zu einer vorgebbaren Genau igkeit ermittelt worden, kann der Kreisdurchmesser nach bekann tem Verfahren berechnet und ausgegeben werden. Er gibt Auskunft über die Antigenkonzentration der realen Probe. Is the exact location of a punch hole found and therefore one Rough positioning with respect to the sample is achieved Ver search, the precipitate parts recognized around the punch hole, to a Circle to complete. Each pixel is made according to the known procedure position and intensity. They come from either precipitate ring or interference objects to be measured. A pc saves all pixels as a whole and determines them Main emphasis. A mask is in turn around this focus Positioned in a circular shape and constantly repeating the position and size changed this mask until an optimal coverage with the ring components is found. Through this procedure who which practically only utilizes precipitate parts, that of the sample are to be counted and delimited from interference objects. Is on this Wise location and size of the sample to a predeterminable accuracy the circle diameter can be determined system are calculated and output. He provides information about the antigen concentration of the real sample.

Vorteilhafterweise wird zunächst die Größe eines Stanzlochs zwecks Kalibrierung des Systems gemessen. Zum Finden des näch sten Stanzlochs im nächsten Lochfeld braucht dann nur die Lage der kalibrierten Maske in der x-y-Richtung geändert zu werden, da alle Stanzlöcher einen hinreichend genauen Durchmesser haben.The size of a punched hole is advantageous first measured to calibrate the system. To find the next Most punch hole in the next hole field then only needs the location the calibrated mask to be changed in the x-y direction since all punch holes have a sufficiently precise diameter to have.

Die Lage und Größe des Stanzlochs bzw. des Präzipitatringes wird durch iteratives Verändern der Lage und Größe der Maske gefunden, bis diese einen minimalen bzw. maximalen mittleren Grauwert bei größtmöglichem Maskendurchmesser erreicht.The location and size of the punch hole or the precipitate ring is done by iteratively changing the position and size of the mask found until these have a minimum or maximum mean Gray value achieved with the largest possible mask diameter.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die Proben frei von Subjektivität mit hinreichender Präzision ausgemessen und verglichen werden. Aufgrund des ge wählten Bildauswerteverfahrens werden die Proben trotz Unregel mäßigkeiten in deren Lage und Geometrie sowie in der Bildquali tät sicher erkannt und ausgemessen. Ergonomische Belastungen für das Personal entfallen ebenso wie eine zeitaufwendige und zu Fehlern neigende Bedienung und Auswertung.The advantages achieved with the invention are in particular in that the samples are free from subjectivity with sufficient Precision measured and compared. Due to the ge selected image evaluation method, the samples are despite the irregularity moderation in their position and geometry as well as in the picture quality activity is reliably recognized and measured. Ergonomic loads for the staff as well as a time-consuming and operation and evaluation tending to errors.

Besonders bedienungsfreundlich ist die Verwendung eines hochauf lösenden Flachbett-Scanners als Bildaufnahmegerät.The use of a high-end is particularly user-friendly detaching flatbed scanner as an image recording device.

Anstelle eines Scanners kann auch eine schwarz/weiß-CCD-Kamera mit Macro-Zoom-Optik mit gutem Erfolg eingesetzt werden. Dabei läßt sich vorteilhafterweise zur Probenpositionierung ein han delsüblicher Plotter umrüsten, indem anstelle des Plotterstif tes ein einfacher Schieber eingespannt wird. Er steht ebenso wie die erfassende Kamera und der Personalcomputer nach Beendi gung der Probenmessungen für andere Aufgaben zur Verfügung. Die einzelnen Arbeitsschritte laufen programmgesteuert ab und ver langen keine speziellen Kenntnisse vom Fachpersonal.Instead of a scanner, a black and white CCD camera can also be used with macro zoom optics can be used with good success. Here can advantageously a han for sample positioning retrofit conventional plotter by instead of the plotter pen tes a simple slide is clamped. He also stands like the capturing camera and the personal computer after completion sample measurements for other tasks. The individual steps are program-controlled and ver do not require any special knowledge from the specialist staff.

Anhand eines Ausführungsbeispiels mit CCD-Kamera und Plotter soll die Erfindung näher erläutert werden.Using an exemplary embodiment with a CCD camera and plotter the invention will be explained in more detail.

In der zugehörigen Zeichnung zeigen: In the accompanying drawing:

Fig. 1 ein Programmflußbild zur Steuerung der Apparaturen nach der Erfindung. Fig. 1 is a program flow chart for controlling the apparatus according to the invention.

Fig. 2 den schematischen Aufbau der Einrichtungen zur Durchfüh rung des erfindungsgemäßen Arbeitsverfahrens, Fig. 2 shows the schematic construction of the means for imple tion of the working process of the invention,

Fig. 3 einen Schieber im Austausch zu einem üblichen Plotter stift. Fig. 3 pens a slide in exchange for a conventional plotter.

Fig. 4 eine Draufsicht auf eine von einer Fachkraft ausgewerte te präparierte Probenplatte, Fig. 4 is a plan view of a full-values by a specialist te prepared sample plate,

Fig. 5 ein Programmflußbild, die Probenausmessung veranschauli chend. Fig. 5 is a Programmflußbild that Probenausmessung veranschauli accordingly.

Die automatisierten Arbeitsschritte zum Auswerten einer Serum probe nach der Single-Radial-Immundiffusionsmethode zeigt Fig. 1. Zuerst legt der Bediener eine Platte 1 nach Fig. 4, natür lich ohne Probennumerierung, auf eine definierte Stelle des Tableaus eines Plotters 2 mit dem Gel nach unten auf. Auf der Platte 1 sind Stanzlöcher 3, um die sich die Proben 3′ ausbrei ten, so eingebracht, daß sie in ein gedachtes Raster fallen und zwar exakt ein Stanzloch 3 je Lochfeld. Danach positioniert ein an Stelle eines Plotterstiftes eingesetzter Schieber 4 (Fig. 3) die Platte 1 so, daß sich eine erste Probe 3′ unter einer fest stehenden Kamera 5 befindet. Die Kamera 5, eine Schwarz-Weiß- CCD-Kamera, kann erforderlichenfalls an ihrem Stativ 6 unter Kontrolle am Monitor so justiert werden, daß die Probe 3′ mit tig und scharf erscheint, womit gleichzeitig alle Lochfelder der Platte 1 bezüglich des Plottertableaus positioniert sind. Zusätzlich erfolgt eine Feineinstellung der Beleuchtungskörper. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgen, durch einen Personal computer 7 gesteuert, vollautomatisch.The automated work steps for evaluating a serum sample according to the single-radial immunodiffusion method are shown in FIG. 1. First, the operator places a plate 1 according to FIG. 4, of course without sample numbering, on a defined location on the table of a plotter 2 with the gel down on. On the plate 1 , punch holes 3 , around which the samples 3 'are spread out, are introduced in such a way that they fall into an imaginary grid, with exactly one punch hole 3 per hole field. Then positioned in place of a plotter pen slide 4 ( Fig. 3), the plate 1 so that a first sample 3 'is under a fixed camera 5 . The camera 5 , a black and white CCD camera, can if necessary be adjusted on its tripod 6 under control on the monitor so that the sample 3 'appears tig and sharp, whereby all hole fields of the plate 1 are positioned with respect to the plotter board . In addition, the lighting fixtures are fine-tuned. All further work steps take place fully automatically, controlled by a personal computer 7 .

Sobald das Bild der ersten Probe 3′ im Personalcomputer 7 ge speichert sind, beginnt der Plotter 2 mit der Positionierung auf die nächste Probe 3′ durch Verschieben der Platte 1 unter der Kamera 5 zu dem entsprechenden Lochfeld. Dazu beaufschlagt der anstelle des Plotterstiftes eingespannte Schieber 4 jeweils seitenmittig die Probenplattenkanten. Der Schieber 4 (Fig. 3) hat im Einspannbereich die gleiche Geometrie wie die zum Plot ter 2 passenden Plotterstifte, lediglich eine eingefräste Nut 8 verhindert ein Verdrehen des Schaftes. Der Schieber 4 ist quaderförmig, seine Seitenkanten betragen im Ausführungsbei spiel 15 mm Länge. Über eine Madenschraube 9 ist er in der Höhe 50 verstellbar, daß er das Plottertableau gerade noch nicht be rührt.As soon as the image of the first sample 3 'is stored in the personal computer 7 , the plotter 2 begins with the positioning on the next sample 3 ' by moving the plate 1 under the camera 5 to the corresponding hole field. For this purpose, the slide 4 clamped in place of the plotter pen acts on the sample plate edges in the center. The slider 4 ( FIG. 3) has the same geometry in the clamping area as the plotter pins matching the plotter 2 , only a milled groove 8 prevents rotation of the shaft. The slider 4 is cuboid, its side edges are 15 mm in length in the exemplary embodiment. About a grub screw 9, it is adjustable in height 50 so that it just does not touch the plotter panel.

Das von der CCD-Kamera gelieferte Videosignal wird im Steuer rechner mittels einer Frame-Grabber-Karte digitalisiert und als Grauwert-Matrix in einem Grafikdateiformat auf der Festplatte gespeichert, im Anschluß auf eine definierte mittlere Hellig keit umgerechnet, mittels Tiefpaß werden unwesentliche Details ausgefiltert und es wird eine Kontrastverstärkung vorgenommen.The video signal supplied by the CCD camera is in control digitized using a frame grabber card and as Grayscale matrix in a graphic file format on the hard disk saved, then to a defined medium brightness converted, insignificant details become by means of low pass filtered out and contrast enhancement is carried out.

Im Beispiel wird die Tatsache genutzt, daß sich der dunkle Prä zipitathof der Probe 3′, der kreisförmig mit variablem Durch messer erscheint (Fig. 4), sich um ein helleres Stanzloch 3 mit konstantem Durchmesser befindet.In the example, the fact is used that the dark Precipitathof the sample 3 ', which appears circular with a variable diameter ( Fig. 4), is around a lighter punch hole 3 with a constant diameter.

Wie in Fig. 5 schematisiert dargestellt, sucht nun die Bildver arbeitungssoftware das hell erscheinende Stanzloch 3 in der Mitte des Bildfeldes als Suchmerkmal, indem es eine kreisförmi ge Maske so auf dem Bildfeld verschiebt, daß dessen mittlere Grauwerte ein Minimum ergeben. Iterativ werden die Schwerpunkt lage in der X-Y-Achse und die Größe der Maske verändert, bis der mittlere Grauwert bei größtmöglichem Radius sein Minimum erreicht hat. Da der wahre Durchmesser des Stanzlochs 3 hinrei chend genau bekannt ist, kann der Rechner damit den Maßstab des Bildes errechnen und das Bildverarbeitungssystem kalibrieren.As shown schematically in Fig. 5, the image processing software is now looking for the bright punch hole 3 in the center of the image field as a search feature by moving a circular mask on the image field so that its mean gray values result in a minimum. The center of gravity in the XY axis and the size of the mask are changed iteratively until the mean gray value with the largest possible radius has reached its minimum. Since the true diameter of the punched hole 3 is sufficiently known, the computer can use it to calculate the scale of the image and calibrate the image processing system.

Der Durchmesser des zugehörigen Präzipitatringes der Probe 3′ wird ermittelt, indem der mittlere Grauwert der kreisringarti gen Fläche zwischen dem Stanzloch 3 und einem zum Stanzloch 3 konzentrischen, größeren Kreis errechnet wird. Der Durchmesser der Maske wird so lange verändert, bis der mittlerer Grauwert ein Maximum bei größtmöglichem Durchmesser aufweist. Da der Präzipitathof nicht immer konzentrisch zum Stanzloch 3 liegt, kann sich der Mittelpunkt des Kreises ebenfalls geringfügig verschieben. Iterativ werden Durchmesser und Schwerpunktlage der Maske verändert, bis der mittlere Grauwert bei größtmögli chem Radius sein Maximum erreicht ist. Der Maskendurchmesser stellt somit den Meßwert dar. Der Rechner nimmt das nächste Bild auf, worauf der Plotter 2 mit der Positionierung eines weiteren Lochfeldes unter der Kamera beginnt.The diameter of the associated precipitate ring of the sample 3 'is determined by calculating the mean gray value of the circular ring-like area between the punched hole 3 and a larger circle concentric with the punched hole 3 . The diameter of the mask is changed until the mean gray value has a maximum with the largest possible diameter. Since the precipitate courtyard is not always concentric with the punch hole 3 , the center of the circle can also shift slightly. The diameter and center of gravity of the mask are changed iteratively until the average gray value is at its maximum at the greatest possible radius. The mask diameter thus represents the measured value. The computer takes the next image, whereupon the plotter 2 begins with the positioning of a further hole field under the camera.

Das nunmehr in der Größe bekannte Stanzloch 3 wird in der oben beschriebenen Art und Weise gefunden und analog der Durchmesser des Präzipitathofs der nächsten Probe 3′ ermittelt. Wenn nach einander alle Proben 3′ ausgemessen worden sind, werden die Er gebnisse durch ein auf statistischen Rechenverfahren basieren des Auswerteprogramm verarbeitet und die quantitativen Merkmale des Präparats ermittelt und in Form eines Meßprotokolls ausge geben.The punching hole 3 , which is now known in size, is found in the manner described above and the diameter of the precipitate yard of the next sample 3 'is determined analogously. If all samples 3 'have been measured one after the other, the results are processed by a statistical calculation method based on the evaluation program and the quantitative characteristics of the preparation are determined and output in the form of a measurement report.

Anstelle einer CCD-Kamera eignet sich auch sehr gut ein hochauflösender Scanner zur Bildaufnahme. Die Platte 1 wird mittels eines geeigneten Rahmens definiert zum Scanner positio niert. Der Scanner erfaßt jedes einzelne Lochfeld, worauf die Auswertung mit den gleichen Arbeitsschritten erfolgt. Durch die Verwendung eines Scanners vereinfacht sich nicht nur der appa rative Aufwand, sondern auch die die manuelle Justierarbeit beim Aufbau des Meßplatzes.Instead of a CCD camera, a high-resolution scanner is also very suitable for image acquisition. The plate 1 is positioned by means of a suitable frame for the scanner. The scanner records every single hole field, whereupon the evaluation is carried out with the same steps. The use of a scanner not only simplifies the outlay on equipment, but also the manual adjustment work when setting up the measuring station.

Claims

1. A method for examining antigen-containing blood serum samples which were introduced into punch holes of an antibody-containing gel plate for comparison with standard samples containing antigen and a precipitate ring was formed by simple radial immunodiffusion (RID) around each punch hole, hole field for hole field of the plate ( 1 ) optoelectronic scanned, stored as a gray scale raster image and evaluated as image processing as follows:

a) determining the position of the punched hole ( 3 ) in the hole field by iteratively moving a software-formed mask in the XY plane, and once determining the size of the punched hole ( 3 ) by additionally changing the size of the mask until it is covered as much as possible with the punched hole ( 3 );
b) sizing the Präzipitatrings (3 ') by iterative size and change in position of the mask to the found punched hole (3) and the punch (3) surrounding Präzipitatring (3') up to the maximum coverage with the Präzipitatring (3 '), and Calibration of the imaging scale takes place with the aid of the recognized size of the punch holes ( 3 ) and the size of the precipitate rings ( 3 ') of the blood serum samples to be examined is compared with the size of the precipitate rings ( 3 ') of the standard samples.

2. The method according to claim 1, characterized by iteratively changing the position and size of the mask with respect to a bright punch hole ( 3 ) and the surrounding precipitate ring ( 3 ') until the masked image section has a maximum average gray value with the largest possible area.

3. The method according to claim 1, characterized in that several punching holes ( 3 ) are scanned with standard samples for the purpose of calibrating the system, are stored and evaluated, the punching holes ( 3 ) in question being selected and defined for the standard samples at random.

4. The method according to claim 1, characterized by the use of a flatbed scanner as electronic image acquisition device.

5. The method according to claim 1, characterized by the use of a black and white CCD camera ( 5 ) with macro zoom optics as an electronic image recording device.

6. The method according to claim 1 and 5, characterized in that after each hole field recording, the plate ( 1 ) by one wide res hole field with respect to the CCD camera ( 5 ) is moved.

7. The method according to claim 1, 5 and 6, characterized by the use of a plotter ( 2 ) with a instead of the plotter pin clamped cuboid slide ( 4 ) for positioning the plate ( 1 ).

8. The method according to claim 1, characterized by the use a PC's as a control computer, image processing device and for statistical evaluation of the measurement results.